手足口病的病原学及实验室检测

陈立中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

国家脊灰实验室2010-04-21

手足口病的病原 引起手足口病的病毒属于小 RNA 病毒科肠道病毒属包

括 柯萨奇病毒 A 组（ Coxasckievirus A CVA ）的 2 4 5 7 9 10 16 型等 B 组（ Coxasckievirus B CVB) 的 1 2 3 4 5 型等 肠道病毒 71 型（ Human Enterovirus 71 EV71 ） 埃可病毒（ Echovirus ECHO ）等

其中以 EV71 及 CVA16 型较为常见 肠道病毒适合在湿热的环境下生存与传播 75 酒精

和 5 来苏不能将其灭活对乙醚去氯胆酸盐等不敏感对紫外线和干燥敏感各种氧化剂 ( 高锰酸钾漂白粉等 ) 甲醛碘酒以及 56 30 分钟可以灭活病毒病毒在 4 可存活 1 年 -20 可长期保存在外环境中可长期存活

人肠道病毒感染的一般致病机制人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径进入途径 口腔口腔 呼吸道呼吸道 咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道

传播传播扁桃体扁桃体深层淋巴结深层淋巴结肠道淋巴结肠道淋巴结

微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染

神经系统神经系统心心脏脏肝脏肝脏胰脏胰脏肾上腺肾上腺

呼吸系统呼吸系统 皮肤及黏膜皮肤及黏膜

病毒血症病毒血症神经系统神经系统

抗体产生抗体产生病毒血症消失病毒血症消失病毒感染症状改善病毒感染症状改善

飞沫接触饮食飞沫接触饮食

肌肉肌肉

流行病学 传染源 患者和隐性感染者发病前数天感染

者咽部与粪便就可检出病毒通常以发病后一周内传染性最强

传播途径可经胃肠道（粪 - 口途径）传播也可经呼吸道（飞沫咳嗽打喷嚏等）传播亦可因接触患者口鼻分泌物皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播

流行以 5 岁及以下儿童为主尤以 3 岁及以下儿童发病率最高一般 5-7 月为发病高峰

实验室诊断mdashmdash临床诊断病例符合下列条件之一者即可

诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子脑脊液

疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）

自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子等标本中检测到 CVA16 或 EV71 特异性核酸或从脑脊液疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

手足口病的病原 引起手足口病的病毒属于小 RNA 病毒科肠道病毒属包

括 柯萨奇病毒 A 组（ Coxasckievirus A CVA ）的 2 4 5 7 9 10 16 型等 B 组（ Coxasckievirus B CVB) 的 1 2 3 4 5 型等 肠道病毒 71 型（ Human Enterovirus 71 EV71 ） 埃可病毒（ Echovirus ECHO ）等

其中以 EV71 及 CVA16 型较为常见 肠道病毒适合在湿热的环境下生存与传播 75 酒精

和 5 来苏不能将其灭活对乙醚去氯胆酸盐等不敏感对紫外线和干燥敏感各种氧化剂 ( 高锰酸钾漂白粉等 ) 甲醛碘酒以及 56 30 分钟可以灭活病毒病毒在 4 可存活 1 年 -20 可长期保存在外环境中可长期存活

人肠道病毒感染的一般致病机制人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径进入途径 口腔口腔 呼吸道呼吸道 咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道

传播传播扁桃体扁桃体深层淋巴结深层淋巴结肠道淋巴结肠道淋巴结

微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染

神经系统神经系统心心脏脏肝脏肝脏胰脏胰脏肾上腺肾上腺

呼吸系统呼吸系统 皮肤及黏膜皮肤及黏膜

病毒血症病毒血症神经系统神经系统

抗体产生抗体产生病毒血症消失病毒血症消失病毒感染症状改善病毒感染症状改善

飞沫接触饮食飞沫接触饮食

肌肉肌肉

流行病学 传染源 患者和隐性感染者发病前数天感染

者咽部与粪便就可检出病毒通常以发病后一周内传染性最强

传播途径可经胃肠道（粪 - 口途径）传播也可经呼吸道（飞沫咳嗽打喷嚏等）传播亦可因接触患者口鼻分泌物皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播

流行以 5 岁及以下儿童为主尤以 3 岁及以下儿童发病率最高一般 5-7 月为发病高峰

实验室诊断mdashmdash临床诊断病例符合下列条件之一者即可

诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子脑脊液

疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）

自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子等标本中检测到 CVA16 或 EV71 特异性核酸或从脑脊液疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

人肠道病毒感染的一般致病机制人肠道病毒感染的一般致病机制进入途径进入途径 口腔口腔 呼吸道呼吸道 咽喉及下肠胃道咽喉及下肠胃道

传播传播扁桃体扁桃体深层淋巴结深层淋巴结肠道淋巴结肠道淋巴结

微病毒血症微病毒血症先天性感染先天性感染

神经系统神经系统心心脏脏肝脏肝脏胰脏胰脏肾上腺肾上腺

呼吸系统呼吸系统 皮肤及黏膜皮肤及黏膜

病毒血症病毒血症神经系统神经系统

抗体产生抗体产生病毒血症消失病毒血症消失病毒感染症状改善病毒感染症状改善

飞沫接触饮食飞沫接触饮食

肌肉肌肉

流行病学 传染源 患者和隐性感染者发病前数天感染

者咽部与粪便就可检出病毒通常以发病后一周内传染性最强

传播途径可经胃肠道（粪 - 口途径）传播也可经呼吸道（飞沫咳嗽打喷嚏等）传播亦可因接触患者口鼻分泌物皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播

流行以 5 岁及以下儿童为主尤以 3 岁及以下儿童发病率最高一般 5-7 月为发病高峰

实验室诊断mdashmdash临床诊断病例符合下列条件之一者即可

诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子脑脊液

疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）

自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子等标本中检测到 CVA16 或 EV71 特异性核酸或从脑脊液疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

流行病学 传染源 患者和隐性感染者发病前数天感染

者咽部与粪便就可检出病毒通常以发病后一周内传染性最强

传播途径可经胃肠道（粪 - 口途径）传播也可经呼吸道（飞沫咳嗽打喷嚏等）传播亦可因接触患者口鼻分泌物皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播

流行以 5 岁及以下儿童为主尤以 3 岁及以下儿童发病率最高一般 5-7 月为发病高峰

实验室诊断mdashmdash临床诊断病例符合下列条件之一者即可

诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子脑脊液

疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）

自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子等标本中检测到 CVA16 或 EV71 特异性核酸或从脑脊液疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

实验室诊断mdashmdash临床诊断病例符合下列条件之一者即可

诊断为实验室确诊病例 自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子脑脊液

疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括 CVA16 和 EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）

自咽拭子或咽喉洗液粪便或肛拭子等标本中检测到 CVA16 或 EV71 特异性核酸或从脑脊液疱疹液血清以及脑肺脾淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括 CVA16和 EV71 等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

实验室诊断 血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴

度ge 1 256∶ 或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有 4 倍或 4 倍以上的升高

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

病原学监测要求 各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监

测了解病原动态分布变化所有重症和死亡病例均需采样此外以县（区）为单位每月最少需采集 5 例首次就诊的普通病例标本当月县（区）病例总数少于 5例时全部采样

以省（区市）为单位 在手足口病流行年份中每年至少采集 20 对 EV71 和 10 对 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清 以阐明和分析 EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性

以省（区市）为单位每月至少从手足口病病例中分离10 株毒株并做血清型别鉴定鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于 5 个工作日内报送至中国疾病预防控制中心具备测序条件的省份可开展 VP1 基因序列测定和分析进行基因定型序列测定完成后将序列结果于 5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心不具备测序条件者将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定中国疾病预防控制中心要于 28个工作日内反馈基因定型结果

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

31 个省级实验室

1

国家实验室

331 个地级实验室

肠道病毒分离物基因分型 血清流行病学检测 诊断方法建立 质量控制 对省级实验室提供技术支持

肠道病毒分离和鉴定 (PCR ICA PCR-RFLP real time PCR ） 对地级实验室的质量控制对地级实验室提供技术支持

RT-PCR Real time PCR 采集标本

中国肠道病毒三级实验室网络中国肠道病毒三级实验室网络

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

标本采集和检测 （ 1 ）所有重症和死亡病例均要采集标本可以采集咽拭子粪便或肛拭子疱疹液脑脊液血清等死亡病例还可采集脑肺肠淋巴结等组织标本聚集性病例至少要采集 2 例病例标本开展病原学检测

（ 2 ）医疗机构负责样本采集疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集

（ 3 ）疾病预防控制机构根据本地的技术能力对采集的标本开展核酸检测病毒分离不具备技术条件时及时送上级机构进行检测

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

标本的选择 粪便标本肛拭子（ 3日内 5-8g ） 咽拭子标本 (3日内 维持液 ) 血清标本（发病 0-3 天 14-30 天） 疱疹液（多个疱疹作为一个标本） 脑脊液标本 ( 出现神经系统症状后 3 天

内）

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

采集标本的种类保存和运输

（一）粪便标本 采集病人发病 3 日内的粪便标本用于病原检测粪便标本采集量5-8g 份采集后立即放入无菌采便管内外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

采集标本的种类保存和运输

（二）咽拭子标本 采集病人发病 3日内的咽拭子标本用于病原检测用专用采样棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位应避免触及舌部迅速将棉签放入装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的15ml 外螺旋盖采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥外表贴上带有唯一识别号码的标签 4暂存并在 12 小时内送达实验室 -20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于 -70冰箱

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

采集标本的种类保存和运输

（三）血清标本 各省（区市）在手足口病流行年份中均应采集 EV71 和 CVA16 感染的手足口病患儿的双份血清采集急性期（发病 0-7d ）和恢复期（发病 14-30d ）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和 CVA16 感染后 IgG 和 IgM 抗体的动态变化评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性静脉采集 3-5ml全血置于真空无菌采血管中自凝后分离血清将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中外表贴上带有唯一识别号码的标签将血清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

（四）疱疹液 在手足口病的实验室诊断中从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因可同时采集多个疱疹作为一份标本先用 75 的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液迅速将棉签放入内装有 3-5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水推荐使用维持液）的采样管中在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

（五）肛拭子标本 采集病人发病 3日内的肛拭子标本用于病原检测用专用采样棉签从患儿肛门轻轻插入适度用力弧型左右擦拭数下拔出后 迅速将棉签放入装有 3 － 5ml保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签在靠近顶端处折断棉签杆旋紧管盖并密封以防干燥

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

（六）尸检标本 采集脑肺和肠淋巴结等重要组织标

本每一采集部位分别使用单独的消毒器械每种组织应多部位取材每部位应取2-3份约 5-10g 的组织淋巴结 2个分别置于 15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

（七）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例可采集脑脊

液标本进行病毒分离或核酸检测采集时间为出现神经系统症状后 3 天内采集量为 10-20ml 采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中 4暂存立即 (12h 内 )送达实验室－ 20 以下低温冷冻保藏需长期保存的标本存于－ 70冰箱但EV71 感染神经系统时很难在脑脊液中检测到 EV71 病原

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

标本运输和贮存注意事项 临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输 12 小时内送达实验室

依照《人间传染的病原微生物名录》肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B类包装置于冷藏保存盒内运输尽量缩短运输时间

可采用陆路或航空等多种运输方式但在运输过程中应采取保护措施避免强烈震动重力挤压等现象

在送到省地市级 CDC 实验室时包装盒内应带冰且包装完整在上送标本的同时需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

实验室检测 病毒分离 测定人双份血清标本的中和抗体滴度 逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

病毒分离 病毒分离细胞系 RD细胞来源于人横纹肌肉瘤细胞 HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细

粪便标本和肛拭子的处理 按ldquo手足口病标本采集及检测技术方案rdquo

疱疹液标本通常直接用于 RNA提取或病毒分离 脑脊液标本通常直接用于病毒分离 咽拭子标本的处理按ldquo手足口病标本采集及检

测技术方案rdquo

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

咽拭子处理（病毒分离用）

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少 40 下）以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等用于病毒分离时需要冻融一次（防止多次冻融）使细胞破裂释放病毒颗粒然后在 4 条件下10000 rpm离心 20min 用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 如果发现有细菌污染须用滤器过滤除菌

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

病毒分离结果解释 RD细胞支持 HFMD 的主要病原体mdashmdash CVA16 和 EV71

等多种肠道病毒的复制 CVA16 和 EV71 均能在 RD 细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE ）表现为细胞圆缩分散胞浆内颗粒增加最后细胞自管壁脱落

但相同滴度的 CVA16 和 EV71 在 RD细胞中生长的速度不同 EV71 的生长速度要快于 CVA16 表现为 EV71感染 RD细胞后出现 CPE 的时间比 CVA16早 EV71 接种细胞后出现 CPE很快但 CVA16 一般要经过 2次以上传代才出现明显的 CPE

若在使用 RD细胞分离的同时再增加 HEp-2细胞可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致 HFMD 的病原体如一些柯萨奇 B 组病毒）但 CVA16 和 EV71 在HEp-2细胞中均不繁殖

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法最常用的是中和实验

通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较抗体滴度 4 倍或 4 倍以上增高证明病毒感染

肠道病毒隐性感染也很常见所以在评估检测结果时就要小心一些

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

中和试验结果判定 如果恢复期血清较急性期血清 EV71 或 CVA16

中和抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高即可确诊 如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和

抗体滴度出现 4 倍或 4 倍以上增高可证实该肠道病毒感染是否为病因需要其它相关实验证实

如果单份血清中和抗体滴度大于 1256 也有诊断意义血清中和抗体滴度为 1128判定为可疑阳性

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ）的标本处理

粪便标本采用氯仿进行处理后提取核酸

肛拭子 咽拭子标本咽拭子要在标本保存液中充分搅动然后在 4 条件下 10000 rpm离心 20min

疱疹液和脑脊液直接用于 RNA提取

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

逆转录 -聚合酶链反应（ RT-PCR ） RT-PCR 实验结果解释表

待检标本 RT-PCR 结果 鉴定结果

HEV(-) EV71(-) CVA16(-) 非肠道病毒（ NEV ）

HEV(+) EV71(-) CVA16(-) 非 EV71 CVA16 的其它肠道病毒

HEV(+) EV71(+) CVA16(-) EV71

HEV(+) EV71(-) CVA16(+) CVA16

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

RT-PCR注意事项按下列好的实验室操作规程操作可以减少交叉污染的发生 PCR 之前的准备工作和之后的处理分别在不同的房间内操作

PCR 之前的准备工作和之后的处理分别使用两套移液器以及其他设备

将试剂分装保存尽量减少重复使用的频率 准备和分装试剂应该在无 PCR扩增产物的区域内进行 准备寡聚核苷酸引物应该在无 PCR扩增产物的环境中进

行 只使用能阻止气溶胶产生的吸尖 戴手套（无滑石粉）并经常更换

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

RT-PCR注意事项 打开各种管子要小心避免气溶胶的产生 减少每次处理样品的数量 将除了核酸之外的其他试剂先加到反应管中最后再加入

核酸 加入一个核酸后要盖上盖子然后再加入其它核酸 使用阳性对照选取一个稳定的每次都能扩增出结果的样

品作阳性对照 使用一个已知性质的样品作阴性对照 每次实验都要用试剂混合物作为空白对照它包含除了标

本 RNA 以外的 PCR反应所需的所有其它成分

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

Real-time RT-PCR （ rRT-PCR ）

与普通 PCR模式相比 实时荧光 PCR具备几个方面的优势 1048766

封闭反应污染机会少1048766 无需 PCR 后处理（杂交电泳拍照）操作简单高

度自动化1048766 特异性强灵敏度高1048766 用途广泛既能定量又能定性1048766 采用对数期分析摒弃终点数据定量准确仪器在线式

实时检测结果直观避免人为判断1048766 可实现一管双检或多检1048766 操作安全缩短时间提高效率荧光定量 PCR是通过

对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

rRT-PCR注意事项 模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5ul模板量）不够部分以水补足如选用另外试剂盒反应体系及条件随之变化

从试剂盒中取出相应的试剂反应液在室温融化后瞬时离心按 n+1配置反应体系（ n=样本数+1管阳性对照 +1管阴性对照）

每次实验均应设立阳性对照和阴性对照 阴性对照核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本

阳性对照提取好的阳性核酸作为模板 RNA

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

rRT-PCR 结果判读 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点结果显示阴性为准或可根据仪器噪音情况进行调整

Ct值le 350 的样本为阳性 Ct值无数值的标本和 Ct值ge 380 的样本为阴性样本

380gt Ct 值 gt350 的样本为临界值 注荧光 PCR同时读取 FAM 和 HEX 进行双

通道检测 FAM荧光 Ct值为 CVA16 的结果 HEX荧光 Ct值为 EV71 的结果

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

生物安全 柯萨奇病毒埃可病毒 EV71 型和目前

分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物

在保证安全的前提下对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II级或以上防护级别的实验室进行涉及病毒分离培养的操作应加强个体防护和环境保护

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规

生物安全 操作粪便脑脊液和血液等临床标本时要

特别注意生物安全要在 II级生物安全柜中进行标本处理病毒分离和病毒鉴定无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫

灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I级实验室进行

所有操作应遵守国家相关法律法规