酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent as

say, ELISA ）

病原生物学实验室 ( 免疫）任书荣

一、实验目的 掌握 ELISA 的原理及方法

二、 principle： 抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍保持其活性；抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，仍分别保持其免疫活性和酶活性。

酶标抗原或抗体与相应抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物时，可以催化底物的水解、氧化或还原，从而产生有色物质。颜色反应的深浅与相应抗体或抗原量相关。

常用的 ELISA 方法包括：间接法、双抗体夹心法、竞争法等。

ELISA 双抗体夹心法 (sandwich assay) 测甲胎蛋白（ α-fetal protein, AFP ）

一、 Principle of AFP detection用抗 AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的 AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗 AFP抗体，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应 AFP的量呈正相关。

principle

E

AFPAb 包被固相载体

+S 显色

E

E

待测 AFP 抗 AFP-E

抗 AFPMcAb 抗体

抗 AFPMcAb 抗体

AFP

双位点一步法：抗 AFP 不同位点的 McAb

二、 material1、 AFP检测试剂盒2 、 AFP参考标准夜（ 0、 25、 50、 100、 200、

400ng/ml）。3 、 DW

4 、终止液（ 2M H2SO4）。5、酶标测定仪、 37℃温箱。6、微量加样器、滴管、吸水纸等。

三、method（一） quantity test1 、 add sample 取包被好的酶标孔 7 孔，进行标记，第 1 － 6 孔分别加

入 AFP 参考标准夜（ 0 、 25 、 50 、 100 、 200 、 400ng/ml ）各 50ul 。第 7 孔加入样品 50ul 。

2 、每孔加酶结合物 1 滴， 37℃15 分钟。3 、 wash在各孔中加入洗液 2 滴 , 轻轻摇动几下 , 弃之 , 然后用蒸馏

水或自来水加满各孔 , 甩掉 , 反复 5 次 , 最后在吸水纸上拍干 .

4 、显色每孔加底物和显色液各 1 滴，轻轻振摇，室温避光反应 5 分

钟，加入 2M H2SO4 100ul 终止反应。5 、酶标仪 450nm 比色，计算结果。

（二） quality test

1． Add sample取包被好的酶标板 3各孔，分别加入阴性对照（ 2

0 ng/ml）、阳性对照（ 400 ng/ml）和待检标本各 50ul，各孔再加入酶结合物 1滴 , 37℃15分钟。

2 、 washing在各孔中加入洗液 2 滴 , 轻轻摇动几下 , 弃之 , 然后

用蒸馏水或自来水加满各孔 , 甩掉 , 反复 5 次 , 最后在吸水纸上拍干 .

3 、 add chromogen每孔加底物和显色液各 1 滴，轻轻振摇，室温避光

反应 5 分钟，观察结果。

四、 result 1． Quantity test 用酶标仪进行比色，以 0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长 45

0nm处分别读取各标准孔和样本孔 OD值，以 OD值为横坐标， AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的 OD值在标准曲线上查出相应标本的 AFP含量。

2． Quality test 在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则 AFP>400ng/ml ，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则 20ng/ml＜ AFP＜ 400ng/ml ，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则 AFP ＜ 20ng/ml ，阴性。

参考范围：正常成人 AFP含量＜ 20ng/ml。

五、 Report

1．简述 ELISA原理及 ELISA双抗体夹心法测 AFP原理。

2 ．记录实验结果。