ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ»

На правах рукописи

БОЛГОВА Светлана Борисовна

РЫБНЫЕ КОЛЛАГЕНЫ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

Специальность: 05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

и биологических активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор технических наук,

профессор Антипова

Людмила Васильевна

Воронеж – 2015

2

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Источники коллагенов 10

1.2 Современные представления о структуре и свойствах коллагенов 14

1.3 Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях

экономики 32

ГЛАВА 2. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Характеристика объектов исследований и условия эксперимента 42

2.2 Порядок проведения экспериментов 43

2.3 Общие методы исследования 45

2.4 Инструментальные и специальные методы исследования 47

ГЛАВА 3. Исследование сырья и обоснование параметров получения

коллагеновых дисперсий

3.1 Обоснование выбора источников рыбного коллагена 57

3.2 Гистоморфологическая характеристика и химический состав

исследуемого сырья 58

3.3 Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновых

дисперсий 62

3.4 Идентификация структурных особенностей коллагена 71

3.5 Оценка качества и безопасности коллагеновых дисперсий 72

ГЛАВА 4. Исследование свойств коллагеновых субстанций

4.1 Определение аминокислотного состава 76

4.2. Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых

белков 77

4.3 Электронно-микроскопический анализ коллагеновых дисперсий 78

4.4 Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий

различного происхождения 82

4.5 Изучение структурообразования коллагеновых дисперсий 86

3

ГЛАВА 5. Разработка рекомендаций по рациональному применению

коллагеновых дисперсий

5.1 Использование коллагеновых дисперсий в технологиях пищевых

продуктов 95

5.2 Проведение технических и токсикологических испытаний в рамках

доклинических исследований 102

5.3 Применение коллагеновых дисперсий в качестве биологически активного

компонента косметических средств 106

ВЫВОДЫ 113

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 115

ПРИЛОЖЕНИЯ 133

4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Рыба и рыбные продукты являются

важным компонентом в пищевом рационе, а для населения ряда стран - основным

продуктом питания. Сложившаяся политическая ситуация и санкции Евросоюза,

США и других сторонников существенно отразились на жизни нашей страны.

Продуктовое эмбарго лишило Россию ряда импортного сырья и продуктов, в том

числе рыбных. [78,143] Поэтому развитие прудового рыболовства и аквакультуры

является актуальным, перспективным и поддерживается Правительством РФ, о

чем свидетельствуют важнейшие стратегические документы: «Водная стратегии

Российской Федерации на период до 2020 года», «Стратегия развития

рыбохозяйственного комплекса Российской Федерации на период до 2020 года»,

«Доктрина продовольственной безопасности Российской Федерации на период до

2020 года» от 24 апреля 2012г. №1853п-П8, в которой выделяются следующие

приоритеты:

• Биофармацевтика и биомедицина с подпрограммой «Биосовместимые

материалы»;

• Пищевая биотехнология с подпрограммами «Глубокая переработка

пищевого сырья», «Функциональные пищевые продукты, включая лечебные,

профилактические и детские», «Пищевые ингредиенты, включая витамины и

функциональные смеси».

Производство прудовой рыбы постоянно растет. Этому способствует

увеличивающийся спрос на недорогую рыбу и умелое использование

экономических рычагов для развития отрасли. [116,122]

Увеличение производства подразумевает разделку и переработку, а,

следовательно, большое количество побочных продуктов, которые в лучшем

случае идут на удобрения или кормовую муку, а в худшем просто на свалку.

Многие из этих отходов содержат функциональный биополимер коллаген – белок,

который благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам нашел

применение во многих отраслях промышленности.

5

В Российской Федерации нет предприятий, получающих коллагеновые белки

из рыбного сырья. Имеются данные [117] о перспективе организации

производства морского коллагена (из кожи морских рыб) на Дальнем Востоке. Но

сейчас этот проект только на стадии НИОКР.

На сегодняшний день в России имеется всего два предприятия,

производящих коллаген: ОАО «Лужский завод «Белкозин» г. Луга Ленинградской

области, построенный еще в советский период и крупнейший в России

промышленный комплекс по производству коллагена на базе Верхневолжского

кожевенного завода в г. Осташкове Тверской области, открывшийся в феврале

2015 года. До его появления практически весь коллаген импортировался

российскими пищевыми заводами из Бразилии и стран Европы [79]. Оба

предприятия используют коллагенсодержащее сырье животного происхождения,

преимущественно спилок шкур крупного рогатого скота.

По данным газеты «Ведомости» компания «Норд Плас» планирует открытие

предприятия по производству коллагена и желатина в особой экономической зоне

«Новоорловская» (ОЭЗ) Санкт-Петербурга. В качестве источников коллагена и

желатина, так же используется животное сырье. Ввод в эксплуатацию намечен на

третий квартал 2015 года. [1,82]

Крупнейшими зарубежными производителями коллагеновых белков

различного направления использования являются: Япония, Китай, Польша,

Германия, США, Дания, Бразилия и Чехия.

Степень разработанности темы

Новые сведения по поиску и использованию коллагенсодержащего сырья,

полученного из прудовых рыб, представляют большой интерес и открывают

перспективы в создании рациональных, экологически чистых, безотходных

технологий функциональных пищевых продуктов, получении эффективных и

безопасных медицинских, фармацевтических и косметических средств.

В России значительный вклад в изучение источников, свойств, способов

получения и применения коллагенов внесли работы Л.В. Антиповой, А.И.

Сапожниковой, Н.В. Меспоровой И.А. Глотовой, О.П. Дворяниновой, С.А.

6

Сторублевцева, Ю.В. Болтыхова, А.Г. Хаустовой, Н.В. Черниги, Э.М. Расулова,

В.И. Воробьѐва, И.М. Чернухи, И.А. Рогова и др.

Исследования проводили в Воронежском государственном университете

инженерных технологий, в рамках Государственного задания №2014/22 НИР

№3017 «Биотехнологии переработки сельскохозяйственных животных и рыб в

обеспечении продовольственной безопасности страны».

Результаты данной диссертационной работы легли в основу заявки на

конкурс Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере

по программе «Участники молодежного научно-инновационного конкурса»

(У.М.Н.И.К.) с темой: «Создание отечественных натуральных косметических

средств из рыб внутренних водоемов» (руководитель Сторублевцев С.А.) на 2015-

2017г. (договор № 0011554 6217ГУ/2015 от 26.06.2015г.), которая стала

победителем.

Цель работы – состоит в обосновании условий создания отечественного

производства коллагеновых субстанций рыбного происхождения для обеспечения

различных секторов экономики.

В рамках поставленной цели были сформулированы и решались следующие

основные задачи:

провести патентно-информационный поиск, обосновать выбор сырьевых

объектов;

гистоморфологическая характеристика, химический и фракционный состав

рыбных шкур как источника функциональных биополимеров;

разработать технологию получения коллагеновых белков, обосновать

параметры и режимы обработки рыбных шкур;

идентифицировать и изучить свойства коллагеновых дисперсий;

выявить структурные особенности коллагеновых белков животного и

рыбного происхождения;

оценить биологическую безопасность в опытах in vivo и функциональную

эффективность коллагеновой дисперсии;

7

разработать практические рекомендации по использованию рыбных

коллагенов в пищевой промышленности и при получении косметических средств;

разработать проекта технической документации на новый вид продукции;

провести апробацию результатов исследований, дать оценку экономической

эффективности новых технических решений.

Научная новизна

Результаты информационно-патентного поиска показали целесообразность

использования рыбного сырья в качестве альтернативного источника

коллагеновых белков. На основание гистоморфологической идентификации

коллагеновых белков в рыбных побочных продуктах переработки, анализа общего

химического состава, количественного соотношения фракций аминокислотного

состава белков в качестве источника предложено использовать шкуру

толстолобика – наиболее распространенной рыбы прудовых хозяйств ЦЧР.

Выявлены закономерности растворения коллагеновых белков шкуры под

действием химических реагентов в результате чего обоснованы условия

получения коллагеновых дисперсий. Идентификация состава аминокислот

показала близость к аналогам животного происхождения, отклонения обозначают

особенности физико-химических свойств методом электрореза и атомно-силовой

микроскопии доказано, что для рыбных коллагенов характерна более выраженная

электрофоретическая подвижность, молекулярная масса лежит в области 212 кДа,

рыбные коллагены характерны выраженными ФТС. Комплекс свойств рыбных

коллагенов позволяет обосновать рациональные пути использования в качестве

пищевой добавки, съедобных покрытий и в составе основ для косметических

средств. Коллагеновые субстанции безопасны, что доказано в опытах in vivo на

теплокровных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость диссертационной работы обусловлена комплексом

исследований направленных на изучение особенностей строения и свойств

коллагенов животного и рыбного происхождения.

8

Разработана и обоснована технология, отвечающая принципам

рационального природопользования, обеспечивающая получение биологически

безопасной и эффективной коллагеновой дисперсии, для различных отраслей

экономики.

Разработан и утвержден проект технической документации на субстанцию

коллагеновую 2 %-я (ТУ 9283-001-02068108-2015). Проведена промышленная

апробация производства рыбных котлет в коллагеновом пленочном покрытии в

кафе «Виктория», г. Бобров, Воронежская обл.; коллагеновой дисперсии рыбного

происхождения ООО «ЛДЦ Альдомед плюс» г. Лиски, Воронежской обл.,

подтвердившая положительные результаты исследований.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологическая основа диссертационного исследования включает в себя

комплекс общенаучных и специальных методов. Основой исследований является

изучение современных представлений о структуре и свойствах, технологии

получения и применения коллагенов различного происхождения. Данная

программа научных исследований основана на принципах рационального

природопользования и направлена на совершенствование ресурсосберегающих и

энергоэффективных технологий получения коллагеновых дисперсий из шкур рыб.

Научные положения, выносимые на защиту.

• технология получения коллагеновых дисперсий;

• результаты сравнительного анализа свойств коллагенов животного и

рыбного происхождения;

• обоснование технических решений по применению коллагеновых

дисперсий в получении функциональных пищевых продуктов и косметических

средств.

Степень достоверности

Достоверность данных, полученных в результате исследований,

основывается на строгих доказательствах и использовании математических

методов. Научные положения, выводы и рекомендации, представленные в

9

диссертационной работе, обоснованы и подтверждены экспериментальными

исследованиями.

Апробация результатов.

Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и

обсуждены на международных, всероссийских научно-практических

конференциях: «Научные перспективы ХХI века. Достижения и перспективы

нового столетия» (Новосибирск, 2015), International congress industrial-academic

networks in cooperation activities for Pharmaceutical, chemical and food fields

(L`Aquila, 2014), «Продовольственная безопасность: научное, кадровое и

информационное обеспечение» (Воронеж, 2014), «Российская аквакультура:

состояние, потенциал и инновационные производства в развитии АПК» (Воронеж,

2012), «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2015), «Инновации и решения в

косметической индустрии», «Инновационные разработки молодых ученых

воронежской области на службу региона» (Воронеж, 2015), LIII отчетной научной

конференции преподавателей и научных сотрудников ВГУИТ за 2014 г.

Разработка экспонировалась на 6-ой межрегиональной специализированной

выставке «Ваше здоровье» в рамках 4-го социального форума «Здоровый мир –

курс на долголетие (г. Воронеж, 2014 г.), VII выставке-фестивале моды и красоты

«Идеаль» (21-23.11.2014г.) (получена награда «За инновационный продукт

отечественного производства»)

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационная работа соответствует 3, 5, 10 и 14 пунктам паспорта специальности

05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 статьи в

журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 11 статей и тезисов

докладов, подана заявка на патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5

глав, выводов, списка литературы из 149 наименований и 4 приложений.

Основное содержание работы изложено на 159 страницах машинописного текста,

содержит 47 рисунков и 26 таблиц.

10

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Источники коллагенов

Коллагены широко применяются в различных областях промышленности.

Однако, производители, как правило, не акцентируя внимание на том, какой

именно вид коллагена добавлен в тот или иной продукт.

На современном рынке фигурируют три разновидности коллагена: животный,

морской и растительный.

Наиболее известным, изученным и применяемым является животный

коллаген, который начали получать с 30-х годов ХХ века из отходов кожевенного

производства (краевые участки шкур, гольевой спилок шкур, гольевая спилковая

обрезь шкур, сухожилия крупного рогатого скота (КРС), гольевой спилок шкур

свиней) и отходы мясной промышленности (костная ткань) [138]. Но из-за

губчатой энцефалопатии (болезни бешенства КРС) и угрозы передачи вируса

человеку, коллаген животного происхождения снят с производства в западных

странах. [41,73,90,92] По мнению Сапожниковой А.И., попадание шкур от

больных животных на предприятия по переработке кожевенного сырья, где в

результате операций золения и двоения шкур образуются гольевая спилковая

обрезь, являющаяся сырьем для получения коллагена, полностью исключено

благодаря тщательному многократному ветеринарно-санитарному контролю.

Кроме того в процессе получения коллагена животное сырье подвергается

действию концентрированных щелочей и органических кислот [125]. По мнению

других источников [74], прионы (безвредные клеточные белки, обладающие

природной способностью превращаться в устойчивые структуры, вызывающие

смертельно опасные заболевания, в том числе коровье бешенство. Они не

содержат нуклеиновые кислоты, чем и отличаются от известных

микроорганизмов: вирусов, бактерий, грибков), устойчивы к распространенным

методам дезинфекции: высоким температурам, замораживанию, высушиванию,

химической обработке спиртами, формальдегидом, кислотами, и ферментами.

11

Даже автоклавированием (134 °C - 18 минут) не достигнуть полного разрушения

прионов, способность которых вызвать заражение сохраняется.

Некоторые специалисты считают, что в коллагене наземных животных

меньше полезных свойств, нежели в растительном и морском. Из-за большого

размера молекул он не доступен глубоким слоям кожи. Но подобный вид

коллагена отлично подходит для производства косметических средств в сфере

ногтевой и парикмахерской индустрии, где необходим поверхностный эффект.

Поэтому его добавляют в препараты для восстановления структуры волос,

смягчения кожи рук, стоп, области локтей. [89]

Морской коллаген начали добывать из кожи морских рыб примерно с 70-х

годов ХХ века. Многие исследователи уделяют ему особое внимание, потому что

рыбий коллаген минимально отличается от человеческого. И, на удивление, более

приближен к нему по биохимическому составу, чем коллаген крупного рогатого

скота. Однако для того, чтобы косметика с морским коллагеном была

действительно эффективной и оказывала выраженное омолаживающее действие,

необходимо сохранение его трехспиральной структуры. [89]

Получению коллагеновых белков из гидробионтов в настоящее время

уделяется много внимания, потому что они обеспечивают дефицит коллагенов

животного происхождения.

В 2000 г. в Европе был запущен проект, объединивший семь крупных

компаний и научно-исследовательских институтов по изучению рыбного

коллагена. Голландский НИИ рыбного хозяйства (RIVO), являясь ведущей

организацией данного проекта, предлагает применять коллаген в косметической и

фармацевтической промышленности для производства кремов и носителей.

Ученые считают, что коллаген может быть основой искусственной кожи, для

людей с серьезными ожогами, позволяющей снизить риск возникновения

инфекционных заболеваний. [55] В университете Хоккайдо учеными созданы

искусственные кровеносные сосуды из коллагена, полученного из кожи лосося.

Изобретение с успехом прошло клинические испытания на крысах, которым

заменили аорты новыми искусственными сосудами.[56]

12

Приверженцы морского коллагена отмечают: температура денатурации

животного коллагена слишком высока для проникновения в кожу, в то время как

морской коллаген более приспособлен для подобного проникновения. Но

необходимо помнить, что средства с таким коллагеном могут вызывать аллергию.

Кроме того, он легче разрушается при низких температурах, чем коллаген

животного происхождения, поэтому разработчиками предъявляются весьма

строгие требования к организации его производства, транспортировке и

хранению. Это обусловливает высокую стоимость средств с морским

коллагеном[119].

Первую эффективную гидратацию коллагена из шкур пресноводных рыб,

используя органические кислоты, произвел в 1985 году коллектив химиков из

Гданьска Мечислав Скродски, Антони Михневич и Генрик Куява. В 1989 году

они получили патент № 144584 на открытый ими «Метод производства раствора

коллагена».[41]

В последующие годы другие польские химики разрабатывали и

совершенствовали этот метод. В результате в 2003 году был получен водный

раствор коллагена в виде дермокосметологического препарата. В 2007 году была

издана (и переиздана в 2009 году с тем же названием) монография «Коллаген.

Новая стратегия сохранения здоровья и продления молодости» украинских

ученых С.А. Батечко и А.М. Ледзевирова, посвященная открытию польских

биохимиков.

Недавно появились российские сведения о возможности получения

коллагеновых субстанций из рыб внутренних водоемов [8,29,41,75,76,145],

которые проявили некоторые преимущества, по сравнению с морскими. В

частности аллергенности, хранимости, стоимости.

В связи с существующей угрозой заражения человека от животного,

возникает вопрос о возможности заражения от рыб. Они, как и крупнорогатый

скот, могут являться переносчиками заболеваний опасных для человека. Чаще

всего они вызываются паразитами, например: дифиллоботриоз, опистархоз,

гнастомоз, меторхоз и д.р. Обезвредить зараженную рыбу можно с помощью

13

посола, глубокой заморозки и длительной термообработки.[42,72,93,99] К тому

же при выделении коллагена сырье обрабатывают химическими реактивами

(щелочь, перекись, органические кислоты), которые так же оказывают

дезинфицирующий эффект.

Что касается растительного коллагена (фитоколлагена), то он хорошо

усваивается кожей, но добывать его труднее, чем животный: не все компании

могут себе позволить производство косметических препаратов, содержащих такой

вид коллагена. [119]

На самом деле коллаген - это белок животного происхождения, а то, что

называют «растительным коллагеном», представляет собой гидролизированный

протеин пшеницы (известны и другие источники), обладающий свойствами

растворимого коллагена и являющийся наиболее подходящей альтернативой

натуральному коллагену животного происхождения. Однако принципиальная

разница в составе аминокислот, а именно отсутствие оксипролина и оксилизина,

ставят под сомнение аналогичность биологического действия препарата. [53]

По мнению автора [61], если на упаковке косметического средства не указан

источник коллагена, то, скорее всего он человеческий. Человеческий коллаген

получают от доноров, трупов, плаценты и абортированных плодов и имеет

низкую вероятность аллергических реакций.

Так же выделяют микроколлаген. Названием микроколлаген определяются, в

основном, небольшие белковые молекулы (олигопептиды), которые имитируют

фрагменты природного коллагена. Эти молекулы оказывают влияние на

выработку коллагена и других элементов дермы. Микроколлаген создается в

биотехнологических лабораториях и модифицируется путем добавления жировых

молекул, которые повышают его устойчивость и позволяют ему лучше проникать

через эпидермальный барьер.[119]

В лаборатории Джеффри Хартгеринка (Jeffrey Hartgerink) в Университете

Уильяма Марша Райса (Rice University) несколько лет назад была разработана

компьютерная модель для расчета стабильной структуры коллагеновых цепочек.

[18] По этой модели был получен синтетический аналог коллагена.

14

Синтетический пептид длиной в 36 аминокислотных остатков способен

формировать тройную спираль и насыщаться водой до формирования гидрогеля.

Учеными было проведено испытание гемостатических свойств нового материала.

Результат показал, что синтетического коллагена связывает тромбоциты и

активирует их, способствует их агрегации. Это значительно ускоряет остановку

кровотечения, и при этом не обнаруживается признаков воспаления. [18]

Поиск новых источников коллагеновых белков, изучение их структуры и

свойств является предметом исследований многих ученых. Это объясняется

появлением современных, высокоточных методов исследования и оборудования,

которые дают возможность глубже изучить строение и свойства этих белков. В

развитии отечественного производства коллагенов следует признать

приоритетность направления по получению рыбных коллагенов.

1.2 Современные представления о структуре и свойствах коллагенов

В организме человека содержится свыше 50 000 индивидуальных белков,

отличающихся первичной структурой, конформацией, строением активного

центра и функциями. Белки построены из 20 химически различных аминокислот,

каждая из которых может занимать любое положение в полипептидной цепи.

Кроме того, белки различаются количеством аминокислот, из которых они

построены.[29,41,44,107,109,142]

Коллаген - основной структурный белок межклеточного матрикса. Он

составляет около 30% общего количества белка в организме, то есть - 6% массы

тела. Название "коллаген" объединяет семейство близкородственных

фибриллярных белков, которые являются основным белковым элементом кожи,

костей, сухожилий, хряща, кровеносных сосудов, зубов. В разных тканях

преобладают разные типы коллагена, а это, в свою очередь, определяется той

ролью, которую коллаген играет в конкретном органе или ткани, то есть

прижизненными функциями. Распределение коллагена в тканях и органах

представлено в таблице 1.1

15

Таблица 1.1

Распределение коллагена в тканях и органах

Типы Гены Ткани и органы

I COL1A1, COL1A2 Кожа, сухожилия, кости, роговица, плацента, артерии,

печень, дентин

II COL2A1 Хрящи, межпозвоночные диски, стекловидное тело,

роговица

III COL3A1 Артерии, матка, кожа плода, строма паренхиматозных

органов

IV COL4A1-COL4A6 Базальные мембраны

V COL5A1-COL5A3

Минорный компонент тканей, содержащих коллаген I и

II типов (кожа, роговица, кости, хрящи,

межпозвоночные диски, плацента)

VI COL6A1-COL6A3 Хрящи, кровеносные сосуды, связки, кожа, матка,

лѐгкие, почки

VII COL7A1 Амнион, кожа, пищевод, роговица, хорион

VIII COL8A1-COL8A2 Роговица, кровеносные сосуды, культуральная среда

эндотелия

IX COL9A1-COL9A3 Ткани, содержащие коллаген II типа (хрящи,

межпозвоночные диски, стекловидное тело)

X COL10A1 Хрящи (гипертрофированные)

XI COL11A1-COL11A2 Ткани, содержащие коллаген II типа (хрящи,

межпозвоночные диски, стекловидное тело)

XII COL12A1 Ткани, содержащие коллаген I типа (кожа, кости,

сухожилия и др.)

XIII COL13A1 Многие ткани

XIV COL14A1 Ткани, содержащие коллаген I типа (кожа, кости,

сухожилия и др.)

XV COL15A1 Многие ткани

XVI COL16A1 Многие ткани

XVII COL17A1 Гемидесмосомы кожи

XVIII COL18A1 Многие ткани, например печень, почки

XIX COL19A1 Клетки рабдомиосаркомы

Например, в пластинчатой костной ткани, из которой построено большинство

плоских и трубчатых костей скелета, коллагеновые волокна имеют строго

16

ориентированное направление: продольное - в центральной части пластинок,

поперечное и под углом - в периферической. Это способствует тому, что даже при

расслоении пластинок фибриллы одной пластинки могут продолжаться в

соседние, создавая, таким образом, единую волокнистую структуру кости.

Поперечно ориентированные коллагеновые волокна могут вплетаться в

промежуточные слои между костными пластинками, благодаря чему достигается

прочность костной ткани. В сухожилиях коллаген образует плотные

параллельные волокна, которые дают возможность этим структурам выдерживать

большие механические нагрузки. В хрящевом матриксе коллаген образует

фибриллярную сеть, которая придаѐт хрящу прочность, а в роговице глаза

коллаген участвует в образовании гексагональных решѐток десцеметовых

мембран, что обеспечивает прозрачность роговицы, а также участие этих структур

в преломлении световых лучей. В дерме фибриллы коллагена ориентированы

таким образом, что формируют сеть, особенно хорошо развитую в участках кожи,

которые испытывают сильное давление (кожа подошв, локтей, ладоней), а в

заживающей ране они агрегированы весьма хаотично.

В межклеточном матриксе молекулы коллагена образуют полимеры,

называемые фибриллами коллагена. Фибриллы коллагена обладают огромной

прочностью и практически нерастяжимы. Они могут выдерживать нагрузку, в 10

000 раз превышающую их собственную массу. По прочности коллагеновые

фибриллы превосходят прочность стальной проволоки того же сечения. Именно

поэтому большое количество коллагеновых волокон, состоящих из коллагеновых

фибрилл, входит в состав кожи, сухожилий, хрящей и костей.[47,107]

Необычные механические свойства коллагенов связаны с их первичной и

пространственной структурами. Молекулы коллагена состоят из трѐх

полипептидных цепей, называемых α-цепями. Идентифицировано более 20 α-

цепей, большинство которых имеет в своем составе 1000 аминокислотных

остатков, но цепи несколько отличаются аминокислотной последовательностью.

В состав коллагенов могут входить три одинаковые или разные цепи.[47,109]

17

Первичная структура α-цепей коллагена необычна, так как каждая третья

аминокислота в полипептидной цепи представлена глицином, около 1/4

аминокислотных остатков составляют пролин или 4-гидроксипролин, около 11% -

аланин. В коллагене отсутствуют такие аминокислоты, как цистеин и триптофан,

α гистидин, метионин и тирозин находятся лишь в очень небольшом количестве.

В составе первичной структуры α-цепи коллагена содержится также необычная

аминокислота - гидроксилизин. Полипептидную цепь коллагена можно

представить как последовательность триплетов Гли-X-Y, где X и Y могут быть

любыми аминокислотами, но чаще в положении X стоит пролин, а в положении Y

- гидроксипролин или гидроксилизин. Каждая из этих аминокислот имеет

большое значение для формирования коллагеновых фибрилл.[44,47]

Пролин благодаря своей структуре вызывает изгибы в полипептидной цепи,

стабилизируя левозакрученную спиральную конформацию. На один виток

спирали приходится 3 аминокислотных остатка, а не 3,6, как это характерно для

вторичной структуры глобулярных белков. Спираль пептидной цепи коллагена

стабилизирована не за счѐт водородных связей (так как пролин их не образует), а

силами стерического отталкивания пирролидиновых колец в остатках пролина. В

результате расстояние между аминокислотными остатками по оси спирали

увеличивается, и она оказывается более развѐрнутой по сравнению с туго

закрученной α-спиралью глобулярных белков.[44,109,142]

Спирализованные полипептидные цепи, перевиваясь друг около друга,

образуют трехцепочечную правозакрученную суперспиральную молекулу,

называемую тропоколлагеном (рис. 1.1). Цепи удерживаются друг около друга за

счѐт водородных связей, возникающих между амино- и карбоксильными

группами пептидного остова разных полипептидных цепей, входящих в состав

трѐхспиральной молекулы. "Жесткие" аминокислоты - пролин и гидроксипролин -

ограничивают вращение полипептидного стержня и увеличивают тем самым

стабильность тройной спирали. Глицин, имеющий вместо радикала атом

водорода, всегда находится в месте пересечения цепей; отсутствие радикала

позволяет цепям плотно прилегать друг к другу.

18

В результате такого скручивания пептидных остовов полипептидных цепей и

наличия удлиненной структуры два других радикала из триады аминокислот Гли-

X-Y оказываются на наружной поверхности молекулы тропоколлагена.

Некоторые комплементарные участки молекул тропоколлагена могут

объединяться друг с другом, формируя коллагеновые фибриллы, причем эти

участки расположены таким образом, что одна нить тропоколлагена сдвинута по

отношению к другой примерно на 1/4 (рис. 1.2) [44,47,142]. Между радикалами

аминокислот возникают ионные, водородные и гидрофобные связи.

Рис. 1.1 - Строение молекулы тропоколлагена (фрагмент)

Рис. 1.2 - Строение коллагеновой фибриллы (фрагмент)

Важную роль в формировании коллагеновых фибрилл играют

модифицированные аминокислоты: гидроксипролин и гидроксилизин.

Гидроксильные группы гидроксипролина соседних цепей тропоколлагена

образуют водородные связи, укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл.

Радикалы лизина и гидроксилизина необходимы для образования прочных

поперечных сшивок между молекулами тропоколлагена, ещѐ сильнее

укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Кроме того, к гидроксильной

19

группе гидроксилизина могут присоединяться углеводные остатки

(гликозилирование коллагена), функция которых пока неясна.

Таким образом, аминокислотная последовательность полипептидных цепей

коллагена позволяет сформировать структуру, с уникальными механическими

свойствами, которая обладает огромной прочностью. Изменение в первичной

структуре коллагена может привести к развитию наследственных болезней.

Рисунок 1.3 – Синтез коллагена

Предшественник коллагена синтезируется на рибосомах. Прежде чем

превратиться в зрелую форму он подвергается значительной модификации в

эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Отщепление сигнального

20

пептида (1) приводит к образованию проколлагена. Молекула проколлагена несет

длинный пропептид. Затем следует гидроксилирование остатков пролина и ряда

остатков лизина (2). Некоторые остатки гидроксилизина дополнительно

гликозилируются (3). Окисление остатков цистеина приводит к образованию

дисульфидных связей (4), которые обеспечивают правильное скручивание

полипептидных цепей в тройную спираль (5). Прежде чем секретироваться в

межклеточное пространство, молекула проколлагена проходит стадии

модификации и правильной сборки. В процессе транспорта через плазматическую

мембрану отщепляются N- и С-концевые пропептиды (6). Коллаген выходит из

клетки и в результате ступенчатой сборки образует микрофибриллы (7). ε-

аминогруппы некоторых остатков лизина подвергаются ферментативному

окислению с образованием альдегидных групп (8). На последнем этапе

происходит конденсация (9) с образованием внутри- и межмолекулярных

поперечных связей, в результате коллагеновые фибриллы приобретают

окончательную структуру, которая характеризуется большой прочностью на

разрыв и высокой устойчивостью к действию ферментов - протеиназ. [29,47]

Долгое время считали, что фибриллярный коллаген отвечает только за

предохранительные и опорные функции. Открытие новых типов коллагена

показало, что для них характерно большое функциональное разнообразие. Но

уникальными белковыми объектами коллагены делает разнообразие уровней

организации, на которых происходит функционирование коллагеновых

полипептидов.

На сегодняшний день известно более двух десятков различных коллагенов.

Для некоторых из них до сих пор продолжается расшифровка первичной

структуры α – цепей, но брутто состав уже известен для многих коллагеновых

субъединиц. Тем не менее, продолжают появляться данные об обнаружении

новых типов коллагенов. [13,17,123].

При изучении коллагена, полученного из различных органов, выяснилось,

что он состоит из разных молекул, которые отличаются друг от друга

аминокислотным составом и физико-химическими параметрами, но имеют

21

одинаковую молекулярную массу. Так же обнаружено, что это различие

обусловлено существованием нескольких разновидностей α-цепей, которые

кодируются разными генами (Никитин и др., 1977; Слуцкий, Симхович, 1980;

Fessler, 1978). Молекула коллагена I типа построена из трех пептидных цепей,

двух α 1(I) цепей и одной α 2(I) цепи. Каждая цепь содержит домен из 338

повторов, образованных из аминокислотных триплетов Gly-X-Y, где Х и Y могут

быть любой аминокислотой, но в большинстве случаев X представлен пролином,

а Y - гидроксипролином. Конформация каждой из пептидных цепей коллагена -

спираль, отличающаяся от α-спирали. В молекуле коллагена все три спирали

перевиты друг с другом, формируя плотный жгут. Все три цепи ориентированы

параллельно; соединяясь "бок о бок", образуют микрофибриллы, которые в свою

очередь, формируют более толстые фибриллы, а из них образуются волокна и

пучки волокон. На сегодняшний день так и не установлено, каким образом

осуществляется "узнавание" цепей, которое необходимое для обеспечения

постоянного отношения α1 : α2, равного 2:1. В культурах хондроцитов,

фибробластов воспаленной десны, некоторых опухолях, амниотических клетках,

костях черепа и сухожилиях обнаружена разновидность коллагена I типа,

состоящая из трех αl(I)-цепей (Слуцкий, Симхович, 1980; Мауnе et al., 1976; Little

et al., 1977; Moro, Smith, 1977; Crouch, Born-stein, 1978). Не установлено, что

именно отражает наличие этих тримеров: аномалию сборки, определенную

стадию дифференцировки или эмбриональные черты клеток. Возможно, что они

представляют собой отдельный тип коллагена [129,134].

Коллаген II типа состоит из трех одинаковых α-цепей, которые отличаются от

α-цепей I типа. По сравнению с I типом у него повышено содержание углеводов.

(Слуцкий, Симхович, 1980; Аlitalo, 1980).

Коллаген III типа, также как коллаген II типа, состоит из трех идентичных α-

цепей. Отличительной особенностью является наличие двух остатков цистеина в

каждой α-цепи. Они находятся около карбоксильного конца и образуют

дисульфидные связи [129]. Коллаген III типа обычно содержится там же, где и

коллаген I типа, в разных соотношениях (Stenman, Vaheri, 1978; Adam-son, Ayers,

22

1979; Alitalo, 1980). Процесс созревания проколлагена III типа замедлен и он

включается in vivo в состав внеклеточного матрикса (Timpl et al, 1977) [40].

Коллагены I, II и III типов называют интерстициальными. Lля них является

характерным образование волокон с периодичной поперечной исчерченностью

(Никитин и др., 1977; Alitalo, 1980). Обнаружена целая группа коллагенов в

составе базальных мембран. Эти коллагены имеют трехспиральную структуру, но

не образуют волокон с поперечной исчерченностью и, видимо, не состоят из трех

идентичных α-цепей. К настоящему времени описано 4 типа коллагенов

базальных мембран, различающихся иммунологически и химически

[40,47,109,134].

Коллаген IV типа в отличие от всех предыдущих, очевидно, совсем не

подвергается процессингу (Minor et al., 1976; Adamson, Ayers, 1979; Crouch,

Bornstein, 1979; Alitalo et al., 1980). В связи с этим он имеет увеличенную

молекулярную массу (140-185 кДа) и содержит дисульфидные связи (Timpl et al.,

1978; Adamson, Ayers, 1979; Tryggvason et al., 1980). Спирализованная часть

молекулы, устойчивая к пепсину, имеет больший размер, чем у интерстициальных

коллагенов (Minor et al., 1976; Adamson, Ayers, 1976). Для коллагена IV типа

характерно высокое содержание 3-оксипролина и углеводов. Показано[129], что

коллаген IV типа состоит из трех идентичных α-цепей, однако позже было

установлено, что в нем имеются две различные цепи, отличающиеся по

подвижности в ПААГ-ДСН (Adamson et al., 1979; Bailey et al., 1979b; Alitalo et al.,

1980 d; Tryggvason et al., 1980). [10].

Еще один тип коллагена базальных мембран был выделен из эмбрионального

материала. Позже этот же тип обнаружили в пепсиновых экстрактах кости и

хряща, а также в базальных мембранах почек. Коллаген V типа состоит из двух

различных α-цепей. Обе цепи по размеру сходны с таковыми интерстициальных

коллагенов (Rhodes, Miller, 1979). В отличие от коллагена IV типа коллаген V

типа не содержит дисульфидных связей и имеет небольшое количество 3-

оксипролина (Burgeson et al., 1976; Rhodes, Miller, 1978, 1979). Соотношение

23

цепей в молекуле точно не установлено. Синтез и созревание коллагена V типа

практически не изучены. [2,3,109,134].

Коллаген VI типа представляет собой вариант коллагенов базальных

мембран, состоящий из двух различных α-цепей. От коллагена V типа его можно

отделить дифференциальным высаливанием (Kresina, Miller, 1979). С-цепь не

содержит цистеина, но он имеется в D-цепи (Kresina, Miller, 1979; Dixit, 1980). У

коллагена VI типа мало 3-оксипролина, но много оксилизина (Glanville et al.,

1979; Dixit, 1980). Стехиометрия молекулы не установлена, но предполагается,

что формула этого коллагена C2D (Kresina, Miller, 1979). Биосинтез, процессинг и

сборка этого типа коллагена не изучены. [12].

Коллаген VII типа плотно держит коллагеновые фибриллы (пучки) базальной

мембраны с коллагеновыми фибриллами из дермы. То есть коллаген VII-го типа

«скрепляет» и удерживает коллагеновые пучки IV-го типа (базальная мембрана,

которая «держит в тонусе» эпидермис), и коллагеновые волокна I и III типов

(основное пространство дермы). Он характеризуется большой компактностью и

стабильной структурой, по сравнению с другими коллагенами. α-цепи данного

коллагена и его метаболизм не исследованы.

Коллаген XI структурно похож на коллаген II типа. Формула коллагена XI

имеет вид α1 (XI)×α2(XI)×α3(XI), причем α3(XI) – цепь, весьма сходна с α1(II) –

цепью, что позволяет предложить, что и α3(IX) и α1(II) - продукты одного гена.

Коллаген IX, α1 (IX)× α2(IX) × α3(IX), существенно отличается по строению от

фибриллообразующих коллагенов, как называют коллагены II и XI. Основное

отличие заключается в том, что N-терминальный участок α1 (IX), несѐт

достаточно крупный доменный участок, а α2 (IX) содержит участок

присоединения гликозаминогликановой боковой цепи [134].

Представленные типы коллагена не показывают все его многообразие.

Изучение их состава и структуры ведется по сей день. Изучение аминокислотного

состава и последовательности чередования аминокислот показало, что существует

два типа цепей – цепи α1 и α2, а также четыре разновидности цепи α1: α1 (I), α1

(II), α1 (III) и α1 (IV).

24

Авторы Ramachandrаn и Karth (1955), а далее авторы Rich и Crick (1967)

обнаружили, что третичная структура коллагена состоит из трех взаимносвитых

цепочек, имеющих общую ось. Длина этой бациллярной формации составляет

около 290 нм, а диаметр 1,4 нм. Речь идет о тропоколлагене, обладающем

способностью агрегирования в фибриллярные формации. [15,21,60,100,144,146].

Изучение спектров коллагена, полученного из сухожилия крысиного хвоста,

авторами [58] показано, что параметры тонкой структуры спектров связаны с

диффузионной подвижностью молекул конституционной воды и с их частичным

упорядочением. [58].

Коллагеновые волокна состоят из различимых в электронном микроскопе

фибрилл – вытянутых в длину белковых молекул, тропоколлагенов. (рис.1.4).

Необходимо четко разграничивать понятия «коллагеновые волокна» и

«коллаген». Первое понятие по существу является морфологическим и не может

быть сведено к биохимическим представлениям о коллагене как о белке.

Коллагеновое волокно представляет собой гетерогенное образование и содержит,

кроме белка коллагена, другие химические компоненты. Молекула

тропоколлагена – это белок коллаген [19,44].

а) б)

Рисунок 1.4 - а) Структура коллагена (по Ричу и Крику) б) различные

уровни структурной организации коллагена (по Кону): 1 - третичная структура; 2

- молекула тропоколлагена; 3 - коллагеновое волокно.

25

Коллагеновые фибриллы имеют различную ориентацию в зависимости от

выполняемой биологической функции соединительной ткани. Так, например, в

сухожилиях, фибриллы коллагена расположены в виде поперечно-связанных

параллельных пучков, которые обладают большой прочностью на разрыв и

практически нерастяжимы.

Последовательность образования тканевых фрагментов на основе

коллагеновых волокон представлена на рисунке 1.5.

Рис. 1.5 - Последовательность образования коллагеновых тканей (на примере

сухожилия)

Основу структурной организации коллагенового волокна составляют

ступенчато расположенные параллельные ряды тропоколлагеновых молекул,

ориентированные в продольном и поперечном направлениях и сдвинутые на

четверть, что обусловливает поперечную исчерченность фибрилл с периодом от

60 до 70 нм (как правило, 64 нм). Упрощенная проекция структуры

тропоколлагена представлена на рисунке 1.6. В каждой из трех цепочек (A, B, C)

отмечаются то, что связи, соединяющие дополнительные цепочки с водородным

атомом α, исходят из центра тройного пучка, тогда как α-углеродные атомы

глицина с двумя водородными атомами находятся вблизи центра. В этом центре

отсутствует пространство для следующего углерода. Если бы на этой позиции

находился иной радикал, нежели глициновый, то все три цепочки были бы

удалены друг от друга в большей степени и не могли бы образовывать

стабилизирующие водородные связи [134]

26

Рисунок 1.6 – Упрощенная проекция структуры тропоколлагена

Аминокислотная последовательность определяет пространственную

структуру белков, а та в свою очередь – биологические и технологические

функции. Следует отметить, что коллаген по сравнению с другими белками

обладает специфическим составом и необычной последовательностью

аминокислот. Все аминокислоты можно разделить на три группы в зависимости

от строения боковой цепи. Первую группу представляют глицин, валин, аланин,

изолейцин, фенилаланин и пролин - это неполярные аминокислоты,

характеризующиеся химической инертностью. Ко второй группе можно отнести

серин, треонин, тирозин, метионин, оксипролин - кислоты, имеющиеся в составе

активные реакционно-способные группы. К третьей группе относят полярные

аминокислоты, диссоциирующие как основания (лизин, оксилизин, аргинин,

гистидин) и как кислоты (глутаминовая и аспарагиновая). Наличие полярных

аминокислот обусловливает высокую реакционную способность коллагена.

Коллаген содержит значительное количество глицина, который распределен в

молекуле вполне равномерно, это означает, что образует каждую третью

аминокислоту в последовательности отдельных цепочек. Это распределение

является условием тесного соединения полипептидных цепочек в трехкратные

спирали. Большое количество данной аминокислоты вызывает высокое

содержание азота в коллагене. Присутствие тирозина в молекуле коллагена стало

предметом длительных споров. Подробные исследования аминокислот показали,

27

что весь тирозин накапливается в терминальных пептидах, не имеющих структуру

спирали, которые можно отщепить протеолитическими ферментами [54].

Следующей типичной аминокислотой коллагена является гидроксилизин,

который встречается также в некоторых других протеинах, например, в шерсти.

Однако в этих протеинах содержание гидроксилизина по сравнению с коллагеном

является небольшим. Его задача состоит в том, чтобы связывать сахаридные

компоненты.

В коллагене довольно редко встречаются лейцин и изолейцин; только

рибонуклеаза и фиброин шелка обладают меньшим содержанием этих двух

аминокислот. Цистеин присутствует в большем количестве только в коллагене

низших животных, в котором он стабилизует структуру с помощью

дисульфидных мостиков; у высших животных он встречается лишь в

регистрационном пептиде α1-цепочки.

Сложность структуры коллагена определяет важные функциональные

свойства этого белка:

– способность сохранять структуру на молекулярном уровне при выделении

из тканей и отделении от других компонентов;

– способность после выделения и перевода в раствор к реконструкции с

образованием различных видов надмолекулярных структур, что широко

используется для получения различных видов искусственных коллагеновых

материалов (ИКМ), находящих применение в пищевой промышленности,

медицине, ветеринарии и др. отраслях народного хозяйства;

– возможность стабилизации надмолекулярной структуры и ее

дополнительного структурирования, лежащие в основе консервирования,

первичной обработки и переработки коллагенсодержащего сырья (выделка кожи

и меха), а также получение искусственных или модифицированных коллагеновых

материалов.

Основными отличительными признаками этого белка являются его

уникальные механические свойства, химическая инертность, его необычный

аминокислотный состав и способность превращаться в желатину - более

28

низкомолекулярный белковый продукт - при длительном нагревании в воде, а

также в водных растворах кислот и щелочей. Весьма актуальным является

изучение изменения структуры коллагеновых структур под действием различных

факторов [14,51].

Ранние исследования показали [86], что коллаген способен растворяться в

разбавленных кислых буферных растворах, из которых он может быть

переосажден в виде фибрилл, обладающих характерной "полосатостью". Другие

биополимеры, присутствующие в коллагене, такие, как полисахариды или

мукополисахариды, являются, как правило, неизменными компонентами этого

белка.

Авторами [115] предложены различные методы интенсификации процесса

растворения коллагена - кавитация на стадии предварительной обработки

коллагенсодержащего материала и механическое перемешивание на стадии

растворения в уксусной кислоте. Для получения чистых, не загрязненных

химическими реагентами продуктов растворения коллагена, применяемых в

качестве сырья в медицине и пищевой промышленности, использована обработка

комплексом ферментных препаратов. Получены коллоидные растворы,

сохранившие волокнистую структуру, необходимую для дальнейшего

использования продуктов растворения коллагена [115].

При обычных условиях волокна коллагена плохо растяжимы. При

нагревании до 60°С влажный коллаген резко сокращается до 1/3-1/4 своей

нормальной длины. После сокращения коллаген приобретает новые свойства; у

него появляется каучукоподобная эластичность, связанная, по всей видимости, с

частичным разрушением поперечных межцепочечных водородных связей. В

присутствии кислот, щелочей и водных растворов солей коллаген поглощает

значительное количество воды. Способность к набуханию коллагена может быть

двух различных типов или быть их комбинацией [16,86]. Первый из них,

известный в практике как '"разбухание", возникает вследствие действия кислот

или щелочей, является неспецифичным и подавляется действием солей. Обычно

он интерпретируется как эффект Доннана, обусловленный наличием заряженных

29

групп в волокнах молекулы коллагена. Такое набухание минимально в

изоэлектрической точке, которая лежит в интервале рН 6.5-8.5. При смещении рН

от изоэлектрической точки в любую сторону оно возрастает до максимума, а

затем, при значениях менее рН 7.0 падает. При набухании фибриллы коллагена

укорачиваются, становятся более толстыми и прозрачными [134,142].

Другой тип набухания наблюдается в растворах нейтральных солей; он хотя

и вызывает утолщение волокон коллагена, но не приводит к укорачиванию их

длины, при этом они расщепляются на тонкие нити. Эти изменения не исчезают

при растяжении волокон, а исходное состояние может восстановиться только

после длительного промывания коллагена от солей водой. Скорее всего, этот

эффект объясняется специфическим действием ионов, которые вызывают

разрушение солеобразных мостиков между коллегановыми цепями.

При нагревании коллагена в водной среде (до 63-64ºС) его структура

деформируется, нити изгибаются, длина их уменьшается до первоначальной

величины. Одновременно фибриллы теряют поперечную исчерченность,

становятся более эластичными и прозрачными. Под микроскопом обнаруживается

очень сильная гомогенизация их микроструктуры. Вследствие теплового

воздействия происходит денатурация, то есть разрушение связей, удерживающих

коллаген в нативной конформации, а также частичный гидролитический распад

по месту пептидных связей. Такой коллаген называют сваренным. Сваренный

коллаген (или желатин) необратимо утрачивает нативные физико-химические

свойства. В результате разрыва поперечных мостиков в структуре коллагена и

увеличения доступности пептидных связей образовавшийся желатин легко

переваривается трипсином и другими ферментами, приобретает свойство

растворяться в воде. Однако образование желатиновых растворов возможно при

достаточно высоких температурах (65-90ºС), при охлаждении эти растворы

застывают, образуя желеподобную массу [54,134].

Ребровой Г.А. и Василевским В.К. изучено влияние УФ-облучения и

радиации (270-380 нм) на биохимические, флуорометрические и

колориметрические свойства коллагена. Показано, что длительное облучение (120

30

часов) сопровождается повышением структурной стабильности коллагена к

действию специфических и неспецифических протеолитических ферментов,

образованием новых дополнительных флуорофор - содержащих соединений,

увеличением количества карбонилов в молекуле коллагена и значительным

изменением характера распределения продуктов щелочного пиролиза белка при

гель - хроматографическом анализе. Изменяются координаты цвета исследуемых

коллагеновых пленок. Эти изменения коллагена показали, что при УФ-облучении

происходят фотомодифицирующие и фотоокислительные процессы в структуре

белка [120].

Сложность и особенности структуры коллагена определяют наиболее важные

биологические функции, среди которых можно выделить:

1. Главная функция коллагена это, конечно, строительная и опорная

роль («клеящая»).

2. Коллагеновые волокна обеспечивают также выносливость основы

собственно кожи во время внешнего нажима и во время ее растягивания.

3. Коллагеновые волокна обладают в природе способностью

выдерживать нагрузки.

4. Коллаген играет также важную роль в регулировании нормальной

полифирации (размножения) клеток. Например: он регулирует активность клеток

гладких мускулов во время клеточного деления.

5. Коллаген задерживает развитие некоторых опухолевых образований,

например, клеток меланомы, в результате совместных действий с интегринами и

индукции ингибитора циклина. В механизмах подавления патологических

клеточных трансформаций принимает также участие гидроксипролин,

структурный признак этого белка.

6. Коллаген обеспечивает возможность роста (адгезии) и укрепления

клеток во внеклеточном матриксе в результате взаимных действий с рецепторами

оболочки.

7. Коллаген стимулирует создание оболочек клеток.

31

Множество наследственных генетических дефектов, связанных с мутациями

в молекулах коллагенов или ферментов, принимающих участие в их биосинтезе,

говорит о важной роли коллагеновых белков. Такие дефекты могут оказывать

влияние на структуру и функцию цитоскелета, связок, сухожилий, кожи, глаз,

кровеносных сосудов, волос и даже размеров тела (например синдром Элера-

Данлоса).

Гидроксилирование остатков пролина и лизина в молекуле проколлагена

катализируется проколлаген-гидроксилазами, имеющими в активном центре

атомы железа. В качестве кофермента используется аскорбат (витамин С).

Симптомы дефицита витамина С, такие, как выпадение зубов, кровоточивость

десен или повреждения кожи (цинга), объясняются нарушением биосинтеза

коллагенов.

Рыбные коллагены по большей части относятся к I и III типам, аналогично

коллагенам скелетных мышц человека. Рыбный и животный коллаген состоит из

субъединиц, закрученных в спираль и имеющих относительную молекулярную

массу 300000. Большое содержание глицина и пролина является характерной

особенностью аминокислотного состава коллагена. Эти аминокислоты

формируют повторяющуюся последовательность: пролин – глицин – Х, где Х –

другая аминокислота. Такая повторяющаяся последовательность и получающиеся

в результате связи обуславливают спиралевидную структуру коллагена. Еще

одной отличительной особенностью рыбного коллагена является более низкое

содержание аминокислот (гистидин, фенилаланин, лизин, лейцин, валин,

аспарагиновая и глутаминовая кислоты) и как следствие, меньшее число

поперечных связей, а также несколько иной аминокислотный состав

(гидроксопролин и гидроксилизин) одной из цепей. Поэтому температура

сокращения и разложения рыбного коллагена ниже аналогичной температуры

теплокровных животных. Так, если коллаген КРС после нагревания в течение 2,5

минут подвергается желатинизации примерно на 10%, то коллаген рыбного

происхождения при тех же условиях разрушается на 50-60 и до 75% [56].

32

Важно отметить, что глубокие исследования особенностей строения

коллагеновых белков, функций, свойств, способов их получения, сохранения в

нативном виде, эффективности и т.д. имеют большое прикладное значение для

различных отраслей экономики, которые используют коллаген в своей

деятельности.

1.3 Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях

экономики

В последние годы в средствах массовой информации часто говорится о

коллагене как о модном средстве, возвращающем молодость коже, придающем

блеск и крепость волосам, здоровье костям и суставам. Однако в медицине и

фармацевтике коллаген нашел широкое применение уже довольно давно.

Коллаген является вспомогательным веществом в технологии различных

лекарственных форм. Коллаген раскрывает всю гамму фармакологических

свойств препарата, обеспечивает оптимальное действие лекарственного вещества,

позволяет снизить концентрацию лекарственного вещества при сохранении

терапевтического эффекта, понижает токсичность ряда лекарственных веществ,

что позволяет вводить эти препараты в большем количестве. [45,55,56,59,84]

Уникальная структура коллагена, наличие на его поверхности большого

количества активных функциональных группировок позволяют использовать его

в качестве матрицы для иммобилизации различных биологически активных и

лекарственных веществ. К настоящему времени изучены комплексы коллагена со

различными веществами. Например, в комплексе с гепарином установлено, что

пролонгированный антикоагуляционный эффект связан с существованием

достаточно прочного коллаген-гепаринового комплекса. После растворения в

крови имеются агрегаты-молекулы гепарин-коллагена, которые функционируют

достаточно активно до тех пор, пока полностью не деградирует белковая часть

комплекса, после чего гепарин инактивируется обычным путем.[57,75,]

33

Большое значение имеет взаимодействие коллагена с антибиотиками.

Коллаген не только пролонгирует действие антибиотиков, но в ряде случаев

снижает их токсичность. [126] Учеными З. Рущак и В. Фрисс (Германия, США)

изучена возможность использования коллагена в качестве носителя антибиотиков

для их доставки к участку воздействия в офтальмологии, стоматологии и для

заживления ран.[87,88]

К достоинствам препарата можно отнести также его способность

избирательно адсорбировать на себе отдельные белковые компоненты

биологических жидкостей, обладающие сродством к определенным участкам

молекулы коллагена, что позволяет эффективно использовать его и как матрицу

при выполнении аффинной хроматографии.

Преимущество коллагена перед синтетическими полимерами заключается в

том, что он является растворимым полимером и подвергается резорбции в живом

организме, сроки которой можно регулировать в широких пределах. [87]

Коллагена обладает способностью ускорять заживление ран, усиливать

адгезию тромбоцитов и вызывать гемостаз и другие свойства при отсутствии

антигенности обусловили его широкое применение в реконструктивной хирургии

(дефекты кожи, обширные ожоги, деформирующие шрамы, пигментация,

хирургия сухожилий, травма мышц и т.д.) [6,9,84,88,91,108]

В медицине на основе коллагена были разработаны различные средства для

быстрой остановки кровотечений (средства местного гемостаза), для лечения ран,

ожогов, трофических язв, пролежней, а также лекарственные формы (мягкие и

жидкие), специальные пластыри, пленки, нити, трубки и губки, импланты для

ортопедии, травматологии, челюстно-лицевой хирургии и др. (рисунок 1.7)

[5,6,33,87,88]

34

а б

в г

Рисунок 1.7 – медицинские коллагеновые продукты: а – дентальные

импланты; б – гель для лечения повреждений кожных покровов; в –

кровеостанавливающие миркотупферы и губка, биоповязка, г – гелевое раневое

покрытие.

В последнее время коллаген становится популярным компонентом БАДов.

Чаще всего его используют в сухом виде. Лиофилизация является одним из

методов получения высушенных продуктов. Она основана на сублимационной

сушке и проводится при температуре ниже 0°С при пониженном давлении. Этот

процесс используется для сушки особенно чувствительных соединений и веществ,

в частности неустойчивых к нагреванию. В результате этого процесса активные

вещества остаются активными и не разрушаются ценные соединений, т.е.

витамины, белки, ферменты, минеральные компоненты и т.д.

Лиофилизированные препараты содержат только следовые количества воды и не

требуют консервирования. После лиофилизации полученный препарат можно

35

легко регидратировать без потери каких-либо органолептических и

биологических свойств. [29,34]

Коллагенсодержащие препараты предназначены для укрепления связок и

суставов, для повышения эластичности кожи, а также для укрепления ногтей,

волос. Так же коллаген показан при высоких нагрузках, в качестве дополнения к

питанию при занятиях спортом, а также после травм. Такие препараты часто

рекомендуют в послеоперационный период. На рисунке 1.8 приведены примеры

таких БАД. [36,103]

а б в

г д

Рисунок 1.8 – Биологически активные добавки с коллагеном: а - «Коллаген-

ультра», производство Франция; б – коллагенсодержащий кофейный напиток

«Nescafe»; в – пептид коллагена «Hua-shen», г – «Артрос», производство Россия, д

- Colvita, производство Польша.

Главным свойством, обуславливающим применение коллагенсодержащего

сырья в косметологии, является его способность стимулировать выработку

собственного коллагена и восстанавливать коллагеновый каркас кожи

(безоперационный лифтинг лица), не маскируя тем самым проблемы, а устраняя

36

их причину. Именно поэтому специалисты в области эстетической медицины

признают коллаген лечебным: по своей эффективности он сопоставим с

инъекциями профессиональных косметологов и для разглаживания морщин не

нужен скальпель. [49,54,56,89]

Коллаген и его гидролизаты часто входят в рецептуры разнообразных

кремов, шампуней, бальзамов, кондиционеров, эликсиров, масок, в том числе

тканевых, коллагеновых листов и др. как влагоудерживающие и питательные

компоненты. Эффективность этих косметических средств объясняется тем, что

коллаген образует пленку, которая действует как влажный компресс и приводит к

снижению трансэпидермальной потери воды кожей. Благодаря гигроскопическим

свойствам коллаген повышает влажность рогового слоя кожи, что позволяет

считать косметические средства с коллагеном геронтопротектором. Крупнейшими

производителями косметики с коллагеном являются Польша (Colway, Kolastyna),

Китай (Hua-shen, TianDe) и Япония (Amicolla, Sakura, EJI, EJI-extra, KWC)(рис.

1.9)[54,89,135,141]

а б

в г

Рисунок 1.9 – Косметические средства с коллагеном: а – крема, гели,

сыворотки; б – препараты для инъекции коллагена; в – коллагеновые нити; г –

коллагеновая маска.

37

В пищевой промышленности коллаген и его гидролизаты используются в

производстве желатина, для осветления вин, получения пищевых пленочных

покрытий и съедобных оболочек, в качестве структурообразователя, при

производстве искусственной икры, бульонов, студней, соусов, различных

оздоровительных напитков и коктейлей и как добавки в хлебопекарном и

кондитерском производствах. [147,148]

Коллаген очень плохо поддается действию пищеварительных ферментов и

является не полноценным белком, что объясняется особенностями

аминокислотного состава. Однако в последнее время роль коллагена в питании

пересмотрена. Физиологическое действие коллагена позволяет отнести его к

пищевым волокнам. В то же время доказано, что при оптимальном сочетании

мышечных белков и коллагенов показатель чистого усвоения белка

максимален.[55,56]

Продукты гидролиза коллагена, такие как глютин, желатин и др.

стимулируют секреторную и двигательную функции ЖКТ, оказывают

положительное влияние на состояние и функционирование полезной микрофлоры

кишечника, поэтому могут быть использованы в качестве аналога пищевых

волокон.[55]

В результате комплекса исследований, проведенных группой авторов под

руководством проф. Антиповой Л.В., изучено коллагенсодержащее сырье

животного и рыбного происхождения, его свойства и способы модификации (в

том числе биотехнологические). Получены коллагеновые дисперсии, определены

их свойства и перспективы применения.

Коллективом ученых под руководством Сапожниковой А.И. был проведен

широкий спектр исследований по получению коллагенов из отходов кожевенного

производства, изучению их свойств и способам применения. [90,125,126]

Дворяниновой О.П. показана возможность получения коллагеновых

дисперсий из кожи морских рыб и ее применение в технологии желейных

продуктов, рубленых полуфабрикатов, как аналогов пищевых волокон и

съедобных покрытий.[75]

38

Предложена технология получения коллагеновой субстанции из шкур

пресноводных рыб. Установлена ее сорбционная способность, в качестве

носителя йода.[76]

Глотовой И.А. обоснованы условия получения и очистки коллагеновых

белков, методами биотехнологии. Получены пищевые дисперсионные системы на

основе коллагенов. Предложена их классификация по технологической

функциональности и прикладному значению.[64,65]

Болтыховым Ю.В. изучался вопрос получения и применения

коллагенсодержащих пленкообразующих композиций с использованием СО2-

экстрактов растительного сырья в технологии мясных продуктов. Такие покрытия

обладают антиоксидантной и бактериостатической активностью, а продукты

имеют улучшенные потребительские свойства, показатели биологической

ценности и сроки годности. [50]

С использованием методов биотехнологии Сторублевцевым С.А. из жилок

КРС был получен коллагеновый гидролизат, который проявляет сорбционную

активность в отношении ионов тяжѐлых металлов и устойчив к действию

ферментов ЖКТ, что дает основание отнести его к аналогам пищевых волокон.

[134]

В результате исследований Вторушиной И.В. обоснован биотехнологический

способ получения коллагена. Доказана нетоксичность и биологическая

активность иммобилизованных коллагеновых препаратов селена. [57]

Галиной Ю.Ф. определены условия биомодификации отходов жиловки

говядины с целью получения продуктов гидролиза. Установлено, что применение

гидролизата коллагена улучшает функционально-технологические свойства

(ФТС) продуктов. [62]

Хаустовой Г.А разработана технология глубокой и комплексной переработки

шкуросырья пресноводных рыб для получения биополимеров: коллагена,

гиалуроновой кислоты и готовых кож. [145]

Пащенко Л.П. было показано, что добавление коллагенового гидролизата в

технологии производства пряников, повышает биологическую и пищевую

39

ценность, а так же позволяет сэкономить сырье, и является экономически

целесообразным. [112]

Кафедра химии ФГОУ ВПО «Кубанского государственного

технологического университета» в течение нескольких лет проводит

исследования в области переработки коллагенсодержащих рыбных отходов с

целью использования их в кормовом и пищевом направлениях. На основании

проведенных исследований разработаны способы получения кормовой белково-

минеральной муки и пищевой добавки [55,56].

Сотрудниками Московского государственного университета прикладной

биотехнологии разработаны технологии применения коллагенсодержащего сырья

при производстве пищевых продуктов (Е.И. Титов, С.К. Апраксина, Л.Ф.

Митасева, А.Ю. Соколов, 2008), показана разработка пищевых продуктов с

использованием субпродуктов II категории и коллагенсодержащего сырья. [138].

Сербскими учеными [20] проведены исследования влияния концентрации

красителей на свойства пищевых коллагеновых оболочек. Установлено, что

красители снижают прозрачность, увеличивают прочностные характеристики

сухих и уменьшает влажных оболочек, не влияют на прохождение водяного пара.

Применительно к технологии продуктов питания с повышенным сроком

годности представляет интерес цикл работ ученых проблемной лаборатории

биополимеров Московского государственного университета прикладной

биотехнологии под руководством Розанцева А.Г. по модификации натуральных,

искусственных белковых оболочек водными растворами антимикробных

действующих веществ в сочетании с добавками синергического действия. В

качестве антимикробных действующих веществ использована натриевая соль

дегидрацетовой кислоты (ДГК) и ее смеси с пищевыми кислотами - лимонной,

молочной и т.д. Улучшение физико-химических свойств модифицированных

коллагеновых оболочек, авторы связывают со специфическими взаимодействиями

в системе коллагеновые компоненты оболочек – ДГК (натриевая соль ДГК) – вода

[134].

40

Широко известны коллагеновые оболочки для мяса и мясных продуктов,

например «Белкозин» (рисунок 1.7). Бразильские ученые [11] разработали

пищевые коллагеновые покрытия для фруктов. Их использование снижет

передачу газов и увеличивает срок хранения.

Рисунок 1.10 – пищевые коллагеновые оболочки

В комбикормовой промышленности коллаген используется для производства

кормов с целью увеличения их биологической ценности, прочности гранул и

увеличения времени их растворения при нахождении в воде. Особенно актуально

использование продуктов гидролиза коллагена при производстве стартовых

комбикормов для молоди ценных пород рыб и гидробионтов, способствующих

увеличению процента их выживаемости. [56]

В зависимости от степени гидролиза отходов рыбопереработки можно

получить продукты с различными свойствами: обогащающую кормовую добавку

(полипептиды, свободные аминокислоты) или увеличивающую пищевую

привлекательность корма.[55,132]

Добавление коллагенсодержащего сырья в корма для птиц, положительно

влияет на оперяемость, сокращает срок линьки и повышает яйценоскость. В

пушном звероводстве способствует получению качественного (прочного,

блестящего) меха.[145]

Коллагеновые гидролизаты используют в качестве питательных сред при

культивировании микроорганизмов.[134]

41

Кроме того коллаген применяется в полиграфии, при производстве

фотопленок, телевизионных трубок и видеокамер, а также используется в

качестве держателя кремниевых чипов в компьютерах и микропроцессорах, в

красках для автомобилей и как клей.[31].

В связи с большой востребованностью коллагеновых белков, остается

актуальным вопрос поиска новых источников безопасных, экономически

целесообразных и эффективных коллагенов.

42

ГЛАВА 2. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЕКТЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристика объектов исследований и условия эксперимента

Объектами исследования служило вторичное коллагенсодержащее сырье

рыбной промышленности - шкуры, выделяемые в качестве отходов при разделке

прудовых рыб в условиях цеха рыбоперерабатывающего предприятия ООО

«Фосфорель» г. Воронежа.

В качестве объекта исследования использовали шкуры следующих видов

рыб: - промысловых – сазан, щука; - прудового выращивания – толстолобик пестрый.

Рыбу в возрасте 3 - 4 года, масса 1 - 3 кг (масса толстолобика в среднем 2,5-3,0

кг на одну голову, щуки - 1,5 – 2,5 кг, сазана 1,0 - 1,5 кг). Сырье доставляли из

Павловского района Воронежской области.

Свежую рыбу очищали от чешуи, удаляли внутренности, отделяли плавники,

голову и хвост. Шкуры с рыбы снимали вручную или на шкуросъемной машине

Nock CF 460 с последующей зачисткой внутренней стороны шкуры от остатков

мышечной ткани, после чего промывали проточной водой при температуре

8-12оС.

Замороженные рыбные шкуры хранили в морозильных камерах при

температуре минус 18ºС, перед использованием дефростировали при 10 – 15ºС в

течение 6 – 12 часов.

Вспомогательное сырье и материалы, применяемые для исследования:

- дистиллированная вода по ГОСТ 6709-72;

- кислота уксусная для пищевой промышленности по ГОСТ Р 55982-2014;

- раствор перекиси водорода по ГОСТ 177-88;

- натрия гидроксид по ГОСТ Р 55064-2012;

43

- спирт этиловый по ГОСТ17299-78;

- культура Parameciа caudatum;

- кислота лимонная моногидрат пищевая по ГОСТ 908-2004;

- кислота янтарная по ГОСТ 6341-75;

- кислота молочная ГОСТ 490-2006;

- мыло хозяйственное твердое 72% ГОСТ 30266-95;

- 2% раствор коллагена животного происхождения по P N 000835/01-170807,

«Белкозин»;

- глицерин дистиллированный. Общие технические условия ГОСТ 6824-96.

2.2 Порядок проведения экспериментов

Экспериментальные исследования проводили в условиях кафедр технологии

продуктов животного происхождения, физической и аналитической химии

Воронежского государственного университета инженерных технологий; научно

исследовательских лабораторий Воронежского государственного медицинского

университета им. Н.Н. Бурденко; научно-исследовательских лабораторий

Пущинского научного центра Российской академии наук (г. Пущино); ФБУЗ

«Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области» (г. Воронеж); ИЦ

«Бирюч» (Белгородская обл.). Схема экспериментальных исследований

представлена на рисунке 2.1

44

Рисунок 2.1 – Схема экспериментальных исследований

Объекты исследования

Шкуры пресноводных рыб: сазан, щука, толстолобик

Химический состав Гистоморфологическая

характеристика

Фракционный состав

белков

Коллагеновые дисперсии

Электрофорез ИК -

спектроскопия

Применение коллагеновых дисперсий

АСМ

Пищевые продукты Биокосметические средства

Сесорометрическая

оценка ароматов

АК

соста

в

Выделение коллагеновых белков:

подбор и обоснование реактивов, концентраций, соотношений и режимов

обработки шкур

Проверка на соответствие

требованиям ТР ТС 009/2011 «О

безопасности парфюмерно-

косметической продукции»

Оценка потребительских свойств

коллагеновых дисперсий

Органолептическая

показатели

Определение ФТС

Расчет

биологической

ценности

Оценка экономической

эффективности

Разработка технической

документации

Подбор методов экспериментальных исследований

Изучение сроков

хранения

Изучение способности к

структурообразованию

Технические и

токсикологические

испытания in vivo

45

2.3. Общие методы исследований

Общий химический состав коллагенсодержащего сырья рыбной

промышленности, коллагена определяли методами:

- массовая доля влаги – термогравиметрическим методом в соответствии с

требованиями ГОСТ 9793-74 [57] и рекомендациям [37];

- жир – рефрактометрическим методом после проведения экстракции жира из

высушенной навески образца монобромнафталином в соответствии с

рекомендациями [37];

- минеральные вещества - гравиметрическим методом после минерализации

пробы в муфельной печи при температурном режиме 500-700 С,

продолжительностью 5-6 часов до постоянного значения массы соответственно

рекомендациям [37];

– белок – методом Кьельдаля [111].

Поваренную соль в пищевых продуктах определяли согласно рекомендациям

[95]

Для определения фракционного состава белков применяли последовательное

экстрагирование дистиллированной водой, солевым раствором Вебера и раствором

гидроксида натрия с массовой долей 10 % водо-, соле- и щелочерастворимых

белковых фракций соответственно, белок количественно определяли биуретовым

методом. [37].

Концентрация белка в растворах определялась с помощью калибровочного

графика, который строили для растворов сывороточного альбумина.

Содержание коллагена в шкурах прудовых рыб количественно определяли

по методу Воловинской [37]. Он основан на экстрагировании фракций

коллагеновых белков с последующим определением в экстрактах белкового азота

методом Биурета.

Определение органолептических показателей осуществляли согласно

методике [37].

46

Микроструктурные исследования шкур исследуемых видов рыб проводили

прямым микроскопированием парафиновых срезов тканей, которые готовили

соответственно методике [37,136]. Образцы для исследования фиксировали в 10

%-м нейтральном формалине. Срезы получали на охладителе микротома ОМТ

0228. Окрашивание проводили методом гематоксилин эозин, где ядерным

красителем выступает квасцовый гематоксилин Эрлиха, основным – эозин В.

Микробиологическую чистоту определяли в соотвествии с указаниями

[67,136].

Водородный показатель измеряли при помощи портативного pH-метра

"HANNA Instruments"HI 8314 F.

Окраску (цветность) жидкостей определяли визуальносогласно рекомендациям

[37,134,145].

Для определения подлинности коллагена проводили биуретовую реакцию

[37,66].

Определение функционально-технологических свойств

Функционально-технологические свойства фаршевых систем включают

показатели: влагосвязывающая (ВСС), влагоудерживающая (ВУС),

жироудерживающая (ЖУС) способности, которые определяли согласно методике

[37].

Определение безвредности и биологической активности проводили на

биотесте (культура Parameciа caudatum). В качестве биотеста использовался легко

культивируемый свободноживущий одноклеточный организм – Parameciа

caudatum, который очень чувствительны и реагирует на активные вещества,

которые могут содержаться в испытуемых объектах и отражает их отношение к

жизнеспособности организма. Исследования проводили в соответствии с

рекомендациями [46,52]

47

2.4 Инструментальные и специальные методы исследований

Идентификацию коллагена определяли методом инфракрасной

спектроскопии [71]. ИК-спектры коллагеновых фракций снимали на

многофункциональном ИК-спектрофотометре Specord M-80 (Германия) и Vertex-

70 в диапазоне 4000-400 см-1

.

Образцы сушили до значения постоянной массы при температуре 37 С,

далее проводили измельчение в вибраторе фон Ардена в течение 4 мин.,

взвешивали 1,5 мг образца и 9,5 мг подготовленного КВr, мешали, брали 2 мг

полученной порошкообразной смеси и помещали в пресс-форму, где путем

вращения пуансона выравнивали поверхность смеси. Дальше смесь подвергали

прессованию (при давлении 150 кг/см2) в течение 10 мин. Получившуюся

таблетку, имеющую диаметр 3 мм, вставляли во внутренние направляющие

держателя спектрофотометра. Все время проведения процесса влажность воздуха

в помещении не должна превышать 75 %.

Рассмотрение спектра начинали с области больших значений волновых

чисел, ориентировочно 4000 – 2500 см-1

. В этой спектральной области

проявляются валентные колебания О-Н-, N-H- и С-Н-связей (рис. 2.2).

Рисунок 2.2 – Инфракрасный спектр органического вещества

48

Колебания свободных, не образующих водородных связей О-Н-групп,

проявляются в виде узкой полосы средней интенсивности в области

3800-3650 см-1

. В этой области О-Н-группы проявляются редко, что обусловлено

стремлением соединений, содержащих О-Н-группы, образовывать водородные

связи. Включение О-Н-групп в систему водородных связей смещает сигнал в

область 3600-3200 см-1

и значительно его уширяет.

Валентные колебания N-H-связей наблюдаются в области 3400-3200 см-1

,

соответствующая им полоса поглощения имеет среднюю интенсивность, из-за

меньшей склонности к образованию водородных связей – небольшую

полуширину. Положение полос, соответствующих валентным колебаниям С-Н-

связей зависит от гибридизации атома углерода.

Спектральная область (2400 – 1900 см-1

) является бедной на сигналы. К

характеристическим колебаниям, проявляющимся в этой области, относят

валентные колебания тройных связей C≡N и C≡С. Положение и интенсивность

полосы, соответствующей колебаниям C≡N-связей, зависит от прочности

образуемых азотом координационных связей, а интенсивность полосы,

соответствующей колебаниям C≡С-связи – от симметрии молекулы относительно

нее.

Аминокислотный состав определяли методом ионообменной хроматографии

на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия).

Метод включает обязательный предварительный гидролиз белков кислотой

или щелочью с целью получения свободных аминокислот. Их затем определяли с

помощью ионообменной хроматографии на колонках, заполненных твердым

носителем, химически соединенным с заряженными группами, которые

обеспечивали электростатическое взаимодействие с исследуемым объектом.

Аминокислоты исследуемого раствора элюируются буферным раствором,

вызывая десорбцию аминокислот, выходящие на колонки в следующем порядке:

кислые, нейтральные и основные.

Окрашенный раствор пропускали через спектрофотометр с длиной волны 570

нм для измерения интенсивности окраски, которая фиксируется самописцем в виде

49

пиков. По расположению пиков судят о наличии индивидуальных аминокислот в

гидролизате, а по площади пиков — об их содержании.

Измеряли площади пиков с помощью потенциометра или вычисляли путем

умножения высоты пика на его ширину, взятую на половине его высоты.

Массовую долю аминокислот рассчитывали по формуле (2.1):

mScт

MSnX

310(1) (2.1)

где Sn– площадь пика соответствующей аминокислоты на полученной

аминограмме, см2;

М – молекулярная масса аминокислоты, Да;

50 – объем раствора, полученный после кислотного гидролиза, см3;

Sст – площадь пика стандартного раствора аминокислоты, см2;

m– масса навески образца, г;

10-3

– концентрация аминокислоты в стандартном растворе, моль/дм3.

В соответствии с прописью метода коллагеновые субстанции подвергали

анализу не менее, чем трех повторностях, в качестве результатов использовали

среднестатистические данные. Исключения составляют инструментальные методы

характерные высокой точности, иллюстративностью.

Оценка молекулярно-массового распределения белковых фракций

образцов

Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8%

полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор

белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в

денатурирующих условиях.

Буферы для электрофореза:

анодный буфер для белкового SDS – электрофореза (10x): 30mМ Tris-HCl (рН

8,45); 1,92М глицин; 1%SDS;

50

катодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-HCl

(рН 8.45), 1.92М глицин;

буфер для концентрирующего геля: 4% акриламид (акриламид: бисакриламид

– 29:1); 0.13M Tris-HCl (pH 6.8); 2% SDS; 0,004% персульфат аммония; 0,003%

TEMED;

буфер для разделяющего геля: 10% акриламид (29:1 акриламид:

бисакриламид); 0,375М Tris-HCl (pH 8.7); 2% SDS; 0.004% персульфат аммония;

0.003% TEMED.

Фракцию растворимых белков анализировали с помощью SDS-электрофореза

в 8% ПААГ. Образцы наносили по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера

использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в

концентрирующем геле (~10% от общего объема геля) напряжение поддерживали

на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение

повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего

из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в

смеси вода:этанол:уксусная кислота (6:4:1). [39]

Идентификация коллагенов на основании электронно-

микроскопического анализа – атомно-силовая микроскопия. [102,121]

Оценку морфологических отличий коллагеновых дисперсий различно

происхождения проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Этот

метод используется для определения рельефа поверхности с разрешением от

десятков ангстрем вплоть до атомарного. Принцип работы атомно-силового

микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между

поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется

наноразмерное остриѐ, располагающееся на конце упругой консоли, называемой

кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к

изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под остриѐм приводит к

изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба

кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод

о рельефе поверхности. [147]

51

При работе в полуконтактном режиме также возбуждаются колебания

кантилевера. В нижнем полупериоде колебаний кантилевер касается поверхности

образца. Такой метод является промежуточным между полным контактом и

полным бесконтактом.

Достоинства метода:

- Наиболее универсальный из методов АСМ, позволяющий на большинстве

исследуемых образцов получать разрешение 1-5 нм;

- Латеральные силы, действующие на зонд со стороны поверхности,

устранены - упрощает интерпретацию получаемых изображений;

Недостатки метода:

- Максимальная скорость сканирования меньше, чем в контактном режиме.

Для калибровки атомно-силового микроскопа Интегра–Вита (NT-MDT,

Россия) были использованы плазмидаpGem длиной 8896 н.п., ДНК фага λ

(Progema, Россия) длиной 48502 п.о. так как изучаемые препараты скорее всего

содержат именно коллаген, который является фибриллярным белком. Препараты

в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на

свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут,

затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут.

Определение суммарных ароматов [96,97,98]

«Электронный нос» – прибор на основе пьезокварцевых резонаторов (ПКР),

который позволяет электронным способом различать всевозможные запахи. Это

набор датчиков с тонкими пленками – полимерами. С помощью которых

определяются отдельные компоненты запаха исследуемого вещества. Схема

прибора представлена на рисунке 2.3.

Пленки формируются методом статического испарения капли раствора

сорбентов. Сорбенты – неподвижные газохроматографические фазы с высокими

параметрами избирательности и эффективности сорбции спиртов, эфиров и

альдегидов (полиэтиленгликоль адипинат ПЭГА, полистирол с метиловым

оранжевым, поливинилприрралидон ПВП), а также нетрадиционные фазы на

основе фотометрических реагентов, природных материалов (пчелиный клей).

52

Химические сенсоры широко применяются в качестве детектирующих

устройств во многих хроматографических методах анализа как самостоятельные

датчики, реагирующие световым или звуковым сигналом на изменение

концентрации в газовых или жидких средах органических и неорганических

соединений различной природы.

Принцип действия химических сенсоров – превращение аналитического

сигнала, возникающего в результате химической реакции анализируемой пробы с

реагентами в околосенсорном пространстве или на поверхности, в любой

физический сигнал.

Электроды 8-и пьезокварцевых резонаторов с собственной частотой

колебания 10 МГц модифицировали путем равномерного нанесения

микрошприцем 0,5-2,0 мкдм3 (в зависимости от концентрации и вязкости

растворов) этанольных растворов полиэтиленгликоль адипината и пчелиного

клея, ацетоновых растворов поливинилпирролидона, смесь полистирола с

индикатором метилового оранжевого с последующим статическим испарением

свободных растворителей в сушильном шкафу. Модифицированные резонаторы

охлаждают в эксикаторе над слоем осушителя до 20±2 °С в течение 10-15 мин.

Масса пленок после охлаждения составила 10-20 мкг.

Сенсоры закрепляли в держателях на крышке и помещали в герметичную

ячейку детектирования.

Подготовка образцов заключалась в отборе средней пробы, которую

помещали в бюкс с притертой пробкой и полиуретановой мембраной,

выдерживали 10-15 мин, после насыщения газовой фазы парами легколетучих

соединений через полиуретановую мембрану отбирали шприцем 3-5 см3

равновесной газовой фазы. Газовую пробу быстро инжектировали в ячейку

детектирования.

Отклики сенсоров регистрировали частотомером или IBM PC в течение 2

мин. Сигналы сенсоров формировали в кинетический «визуальный отпечаток»,

рассчитывали их площадь.

53

Продолжительность анализа составляла 40-50 мин; повторное применение

сенсоров снижает затраты времени до 15-20 мин

Рисунок 2.3 - Схема «электронного носа»

Толщину коллагенового покрытия определяли с помощью программы

Meta Vision v.1.2, согласно руководству пользователю.

Оценка биологической ценности готовых продуктов

Оценку аминокислотной сбалансированности и биологической ценности

продуктов проводили расчетным путем по показателям: аминокислотный скор;

коэффициент различия аминокислотного скора; биологическая ценность

пищевого белка [37].

Значения аминокислотного скора определяли по формуле:

,100j

jj

Aэ

AC

% (2.2)

где Аj – содержание j-той незаменимой аминокислоты в исследуемом продукте,

г/100 г белка;

Аэj - содержание j-той незаменимой аминокислоты, соответствующее

физиологической норме (эталону), г/100 г белка.

54

Коэффициент различия аминокислотного скора (КРАС, %) рассчитывали по

формуле:

,n

РАСКРАС

j

(2.3)

где РАСj – различие аминокислотного скора j-той аминокислоты;

n – количество незаменимых аминокислот.

,CСРАС minj (2.4)

где Сmin – минимальный скор незаменимой аминокислоты оцениваемого

белка по отношению к физиологической норме.

Биологическую ценность белка (БЦ, %) определяли по формуле:

,КРАС100БЦ (2.5)

Проведение технических и токсикологических испытаний в рамках

доклинических исследований проводили согласно рекомендациям

[68,69,70,101,124]

Исследование потребительских свойств коллагеновых дисперсий

проводили методом прямых оценок, то есть осуществляли сбор данных о мнении

респондентов о продукте и его свойствах.

Анализ влияния коллагеновых дисперсий на кожу и волосы осуществляли

с помощью аппаратных методов исследования: корнеометрия, себуметрия,

мексаметрия, определение степени шелушения, определение толщины стержня

волоса, определение степени поврежденности стержня волоса, определение

прочности волоса на разрыв, определение интенсивности блеска волоса,

определение значения статического потенциала, в соответствии с инструкцией к

приборам.

Статистическая обработка результатов эксперимента [137]

Все экспериментальные исследования проведены не менее чем в трех

повторностях, аналитические определения для каждой пробы – в двух-трех

повторностях. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов,

каждое значение является средним как минимум из трех определений.

55

Среднее арифметическое результатов экспериментов вычисляли по формуле:

,n

y

y

n

1kk

(2.6)

где

yk – результат отдельного опыта;

n – число повторностей эксперимента.

Отклонение единичного результата от среднего арифметического:

,yyy kk (2.7)

Квадратичная дисперсия:

,)()()(

n

1k

2kk

2 1nyyyS

(2.8)

Стандартное отклонение единичного результата:

,)1n()yy()y(Sn

1k

2kk

(2.9)

Стандартное отклонение среднего результата:

,)1n(n

)yy(

)y(S

n

1k

2k

(2.10)

Степень адекватности:

),y(StE (2.11)

где

t – критерий.

Величина доверительного интервала:

,Ey (2.12)

Для математической обработки результатов исследований использованы

методы регрессионного анализа с применением градиентного метода и метода

56

наименьших квадратов, линейного программирования. Графические зависимости

на рисунках представлены после обработки экспериментальных данных по методу

наименьших квадратов [134], реализованные в Microsoft Excel.

57

ГЛАВА 3. Исследование сырья и обоснование параметров получения

коллагеновых дисперсий

3.1 Обоснование выбора источников

В последнее время бизнес, связанный с разведением, выращиванием и

переработкой рыбы становится все более популярным. Наравне с

производителями морской рыбы, прудовые рыбные хозяйства имеют большое

значение в системе Агропромышленного комплекса (АПК). Добыча рыбы в

местных прудовых хозяйствах позволяет минимизировать затраты на

транспортировку к месту реализации, повышает уровень занятости людей,

обеспечивает пополнение местного бюджета. К тому же себестоимость прудовой

рыбы меньше морской в 2-4 раза и в 1,5-2 раза по сравнению с мясными

продуктами.

При производстве рыбы и рыбных продуктов перед производителями

возникает вопрос утилизации отходов. На современном этапе рыбные

предприятия являются источниками большого количества органических отходов,

которые быстро разлагаются и наносят вред окружающей среде и человеку.

Поэтому переработка отходов является важной задачей для снятия

напряженности экологической ситуации.

К основным отходам рыбоперерабатывающей промышленности относятся:

головы, кожа, чешуя, внутренности и плавники, которые являются источником

белков, в том числе коллагеновых, и представляют собой важный

продовольственный резерв, который часто недооценивают. Получение коллагенов

является актуальным в связи с дефицитом пищевых белков, в том числе

животных. Согласно литературным данным наиболее перспективным источником

коллагеновых белков является шкура рыб. [8,31,75,76,145]

В соответствии с поставленными целями и задачами оценивали

гистоморфологическую характеристику, исследовали химический и фракционный

58

состав нативных шкур пресноводных рыб, для оценки возможности получения из

них коллагеновых субстанций.

3.2 Гистоморфологическая характеристика и химический состав

исследуемого сырья

Микроструктурный анализ является одним из наиболее объективных и

поэтому был выбран для идентификации коллагеновых структур в шкурах.

От рыбы отделяли голову, хвост, плавники, очищали от чешуи, машинным

способом снимали шкуру, вручную зачищали от прирезей мышечной ткани и

жира, затем промывали.

Шкура рыб является соединительной тканью, существенной особенностью

которой, отличающей ее от других видов, является значительное количественное

преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами.

Межклеточный матрикс состоит из волокнистых компонентов, а пространство

между ними заполнено основным веществом, содержащим гликопротеины.

Коллагеновые и эластиновые волокна являются волокнистыми компонентами [76].

При микроскопировании нативных образцов шкур с применением красителя

Амидо-черный 10б выявили плотную архитектонику дермальной части кожи

щуки (рисунок 3.1 а). В случае препаратов шкур рыб сазана и толстолобика

(рисунок 3.1 б, в), значительную часть занимают межструктурные пространства,

что характеризует рыхлость ткани. Для получения коллагена предпочтительней

использование тканей с более рыхлой структурой, так как для их разволокнения

требуется меньше усилий.

59

в

Рисунок 3.1 Гистоморфологическое строение шкур рыб: а – сазан; б –

щука; в – толстолобик. 1 – коллагеновые волокна; 2 – дерма. Увеличение ×100.

Уточнили химический состав, позволяющий определить перспективность

каждого вида рыбного шкуросырья в получении коллагеновых субстанций.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Сазан Щука Толстолобик

Массо

вая д

ол

я, %

Влага

Ж ир

Белок

Зола

Рисунок 3.2 Химический состав шкур пресноводных рыб

а б

1 1

1

2

2

2

60

Как видно на рисунке 3.2, массовая доля влаги в шкуре пресноводных рыб

колеблется от 73,01 % для сазана до 76,84 % для толстолобика.

Массовая доля белка варьирует от 16,5 % для толстолобика до 18,59 % у

щуки; жира – от 4,79 % для щуки до 7,39 % у сазана; золы, а, следовательно,

минеральных веществ, от 1,38 % для толстолобика до 1,73 % для сазана.

Данные об общем содержании белковых веществ в шкурах использовали для

определения фракционного состава белков.

Рисунок 3.3 Фракционный состав шкур рыб

На диаграмме (рисунок 3.3) видно, что во всех случаях превалирующей

фракцией является щелочерастворимая, максимальное содержание которой

отмечается в шкуре толстолобика, наименьшее – в шкуре щуки. Как известно

[4,29] эта группа белков объединяет протеиноидные белки, главным образом

коллагеновые. В целом же массовая доля протеиноидной фракции

(щелочерастворимой) варьируется в пределах 84,7 - 90,73% относительно общего

содержания белков в объектах исследования.

Так как в данной работе шкуры рыб рассматриваются как альтернатива

коллагенсодержащим источникам животного происхождения, то представляло

интерес определить количественное содержание коллагена в сырье животного и

рыбного происхождения.

61

Количественное содержание коллагена, определяли двумя способами: 1) по

методу В.П. Воловинской; 2) по выплавляемому желатину. Результаты

представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1

Содержание коллагена в исследуемых образцах

Исследуемое сырье Метод Воловинской В.П.,

% от сухого вещества

Выплавление желатина,

% от сухого вещества

Гольевой спилок шкур

КРС (по Сапожниковой

А.И., Месроповой Н.В.)

90,5 89,04

Шкуры рыб 89 86

Из данных таблицы 3.1 следует, что больше коллагена содержится в гольевом

спилке шкур КРС. Показатели содержания коллагена, полученные по методу В.П.

Воловинской выше, чем по выплавленному желатину. Что, вероятно, можно

объяснить несколько большей погрешностью второго метода, а так же

особенностями строения используемого сырья.

Так же проведены опыты, направленные на изучение стабильности

структуры коллагенсодержащих источников. Для чего определяли скорость

выплавления желатина. Результаты представлены в таблице 3.2.

Таблица 3.2

Скорость выплавления желатина

Виды отходов

Выплавленный желатин, % от сухого

вещества

время обработки мин

15 30 45 60

Гольевой спилок шкур КРС (по

Сапожниковой А.И., Месроповой Н.В.) 36,29 55,62 73,88 88,01

Шкуры рыб 42,88 72,12 84,96 86,0

62

Как видно из данных табл. 3.2, в случае рыбного сырья процесс выплавления

желатина происходит быстрее, что, вероятно связано с особенностями

аминокислотного состава образцов, который обеспечивает наличие прочных

связей, укрепляющих структуру коллагеновых фибрилл в случае сырья животного

происхождения.

Так как шкура толстолобика имеет достаточно рыхлую структуру по

сравнению с другими образцами, ее массовая доля белка составляет 16,5%,

большая часть которого (90,73%) приходится на щелочераствоирмые, к которым

относится коллаген, было принято решение выбрать именно этот объект (шкуру

толстолобика) как источник коллагеновых белков. Дополнительно заметим

повсеместную распространенность и невысокую стоимость этого вида сырья.

3.3 Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновых

дисперсий

Результаты исследования гистоморфологической характеристики, химического

и фракционного состава белков шкур рыб и говорят о возможности использования

рыбного шкуросырья как источника коллагена при условии его очистки от

балластных фракций.

Существуют биотехнологические способы очистки коллагена от балластных

веществ [24,29,90,125,130,131,134,138,145]. Однако применение ферментных

препаратов является дорогостоящим, требует жестких условий и увеличивает

количество технологических операций, например, таких как ввод и инактивация

фермента. Немаловажное значение имеет существующий дефицит и высокая

стоимость препаратов

Для разработки модифицированной технологии выделения коллагена

исследовали влияние физико-химических методов модификации на структуру

коллагеновых белков.

Отбеливание, удаление балластных белковых фракций и разрыхление

структуры соединительной ткани возможно при использовании смеси растворов

63

гидроксида натрия и пероксида водорода, данный метод в конце 90-х годов

прошлого века был успешно апробирован для спилка шкур КРС (Сапожникова и

др.). [125] Данный способ так же был применен к рыбным шкурам: образцы шкур

погружали в перекисно-щелочную смесь, концентрацию гидроксида натрия и время

замачивания подбирали экспериментально (таблица 3.3, 3.4), концентрацию

пероксида водорода брали равной 3%, гидромодуль 1:4, а соотношение

компонентов NaOH : H2O2 - 7:3, так как в этом случае наблюдается максимальный

выход – 85%. [145]. Обработку проводили при температуре 2±2 ºС.

Таблица 3.3

Состав пероксидно-щелочных смесей для обработки рыбных шкур

Перекисно-щелочная

смесь, №

Концентрация компонентов, %

NaOH H2O2

1 1 3

2 2 3

3 3 3

4 4 3

5 5 3

Таблица 3.4

Изменение массы шкур в процессе обработки пероксидно-щелочными смесями

Время, ч

Изменения массы, Δm %

Пероксидно-щелочная смесь, №

1 2 3 4 5

0 0 0 0 0 0

1 54,27 55,81 67,95 71,07 66,43

2 90,68 89,93 96,64 96,64 94,38

3 82,84 88,64 92,98 74,92 74,22

4 76,98 81,78 88,68 66,63 63,87

64

Из данных таблицы 3.4 видно, что максимум набухания происходит при

использовании пероксидно-щелочной смеси №3, в течение 2 часов. В течение этого

времени, образцы поглощают порядка 40-45 % смеси от исходного количества и

отбеливаются. Увеличение продолжительности данной операции не приводит к

увеличению выхода продукта, а использование концентрации гидроксида натрия

свыше 3% не целесообразно.

При перекисно-щелочной обработке сырья в результате взаимодействия

компонентов реакционной среды происходит растворение коллагеновых белков за

счет ускорения разрыва водородных связей с экзотермическим эффектом. Кроме

того, воздействие гидроксида натрия и пероксида водорода способствует более

глубокому проникновению щелочи в структуру коллагеновых фибрилл.[145]

После перекисно-щелочной обработки для установления рациональных

условий химической модификации образцов шкуросырья под действием

органических кислот различных концентраций определяли максимальную степень

набухания коллагенсодержащего сырья и рационального соотношения

применяемых реагентов.

Для получения коллагена шкуры заливали растворами органических кислот

различной концентрации: молочной, уксусной, лимонной и янтарной в

концентрациях 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 и 1%, гидромодуль 1:4, при температуре 2±2 ºС.

Результаты представлены на рисунке 3.4.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0,1% 0,3% 0,5% 0,7% 1,0%

Концентрация органических кислот

Сте

пен

ь н

аб

ухан

ия, %

Молочная кислота

Уксусная кислота

Лимонная кислота

Янтарная кислота

Рисунок 3.4 - Степень набухаемости шкур рыб в органических кислотах с

различной концентрацией

65

На диаграмме видно, что наибольшее набухание происходит при обработке

органическими кислотами с концентрацией 0,5%. Наибольшая степень

набухаемости наблюдается в случае уксусной кислоты. Использование уксусной

кислоты с концентрации менее 0,5% не обеспечивает достаточного выхода

продукта. Применение кислоты с большей концентрацией приводит к

перерасходу реагента.

Действие органических кислот на шкуросырье оценивали на уровне

микроструктурных исследований (рис. 3.5)

Рисунок 3.5 – Изменение микроструктуры шкуры рыб: а – контроль (не

обработанная шкура); б – шкура после обработки лимонной кислотой; в – шкура

после обработки молочной кислотой; г – шкура после обработки уксусной

кислотой; д – шкура после обработки янтарной кислотой. Увеличение ×200.

Окраска Гематоксилин-Эозин

В гистологических срезах необработанной шкуры (рисунок 3.5 а) хорошо

просматривается волокнистая структура сырья. После обработки шкуры водным

раствором лимонной кислоты (рисунок 3.5 б) наблюдается набухание, вследствие

чего волокнистая структура просматривается нечетко.

Обработка шкуры водным раствором молочной кислоты (рисунок 3.5 в)

разрушает структуру волокон коллагена. Более существенно изменилась

а б в

г д

66

микроструктура шкуры после обработки еѐ водным раствором уксусной кислоты

(рисунок 3.5 г). Наблюдается сильное набухание с частичной деструкцией

соединительной ткани.

Слабое действие на структурные компоненты шкуры проявил водный

раствор янтарной кислоты (рисунок 3.5 д).

На основании микроструктурных исследований шкуры рыб и подобранной

экспериментальным путем перекисно-щелочной смеси и концентрации

органической кислоты для обработки коллагенсодержащего сырья провели

оценку динамики изменения массы коллагенсодержащего сырья в зависимости от

времени обработки.

Результаты представлены на рисунке 3.6, где видно, что степень набухания

рыбной шкуры после часа максимальна при обработке молочной кислотой.

Однако с увеличением продолжительности обработки наилучший эффект

наблюдается в случае уксусной кислоты и степень набухания имеет наибольшее

значение.

Рисунок 3.6 - Динамика набухания рыбной шкуры в водных растворах

органических пищевых кислот

На основании полученных данных можно обозначить рациональные

параметры обработки коллагенсодержащего сырья, обеспечивающих

максимальный выход продукта (табл. 3.5).

67

Таблица 3.5

Рациональные параметры обработки

Сырье Этап перекисно-щелочной обработки

Шкура

толстолобика

Концентрация

компонентов

смеси, %

Соотношение

компонентов Гидромодуль

Время

обработки, ч

NaOH Н2О2 7:3 1:4 2

3 3

Этап кислотной обработки

Название

кислоты Концентрация, % Гидромодуль

Время

обработки, ч

Уксусная 0,5 1:4 72

На рисунках 3.7-3.10 показаны визуальные изменения шкуры толстолобика в

процессе получения коллагеновой дисперсии.

Рисунок 3.7 - не очищенная шкура толстолобика

На рисунке 3.7 показана шкура толстолобика сразу после снятия с чешуей и

прирезями мяса.

68

Рисунок 3.8 - очищенная шкура толстолобика

На рисунке 3.8 показана шкура толстолобика после очистки от чешуи,

остатков мышечной ткани и промывки.

Рисунок 3.9 - шкура толстолобика после перекисно-щелочной обработки

На рисунке 3.9 изображена шкура толстолобика после обработки перекисно-

щелочной смесью. Произошло набухание и не полное обесцвечивание. При этом

она остается прочной, плохо поддается измельчению.

69

Рисунок 3.10 - шкура толстолобика после обработки уксусной кислотой

На рисунке 3.10 показана шкура толстолобика после этапа обработки

уксусной кислотой. Произошло удаление оставшихся пигментных веществ, легко

поддается измельчению.

Установленные закономерности обосновывают режимы обработки шкур рыб

внутренних водоемов для получения коллагеновой дисперсии. Разработанная

технология реализована в лабораторных условиях с получением дисперсии из

шкуры толстолобика.

В растворенной форме коллаген часто используется в косметической и

медицинской промышленности. В фармацевтической технологии для любого

нового вспомогательного вещества необходимо наличие его стандартной

субстанции. Для коллагена такой субстанцией является 2%-й раствор в 0,2 – 0,5 М

уксусной кислоте щелочно-обработанной дермы КРС [70,145]. Поэтому в ходе

дальнейших исследований мы проводили сравнительный анализ свойств 2%

коллагеновых субстанций рыбного (полученной по предлагаемой нами

технологии) и аналога животного (произведенного на заводе «Белкозин», г. Луга)

происхождения. На рисунках 3.11 и 3.12 показан внешний вид коллагеновых

субстанций различного происхождения. Можно сделать вывод, что коллагеновые

дисперсии животного и рыбного происхождения не имеют внешних различий.

70

Рисунок 3.11 – коллагеновая дисперсия животного происхождения

Рисунок 3.12 – коллагеновая дисперсия рыбного происхождения

71

3.4 Идентификация структурных особенностей коллагена

Инфракрасная спектроскопия (ИК) - один из основных методов анализа

органических соединений. Она основана на поглощении инфракрасного

излучения молекулами изучаемого вещества. При поглощении инфракрасного

излучения происходит возбуждение колебаний и вращений молекул.

Возможности ИК-спектроскопии позволяют определять присутствующие в

молекуле функциональные группы и устанавливать строение индивидуальных

соединений.[]

Для идентификации строения полученной коллагеновой дисперсии из

рыбного сырья был изучен спектр поглощения в инфракрасной области (рисунок

3.13).

Обнаружены характерные полосы поглощения: 3335- 2908, 2404 - 16551611,

1502, 1493, 1211, 893, 611см-1

, что, по литературным данным, соответствует

соединениям типа (CH3,С-H) (3335-2908); (NO2,N-C≡N)(2404-1655);

(C=0,NO2)(1611); (C-C-H)(1431,1211); (893-623)(-C-C,≡C-H), эти данные

подтверждают, что полученная дисперсия рыбного происхождения содержит

коллагеновые белки.

Рисунок 3.13-ИК-спектроскопия коллагена

72

3.5 Оценка качества и безопасности коллагеновых дисперсий

Установлено, что свойства полученной рыбной дисперсии максимально

приближены к аналогу из спилка шкур КРС (табл. 3.6)

Таблица 3.6

Сравнительные характеристики субстанций из спилка КРС и шкуры толстолобика

Показатель Субстанция рыбного

происхождения

Субстанция животного

происхождения

Подлинность Окрашивание в фиолетовый цвет

Прозрачность Прозрачный

Цветность 0,1% раствор коллагена в воде бесцветен

рН 4,8 3,2

Массовая доля сухих веществ 1,95-2% 1,85%

Микробиологическая чистота Категория 1.2. Б

Массовая доля коллагена 0,92 1,75

Как видно из данных таблицы 3.6, дисперсии близки по свойствам, но имеют

и некоторые отличия, связанные, по всей вероятности, с особенностями строения

и способов получения коллагеновых дисперсий.

Все новые лекарственные средства, препараты и добавки должны быть не только

эффективными, но и безвредными для животных и человека. В связи с этим проведено

определение безвредности и биологической активности рыбного коллагена на

биотесте (культура Parameciа caudatum) (табл. 3.7, рис. 3.14 и 3.15). Исследования

выполнены в соответствии с требованиями ВОЗ, Минздрава РФ, Ветеринарно-

фармакологического совета департамента России [67]

73

Рисунок 3.14 - Активность инфузорий в контрольных образцах.

Увеличение х100.

Рисунок 3.15 - Активность инфузорий в разведении 1:1000 при внесении

коллагеновых дисперсий. Увеличение х100.

Таблица 3.7

Биологическая активность коллагена на биотесте P. Caudatum

Разведение

Биологическая

безопасность

Плотность

инокулята

Индекс биологической

активности

Исследуемый объект – коллагеновая дисперсия

1:1000 ИН

1,01± 0,02 1,02± 0,02

1:10000 ИН 1,02± 0,02 1,01± 0,02

1:100000 ИН 1,0± 0,02 1,0± 0,02

74

Из данных табл. 3.7 и на рисунках 3.13 и 3.14 видно, что коллагеновая

дисперсия, полученная из шкур прудовых рыб, не влияет на движение клеток, не

вызывает снижения жизнеспособности и гибели инфузорий, а значит, является

биологически безвредным.

Для дальнейших исследований представляло интерес определить срок и

оптимальный температурный режим хранения, на основе микробиологических

показателей (табл. 3.8).

Таблица 3.8

Результаты определения срока хранения 2%-ого раствора коллагеновой

субстанции из шкуры толстолобика в зависимости от температуры

Продолжительность

хранения, недели

Температура хранения, 0С

0 4 10 15 20

1 - - - - +

2 - - - - +

4 - - - - +

6 - - - - ++

8 - - - + ++

10 - - - + ++

12 - - - + ++

14 - - - + ++

16 - - - + ++

18 - - - + ++

20 - - + + ++

22 - - + + ++

24 - + + ++ ++

26 - + + ++ ++

Примечание:

+ - превышение общего число аэробных бактерий и грибов - суммарно более 10 в

1 см3;

75

+, + - превышение общего число аэробных бактерий и грибов, наличие

энтеробактерий в 1 см3.

На основании табличных данных, можно рекомендовать следующие

режимы и сроки хранения:

При 0 0С – не более 26 недель;

При 4 0С – не более 22 недель;

При 10 0С – не более 18 недель;

При 15 0С – не более 8 недель;

При 20 0С – хранение не рекомендуется.

76

ГЛАВА 4. Исследование свойств коллагеновых субстанций

4.1 Определение аминокислотного состава

Поиск альтернативных источников коллагена является актуальной задачей,

но не менее значимым является изучение строения и свойств коллагенов. Поэтому

в ходе данной работы был проведен сравнительный анализ коллагеновых белков

животного и рыбного происхождения.

Первичная структура белков представлена набором свободных аминокислот,

соединенных пептидной связью. Специфическая последовательность и состав

аминокислот определяют особенности структурных уровней пространственного

строения, а, следовательно, функции белков, в нашем случае коллагенов. [39]

Сравнительные данные представлены в таблице 4.1

Таблица 4.1

Сравнительная характеристика аминокислотного состава коллагеновых

субстанций

Аминокислоты,

мг/100г белка Животный коллаген Рыбный коллаген Отклонения

Аспарагиновая кислота 6,26 ±0,04 7,12±0,04 +0,86

Треонин 1,96±0,02 2,46±0,02 +0,50

Серин 2,96±0,04 4,57±0,04 +1,61

Глутаминовая кислота 9,79±0,04 11,36±0,04 +1,57

Пролин 13,10±0,04 11,67±0,04 -1,43

Оксипролин 10,82±0,02 12,93±0,02 +2,11

Глицин 6,03±0,04 6,72±0,04 +0,69

Аланин 6,43±0,04 10,51±0,04 +3,92

Валин 1,98±0,02 2,65±0,02 +1,33

Метионин 1,54±0,02 1,03±0,02 -0,51

Изолейцин 2,86±0,02 3,83±0,02 +0,94

Лейцин 2,21±0,04 1,98±0,04 -0,23

Тирозин 0,85±0,04 0,99±0,04 +0,13

Фенилаланин 2,35±0,04 2,49±0,04 +0,14

Гистидин 1,22±0,02 0,77±0,02 -0,45

Лизин 5,42±0,04 4,16±0,04 -1,36

Аргинин 6,8±0,02 8,33±0,02 +1,53

77

Как видно из данных таблицы, коллагеновые субстанции различного

происхождения имеют одинаковый набор аминокислот, но характеризуются

разным содержанием отдельных аминокислот, что предполагает различия в

структуре, а, следовательно, в свойствах.

Наибольшее отклонение отмечено в количестве аланина, оксипролина.

Низкомолекулярные аминокислоты создают условия для более компактных

спиралей полипептидных цепей.

Характерной особенностью коллагеновых белков является наличие и высокое

содержание таких аминокислот, как пролин и оксипролин.[47] Из таблицы 4.1

видно, что наибольшие значения имеют именно эти аминокислоты, это

доказывает, что полученная дисперсия содержит коллагеновые белки. Именно эти

аминокислоты обеспечивают формирование специфической вторичной структуры

в виде трехцепочечных спиралей.

Отсутствие триптофана и невысокое содержание серосодержащей

аминокислоты – метионина, так же свидетельствует о наличие коллагеновых

белков.

Существует мнение, что такие аминокислоты как глицин, аланин,

глутаминовая кислота, пролин, серин, аспарагиновая кислота, тирозин могут

принимать участие в синтезе коллагена. Большее содержание этих аминокислот

наблюдается в случае дисперсии рыбного происхождения, что может говорить о

его большей эффективности.

4.2. Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых белков

Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8%

полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор

белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в

денатурирующих условиях.

Образцы наносились по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера

использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в

78

концентрирующем геле (~10% от общего объема геля) напряжение поддерживали

на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение

повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего

из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в

смеси вода: этанол: уксусная кислота (6:4:1). [32] (рис. 4.1)

Как видно на рис.4.1 фракционный состав коллагеновых дисперсий рыбного

и животного происхождения, имеет отличия. Так, для животных коллагенов

характерна миграция фракций в области свыше 212кДа. Имеются фракции,

мигрирующие в области соответствующей диапазону 66-212кДа, что может быть

связано с наличием минорных компонентов и сопутствующих белков. Однако

количество их значительно меньше. Это свидетельствует о том, что даже в

условиях денатурирующего электрофореза основную массу препарата составляет

высокомолекулярные белки, для которых не характерна субъединичная

структура. Для препарата рыбного происхождения также наблюдается миграция

мономеров в высокомолекулярной области, выше 212кДа, однако количество этих

фракций значительно меньше. Основная часть коллагена, полученная из рыбных

шкур, мигрирует в области 212кДа. Также присутствует большое количество

фракций, мигрирующих в области от 45 до 212кДа. [32]

Как видно на рис. 4.1, белки коллагеновых субстанции представляют собой

многокомпонентные системы с различной подвижностью фракций под действием

электрического поля. Это свидетельствует о необходимости глубокой очистки и

выделения фракций для тонких экспериментальных исследований. Возможно, это

свидетельствует о деструктивном воздействии в условиях получения

коллагеновой дисперсии

79

Рис. 4.1 Электрофоретическое фракционирование образцов, содержащих

коллаген. Дорожки 1,4,7,10 – маркеры молекулярной массы; дорожки 2,5,8

дорожки – образец, полученный из кожи рыб; дорожки 3,6,9 – образец,

полученный из спилка шкуры КРС.

Согласно данным [41] коллаген имеет молекулярную массу около 300кДа, по

данным С.А. Батечко и А.М. Ледзевирова коллаген, полученный польскими

учеными из шкур рыб имеет значения 357-362кДа, для цепочек α2 значение около

130кДа, для α1 – 105кДа, а для β – 250кДа и являются доминирующими

единицами [19]. В целом следует отметить сходимость полученной информации с

данными польских и украинских авторов и доказывает наличие третичной

структуры тропоколлагена.

4.3 Электронно-микроскопический анализ коллагеновых дисперсий

В связи с выявленными отличиями электрофоретической подвижности

фракций препаратов полученных из спилка шкур КРС и шкур рыб, представляло

интерес оценить морфологические отличия этих образцов. Для этого

использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Препараты в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на

свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут,

80

затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут. Сканы,

полученные в полуконтактном режиме, выявили ряд морфологических отличий в

препаратах (Рис. 4.2).

[A]

[B]

[B]

81

Рис. 4.2. Визуализация образцов с помощью АСМ. [A] Сканы препаратов,

полученный из спилка шкуры КРС. 1 – Скан 50×50 нм; 2 – Скан 4×6 нм; 3 –

сечение, проведенное поперек молекулы. [B] Сканы препаратов, полученных из

шкуры рыб. 1 – Скан препарата 1,8×1,8 нм; 2-4 – Сечение, проведенное через

молекулярные конгломераты; 5 – Скан препарата 2×2 нм; 6-7 - Сечение,

проведенное через молекулярные конгломераты; 8 – Скан препарата 3,5×3,5 нм; 9

– Сечение, проведенное вдоль наименьшей молекулы.

Изучение морфологии препарата животного происхождения соответствует

общим классическим представлениям о структуре коллагенов. А именно, ширина

молекулы составляет 1-2 нм, а длинна фибриллы более 300 нм, при этом, как

правило, отдельные молекулы закручиваются в общий жгут. Анализ морфологии

препарата, полученного из шкуры рыб, имеет ряд отличий. А именно: ширина

частиц, обнаруженных в поле, составляет 4-5 нм, однако их морфология не

гомогенна и, скорее всего, состоит из нескольких субъединиц. Однако длина этих

частиц относительно одинаковая и составляет около 200 нм, что согласуется с

данными, полученными в условиях денатурирующего электрофореза. Таким

образом, можно сделать вывод о том, что величина молекул, формирующих

фракции препарата рыбного происхождения, имеет значительно меньшие

размеры и, вероятно, более низкие уровни организации пространственной

структуры.

Есть экспериментальные доказательства ряда авторов, что рыбные коллагены

представлены тропоколлагеном, имеющим три структурных уровня [41].

82

Полученные нами данные подтверждают эту версию и дополнительно

указывают на возможно большие возможности в косметической промышленности

и медицине из-за природных особенностей, которые реализованы рядом фирм для

более современных косметических и медицинских средств при отменном эффекте

– стимулировании собственных биосинтетических механизмов организма

человека, а не маскирование имеющихся дефектов.

Таким образом, особенности аминокислотного состава, данные

электрофоретического исследования и атомно-силовой микроскопии

свидетельствуют об имеющихся отличиях в структуре, а, следовательно, и

свойствах.

4.4 Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий

различного происхождения

Рыба, а, следовательно, и отходы от ее переработки, имеют сильный,

специфический запах, обусловленный наличием триметиламина, его окиси или

соединений. Так же на формирование «рыбного» запаха оказывают влияние

липиды. Ненасыщенные липиды при хранении рыбы окисляются в

гидроперекиси, которые являются предшественниками компонентов с

прогорклым запахом. Носителями запаха и вкуса продуктов окисления липидов

являются альдегиды, кетоны и метилкетоны с небольшой молекулярной массой, а

также свободные жирные кислоты с короткой цепью. Для некоторых рыб

причиной запаха может являться наличие легколетучих соединений содержащих

серу. В связи с этим представляло интерес провести оценку суммарных ароматов

коллагеновой дисперсии рыбного происхождения и сравнить с субстанцией

животного происхождения.

Для установления содержания легколетучих соединений в равновесной

газовой фазе (РГФ) над образцами коллагеновых субстанций различного

происхождения сравнивали величины откликов всех выбранных сенсоров в

массиве (табл. 4.2).

83

Таблица 4.2

Отклики сенсоров (Гц) и площадь «визуальных отпечатков» сигналов

сенсоров в РГФ над пробами

Образец ПВП Tw ДЦГ18К6 ПЭГ2000 МО ТХ-

100 ПДЭГС ТОФО

S∑,

Гц.с

Рыбного

происхождения 49 10 8 24 6 19 30 16 1009

Животного

происхождения 25 5 4 14 3 11 15 9 283

Установлено существенное различие содержания легколетучих органических

соединений, на которые настроен массив сенсоров в равновесной газовой фазе

над пробами. При «слепой» органолептической оценке запаха такие пробы

воспринимаются дегустаторами как совершенно различные.

Установлено по откликам отдельных сенсоров, что в равновесной газовой

фазе над образцами содержатся в основном гидрофильные соединения (полярные

легколетучие) и вода, в тоже время заметна концентрация азотсодержащих

соединений и кислот, сложных эфиров. Интенсивность (суммарная концентрация

легколетучих соединений, детектируемая сенсорами) различается в 3,6 раза

между пробами животного и рыбного происхождения.

Для установления различий в составе (качественном и количественном)

легколетучей фракции запаха проследили изменение общего содержания

легколетучих компонентов в РГФ над пробами (рис. 4.4). По форме фигуры

«визуального отпечатка» максимальных откликов всех сенсоров в массиве и

особенно кинетических «визуальных отпечатков» установлена высокая степень их

идентичности, что характеризует близкий химический состав проб.

Проследили изменения в количественном составе РГФ над пробой по

относительному содержанию основных классов легколетучих соединений,

оцененное методом нормировки (табл. 4.3).

84

Таблица 4.3

Относительное содержание компонентов в пробах, ω % масс.

№ пробы

Влага,

другие

полярные

Летучие

кислоты,

спирты

Азот-

содержащие

Алифатические

кислоты

Кетоны,

спирты,

эфиры

Кетоны,

серо-

содержащие

Ароматич.

соед.

Рыбного

происхождения 30,2 11,1 18,5 3,7 14,8 11,7 9,9

Животного

происхождения 29,0 10,5 17,4 3,5 16,3 12,8 10,5

* - отмечены значимые отличия содержания определенных классов

соединений относительно стандарта.

Установлено, что по содержанию основных классов органических

соединений образцы идентичны друг другу. Существенно отличается

концентрация их в пробах. Различия в качественном составе: В коллагеновой

дисперсии рыбного происхождения на 9,2 % меньше спиртов, альдегидов,

кетонов, на 8,6 % специфических и серосодержащих соединений, чем в

коллагеновой дисперсии животного происхождения. Незначительно больше

короткоцепочечных кислот и на 6 % алкиламинов.

Изменения в качественном составе РГФ над пробами проследили с помощью

параметра Аi/j, который показывает постоянство соотношения концентраций

отдельных классов легколетучих соединений в РГФ (табл. 4.4).

По соотношению А абсолютных сигналов сенсоров с пленкой ПДЭГС

(азотсодержащие органические соединения, вода) и с универсальной пленкой

ПВП (ПДЭГС/ПВП) оценивали долю азотсодержащих соединений среди других

полярных соединений и воды. Аналогично оценивали долю кислот (Tw с

18К6/ПВП), спиртов, кетонов (ПЭГ2000/ПВП), других соединений, по которым

установлены некоторые особенности изменения состава анализируемых проб

(табл. 4.4). Если показатели А для проб близки или совпадают для таких

показателей РГФ над пробами по соотношению сигналов сенсоров, то можно

считать, что соотношение содержания в пробах указанных соединений одинаково.

85

Если соотношение сигналов отличается от таковых для проб, то соотношение

концентраций этих групп соединений различно (табл. 4.3).

Коллагеновая дисперсия животного

происхождения

Коллагеновая дисперсия рыбного

происхождения

Сравнение

Рисунок 4.3 «Визуальные отпечатки» максимальных сигналов и

кинетические сигналы сенсоров в РГФ над пробами.

По осям указаны номера сенсоров в матрице. По вертикали – максимальные

отклики сенсоров (Гц).

∆Fmax, Гц

∆Fmax, Гц

∆Fmax, Гц

86

Таблица 4.4

Соотношение сигналов нескольких сенсоров в матрице для тестируемых проб

Пробы Показатель стабильности аромата

АПДЭГС/ПВП АTwс/ПВП АТОФО/ПЭГ2000 А ТХ100/ПВП

Рыбного

происхождения 0,61 0,20 0,67 0,39

Животного

происхождения 0,60 0,20 0,64 0,44

* отмечен параметр с максимальным отклонением от стандарта (контроля).

Установлено, что составы равновесных газовых фаз над пробами близки

между собой, однако интенсивность запаха (концентрация этих соединений) над

образцом рыбного происхождения на 72 % больше, чем над образцом животного

происхождения. Такой результат можно объяснить высокой сорбционной

емкостью рыбных коллагенов, что обусловлено наличием большого количества

функциональных групп, а именно свободных карбоксильных и аминогрупп, что в

свою очередь связано с различиями количественного аминокислотного состава. А

так же тем, что рыбная коллагеновая дисперсия содержит большое количество

альдегидов, аминов, кетонов, серосодержащих соединений, то есть веществ

обуславливающих специфический запах.

4.5 Изучение структурообразования коллагеновых дисперсий

В настоящее время во многих отраслях промышленности, в том числе

пищевой, одним из наиболее перспективных направлений является создание

полимерных упаковочных материалов, отвечающих требованиям безопасности и

экологичности.

Коллаген является природным биополимером, имеет упрочненную структуру

и подходит для получения съедобных пленок и покрытий.

Модельные пленочные покрытия из коллагеновой дисперсии, получение

которой описано в п. 3.3, разбавляли дистиллированной водой до 2-х %сухих

87

веществ, формовали следующим образом: сухую, обезжиренную, пластиковую

поверхность (проводились испытания со стеклянной и тефолоновой

поверхностями, но наилучший результат достигается при использовании

пластика) устанавливали горизонтально, на нее, методом налива с последующим

равномерным распределением (с помощью шпателя) наносили коллагеновую

дисперсию. Сушку проводили при температуре 20оС, без дополнительной

конвекции, с принудительной циркуляцией воздуха и без нее. Степень высыхания

определяли сенсорным методом по внешнему виду и по изменению массы

пленочных покрытий.

По достижении необходимой степени высушивания, фиксировали время

сушки, которое составило около 10 часов с принудительной циркуляцией воздуха

и около 15 без нее. Пленочное покрытие, полученное из 2% коллагеновой

дисперсии, прозрачное, тонкое, не эластичное, при снятии с подложки рвется.

Поэтому для улучшения качества пленочного покрытия было принято решение

ввести пластификатор. В качестве такого вещества был выбран глицерин (Е422).

Он часто используется при производстве пленок для пищевых продуктов, имеет

широкую доступность, низкую стоимость и разрешен в большинстве стран мира.

Для подбора оптимальной концентрации в коллагеновую дисперсию добавляли, в

5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 % глицерина. Полученные смеси перемешивали до

однородного состояния, после чего делали модельные покрытия по методике,

описанной выше.

Анализ полученных данных о влиянии соотношения коллагена и

пластификатора в смеси на процесс пленкообразования (табл. 4.5) показал, что

пленки с концентрацией глицерина от 5 до 40 % имеют заметные отличия.

88

Таблица 4.5

Характеристика пленочных покрытий, полученных из коллагеновых

дисперсий с добавлением глицерина в различных концентрациях

Концентрация

глицерина, % Характеристика пленочных покрытий

0 Прозрачное, тонкое, при снятии рвется, не эластичное

5 Прозрачное, тонкое, при снятии рвется, слабоэластичное

10 Прозрачное, тонкое, эластичное, снимается

15 Прозрачное, тонкое, эластичное, снимается

20 Прозрачное, тонкое, эластичное, снимается

25 Прозрачное, тонкое, эластичное, снимается хуже, чем при 20%

30 Прозрачное, тонкое, не эластичное, не снимается, рвется

35 Прозрачное, тонкое, не эластичное, не снимается, рвется

40 Прозрачное, тонкое, не эластичное, не снимается, рвется

Из данных таблицы 4.5 видно, пленочные покрытия приемлемого качества

получаются при добавлении к 2-х% коллагеновой дисперсии от 10 до 20%

глицерина (рисунок 4.4). Добавление 25-40% приводит к перерасходу глицерина,

ухудшению механических свойств пленочных покрытий (рисунок 4.5).

Рисунок 4.4 Коллагеновая пленка с содержанием глицерина 10%

89

Рисунок 4.5 Пленочное покрытие, полученное из коллагеновой дисперсии с

добавлением 35% глицерина

Bзменение свойств растворов с различной концентрацией коллагена и

пластификатора при переходе из жидкого состояния в твердое, объясняется

резким и скачкообразным замедлением релаксационных процессов в полимерах.

При любых сочленениях двух твердых разнородных материалов обычно

возникают напряжения, обусловленные различием их физических свойств и

наличием адгезионного контакта. Основным внутренним фактором, вызывающим

возникновение напряжений, является процесс испарения растворителя, в данном

случае воды. При уменьшении количества растворителя в момент достижения

определенного его значения пленочное покрытие начинает приобретать упругие

свойства; одновременно в нем возникают внутренние напряжения, являющиеся

результатом усадки. Введение пластификатора в полимер, особенно аморфного

строения, позволяет снизить, а при определенных концентрациях и полностью

устранить возникающие напряжения [113].

Молекулы пластификатора предназначены для уменьшения сил притяжения

между молекулами белка при низких значениях влажности и для увеличения

гибкости пленок. Важно отметить, что остаточное содержание влаги в пленочном

покрытии также выступает в качестве пластификатора для гидрофильных пленок,

и, видимо, поэтому белковые пленочные покрытия становятся более хрупкими в

условиях низкой влажности (рисунок 4.6).

90

Рисунок 4.6 Коллагеновая пленка без добавления пластификатора

Использование коллагеновой дисперсии, содержащей более 2-х % сухих

веществ не является целесообразным в виду получения пленочных покрытий

очень низкого качества, независимо от количества внесенного глицерина.

(рисунок 4.7)

Рисунок 4.7 Пленочное покрытие, полученное из 7% коллагеновой дисперсии

с добавлением 10 % глицерина

Таким образом, для получения пищевых пленочных покрытий нами была

выбрана коллагеновая дисперсия с содержанием сухих веществ 2% с добавлением

10% глицерина в качестве пластифицирующего вещества. Для этой смеси и

полученных из нее пленочных покрытий, были определены параметры,

представленные в таблице 4.6.

91

Таблица 4.6

Параметры пленкообразующих растворов и полученных из нее пленочных

покрытий

Показатели

Растворы

Коллагеновая дисперсия Коллагеновая дисперсия с

10% глицерина

Водородный показатель

(рН) 6,2-6,3 6,0-6,1

Вязкость, Па*с 8,66 7,21

Температура коагуляции

полимера, оС

47 оС 57

оС

Масса 1 м2 пленки, г 86,1 96,2

Массовая доля влаги, % 15 15,3

Одним из важных факторов, определяющих технологические свойства

пленкообразующей смеси, является толщина покрытия, образующегося на

поверхности продукта.

Для ее оценки использовали морфометрическое исследование образцов,

основанное на микроскопировании и измерении толщины покрытия. В качестве

образцов служили срезы 1х1 см, приготовленные из рыбного изделия покрытого

пленкообразующей смесью. Микроскопирование проводили при малом

увеличении (х3,8, zoom х 4, кратность 22,8) на микроскопе фирмы Биомед,

измерение толщины с помощью программы Meta Vision v.1.2, одно деление

стандарта соответствовала 10 мкм = 1,503 точки (рисунок 4.8, 4.9).

Исследования проводили для закономерно повторяющихся структур среза,

где измеряли ширину изучаемого участка образца.

92

Рисунок 4.8 Рабочее окно программы Meta Vision для коллагенового

покрытия без добавления пластификатора

Рисунок 4.9 Рабочее окно программы Meta Vision для коллагенового

покрытия с добавлением пластификатора

93

Таблица 4.7

Расчет показаний программы Meta Vision для коллагенового покрытия без

добавления пластификатора

Величина измеренного

участка, точек Коэффициент перевода

Ширина изучаемого

участка, мкм

78,5875

1,503

52,2871

78,7909 52,4224

81,0882 53,9509

80,3617 53,4675

78,1875 52,0209

Таблица 4.8

Расчет показаний программы Meta Vision для коллагенового покрытия с

добавлением пластификатора

Величина измеренного

участка, точек Коэффициент перевода

Ширина изучаемого

участка, мкм

134,35

1,503

89,3879

135,059 89,8596

139,09 92,5416

137,004 91,1537

134,134 89,2442

Среднюю толщину рассчитывали по формуле:

n

h

h

n

i

i

ср

1

, (4.1)

где hi –ширина исследуемого участка образца;

N - количество всех исследованных участков.

94

8298,525

0209,524675,539509,534224,522871,521

срh мкм;

4374,905

2442,891537,915416,928596,893879,892

срh мкм,

где hср1 – средняя толщина для пленочного покрытия, полученного из

коллагеновой дисперсии без добавления глицерина в качестве пластификатора;

hср2 – средняя толщина для пленочного покрытия, полученного из

коллагеновой дисперсии с добавлением глицерина в качестве пластификатора;

Таким образом, коллагеновая дисперсия и смесь коллагеновой дисперсии и

10 % глицерина позволяет получить пленочные покрытия, которые можно

использовать для формирования пищевых оболочек, однако требует доработки

технологии, внесения дополнительных веществ и, скорее всего, дубления.

95

ГЛАВА 5. Разработка рекомендаций по рациональному применению

коллагеновых дисперсий

5.1 Использование коллагеновых дисперсий в технологиях пищевых

продуктов

В соответствии с современной теорией питания роль соединительнотканных

белков пересмотрена. Установлено положительное влияние ингредиентов

соединительной ткани на процесс пищеварения, состояние и функцию полезной

кишечной микрофлоры. Коллаген является аналогом пищевых волокон, а его

технологические качества позволяют разрабатывать модифицированные

рецептуры рыбных полуфабрикатов. Оценка таких функционально-

технологических свойств как влагоудерживающая способность (ВУС),

влагосвязывающая способность (ВСС) и жироудерживающая способность (ЖУС)

необходима при производстве полуфабрикатов.

В качестве объектов исследования были выбраны: рыбный фарш (минтай) без

добавления коллагена в качестве контроля и рыбный фарш, с массовой долей

замены в нем основного сырья на коллагеновую дисперсию от 5-25%. Показатели

ВСС, ВУС, ЖУС приведены на рисунке. 5.1.

50

55

60

65

70

75

80

0 5 10 15 20 25

массовая доля коллагеновой

дисперсии, %

ФТ

С, % ВСС

ВУС

ЖУС

Рисунок 5.1 Влияние количества коллагеновой дисперсии на функционально-

технологические свойства модельного фарша

96

Одним из важнейших показателей фарша является ВСС. В процессе

термической обработки происходят физико-химические, коллоидно-химические

изменения, в результате которых часть воды и жира, связанные с сырым фаршем,

определяются в виде потерь массы. В составе фарша удерживается влага,

количество, которой характеризуется соответствующей ВУС. При этом ВУС

характеризует содержание влаги в фарше и количество влаги, отделившейся в

процессе тепловой обработки. Этот показатель связан с выходом готовой

продукции.

Увеличение ВУС фарша с добавлением коллагеновой дисперсии объясняется

тем, что в процессе тепловой обработки происходит процесс клестеризации и

желатинизации его составных частей, в результате чего образуется коллоидная

система.

Коллаген в технологии рыбных продуктов использовали для модификации

рецептуры котлет «Юбилейные». Результаты модификации рецептуры котлет и

схема их производства представлены в табл. 5.1 и на рис. 5.2.

Таблица 5.1

Традиционная и модифицированная рецептура котлет «Юбилейные»

Компоненты рецептуры

Массовая доля компонента в рецептуре, %

Традиционная рецептура Модифицированная

рецептура

Фарш рыбный 60 40

Коллагеновая дисперсия - 20

Морковь свежая 15 15

Лук репчатый свежий 9 9

Манная крупа 5 5

Сухари панировочные 6 6

Зелень (укроп/петрушка) 3 3

Соль поваренная 1 1

Перец черный молотый 1 1

Итого: 100 100

97

Рисунок 5.2 – Структурная схема производства рыбных котлет «Юбилейные»

Фарш рыбный размораживают при температуре +15 оС в течение 10-12 ч.

Затем добавляют коллагеновую дисперсию (20% от массы фарша). Свежие овощи

(морковь и репчатый лук) проверяют, очищают, промывают холодной водой и

измельчают. Зелень свежую или предварительно замоченную сухую, проверяют,

промывают, измельчают и добавляют в фарш. Далее всыпают манную крупу.

Соль и перец добавляют в сухом виде, предварительно просеивая. Перемешивают

компоненты фарша на фаршемешалке до образования однородной массы, причем

температура фарша должна быть не выше 14С. Из приготовленного фарша

формуют котлеты овальной формы, затем панируют.

Замораживают полуфабрикаты в морозильных камерах до температуры в

центре фарша не выше минус 10 С, соответственно режимам, рекомендуемым

действующими технологическими инструкциями.[66]

Добавление 20% коллагеновой дисперсии обеспечивает удовлетворение

потребности в пищевых волокнах на 10% от нормы в пересчете на 100 г готового

продукта.

В таблицах 5.2, 5.3 представлены результаты исследования

органолептических, физико-химических и микробиологических исследований.

Овощи: лук, морковь Манная крупа Рыбный фарш

Составление фарша

Коллагеновая

дисперсия

Специи:

соль, перец

Формовка

Замораживание

Сухари

панировочные

Упаковка и

маркировка

Зелень

укроп/петрушка

98

Таблица 5.2

Органолептические и физико-химические показатели рыбных котлет

"Юбилейные"

Наименование

показателя

Значение показателя

«Юбилейные»

традиционная рецептура

«Юбилейные»

модифицированная

рецептура Внешний вид

(форма/цвет)

Овальная/цвет панировки

Консистенция Нежная, сочная, некрошливая

Вид фарша на разрезе Фарш равномерно перемешан

Вкус и запах Свойственные доброкачественному сырью, с

ароматом лука, без посторонних привкуса и запаха

Массовая доля, %

Влаги 58,9 61,7

Жира 17,3 18,7

Белка 12,7 14,0

Выход, % 82,2 85,0

Таблица 5.3

Микробиологические показатели котлет "Юбилейные"

Показатель Значение

Количество КМАФАМ, КОЕ в 1 г, не

более 110

4

БГКП (колиформные) в 0,0001 г

продукта не обнаружено

Патогенные микроорганизмы, в том

числе сальмонеллы в 25 г продукта не обнаружено

Так же был выполнен расчет аминокислотного скора и биологической

ценности (БЦ). Результаты представлены в таблице 5.4 и на рисунке 5.3.

99

Таблица 5.4

Аминокислотный состав в традиционной и модифицированной рецептуре котлет

"Юбилейные"

21,81

45,44

0 10 20 30 40 50

БЦ, %

Контроль Опыт

Рисунок 5.3 Биологическая ценность котлет «Юбилейные» по традиционной

и модифицированной рецептурам

Использование защитных пищевых покрытий способствует сохранению

качества, увеличению срока хранения, предотвращению потерь продукции при

транспортировке и хранении.

Для получения рубленного, рыбного полуфабриката с коллагеновым

покрытием составляли фарш по традиционной рецептуре котлет «Юбилейные»

(таблица 5.2), где заменили панировочные сухари на пленкообразующую смесь,

Наименование аминокислоты

Содержание аминокислоты г/100 г

идеальный

белок по

ФАО/ВОЗ

традиционная

рецептура

модифицированная

рецептура

Валин 50 95,8 57,1

Изолейцин 40 94,9 17,0

Лейцин 70 10,5 55,5

Лизин 55 18,9 8,1

Метионин 35 109,9 70,1

Треонин 40 75,5 41,4

Триптофан 10 85,5 51,2

Фенилаланин 60 134,5 170,9

КРАС 78.17 58.97

100

разработка которой представлена в п. 4.6. Из полученного фарша формовали

котлеты овальной формы, замораживали до твердого состояния и наносили

покрытие. Покрытие может наносится разными способами: погружением,

орошением, нанесением щеткой или перемещением через емкость, заполненную

коллагеновой дисперсией. Нами был выбран наиболее простой и эффективный

способ - погружной. После нанесение пленкообразующей смеси, полученный

полуфабрикат подсушивали (при температуре 15 оС с принудительной

циркуляцией воздуха 1-2 м/с) и замораживали при температуре 18-20 оС, в

течение 3-4 часов.

Полуфабрикаты оценивали по физико-химическим и органолептическим

показателям. (табл. 5.5)

Таблица 5.5

Органолептические и физико-химические показатели рыбных

полуфабрикатов в коллагеновом покрытии

Наименование показателя

Характеристика и норма

Котлеты «Юбилейные»

опыт

Котлеты «Юбилейные

контроль

Внешний вид

Круглой или овальной формы

Поверхность покрыта

коллагеновой пленкой

Поверхность покрыта

панировкой

Вид на разрезе Хорошо перемешанного фарша

Вкус и запах Свойственные доброкачественному сырью с луком

и специями. Допускается слабый запах уксуса

Консистенция Жареных полуфабрикатов сочная, некрошливая

Массовая доля, не менее %

влаги 50,1 45,5

белка 20 18

жира 11,5 12

соли, % 1 1

101

Примечание: в контроле в качестве панировки использовали сухари, в опыте

коллагеновую дисперсию.

Для разработки рекомендаций по применению полуфабрикатов в

коллагеновой оболочке проводили сравнительную оценку выхода продукта при

различной термообработке (на пару, жарение, СВЧ). Результаты представлены на

рисунке 5.4.

50

60

70

80

90

100

Вы

хо

д,

%

СВЧ На пару Жареные

Контроль

Опыт

Рисунок 5.4 Сравнительная оценка выхода рыбных полуфабрикатов с

коллагеновым покрытием

Наибольший выход наблюдали в случае приготовлении котлет на пару.

Так же был выполнен расчет аминокислотного скора и биологической

ценности (БЦ). Результаты представлены в таблице 5.6 и на рисунке 5.5.

Таблица 5.6

Аминокислотный состав в традиционной и модифицированной рецептуре котлет

"Юбилейные"

Наименование

аминокислоты

Содержание аминокислоты г/100 г

Идеальный белок

по ФАО/ВОЗ

Традиционная

рецептура

Модифицированная

рецептура

Валин 50 95,8 98,2

Изолейцин 40 94,9 93,1

Лейцин 70 10,5 11,4

Лизин 55 18,9 15,2

Метионин 35 109,9 108,2

Треонин 40 75,5 72,3

Триптофан 10 85,5 77,9

Фенилаланин 60 134,5 135,0

КРАС 78.19 76,2

102

21,81

23,8

20 21 22 23 24

БЦ, %

Опыт

Контроль

Рисунок 5.5 Биологическая ценность котлет «Юбилейные» с коллагеновым

покрытием и без него

Полученные данные показывают целесообразность применения в качестве

покрытия коллагеновые дисперсии. При этом улучшаются органолептические

показатели и увеличивается выход продукта, что экономически целесообразно.

5.2 Проведение технических и токсикологических испытаний в рамках

доклинических исследований

В условиях научно-исследовательской лаборатории Воронежского

государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко в опытах на

теплокровных животных (in vivo) были проведены технические и

токсикологические исследования рыбной коллагеновой субстанции в рамках

доклинических испытаний.

При изучении острой токсичности проводили токсиметрическую оценку

коллагеновой субстанции на белых крысах и мышах. В течение 14 дней после

затравки учитывали количество павших и выживших животных. При этом

коллагеновую субстанцию вводили внутрижелудочно через зонт в различных

дозах (500- 1500 мг/кг живой массы). В результате опытов коллагеновая

субстанция рыбного происхождения отнесена к 4-му классу по токсичности и

является безопасной.

103

Для подтверждения безопасности применения коллагеновой субстанции

провели оценку аллергенности, которую определяли на морских свинках путем

накожных аппликаций. Изменений в клиническом статусе животных и на месте

аппликаций коллагеновой субстанции не выявлено.

Эмбриотоксическое действие коллагеновой субстанции изучали на

беременных белых крысах с массой тела 180-200 г. От оставшихся 25 самок было

получено потомство, за развитием которого вели наблюдение: проводили

взвешивание, замеры длины тела, хвоста, ступней, ушей, учитывали сроки

отлипания ушей, прорезания глаз, обрастание шерстным покровом, подвижность

и активность высасывания молока матери в течение первых дней жизни.

Физическое развитие. Масса крысят, матери которых получали состав, не

отличалась от массы контрольных животных на протяжении всего периода

изучения.

У крысят подопытных и контрольных животных не наблюдалось различий и

по другим показателям общего развития - и у тех, и у других крысят уши

отлипались на 2-3 день жизни, с 8-го дня крысята начинали обрастать шерстью,

между 16 и 19 днем у них открывались глаза.

Изучали поведение животных "в открытом поле". В таблице 5.7

представлены результаты опытов.

Таблица 5.7

Поведение крысят "в открытом поле"

Наименование Кол-во

животных

Число

пересеченных

квадратов

Число

заглядываний в

отверстия

Число

Фекальных

шариков

Коллагеновая

субстанция 20 16,0+1,0 6,0+0,2 4,0+0,2

Контроль 20 12,9+1,3 5,0+0,3 4,0+0,4

104

На течение и продолжительность беременности субстанция не оказывала

влияния. Так, у контрольных и опытных крыс беременность продолжалась 22-23

дня, у самок, которые получали субстанцию - 23 дня. Была отмечена разница в

численности помета крысят и дальнейшем их развитии. Проводилось сравнение

развития крысят опытной и контрольной групп.

Установлено, что двигательная активность крысят, матери которых получали

коллагеновую субстанцию, практически не отличалась от двигательной

активности контрольных.

Проведенные эксперименты показали, что потомство, родившиеся у крыс,

получавших при беременности коллагеновую субстанцию не отличалось от

контрольного увеличенной ориентировочной активностью. На 20 день жизни

число крысят, мамы которых во время беременности получали препарат, и

контрольных животных, поднявшихся по сетке, было одинаковым. Изменение

ориентировочных рефлексов у животных опытной группы не носило

статистически значимого характера. Порог болевого раздражения (зажатие

хвоста) у животных обеих групп был одинаков.

Тератогенное действие коллагеновой субстанции изучали на белых крысах.

После спаривания самкам через день в течение всей беременности вводили

максимально возможную дозу по объему для введения в желудок — 5000 мг/кг, и

получили от них потомство. У новорожденных крысят изменений,

классифицируемых как уродства, не было выявлено.

В течение всего опыта за подопытными животными вели наблюдение,

учитывали поедаемость корма, прием воды, состояние слизистых оболочек,

волосяного покрова, поведение, взвешивали в начале и в конце эксперимента.

В результате у грызунов не зарегистрировали гибели, не отмечали признаков

интоксикации и заболеваний. Динамика прироста массы тела представлена на

рисунке 5.6.

105

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

масса, г на начало

опыта

масса, г на конец

опыта

контроль

2 опытная

1 опытная

Рисунок 5.6 - Прирост массы тела крыс при применении коллагеновой

субстанции в течение 45 дней, граммов

Таким образом, применение коллагеновой субстанции в течение 45 дней

опыта не снижало прироста массы тела опытных животных, а наоборот

способствовало увеличению данного показателя на 63, 48 % в 1-й группе и на 1,6

во 2-й группе по сравнению с контролем.

В конце опыта грызуны были убиты, проведено анатомическое вскрытие и

взвешивание внутренних органов. Результаты представлены в таблице 5.8.

Таблица 5.8

Весовые индексы внутренних органов белых крыс (в % к живой массе тела)

Наименование органа Группы

1 2 Контроль Печень 3,75+0,211 4,01+0,153 3,977+0,041

Сердце 0,39+0,026 0,39+0,033 0,35+0,009

Почки 0,74+0,021 0,75+0,052 0,73+0,022

Семенники 1,17+0,094 1,16+0,055 1,26+0,015

Селезенка 0,39+0,021 0,41+0,031 0,36+0,056

ЖКТ 9,55+0,781 9,76+0,652 10,81+0,975

Достоверных различий по массе тушек и внутренних органов у белых крыс в

опыте и контроле не выявлено, не установлено также и патологических

106

изменений во внутренних органах при скармливании коллагеновой субстанции в

течение 45 дней.

Морфологические показатели крови (количество эритроцитов, лейкоцитов,

гемоглобина и гематокрит) у животных всех групп существенно не отличались и

находились в пределах нормы.

Углеводная, белково-образовательная и мочевинообразовательная функции

печени не нарушены.

На основании вышеизложенного можно заключить, что проведенными

токсикологическими исследованиями не установлено отрицательного влияния

коллагеновой субстанции на организм экспериментальных животных, не

выявлены противопоказания к проведению дальнейших исследований и

использованию.

5.3 Применение коллагеновых дисперсий в качестве биологически активного

компонента косметических средств

Как уже говорилось ранее, коллаген является самым распространенным

белком в организме млекопитающих и человека в том числе. Однако с возрастом

его выработка постепенно сокращается (рис. 5.7). [41]

Рисунок 5.7 – Выработка коллагена в организме человека

107

Сокращение количества коллагена влияет на состояние кожи, ее

увлажненность и упругость. Поэтому для сохранения здоровья, молодости и

красоты кожи необходимо восполнять недостаток коллагена с помощью внешних

аппликаций косметических средств и БАД для нутритивной коррекции.

Для того чтобы использовать полученные рыбные коллагеновые белки, как

активный компонент косметических средств было необходимо провести проверку

на соответствие ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической

продукции»[140]. Исследования проводились в ФБУЗ «Центр гигиены и

эпидемиологии в Воронежской области». Результаты представлены в таблице 5.9.

108

Таблица 5.9

Протокол испытаний коллагеновой субстанции рыбного происхождения

№9627п от 27 августа 2014г

№

п/п Определяемые показатели

Результаты

исследований

Величина

допустимого

уровня

Еди-

ницы

изме-

рения

НД на методы

исследований

1 2 3 4 5 6

Санитарно-гигиенические

исследования

1 Водородный показатель

(рН) 6.2 ±0,1 5,0-9,0 -

ГОСТ 29188.2-

91

2 Мышьяк менее 0,025 не более 5,0 мк/г ГОСТ 4152-89

3 Ртуть менее 0,03 не более 1,0 мк/г ГОСТ 26927-86

4 Свинец менее 0,25 не более 5,0 мк/г ГОСТ30178-96

Токсикологическое

исследование:

5 Кожно-раздражающее

действие

0

(отсутствует)

0

(отсутствует) балл

МУ 2102-79

МУ 2196-80

МУ 2163-80

6 Воздействие на слизистую

оболочку (однократно)

0

(отсутствует)

0

(отсутствует) балл

МУ 2196-80

МУ2163-80

7

Общетоксическое действие,

определяемое

альтернативными методами

in vitro

отсутствие отсутствие - МУ 01.038-08

8 Микробиологические

показатели:

Общее количество

мезофильных аэробных и

факультативно-анаэробных

микроорганизмов, КОЕ/г

85 Не более 103

- ГОСТ ISO

21149-2013

Candida albicans в 0,1г отсутствует не

допускается -

ГОСТ ISO

18416-2013

Escherichia coli в 0,1г отсутствует не

допускается -

ГОСТ ISO

21150-2013

Staphylococcus aureus в 0,1г отсутствует не

допускается -

ГОСТ ISO

22718-2013

Pseudomonas aeruginosa в

0,1г отсутствует

не

допускается -

ГОСТ ISO

22717-2013

Полученная коллагеновая дисперсия отвечает требованиям ТР ТС009/2011

«О безопасности парфюмерно-косметической продукции» и может

использоваться в косметических средствах без ограничений.

109

На базе ИЦ «Бирюч» (Белгородская обл.) были проведены исследования

потребительских свойств коллагеновой дисперсии рыбного происхождения, а так

же косметических средств: без коллагена, с коммерческим коллагеном

(животного происхождения, фирмы «CRODA») с коллагеном рыбного

происхождения. Косметические средства производились сотрудниками

исследовательского центра, по запатентованным рецептурам.

В испытаниях принимали участие 30 женщин в возрасте от 20 до 48 лет.

Критериями включения в исследование являлись:

- возраст от 18 лет;

- клиническое здоровье;

- осознанное и добровольное согласие на участие в апробации.

Критериями исключения из исследования служили:

- повышенная чувствительность к компонентам, входящим в состав

исследуемого продукта;

- гиперреактивность кожи на внешние и/или внутренние стимулы,

проявляющаяся субъективными и/или объективными симптомами, связанными с

развитием воспаления;

- дерматологические заболевания в фазе обострения, наличие повреждений

целостности кожных покровов в области кистей;

- одновременное участие в другом клиническом исследовании;

- планирование беременности, беременность и период лактации.

Во время испытаний исключалось использование каких-либо косметических

продуктов для ухода за кожей и волосами (таких как, например, кремы, бальзамы,

шампуни и т.д.).

Объектами исследования были волосы для испытания шампуня и бальзама и

кожа внутренней стороны запястья для крема и коллагеновой дисперсии.

Испытания проводились по схеме, представленной на рисунке 5.8.

110

Рисунок 5.8 – Схема исследований

Действие тестируемых средств оценивалось по следующим показателям:

Средства для волос:

Состояние волос до и после Аппаратные измерения

Гладкость Увлажненность

Блеск Жирность

Объем Толщина волоса

Послушность волос Структура при увеличении х1000

Ощущения после использования Прочность волоса на разрыв

(искусственная прядь)

Смываемость Блеск

Утяжеление волос Уровень статического электричества

Эффект жирных волос

111

Средства для кожи:

Состояние кожи до и после Аппаратные измерения

Упругость кожи Увлажненность

Увлажненность кожи Жирность

Степень выраженности морщин Покраснение

Шелушение

Исходя из данных, полученных в результате компаративного исследования

средств для волос и средств для кожи без содержания коллагена, с содержанием

коммерческого коллагена и с содержанием коллагеновой дисперсии, следует, что

средства с содержанием коллагеновой дисперсии проявляют свойства на уровне

коммерческого аналога.

Показатели, полученные аппаратными методами исследования после

использования средств для волос с рыбной коллагеновой дисперсией находятся в

пределах нормы. По субъективным оценкам пробантов действие средств с

рыбным коллагеном сравнимо с действием коммерческого аналога. Согласно

мнению респондентов, средства с рыбной коллагеновой дисперсией проявляют

достаточно высокую смываемость, не вызывают эффекта утяжеления и жирности

волос.

Исследование потребительских свойств средств для кожи с глицерином, с

коммерческим коллагеном, а также с рыбным коллагеном, показало, что крем с

рыбной коллагеновой дисперсией продемонстрировал результаты на уровне

коммерческого аналога, а в рамках субъективной оценки состояния кожи до и

после использования — превзошел коммерческий аналог.

Анализ действия коллагеновой дисперсии, без каких-либо добавок позволяет

сделать вывод, что после использования в течение двух недель уровень

увлажненности кожи рук увеличился на 21% (степень увлажненности

увеличилась у 9 из 10 пробантов), а степень покраснения и шелушения кожных

покровов снизилась в среднем на 5% у большей части пробантов (рис. 5.9, 5.10).

112

Рисунок 5.9 – Тестирование коллагеновой дисперсии. Аппаратные показатели

Рисунок 5.10 – Тестирование коллагеновой дисперсии. Метод прямых оценок

47,77

57,67

0

20

40

60

80

100

%

До После

Увлажненность кожи

249,83 238,79

0

50

100

150

200

250

300

%

До После

Покраснение

0 0,1

0

20

40

60

80

100

%

До После

Жирность кожи

26,85 25,41

0

20

40

60

80

100

%

До После

Шелушение

88,6

0

2

4

6

8

10

Балл

До После

Упругость кожи

6,2

7,5

0

2

4

6

8

10

Балл

До После

Увлажненность кожи

5,5 4,9

0

2

4

6

8

10

Балл

До После

Степень выраженность морщин

113

Испытания на людях-добровольцах с нормальной здоровой кожей

продемонстрировали отсутствие отрицательного воздействия исследуемого

продукта на кожу респондентов.

В соответствии с поставленными задачами и на основании полученных

результатов исследований представляется возможным сформулировать

следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Патентно-информационный поиск показал целесообразность поиска

новых источников коллагеновых белков. Наиболее перспективным отходом

рыбоперерабатывающей промышленности для получения коллагена является

шкура рыб, так как ее выход составляет 4%.

2. Шкура толстолобика содержит 16,5% белка, большая часть которого

относится к щелочерастворимым, имеет рыхлую структуру соединительной ткани

и содержит 83% коллагена, это говорит о том, что данный вид сырья можно

рекомендовать для получения коллагена.

3. На основании анализа закономерностей влияния химических

реагентов на растворимость коллагенов шкуры. Применение пероксидно-

щелочной смеси и уксусной кислоты в установленных режимах и условиях

позволяет получить коллагеновую дисперсию обладающую характеристиками:

прозрачная желеобразная субстанция, рН 4,8, массовая доля сухих веществ 1,95-

2%, массовая доля коллагена 0,92.

4. Применение метода ИК-спектроскопии позволило доказать, что

полученная дисперсия состоит преимущественно из коллагеновых белков.

Установлена оптимальная температура 0оС и срок хранения дисперсии 26 недель.

5. В составе аминокислот белков отсутствует триптофан, пролин и

оксипролин превалируют, что является структурным признаком коллагеновых

белков и доказывает эффективности рыбного коллагена. Электрофоретическая

подвижность свидетельствует о наличие в белках рыбной дисперсии α2, α1, β

114

цепей, с третичной структурой. Методом АСМ установлены морфологические

отличия коллагенов животного и рыбного происхождения. Анализ суммарных

ароматов показал идентичность состава РГФ, но интенсивность запаха рыбного

коллагена на 72% выше. Установлено, что рыбные коллагеновые дисперсии

структурируются при нанесении на пластиковую поверхность, при температуре

20оС, с принудительной циркуляцией воздуха. При внесении 10 %

пластификатора образуются пленки высокого качества, применимые для

покрытия пищевых продуктов.

6. Полученная рыбная дисперсия относится к 4 классу опасности

(безопасна) и соответствует ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-

косметической продукции».

7. Использование коллагеновой дисперсии в качестве замены 20%

основного сырья, обеспечивает улучшение ФТС. Коллагеновые пленочные

покрытия увеличивают выход готового продукта. Косметические средства с

применением полученного коллагена обладают биологически активным

действием и на основании оценки потребительских свойств и в аппаратном опыте

продукта показали отсутствие отрицательного воздействия, при улучшении

состояния кожи и волос.

8. Разработан и утвержден проект ТУ 9283-001-02068108-2015

Субстанция коллагеновая. Проведена апробация рыбных котлет в коллагеновом

пленочном покрытии в кафе «Виктория», г. Бобров и коллагеновой дисперсии

рыбного происхождения ООО «ЛДЦ Альдомед плюс» г. Лиски. Получение

коллагена из рыбного сырья снижает себестоимость на 960,6 тыс. р.,

рентабельность продукции выше на 15,9 %.

115

Список используемых источников

1. «Норд Плас» организует в особой экономической зоне производство

коллагена – URL: http://karpovka.com/2014/04/02/168233/ (дата

обращения:04.04.2015)

2. Adamson, E.D. The localization and synthesis of some collagen types in

developing mouse embryos. E. D. [Text] / Adamson, S. E. Ayers // Cell. – 1979. V.16. -

№4. - Р.953–965.

3. Andriopoulos, N.A. [Text] / Antibodies to human native and denatured

collagens in synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. N.A. Andriopoulos, J.

Mestecky, E.J. Miller, J.C. Bennett // Clin Immunol Immunopathol. - 1976 . - № 6. - Р.

209–212.

4. Antipova L.V. Prospects of obtaining and applying wound healing

materials based on fish collagen / L.V. Antipova, S.A. Storublevtsev, S.B. Bolgova,

L.V. Kozhanova // Materials of 1st International Congress Industrial-academic

networks in cooperation activities for pharmaceutical, chemical and food fields, 2014. p.

116-120.

5. Bechir, A. The Nanobiotechnology of Obtaining of Collagen Gels from

Marin Fish Skin and Yours Reological Properties for using Like New Materials in

Dental [Text] / A. Bechir, R. Sirbu, M. Leca, M. Maris, D.A. Maris, E.M. Cadar, M.M.,

Medicine International Journal of Medical, Health, Biomedical, Bioengineering and

Pharmaceutical Engineering Vol:2, No:6, 2008, p. 190-196.

6. Collagen as an implantable material in medicine and dentistry – URL:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12498470 (дата обращения:13.07.2015)

7. Collagen coating of glass bottom dishes and glass bottom plates – URL:

http://www.cellvis.com/collagen_coating_of_glass_bottom_dish_plate.php (дата

обращения:28.05.2015)

8. Collagen from fish? Yes, it is possible. // http://cebiotech.com/ 1.09.2014.

URL: http://cebiotech.com/articles/Collagen-from-fish-yes-it-is-possible-interview-

with-dr-olga-bukovskaya-and-julia-blokhina,261(дата обращения: 21.08.2015)

116

9. Collagen-based Bone Filling Augmentation Material – URL:

http://www.morita.com/usa/cms/website.php?id=/en/products/dental/partner/auxiliaries/

foundation.htm (дата обращения: 23.08.2015)

10. Crouch, E. Characterization of a type IV procollagen synthesized by human

amniotic fluid cells in culture JBC [Text] / E. Crouch, P.Bornstein // Vol. 254, Issue 10.

- 1979. - Р. 4197-4204

11. Influence of galactomannans/collagen edible coatings in gas transfer rates

in fruits Lima1, A.M.P.; Cerqueira 2, M.A.; Souza2, B.W. Teixeira 2, J.A.; Vicente2,

A.A.; Moreira 1, R.A. VALNATURA PROJECT 2005/08 – URL:

http://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/31454/1/document_17820_1.pdf -

(дата обращения: 03.07.2015)

12. Kresina, T.F. Isolation and characterization of basement membrane

collagen from human placental tissue. Evidence for the presence of two genetically

distinct collagen chains. [Text] / T. F. Kresina, E. J. Miller // Biochemistry. - 1979. -

V.18 - №14.- Р.3089–3097.

13. Lampe, A.K. Collagen VI related muscle disorders. [Text] / A.K. Lampe,

K.M. Bushby // J. Med. Genet. – 2005 -.Vol. 42. P. 673-685.

14. Li, G.Y. Physicochemical properties of collagen isolated from calf limed

splits. [Text] / G.Y. Li, S. Fukunaga, K.J. Takenouchi // Amer. Leather Chem. Ass. -

2003.- Vol. 98. - P. 224-229.

15. Li, Y.C. Preparation and analysis of collagen polypeptide from hides by

enzymes. [Text] / Y.C. Li, D.Y. Zhu, L.Q. Jin // J. Soc. Leather Technol. Chem. -

2005.- Vol. 89. - P. 103-106.

16. Pszczola, D. [Text] // II Food Technol. - 2001. - V. 55. - № 9. P. 92-95.

17. Ruehl, M. The Elongated First Fibronectin Type III Domain of Collagen

XIV Is an Inducer of Quiescence and Differentiation in Fibroblasts and Preadipocytes.

[Text] / M. Ruehl, U.Erben, D. Schuppan, C. Wagner, A. Zeller, C. Freise, H. Al-

Hasani, M. Loesekann, M. Notter, B. M. Wittig, M. Zeitz, W. Dieterich , R.

Somasundaram // J. Biol. Chem. - Vol. 280. P. 38537-38543.

18. Synthetic collagen promotes natural clotting – URL:

117

http://news.rice.edu/2014/04/09/synthetic-collagen-promotes-natural-clotting/ (дата

обращения:27.08.2015)

19. Types of Collagen // tropocollagen.eu 07 октября 2014. URL:

http://www.tropocollagen.eu/types-of-collagen/ (дата обращения: 11.08.2015)

20. Voicu, G. Synthesis, characterization and bio-evaluation of bioactive

composites scaffolds based on collagen and glass ceramic [Text] / G. Voicu, S.I. Jinga,

R. Trusca, F. Iordache Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures Vol. 9, No. 1,

January – March 2014, p. 99 – 108

21. Wetzel, D.L. Synchrotron infrared microspectroscopic analysis of

collagens I, III, and elastin on the shoulders of human thin-cap fibroatheromas [Text] /

David L. Wetzel, Ginell R. Post, Robert A. Lodder // Vibr. Spectrosc. - 2005. – V. 38,

№ 1-2. - P. 53-59.

22. What is fish collagen? – URL: http://www.wisegeek.com/what-is-fish-

collagen.htm (дата обращения 10.03.2015)

23. Адлер, Ю.П. управление качеством [Текст] / Ю.П. Адлер. – М.:

МИСиС, 2000. – 163 с.

24. Антипова Л.В. Шкуры рыб - как объект для получения коллагеновых

субстанций [Текст] / Л.В. Антипова, С.А. Сторублевцев, М.В. Бобрешова //

Научная конференция хранителна наука, техника и технологии – Научнитрудове

Университет по хранителни технологии Пловдив Том LIX. - Volume LIX. – 2012.

– С.976-978.

25. Антипова, Л.В. Влияние ароматизаторов с коллагеновыми носителями

на срок хранения фарша / Л.В. Антипова, Т.А, Кучменко, М.М. Данылив, В.В.

Зверев // Мясная индустрия – 2007 – №3 – с. 39-41

26. Антипова, Л.В. Исследование йодосвязывающей способности

коллагеновых белков кож прудовых рыб / Л.В. Антипова, В.С. Слободяник, О.П.

Дворянинова, Лы Тхи Иен // Вестник ВГТА – 2008 – №3 – с. 31-36

27. Антипова, Л.В. Исследование процесса сорбции йода на коллагеновом

носителе в получении функционального ингредиента для пищевых систем / Л.В.

Антипова, А.Н. Рязанов, С.А. Сторублевцев, Ф.С. Базрова // Вестник ВГУИТ –

118

2013 – №3 – с. 102-105.

28. Антипова, Л.В. Коллаген рыбного происхождения: свойства и

перспективы применения в косметологии и медицине [Текст] / Л.В. Антипова,

С.Б. Болгова // Материалы 19-ой Международной Пущинской школы-

конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века». – Пущино, 2015г. –

с.5.

29. Антипова, Л.В. Коллагены: источники, свойства, применение /

Л.В.Антипова, С.А. Сторублевцев – Воронеж: ВГУИТ, 2014. – 512 с.

30. Антипова, Л.В. Новые белковые источники для косметических

средств по уходу за кожей и волосами [Текст] / Л.В. Антипова, С.А.

Сторублевцев, С.Б. Болгова, О.Г. Стукало // Материалы II конференции

«Инновации и решения в косметической индустрии». – Воронеж, 2015г. – с.28.

31. Антипова, Л.В. Оценка возможности использования природных

биополимеров рыбного происхождения в технологиях лакокрасочных покрытий /

Л.В. Антипова, О.П. Дворянинова, А.В. Соколов, Т.С. Гаршина, С.С.

Канонистова, К.В. Матасова // Материалы Международной научно-технической

конференции Продовольственная безопасность: научное, кадровое и

информационное обеспечение, Воронеж, 2014 – с.271-277.

32. Антипова, Л.В. Оценка молекулярно-массового распределения

белковых фракций коллагеновых субстанций рыбного и животного

происхождения [Текст] / Л.В. Антипова, С.Б. Болгова // Материалы

Международной научно-технической конференции «Продовольственная

безопасность: научное, кадровое и информационное обеспечение». – Воронеж,

2014 г. – с. 56-59.

33. Антипова, Л.В. Перспектива создания препаратов с асептическими

свойствами на основе гидролизованных форм коллагена / Антипова Л.В.

Сторублевцев С.А. Гребенщиков А.В., Макарова Е.Л., Лакиза В.В. //

INTERNATIONAL JOURNAL OF EXPERIMENTAL EDUCATION – 2011 – № 11 –

с. 50-51

119

34. Антипова, Л.В. Применении коллагеновых субстанций в отраслях

экономики [Текст] / Л.В. Антипова, С.А. Сторублевцев, С.Б. Болгова, И.В. Сухов,

К.В. Матасова, И.Ю. Жданова, К.В. Майорова // Международный журнал

прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 10, ч.4. – с. 601-604.

35. Антипова, Л.В. Рыбные коллагены: источники, свойства и применение

[Текст] / Л.В. Антипова, С.А. Сторублевцев, С.Б. Болгова, И.Ю. Жданова, К.В.

Майорова // Сырье и упаковка для парфюмерии, косметики и бытовой химии. –

2015. – №7 (169) - с.15-17.

36. Антипова, Л.В. Свойства препаратов функциональных биополимеров

рыбного происхождения / Антипова Л.В., Дворянинова О.П., Сторублевцев С.А.,

Черкесов А.З // Вестник ВГУИТ – 2014 – №3 –с 103-105

37. Антипова, Л.В. Современные методы исследования сырья и

продуктов животного происхождения / Антипова Л. В. – Воронеж.: Воронежский

ЦНТИ – филиал ФГБУ «РЭА» Минэнерго России, 2014. – 531 с.

38. Антипова, Л.В. Сорбционная способность биомодифицированной

соединительной ткани убойных животных / Антипова Л.В. Сторублевцев С.А. //

Мясная индустрия – 2009 – №2 – с. 63-64

39. Антипова, Л.В. Сравнительный анализ аминокислотного состава

коллагеновых субстанций рыбного и животного происхождения [Текст] / Л.В.

Антипова, С.Б. Болгова // Материалы Международной научно-технической

конференции «Продовольственная безопасность: научное, кадровое и

информационное обеспечение». – Воронеж, 2014 г. – с. 59-61.

40. Банников, Г.А. Проблемы биологии развития, явления индукции и

дифференцировки при опухолевом росте [Текст] /Г.А. Банников, В.И. Гельштейн,

В.С. Глейберман, А.В. Любимов, Т.Г. Мойжесс, В.И. Самойлов // Издательство

"Наука" М:, - 1981 - 263 с.

41. Батечко, С.А. Коллаген. Новая стратегия сохранения здоровья и

продления молодости [Текст] / С.А. Батечко, А.М. Ледзевиров – Колечково, 2010.

– 244с.

42. Бауэр, О. Болезни прудовых рыб / О. Бауэр, В. Мусселиус, Ю.

120

Стрелков – Колос, 1969 г – 336с.

43. Бегма, А.Н. Опыт применения коллагеновых повязок и губок

Метуракол в хирургической практике / Бегма А.Н., Бегма И.В., Хомякова Е.К. –

URL: http://www.rmj.ru/articles_9589.htm (дата обращения:23.06.2015)

44. Березов, Т.Т. Биологическая химия [Текст] /Т.Т Березов., Б.Ф.

Коровкин Учебник.– 3-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1998.– 704 с.

45. Биоматериалы – URL: http://www.rusimplant.ru/catalog/biomaterials/

(дата обращения:29.06.2015)

46. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки качества объектов

окружающей среды: учебно-методическое пособие / А.Г. Бубнов [и др.]; под

общей ред. В,И. Гриневича; ГОУ ВПО Иван. гос. хим.-технол. ун-т. – Иваново,

2007. – 112с.

47. Биохимия. Под ред. Чл.-корр. РАН, проф. Е.С. Северина. – Москва –

2003 – 779 с.

48. Болгова, С.Б. Идентификация коллагенов на основании электронно-

микроскопического анализа [Текст] / С.Б. Болгова, Л.В. Антипова //

Международный студенческий научный вестник. – 2015. – №3 - с.249-250.

49. Болгова, С.Б. Перспектива применения рыбного коллагена в

косметической и фармацевтической промышленности [Текст] / С.Б. Болгова, Л.В.

Антипова, А.В. Гребенщиков // ХII Международная научно-практическая

конференция: «Научные перспективы ХХI века. Достижения и перспективы

нового столетия» 10-11.07.2015, Новосибирск – Россия, с. 128-131.

50. Болтыхов, Ю.В. Получение и применение коллагеносодержащих

пленкообразующих композиций в технологии мясных продуктов: диссертация на

соискание ученой степени кандидата технических наук: 05.18.07 / Болтыхов

Юрий Владимирович - Воронеж, 2009.- 249 с.

51. Борискина, Е.П. Физические факторы стабильности трехспиральных

структур коллагенового типа [Текст] / Е.П.Борискина, Т.В. Больбух, М.А.

Семенов, В.Я. Малеев // Биополимеры и клетка,2006, №6 с. 458-467.

121

52. Бубнов А.Г. Биотестовый анализ – интегральный метод оценки

качества объектов окружающей среды: учебно-методическое пособие / А.Г.

Бубнов [и др.]; под общей ред. В.И. Гриневича; ГОУ ВПО Иван. гос. хим.-технол.

ун-т. – Иваново, 2007. – 112с.

53. Ванюшкина, В. Натуральный коллаген – URL:

http://www.allseason.ru/publics/single/4472/5416 (дата обращения:19.06.2015)

54. Васильев, М.П. Коллагеновые нити, волокнистые и пленочные

материалы: Монография. – Спб.: СПГУТД, 2004. – 397 c.

55. Воробьев, В.И. Использование рыбного коллагена и продуктов его

гидролиза [Текст] / В.И. Воробьев // Известия Калининградского

государственного технического университета. - 2008. - N 13. - С. 55-58. -

Библиогр.: с. 58

56. Воробьев, В.И. Приведены данные об использовании рыбного

коллагена и продуктов его гидролиза в различных областях промышленности и

хозяйства – URL: http://d.120-bal.ru/voda/21597/index.html (дата

обращения:13.07.2015)

57. Вторушина, И.В. Получение и применение иммобилизованных

коллагеновых препаратов селена в технологии мясных и рыбных рубленых

полуфабрикатах: диссертация на соискание ученой степени кандидата

технических наук: 05.18.07 / Вторушина Ирина Викторовна - Воронеж, 2012.- 249

с.

58. Габуда, С.П. Структура коллагена и разупорядоченность водной

подсистемы в фибриллярных белках [Текст] / С.П. Габуда, А.А. Гайдаш, Е.А.

Вязовая// Биофизика, 2005, №2, с. 231-235.

59. Гаврилов, А.С. Фармацевтическая технология. Изготовление

лекарственных препаратов. – М.: Гэотар-Медиа, 2010. – 624с.

60. Гарнов, Н.В Исследование пространственной коллагеновой структуры

суставного хряща с помощью высокоразрешающей ямр-томографии [Текст] / Н.В.

Гарнов, В. Грюндер Известия Южного федерального университета. Технические

науки, №2008, №5, С. 8-11.

122

61. Гитлер не дошел до этого: из чего делают косметику – URL:

http://newsland.com/news/detail/id/608453/

62. Глотова, И. А. Реологические характеристики полифункциональных

дисперсных систем на основе коллагеновых белков животных тканей / И.А.

Глотова, Ю.В. Болтыхов.// Успехи современного естествознания.- 2008. - № 2. - с.

43-44.

63. Глотова, И.А. Инновационные направления в использовании

вторичного коллагенсодержащего сырья / И.А. Глотова // Мясные технологии. -

2010. - № 7. - С.56-59.

64. Глотова, И.А. Получение функциональных дисперсных систем на

основе коллагеновых белков: формализованный подход к описанию тепло-

массообменных процессов / Глотова И.А. Ряжских В.И. Галочкина Н.А.

Макаркина Е.Н. Галочкин М.Н. // Фундаментальные исследования – 2012 – № 11-

2 – с. 383-388

65. Глотова, И.А. Развитие научных и практических основ рационального

использования коллагенсодержащих ресурсов в получении функциональных

добавок, продуктов и пищевых покрытий: диссертация на соискание ученой

степени доктора технических наук: 05.18.04, 05.18.07 / Глотова Ирина

Анатольевна - Воронеж, 2003.- 458 с.

66. ГОСТ 23041-78 Мясо и продукты мясные. Метод определения

оксипролина. – Введ. 1979-01-01. – М.: Стандартинформ, 2010, с. 6.

67. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Микробиология. Продукты

пищевые. Общие правила микробиологических исследований [Текст] – М.: Изд-во

стандартов, 1999.

68. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т. 1. Общие

методы контроля качества лекарственных средств / Центр экспертиз и испытаний

в здравоохранении; под общ. ред. Г. В. Годовальникова. - Минск: Минский

государственный ПТК полиграфии, 2006 – с. 726.

123

69. Государственная Фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т.2.

Контроль качества лекарственных веществ и лекарственного растительного сырья

/ Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении; под общ. ред. А. А Шерякова.

- Молодечно: «Типография «Победа», 2009 – с. 728.

70. Государственная фармакопея СССР XI издание выпуск 1. Общие

методы анализа – URL: http://www.alppp.ru/law/hozjajstvennaja-

dejatelnost/promyshlennost/35/gosudarstvennaja-farmakopeja-sssr---izdanie--vypusk-1-

-obschie-metody-analiza.html (дата обращения:13.03.2015)

71. Гремлих, Ганс-Ульрих Язык спектров. Введение в интерпретацию

спектров органических соединений [Текст]. / Ганс-Ульрих Гремлих – ООО

«Брукер Оптико», 2002. – 94 с.

72. Грищенко, Л. Болезни рыб с основами рыбоводства. Учебники и

учебные пособия для студентов высших учебных заведений / Леонид Грищенко,

Магомет Акбаев – КолосС, 2013 г – 480с.

73. Губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE) – URL:

http://www.vetlab.spb.ru/interesting/gubchataya-entsefalopatiya-krupnogo-rogatogo-

skota-bse (дата обращения:03.04.2015)

74. Губчатая энцефалопатия: прионы и вирусы в одной упряжке – URL:

http://www.dw.com/ru/%D0%B3%D1%83%D0%B1%D1%87%D0%B0%D1%82%D0

%B0%D1%8F-

%D1%8D%D0%BD%D1%86%D0%B5%D1%84%D0%B0%D0%BB%D0%BE%D0

%BF%D0%B0%D1%82%D0%B8%D1%8F-

%D0%BF%D1%80%D0%B8%D0%BE%D0%BD%D1%8B-%D0%B8-

%D0%B2%D0%B8%D1%80%D1%83%D1%81%D1%8B-%D0%B2-

%D0%BE%D0%B4%D0%BD%D0%BE%D0%B9-

%D1%83%D0%BF%D1%80%D1%8F%D0%B6%D0%BA%D0%B5/a-15486006

(дата обращения:23.04.2015)

75. Дворянинова, О.П. Биотехнологический потенциал рыб внутренних

водоемов: глубокая переработка и высокотехнологичные импортзамещающие

производства: диссертация на соискание ученой степени доктора технических

124

наук: 05.18.04, 05.18.07 / Дворянинова Ольга Павловна - Воронеж, 2013.- 508 с.

76. Дворянинова, О.П. Получение, свойства и применение коллагеновых

дисперсий из кожи рыб: диссертация на соискание ученой степени кандидата

технических наук: 05.18.04 / Дворянинова Ольга Павловна - Воронеж, 2002.- 218

с.

77. Деминерализованный костный (бычий) коллаген – URL :

http://www.rusimplant.ru/catalog/biomaterials/osteodent-m/ (дата

обращения:24.08.2015)

78. ЕС продлил экономические санкции против России – URL:

http://top.rbc.ru/economics/22/06/2015/5587bca19a79476f91de9dd9 (дата обращения:

11.06.2015 г.)

79. Завод по производству коллагена открылся в Тверской области –

URL: http://ria.ru/economy/20150204/1045878314.html (дата обращения:11.08.2015)

80. Ибрагимова, З.Р. Кожа прудовых рыб – органический носитель йода в

технологии рыбных продуктов [Текст] / З.Р. Ибрагимова, Ф.С. Базрова, С.Б.

Болгова // Материалы международной научно-практической конференции

«Российская аквакультура: состояние, потенциал и инновационные производства

в развитии АПК». – Воронеж, 2012г. – с. 168-169.

81. Игнатьева, Н.Ю. Коллаген — основной белок соединительной ткани //

Эстетическая медицина том IV. – М., – 2005. - № 3. - С. 257 -258.

82. Инвестиции в желе – URL:

http://www.vedomosti.ru/newspaper/articles/2014/04/03/investicii-v-zhele (дата

обращения:20.06.2015)

83. Истранова, Е.В. Модификация коллагена: физико-химические и

фармацевтические свойства и применение / Е.В. Истранова, Л.П. Истранов, Е.А.

Чайковская // Химико-фармацевтический журнал, том 40 – 2006 –№2 – с.32-36

84. Ищенко, В.И. Промышленная технология лекарственных средств:

Учебное пособие / В.И. Ищенко. - Витебск, издательство ВГМУ, 2003. - 567 с

125

85. Кащенко, О.А. Изучение условий сорбции летучих веществ ароматов

CO2-экстрактов на препаратах животных белков / Кащенко О.А., Данылив М.М.,

Антипова Л.В., Поленов И.В. // Современные наукоемкие технологии – 2010 – №3

– с. 40-41

86. Кендрью, Дж. Белки [Текст] // Под ред. Г.Нейрат, К. Бейли М.: ИЛ,

1959. С. 400-435

87. Киселев, В.И. Применение коллагена в медицине – URL:

http://mi32.narod.ru/02-02/kollagen.html (дата обращения:18.07.2015)

88. Коллаген - применение в медицине и фармацевтических технологиях

– URL: http://fishcollagen.ru/articles/203619 (дата обращения:28.05.2015)

89. Коллаген в косметике для волос и лица. Достоинства и недостатки –

URL: http://nipponkea.com/kollagen (дата обращения:12.07.2015)

90. Коллаген: Мифы и реальность. Мнение Эксперта – URL:

http://www.allvet.ru/articles/article78.php. (дата обращения:13.03.2015)

91. Коллагеновые материалы, пленки и способы их изготовления [Текст]:

пат. 2455322 РФ: МПК: C08J5/00, C08J5/18, B32B9/02, B05D3/00, B29C67/20,

C12N5/00, C12N11/04, A61K9/70 / Паукшто М. В., МакМартри Д. Х., Фуллер Д.

Д., Бобров Ю. А., Кирквуд Д. И.; заявители и патентообладатели КоллЭнджин,

Инк., Зе Боард оф Трастис оф зе Лилэнд Стендфонд Юниор Юриверсити -

№2009125186/05; заявл. 05.12.2007; опубл. 10.07.2012.

92. Коровье бешенство и губчатая энцефалопатия человека. Медикус.ру –

URL: http://www.medicus.ru/fphysician/patient/korove-beshenstvo-i-gubchataya-

encefalopatiya-cheloveka-32989.phtml (дата обращения:13.08.2015)

93. Крис Э. Болезни рыб. Профилактика и лечение / Крис Эндрюс, Э.

Экселл, Н. Кэррингтон – Аквариум-Прин, Москва, 2007 – 208 с.

94. Курчаева, Л.В. Свойства коллагенов животного и рыбного

происхождения / Л.В. Курчаева, Г.А. Хаустова, М.В. Мальцева // 14-я

международная научно-практическая конференция, посвященная памяти В.М.

Горбатова «Перспективные направления исследований в области переработки

мясного сырья и создания конкурентоспособных продуктов питания». — 2011.

126

Москва, с 137-141.

95. Курьянова, Н.Х Методы исследования мяса и мясных продуктов /

сост. Н.Х. Курьянова – Димитровград: ТИ(ф)УГСХА, 2013. –71 с.

96. Кучменко, Т.А. Инновационные решения в аналитическом контроле

[Текст]: учеб.пособие / Т.А. Кучменко// Воронеж. гос. технол. акад., ООО

«СенТех». – Воронеж: 2009.- 252 с.;

97. Кучменко, Т.А. Контроль качества и безопасности пищевых

продуктов, сырья [Текст]: лабораторный практикум: учеб.пособие / Т.А.

Кучменко, Р.П. Лисицкая, П.Т. Суханов, Ю.А. Асанова, Л.А. Харитонова //

Воронеж. гос. технол. акад., ООО «СенТех». – Воронеж: 2010.- 116 с.

98. Кучменко, Т.А. Химические сенсоры на основе пьезокварцевых

микровесов. В монографии Проблемы аналитической химии. Т. 14/ Под ред. Ю.Г.

Власова. - Воронеж - 2011.- С.127-202.;

99. Маловастый, К. Диагностика болезней и ветсанэкспертиза рыбы / К.

Маловастый – Лань, 2013 г – 512 с.

100. Метревели, И.О. Изучение влияния ультрафиолетового излучения на

коллаген методами микрокалориметрии и электронного парамагнитного

резонанса [Текст] / И.О.Метревели, Л.О. Иамичейшвили, К.К. Джариашвили, Э.И.

Чикваидзе, Г.М. Мревлишвили // Биофизика. – Вып. 51. – 2006 - № 1. – с. 39-43.

101. Миронов, А.Н. Руководство по проведению доклинических

исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов – Москва:

Гриф и К, 2012. — 944 с.

102. Миронов, В.Л. Основа сканирующей зондовой микроскопии [Текст] /

В.Л. Миронов – ИМФ РАН, г. Нижний Новгород, 2004 г. с.114

103. Могильный, М.П. Пищевые и биологически активные вещества в

питании / М.П. Могильный. - М.: ДеЛи принт, 2007. - 240 с.

104. Мурашев, С.В. Влияние разрушения структуры коллагена на

гидрофильные свойства продуктов этого процесса // Научный журнал НИУ

127

ИТМО. Серия «Процессы и аппараты пищевых производств», 2013. - №2.

[Электронный ресурс]: URL: http://www.processes.ihbt.ifmo.ru (дата

обращения:14.08.2015)

105. Неклюдов, А.Д. Биологически активные соединения из природных

объектов. Свойства и структурно-функциональные связи [Текст] / А.Д. Неклюдов,

А.Н. Иванкин. - М.: МГУЛ, 2003. – 480 с.

106. Неклюдов, А.Д. Коллаген: получение, свойства и применение [Текст] /

А.Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин // - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - 336 с.

107. Неклюдов, А.Д. Коллаген: получение, свойства и применение:

монография / А.Д. Неклюдов, А.Н. Иванкин. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - 346 с.

108. Николаева, Т.И. Гиролизаты коллагена в профилактике и лечении

заболеваний суставов / Николаева Т.И., Шеховцов П.В. // Фундаментальные

исследования – 2014 – №12 –с 524-528

109. Николаева, Т.Н. Структурно-термодинамические аспекты упаковки

коллагеновых фибрилл [Текст] / Т.Н. Николаева, Е.И. Тиктопуло, Е.Н. Ильясова,

С.М. Кузнецова Биофизика, 2007, № 5, с. 899-911.

110. Николаева, Т.Н. Термодинамические характеристики коллагеновых

фибрилл, реконструированных in vitro при разных температурах и концентрациях

[Текст] / Т.Н.Николаева, Е.И. Тиктопуло, Р.В. Полозов, Ю.А. Рочев Биофизика,

2007, №2, с. 261-267

111. Определение общего количества азота по Кьельдалю – URL:

http://newgreenfield.ru/biohimiya-myasa/3363-opredelenie-obschego-kolichestva-

azota-po-keldalyu.html (дата обращения:13.03.2015)

112. Пащенко, В.Л. Разработка технологии функционального продукта с

применением коллагенового гидролизата / Пащенко В.Л., Сторублевцев С.А. //

Фундаментальные исследования – 2011 – №4 – с. 127-135

113. Покусаева, О.А. Ихтиожелатин как основа съедобных пленочных

покрытий для пищевых продуктов / О.А. Покусаева, Н.В. Долганова, О.С.

Якубова // Вестник АГТУ. Сер.: Рыбное хозяйство – 2015 – № 2 – с 123-128

128

114. Покусаева, О.А. Разработка пищевых плѐнок на основе

ихтиожелатина / О.А. Покусаева, К. С. Захарова, Н. В. Долганова, О.С. Якубова //

Научные достижения в решении актуальных проблем производства и переработки

сырья, стандартизации и безопасности продовольствия: тез. IV Междунар. науч.-

практ. конф. молодых ученых, аспирантов, студентов – Киев: Нац. ун-т

биоресурсов и природопользования Украины, 2014 – с. 37–38.

115. Полубояров, В.А. Интенсификация процесса растворения коллагена с

помощью механохимической обработки [Текст] /В.А. Полубояров, Е.В.

Волоскова, В.В. Янковая, Т.И. Гурьянова// Химия в интересах устойчивого

развития, 2009, №2. - с. 183-189.

116. Производство важнейших видов продукции по виду экономической

деятельности «Рыболовство» – URL:

http://voronezhstat.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat_ts/voronezhstat/ru/statistics/enterpri

ses/fisheries/ (дата обращения: 11.06.2015 г.)

117. Производство морского коллагена для перорального применения –

URL: http://infrahub.ru/projects/proizvodstvo-morskogo-kollagena-dlya-peroralnogo-

primeneniya (дата обращения:18.04.2015)

118. Производство мяса в России несколько сократилось //meatinfo.ru 07

октября 2014. URL: http://meatinfo.ru/news/proizvodstvo-myasa-v-rossii-neskolko-

sokratilos-332538 (дата обращения: 11.02.2015)

119. Различные виды коллагена– URL:

http://ru.inventiapt.com/AboutCollagen,16,Why-Native-Collagen.aspx (дата

обращения:28.07.2015)

120. Ратнер, С.Б. Роль релаксационного состояния полимерных материалов

в процессе достижения ими разрушения или критической ползучести [Текст] /

С.Б. Ратнер ВМС (серия А. и Б). – 1993. - № 3.

121. Рашкович, Л.Н. Атомно-силовая микроскопия процессов

кристаллизации в растворе / Рашкович Л.Н. // Соросовский образовательный

журнал – 2001 – №10 – с. 102-108.

122. Россия в цифрах 2015: Крат. стат. Сб./Росстат – М., 2015 – 543с.

129

123. Рубин, М.А. К вопросу о механизмах влияния иминокислот на

физические характеристики коллагенов [Текст] / М.А. Рубин, Е.И. Тиктопуло,

В.А. Намиот, В.Г. Туманян, Н.Г. Есипова. Биофизика, 2008. - №5 - С. 910-918.

124. Руководство по проведению доклинических исследований

лекарственных средств. Часть первая. – М.:Гриф и К, 2012. – 944с.

125. Сапожникова, А.И. Изучение возможности получения золей коллагена

пероксидно-щелочныым способом / Сапожникова А.И., Белевцова Д.В. //

Известия высших учебных заведений серия: химия и химическая технология. Т.

49 – 2006 – №12 – с. 73-76

126. Сапожникова, А.И. Коллаген как носитель для применения в

биотехнологии / А.И. Сапожникова, С.А. Каспарьянц, Н.В. Месропова, Е.Б.

Дьяконова, И.В. Топорова – URL : http://www.collagen.su/archives/2581 (дата

обращения:13.07.2015)

127. Серебрения методы – URL:

http://bigmeden.ru/article/Серебрения_Методы (дата обращения:11.03.2015)

128. Сиротина, Г.Г. Технология готовых лекарственных средств.[Текст]:

методическое пособие / Г.Г Сиротина, С.Н. Назаренко инициалы - Воронеж: ВГУ,

2007 –с. 32-34 (дата обращения:14.08.2015)

129. Слуцкий, Л.И. Молекулярная гетерогенность коллагена [Текст] / Л.И.

Слуцкий, Б.3. Симхович // - Успехи современной биологии, 1980, Выпуск 89, с.

58-73.

130. Способ обработки коллагеносодержащего сырья [Текст]: пат. 2139937

РФ: МПК C14C13/00, C14C1/08, C08H1/06 / Титов А.О., Титов О.П., Хантургаева

В.Г., Кожевникова Н.М., Хантургаева Г.И.; заявители и патентообладатели

Восточно-Сибирский государственный технологический университет,

Байкальский институт природопользования СО РАН - №98122080/12; заявл.

07.12.1998; опубл. 20.10.1999

131. Способ получения коллазоля [Текст]: пат. 2129805 РФ: МПК

A23J1/10, C09H1/00, C09H3/00, C14C1/08 / Сапожникова А.И., Каспарьянц С.А.,

Белевцова Д.В.; заявители и патентообладатели Сапожникова Алла Ионовна,

130

Каспарьянц Сергей Александрович, Белевцова Дарья Валерьевна - №97121210/13;

заявл. 30.12.1997; опубл. 10.05.1999.

132. Способ получения кормовой белково-минеральной муки (варианты)

[Текст]: пат. 2262861 РФ: МПК A23K1/10 / Воробьев В.И., Сергеева Н.Т.;

заявитель и патентообладатель Калининградский государственный технический

университет - №2001108484/13; заявл. 29.03.2001; опубл. 27.10.2005.

133. Способ получения пищевой добавки [Текст]: пат. 2241347 РФ: МПК:

A23L1/0562, A23L1/325, A23L1/30 / Степанцова Г.Е., Воробьев В.И.; заявитель и

патентообладатель Федеральное государственное унитарное предприятие

Атлантический научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и

океанографии - №2002102173/13; заявл. 25.01.2002, опубл. 10.12.2004.

134. Сторублевцев, С.А. Получение и применение функционального

гидролизата коллагена соединительных тканей сельскохозяйственных животных:

диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук: 05.18.07 /

Сторублевцев Станислав Андреевич.- Воронеж, 2009.- 249 с.

135. Сторублевцев, С.А. Создание отечественного производства

натуральных косметических средств из рыб внутренних водоемов [Текст] / С.А.

Сторублевцев, С.Б. Болгова // Сборник докладов Региональной научной

конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Инновационные

разработки молодых ученых воронежской области на службу региона». –

Воронеж, 2015. – с.7-8.

136. Сулейманов, С.М. Методы морфологических исследований [Текст]:

методическое пособие / С.М. Сулейманов.– Воронеж: ВГТА, 2007. – 87 с

137. Сысоев, В.В. Введение в линейное программирование: Методические

указания по курсу «Математические методы и модели в расчетах на ЭВМ»

[Текст] / В.В. Сысоев. – Воронеж. Технол. By-n/ - Воронеж, 1990.-27с.

138. Титов, Е.И. Коллагенсодержащее сырье мясной промышленности и

его использование / Е.И. Титов, С.К. Апраксина, Л.Ф. Митасева и др. - М.:

МГУПБ, 2006. - 80 с.

131

139. Тихинова, Ю.В. Свойства продуктов гидролиза коллагена / Ю.В.

Тихинова, Л.Г. Кривоносова, С.П. Ломакин, ЭС. Филатова, Р.Р. Хабибуллин //

Башкирский химический журнал, том 16 – 2009 – №1 – с. 13-15

140. ТР ТС 009/2011 О безопасности парфюмерно-косметической

продукции – URL:

http://www.eurasiancommission.org/ru/Lists/EECDocs/P_799_3.pdf (дата

обращения:13.06.2015)

141. Трегубова, Е.Д. Применение коллагена рыб в современной

косметологии / Трегубова Е.Д., Антипова Л.В., Хаустова Г.А., Данылив М.М. //

Успехи современного естествознания – 2011 – №7 – с. 220

142. Уайт, Л. Основы биохимии [Текст] / Ф. Хендлер, Э. Смит, Р. Уилл, И.

Леманн Т.3. М. Мир, 1981. С. 1467-1480.

143. Указ о применении отдельных специальных экономических мер в

целях обеспечения безопасности Российской Федерации. – URL:

http://kremlin.ru/events/president/news/46404 (дата обращения: 11.06.2015 г.)

144. Уманский, А.С. Кристаллография, рентгенография и электронная

микроскопия // Уманский, А.С., Скаков Ю.А.. - М.: Наука, 1982. – с. 362.

145. Хаустова, Г.А. Разработка технологий глубокой переработки рыбного

шкуросырья для получения коллагена, гиалуроновой кислоты и готовых кож :

диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук : 05.18.07 /

Хаустова Галина Александровна - Воронеж, 2013.- 249 с.

146. Шорманов, В. К. Фотометрическое определение коллагена [Текст] / В.

К. Шорманов, Г. Г. Булатников // Журнал аналитической химии. - 2006. - 61, № 4.

- С. 351-355.

147. Энциклопедия URL:

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%BA%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%

80%D1%83%D1%8E%D1%89%D0%B8%D0%B9_%D0%B0%D1%82%D0%BE%D

0%BC%D0%BD%D0%BE-

%D1%81%D0%B8%D0%BB%D0%BE%D0%B2%D0%BE%D0%B9_%D0%BC%D0

%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF (дата

132

обращения 21.08.2015)

148. Якубова, О.С. Разработка технологии получения ихтиожелатина из

чешуи рыб: диссертация на соискание степени кандидата технических наук:

05.18.04 / Якубова Олеся Сергеевна. - Воронеж, 2006 – с. 206.

149. Якубова, О.С. Свойства ихтиожелатина из чешуи рыб Каспийского

бассейна / О.С. Якубова, Н.В. Долганова // Хранение и переработка сельхозсырья

– 2005 – № 11 – с. 53–55.

133

ПРИЛОЖЕНИЯ

134

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ОЦЕНКА ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ

135

Объем выпускаемой продукции и число смен при производстве коллагена

животного и рыбного происхождения представлены в таблице А1

Таблица А1

Расчет годового объема производства продукции в натуральном выражении

Наименование

продукции

Сменная норма

выработки готовой

продукции, т

Количество

смен работы в

год, Тэф

Годовой объем

производства, т

Структура

ассортимента,

%

Рыбный

коллаген 0,05 260 13 100

Животный

коллаген 0,05 260 13 100

Стоимость товарной продукции по отпускным ценам предприятия

рассчитывается в таблице А2

Таблица А2

Расчѐт стоимости товарной продукции

Наименование

продукции

Объѐм

выпуска

продукции,

т

Себестоимос

ть товарной

продукции,

тыс. р.

Рентабельность

продукции %

Цена

изго-

товления

Отпускная

цена

предприятия

Стоимость

товарной

продукции

тыс. р.

Рыбный

коллаген 13 422,30 30 549,0 647,82 8421,66

Животный

коллаген 13 496,19 30 645,2 761,34 9897,42

Экономическая эффективность характеризуется рядом показателей, которые

сведены в таблице А3.

136

Таблица А3

Основные технико-экономические показатели предприятия

Показатели

Значение показателя

Рыбный

коллаген

Животный

коллаген

Годовая выработка в натуральном

выражении, т 13 13

Безубыточный объѐм производства, т 5,57 5,57

Товарная продукция, тыс. р. 8421,66 9897,42

Полная себестоимость товарной продукции,

тыс. р. 5489,88 6450,48

Затраты на 1 р. товарной продукции, р. 0,65 0,65

Валовая прибыль, тыс. р. 2931,78 3446,94

Чистая прибыль, тыс. р. 2347,78 2757,54

Среднесписочная численность работающих,

чел. 9 9

Годовой фонд заработной платы всех

работающих, тыс. р. 1815,63 1815,63

Производительность труда одного

работающего, тыс.р./чел 935,74 1099,71

Среднемесячная заработная плата, тыс. р. 15,13 15,13

Фондоотдача активной части ОПФ 23,7 27,9

Цена за кг готовой продукции, р. 647,82 761,34

В результате проведенной работы можно сделать вывод, что организация

производства рыбного коллагена является достаточно прибыльным. На основании

анализа технико-экономических показателей производства установили, что

производство продукции эффективно и рентабельно.

137

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРОЕКТ НОРМАТИВНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ

138

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ

ТЕХНОЛОГИЙ

ОКП 928324 Группа Н 28

(ОКС 67.120.99 )

СОГЛАСОВАНО

Директор

ФБУ «Воронежский ЦСМ»

_________________И.И. Павельев

«___»__________________ 2015г

УТВЕРЖДЕНО

Проректор по науке

и технике ВГУИТ

___________С.Т. Антипов

« » 2015 г.

СУБСТАНЦИЯ КОЛЛАГЕНОВАЯ 2 %-я

Проект технических условий

ТУ 9283-001-02068108-2015

Дата введения в действие

« » 2015 г.

РАЗРАБОТАНО

аспирант кафедры

ТПЖП ВГУИТ

________________С.Б. Болгова

личная подпись

Заведующий кафедрой

ТПЖП ВГУИТ

профессор, д.т.н.,

____________А.Н. Пономарев личная подпись

Воронеж 2015

139

ТУ 9283-001-02068108-2015

1. Область применения

1.1 Настоящие технические условия распространяются на субстанции

коллагеновые 2%-е, полученные из рыбного сырья и предназначенные для

дальнейшего использования в косметической и медицинской промышленности.

Обозначение при заказе: «Субстанция коллагеновая 2%-я, по ТУ 9283-001-

02068108-2015». Требования настоящих технических условий являются

обязательными.

1.2 Перечень нормативных документов приведѐн в приложении А1.

2. Требования к качеству и безопасности

2.1 Субстанция коллагеновая 2%-я должна быть изготовлена в соответствии с

требованиями настоящих технических условий с соблюдением действующих

санитарных норм и правил, утвержденных в установленном порядке.

2.2 По органолептическим и физико-химическим показателям субстанция

коллагеновая 2%-я должна соответствовать требованиям, указанным в таблице

А1.

Таблица А1 - Органолептические и физико-химические показатели субстанции

коллагеновой 2%-й

Показатель Характеристика и норма для субстанции коллагеновой 2%-й

Внешний вид Прозрачный раствор

Цвет От светло-желтого до белого цвета

Запах Без постороннего. Слабо выраженный, характерный для данного

вида сырья

Вкус Не нормируется

Прозрачность Прозрачный

рН 6

Массовая доля золы, %,

не более

Не более 2

Посторонние примеси Не допускаются

Динамическая вязкость,

мПа∙с

Не менее 12

2.3 Сырье для производства субстанции коллагеновой 2%-й по качеству и

показателям безопасности должно соответствовать «Гигиеническим требованиям

140

ТУ 9283-001-02068108-2015

безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.1078),

утвержденным постановлением Главного государственного санитарного врача РФ

от 6 ноября 2001 г. (индекс 1.3.1.3.)

Таблица А2 - Микробиологические показатели рыбного сырья

Наименование показателя Значение для рыбного сырья

Количество мезофильных аэробных и факультативно-

анаэробных микроорганизмов КОЕ/г, не более 1104

Масса продукта (г), в

которой не допускаются

БГКП (колиформы) 1,0

S. аurеs 1,0

Содержание токсичных элементов, антибиотиков, нитрозаминов,

пестицидов, радионуклидов в сырье должны превышать требованиям СанПиНа

2.3.5.1078 (индекс 1.3.1). Сведения о содержании токсичных элементов

представлены в таблице А3.

Таблица А3 – Содержание токсичных элементов, нитрозаминов и радионуклидов

Наименование показателя Допустимые уровни, не

более

Токсичные элементы, мг/кг

свинец 0,5

мышьяк 0,1 кадмий 0,05 ртуть 0,03 медь 5,0 цинк 70,0

Нитрозоамины мг/кг сумма НДМА и

НДЭА

0,002 Радионуклиды, бк\кг Цезий-137 160

Стронций-90 50

2.5 Требования к сырью и материалам

2.5.1 Для производства субстанции коллагеновой применяют:

- Шкуры толстолобика: ГОСТ 7631-2008;

- Гидроксид натрия: ГОСТ Р 55064-2012;

- Раствор перекиси водорода: ГОСТ 177-88;

- кислота уксусная для пищевой промышленности: ГОСТ Р 55982-2014;

- Полимерные контейнеры: ГОСТ 16338-85;

- Крышка из ПЭВД: ГОСТ 16337-77;

141

ТУ 9283-001-02068108-2015

- Пленка из полимерных материалов: ГОСТ 25951-83;

- Этикетки бумажные: ГОСТ Р 51074-2003.

2.5.2Сырье для производства полуфабрикатов по качеству и показателям

безопасности должно соответствовать «Гигиеническим требованиям безопасности

и пищевой ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.1078).

3. Требование к качеству и безопасности готовой продукции.

Коллагеновая субстанция должна соответствовать требованиям

технического регламента Таможенного союза 009/2011 «О безопасности

парфюмерно-косметической продукции». Требуемые нормы представлены в

таблице А4.

Таблица А4 – Требования ТРТС 009/2011

Определяемые показатели

Величина

допустимого

уровня

Единицы

измерения

НД на методы

исследований

Санитарно-гигиенические исследования

Водородный показатель (рН) 5,0-9,0 - ГОСТ 29188.2-91

Мышьяк не более 5,0 мк/г ГОСТ 4152-89

Ртуть не более 1,0 мк/г ГОСТ 26927-86

Свинец не более 5,0 мк/г ГОСТ30178-96

Токсикологическое исследование:

Кожно-раздражающее действие 0

(отсутствует) балл

МУ 2102-79

МУ 2196-80

МУ 2163-80

Воздействие на слизистую оболочку

(однократно)

0

(отсутствует) балл

МУ 2196-80

МУ2163-80

Общетоксическое действие, определяемое

альтернативными методами in vitro отсутствие - МУ 01.038-08

Микробиологические показатели:

Общее количество мезофильных аэробных

и факультативно-анаэробных

микроорганизмов, КОЕ/г

Не более 103

- ГОСТ ISO 21149-

2013

Candida albicans в 0,1г не

допускается -

ГОСТ ISO 18416-

2013

Escherichia coli в 0,1г не

допускается -

ГОСТ ISO 21150-

2013

Staphylococcus aureus в 0,1г не

допускается -

ГОСТ ISO 22718-

2013

Pseudomonas aeruginosa в 0,1г не

допускается -

ГОСТ ISO 22717-

2013

142

ТУ 9283-001-02068108-2015

4. Маркировка

Маркировка транспортной тары по ГОСТ 14192-96 с нанесением основных,

дополнительных и информационных надписей.

Транспортная маркировка, характеризующая продукцию, наносится на одну из торцевых

сторон транспортной тары путем наклеивания ярлыка с указанием:

- наименования продукта;

- наименования предприятия-изготовителя, его юридического адреса,

включая страну, и товарного знака (при наличии такового у предприятия-

изготовителя), местонахождения предприятия - изготовителя при несовпадении с

его юридическим адресом;

- массы нетто и массы брутто;

- количества потребительских упаковочных единиц в единице транспортной тары;

- даты изготовления и даты упаковывания, срока годности, условий хранения; - -

обозначения настоящих технических условий, информации о подтверждении соответствия.

Дополнительно на контейнеры с коллагеновой субстанцией наклеивают

бумажные этикетки по ГОСТ Р 51074 с указанием:

-наименования предприятия-изготовителя, его адреса и товарного знака

-наименования продукта;

-состава продукта;

-даты и часа его изготовления;

-срока годности;

-массы нетто единицы упаковки;

-информации о сертификации;

-обозначения настоящих технических условий.

5. Упаковка

143

ТУ 9283-001-02068108-2015

- Субстанцию коллагеновую 2%-й помещают в полимерные (ПЭНД)

контейнеры по ГОСТ 16338 вместимостью 5 л с крышкой из ПЭВД по ГОСТ

16337. Упаковка должна соответствовать ГОСТ 17768. Коэффициент заполнения

емкости – не более 0,95. При заполнении флаконов допускается отклонение ±1,5%

от объема.

- Контейнеры закручивают герметично завинчивающейся крышкой с

контролем вскрытия (кольцо из ПЭВД по ГОСТ 16337).

- Контейнеры упаковывают партиями по 10шт. в пленку из полимерных

материалов по ГОСТ 25951.

- Тара и упаковочные материалы для упаковки должны быть чистыми,

сухими, без плесени и постороннего запаха, должны быть изготовлены из

материалов, разрешенных органами государственного санитарно-

эпидемиологического надзора для контакта с данным видом продукции.

6. Правила приемки

6.1 Продукцию принимают партиями. Под партией понимают любое

количество единиц субстанции коллагеновой 2%-й одной марки, однородного по

своим качественным показателям и оформленного одним документом. Партия

продукции должна сопровождаться выданным изготовителем документом,

удостоверяющим качество и безопасность, с указанием:

- номера и даты выдачи документа, удостоверяющего качество и

безопасность;

- наименование и местонахождение изготовителя: юридический адрес,

включая страну, и (при несовпадении с юридическим адресом) адрес(а)

производств(а) и организации, уполномоченной изготовителем на принятие

претензий от потребителей на ее территории (при наличии);

- наименование продукции, номера партии (при его наличии);

- даты изготовления (с указанием часа изготовления продукции, срок

годности, который исчисляется часами);

- массы нетто продукции;

144

ТУ 9283-001-02068108-2015

- числа единиц потребительской тары с продукцией и ее вида;

- обозначение настоящих технических условий;

- числа единиц транспортной тары с продукцией и ее вида;

- результатов текущего контроля;

- даты отгрузки, условий транспортирования;

- сроков хранения или сроков годности, условий хранения;

- информации о подтверждении соответствия;

- подписи лица, ответственного за выдачу документа.

6.2 Органолептические показатели определяют в каждой партии.

Результаты контроля вносят в удостоверение о качестве и безопасности на

партию. Номер удостоверения о качестве и безопасности указывают в товарно-

транспортной накладной.

6.3 Физико-химические показатели определяются в соответствии с

ГОСТами периодически, не реже одного раза в декаду, при разногласиях по

органолептической оценке качества продукции, а также по требованию

контролирующей организации или потребителя.

6.4.Определение токсических и микробиологических элементов проводится

периодически, но не реже одного раза в месяц.

7 Методы контроля

7.1 Отбор проб

Методы отбора проб по ГОСТ 31339

Подготовка проб по ГОСТ 26929

Методы определения органолептических и физических показателей по

ГОСТ 7631.

7.2 Определение цветности ГОСТ 14871

7.3 Определение рН по ГОСТ 29188.2-91

7.4 Определение вязкости по ГОСТ 33-2000

7.5 Массовая доля золы по ГОСТ 15113.8-77

7.6 Массовая доля влаги по ГОСТ 15113.4-77

145

ТУ 9283-001-02068108-2015

7.7 Массовая доля коллагена по ГОСТ 23401

7.8 Определение микробиологических показателей – по ГОСТ Р 50454,

ГОСТ Р 50455, ГОСТ 10444.15, ГОСТ 26669, ГОСТ 26670, ГОСТ ISO 18416-2013,

ГОСТ ISO 22718-2013, ГОСТ ISO 22717-2013.

7.9 Минерализация для определения токсичных элементов по ГОСТ

26929

7.10 Метод определения ртути по ГОСТ 26927-86

7.11 Метод определения мышьяка по ГОСТ 4152-89

7.12 Метод определения свинца по ГОСТ30178-96

7.13 Определение радионуклидов по МУК 2.6.2.717

7.14 Контроль массы по ГОСТ 7631 (Весы ГОСТ Р 53228-2008

8 Правила транспортировки и хранения

8.1. Субстанция коллагеновая 2%-я транспортируют всеми видами

транспорта в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами

перевозок грузов, действующими на данном виде транспорта.

8.2 Срок годности субстанции коллагеновой 2%-й при хранении на

предприятии-изготовителе и торговой сети при температуре не выше 10 ˚С и

влажности воздуха на более 70% 4 месяца.

146

Приложение А1

Перечень документов, на которые даны ссылки в технических условиях

Обозначение

нормативного или

технического

документа

Наименование документа

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ Р 55064-

2012

Натр едкий технический

ГОСТ Р 55982-

2014

Кислота уксусная для пищевой промышленности. Технические

условия

ГОСТ 33-2000 Прозрачные и непрозрачные жидкости. Определение

кинематической вязкости и расчет динамической вязкости ГОСТ 7631-2008 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Методы определения

органолептических и физических показателей

ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных

аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

ГОСТ 15113.8-77 Методы определения золы ГОСТ 14192-96 Маркировка грузов

ГОСТ 14871-76 Реактивы. Методы определения цветности жидких химических

реактивов и растворов реактивов

ГОСТ 16337-77 Полиэтилен высокого давления

ГОСТ 16338-85 Полиэтилен низкого давления

ГОСТ 17768-90 Средства лекарственные. Упаковка, маркировка, транспортирование

и хранение

ГОСТ 23041-78 Метод определения оксипролина

ГОСТ 25951-83 Пленка полиэтиленовая термоусадочная. Технические условия

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для

микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 26927-86 Сырье и продукты пищевые. Методы определения ртути

ГОСТ 26929-94 Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для

определения содержания токсичных элементов

ГОСТ 29329-92 Весы для статического взвешивания. Общие технические условия

ГОСТ 31339-2006 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и

методы отбора проб

ГОСТ Р 50455-92 Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный

метод)

ГОСТ Р 51074 Продукты пищевые. Информация для потребителя. Общие

требования

ГОСТ Р 53969-

201

Метод определения массовой доли влаги

МУК 2.6.2.717-98 Радиационный контроль. Стронций-90 и цезий-137. Пищевые

продукты. Отбор проб, анализ и гигиеническая оценка.

Методические указания

СанПиН

2.3.2.1078

Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности

пищевых продуктов

ТРТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической продукции»

147

ПРИЛОЖЕНИЕ В

АКТЫ АПРОБАЦИИ

148

149

150

151

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

ДИПЛОМЫ, НАГРАДЫ, СЕРТИФИКАТЫ

152

153

154

155

156

157

158

159