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체중 관련 기능성 시험

정해랑1, 강재헌2

한국보건산업진흥원1, 인제대학교 상계백병원 가정의학과2

1. 비만과 다이어트 / 76

(1) 비만의 병태생리 ························································································76

2. 비만 관련 biomarker / 90

(1) 현재 보편적으로 인정되고 있는 지표 ·················································91

(2) 현재 연구 중인 지표 ·············································································92

3. 비만 및 다이어트 관련 시험방법 / 99

(1) 생체외 실험 ····························································································99

(2) 동물실험 ·······························································································108

(3) 실험설계 및 수행방법 ·········································································119

(4) 동물실험 설계 및 수행방법(안) 도출 ·····················································123

(5) 인체시험 ·······························································································125

4. 참고문헌 / 129

5. 부록 / 133

(1) 사료섭취량, 체중측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법 ·············133

(2) 지방조직 무게측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법 ··················135

(3) 혈중 중성지방, 콜레스테롤 측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법

··············································································································136

(4) 비만유전자 발현측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법 ······················138

1. 비만과 다이어트

(1) 비만의 병태생리

가. 비만의 정의: 비만은 체내에 지방이 과잉 축적된 상태를 말한다.

나. 비만의 원인

지나친 열량섭취, 내분비 장애, 운동부족, 유전적 요인 등이 있지만 그 중에서 과잉

에너지 축적이 가장 직접적으로 관계된다. 다른 특별한 원인 없이 섭취에너지에 비해

소비에너지는 적을 때 초래되는 단순성(본태성)비만과 내분비질환 (인슐린 의존성

당뇨병, cushing 증후군, 난소 기능 부전, 갑상선 기능저하)이나 시상하부장애 (뇌의

만복감 중추장해시 나타난다.)등 어떤 원인으로 인해 비만이 되는 증후성 비만이 있

다. 비만의 95%는 단순 비만에 속한다 (대한비만학회. 임상비만학 2001; 대한비만학

회. 임상비만학의 최신지견 대사증후군. 2002; 이귀녕, 2000; 최웅환, 2002)

가족의 비만력과 유전

비만의 요인 중에서 유전인자가 관련된 사실은 여러 연구를 통해 알려져 있다. 비만이

생활습관의 잘못에서 많이 생기나 식욕을 스스로의 의지로 조절할 수 없는 경우에는

유전자 등의 물질적인 근거가 있다는 최근의 연구결과가 보고되었다. 즉 유전성 비만

마우스(ob/ob 마우스)로부터 비만 유전자(ob 유전자)가 발견되었다. 이 비만 유전인

자는 식욕을 억제하는 렙틴(leptin)이라는 단백질을 만든다. ob/ob 마우스에서는 이

렙틴 구조에 변이가 생겨 작용이 잘 안되어 식욕을 억제하지 못해서 과식을 하게 되어

비만에 이르게 되는 것이다.

사람에 있어서도 일반적으로 비만자가 혈중 렙틴 농도가 상승되고 있는 데도 불구하

고 식욕이 억제되지 않는 것은 렙틴에 대한 감수성이 낮기 때문이다. 병적인 비만에

서는 체내에서 만들어지는 단백질 구조가 유전성 비만 마우스에 나타난 것과 매우 유

사한 결과가 확인되었다. 최근 아드레날린 수용체에서 이상을 일으키는 유전자가 존

재하고 있음을 추정하는 연구결과도 보고되었다. 지방조직의 아드레날린 수용체 특

히 베타 3-수용체는 지방을 분해하고 에너지로 바꾸는 데 관여하고 있다. 이 유전자

에 이상이 생기면 소비 에너지가 저하되어 살이 찌게 된다.

한편 연구조사 결과에 의하면 양친이 비만이면 자녀들의 70-80%는 비만이 되며, 한쪽

부모가 비만이면 자녀들의 40-50%가 비만이었음이 밝혀졌다. 그리고 체중이 정상인

부모로부터 태어난 자녀 가운데는 9-10%만이 비만이었다고 한다. 비만아의 형제자매

중에도 비만아가 많은 것을 보면 비만 발생은 유전이 많이 관련되어 있음을 알 수 있

다. 그러나 식사내용이나 운동량 등의 생활습관에 있어서 부모로부터 많은 영향을 받

고 있으며, 친자간에 높은 상관을 보이나 양부모와 양자간에서도 비슷한 비만 현상을

볼 수 있다. 부부지간에 있어서도 한 쪽이 비만이면 배우자도 비만 경향이 보인다.

따라서 동일 가정 내에서 비만이 많이 발생한다 해서 모두 유전인자 탓으로 단정할

수 없고 후천적인 사회 환경의 요인도 크다고 할 수 있다.

정신적 요인

현대는 스트레스 시대라고 할만큼 일상생활에서 압박을 많이 받고 있으며, 이러한 정

신불안과 욕구불만을 해소하기 위해 음식섭취를 증가시키는 반면에 신체활동은 감소

하였으므로 에너지 대사에 불균형이 초래되어 비만이 될 수 있다. 피곤하거나 화가

났을 때 과식할 수 있고 어떤 문제가 발생했을 때도 음식섭취를 통해 그 문제를 보상

하거나 도피하려는 경향이 있다. 이런 행동은 어렸을 때 습득되어진다. 즉 음식과의

관련 여부를 떠나서 모든 생리적, 심리적 욕구를 대신 채워주기 위해 음식을 제공받

아 온 아이들의 경우 이런 식으로 음식을 이용하는 것을 배우게 된다. 비만한 사람

중에는 의지력이나 자제력이 부족하여 식욕과 체중조절을 못하는 경우가 많다.

내분비인자

시상하부에는 섭취중추와 만복감을 조절하는 중추가 있으며 만약 여기에 어떠한 기질

적 장애가 생기면 식욕조절을 못하게 됨으로써 음식을 과잉으로 섭취하게 되어 비만

이 일어난다. 두부의 전면에 있는 내분비선인 갑상선에서 만약 호르몬 내분비기능이

저하되면 기초대사가 저하되어 열량소비가 감소되기 때문에 비만이 된다. 그러나 비

만인의 모두가 갑상선 기능에 장애가 있는 것은 아니다. 부신피질 호르몬의 과잉분비

로 인한 비만은 내분비성 비만의 대표적인 비만으로 신장 또는 간 질환의 치료에 있

어 다량의 부신피질 스테로이드제를 오랫동안 사용했을 때에도 비만이 되는 경우가

있다. 쿠싱증후군(Cushing syndrome)은 부신피질 자극 호르몬(ACTH)분비를 상승하게

하여 부신피질을 자극함으로써 코티솔이 과잉으로 생성되어 중심부 지방세포 증식을

초래한다. 여성은 여성호르몬인 에스트로겐에 의해 지단백 분해효소(lipoprotein

lipase, LPL)가 조절되는데 폐경 이후에 분비가 감소되면 피하지방 합성이 촉진되고

인슐린의 과잉분비로 지방생성이 촉진되며, 지방분해가 억제되어 지방이 축적되므로

비만이 유발된다. 남성은 LPL이 테스토스테론에 의해 조절되고 복부에 LPL이 많기 때

문에 복부비만이 초래된다. 기타 하수체 내분비 장애는 비만과 밀접한 관계가 있다.

어린이들은 연간 4-6㎝ 씩 키가 커지는 것이 보통이며 성장에도 호르몬의 관여가 크

다. 그러나 성장률이 차차 저하되고 비대해지면 일단 대사에 이상이 생긴 비만으로

보고 전문의의 진찰을 받도록 한다.

질병이 아닌 중년기의 비만을 단순성 비만이라고 하며 시상하부, 부신피질, 간뇌, 하

수체, 성선 등에 있어서의 내분비 장애에 의한 비만을 증후성 비만이라고 한다.

사회적 환경인자

경제가 고도로 발달함에 따라 식생활은 윤택해지고 활동량은 줄어들고, 식습관도 서

구화되면서 섭취 칼로리 과잉, 운동 부족 등으로 섭취 에너지와 소비에너지간의 불균

형으로 인해 비만이 증가하고 있다.

운동부족에 의한 비만

운동부족과 비만관계는 소비 에너지 저하도 있지만 그보다 에너지가 체내에서 저장되

기 쉬운 대사상태로 변하는 것이 더 중요하다. 운동부족은 활동 에너지량을 감소시켜

서 잉여 칼로리를 체내에 저장하게 되며 인슐린의 활동이 약해지면서 인슐린이 혈당

을 내리는 작용이 감소되며, 지방합성작용은 감소되지 않으므로 지방축적작용을 촉

진시키는 대사상태로 변한다. 또한 운동부족 상태에서는 기초대사도 감소되므로 저

장에너지는 더욱 증가되기 쉽다. 성장이 끝난 성인기부터는 단백질도 탄수화물도 체

내에 들어온 여분의 영양은 지방형태로 몸 안에 저장된다. 이러한 과잉영양이 지방으

로 변할 때 운동 부족은 지방합성효소의 작용을 상승시키게 된다. 한편 에너지 소비

에는 수영 등의 의도적이거나 계통적으로 몸을 움직이는 운동과 작업 및 가사노동 등

일상생활 중의 운동 이외의 신체활동 두 가지가 있다. 여가 시간을 이용한 운동량은

비교적 일정하나 기계화, 교통, 정보통신수단이 발달되고 가사노동도 전력화되면서

신체활동량은 크게 감소되었다.

운동과 신체활동량이 감소하면 이에 맞게 식사량도 감소시키는 에너지 균형의 자발적

인 조정이 따라야 하나 실제로는 어려워 비만이 급증하고 있다.

한편 도시화와 학력사회는 어린이들의 일상생활 패턴을 변화시켜 비만해지기 쉬운 환

경을 조성하고 있으며, 생활의 편리함과 기계화 등으로 인한 운동부족은 칼로리 소비

가 적게 되며 비만인은 운동을 기피하여 운동량이 감소되므로 더욱 비만을 촉진하게

된다.

식사와 비만

가) 음식의 종류

비만은 인슐린 분비를 높이는 당질의 과잉섭취로 일어나며 지질도 지질 단독보다 당

질과 함께 섭취했을 때 비만을 초래하기 쉽다. 지방 침착의 주원인인 인슐린 분비는

당질의 종류에 따라 촉진도가 다르며 단당류에서는 갈락토오스: 포도당: 과당=115:

100: 35의 순이며, 이는 각 단당의 흡수속도의 비에 가깝다.

미각에 있어서 단맛의 강도는 과당>자당>포도당>갈락토오스의 순이며 과당은 단맛이

강하나 흡수속도는 더디고 인슐린 분비작용은 약하다. 사카린과 같은 인공감미료는

자당보다 수백 배 단맛이 강하나 인슐린 분비를 일으키지 않는다.

음식물 중의 당질은 여러 가지가 있으며 대부분의 전분은 단맛은 없으나 소화흡수 되

면 단당으로 되어 인슐린 분비를 일으킨다. 단맛이 있는 당질만 비만에 관계하는 것

은 아니며, 음식 중의 탄수화물의 소화흡수 속도 흡수 후의 단당의 성분과 농도가 주

요 문제가 된다.

나) 식사형태

① 분할섭식

아침이나 점심을 먹지 않고 저녁에 몰아서 한꺼번에 대량의 음식을 먹거나 밤참을

하는 습관은 비만을 초래한다. 하루 한 끼에 대량 먹는 경우와 고르게 세 끼 식사

를 하는 경우를 비교하면 동일한 하루의 에너지 섭취인 데도 불구하고 분할 섭식

인 경우는 비만이 적고 혈중 콜레스테롤도 낮으며 내당능 저하도 적다. 즉 한 끼만

먹는 경우는 지방생성 효소의 활성이 증가되고 인슐린 분비량이 많아져서 지방분

해가 억제되고 지방합성이 증가한다.

② 저작횟수와 식사시간

비만자는 많은 경우 식사속도가 빠르고 음식 저작 횟수도 적다. 잘 씹지 않기 때문

에 소화흡수속도, 혈당상승 속도가 더디며 섭식중추의 계속적인 자극으로 과식을

초래하여 비만이 되기 쉽다.

또한 임신시 태아의 영양을 고려하여 과잉으로 음식을 섭취할 경우 모체가 비만이

되기 쉽고 가족 모두가 고열량 음식을 좋아하는 경우에도 가족이 모두 비만형으로

될 수 있다.

다) 과식의 원인

과식을 해서 섭취에너지가 과잉되면 체내에 대사이상이 없어도 저장 에너지를 증가시

키게 되므로 체지방 증가가 일어난다.

사람이 과식을 하는 것에 대한 가설에는,

① 만복감의 한계 상승

만복을 느끼는 혈당의 한계치가 높아진다는 가설이다. 시상하부에 있는 만복중추

가 자극을 받으면 만복감이 생겨서 섭식이 정지된다. 이 만복중추를 자극하는 것

은 혈당치이지만 정상치보다 높이 마련되고 있으므로 만복을 느낄 때까지 먹으면

과식을 하게 된다. 급히 먹는 식습관은 만복감을 늦게 느끼게 되므로 과식을 하게

된다.

② 과잉 인슐린의 공복중추 자극

인슐린 과잉분비(고인슐린혈증)는 공복감이 생긴다. 시상하부의 섭식중추는 인슐

린의 자극을 받으면 섭식이 증가한다. 비만자 중에는 인슐린 과잉 분비가 나타나

며 일정 이상의 비만이 되면 과잉 인슐린이 공복중추를 더욱 자극해서 과식을 하

게 되므로 비만을 악화시킬 경향이 있다.

③ 뇌 속의 아민 기구의 이상

시상하부의 신경전달 물질인 아민에는 신경작용을 조절하는 기구가 있으나 여기

에 이상이 생기면 과식하게 된다. 섭식에 도파민, 세로토닌, 히스타민 등이 있어

서 자극과 억제에 의해 식욕이 자극되거나 억제된다. 이 가운데 섭식기능을 흐트

러지게 하는 것은 세로토닌이며, 예로 항세로토닌 작용이 있는 약물을 복용하면

탄수화물의 섭식이 선택적으로 감소된다. 탄수화물의 섭취는 간접적으로 뇌 속의

세로토닌 농도를 상승시킨다. 세로토닌은 정서를 안정시키는 작용이 있어서 스트

레스 해소의 과식과도 관련성이 있을 것으로 지적되고 있다.

④ 펩티드 호르몬의 이상

뇌 속에는 아민 외에 펩티드 호르몬도 신경 전달 물질 또는 신경 기능 조절물질로

서 중요 역할을 하고 있다. 펩티드 호르몬 중에는 강한 섭식 억제 작용이 있는 콜

레시스토키닌이 유전성 비만 마우스의 대뇌피질 속에 적다는 보고가 있다. 이와

같은 펩티드 호르몬의 이상은 인간에게도 과식의 요인의 하나가 될 가능성이 있는

것으로 생각된다.

⑤ 스트레스의 영향

실험동물인 쥐의 꼬리에 바늘로 계속 약한 자극을 주면서 스트레스를 가하면 과식

상태에 빠져서 갑자기 체중이 증가한다. 사람도 불안하거나 욕구불만, 갈등 등의

심리적 스트레스가 쌓일 때 배고프지 않아도 자꾸 먹는 데에 쏟는 행위를 하게 된

다. 이러한 현상은 사춘기와 젊은 여성들에게 흔한 현상으로 비만자 중에는 먹는

일로 스트레스 해소를 하는 경우가 많다. 충동적으로 대식을 하고 그 중에는 스스

로 토해내는 패턴을 되풀이하는 경우도 많다. 스트레스에 의한 야식증후군(night

eating syndrome)은 야간에 과식하기 때문에 잠이 잘 오지 않아 불면상태가 되어

아침에 식욕이 없어 결식하는 등 악순환이 반복된다. 밤의 다량의 식사는 인슐린

분비를 증가시키고, 인슐린은 체내에서 지방합성을 촉진시키므로 밤에 먹는 여분

의 에너지는 낮보다 체지방이 되기 쉽다. 비만자는 빨리 먹기, 몰아서 먹기 등 부

적절한 섭식 패턴을 가지고 있으며 이를 비만형 식사 패턴이라고 한다.

다. 비만생리

열발생 기능장애와 비만

열 발생은 열 생성을 통해 과잉의 에너지를 제거하는 우리 몸의 능력이다. 여기에는

운동에 의한 열 발생, 추위에 의한 열 발생, 식이에 의한 열 발생이 있으며 이러한

열 발생이 원활하게 이루어지지 않을 때 소모 에너지가 감소되어 비만이 되기 쉽다.

식이에 의한 열생성 작용은 주로 갈색지방세포(BAT, brown adipose tissue)에서 조절

된다. 백색 지방은 지방조직을 먼저 저장하고 산화시킴으로써 열의 발생

(thermogenesis)과 ATP를 생성하나, 갈색지방세포는 백색지방세포(WAT, white

adipose tissue)와는 달리 철을 함유한 시토크롬 색소가 있는 미토콘드리아를 함유하

고 있어 특이한 갈색을 나타내며 체내로 들어온 에너지원으로부터 주로 몸에 지방으

로 저장할 수 없는 열만을 발생시킨다. 이러한 열생성 과정은 uncoupling protein

(UCP)란 단백질을 통해 일어나고 UCP는 발현되는 조직에 따라 UCP1, UCP2, UCP3가 있

어 각각의 특이한 에너지 소모를 증가시킨다. 이중 UCP-1의 발현이 갈색지방 특이적

인 반면 UCP-2는 대부분의 조직에서 발현되고 UCP-3는 주로 골격근과 갈색지방에만

발현된다. UCP-1의 세포내 작용과 UCP-1의 기능이 절제된 형질전환 생쥐의 표현형에

서 제 2형 당뇨병과 인슐린 저항성의 병태생리가 나타났다. 즉 비만에 의한 인슐린

저항성의 접근을 에너지 대사와 연결시켜 생각한 결과 갈색지방조직이 적은 사람은

비만이 초래하게 된다.

지단백 분해효소

지방조직 내의 지단백 분해효소는 순환하는 혈장의 중성지방을 지방세포가 이용하는

속도를 결정하는 효소이다. 이것은 중성지방이 글리세르인산염(glycerol phosphate)

과 유리지방산으로 분해되는 것을 향상시키는데 이들은 지방세포로 들어가 다시 에스

테르화되어 중성지방으로 저장된다. 지방조직의 지단백 분해 효소 활성이 비만시 증

가된다. 그러나 최근 자료들에 따르면 체중감소가 안정된 후에는 증가되었던 지방조

직내의 지단백 분해 효소 활성이 감소하지만 에너지를 다시 섭취하면 이전의 수준 이

상으로 빠르게 증가한다고 한다. 따라서 이러한 변화는 음식섭취 증가에 기인하는 순

환 중성지방을 지방조직만으로 저장하는 능력을 향상시킬 수 있다. 그러므로 이전에

저에너지 식사를 한 비만자들이 에너지 섭취를 증가시킬 경우 체중이 다시 증가하게

된다.

시발점(set point)

개인은 각자가 유지해야 할 체중과 지방량을 고정하는 통제체제를 가지고 있다. 즉

우리 몸은 생리적 조절의 시발점을 가지고 있는데 비만자는 마른자 보다 높은 시발점

을 가진다. 그러므로 비만자의 경우 그들이 아무리 체중을 감소하려 해도 그들의 높

은 생리적 조절의 시발점이 체중을 감소된 체중 이전의 상태로 이끌기 때문에 여전히

비만 상태에 머문다.

육체적 활동

1일 에너지 소모량 중 기초대사량 (인체의 생명, 기능유지에 필요한 대사량으로 1일

소모에너지의 60% 차지)은 25세 이후부터 감소하기 시작하여 활동량도 감소한다. 따

라서 적은 양의 에너지 섭취로써 균형이 이루어져야 하나, 섭취량을 25세 이전 그대

로 유지하는 것은 체중의 증가를 가져온다. 특히 비만자의 경우 정상인과 섭취량이

같을지라도 활동량이 정상인보다 적기 때문에 더 큰 체중증가를 가져올 수 있다. 비

만자의 지속적인 체중 감소를 위해서는 지속적인 섭취에너지 제한과 육체활동 증가와

운동이 수반되어야한다. 오랜 기간 섭취에너지를 제한하면 이에 적응하기 위하여 기

초대사량이 감소한다. 이때 섭취에너지를 증가시킨다면 여분의 에너지는 지방조직을

생성하므로 체중감량 기간보다 더 빨리 더 많이 체중이 회복되어 비만의 치료는 어렵

게 된다. 따라서 지속적인 섭취에너지 제한과 함께 운동이 중요하다. 특이동적 작용

(SDA specific dynamic action)을 위한 대사량은 음식물 섭취로 에너지 대사가 증가

되는 현상으로 당질은 15-20%로 당질 산화시에는 에너지 소모가 없으나 글리코겐이나

지방으로 전환될 때에는 각각 5%, 28%의 에너지가 소모되고 단백질은 합성 분해에

20-30%, 지방은 저장과 재이용에 3-4%의 에너지 소모를 나타낸다. SDA에 따른 대사량

은 3대 영양소 중 단백질이 가장 크므로 비만자에게는 단백질의 섭취가 당질이나 지

방의 섭취보다 유리하다고 본다. SDA에 따른 대사량은 기초대사량과 활동대사량을 합

한 소비에너지의 10%에 해당되며 1일 전체 소모에너지에 대해서는 6-8%를 나타낸다.

식사행동

식사를 제한해 하루 한 끼의 저녁식사를 하는 경우 지방생성 효소들의 활성이 증가한

다. 그래서 식사제한으로 일시적 체중감소가 일어날지라도 다시 정상적인 식사로 돌

아왔을 때는 지방합성이 증가되어 급속히 체중이 증가하게 된다. 또한 간식을 통해

주로 섭취되는 단당류들은 빠른 소화흡수로 지방으로의 전환을 촉진하며 그 결과 지

방생성효소가 활성화된다. 이 경우 식사시간 간격이 길어질수록, 즉 식사횟수가 적을

수록 인슐린 분비량은 많아지고 지방생성효소의 활성으로 인해 지방합성 저장은 더욱

왕성하여 비만을 초래하게 된다. 또한 식사속도가 빠르고 씹는 횟수가 적을수록 소화

흡수속도는 느리게 되므로 혈당상승 속도도 저하되어 뇌의 시상하부의 섭식중추는 계

속 자각되지만 포만중추는 억제되므로 결국 섭취량이 많아져 과식하게 되고 비만을

초래한다.

식사 유발성 열생산(Diet induced thermogenesis DIT)

식사섭취로 교감신경이 흥분되면 갈색 지방조직과 근육조직의 대사율이 항진되어 식

사 후에는 섭취에너지의 10-15%가 소모되며 식후 2-3시간 후에는 정상으로 환원된다.

그러나 비만자는 교감신경의 자극이 둔화되어 DIT가 섭취에너지의 10-15%보다 적으

므로 여분의 에너지가 지방으로 전환된다.

내분비계 이상

비만 환자들의 1% 이하가 내분비 이상을 보이므로 비만의 원인으로서 자주 보이는 경

우는 아니지만 비만과 내분비 호르몬 사이에는 관계가 있다

시상하부 질환

동물실험에 의하면 시상하부 손상시 비만이 나타났다고 하는데 뇌에 의한 섭식 조절

과정은 단순한 섭식중추와 포만중추의 균형에 의한 것이기보다는 자극 억제 신경계들

의 복합적인 것이다. 인간에 있어서도 시상하부의 종양 감염 등으로 손상을 가진 일

부 환자들의 경우 비만상태를 보이며 그들의 대부분은 시상하부의 종양 수술 후 비만

을 보였다.

뇌하수체의 부신질환

cushing 증후군은 비만으로 이끄는 뇌하수체 기능이상의 가장 일반적인 형태로 부신

피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH)은 뇌하수체 종양이나 지나치

게 활성을 띤 뇌하수체 세포들에 의해 과잉 분비되는데 이것은 부신피질을 자극하여

코티졸이 과잉 생성하게 되어 지방세포들이 주로 몸의 중심부에 위치하여 증식하게

된다.

갑상선 질환

비만은 갑상선의 기능부전(hypothyroidism)에 의한 기초 대사량의 저하에 기인할 수

있지만 이런 경우는 드물다.

난소기능부전

폐경으로 인해 estrogen 분비가 감소되면 피하지방 합성이 촉진되어 비만을 초래한다.

라. 비만의 분류

지방조직 체내 분포 부위에 의한 분류

① 허리와 둔부의 피하지방량을 측정하여 하반신비만과 상반신비만(복부 비만)으로

분류하였는데, 상반신비만은 복부의 내장지방량 과다로 체내 대사 장애를 가져와

성인병 발병과 밀접한 관련이 있다. (한정미 et al. 2001)

② 허리와 엉덩이 둘레비(waist/hip circumference ratio)가 구미 여성의 경우 약

0.7이 정상이고 0.85에 달하면 혈당의 내성검사가 필요하며 당뇨병의 합병빈도가

높다고 한다. 복부 즉 허리의 지방과잉 축적으로 복부 내 장기를 구성하는 세포는

포도당에 비해 지방을 에너지원으로 선호하므로 포도당에 대해 불내성을 보인다.

지방조직 형태에 의한 분류

체지방은 일차적으로 중성지방의 형태로 지방세포에 저장되며 지방세포 크기의 증

대, 또는 지방세포수의 증가에 의해 지방조직이 증가한다. 지방세포는 먼저 각 부위

의 세포 크기가 0.7-0.8㎍/cell 까지 증대된 후에 세포수가 증가하는데 지방세포수는

생후 1년간 급속히 증가된 후 정체하다가 사춘기에 집중적으로 증가한 후 성인에 와

서 멈춘다. 성인 이후에는 지방세포의 크기가 증대하는데 비만자의 지방 세포당 지방

의 양은 정상인보다 많으며 그 크기도 어느 정도 커지게 되면 성인기 이후에도 다시

지방세포수가 증가한다. 정상인의 지방세포수는 200억-300억 개인데 비해 비만자는

900-1,500억 개로 정상인의 3-5배의 지방세포수를 가지고 있다. 일단 유년기에 지방

세포수가 증가하면 그 수를 줄일 수 없으며 언제라도 비만을 일으킬 요인을 지니고

있다.

① 지방세포 증식형 비만(hyperplastic obesity): 유년기에 많이 발생하고 지방세포

수의 증가에 의해 일어나는 비만이다. 지방세포 수는 일생 중 아무 때나 증가하는

것은 아니며, 2세 이하, 5-7세, 그리고 사춘기에 증가한다. 지방세포수가 늘어도

세포 하나 하나의 크기는 정상이다. 한 번 증식한 세포는 어느 시기에 마르게는

되어도 수는 줄지 않으며 체중감소에 성공해도 원래 지방이 들어오는 허용량이 크

므로 비만이 재발되기 쉽고 비만도도 높다. 유년기 비만은 성인기 비만으로 진행

되기 쉽다.

② 지방세포 비대형 비만(hypertrophic obesity): 성인이 된 후에 많이 발생하며 주

로 지방세포 크기가 커지는 비만이다. 주로 사춘기 이후에 일어나기 쉽다. 비만이

아동기부터 시작되는 것인지 30대 이후 성인기에 시작되는 것인지에 따라서 건강

에 미치는 영향은 크게 달라진다.

마. 비만이 가져올 수 있는 질병

비만은 성인병을 유발시키는 촉진제가 되며 대사 장애로서 제 2형 당뇨병, 동맥경화

증의 발현 위험을 증가시키며, 심장의 혈액공급에 부담을 주게 되어 심장병에 걸리게

되며, 남은 지방은 간에 부담을 주어 지방간, 담석증, 간경변에 걸리게 된다. 몸무게

가 뼈와 관절에 부담을 주어 골격이상이 생기며 행동이 둔화됨에 따라 활동력이 제한

되므로 운동부족이 되어 비만이 더욱 심화되며, 특히 여성비만은 내분비이상을 가져

와 월경불순, 성욕감퇴, 출산시 합병증, 피부 습진, 땀을 많이 흘리게 된다.

제 2형 당뇨병

제 2형 당뇨병 발병률은 정상체중보다 과체중인 경우 약 13% 정도 더 높으며 주로 인

슐린 비의존성 당뇨병 형태로 발생한다. 미국에서는 인슐린 비의존성 당뇨 환자의

85%가 비만이라 한다. 특히 허리와 엉덩이 둘레비는 인슐린 비의존성 당뇨병과 심혈

관계 질환에 주요 예후 인자로 하반신 비만에 비해 상반신 비만과 관련이 깊다. 엉덩

이 둘레가 큰 하반신 비만시에는 말초조직의 경미한 인슐린 저항성이 있고 이를 보상

하기 위해 췌장에서 인슐린 분비가 증가되는 반면 상반신 비만에서는 말초조직의 인

슐린 저항성이 보다 심하고 간에서 인슐린 제거가 감소하여 고인슐린 혈증이 더욱 현

저하다. 즉 상반신 비만의 경우 지방분해활성이 높은 복강내지방에서 전신혈액순환

으로 배출된 다량의 유리지방산이 간으로 유입되면 간에서 포도당 이용률은 낮아지고

인슐린 결합 및 작용이 방해된다. 한편 말초조직에서도 유리지방산의 유입으로 포도

당 이용률이 낮아져 인슐린 저항성을 나타낸다. 따라서 고인슐린 혈증이 되어 인슐린

비의존성 당뇨를 유발한다.

혈중 인슐린은 세포막에 존재하는 인슐린 수용체와 결합한다. 일반적으로 혈중 인슐

린 농도가 높은 경우에는 인슐린 수용체의 수가 적다. 비만자의 세포는 인슐린 수용

체의 수가 적으며 인슐린과 수용체의 친화력도 낮고 인슐린과 수용체의 결합 후 포도

당 수송자(glucose transporters)가 세포막 가까이 접근하는 단계에서도 어려움이

있다. 또한 포도당 수송자의 수도 적고 포도당과 수송자의 친화력 감소 등으로 인해

정상인에 비해 비만자에서는 세포 내로의 포도당 수송에 어려움이 있다고 본다.

이와 같이 비만자에서는 인슐린 저항이 있으므로 정상인에 비해 더 많은 인슐린을 분

비하게 되고 이런 현상이 장기간 지속될 때 췌장은 피로해지며 대사에 대한 췌장의

인슐린 분비반응은 둔감해진다.

또한 가족력을 포함한 유전적 소인과 지방분포가 당뇨병의 발생을 증가시킨다. 비만

과 당뇨병을 유발하는 동일 유전자는 밝혀져 있지 않지만 인슐린 수용체후 신호전달

과정의 결함이나 지방조직에서 분비되는 렙틴이나 아디포넥틴, 레시스틴과 TNF-

alpha, interleukin-6같은 싸이토카인 등이 인슐린 저항성에 관여하는 유전자로 보

인다. 렙틴은 췌장에서 인슐린 분비를 감소시키고 간이나 근육세포에서 포도당 대사

에 관여하는 것 등이 보고되고 있지만 인슐린 감수성을 증가시킨다는 보고들도 많아

인슐린 저항성에 있어서 렙틴의 역할은 좀 더 규명되어져야 한다. 아디포넥틴은 비만

환자에서 정상인보다 감소되어 있고 제 2형 당뇨병과 관상동맥질환을 보이는 환자에

서도 감소되어 있다 아디포넥틱 농도는 공복 인슐린 농도와 반비례 관계를 보이므로

아디포넥틴의 감소가 인슐린 저항성을 유발하는 인자로 생각된다. Resistin은 발견

초기에는 지방세포에서 분비되는 강력한 인슐린 저항성 유발인자로 생각되었으나 이

후 많은 보고에서 그 역할이 불분명해지고 있다. TNF-alpha는 인슐린의 신호전달을

방해하여 인슐린 저항성을 일으킨다. IL-6는 급성기 반응, 면역반응에 관여하는데 지

방세포에서 포도당 대사와 연관이 있고 TNF-alpha 같은 다른 싸이토카인 분비에 영향

을 미쳐서 인슐린 저항성을 유발할 수 있다고 보고하고 있다. 비만환자에서는 지방분

해가 증가되어 있는데 특히 복부 비만인 경우에는 지방분해 산물인 free fatty

acid(FFA)가 직접 간문맥을 통하여 간으로 유입되어 인슐린의 작용을 감소시키고 인

슐린 추출이 감소되어 인슐린 저항성이 심해진다. 또한 비만환자에서는 glucose-

fatty acid cycle(Randle cycle)에 의한 근육에서의 인슐린 감수성이 저하되면서 인

슐린 저항성을 더욱 심화된다. 이러한 것을 볼 때 당뇨병 발생에 복부비만이 중요한

원인이 됨을 알 수 있다.(최웅환, 2002; 김미정 et al. 2003; 손수진 et al 2002; 손

수진 et al. 2003; 이근미, 1998; 최웅환, 1997; Park H. S. et al. 2001;. Bobbioni

Harsch et al. 1999; Yuzo Ninomiya et al. 2002; Marvri A. et al. 2001)

고혈압

비만환자의 약 60%가 고혈압을 가지고 있다고 한다. 비만이 고혈압을 유발하는 기전은

확실하지는 않지만 체액의 증가 신장에서의 나트륨 보유의 증가, 교감신경계 그리고

레닌-안지오텐신-알도스테론계(renin-angiotensin-aldosterone system: RAAS)의 활

성화가 관여하는 것으로 보인다.

① 비만 고혈압에서의 렙틴의 역할

지방조직에서 유래된 호르몬인 렙틴이 비만과 관련된 고혈압 발현에 중요역할을

하는 것으로 확인되고 있다. 즉 지방조직에서 분비되는 렙틴은 뇌의 시상하부에

작용하여 식욕을 억제하도록 하고 체열 발산을 조장하여 체중을 조절하려고 하며

SNS도 항진시켜 혈압이 상승하게 된다. 이는 체중 증가로 혈압이 상승된 사람들에

게서 혈액내의 norepinephrine과 함께 렙틴도 많이 증가되었다는 사실과 비만하

나 정상 혈압을 가진 환자에 비해 비만과 고혈압이 함께 동반된 환자에서 혈장

norepinephrine과 렙틴이 증가되어 있었다는 연구 결과도 이를 뒷받침하고 있다.

동물실험에서도 렙틴을 뇌에 주입하였을 때 동맥압과 혈관의 저항이 증가되었으

며 또 다른 실험에서는 혈관에 직접 주입함으로서 혈압 및 맥박수를 증가시켰다는

보고도 있다. 그러나 렙틴이 nitric oxide(NO)의 형성을 자극하여 혈관확장효과

가 일어나면서 혈압을 강하시킨다는 연구 결과도 있어 비만한 사람에서 많이 분비

되는 렙틴이 혈압에 어떤 영향을 주는지는 아직도 잘 알려져 있지 않다. 즉 지방세

포에서 분비되는 렙틴은 SNS를 항진시켜 혈압을 상승시킬 수도 있고 반대로 NO 생

성을 통하여 혈압을 강하시킬 수도 있는 양면성을 가지고 있는 것으로 보이며 이

에 대한 최종 반응은 교감신경 반응의 저항성의 정도 그리고 내피세포기능 이상의

정도에 따라 결정되리라고 생각된다. 그러나 내피기능의 손상이 있을 것으로 보이

는 대부분의 환자에서는 렙틴에 의한 NO 생성능력은 제한될 것으로 보여 결국 렙

틴은 SNS 활성을 통한 혈압상승을 유발할 가능성이 높다고 생각된다. (이귀녕 et

al. 2000; 최웅환, 2002; 김미정 et al. 2003; 손수진 et al 2002; 손수진 et al.

2003; 이근미, 1998; 최웅환, 1997; Park H. S. et al. 2001;. Bobbioni Harsch

et al. 1999; Yuzo Ninomiya. et al. 2002; Marvri A. et al. 2001)

② 비만 고혈압에서의 유리지방산의 역할

지방세포에서 분비되는 유리 지방산(free fatty acid FFA) 혹은 비 에스터화된 지

방산(nonesterified fatty acid NEFA)은 금식 시에는 catecholamine에 의해 자극

되어 분비되며 식사후에 지방세포에서 NEFA가 유리되어 나오는 상황을 억제하는

데에는 인슐린이 가장 중요한 역할을 한다. 그러나 비만과 동반된 고혈압 환자는

대부분 인슐린 저항성이 있는 상태로 이러한 인슐린의 작용이 원활하지 못하여 복

부 내장지방조직으로부터 NEFA의 분비가 증가하게 된다. 이러한 NEFA는 alpha

1-adrenergic agonist로서의 역할을 통해 혈관을 수축시켜 혈압을 상승시킨다.

또한 NEFA는 내피 의존적인 NO의 생성을 현저히 감소시켜 혈압상승이 조장될 수

있다.

③ 지방조직과 RAS

레닌- 안지오텐신계(renin-angiotensin system RAS)도 지방조직과 관련이 있어

aldosterone 생산과 혈압조절에 관여되는 RAS의 첫 단계 물질로서 그리고

angiotensin 1의 전구물질인 angiotensinogen은 주로 간에서 생산되는 것으로 알

려져 있지만 지방세포에서도 생산되고 또 생리적으로 조절된다는 사실이 확인되

었다. 또한 angiotensin II는 잘 알려진 혈압상승 호르몬으로서 혈장 외에 지방조

직이 이 물질의 중요한 말초 생산 장소이다. 이 외에도 RAS의 속도조절 효소인

renin 및 angiotensin-converting enzyme도 인간의 지방 조직에 잘 국한하여 발현

된다. 이러한 angiotensin II의 생성에 관련되는 물질 이외에 angiotensin II

receptor 도 지방조직에 발현된다.

④ Natriuretic peptide와 비만 고혈압

비만환자는 atrial natriuetic peptide(ANP)에 반응이 저하되어 있다고 알려져

있으며 체중이 감소되면 ANP에 대한 반응도 항진되어 혈압의 감소와 natriuresis

도 증가된다. 이러한 비만환자에서의 ANP 반응의 감소는 이뇨, 혈관 확장 작용의

감소와 함께 SNS 및 RAS의 억제가 잘 이루어지지 않으면서 고혈압이 발현될 가능

성을 더 높인다고 생각된다.

동물 및 사람의 지방세포에서 natriuretic peptide의 수용체로서 A형(NPr-A)과

청소 수용체로 C형(NPe-C)이 알려져 있다. 비만형 고혈압 환자의 지방세포에는

NPr-C 유전자 발현이 항진되어 있어 natriuretic peptide의 natriuresis와 혈관

확장 효과가 감소되며 결국은 혈압을 상승시키는 방향으로 작용하게 된다. 또한

체중감소나 식이 조절을 잘 하면 지방세포 NPr-C의 하향 조절로 염분의

natriuresis도 항진되면서 혈압도 하강하는 것으로 생각된다.

고지혈증(Hypertriglyceridemia)

비만한 사람들 중에는 지단백대사의 이상으로 고지혈증이 많으며, 이들은 혈중 중성

지방과 LDL-apoB가 높으며, HDL-콜레스테롤이 낮아 심혈관질환의 중요 원인이 되고

있다. 고중성지방혈증은 포도당 글리세롤과 지방산이 간으로 유입되는 것이 증가하

는 것과 비만에서 보이는 고인슐린 혈증으로 인해 간에서 초저밀도 지단백의 생성이

증가하는 것이 원인이다. 인슐린 저항성이란 포도당 대사에 대한 인슐린 작용이 감소

된 상태를 말한다. 인슐린은 간에서 포도당 생성을 억제하여 말초조직의 포도당 이용

을 증가시킨다. 인슐린 저항성은 간의 포도당 생성 억제 장애와 말초조직의 포도당

이용감소로 나타난다. 지방세포에 지방이 축적되는 것은 중성지방을 합성하고 분해

하는 과정에 의해 결정된다. 음식에 포함된 중성지방은 소장에서 흡수되어 카일로 마

이크론의 형태로 혈액으로 순환되는데 혈관 내피세포에 있는 지단백리파제(LPL

lipoprotein lipase)에 의해 가수분해되어 유리지방산과 글리세롤로 분해된 후 지방

세포로 이동된 후 다시 중성지방으로 합성되어 저장된다. 간에 있는 지방산에서 초저

밀도지단백이 생성되는데 이는 주로 중성지방으로 이루어져 있다. VLDL은 지단백리

파제의 작용으로 IDL과 LDL로 가수분해 된 후 LDL 수용체를 통해 제거된다. 지질대사

에는 LPL이 중요하며 비만과 함께 동반되는 인슐린 저항성에 의해 이 효소의 작용이

억제되어 지질대사에 이상이 초래된다.

인슐린 저항성으로 나타나는 고지혈증은 지방세포에서 인슐린의 작용이 억제되는 것

에서 시작된다. 지방세포에 축적되어 있는 중성지방의 분해가 증가되어 혈중 유리지

방산의 농도가 증가하고 간으로 지방산의 유입이 증가하여 VLDL의 생성이 증가하게

된다. 또한 지방산의 증가는 LDL이 생성되는 과정에서 중성지방의 함량이 높은 LDL이

만들어지게 된다. 인슐린의 작용저하로 LDL에 포함되어 있는 중성지방은 쉽게 가수분

해되어 small dense LDL로 변하게 된다. 이 작고 조밀한 LDL은 동맥경화증의 발생이

훨씬 높다. 왜냐하면 이러한 LDL은 산화과정이 쉽게 일어나 oxidized LDL로 변하기

때문이다.

HDL은 chylomicron과 VLDL 대사중에 생성되는데 각 지단백의 중성지방과 콜레스테롤

의 교환을 통해 콜레스테롤을 처리하는데 비만에서는 인슐린 저항성이 있어 이러한

교환이 감소되어 HDL이 감소된다. 체중감소 후에는 높았던 혈장 중성지방이 감소하는

경향이 있고 이 변화는 고인슐린혈증을 감소시킬 수 있다.

이러한 대사이상은 복부 비만이 있을 때 흔히 나타나는데, 복부에 지방이 많으면 피

하지방에 비해 쉽게 지방산으로 분해되고 간문맥을 통해 간으로 유입된다. 또한 지방

산의 증가는 근육에서 인슐린 저항성을 증가시켜 고지혈이 발생한다. 또한 상반신 비

만자는 인슐린 저항성을 보여 고인슐린 혈증이 나타나며 이로 인해 고중성지방혈증이

된다. 또한 혈중에 VLDL 농도는 높아지고 HDL은 낮아진다. VLDL 중의 중성지방은 곧

분해 유리되어 말초조직에서 연소되어 에너지원이 되거나 지방조직에 저장, 축적된

다.(이가영. et al. 2002; 박혜순. et al. 1992)

뇌졸중

일본에서는 체질량지수가 30이상인 인구집단에서 뇌혈관질환이나 사망률이 증가하고

있으며, 제 2형 당뇨병, 고혈압, 그리고 고지혈증과 같은 동반 질환이 있는 경우에는

체질량지수가 25-29.9 범위에 있더라도 뇌졸중 유병률이 증가하는 것으로 보고되고

있다.

여성 생식기계 이상

비만은 다낭성 난소 증후군, 불임, 월경이상 등과 같은 부인과 질환과 연관되어 있

고, 출산 시의 건강상의 문제와 태아 이상과도 연관되어 있으며, 이러한 위험 증가는

성인기에 비만해진 경우뿐만 아니라 소아기나 청소년기에 비만해진 경우와도 독립적

으로 연관되어 있고, 복부 비만은 안드로겐의 영향을 증가시키므로 월경이상과 불임

의 중요한 원인이 된다.

호흡기능

비만은 호흡기능에 부정적인 영향을 미치고 호흡기계 증상의 위험을 높이는 것으로

알려져 있다. 비만한 남녀에서 수면무호흡증은 흔하며 특히 복부 비만과 목 크기가

폐색성 수면무호흡증과 연관되어 있는데, 이것은 누운 자세에서 상기도가 좁아지기

때문이며, 심한 경우에는 급사를 초래할 수도 있다. 비만과 연관된 다른 호흡기계 이

상으로는 폐성 고혈압, 수술 후 위험 증가 등이 있다.

근골격계 이상

요통 위험의 증가가 비만, 특히 비만한 여성에서 관찰되고, 요통은 신체활동량 저하

를 초래하여 비만도를 증가시킬 수 있으며, 역으로 비만이 척추에 기계적인 부담을

늘려 요통의 위험을 증가시킬 수도 있으며, 이로 인해 이에 따라 걸음걸이가 변하여

척추의 충격 흡수 효율을 떨어뜨리면서 척추에 부담을 증가시킬 수 있다. 일반적으로

근골격계 이상은 비만하거나 노년 인구에서 더 흔하다.

통풍

확실한 원인은 알 수 없으나 체중이 증가함에 따라 요산이 증가 축적하여 통풍을 초래

한다. 특히 복부비만에서 발현이 많다. 비만에서는 케톤체나 유산의 증가에 의해 신

장에서 요산 배설이 저하될 가능성도 생각할 수 있으며 비만 자체에 의해 핵산대사가

항진되고 내장기능의 변화 혈액 순환 변화 등도 요산치에 영향을 준다고 생각된다.

암

북미암학회에서 75만 명을 대상으로 실시한 전향적 연구에 따르면, 비만한 사람의 암

의 상대위험도는 남성 1.33, 여성 1.55이었고, 비만과 연관된 초과 암 사망률은 남성

의 경우 대장결장암, 여성의 경우 담낭, 담도, 유방, 자궁경부, 자궁내막, 자궁체부,

난소의 암에서 주로 나타났다.

유방암과 자궁암의 발생률은 마른 여성보다 비만 여성이 2-3배 더 높은데, 이 높은

발생률은 폐경에 의한 에스트로겐 생성 감소에 기인하는 것 같다. 또한 비만 여성의

경우 담낭과 담즙체계의 암 발생률이 높고 남성의 경우 결장, 직장, 전립선암으로 인

한 높은 사망률을 보이나 그 원인은 밝혀지지 않았다.

간 담도계 질환

비만한 사람은 지방간의 발생이 많으며, 체지방이 증가하면 지방조직에 축적된 콜레

스테롤 양도 증가하게 된다. 따라서 콜레스테롤 대사율이 항진되므로 콜레스테롤의

담즙 분비 증가를 가져와 담즙 내의 콜레스테롤 농도가 높아져 담석(콜레스테롤결석)

형성이 촉진된다. (정민영. 1992; 이흥규, 1992)

사회적 문제

서구 국가에서 비만한 사람은 종종 차별과 불이익을 받게 되며, 이러한 현상은 특히

여성과 어린이에서 흔하다.

가) 사회적 편견 그리고 차별

많은 산업화 사회에서 비만은 바람직하지 않은 외모로 인식되며, 차별 받기 쉬운 신

체적 상태이다. 대규모 조사 결과를 분석해보면, 비만한 아이들은 그렇지 않은 친구

들에 비해 최종 학력이 더 낮고, 명문 학교에 덜 가며, 원하는 직장을 잘 못 얻는 경

향이 있으며, 더욱이 영국과 미국의 비만한 젊은 여성은 비만하지 않은 젊은 여성이

나 다른 건강상의 문제를 가진 여성들에 비해 소득이 의미 있게 적은 경향이 있다.

나) 심리적 영향

이 부분에 대한 연구는 일관된 결론을 내지 못한 상태이다. 표준 심리검사의 점수를

보면 비만한 사람과 비만하지 않은 사람 사이에 차이가 거의 없으나 비만한 사람들이

강한 문화적 차별을 받고 부정적인 대우를 받는다는 연구 결과들도 많이 있다.

다) 체형 불만족

비만한 사람들은 신체 이미지가 바뀌어 자신들의 신체를 부정적으로 보고 다른 사람

들이 자신들을 사회적으로 격리하려 한다고 믿고 있으며, 이러한 경향은 비만이 드문

중상위 사회경제적 수준에 속해있는 젊은 여성들과 어릴 때부터 비만했던 사람에서

흔하다.

2. 비만 관련 biomarker

비만에 관한 많은 연구가 수행되면서 다양한 바이오마커가 제시되고 있다. 여기서는

현재의 지식으로 보편적으로 인정되는 지표와 연구가 활발히 진행 중인 지표로 구분,

정리하였다.

(1) 현재 보편적으로 인정되고 있는 지표

가. 체질량지수(Body Mass Index; BMI) 측정

체질량 지수는 키와 체중을 이용하여 비만의 정도를 평가하는 방법 중 하나로서, 체

중(㎏)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값(BMI= ㎏/㎡)이다. 체질량지수는 질병의 이환

율 및 사망률의 상대 위험도를 반영한다. 즉, BMI가 높을수록 심혈관질환, 암 발생

위험이 높고 조기 사망 가능성이 높아진다. WHO에서는 과체중(overweight)을 체질

량지수 25-29.9㎏/㎡, 비만(obesity)을 체질량지수 ≥ 30㎏/㎡로 정의한다.(대한비

만학회. 임상비만학. 2001; 대한비만학회. 임상비만학의 최신지견 대사증후군.

2002; 이귀녕, 2000; 최웅환, 2002; 한정미.et al. 2001; 정민영, 1992; 이흥규,

1992; 조민자 et al. 2000; 이광우, 1992; 김영설 et al. 1992)

나. 허리둘레 측정

허리둘레는 복부 지방량을 반영하는 아주 유용한 지표이다. 허리둘레는 체질량지수보

다 질병발생 위험을 더 잘 반영하며, 특히 체질량지수가 25 ㎏/㎡ 미만인 경우에도

허리둘레가 크면 제2형 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 관상동맥 질환 등의 질병 발생 위

험이 높아지는 것으로 밝혀져 있다.

허리둘레는 줄자로 쉽게 측정할 수 있지만 측정하는 해부학적 부위는 정의에 따라 차

이가 있을 수 있다. 흔히 추천되는 부위로는 허리의 가장 가는 부위를 재거나 10번째

늑골 하단을 재는 것이다.

허리둘레는 성별, 연령별, 인종별 차이가 크다고 한다. WHO는 유럽에서의 연구 결과

를 근거로 남자의 경우 102㎝ (40 inch), 여자의 경우 88㎝ (35 inch) 이상을 복부

비만의 기준으로 제시하고 있으나, 국내 연구 결과를 보면 체격이 서구 사람들보다

작은 한국인에서는 남자 90㎝, 여자 80㎝ 이상으로 정하는 것이 타당하다.(대한비만

학회. 임상비만학. 2001; 대한비만학회. 임상비만학의 최신지견 대사증후군. 2002;

이귀녕, 2000; 최웅환, 2002; 한정미.et al. 2001; 이가영. et al. 2002; 박혜순 et

al. 1992; 정민영, 1992; 이흥규, 1992; 조민자 et al. 2000; 이광우, 1992; 김영설

et al. 1992)

다. 체지방 측정

체지방은 전체 체중에서 지방 무게가 차지하는 백분율(%)로 나타내며, 정상치는 성인

남자의 경우 15-18%, 여자의 경우 20-25%이다. 체지방률이 남자의 경우 25%이상, 여

자의 경우 30%이상인 경우 비만으로 판정한다. 체지방을 직접적으로 측정하는 것이

불가능하므로 여러 가지 간접적인 측정법들이 이용되고 있다.

① 피부주름두께(Skinfold thickness) 측정법

피부 주름 두께 측정법은 피하지방의 두께를 측정하여 전체 체지방의 정도를 평가

하는 방법이다. 측정 도구로는 피부 주름 측정용 캘리퍼를 사용하는데 이 기구는

피부에 가해지는 압력이 일정하도록 만들어져 있다. 캘리퍼를 사용하여 이두박

근, 삼두박근, 견갑골 하부, 장골능 상부 4부위의 피부 두께를 측정하고 이를 더

한 수치를 회귀 식으로 만든 표에 적용하여 연령에 따른 체지방률을 산출한다. 이

방법은 비용이 저렴하고 측정이 쉽다는 장점이 있으나 잘 훈련된 측정자가 아닐

경우 측정 오차가 상당히 클 수 있다. 또한 사람에 따라 지방의 분포가 다르기 때

문에 그 정확도가 떨어질 수 있으며, 비만 관련 만성 질환들과 밀접한 관련이 있는

내장 지방을 반영하지 못한다는 제한점이 있다.

② 생체전기저항 분석법(Bioelectric impedance analysis)

이 방법은 앞서의 신체계측에 의한 방법보다도 체내 지방량, 제지방량(fat-free

mass), 수분량을 더 정확하게 측정하는 간단하고 안전한 방법 중 하나이다. 상지

와 하지에 표면 전극을 붙여 전기 저항을 측정하게 되는데, 일반적으로 지방조직

은 전류가 잘 흐르지 않고 지방을 제외한 기타 조직은 전류가 잘 흐르기 때문에,

전기 저항과 체지방량 사이에는 높은 양의 상관관계가 나타나게 되는 것이다. 대

부분의 생체전기저항 분석기에는 성, 연령, 인종에 따른 계산공식이 입력되어 있

으며, 최근 국산화가 이루어져 한국인의 신체계측자료를 바탕으로 한 공식이 이용

되고 있다. 그러나 이 방법 역시 비만 정도가 아주 심한 환자에게는 정확도가 떨어

지며, 재현성(repeatability)이 낮다는 단점이 있다.

그밖에 체지방을 측정하는 방법으로 수중체중 측정법, 체내 총수분량 측정법, 체

내 총칼륨 측정법, DEXA(Dual-Energy X-ray Absorptiometry)등이 있으나 비용이

많이 들고 임상에서 쉽게 이용하기 어려워 주로 연구 목적으로 사용되고 있다.(대

한비만학회. 임상비만학. 2001; 대한비만학회. 임상비만학의 최신지견 대사증후

군. 2002; 이귀녕 et al. 2000; 최웅환, 2002; 한정미 et al. 2001)

(2) 현재 연구 중인 지표

가. 혈중 leptin 농도 측정

렙틴(Leptin)은 지방세포의 ob 유전자 특이 단백산물로 시상하부로 체내에너지 저장

정도를 전달하는 구심성 포만신호로 작용하여 식욕을 감소시키고 열량소모를 증가시

켜 에너지 항상성을 유지하여 체중조절에 밀접한 관계가 있으며, 비만을 조절할 수

있는 여러 가능성이 있는 지표이다. 렙틴은 시상하부에 있는 렙틴 수용체와 결합하여

작용하는데 수용체 결합 후 작용은 두 가지 경로를 가진다. 공복시에는 NPY/Y5 수용

체를 통하여, 섭식 후에는 MSH/MC4 수용체를 통하여 에너지 소비와 식욕을 조절한다.

실험에 의하면 렙틴은 비만한 사람에게서 혈중 농도가 높았으며, 복부 피하지방과 아

주 유의한 상관이 있다고 보고하고 있다. 그러므로 혈중 렙틴은 체지방량의 변화를

나타내는 지표로 사용할 수 있다.

측정방법; 공복상태에서 혈액을 채취하여 3000rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청

을 얻은 후 혈중 leptin 농도 측정용 kit(Human leptin RIA kit, LINCO Research,

INC)를 사용하여 radioimmunoassay(RIA) 방법으로 측정한다(11-12,14-22).(이귀녕 et

al. 2000; 최웅환, 2002; 김미정 et al. 2003; 손수진 et al. 2002; 손수진 et al.

2003; 이근미, 1998; 최웅환, 1997; Park H. S. et al. 2001; Bobbioni Harsch et

al. 1999; Yuzo Ninomiya et al. 2002; Marvri A. et al. 2001)

나. Ob-gene의 유전자 다형성 검사(Ob-gene receptor의 Gln223Arg polymorphism)

DNA를 전혈에서 뽑아 RCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)으로

Ob-gene 유전자의 Gln223Arg 변이다형성을 관찰하면 Gln223Arg 변이를 가진 사람은

이형접합체(G/A), 동형접합체(A/A), 동형접합체(G/G)로 분류되며, Ob-gene 유전자

변이에 따른 혈청지질조성의 차이를 보이며 leptin 농도에도 차이를 보였다. G/G

genotype은 G/A genotype과 A/A genotype에 비하여 체질량 지수, 체지방량이 증가되

었다고 보고하고 있다.

측정방법 : 전혈에서 DNA 뽑아 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length

Polymorphism)로 검사한다.(김소혜 et al. 2000; Simin Liu et al. 2002)

다. C- 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)

감염성 혹은 비감염성 염증 반응, 세포 및 조직대사의 비특이적 반응으로 증가하는

급성 반응상 물질(acute phase reactant)로 이를 이용해 각종 염증반응 및 질병의 활

성도를 측정하는 지표로 이용되고 있다. CRP가 증가할수록 정상인에서는 심근경색,

협심증의 위험도가 증가하며 불안정 협심증, 심근경색 환자에서 사망률 증가와도 연

관되어 심혈관질환에서 독립적인 위험인자이다. 최근 연구에서 보면 인간의 지방세

포는 단순히 지방 축적의 기능만 하는 것이 아니라 tumor necrosis factor,

proinflammatory cytokine interleukin-6를 분비함으로써 과도한 지방을 가진 사람

에서는 low grade systemic inflammation을 유도하여 염증지표인 CRP를 증가시킨다

고 한다. 비만에 의해 CRP수치가 증가되는 기전은 지방세포(adipocytes)에 의해

TNF-alpha가 생성되고 이로 인해 IL-6분비가 촉진되어 간에서의 CRP생성이 증가한

다. 생성된 IL-6는 간으로부터 응고인자의 합성을 촉진하고 간의 포도당 신생 및 중

성지방의 합성을 촉진하며 TNF-alpha는 지단백질 분해효소의 활성도를 억제하고 간

의 지방질신생을 자극한다고 알려져 있다. 한국인의 경우 체질량 지수 25.0㎏/㎡이상

부터 CRP증가 위험이 유의하게 높은 것으로 나타났으며 비만의 정도가 심할수록 CRP

증가 위험이 높았다. 그러므로 비만한 사람에서 low grade systemic inflammation

인 존재한다고 생각되며 서구인과는 다르게 체질량지수가 그다지 높지 않아도 복부비

만이 많은 한국인들에게서 비만을 판정하는 유의한 marker라고 생각된다.

검사방법 : CRP는 high sensitivity CRP로서 0.03㎎/㎗ 로부터 감지되며

Nephelometry법으로 검사한다.(김윤정 et al. 2003; Simin Liu et al. 2002)

라. Ghrelin

지금까지 발견된 여러 체내 식욕증가 물질보다 강력한 식욕증가 물질로 알려져 있다.

Ghrelin은 쥐의 말초를 통한 투여보다 뇌에 직접 투여되었을 때 음식섭취를 증가시켜

체중증가를 일으키고 지방의 사용을 감소시켜 체중을 증가시킨다.

Ghrelin은 위점막 세포에서 분비되어 시상하부에 작용하는 단백질이며 성장호르몬분

비 촉진제로 작용하므로 지방분포와 관련되어 비만증을 설명하는 물질로 연구되고 있

다. 즉 그렐린은 성장호르몬 분비에서 Growth hormone secretagogue(GSH)수용체 신

호계에 관여한다. Ghrelin 의 분비 조절기전은 잘 밝혀지지 않았으나 에너지 과잉이

급성(과식) 또는 만성으로 지속되면(비만) 혈중 ghrelin 치가 감소하며 공복시나 거

식증인 경우 증가한다. 실제 비만환자에서 혈중 ghrelin 치는 정상인에 비해 낮고 체

중감량시 증가하는 것은 비만환자에서 ghrelin이 하향조절 되어 있는 것으로 설명할

수 있으며, leptin 치와는 반비례를 나타낸다. 따라서 비만환자에서 혈중 GHS와 내인

성 리간드(endogenous ligand)인 ghrelin이 낮아 혈중 GH치의 감소를 일으켜 비만해

진다고 할 수 있다. 특히 ghrelin은 식욕 및 체지방 분포와 높은 관련이 있으며 복부

지방 내장량과 관계가 있다. 혈중 ghrelin은 BMI와 반비례하며 복부내장 지방량보다

전체 지방량이 더 높은 관련이 있다.

측정방법 : 혈중 ghrelin은 공복시 채혈하여 분리된 혈청에서 I-I-labelled

bioactive ghrelin을 이용하여 RIA법(Phoenix Pharmacuials, Belmont CA, USA)로

측정한다. (서영성 et al. 2002; 김은혁 et al. 2002)

마. 아디포넥틴

아디포넥틴은 3T3-L1이라는 지방세포주의 분화과정에서 mRNA의 cDNA 라이브러리로부

터 지방세포 complement C1q와 연관된 단백질로 규명되어 인간에서 주로 지방조직에

서 발현되고 혈중에는 약 0.01%가 순환한다. 아디포넥틴은 비만한 환자의 지방조직에

서 발현양이 감소하는 것으로 알려져 있다. 당대사보다는 동맥경화를 유발하는 혈관

기능으로 아디포넥틴이 혈관 내피세포에 접착을 억제시켜 혈관장애에 예방적 역할을

하여 비만에의 한 동맥경화의 한 원인으로 설명할 수 있으며, 실제 혈중 아디포넥틴

의 감소가 당뇨병성 대혈관 합병증의 표식자로 이용될 수 있다.

측정방법 : 혈중 adponectin은 RIA(Radio-Immuno-Assay, Commercial kit)법에

의해 측정한다.(이가영 et al. 2002; Wei-Shiung Yang et al. 2002; Rerresa T Fung

et al. 2001; Wei Shiung Yang et al. 2001; Wei Shiung Yang et al. 2002;

Gabriella Milan et al., 2002)

바. β ₃-아드레날린 수용체

주로 갈색 지방세포에 분포하며 카테콜아민에 반응하여 지방분해와 열생성에 관여한

다. 갈색 지방세포는 주로 내장지방에 관여하는데 인슐린 저항성과 연관이 있다. 베

타3-아드레날린 수용체가 갈색지방세포뿐만 아니라 일반 지방세포에도 분포함이 알

려지고 있어 지방세포의 크기나 분포 및 렙틴분비에 관여할 것으로 생각되고 있다.

그러므로 베타3-아드레날린 수용체의 감소는 열생성의 감소와 함께 지방세포의 기능

에도 영향을 미쳐 비만을 야기 시킬 수 있다.(이흥규, 1992)

사. Uncoupling protein 유전자

Uncoupling protein(UCP)은 미토콘드리아 내막에 존재하며 열생성에 관여하는 단백

질로 알려져 있다. 여러 종류의 UCP, UCP1(갈색지방조직), UCP2(다양한 조직), UCP3

(주로 골격근)가 보고 되어 있으며 UCP 유전자 변이가 열생성과 관련하여 비만의 원

인 유전자일 가능성이 있다. 비만한 쥐에 유전자 조작으로 UCP를 많이 발현시

키면 체중이 감소하고 피하지방의 감소가 나타난다.(정민영, 1992; 이광우, 1992)

아. Insulin receptor substrate-1 유전자

비만이 인슐린 저항성과 함께 표현되는 점을 고려하면 인슐린의 작용에 관여하는

IRS-1 유전자의 결함이 비만과 연관이 있으리라 여겨진다.(Joyce B Harp et al.

2002; Joyce B. Harp, 2002)

자. Peroxisome proliferator activated receptors(PPARs)

퍼르옥시솜은 진핵생물의 세포내에 공포모양으로 존재하는 미세기관으로서 산화작용

에 관여한다. 퍼르옥시솜 증식제(peroxisome proliferator)는 퍼르옥시솜의 수를 증

가시킬 수 있는 화합물 총칭하는 명칭이며, 지방과 지방산, 고지혈증 치료제인 피브

레이트, 프로스타글란딘 등이 이에 속한다.

이러한 퍼르옥시솜 증식제를 리간드(연결물질, ligand)로 하는 핵내 수용체가 발견

되었고 이를 총칭하여 PPARs이라 하며, α ,δ ,γ 의 세 종류가 있다. PPARγ 는 지방세

포의 분화에 관여하며 비만의 원인 유전자로 알려져 있다.(정민영, 1992; 이광우,

1992; 김영설 et al. 1992)

차. Renin- Angiotensin

지방조직에서 발현되는 angiotensin II는 영양상태에 의해 조절되어 공복시 감소되

고 식사 후 증가되는 것으로 알려져 있다. 이런 angiotensin II는 지방세포 분화에

관여하며 원거리의 표적혈관에도 작용하여 혈압조직과 심혈관반응을 조절하게 된다.

그러므로 비만한 환자에서의 심혈관 질환의 한 요소로 작용할 수 있다.(Wei Shiung

Yang et al. 2002; Gabriella Milan et al. 2002)

타. TNF-alpha

TNF-alpha는 초기 대식세포에서 규명되어 인슐린 저항성, 식욕감퇴 및 체중감소를 초

래하는 것으로 알려졌다. 이후 인간의 지방조직에서 TNF-alpha가 발현되고 특히 피하

지방보다 내장지방에서 더 많이 발현되고 지방의 양에 의존적으로 그 발현량이 증가

되는 것으로 알려져 있다. TNF-alpha 는 lipoprotein(LPL)을 억제시키고 지방세포 분

화에 중요한 대표적 지방전사 조절인자인 C/EBP alpha와 PPARr를 억제시켜 지방세포

특이단백질인 LPL, aP2, fatty acid synthetase, GPDH 및 GLUT4 등을 하향조절 시킨

다. 최근 연구에서 TNF-alpha 투여 후 혈중 중성지방이 증가되며 이 결과 간조직에서

lipogenesis 가 촉진되어 간 조직에서 인슐린 민감도를 감소시켜 인슐린 저항성을

초래시킨다.(이가영 et al.2002; 박혜순 et al 1992; 정민영, 1992; 이흥규, 1992;

김영설 et al. 1992; Hotamisligil GS, 1999; Schreyer SA et al. 1998)

파. Resistin

레지스틴은 750개의 염기를 갖는 mRNA로 유일하게 지방조직에서만 발현되며, 인간의

혈중을 순환하여 공복시 감소되고 식사후에는 증가 된다는 보고가 있다. 이는 영양상

태에 따라 레지스틴이 영향을 받는 것을 의미하며 비만한 동물에서는 레지스틴이 증

가한다고 한다. 레지스틴은 PPARr(peroxisome proliferator activated receptor-r)

를 통한 지방세포 분화를 조절하는 기능을 갖고 있다. 지방조직으로부터 RNA 추출하

여 Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)에 의해 mRNA양을 측

정한다. (Claire M Steppan et al. 2001)

하. Agouti 단백

Agouti단백은 정상적으로 모근에서만 분비되는 것으로 alpha-MSH가 melanocortin-4

수용체에 결합하는 것을 방해하고 eumelanin의 생성을 촉진한다. 모근에서만 발현되

어야 하는 agouti 단백이 과도하게 발현되는 유전변이가 있다. 이 경우 시상하부에서

는 agouti 단백이 고농도로 나타나고 이 결과로 증가된 agouti 단백이 사상하부에서

alpha-MSH와 melanocortin-1수용체의 결합을 방해하여 비만이 유발된다. serum에서

AGRP 측정한다.(Shen C P et al. 2002)

Table 1. 비만의 biomarker

현재 보편적으로 인정되고 있는 지표

Biomarker 방법

체질량지수(BMI)- 키와 체중을 이용하여 비만정도 평가

- 비만을 가장 쉽게 판단

허리둘레 측정- 복부지방량을 반영하는 유용한 지표로 질병발생 위험을 반영

- 비만을 쉽게 판단

체지방측정

피부주름두께

생체전기저항분석법

- 피하지방두께를 캘리퍼로 측정

- 지방조직은 전류가 잘 흐르지 않는 성질을 이용하여 체지방량

측정

현재 연구 중인 지표

Biomarker 방법

Leptin

- 지방세포의 ob 유전자 특이 단백산물로 에너지 항상성 유지

- 렙틴의 분비가 적거나 렙틴 수용체에 이상이 있는 경우 비만이

유발

Ob-gene의 유전자 다형성

검사

- Gln223Arg 변이를 가진 사람은 혈중 지질농도, leptin 농도가 높

고 비만인 경우가 많음

C-반응성단백- 감염시 나타나는 조직대사의 비특이적 반응으로 나타나는 급성

반응성 물질

Ghrelin

- 음식섭취와 체내 영양상태에 대한 신호를 시상하부에 전달하며,

성장호르몬 분비 촉진

- 비만환자는 혈중 성장호르몬 수용체 신호체계의 내인성 리간드

인 ghrelin이 낮아 비만유발

Ghrelin

- 음식섭취와 체내 영양상태에 대한 신호를 시상하부에 전달하며,

성장호르몬 분비 촉진

- 비만환자는 혈중 성장호르몬 수용체 신호체계의 내인성 리간드

인 ghrelin이 낮아 비만유발

adiponectin

- 지방조직에서 발현되고 혈중을 순환하는 단백질

- 혈관내피세포에 단핵구 접착을 억제시켜 혈관장애에 예방역할을

하는데 비만환자에서는 발현량이 감소됨

베타3- 아드레날린수용체

- 갈색지방세포에 분포하며 카테콜아민에 반응하여 지방분해와 열

생성에 관여

- 베타3- 아드레날린 수용체 감소는 열생성을 감소시키고 지방세

포 기능에 영향을 미쳐 비만 야기

Uncoupling protein

유전자(UCP)

- Uncoupling protein(UCP)은 미토콘드리아 내막에 존재하며 열생

성에 관여하는 단백질

Peroxisome proliferator

activated receptor(PPARs)

- Peroxisome proliferator를 리간드로 하는 수용체로 지방세포의

분화에 관여하며 비만유전자로 알려져 있음

Renin-Angiotensin

- 지방조직에서 발현되며 영양상태에 의해 조절되며 지방세 포

분화에 관여

- 비만환자에서 심혈관 질환의 한 요소로 작용

Coagulation 및

Complemente factors

- 비만에 의해 변화된 PAI-1 단백질은 응고와 피브린 분해 경로에

작용하여 심혈관 질환 유발, 지방조직에서 많이 합성되며 혈중

PAI-1이 내장지방 증가와 비례하여 증가

TNF-alpha- 지방조직 특히 내장지방에서 더 많이 발현되고 지방의 양에 의존

적으로 발현 증가

Resistin- 지방조직에서만 발현되어 인슐린 저항성을 유도하며 비만환자에

서는 혈중 농도가 증가

Agouti-related 단백(AGRP)

- 모근에서만 분비되는 것으로 alpha-MSH가 melanocortin-4 수용

체에 결합하는 것을 방해하고 eumelanin의 생성을 촉진하는데,

이것이 agouti 단백이 과도하게 발현하면 시상하부에서

alpha-MSH와 melanocortin-1 수용체의 결합을 방해하여 비만유발

3. 비만 및 다이어트 관련 시험방법

다이어트 관련기능을 평가하기 위하여 생체외 시험, 동물실험, 인체시험에서 주로 사

용되는 방법은 다음과 같다. 각 방법별 재현성, 정확성, 장단점을 비교, 제시하였다.

(1) 생체외 실험

가. 지방세포 배양 방법

전지방세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포가 지방세포의 대사과정을 연구하는데 널리

이용되고 있다. 본 세포의 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방축적이 활발하여 비

만을 유도하게 된다. 항비만 효과를 가질 것으로 생각되는 물질을 본 세포에 처리한

후 세포의 분화가 적을수록 항비만 효과가 크다고 볼 수 있다.

① 3T3-L1 세포를 배양액을 이용하여 5%로 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 온도는

37℃로 배양한다.

② 세포 배양액은 10% fetal bovine serum(FBS)과 항생제(antibiotics)가 포함된

Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)을 사용한다.

③ 2-3 일 간격으로 배양세포 포면을 인산완충염용액 (phosphate buffered saline,

PBS)으로 세척한 후 0.5% 트립신(trypsin)을 넣고 처리하여 세포를 탈착시켜 계대

배양한다.

④ 세포를 개별 실험에 사용할 때는 분화유도물질인 인슐린 (5 ㎍/㎖), dexame-

thasone (DEX, 0.25uM), 1-methyl-3-methylxanthine (MIX, 0.5mM) 이 함유된 분

화유도 배양액으로 교환하여 1-3일간 배양하여 지방세포로 분화를 유도한다. 배

양 3일 후 인슐린만 함유하는 배지로 2-3일간 배양한 후 인슐린을 제거한 배양액

으로 바꾼다.

⑤ 중성지방으로 유입되는 포도당 측정 실험이나 포도당 산화 실험시에는 10-12일 째

에 저농도 (5mM) 포도당을 함유한 배양액으로 배양한다.

⑥ 항비만효과 물질 처리는 분화유도 전 혹은 분화유도 후에 처리한다.

나. 지방세포 분화 측정

세포의 형태 관찰

① 전지방세포 (preadipocyte)인 3T3-L1 세포는 10-15일간 배양하면 50-70 %이상의

세포가 분화되어 성숙된 지방세포로 변한다.

② 이때 세포의 형태 (morphology)를 관찰하여 세포 모양이 둥글어지고 세포질

(cytoplasm)이 지방으로 꽉 찬 정도를 광학현미경으로 관찰한다.

※ 평가: 가장 간편하고 경제적인 방법이나 정확한 정량적 데이터가 아니다.

지방세포 수 측정

세포배양판 (plate)에 붙어있는 세포를 수습하여 현미경을 이용하여 헤마사이토미터

(hemacytometer)로 세포수를 측정한다.

※ 평가: 간편하고 경제적인 방법. 데이터 분석에서 기본적인 것만 얻을 수 있다.

Oil-Red-O 염색법

지방세포로 분화된 세포내의 지방을 염색하여 분화정도를 측정한다.

① 세포를 7 % 포름알데하이드 (formaldehyde)가 포함된 인산완충염용액으로 1시간

동안 고정시킨 후 PBS 로 세척한다.

② 세포를 1 % Oil-Red-O가 있는 99 % 이소프로판올 (isopropylalcohol) 액으로 10분

간 염색한다.

③ 세포질내 붉은색 과립이 있는 세포를 분화된 지방세포로 간주하고, 광학현미경으

로 관찰하면서 헤마사이토미터(hemacytometer)로 세포수를 측정한다.

④ 염색된 Oil-Red-O를 이소프로판올로 녹여내어 510 nm에서 흡광도를 측정하여 지방

세포의 분화정도를 측정한다.

※ 평가: 정확한 수치적 데이터를 얻을 수 있고 세포내 지방 함량 데이터를 동시에

얻을 수 있으므로 많이 이용한다.

참고문헌: Green H, Kehinde O, Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate

lipid. Cell, 1: 113-116, 1974

다. 세포내 비만관련 지질, 지단백질 및 호르몬 측정

Triglyceride 측정

혈중 및 간조직중의 중성지방은 commercial kit를 이용한 효소법으로 측정한다.

※ 평가: 간편하며 수치적인 데이터를 얻을 수 있어 많은 논문에서 이용한다.

Total lipid 측정

총지질함량은 sulfo-phospho-vanillin 방법에 기초한 kit을 이용하여 측정한다.


참고문헌: CS and Dunn RT. A colorimetric method for determination of total serum

lipid based on the sulfophospho-vanillin reaction. Am J Clin Path 53:

89-94, 1970

Total Cholesterol 측정

총콜레스테롤함량은 commercial kit을 이용하여 측정한다.


LDL-Cholesterol 측정

LDL-Cholesterol은 Friedewald 등에 의한 계산법으로 분석한다.

계산방법) LDL 콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤 - (중성지방/5)


참고문헌: Friedewald WT, Levy RI and Fedreison DS. Estimation of concentration

of low density lipoprotein cholesterol in plasma, without use the

prepatative ultracentrifuge. Clin Chem 18: 499-515, 1979

HDL-Cholesterol 측정

HDL-Cholesterol은 phosphotungstic acid-Mg 침전효소법에 기초한 commercial kit를

이용하여 분석한다.


Leptin 함량 측정

혈중 leptin 농도는 125I-labeled leptin RIA kit을 이용하여 Gamma Scintillation

Counter로 측정한다.


라. Lipogenesis와 Adipogenesis관련 효소 및 유전자 측정

ACS (acyl-CoA synthetase)

ACC (acetyl-CoA carboxylase)

Aconitase

- Northern blotting1)

세포나 조직에서 특이적 단백질의 암호코드인 RNA의 발현 정보를 보기 위한 방법이

다. 모든 단백질이 만들어지기 위해서는 우선 그 단백질의 유전자로부터 전령 RNA

가 만들어져야 한다. 이것을 전사라고 하며, northern blotting은 전사된 전령 RNA

의 크기와 양을 분석하는데 사용된다.

① 조직으로부터 총 RNA를 Trizol reagent를 이용하여 분리한다2).

② 총 RNA를 1.2% agarose-formaldehyde gel상에서 전기영동하여 분리한다음

nylon membrane에 옮긴다.

③ 검출하고자하는 cDNA 단편은 biotin labeling kit를 이용하여 biotin labelled

cDNA probe로 합성하고, nylon membrane과 42℃에서 18시간 혼성화시킨다.

④ BrightStarTM BioDetectTM kit을 이용하여 혼성화 후 결합되지 않은 probe를 제

거 한다.

⑤ CDP-star solutions으로 처리한 뒤 x-ray film에 노출시켜 (실온, 45min) mRNA

를 확인한다.

※ 평가: Northern blotting은 정확한 방법이지만 결과 얻기가 어렵고 방사성 원소를

사용할 경우 사용의 어려움이 있다.

- RT-PCR

세포내 발현된 RNA를 검출하고, 분석하는 방법으로 전사 RNA로부터 역전사 과정을

통하여 다루기 쉬운 DNA를 추출하여 염기 서열을 분석하거나 특정 RNA의 발현 유무

를 확인할 수 있다.

① 조직중의 50-100㎎을 취해 Trizol reagent를 이용하여 총 RNA를 추출한다2).

② 분광광도계를 이용하여 농도를 확인한다.

③ 유전자 각각의 cDNA 합성을 위하여 commercial RT-PCR kit와 검출하고자하는

DNA서열의 단편을 RT-PCR기기에 넣어 RT-PCR 반응을 실시한다.

④ 대조군으로 β -actin을 사용하며, 반응이 끝난 후 1.0 % agarose gel에 전기영

동 하여 검출된 cDNA 생성물을 확인한다.

※평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 비교적 적은량의 시료를 가지고도 데이터를

얻기가 쉽다.

참고문헌:

1) Mynatt RL, Park EA, Thorngate PE, Das HD, Cook GA. Changes in carnitine

palmitoyltranferase-I mRNA abundance produced by hyperthyroidism and

hypothyroidism parallel change in activity. Biochem Biophys Res Commun

201:932-937, 1994

2) Chomczynski P and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid

guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration. Anal Biochem 162:

156-159, 1987

LPL (lipoprotein lipiase)

지단백 지방분해효소는 혈중 지단백(주로 킬로마이크론과 초저비중지단백)으로부터

중성지방을 분해하는 효소로 비만 발생에 기여하는 주요한 요인이 된다.

- Nilsson-Ehle and Schotz법

① 분화된 지방세포에서 배양액을 제거하고 새로운 배양액에 헤파린 (100㎎/㎖) 첨

가 하여 24℃에서 45분간 반응시킨다(이 조건에서 90% 이상의 LPL 분해활성이

헤파린에 의해 유리된다).

② 헤파린 용출액에 시료를 100㎕ 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨다.

③ 3H-triolein을 100㎕ 첨가하고 아포단백 CⅡ의 급원으로 알부민과 사람의 혈청

을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시킨다

④ 유리되어 나온 3H-oleic acid를 유기용매로 용출하여 함량을 측정한다.

FAS (fatty acid synthease)

① 분화된 지방세포를 균질화하여 18,500×g에서 1시간 원심분리한다.

② 아세틸코에이(acetyl-CoA)와 ATP가 함유된 인산완충액에서 15분간 배양한다.

③ malonyl-coA를 첨가한 직후부터 NADPH 산화율을 흡광광도계로 측정한다.

※ 평가: 효소 활성 측정법은 정확한 방법이지만 방사성원소를 사용해야 하는 어려움

이 있다.

GPDH (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)활성 측정

GPDH는 세포분화의 지표가 되는 효소로 GPDH의 활성을 측정함으로써 지방세포의 분화

정도를 측정한다. GPDH 1 단위 (unit)은 1분 동안 0.01umole의 NADPH를 생성하는 효

소의 양으로 정의하고 효소의 활성은 단백질 1㎎에 해당하는 효소 단위로 나타낸다.

① 분화된 세포를 인산완충염용액으로 세척한 후 차가운 세포 용해액 (lysis

buffer) (0.25M 수크로오스, 1mN EDTA, 5mM tris-base, 1mM dithilthreitol)

을 첨가하고 얼음위에서 균질화한다.

② 균질액을 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리 한 후 상층액을 취하여 cytosol을

분리해낸다.

③ 상층액의 단백질 함량을 측정한다.

④ 1-5 µg의 단백질이 함유된 상층액을 상온에서 1㎖ 반응액에 넣고 340㎚에서 흡

광도를 측정한다.

⑤ 처음 1분은 10초 간격, 그 후 60분은 매 1분마다 흡광도를 측정하여 소비된 NADH

의 양을 측정함으로써 GPDH의 활성을 측정한다.

※ 평가: 비교적 간단하고 많이 이용되는 방법이며 효소 활성을 측정할 수 있어 정확

Lipolysis와 fatty acid oxidation관련 효소 및 유전자 측정

HSL (hormone sensitive lipase) : 호르몬 민감성 지방분해효소는 지방조직에서 중성

지방을 분해하는 단계에서 가장 중요한 효소이다.

① 분화된 지방세포를 균질화하여 10,000×g에서 45분간 원심분리한다.

② 상층액에서 cholesteryl-14C-oleate를 기질로 하여 측정한다.

CPT-I (carnitine palmitoyl transferase-I)

- 방법: Northern blotting1)



가 만들어져야 한다. 이것을 전사라고 하며, northern blotting은 전사된 전령

RNA의 크기와 양을 분석하는데 사용된다.


② 총 RNA를 1.2% agarose-formaldehyde gel상에서 전기영동하여 분리한 다음


③ 검출하고자 하는 cDNA 단편은 biotin labeling kit를 이용하여 biotin labelled

cDNA probe로 합성하고, nylon membrane과 42℃에서 18시간 혼성화 시킨다.


거한다.


를 확인한다.

- 방법: RT-PCR










※ 평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 비교적 적은양의 시료로도 데이터를 얻기가

쉽다.

- 방법: CPT-I 활성 측정

간세포의 미토콘드리아에서 CPT-I활성을 측정한다.

① 각 세포로부터의 미토콘드리아는 Johnson과 Lardy3)의 방법대로 sucrose

density 원심분리법으로 분리한다.

② Bremer4)의 동위원소를 이용한 분석방법에 따라 CPT-I 활성을 측정한다. 즉,

Cocktail·(I250 Imidazol 800mM, sucrose 2M, EGTA 0.1M, Antimycin A 1㎎/mL,

BSA 20%, KCl 1M)과 Cocktail II(L-carnitine 50mM, 3H-L-carnitine 1m Ci/mL)

을 준비한 후 다음의 순서대로 진행한다.

a. 시험관에 Cocktail I250와 Palmitoyl-CoA를 첨가한 후 시료의 효소(간의 미토

콘드리아 150㎍, 심장이나 근육의 미토콘드리아 10-25㎍)를 가하여 37℃ 항

온조에서 5분간 반응시킨다.

b. 다시 적당량의 Cocktail II를 가한 후 5분간 더 반응시킨 후 PCA를 가해 반응

을 중지시킨 후 냉장 보관한다.

c. 2000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 PCA를 가하여 마쇄 후

다시금 상등액을 제거하는 방법을 반복한다.

d. 증류수, saturated ammonium sulfate 및 n-butanol 혼합액을 가하고 잘 섞은

후 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 액상층과 butanol층을 분리한다.

e. butanol층 위의 층액을 잘 제거 후 동위원소 측정용 용기에 옮겨 5mL의

scintillation fluid를 가하여 동위원소를 측정하여 총단백질 당 CPT-I활성

으로 환산한다.

※ 평가: 실험방법상의 조절이 어려워 재현성이 낮다.

참고문헌:




201:932-937, 1994



156-159, 1987

3) Jhnson D and Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in

Enzymology 10: 94-96, 1967

4) Bremer J. The effect of fasting on the activity of liver carnitine

palmitoyltransferase and its inhibition by malonyl-CoA. Biochim biophys.

Acta 665: 628-631, 1983

UCPs (uncoupling proteins)

- 방법: Northern blotting





① 조직으로부터 총 RNA를 Trizol reagent를 이용하여 분리한다.






거한다.


를 확인한다.

- 방법: RT-PCR




① 조직중의 50-100㎎을 취해 Trizol reagent를 이용하여 총 RNA를 추출한다.






※ 평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 적은량의 시료에서도 데이터를 얻기가 쉽다.

참고문헌:




201:932-937, 1994



156-159, 1987

실험방법은 조작이 과학적이고, 얻어진 결과가 재현성이 있을 뿐 아니라 보편성이 풍

부하면서도 유효한 실험이어야 한다. 위 시험방법별 재현성, 정확성, 장점, 단점을

정리하면 (Table 2)와 같다.

Table 2. 생체외 시험의 시험방법별 재현성, 정확성, 장단점 비교표

재현성 정확성 장점 단점

1. 지방세포 분화 측정

① 세포형태 관찰 보통 낮음 경제적, 간편객관적 data

얻기어려움

② 지방세포수 측정 높음 보통 경제적, 간편, 척도가 되기 어려움

③ Oil-red-O 염색법 높음 보통정량적, 비교적

정확

세포내 전체

지방함량 측정에

어려움2. 세포내 비만관련 지질, 지단백질 및

호르몬 측정

① Triglyceride, total lipid 매우

높음높음 간편, 정량적

TCL 방법에 비해

Kit의 detection

limit이 높음

② Cholesterol (total choleterol,

LDL-cholesterol, HDL-cholesterol)높음 보통 간편, 정량적

TCL 방법에 비해

Kit의 detection

limit이 높음

③ Leptin 함량 높음 높음 간편, 정량적방사성 동위원소

사용3. Lipogenesis 와 adipogenesis관련

효소 측정

① 효소 활성 측정 높음 높음정량, 정확,

일반적

① 방법이 어려움

② 방사성 동위원소

사용

② 유전자 발현 측정

RT-PCR 보통 보통

적은량의 시료

로 데이터 얻기

쉬움

① 반(semi) 정량적

방법

② 정확한 결과

얻기 어려움Real-time

PCR

매우

높음높음

간단, 정량,

정확실험비용이 많이 듬

Northern

blotting높음 높음 정확

① 많은양의 시료

필요

② 결과 얻기어려움

③ 방사선 원소사용

③ GPDH (glycerol phosphate

dehydrogenase)높음 보통 간단,정량,정확

① 숙달된 기술

필요

② 지방세포 분화

측정에 대한

특이성 결여

③ UCPs (uncoupling proteins) 유전자 높음 높음측정방법에

따라 다름

측정방법에 따라

다름

(2) 동물실험

가. 식이섭취 및 체중 증가량 측정

체중의 측정은 매일 일정한 시간에 하는 것이 좋다. 이것은 밝은 기간과 어두운 기간

에 명확하게 섭취행동이 다르기 때문이다. 일반적으로 어둡기 시작한 직후에 하루 중

에서 최대로 잘 먹으며 잠시 쉬다가 또다시 먹기 시작한다. 밤새 대강 3-4차례 섭취한

다고 할 수 있다. 정상 랫트를 이용할 경우 체중은 어두울 때 증가한다. 밝을 때는

외부에서 소리와 진동 등의 자극이 없을 경우 대부분 잠을 자므로 섭취량이 거의 없

게 되고 체중은 감소한다. 정상동물은 그렇지 않지만, 식이중추에 이상이 있는 동물

은 섭취량과 체중이 하루 내에도 변동한다. 다만, 식이섭취로 인한 체중변동을 막기

위하여, 체중 측정 두 시간 전에 사료를 빼 내야 한다. 실험동물은 한 마리씩 분리하

여 사육하면서 실험기간 동안 식이 섭취량을 일주일에 3회 측정한다.


4. Lipolysis 와 fatty acid oxidation

관련 효소 및 유전자 측정　　

① HSL (hormone sensitive lipase)　　 높음 높음정량, 정확,

일반적

① 방법이 어려움


사용

② CPT-I (carnitine

palmitoyl transferase

-I)　

유전자 높음 높음측정방법에

따라 다름


다름

효소활성 낮음 보통 정량, 정확

① 재현성 낮음


사용

③ UCPs (uncoupling proteins) 유전자 높음 높음측정방법에

따라 다름


다름

- 총 식이섭취 칼로리

① 실험기간동안 섭취한 총섭취량을 칼로리로 환산한다.

② 환산한 총칼로리를 실험 일수로 나누어 하루에 섭취한 칼로리로 나타낸다(kcal/

day).

- 식이 효율 및 에너지 효율

식이 효율(food efficiency ratio)은 실험 기간 동안의 체중 증가량을 사료 섭취량

으로 나누고, 에너지 효율(energy Efficiency Ratio; EER)은 실험 기간동안의 체중

증가량을 에너지 섭취량으로 나누어 산출한다.

- 전체 체중 증가량

전체 체중 증가량은 실험동물을 희생시키기 직전에 측정한 체중에서 실험 시작시의

체중을 빼어 산출한다.

나. 체지방량 측정

총 체지방량 측정

조직을 채취한 사체의 총 지방량을 carcass 법을 사용하여 측정한다.

① 사체에 증류수 500㎖을 넣고 125℃에서 60분간 가열하여 식힌 후 균질화 한다.

② 플라스크에 균질액 1g과 메탄올 27㎖을 첨가하여 혼합하고 30분 후 클로로포름

14 ㎖을 첨가하고 12시간 정도 방치한다.

③ 준비된 혼합액을 3개의 시험관으로 나누어 여과한다.

④ 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용액과 0.88% KCl (염화칼륨)을 4.2㎖로

플라스크를 세척하여 각 시험관의 부피를 21㎖로 맞춘다.

⑤ 20초간 균질화한 후 1,500×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한다.

⑥ 시험관을 55-60℃에서 가열하여 4㎖이 될 때까지 부피를 줄인다.

⑦ 90℃에서 3-4 시간 건조한 후 식혀서 시험관에 지방만 남도록 한다.

⑧ 시험관의 원래 무게와 지방층이 생긴 후의 무게의 차이로 지방의 무게를 구한

다.

※ 평가: 실험방법이 잔인하나 경제적이고, 결과는 정확하다.

복부지방 분포 측정

실험동물의 희생 전일 마취하여 복부 지방 분포를 촬영한다. 동물 모델용으로 특수

고안된 자기공명 영상장치 (Magnetic Resonance Imaging system), 또는 미세 컴퓨터

단층 촬영 (micro computerized tomography)을 이용하여 실험동물의 복부를 촬영하

여 복부의 체지방 분포 양상을 관찰한다. 필요시 상부 복부에서 하부 복부까지 계속

적인 단층촬영이 가능하다.

※ 평가: 정확한 방법이나 비용이 많이 든다.

복부 및 내장지방 무게 측정

복부지방의 경우 생식기 주위의 지방을, 내장지방의 경우 소화기관주위의 지방만을

채취하여 그 무게를 측정한다.

※ 평가: 간편하고, 비교적 정확하다.

다. 지방조직과 간조직의 성상 측정

지방세포 수, 크기 측정

① 적출한 adipose tissue를 Hanks solution으로 세척한 후 가위를 이용하여 작은 조

각으로 자른다.

② Collagenase type I (Gibco)를 함유한 hanks solution 중에서 60 분 (37℃) 동안

shaking incubator 두어 digestion 시킨다.

③ Digested adipocytes는 hanks solution에서 잘 세척한 후 30 분 동안 후드에 방치

하여 adipocyte만 분리한다.

④ Culture Counter (Beckman)를 이용하여 fat cell size 및 number를 조사한다.

※ 평가: 간편하고, 경제적이다.

간조직의 지질 침착도 및 침착양상 측정

간조직 중의 지질 침착도는 Catalano-Lillie의 oil-red-O stain법을 이용하여 조사

한다. 이 방법의 원리는 간조직 절편을 유기용매에 용해시킨 염료에 처리하여 지질과

유기용매와의 지질 용해성 차이를 이용하는 것이다. 용매제로 isopropanol을 사용하

며, oil-red-O 염색용액과 mayer의 hematoxylin 염색용액을 사용한다.

① 동결 절편한 간조직을 silde glass에 부착한 후 공기 중에 10분 정도 방치한다.

② 100% isopropanol로 절편을 헹구어 oil-red-O 염색용액에 10분간 반응시킨다.

③ 염색액에서 꺼내어 60% isopropanol로 분별한 후 물로 수세하고 Mayer의

ematoxylin 용액으로 2-3분간 염색한 후 흐르는 물에서 10분간 수세한다.

④ 수용성 봉입제 (glycerin jelly)로 봉입하여 준비한 후 현미경으로 관찰한다.

※ 평가: 정확한 수치적 데이터를 얻을 수 있고 세포내 지방 함량 데이터를 동시에

얻을 수 있으므로 많이 이용한다.

라. 혈중 및 간조직 중의 지질, 지단백질 및 호르몬 측정

Triglyceride 측정

혈중 및 간조직중의 중성지방은 commercial kit를 이용한 효소법으로 측정한다.


Total lipid 측정

총지질함량은 sulfo-phospho-vanillin 방법에 기초한 kit을 이용하여 측정한다.


참고문헌: CS and Dunn RT. A colorimetric method for determination of total serum

lipid based on the sulfophospho-vanillin reaction. Am J Clin Path 53:

89-94, 1970

Total Cholesterol 측정

총콜레스테롤함량은 commercial kit을 이용하여 측정한다.


LDL-Cholesterol 측정

LDL-Cholesterol은 Friedewald 등에 의한 계산법으로 분석한다. 계산방법: LDL 콜레

스테롤 = 총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤 - (중성지방/5)


참고문헌: Friedewald WT, Levy RI and Fedreison DS. Estimation of concentration

of low density lipoprotein cholesterol in plasma, without use the

prepatative ultracentrifuge. Clin Chem 18: 499-515, 1979

HDL-Cholesterol 측정

HDL-Cholesterol은 phosphotungstic acid-Mg 침전효소법에 기초한 commercial kit를

이용하여 분석한다.


Leptin 함량 측정

혈중 leptin 농도는125 I-labeled leptin RIA kit을 이용하여 Gamma Scintillation

Counter로 측정한다.


마. 복부지방 및 간조직중의 Lipogenesis와 Adipogenesis관련 효소 및 유전자 측정

ACS (acyl-CoA synthetase), ACC (acetyl-CoA carboxylase), Aconitase

1) Northern blotting1)











거한다.


를 확인한다.

※ 평가: Northern blotting은 정확한 방법이지만 결과 얻기가 어렵고 방사성 원소를

사용할 경우 사용의 어려움이 있다.

2) RT-PCR







DNA 서열의 단편을 RT-PCR기기에 넣어 RT-PCR 반응을 실시한다.



※ 평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 적은량의 시료로도 데이터를 얻기가 쉽다.

참고문헌:




201:932-937, 1994



156-159, 1987

LPL (lipoprotein lipiase)

지단백 지방분해효소는 혈중 지단백 (주로 킬로마이크론과 초저비중지단백)으로부터

중성지방을 분해하는 효소로 비만 발생에 기여하는 주요한 요인이 된다.

① 분화된 지방세포에서 배양액을 제거하고 새로운 배양액에 헤파린 (100㎎/㎖) 첨

가하여 24℃에서 45분간 반응시킨다(이 조건에서 90% 이상의 LPL 분해활성이 헤

파린에 의해 유리된다).

② 헤파린 용출액에 시료를 100㎕ 처리하고 4℃에서 30분간 반응시킨다.

③ 3H-triolein을 100㎕ 첨가하고 아포단백 CⅡ의 급원으로 알부민과 사람의 혈청

을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시킨다.

④ 유리되어 나온 3H-oleic acid를 유기용매로 용출하여 함량을 측정한다.

참고문헌: Nilsson-Ehle P, Schotz MC. A stable, radioactive substrate emulsion

for assay of lipoprotein lipoase. J LIpid Res 1976:17-546

FAS (fatty acid synthease)

① 분화된 지방세포를 균질화하여 18,500×g에서 1시간 원심분리한다.

② 아세틸코에이(acetyl-CoA)와 ATP가 함유된 인산완충액에서 15분간 배양한다.

③ malonyl-coA를 첨가한 직후부터 NADPH 산화율을 흡광광도계로 측정한다.

※ 평가: 효소 활성 측정법은 정확한 방법이지만 방사성원소를 사용해야 하는 어려움

이 있다.

GPDH (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)활성 측정

GPDH는 세포분화의 지표가 되는 효소로 GPDH의 활성을 측정함으로써 지방세포의 분화

정도를 측정한다. GPDH 1 단위 (unit)은 1분 동안 0.01umole의 NADPH를 생성하는 효

소의 양으로 정의하고 효소의 활성은 단백질 1㎎에 해당하는 효소단위로 나타낸다.

① 분화된 세포를 인산완충염용액으로 세척한 후 차가운 세포 용해액 (lysis

buffer) (0.25M 수크로오스, 1mN EDTA, 5mM tris-base, 1mM dithilthreitol)을

첨가하고 얼음위에서 균질화 한다.

② 균질액을 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리 한 후 상층액을 취하여 cytosol을

분리해낸다.

③ 상층액의 단백질 함량을 측정한다.

④ 1-5 µg의 단백질이 함유된 상층액을 상온에서 1㎖ 반응액에 넣고 340㎚에서 흡

광도를 측정한다.

⑤ 처음 1분은 10초 간격, 그 후 60분은 매 1분마다 흡광도를 측정하여 소비된 NADH

의 양을 측정함으로써 GPDH의 활성을 측정한다.

※ 평가: 비교적 간단하고 많이 이용되는 방법이며 효소 활성을 측정할 수 있어 정확하다.

바. 복부지방 및 간조직중의 Lipolysis와 fatty acid oxidation관련 효소 및 유전자

측정

HSL (hormone sensitive lipase)

호르몬 민감성 지방분해효소는 지방조직에서 중성지방을 분해하는 단계에서 가장 중

요한 효소이다.

① 분화된 지방세포를 균질화하여 10,000×g에서 45분간 원심분리한다.

② 상층액에서 cholesteryl-14C-oleate를 기질로 하여 측정한다.

CPT-I (carnitine palmitoyl transferase-I)

1) Northern blotting1)


다. 모든 단백질이 만들어지기 위해서는 우선 그 단백질의 유전자로부터 전령 RNA가

만들어져야 한다. 이것을 전사라고 하며, northern blotting은 전사된 전령 RNA의

크기와 양을 분석하는데 사용된다.







거 한다.


를 확인한다.

2) RT-PCR







DNA 서열의 단편을 RT-PCR기기에 넣어 RT-PCR 반응을 실시한다.


동하여 검출된 cDNA 생성물을 확인한다.

※ 평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 적은량의 시료로도 데이터를 얻기가 쉽다.

3) CPT-I 활성 측정

간세포의 미토콘드리아에서 CPT-I활성을 측정한다.

① 각 세포로부터의 미토콘드리아는 Johnson과 Lardy3)의 방법대로 sucrose

density 원심분리법으로 분리한다.

② Bremer4)의 동위원소를 이용한 분석방법에 따라 CPT-I 활성을 측정한다. 즉,

Cocktail·(I250 Imidazol 800mM, sucrose 2M, EGTA 0.1M, Antimycin A 1㎎/mL,

BSA 20%, KCl 1M)과 Cocktail II·(L-carnitine 50mM, 3H-L-carnitine 1m

Ci/mL)을 준비한 후 다음의 순서대로 진행함.

a. 시험관에 Cocktail I250와 Palmitoyl-CoA를 첨가한 후 시료의 효소·(간의 미토

콘드리아-150㎍, 심장이나 근육의 미토콘드리아 10-25㎍)를 가하여 37℃ 항온

조에서 5분간 반응시킨다.

b. 다시 적당량의 Cocktail II를 가한 후 5분간 더 반응시킨 후 PCA를 가해 반응을

중지 시킨 후 냉장 보관한다.

c. 2000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 PCA를 가하여 마쇄 후

다시금 상등액을 제거하는 방법을 반복한다.

d. 증류수, saturated ammonium sulfate 및 n-butanol 혼합액을 가하고 잘 섞은

후 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 액상층과 butanol층을 분리한다.

e. Butanol층 위의 층액을 잘 제거 후 동위원소 측정용 용기에 옮겨 5mL의

scintillation fluid를 가하여 동위원소를 측정하여 총단백질 당 CPT-I활성

으로 환산한다.

※ 평가: 실험방법과정 중의 조절이 어려워 재현성이 낮다.

참고문헌:




201:932-937, 1994



156-159, 1987

3) Jhnson D and Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in

Enzymology 10: 94-96, 1967

4) Bremer J. The effect of fasting on the activity of liver carnitine

palmitoyltransferase and its inhibition by malonyl-CoA. Biochim biophys.

Acta 665: 628-631, 1983

UCPs (uncoupling proteins)

1) Northern blotting





① 조직으로부터 총 RNA를 Trizol reagent를 이용하여 분리한다.




cDNA probe로 합성하고, nylon membrane과 42℃에서 18시간 혼성화시킨다.


거한다.


를 확인한다.

2) RT-PCR


통하여 다루기 쉬운 DNA를 추출하여 염기 서열을 분석하거나 특정 RNA의 발현 유

무를 확인할 수 있다.

① 조직중의 50-100㎎을 취해 Trizol reagent를 이용하여 총 RNA를 추출한다.


③ 유전자 각각의 cDNA 합성을 위하여 commercial RT-PCR kit와 검출하고자 하는



동하여 검출된 cDNA 생성물을 확인한다.

※ 평가: RT-PCR은 증폭한 데이터이므로 부정확하지만 데이터를 얻기가 쉽다.

참고문헌:

1) Mynatt RL, Park EA, Thorngate PE, Das HD and Cook GA. Changes in carnitine

palmitoyltranferase-I mRNA abundance produced by hyperthyroidism and


201:932-937, 1994



156-159, 1987

실험방법은 조작이 과학적이고, 얻어진 결과가 재현성이 있을 뿐 아니라 보편성이 풍

부하면서도 유효한 실험이어야 한다. 위 시험방법의 재현성, 정확성, 장점, 단점을

정리하면 (Table 3)과 같다.

Table3. 동물실험의 시험방법별 재현성, 정확성, 장단점 비교표


1. 식이섭취 및 체중증가량 측정

① 총 식이섭취 칼로리 높음 높음간단, 정확,

정량적, 경제적

칼로리 분석 안된 물질

사용시 적용 어려움

② 에너지 효율매우

높음

매우

높음

간단, 정확,

정량적, 경제적

칼로리 분석 안된 물질

사용시 적용 어려움

③ 전체 체중 증가량매우

높음

매우

높음

간단, 정확,

정량적, 경제적개체당 편차가 큼

2. 체지방량 측정

① 총 체지방량 측정 높음 높음

① 비만지표로의

대표성

② 정확, 경제적

① 방법이 복잡, 어려움

② 실험자 시료 채취기술

차이

③ 시간과 경제적인문제

④ 지방 분포 파악 불가

② 복부지방 분포 측정 높음매우

높음

①　시간차별 측정

가능으로 변화 양상

측정 가능

② 정확

① 촬영부위에 따라지방

분포 달라짐.

② 고가의장비

③ 복부 및 내장지방 무게

측정보통 높음 간편, 정확

①　부위에 따라 대표성

낮을수 있음

② 정확성과 재현성

어려움

3. 지방조직과 간조직의 성상 측정

① 지방세포 수, 크기

측정(방법 다름)보통 보통

① 훈련된 연구원이

하면 객관성이 좋을

것임

② 간편, 경제적

편차가 큼


4. 혈중 및 간조직 중의 지질, 지단백질 및 호르몬 측정

① Triglyceride, total

lipid 높음 높음 간편, 정확, 정량적

① 혈중 농도가 곧

항비만효과정도를

나타내지 않음

② TLC 방법보다 민감도가

낮음

② Cholesterol (total

cholesterol,

LDL-cholesterol,

HDL-cholesterol)

높음 보통 간편, 정확, 정량적

①　비만지표로의

대표성이 낮음

② 인체에의 적용가능성

의문

③ Leptin 함량 높음매우

높음간편, 정확, 정량적

① 방사선 동위원소 사용

② 고가

5. 복부지방 및

간조직중의 Lipogenesis

와 Adipogenesis관련 효소

측정

① 간에 대해서 정확

② 대표성

③ 지방합성과정

규명가능

① 유전자 발현 측정 법에

따라 제한점

② 이 효소 mRNA 증가가

곧 효소 활성 증가를

의미하지 않음

③ HPLC, TLC, GC

방법보다 민감도가

낮음

④ 순도높은 RNA 수득이

관건

① 효소 활성 측정 높음 높음 정량, 정확, 일반적① 방법이 어려움

② 방사성 동위원소 사용

② 유전자

발현 측정

RT

-PCR보통 보통

적은량의 시료로

데이터 얻기쉬움

① 반(semi) 정량적 방법

② 정확한 결과 얻기

어려움

Real-time

PCR

매우

높음높음 간단, 정량, 정확 실험비용이 많이 듬

Northern

blotting높음 높음 정확

① 많은양의 시료 필요

② 결과얻기 어려움

③ 방사선 원소 사용

③ GPDH (glycerol

phosphate

dehydrogenase)

보통 보통 간단, 정량, 정확

①숙달된 기술 필요

②지방세포 분화 측정에

대한 특이성 결여


6. 복부지방 및 간조직중의 Lipolysis 와 fatty acid oxidation 관련 효소 및 유전자 측정　　

① HSL (hormone

sensitive lipase)　　보통 높음 정량, 정확, 일반적

①　방법이 어려움

②　방사성 동위원소 사용② CPT-I

(carnitine

palmitoyl

transferas

e-I)　　

유전자 높음 높음 측정방법에 따라 다름 측정방법에 따라 다름

효소활성 낮음 보통 정량, 정확① 재현성 낮음

② 방사성 동위원소 사용

③ UCPs (uncoupling

proteins) 유전자높음 높음 측정방법에 따라 다름 측정방법에 따라 다름

(3) 실험설계 및 수행방법

가. 동물실험

동물실험 논문을 평가함에 있어 다음과 같은 사항을 포함하고 있어야 한다.

① 동물 식이에 효과를 측정하고자 하는 식품성분의 첨가량이 현실성 있는 범위 내에

있는가

② 동물 식이 중 조사 대상 성분 이외에 다른 식이성분 함량을 모든 실험군에서 동일

하게 조절하였는가

③ 사용된 실험동물 수, 실험식이 공급기간, 비만유발 방법, 평가항목의 선택 및 측

정방법이 적절한가. 또한 적어도 계획의 미비, 부적당한 실험환경, 설비 및 기기

의 불량, 실험기술의 미숙, 부적절한 동물의 사용 등에 의해 결과가 잘 못 평가받

아서는 안된다.

동물실험의 결과에 영향을 미치는 요인은 여러 가지가 있지만, 그 중에서도 사용동물

이 유전학적으로, 미생물학적으로 컨트롤되어 있는 품질이 보장된 실험동물을 사용

함으로서, 실험결과의 편차를 줄이고 재현성을 얻을 수 있다. 실험에 선택된 동물은

과학적으로 타당한 결과를 얻기 위해 적합한 품종과 품질, 그리고 최소한의 동물수를

사용하여야 하며(WHO, International guiding principles for biomedical research

involving animals . Basic principles), 적절한 경우, 수식모델, 컴퓨터 시뮬레이션

및 생체 외에서의 생물학적 기법 등과 같은 방법이 이용되어야 한다.

- 동물종

식품의 기능성 평가를 위해서는 마우스와 랫트 등의 설치류를 이용하는 것이 좋다.

주로 랫트는 Sprague- awley rat 또는 wistar rat을 사용하고 마우스는 C57BL/6

mouse 또는 ICR mouse를 사용한다.

일반적으로 마우스는 실험동물 가운데 가장 사용빈도가 높은 동물이다. 마우스는

유전적 특성을 달리하는 많은 계통이 유지되고 있기 때문에, 연구목적에 적합한 계

통을 선택할 수 있으며, 라이프 사이클과 수명이 짧기 때문에 세대 교체를 빨리 진

행시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한 번식능력이 높고 사육관리가 용이하며, 실험

에 다량의 동물을 일시에 사용할 수 있으므로, 통계적 결론을 얻어내기가 용이하다.

랫트는 마우스 다음으로 사용빈도가 높으며, 주로 종양, 내분비, 약리, 대사, 생화

학, 영양, 생식 등의 연구에 많이 사용된다. 마우스로 평가시험을 할 경우 약물이

적게 든다는 장점이 있지만 생리적인 현상을 분석하고 해석하기에는 랫트 등 신체

크기가 큰 쪽이 잇점이 더 크다. 또한 랫트도 계통에 따라 성격과 행동 패턴이 다르

고 같은 화합물에도 평가에 사용하는 동물에 따라 섭취억제가 안되는 것이 있으므

로 주의가 필요하다. 랫드에서 사용빈도가 높은 계통은 wistar, wistar-king,

long-evans, sprague dawley, baffalo, F344, holtzman등이 있다. SD는 1925년 미

국 Sprague-Dawley사에의해 개발 번식되어 전세계적으로 실험에 사용되는 대표적

인 실험동물로, 독성, 약리, 내분비, 영양 등 전반적으로 거의 모든 연구실험에 사

용되고 있다. 번식과 발육이 좋으며, 온순하여 실험에 용이하다.

실험동물을 유전적 컨트롤에 의해 분류하면 근교계, 변이종, 폐쇄군, 교잡군, 잡종

으로 나눌 수 있다. 근교계는 극도의 근친교배에 의해 확립된 계통으로, 마우스의

경우 형매교배(sister-brother mating) 또는 친자교배(parent-offspring mating)

를 20대 이상 계속한 것을 말한다. 실험동물에서 근교계가 중요시되는 이유는, 근

교계가 유전적으로 계통 특유의 성질을 가지며, 계통 특유의 반응을 나타낸다는 점

에서 특정의 연구목적에 적합하다는 것이다. 이외에도 근교계는, 모든 개체가 유전

적 유사성이 높기 때문에 각종의 실험처치에 대해 균일한 반응을 기대할 수 있다.

- 동물모델

실험동물의 종이나 계통의 분류에 속하는 것은 아니지만, 사람질환에 따라 모델동

물을 구별할 수 있다. 현재 사람의 질환과 비슷한 질환을 가지는 모델동물을 이용

함으로서, 미해결된 사람 질환의 원인 해명, 진단, 치료, 예방의 연구에 많은 공헌

을 하고 있다. 질환모델 동물을 개발하는 방법은 동물에서 자연히 발생하는 것을

발현해 내는 자연발증에 의한 것과, 인위적으로 발증 시키는 방법이 있다. 다양한

질환모델 동물이 개발되어 있는데, 이 중 비만에 관한 동물실험에 쓰이는 동물모델

로, 유전형질을 갖지 않은 비만형 동물모델(①, ②, ③)과 유전형질의 변이에 의하

여 유발된 비만의 동물모델(④, ⑤)로 구분하여 정리하면 다음과 같다.

① 시상하부 복내측(ventromedial) 부분의 손상으로 유발된 비만 동물모델

미세수술이나 gold thioglucose, bi-piperidyl mustard, monosodium

glutamate, 4-nitroquinolone-1-oxide 같은 약재에 의하여 시상하부에 병변을

초래하여 식욕 또는 포만감을 변화시켜 식이 섭취량을 증가시킴으로써 비만을

유도할 수 있다. 이러한 동물모델은 시상하부가 비만을 유도하는 기전을 연구하

기에 적합한 모델이다.

② 호르몬의 변화를 유도하여 유발된 비만의 동물모델

여러 호르몬이 대사율, 지방 합성, 지방 축적에 관여하는데, 대표적으로 인슐린

종, 당질코르티코이드가 증가된 쿠싱증후군 및 성선 제거시 비만이 유발되는 것

으로 알려져 있으나 동물의 종에 따라 호르몬에 대하여 다른 반응을 보이므로

주의하여야 한다.

③ 식사에 의해 유발된 비만

식사방법인 과식(overfeeding)과 에너지 과밀도 식사(energy dense diet)에 의

하여 비만이 유발 될 수 있다. 종에 따른 차이가 있으므로 동물과 식사의 선택에

서 주의를 기울여야하며, 일반적으로 섭취 칼로리 전체의 약 40%를 지방으로 제

조한 식사로 Sprague-Dawley 쥐에게 주었을 경우 체중과 체지방률을 현격히 증

가시키는데 이는 지방세포의 크기와 수가 증가되어 비만이 유발되는 것으로 알

려져 있다. 이 방법은 사람이 비만해지는 경우와 매우 유사한 과정을 가진다는

장점이 있으므로 많은 비만 연구에 모델로 이용되고 있으나 식사를 정확히 정량

화 할 수 없음으로 실험결과를 분석하기가 어렵다는 것을 염두에 두어야 한다.

식사로 유발된 비만의 동물모델들은 값싸게 동물을 얻을 수 있으며 식사 환경에

의해 유발되는 비만의 가전을 연구하기에 적합한 장점이 있으나 유전형질에 의

하여 유발된 동물모델에 비하여 비만도가 훨씬 경하며 여러 실험조건에 많은 영

향을 받을 수 있다는 것을 염두에 두어야 한다.

④ 다유전자 변이 동물모델(polygenic animal model)

비만의 심한 합병증 등을 연구하기에는 적합한 모델은 아니지만 비만할 수밖에

없는 유전 형질을 가지고 태어난 것이 아니라 식사나 환경에 의하여 쉽게 비만

해 질 수 있는 소인을 가진 동물모델로서 비만한 사람과 생리적으로 가장 유사

하다는 장점을 가진 동물 모델이다.(예 : New Zealand Obese(NZO) mouse, KK

mouse)

⑤ 단일 유전자 변이 동물모델(monogenic animal model)

유전자의 변이에 따른 이상소견을 정확히 규명할 수 있으며, 유전자의 동형 혹

은 이형접합체에 따른 형질 표현의 정도에 대한 연구가 가능한 것이다. 또한 다

른 동물모델에 유전자를 이식함으로써 각각의 유전자 사이에 상호작용을 알 수

있다는 장점이 있다. 가장 큰 단점은 비만의 정도가 생리적이지 못한 매우 심한

상태, 이로 인한 불임이 유도되어 동물번식에 어려움이 많다는 것이다. 주로 마

우스는 ob/ob mouse, db/db mouse, fa mouse가 사용되며, 랫트는 fa/fa Zucker

rat과 OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) rat이 사용되고 있다. ob/ob

mouse는 렙틴 유전자가 결손되어, 그리고 db/db mouse는 렙틴 수용체 유전자가

결손 되어 선천적으로 비만 경향을 나타낸다.

유전자 형질변환 모델의 경우 특정 질환에서의 유용성을 보는데는 적합하나, 질

병인이 아닌 건강인과 반건강인을 대상으로 하는 건강기능식품에서 사용하는

것은 문제가 있다. 따라서 정상 상태의 동물에게 고지방식이등의 과밀도 식사를

제공하여 비만을 유도하는 diet-induced obese (DIO) 모델을 사용할 것을 권장

한다. 다만, 특별히 필요한 경우 이들 모델을 이용할 수 있을 것이다.

- 주령

동물 종간의 정확한 비교를 하기 위해서는 각 동물의 일생에서의 연령 비교의 형을

조사하여, 그 각각의 동물종의 생물적 단계에 대하여 알맞게 대응하도록 그 부분의

수치를 비교할 필요가 있다. 생리적인 측면에서 보았을 때 어느 정도 연령이 들어

지방이 체내에 축적된 동물이 좋지만, 기존 보고 논문을 보면 비교적 어린 연령(8

주 정도)도 평가에 빈번하게 이용되고 있다.

- 사육환경

사육구역 내에서 1주간의 적응 훈련 후 실험. 사육조건은 온도 22.0± 1oC, 습도 50±

10%, 조도 120 Lux에서 사육하며 물과 식이는 제한 없이 공급한다.

나. 실험설계에 대한 검토

- 군 배치

실험물질의 투여수준을 달리한 3개 이상의 실험군과 대조군으로 구성하여야 한다.

- 군당 마리수

동물실험에서 군당 마리 수는, 동물입수의 난이도, 가격, 실험의 조작내용 등에 의

해 크게 제한을 받는다. 현실적으로는 통계학적 기법으로 설정된 마리수 보다 훨씬

적은 수로 하는 실험 예가 많다. 실험마다 여러 가지 제약이 있으므로 획일적인 공

시동물의 수를 논하는 것은 어렵지만, 일반론으로는「동물의 개체반응차 ＋ 실험

환경의 변동폭 ＋ 실험조작기술의 미숙련도」가 증가할수록 공시동물의 수는 증가

할 수밖에 없다. 통계학에 기반한 실험계획법도 필요하지만 이들 요인을 가능한 한

통제해서 실험동물의 사용 수를 줄이려는 노력도 한편으로 필요하다.

마우스나 랫트를 이용할 경우 군당 10 마리 정도로 하되, 최소 7마리를 유지할 필요

가 있다.

- 실험식이 공급 기간

실험식이 공급기간은 연구 목적, 물질의 특성, 물질의 농도, 공급 방법 등에 따라

달라질 수 있다. 사료에 첨가하거나 음용수에 혼합하여 공급할 경우 비교적 장기간

공급할 수 있고, 구강 투여로 공급할 경우는 투여 방법에 의하여 실험동물에게 신

체적 스트레스가 가해질 수 있으므로 비교적 단기간 공급하는 것이 바람직하다.

실험물질의 비만 예방 효과를 알아보는데 중점을 둔다면 실험 시작 시 실험동물에

게 비만을 유도하는 고지방 식이와 실험물질을 동시에 공급하면서 사육하고, 실험

물질의 비만 치료 효과에 중점을 둔다면 우선 실험동물에게 고지방 식이를 공급하

여 비만을 유도한 후 실험물질을 공급하게 된다. 이 때 식이로 비만을 유도하는 기

간은 4-12주로 한다.

다. 실험사료에 대한 검토

- 사료의 조성

동물사료의 조성이 연구결과에 결정적 영향을 미칠 수 있기 때문에, 사료의 조성에

주의하여야 한다.

순수사료는 AIN(American Institute of Nutrition)의 AIN-93M 및 AIN-93G 기준을 준

용할 것을 권한다. 1976년 AIN에서 구성한 실무위원회는, 실험실에서 설치류를 이용

한 영양연구의 표준식이, 즉 AIN-76 rodent diet를 제시하였다. 그 후 영양적인 면에

서 또 기술적인 면에서 여러 문제점을 논의 한 후 1993년, AIN-93을 발표하였다.

AIN-93G 는 성장, 임신 및 수유단계를 지원하도록 된 것이며, AIN-93M 식이는 단백질

과 지방함량을 낮춘 것으로 성인을 위한 것이다.

라. 투여방법

인체의 섭취경로와 동일하게 하여야 한다. 이를 위해 사료 또는 음용수에 기능성분

이나 제품을 첨가하며, 실험 목적에 따라 위장으로 구강 투여할 수 있다.

(4) 동물실험 설계 및 수행방법(안) 도출

동물실험의 일반원칙 및 중국의 관련규정, 전문가의 의견을 반영하여 아래와 같이 최

종안을 도출하였다.

실험동물의 사육 및 식이

① 실험동물의 종류 및 계통: 랫트나 마우스를 이용한다. 고지방식이를 제공하여 비

만을 유도하는 것을 원칙으로 하되, 필요에 따라 유전적으로 비만한 동물모델을

이용할 수 있다.

② 실험동물의 주령, 성별 및 사용 마리수 : 4주령 이상을 이용한다. 군당 10마리 정

도가 무난하며 최소 7마리 이상으로 한다.

③ 실험동물의 공급원 : 실험동물의 사육조건 인증서를 제출할 수 있는 공급원

⑤ 비만유도식이 공급기간 : 비만의 유도는 고지방식이를 4주 이상 공급한다.

⑦ 식이섭취량 및 체중 측정 : 실험 기간 동안 식이 섭취량은 주 2회 이상, 체중은

주 1회 이상 측정한다.

실험식이의 조제 및 투여량

① 실험식이의 조제 : 실험식이의 조제는 정상식이를 기준으로 비율을 조정한다. 정

상 식이군은 AIN-93A 혹은 AIN-93G diet로 공급하고, 비만대조군은 고지방식이를

공급하여 사육한다. 실험군은 비만대조군과 동일한 고지방 식이에 실험물질을 농

도별로 혼합하여 공급하거나, 동일한 고지방 식이를 공급하면서 실험물질을 음용

수를 통하여, 혹은 구강투여를 통하여 공급한다.

② 투여량 결정 : 실험 재료에 대한 독성시험자료, 임상효능 실험자료를 활용하여 투

여량을 결정하고 임상투여용량 또는 그 배수에 해당하는 용량으로 한다.

투여 경로 선정

투여경로는 실험물질이 생리적으로 위장관을 통하여 소화, 흡수될 수 있도록 경구투

여를 원칙으로 한다. 사료나 음용수에 혼합하여 공급하거나 위장으로 구강투여 할 수

있다.

투여기간

실험식이의 투여기간은 투여방법에 따라 결정하며 식이에 첨가할 경우 4주 이상 공급

하고 구강투여 시 이보다 단축할 수 있다.

혈청수집

혈액은 희생 시 heart puncture 방법이나, 복대정맥으로 채취한 후 3000 rpm에서 15

분간 원심분리하여 혈청을 얻고 이들 시료는 분석 시까지 -70℃에서 보관한다.

(5) 인체시험

가. 다이어트 기능성 식품의 인체시험 시 고려사항

윤리적인 측면

① 임상시험책임자의 선정이 적합한가?

② 시험의 설계가 피험자의 안전을 충분히 고려하였나? 위험성이 최소화되었는가?

③ 피험자가 노출될 위험성이 임상시험 결과의 유용성에 비해 용인될 수 있는가?

④ 피험자의 선정이 공정한가?

⑤ 피험자로 경제적이나 교육 정도가 낮은 피험자 등 일부 특수 피험자 군만이 자의

에 의하지 않고 시험에 참가하게 될 가능성은 없는가?

⑥ 어떤 형태의 동의 취득이 타당한가? 피험자의 동의를 구하는 과정에 문제는 없는가?

⑦ 동의서 및 설명문이 제대로 작성되었는가?

⑧ 피험자의 개인 신상 및 시험 자료에 관한 사항의 보안이 완전한가?

임상시험 설계 및 시행의 측면 (설계 및 시행)

① 시험 목적이 명확하게 기술되었고, 합리적인가?

② 시험의 설계가 목적에 합당한가?

③ 진단의 기준이 명확하게 기술되었는가?

④ 피험자의 선정에 대한 기술이 명확한가?

⑤ 피험자 수가 시험 목적에 적절한가?

⑥ 시험 목적상 대조군이 필요한 연구인가? 대조군이 설정되었는가?

⑦ 대조군에서 시행되는 모든 사항이 진정한 대조군으로 이용될 수 있게 설계되었는가?

⑧ 비교 시험인 경우 무작위 배정 방법에 문제는 없는가?

⑨ 맹검 시험의 경우 눈가림이 잘 이루어지지 않을 가능성은 없는가?

⑩ 탈락 예상 피험자 수를 적절히 고려한 설계인가?

⑪ 탈락에 대한 기술이 명확하게 기술되어 있는가?

⑫ 결과 판정(outcome)의 기준이 명확하게 기술되어 있는가? 계측되는 변수(para-

meter)가 시험 목적 또는 결과 판정에 적합한가?

⑬ 부작용의 확인 방법, 시기 등이 예측되는 부작용의 모니터링에 합당한가?

⑭ 시험 중지 또는 시험 종료에 대한 종점(endpoint) 설정이 타당한가?

나. 인체시험 설계 및 수행방법

비만관련 임상전문가 17인을 대상으로 다이어트 기능성 식품의 임상적 평가 기준에

대한 한 설문을 실시하였다(설문지 부록2 첨부). 임상시험의 진행방법 타당성에 대한

설문 결과 전문가 17인 중 70% 이상이 타당하다고 응답한 내용과 수정 및 건의 내용

중 연구자 3인 이상이 타당하다고 동의한 내용을 포함하였다.

피험자

- 피험자의 선정기준

① 비만 : 체질량지수(Body-Mass Index)가 23 이상인 사람 또는 복부둘레 남자 90㎝,

여자 80㎝ 이상인 사람

② 연령이 만 19세 이상 60세 미만

③ 본 임상시험에 대한 자세한 설명을 들은 후 동의서에 서명함

- 피험자의 제외기준

① JNC-7 2기(≥ 160/100㎜Hg)이거나 이뇨제를 복용하고 있는 고혈압 환자

② 공복 혈당이 126㎎/㎗ 이상이거나 무작위 혈당이 200㎎/㎗ 이상인 경우, 또는

경구 혈당강하제 또는 인슐린을 복용하고 있는 당뇨병 환자

③ 심장, 신장, 간, 갑상선, 뇌혈관 질환이 있는 경우

④ 담낭 질환이나 위장관계 질환, 통풍, 포르피리아가 있는 경우

⑤ 우울증, 정신분열증, 알콜중독증, 약물중독 등의 정신질환자

⑥ 비만치료제(흡수저해제 및 항우울제, 식욕억제제, 피임약, 스테로이드제제, 여

성 호르몬제를 복용하고 있는 경우

⑦ 임신이나 수유중인 경우

⑧ 연구 시작일로부터 3개월 이내에 상업적인 비만프로그램 또는 다이어트 식품을

복용한 경우

⑨ 심한 근골격계 질환으로 운동을 할 수 없을 것으로 판단되는 경우

⑩ 최근 5년 이내 암의 진단 및 치료를 받은 적이 있는 경우

⑪ 천식 및 기타 알레르기 질환이 있는 경우

⑫ 최근 6개월 이내 수술 병력이 있는 경우

- 목표한 피험자의 수

해당 임상시험에 필요한 피험자 수를 통계적 근거와 현실적인 여건에 따라 추정하

고 이 때 고려되었던 사항 등에 대하여 기술하여야 한다. 만일 피험자 수를 추정하

기 위해 공식을 이용하였다면, 해당 공식을 이용한 근거를 참고문헌 등을 참조하여

밝혀야 한다. 또한 공식에 사용된 중요한 인자들, 예를 들어 반응의 평균 기대치,

편차의 정도 등에 대해서는 어떤 근거에 의해 해당 값들을 얻게 됐는지를 기술하여

야 한다.

식품의 효과의 크기(effect size)에 대한 정보 부족으로 통계적인 방법으로 대상자

수 결정이 어려울 경우, 시험군과 대조군 각각 최소 20명 이상의 대상자가 필요하다.

중재방법

중재 기간은 실험하고자 하는 식품의 열량, 영양소 구성, 음용법 등에 따라 다를 수

있으나 최소 6주 이상이 되어야 한다. 중재 기간을 정할 때에는 대상자의 예상 감량

속도, 영양 결핍 가능성 등 여러 사항을 고려하여야 한다. 연구 대상자들의 배정은

이중맹검법(double blind test)에 의해 실시하여야 한다.

① 식이요법 : 식이요법의 교육은 모든 대상자에 시행하며, 교육은 연구시작 당일부

터 시행한다. 교육 실시 회수와 시간은 연구의 특성과 가용 자원에 따라 달라질

수 있으나 가급적이면 매 방문 시마다 하는 것이 권장된다. 연구시작 전에 작성한

식사일지를 바탕으로 각 개인별 식이교육을 실시한다.

② 운동요법 : 연구시작 전에 실시한 여러 체력검사와 운동부하검사 등을 통해 각 개

인에 맞는 운동을 처방하며, 교육은 연구시작 당일부터 시행한다. 교육 실시 회수

와 시간은 연구의 특성과 가용 자원에 따라 달라질 수 있으나 가급적이면 매 방문

시마다 하는 것이 권장된다.

③ 연구 중단 기준

임상적으로 중대한 이상반응이 나타날 때

측정항목 및 방법

- 신체계측

① 신장, 체중, 체질량지수

② 허리 둘레

- 혈압, 맥박

- 신체 조성(체지방율 및 제지방량)

① 피지후법(4개 부위)

② 임피던스법

③ Whole body DEXA

④ Computed Tomography

- 혈액검사

① CBC

② Urinalysis with microscopy

③ Blood Chemistry : 총 cholesterol, Triglyceride, HDL-Cholesterol, Protein/

Albumin, GOT/GPT, Alk Phosphatase, 총 Bilirubin, Glucose, BUN/ Creatinine,

Uric acid, Calcium/Phosphorus, Na/K/Cl, (Fasting) Insulin, Zn, Mg, Iron,

Thyroid function test(T3, free T4, TSH)

- 심전도(EKG)

- 식사일지: 영양교육과 개인별 식사행동 및 양상을 검토하기 위하여 프로그램을 시작

하기 전과 끝난 후에 3-Day Food Record법을 이용하여 영양조사 및 평가에 관한 설문

검사를 시행한다. 또한 임상시험 기간 내내 daily food record를 작성하게 하여 순

응도를 확인한다.

- 건강평가 설문: 개인의 병력, 현재의 생활습관 등을 검토하기 위하여 문진을 실시한다.

- Symptom Checklist 및 부작용: 임상시험 전과 그리고 매번 외래 방문시 체중감소와

연관된 증상들에 대해 문진을 실시하고 그 증상이 심하여 특별한 조치가 필요한지

판단한다.

- 신체활동량 평가: 1주와 8주에 일일 신체활동량을 기록하게 한다.

평가

- 부작용 및 합병증 평가: 연구기간 중 발생한 모든 부작용을 기록하고 그 정도와 그에

따른 대응책을 아래와 같은 분류에 따라 실시하여 피험자의 안전을 도모한다.

부작용의 정도 대응책

Mild 복용 지속, 무처치 혹은 간단한 대증요법

Moderate 복용 중단 및 일반적인 치료

Severe 복용 중단 및 집중치료 혹은 입원치료

다이어트식품 복용과의 관련성

A None

B Possible

C Probable

D Definite

E Unknown

- 순응도(Compliance) 평가: 매 방문시 마다 환자가 처방(다이어트식품 복용, 일일섭

취열량, 운동 등)을 제대로 지켰는가를 확인한다.

- 수치 처리 및 결과판정: 실험 전 후, 상기 지표의 측정결과를 근거로 하며, 대조군과

비교하여 통계적으로 유의한 효과의 차이를 보이고 개체 건강에 명확한 손상이 없는

경우 실험 대상 식품은 다이어트 작용이 있다고 판정할 수 있다.

- compliance 평가

① self report 방식

② 남은 약이나 식품을 반납하도록 하여 count

4. 참고문헌

강금지. et al.(2001), 한국영양학회지 34(4); 367-74.

강순아. et al.(2002), 한국식품영양과학회지 31(5); 788-95.

강순아. et al.(2002), 한국식품영양과학회지 31(6); 1052-7.

강순아. et al.(2002), 한국영양학회지 35(9); 903-11.

강재헌. et al.(1998), 가정의학회지 12(2); 167-76.

건강기능식품의 기준 및 규격 제정(안) 입안예고. 식품의약품안전청 공고 제 2003-62

호. 2003.6.28

고진복.(2001), 한국영양학회지 34(7); 741-7.

권순영. et al.(2001), 한국영양학회지 34(6); 626-36.

김경수.(2003), 대한임상건강증진학회 춘계학술대회 3(1); S57-S60.

김미정. et al.(2003), 가정의학회지 24(4); 360-4.

김범택.(2003), 대한임상건강증진학회 춘계학술대회 3(1); S76-S78.

김상만. et al.(1999), 대한비만학회지 8(2); 72-78.

김상만. et al.(2002), 한국식품영양학회지 15(3); 267-71.

김상만.(19992), 춘계학술대회. S-10-19.

김소혜. et al.(2000), 대한지역사회영양학회 추계학술대회, 438.

김순경. et al.(2001), 한국식품영양과학회지 30(3); 516-20.

김영설. et al.(1992) 지방조직과 지방세포대사. 1(1); 48-52.

김윤정. et al.(2003), 가정의학회지 24; 456-60.

김은혁. et al.(2002), 대한비만학회지 11(4).

김정희.(2003), 대한임상건강증진학회 춘계학술대회 3(1); S61-S70.

노흥균. et al.(2002), 한국식품영양과학회지 31(6); 1078-83.

대한비만학회. 임상비만학. 고려의학 2001

대한비만학회. 임상비만학의 최신지견 대사증후군. 2002

박웅덕.(2001), 경원대학교 한의학과 박사학위논문.

박현서. et al.(2001), 한국영양학회지 34(8); 850-7.

박혜순. et al.(1992), 가정의학회지 13(4); 344-53.

배정환.(2002), 경희대학교 한의학과 박사학위논문.

서영성. et al..(2002), 대한비만학회지. 11(4); 356-61

소비자보호원. 다이어트 제품 피해 실태 조사 2002.11

소비자보호원. 생활경제국 표시광고팀. 다이어트 식품 광고 실태 조사. 2000.11

손수진. et al.(2002), 대한지역사회영양학회지 7(4); 475-83.

손수진. et al.(2003), 대한지역사회영양학회지 8(1); 102-11.

손효현. et al.(2002), 한국영양학회지 35(10); 1023-30.

식약청. 후생노동성. 의약품성분이 검출된 식품. 2003.3. 24

일본 후생노동성. 의약발 제 0828004호. 이른 바 다이어트 용 건강식품에 의한 건강

피해 방지를 위한 요청에 대하여. 2002. 8. 28

오유진. et al.(2002), 한국영양학회지 35(8); 834-9.

이가영. et al.(2002), 가정의학회지 23(7); 917-24.

이광우.(1992), 대한비만학회지. 1(1); 1-4.

이귀녕, 권오헌. 임상병리파일 제 3판 의학문화사 148-96, 2000

이근미.(1998), 대한비만학회지 7(4); 280-6.

이민숙. et al.(2003), 농화학회지 46(2); 1-7.

이복기. et al.(2002), 대한비만학회지 11(2); 131-41.

이상엽.(2003), 대한비만학회 연수강좌 12(2); 25-44

이성희. et al.(2002), 대한영양사협회 학술지 8(2); 175-84.

이종호(2003), 한국생약학회 제26회 과학의 달 기념 한약개발 심포지움-기능성 식품

의 소재와 개발 방향 p3-9

이진실(2003), 대한임상건강증진학회 춘계학술대회 3(1); S71-S75.

이혜양(1997), 대한비만학회지 6(1); 75-84.

이흥규(1992), 대한비만학회지. 1(1); 34-39.

일본 후생노동성. 약식약발 제 0829007호. 식품으로 판매하여 공급하는 물질에 건강

보호, 증진효과 등에 관한 허위과대 광고 등의 금지 및 광고의 적정화를 위한 감시지

도 등에 관한 지침에 대하여. 2003. 8. 29

임경숙(2003), 대한임상건강증진학회 춘계학술대회 3(1); S85-S94.

장은재 et al.(2003), 한국식품영양학회지 32(3); 479-84.

장응찬(2002), 한국체육학회지 41(4); 507-14.

정미경 et al.(2002), 한국영양학회지 35(6); 635-42.

정민영(1992), 대한비만학회지. 1(1); 5-10.

조남한 et al.(1997), 대한비만학회지 6(1); 67-73.

조민자 et al.(2000), 대한지역사회영양학회 추계학술대회 749.

조영철 et al.(2002), 한국약용작물학회 10(2); 93-99.

주종재 et al.(1999), 한국영양학회지 32(5); 533-9.

주종재(2000), 한국영양학회지 33(8); 787-93.

최웅환(1997), 대한비만학회지 6(2); 1-6.

최웅환(2002), 대한비만학회지 11(2); 103-7.

최원호(2000), 경산대학교 한의학과 박사학위논문.

한국보건산업진흥원. 다이어트 상품의 올바른 선택을 위한 소비자 프로그램 개발 및

평가. 한국보건산업진흥원. 2001.5

한정미 et al.(2001), 가정의학회지 22(2); 212-9.

홍성의 et al.(2002), 생약학회지 33(4); 312-8.

Bobbioni Harsch et al.(1999), International J. Obesity 23; 470-5.

Bray GA et al.(1998), Marcel Dekker, Inc, 31-40.

Claire M Steppan et al.(2001), Nature 409(18); 307-12.

Commission Directive 96/8/EC of 26 February 1996 on foods intended for use in

energy-restricted diets for weight reduction

Commission of the european communities. proposal for a regulation of the

european parliament and of the coumcil on nutrition and health claims made on

foods. COM(2003) 424 final, 2003/0165(COD). Brussels, 16. 7. 2003

Commission of the European communities. proposal for a regulation of the

European parliament and of the council on nutrition and health claims made on

foods. COM(2003) 424 final. 16. 7. 2003

Crawford V et al.(1999), Obesity and Metabolism 1; 331-7.

Gabriella Milan et al.(2002), Obesity Research 10(11); 1197-99.

Hotamisligil GS.(1999), Exp Clin Endocrinol Diabetes 107(2); 111-2.

Joyce B Harp et al.(2002), Obesity Research 10(10); 985-90.

Kovacs E. M. R. et al.(2001) Effects of 2-week ingestion of (-)-hydroxycitrate

and (-)-hydroxycitrate combined with medium-chain triglycerides on satiety and

food intake physiology & behavior. 74; 543-9.

Lee S. H. et al.(2002), Food Sci. Biotechnol. 11(5); 462-69.

Marvri A. et al.(2001), Obesity and Metabolism. 3; 293-6.

Park H. S. et al.(2001), 가정의학회지. 22(3); 303-15.

Pittler MH et al.(1999), Eur J Clin Nutr 53(5); 379-81.

Rerresa T Fung et al.(2001), Am J Clin Nutr 73; 61-67.

Schreyer SA et al.(1998), J Clin Invest 102(2); 402-11.

Shen C P et al.(2002), J Neuroendocrinology 14; 607-10.

Simin Liu, et al.(2002), Am J Clin Nutr 75; 492-8.

Si-Quan Li et al.(2001), Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 41(6);

451-64.

Trudy J Yost et al.(1989), Am J Clin Nutr 49; 326-30.

Wei Shiung Yang et al.(2001), J Clinical Endocrinology & Metabolism. 86;

3815-19.

Wei Shiung Yang et al.(2001), Obesity Research 10(11); 1104-10.

Wei-Shiung Yang et al.(2002), Obesity Research 10(11); 1104-10.

Yuzo Ninomiya et al.(2002), Vitamins and hormones 64; 221-49.

<부록 1> 독성약리병리시험 표준작업지침서(Ⅱ)의 항비만물질 효력검색법

(1) 사료섭취량, 체중 측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법

가. 서 론

비만은 일반적으로 에너지원의 섭취와 체내에서의 에너지 소비의 불균형에 의해 에너

지원이 소비를 능가할 때 과도한 칼로리가 지방조직(adipose tissue)에 저장되는 현

상이 지속됨으로써 유발되므로 시험물질의 비만에 대한 효능을 평가하기 위하여 사료

섭취량과 체중을 측정한다.

나. 시험계획서의 작성

시험계획서는 NITR/SOP/GER/010_02에 따라 작성한다.

다. 시험계

① 시험계의 종류 및 계통 : ICR 마우스

② 시험계의 주령, 성별 및 사용 마리수 : 5-6주령, 수컷, 군 당 10마리

③ 시험계의 공급원

④ 동물의 순화 : 사역구역내에서는 동물을 입수하고, 순화사육한다. 사양관리는 온

도 22.0±1℃, 습도 50±10%, 조도 120 Lux에서 실험기간에 따라 사육하고 물과 사

료는 자유롭게 섭취하도록 한다.

⑤ 실험군 분리 : 실험군 분리는 각 용량군이 균질성이 있는 개체군으로 구성되어야

하기 때문에 NITR/SOP/GTX/002_02에 따라 분리한다.

라. 실험장비

저울

마. 시험물질의 조제 및 투여량 설정

① 시험물질의 조제 : 시험물질의 조제는 NITR/SOP/TSB/008_02에 따라 조제한다.

② 투여량 설정 : 시험물질에 대한 자료를 획득하고 이들 자료 중 독성시험 자료나

효력시험자료(임상시험자료)가 포함되어 있는 경우에는 충분히 활용한다. 투여용

량은 임상투여용량 또는 그 수배에 해당되는 용량으로 한다.

바. 투여경로의 선정

투여경로는 원칙적으로 인체 투여경로와 같은 경로를 택한다. 다만, 부득이한 경우에

는 약동력자료 등을 참고하여 다른 투여 경로를 선정할 수 있다. 투여 경로는 경구

투여, 정맥투여, 복강투여, 피하투여 등이 있다.

사. 투여기간

2주간 투여를 원칙으로 하며, 반복 투여시는 매일 같은 시간에 투여한다.

아. 방법

1) 순서

① ICR 마우스를 군 당 10마리로 하여 시험물질을 사료에 혼합하여 2주간 섭취시킨다.

② 양성대조물질은 0.9% 생리식염수에 녹여 ICR 마우스에 2주간 매일 복강 투여한다.

③ 시험물질을 2주간 투여하는 동안 매일 체중과 사료섭취량을 측정한다.

2) 평가 기준

모든 실험결과는 평균±표준오차로 표기하고 대조군과 투여군과의 차이는 student's

t-test로 유의성을 검정하며 p<0.05인 경우 유의성이 있다고 판정한다.

자. 동물의 처리

시험이 종료되면 모든 동물은 NITR/SOP/GTX/113_02에 따라 처리한다.

차. 업무일지

업무일지는 시험기간 중 시험종사원의 일일업무를 기재하는데 사용되고 NITR/

SOP/GER/013_02에 따라 작성한다.

카. 시험보고서의 작성 및 관리

결과는 NITR/SOP/EST/101_01의 서식 1에 따라 작성한다. 효력검색시험의 결과를 보

고함에 있어 보고, 서식보고서의 표준 구성 등을 규정하므로 시험관련자료를 정확히

반영하고 기록되어야할 내용이 완전히 포함된 신뢰성 높은 보고서를 작성하기 위하여

NITR/SOP/GER/014_02에 따라 작성 관리한다.

타. 자료 및 검체 관리

모든 시험자료 및 검체, 보고서의 분실 파손 및 혼동을 방지하고, 특정보관시설에서

보관관리를 일관성 있게 하기 위하여 NITR/SOP/GER/015_02에 따라 관리한다.

파. 변경사항

SOP 제정번호 및 제정일 : NITR/SOP/EST/101_01(1999.12.31)

(2) 지방조직무게측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법

가. 서 론

항비만 효능을 평가하기 위하여 지방조직의 무게 변화를 측정한다.



다. 시험계




④ 동물의 순화 : 사역 구역내 에서는 동물을 입수하고, 순화 사육한다. 사양관리는

온도 22.0±1℃, 습도 50±10%, 조도 120 Lux에서 실험기간에 따라 사육하고 물과

사료는 자유롭게 섭취하도록 한다.



라. 실험장비

저울










사. 투여기간


아. 방법

1) 순서



③ 동물을 희생시켜 부고환 지방(epididymal fat)을 떼내어 무게를 측정한다.

2) 평가 기준





차. 업무일지











파. 변경사항


(3) 혈중 중성지방, 콜레스테롤 측정법을 이용한 항비만물질 효력 검색법

가. 서론

항비만 효능을 평가하기 위하여 비만의 생화학적 지표인 혈중 콜레스테롤과 중성지질

의 변화를 측정한다.



다. 시험계









라. 실험장비

저울

저온 원심분리기 (High Speed Refrigerated Microcentrifuge)(NITR/INS/BPH/

2304_02)










사. 투여기간


아. 방법

1) 순서



③ 투여가 끝난 후 심장으로부터 채혈하여 전혈을 얻으며 전혈을 10,000rpm으로 10분

간 원심분리하여 혈청을 제조한다.

④ 제조된 혈청으로부터 Technicon RA-XT 시스템을 이용하여 총콜레스테롤과 중성지

질을 측정한다.

2) 평가 기준





차. 업무일지










보관관리를 일관성있게 하기 위하여 NITR/SOP/GER/015_02에 따라 관리한다.

파. 변경사항


(4) 비만유전자 발현 측정법을 이용한 항비만물질 효력검색법

가. 서론

비만 유전자 렙틴(leptin)은 설치류에 투여했을 때 식욕억제와 체중감소효과가 있음

이 보고되었고 렙틴(leptin)을 외측 혹은 3번 뇌실에 직접투여 했을 때도 같은 결과

를 얻었으며 비만 유전자 산물인 렙틴(leptin)은 설치류의 중추신경계 내에 있는 렙

틴(leptin) 수용체에 작용하여 에너지의 균형을 조절한다고 발표되어 있으므로 시험

물질의 항비만 효능 및 기전을 평가하기 위하여 비만 유전자 발현을 측정한다.



다. 시험계









라. 실험장비

저온 원심분리기 (High Speed Refrigerated Microcentrifuge)(NITR/INS/BPH/

304_02)

Scanning densitometer

Gamma counter










사. 투여기간


아. 방법

1) 시험물질처치

① ICR 마우스를 군당 10마리로 하여 시험물질을 사료에 혼합하여 2주간 섭취시킨다.

② 시험물질은 0.9% 생리식염수에 녹여 ICR 마우스에 2주간 매일 복강 투여한다.

2) 마우스 ob cDNA 제조

① 마우스 ob cDNA를 제조하기 위해 마우스 부고환 지방 조직(epididymal adipose

tissue)으로부터 TRIZOL 시액(Life Technologies Inc., Grand Island, N.Y> 14072

U.S.A.)을 이용하여 총 RNA를 분리한다.

② cDNA 합성을 위해 RNA(5㎍)에 primer인 oligo(dT) 0.5㎍과 DEPC를 처리한 물 12㎕

를 더한 다음 70℃에서 10분간 배양하고 1분간 얼음 속에 방치한다.

③ RNA/primer 혼합물을 10×PCR 완충액(2㎕), 25mM MgCl2(2㎕), 10mM dNTP 혼합물(1

㎕), 0.1M DTT(2㎕)을 함유한 반응액에 넣고 가볍게 혼합한 다음 42℃에서 5분간

배양한다.

④ 이 반응액에 SUPERSCRIPT Ⅱ RT(200unit, Gibco BRL Inc.) 1㎕을 첨가하고 42℃에

서 50분간 배양하고 70℃에서 15분간 반응을 끝낸 다음 얼음 위에서 식힌다.

⑤ 이 시험관에 RNase H 1㎕을 넣고 37℃에서 20분간 배양한다.

⑥ ob cDNA을 증폭하기 위해 위의 RT 반응액(1㎕)에 2.5units의 AmpliTag DNA

polymerase(roche molecular systems, Inc., Branchburg, Newjersey, U.S.A.),

2set의 primer(A set; primer1(AATGTGCTGGAGACCCCTGT), primer2

(CAGCATTCAGGCTAACATC), B set; primer 1(GAGGGAT CCCTGCTCCAGCAGCTGCAAGGT),

primer 2(TACATGATTCTTGGGAGCCTGGTGGCCTTT))를 각각 400 pmol, PCR 반응액(100

㎕: provided by Perkin Elmer)을 넣고 94℃에서 3분, 95℃에서 30초, 58℃에서

45초, 72℃에서 45초(35 cycle)동안 PCR(GeneAmp PCR system 9600, Perkin Elmer

Co.)을 수행한다.

⑦ 이 PCR 산물을 한천 겔에서 전기 영동한 결과 나타난 약 500bp와 550bp 중 500bp

cDNA를 RNA 분석을 위해 probe로 사용한다.

3) Northern blot 분석

① Total RNA을 얻기 위해 지방 조직 1g을 TRIZOL 시액(Life Technologies, Grand

Island, N.Y.14072 U.S.A.) 10㎖에 넣고 조직 균질기로 균질화한 다음 포름아마이

드 20㎕에 녹인다.

② RNA(20㎕)을 포름알데히드 반응액(20㎕)에 넣고 65℃에서 10분 동안 가열한 다음

2.2M 포름알데히드를 함유하고 있는 1% 한천겔에 넣고 전기영동한다.

③ 한천겔을 Hybond-N nylon hybridization 막(Amersham International plc)에

blotting하고 [α -32P]dCTP random-priming labelled 마우스 ob cDNA probe로

hybridization한 다음 5×SSC와 0.1% SDS가 들어있는 용액으로 42℃에서 20분간 세

척한다.

④ 이 막을 X-ray 필름에 노출시킨 다음 현상하고 Bio-image 분석기 BAS 2000(Fuji

Film Institution, Tokyo, Japan)을 이용하여 band를 정량한다.

4) 혈중 비만 유전자(leptin) 정량

① 제조된 혈청으로부터 마우스 비만 유전자(leptin) RIA kit(Linco Research Inc.,

St. Louis, MO, U.S.A.)를 이용하여 비만 유전자(leptin)를 정량한다.

② 각 시험관에 분석용 완충액(0.025M EDTA, 0.1% Sodium Azide, 0.05% Triton

X-100, 1% RIA grade BSA를 함유한 0.05 M phosphosaline, pH 7.4) 100㎕, 마우스

비만 유전자(leptin)항체 100㎕ 넣고 4℃에서 20시간 배양한다.

③ 그 다음 [125I] 마우스 비만 유전자 (leptin)(<3μ Ci) 100㎕를 넣고 4℃에서 20시

간 배양한 다음 침전용 시약 1.0㎖을 넣고 4℃에서 20분간 배양하여 3000×g로 원

심분리하고 상등액을 버린 다음 gamma counter로 1분간 counting한다.

5) 평가 기준





차. 업무일지











파. 변경사항


참고문헌

식품의약품안전청 : 독성약리병리시험 표준작업지침서 (Ⅱ). 서울, p.342-351(1999)

체중 관련 기능성 시험 - mediston.com‹¤이어트.pdf · 구화되면서 섭취 칼로리...

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