全长单链 PCR产物整合到枯草芽孢杆菌体内

齐鑫

枯草芽孢杆菌• 芽孢杆菌属的一种，不致病• 无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢 0.6 ～

0.9×1.0 ～ 1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大

• 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭（ b ú ）

• 可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚• 主要用于工业生产，有的菌株是 α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌

枯草芽孢杆菌生长条件• 最适温度： 32℃• 最适 pH值： 7.0• 最适转速： 120r/min• 芽孢率生长最适温度 36℃，最适 PH 为 7.2，最适转速 120r/min

• 枯草芽孢杆菌具有同源重组机制，以前根据这一点研究过：

• gene disruption/replacement• Recombinational cloning• direct repeated (DR) sequences mediated in-

frame deletion • marker rescue system• Multimeric plasmid-based transformation • recombinational capture of PCR products

• 一些研究发现利用引入外源的重组系统比如 Cre system 和 λ Red proteins system，结合电转化，可以有效的进行枯草芽孢杆菌体内的重组。

• Cre system ： P1噬菌体感染大肠杆菌，在溶源状态时是单拷贝质粒，在裂解状态时是作为线状双链 DNA包进噬菌体头部中。 P1编码的重组酶 Cre催化两个 loxP位点间的重组，被广泛应用。

• 2010 年，研究发现， λ 重组系统中，利用的是 dsDNA 降解为 ssDNA ，然后才进行重组。

• 这一点和枯草芽孢杆菌一致，外源 dsDNA到细胞表面时候会降解成为 ssDNA ，早在1991 年就发现了。

• 于是就有了一种新的方法• 利用单链 DNA 是否比双链 DNA 更加有效？

可行性验证

1

• 三对引物的 PCR 反应

2

• 联合 PCR ，有一个问题： 2004 年有人证明，用最外面的引物再次扩增是有困难的。

3

• 嵌套 PCR• 前后截去 500bp 的长度

4

• 不对称 PCR ：引物比为 30pmol 和 0.5pmol 。

转化1 ：线性化的 dsDNA2 ：先导链 ssDNA3 ：后随链 ssDNA4 ：正对照： pMA5分别以这四种作为转化的底物，电转到

B.subtilis DL3p ， B.subtilis DL3p 是 B.subtilis 168 的一种蛋白酶缺陷型菌株，即可以表达一些特定的蛋白。

淀粉板验证转化是否成功• 左边菌落为正对照，右边菌落为用 kana 基

因代替 amyE 基因的菌株。

PCR 验证转化是否成功• 1 ：重组了 kana 基因• 的菌株为模板• 2 ：负对照• 3 ：转化了 pMA5 质• 粒的菌株为模板

计算转化效率方法• 孵育完涂板时，稀释 10000 倍涂在无 kana

的 LB 板上，计算菌落数量。（能成活的细胞数目）

• 正常的实验组，原浓度涂在有 kana 的 LB 板上。（进行正常的筛选）得到 CFU

• 两者数据相除，再除以 DNA 的质量（ ug ），得到转化效率，单位为 CFU/ug DNA per viable cell

转化效率对比1 ：线性化的 dsDNA2 ：先导链 ssDNA3 ：后随链 ssDNA4.5.6 为 1.2.3 分别在5’ 端两个连续硫磷酰化的结果（起到保护作用）

一些问题• 1. 在之前研究中大肠杆菌 ssDNA 的转化效

率不如 dsDNA 。• 造成的可能原因是 ssDNA 的二级结构不同。• 2.5’ 端的基团可以保护 5’ 端不受降解，明

显可以提高转化效率。

更多的研究• 在枯草芽孢杆菌中引入解脂耶罗维亚酵母

中的 Lip2 基因。可以合成脂肪分解酵素。

• 过富培养基上培养： 2% (w/v) yeast extract, 2.5% (w/v) tryptone, 3% (w/v) K2HPO4) containing 1% (w/v) starch

• 测定酶的活性使用 p-nitrophenyl 方法，进行分光光度法测量。

• B.subtilis DL3p ：• 0.02±0.01 U/mg total protein• 转入 Lip2 基因的 B.subtilis DL3p ：• 0.91±0.05 U/mg total protein.

总结• 后随链的 ssDNA 转化入枯草芽孢杆菌体内

的效率很高。• 如果在 5’ 端加上硫磷酰化的保护基团，会

更加增加转化效率。• 这个实验不仅表现了枯草芽孢杆菌研究的

一个可行性，还说明一些其他菌株也可以作为实验工具的潜力。