细胞库检定及方法介绍 The Introduction of Cell Banks Characterization and Methods

2020

主讲人：李晴晴

北京义翘神州科技股份有限公司

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目 录 Directory

①细胞库的建立及检定概述

②细胞库检定的项目要求

③细胞库检定的方法介绍

1

PART1

细胞库的建立及检定概述 • 细胞库的建立 • 各级细胞库的概念

• 细胞库的检定阶段 • 细胞库检定的必要性

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细胞库的建立

目的

•细胞库的建立可为生物制品的生产提供检定合格、质量相同、能持续

稳定传代的细胞。

要求

•细胞建库应在符合中国现行《药品生产质量管理规范》的条件下制备。

•三级细胞库管理包括细胞种子、主细胞库（MCB）及工作细胞库

（WCB）。在某些特殊情况下，也可采用细胞种子及MCB二级管理，

但须得到国务院药品监督管理部门的批准。

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工作细胞库的细胞由MCB传代扩增制成。生产

企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。

冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代

增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制

品。复苏后的传代的水平应不超过批准的该细

胞用于生产的最高限定。所制备的WCB必须经

检定合格后，方可用于生产。

MCB 取细胞种子经细胞传代、增殖后均匀混合成一批

，定量均匀分装于细胞冻存管，保存于液氮。经

全面检定合格后，即可作为主细胞库，用于工作

细胞库的制备。生产企业的主细胞库最多不得超

过两个细胞代次。

EOPC&UPB 生产终末细胞是指在或超过生产末期时收获的

细胞，尽可能取按生产规模制备的生产末期细

胞。EOPC应进行一次全面检定，当生产工艺

发生改变时，应重新对EOPC进行检测。收获

液UPB包含生产用细胞和细胞培养上清液。

由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞

群体，或经过克隆培养形成的均一细胞群体，

通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在

特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬

液，定量均匀分装于细胞冻存管，于液氮冻存

，即为细胞种子，供建立主细胞库用。

WCB PCB

各级细胞库的概念

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UPB

PCB

扩增

MCB

复苏

WCB EOPC

筛选 复苏

冻存

RCB

复苏 冻存

扩增 冻存 复苏

冻存

细胞库检定阶段

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Primary Cell Bank

原始细胞库（PCB）

Master Cell Bank

主细胞库（MCB）

Working Cell Bank

工作细胞库（WCB）

Unprocessed Bulk

收获液（UPB）

End of production Cell

生产终末细胞（EOPC）

细胞库检定阶段

原则上各级细胞库建好库后要及时进行检定，确保细胞库没有污染后，才能用于下级细胞库的建立或产品的生产。

细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞（EOPC）进行一次全面检定。当生产工艺发生改变时，应重新对EOPC进行检定。每次从MCB建立一个新的WCB，均应按规定项目进行检定。

IND或BLA阶段对细胞库的检定要求是相同的，但需满足现行药典法规的要求。

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造成生物制品的污染，

直接影响产品的安全

性；

污染后给企业带来巨

大的经济损失。

生物制品的安全性 国内外法规要求

中国、美国、欧洲等

药典明确规定必须对

细胞库进行充分检定

后才可用于生物制品

的生产；

CDE审查必查项目。

细胞库检定的必要性

PART2

细胞库检定的项目要求 •中国药典检定项目

•细胞治疗类产品(以293细胞为例)

•检定用细胞

•抗体和蛋白类产品（以CHO细胞为例）

•干细胞类产品（以hMSCs细胞为例）

•牛血清和胰酶病毒检定

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检测项目 MCB WCB EOPC

细胞鉴别 ＋ ＋ （＋）

细菌、真菌检查 ＋ ＋ ＋

分枝杆菌检查 （＋） （＋） （＋）

支原体检查 ＋ ＋ ＋

内外源病毒污染检查

细胞形态观察及血吸附试验 ＋ ＋ ＋ 体外不同细胞接种培养法 ＋ ＋ ＋ 动物和鸡胚体内接种法 ＋ － ＋

逆转录病毒检查 ＋ － ＋ 种属特异性病毒检查 （＋） － － 牛源性病毒检查 （＋） （＋） （＋） 猪源性病毒检查 （＋） （＋） （＋） 其他特定病毒检查 （＋） （＋） （＋）

染色体检查 （＋） （＋） （＋）

成瘤性检查 （＋） （＋） －

致瘤性检查 （＋） （＋） －

中国药典检定项目

“+ ”为必检项目，“-”为

非强制检定项目。

( + ) 表示要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。

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检测项目 MCB WCB EOPC(3批) 收获液(3批) 细胞鉴别 ★ ★ ★

细菌、真菌检查 ★ ★ ★ ★微限 支原体检查 ★ ★ ★ ★ 分枝杆菌检查 ★ ★ ★

内外源病毒污染检查

细胞形态观察及血吸附试验 ★ ★ ★ （★）

体外不同细胞接种培养法

人源MRC-5 ★ ★ ★ ★ 猴源VERO

同种属同组织类型细胞

动物和鸡胚体内接种法

鸡胚 ★ ★ 成鼠、乳鼠 ★ ★

豚鼠（新建细胞系） （★） （★） 家兔（猴源细胞系） （★） （★）

逆转录病毒检查 逆转录酶活 ★ ★ ★ 电镜法 ★ ★ ★

感染性病毒检测-敏感细胞培养法 ★ ★ ★

种属特异性病毒检查 鼠源病毒检测 ★

其他特定病毒检查 鼠细小病毒检查 ★

★ ★

牛源性病毒检查（传代过程中使用牛源血清的情况下检查 ） （★） （★） （★） 猪源性病毒的检测（传代过程中使用猪源胰酶的情况下检查） （★） （★） （★）

抗体和蛋白类产品（以CHO为例）

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检测项目 MCB WCB EOPC 细胞鉴别 ★ ★ ★

SV40 大T抗原核酸序列测定 ★ ★ ★ 腺病毒5型EIA基因序列鉴别 ★ ★ ★

细菌、真菌检查 ★ ★ ★ 支原体检查 ★ ★ ★ 分枝杆菌检查 ★ ★ ★

内外源病毒污染检查

细胞形态观察及血吸附实验 ★ ★ ★

体外不同指示细胞接种培养

人源MRC-5

★ ★ ★ 猴源VERO

同种属同组织类型细胞

动物和鸡胚体内接种法 鸡胚 ★ ★

小鼠、乳鼠 ★ ★ 逆转录病毒检查 逆转录酶活 ★ ★

种属特异性病毒检查 人源病毒检测 ★

复制型腺病毒检测 ★ 牛源性病毒检查（使用牛源血清的情况下检查 ） （★） （★） （★） 猪源性病毒的检测（使用猪源胰酶的情况下检查） （★） （★） （★）

细胞治疗类产品（以293细胞为例）

干细胞类产品（以hMSCs细胞为例）

完整版“通用型”hMSCs“质量检验”的内容。 P5，P5+X，P5+X+Y分别代表初始检测代次（或临床使用代次）、初始代次后的X个扩展代次（如5个代次）、初始代次的X+Y个扩展代次（Y也可以为5个代次）。

检测项目 相同组织来源批次细胞 P5 P5+X P5+X+Y

1．细胞鉴别

1.1 细胞形态 ★ ★ ★

1.2 同工酶法 ★ ★

1.3 STR图谱鉴别 ★ ★

1.4 流式细胞仪检测细胞表面标记物 ★ ★ ★

1.5 种属间细胞污染检测 ★ ★

1.6 染色体核型检测 ★

2．细菌、真菌检测 ★ ★ ★

3．支原体检测 3.1 培养法 ★ ★ ★

3.2 DNA荧光染色 ★ ★ ★

4．细胞内、外病毒因子检测

4.1细胞培养直接观察法 ★ ★ ★

4.2体外不同传代细胞培养及血吸附/血凝试验 ★ ★

4.3动物体内接种法

1）乳鼠脑内及腹腔接种；2）小鼠脑内及腹腔接种；3）豚鼠腹腔接种；4）家兔皮内及皮下接种 ★ ★

4.4鸡胚接种检测

1）鸡胚卵黄囊腔接种；2）鸡胚尿囊腔接种及尿囊液血凝试验 ★ ★

4.5 特殊人源病毒检测

HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV检测 ★

4.6 牛源病毒检测 ★

4.7 猪细小病毒检测 ★

4.8 逆转录病毒检测 ★ ★

干细胞类产品（以hMSCs细胞为例）

检测项目 相同组织来源批次细胞

P5 P5+X P5+X+Y

5. 免疫学反应检测 5.1淋巴细胞增殖抑制检测 ★ ★ ★

5.2 特定淋巴细胞亚群检测 (Th1\Th17\Treg) ★ ★ ★

5.3 淋巴细胞分泌TNF-α抑制试验 ★ ★ ★

6. 生物学有效性评价 6.1 成骨细胞分化 ★ ★ ★

6.2 成软骨细胞分化 ★ ★ ★

6.3 成脂细胞分化 ★ ★ ★

7.细胞活性检测 7.1 细胞数和细胞存活率 ★ ★ ★

7.2 细胞生长曲线 ★ ★

7.3 细胞周期测定 ★ ★

8. 成瘤性检测 8.1 裸鼠体内接种试验 ★

8.2 软琼脂克隆形成试验 ★

8.3 端粒酶活性检测 ★ ★

9. 残留物检测 9.1牛血清白蛋白残留检测 ★

9.2抗生素残留检测 ★

完整版“通用型”hMSCs“质量检验”的内容。 P5，P5+X，P5+X+Y分别代表初始检测代次（或临床使用代次）、初始代次后的X个扩展代次（如5个代次）、初始代次的X+Y个扩展代次（Y也可以为5个代次）。

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检测项目 MCB WCB

细胞鉴别 ★ ★

细菌、真菌检查 ★ ★

支原体检查 ★ ★

内外源病毒污染检查

细胞形态观察及血吸附实验 （★） （★）

体外不同指示细胞接种培养

人源MRC-5

（★） （★） 猴源VERO

同种属同组织类型细胞

动物和鸡胚体内接种法

鸡胚 （★）

成鼠、乳鼠 （★）

豚鼠 （★）

家兔 （★）

检定用细胞

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样品 检定项目 检定病毒种类 检测方法

血清 牛源性病毒检查

牛腹泻病毒 牛腺病毒

牛副流感病毒 牛细小病毒 呼肠弧病毒 狂犬病毒

细胞病变检查 血吸附试验 荧光抗体检测

胰酶 猪源性病毒检查 猪细小病毒 细胞病变检查 血吸附试验 qPCR检测

牛血清和胰酶病毒检定

PART3

细胞库检定的方法介绍 •细胞鉴别 •细菌、真菌检查

•支原体检查

•逆转录病毒检查

•体外不同细胞接种培养法

•动物和鸡胚体内接种法

•种属特异性病毒检查 •牛源、猪源病毒检查

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方法类别 检测方法

生物化学法 同工酶试验

免疫学检测 组织相容性抗原、种特异性免疫血清

细胞遗传学检测 染色体核型、标记染色体检测

遗传标记检测 DNA 指纹图谱、STR、RELP-PCR、EPIC-PCR

其他方法 杂交法、PCR 法、报告基因法等

细胞鉴别

选择下述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属性的鉴别：

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阳性对照

1 2 3 4 5 6 7 8

1-金黄色葡萄球菌；

2-枯草芽孢杆菌；

3-黑曲霉；

4-阴性；

5-铜绿假单胞菌；

6-生孢梭菌；

7-白色念珠菌；

8-大肠埃希菌。

9-样品

药典方法要求： 培养基的适用性检查 方法适用性检查 供试品的无菌检查（薄膜过滤法）

依据：2015版中国药典三部通则1101无菌检查法

细菌、真菌检查

B+A环境

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10-9 10-8 10-7 阴性对照

10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

肺炎支原体灵敏度10-9 口腔支原体灵敏度10-10

依据：2015版中国药典三部通则3301支原体检查法

培养基的灵敏度检查： ①肺炎支原体培养基灵敏度标准：10-8

②口腔支原体培养基灵敏度标准：10-4

菌种：

肺炎支原体

（ATCC 15531株）

口腔支原体

（ATCC 23714株）

样品检查： 样品分别接种至半流体和液体培养基，于接种7天后从液体培养基中转种进行次代培养，继续培养21天，同时观察初代培养和次代培养结果，以培养基有无颜色变化为结果判定标准，培养基颜色无变化说明无支原体污染，反之则可能有支原体污染，可取加倍量样品复试。

支原体检查-培养法

阴性对照

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污染支原体的Vero细胞 未污染支原体的Vero细胞

药典要求： 阳性对照除细胞外可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒；阴性对照仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。

样品检查： DNA荧光染色法是将样品接种于Vero细胞中培养3-5天后传代，再培养3-5天后用特异荧光染料染色，同时设阴性对照和阳性对照。如样品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。

依据：2015版中国药典三部通则3301支原体检查法

支原体检查-DNA染色法

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MRC-5正常细胞系 MRC-5血吸附试验 阳性

药典方法： • 细胞病变观察 • 血吸附试验 • 红细胞凝集试验

样品检查： 样品接种于猴源细胞Vero，人二倍体细胞MRC-5，和同种属同组织类型来源细胞上，取培养7天的细胞上清液分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养7天，观察细胞病变，并在观察期末取细胞培养物进行血吸附试验；取细胞培养上清液进行红细胞凝集试验。

体外不同细胞接种培养法

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方法描述：用待检细胞培养上清液制备细胞裂解物，接种动物体内进行外源病毒因子检测。待检细胞至少应接种乳鼠、成年小鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计4组，如为新建细胞，还需接种豚鼠。原代猴肾细胞还需用家兔体内接种法或兔肾细胞培养法检查猴疱疹B病毒。按上表所列方法进行试验和观察。接种后24小时内动物死亡超过20 %，试验无效。

动物和鸡胚体内接种法

动物组 要求 数量 接种途径 细胞浓度（个活细胞/mL）

接种细胞液量（mL/只）

观察天数

乳鼠 24小时内 至少20只 （2窝）

脑内 腹腔

＞1×107 0.01 0.1

21天

成年小鼠 15-20g 至少10只 脑内 腹腔

＞1×107

0.03 0.5

21天

鸡胚 9-11日龄 10枚 尿囊腔 ＞5×106 0.2 3-4天

鸡胚 5-7日龄 10枚 卵黄囊 ＞2×106 0.5 5天

豚鼠 350-500g 5只 腹腔 ＞4×105 5.0 至少42天

家兔 1.5-2.5kg 5只 皮下 皮内

＞2×105 9.0 0.1×10

至少21天

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逆转录病毒检查

逆转录酶活检测

（TM-PERT法）

• 以噬菌体MS2 RNA为

模板，经反转录后再采

用实时荧光定量PCR法

检测特异性扩增信号，

从而测定样品中的逆转

录酶活性。

电镜法

• 逆转录酶活检测为阳性

时进行电镜检查

• 使用透射电镜（TEM）

直接观察不少于100个

细胞轮廓中逆转录病毒

样颗粒。

感染性试验

•逆转录酶活检测为阳

性时进行感染性实验

•使用PG-4细胞空斑病

变法评估逆转录病毒感

染性。若出现空斑病变

则判定为有可感染性逆

转录病毒。

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鼠源病毒 人源病毒 猴源病毒

抗体产生试验或分子检测 分子检测 分子检测

出血热病毒 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒 III型呼肠弧病毒 仙台病毒 脱脚病病毒 小鼠腺病毒 小鼠肺炎病毒 鼠白血病病毒

人EB病毒 人巨细胞病毒(EVMV) 人逆转录病毒(HIV-1/2、HTLV1/2) 人肝炎病毒(HAV、HBV、HCV) 人细小病毒B19 人乳头瘤病毒 人多瘤病毒 人腺病毒 人疱疹病毒-6/7/8

猴多瘤病毒（如SV40） 猴免疫缺陷病毒（SIV）

种属特异性病毒检查

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牛源病毒检查

方法描述：取样品用培养上清液制备成至少相当于107个活细胞/mL的裂解物进行检测。通过接种指示细胞培养21天后进行细胞病变观察（CPE）、血吸附检查（HAd）及荧光抗体检测（IF）。

依据： 2015版中国药典三部通则3604新生牛血清检测

• Vero细胞

• BT细胞

• MDBK细胞

• 人二倍体细胞

细胞病变观察

（CPE）

• Vero细胞

• BT细胞

• MDBK细胞

• 人二倍体细胞

血吸附检查

（HAD）

• 牛副流感病毒

• 牛腹泻病毒

• 牛腺病毒

• 牛细小病毒

• 呼肠弧病毒

• 狂犬病毒

荧光抗体检测

（IF）

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MDBK细胞-BVDV阳性 BT细胞-BPV阴性 MDBK细胞-BVDV阴性 BT细胞-BPV阳性

荧光抗体检测：阳性对照有绿色荧光

牛源病毒检查

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猪源病毒检查

药典方法： • 细胞病变观察 • 血吸附试验 • qPCR法

样品检查： 取样品接种指示细胞PK-15培养21天后进行细胞病变观察（CPE）、血吸附检查（HAd）；采用qPCR荧光探针法，对样品中是否有猪细小病毒(PPV) 污染进行检查

PK-15正常细胞系 PK-15血吸附试验 阳性 PK-15感染PPV CPE

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