ว กรมวิทย พ 57 (2) เม.ย. - มิ.ย....

ปท 57 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2558 Vol. 57 No. 2 April - June 2015

ว กรมวทย พ 57 (2) เม.ย. - ม.ย. 2558 B

ull Dept M

ed Sci 57 (2

) April - June 2015

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยจดท�าโดยกรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขเพอเผยแพรผลงานวจยและแลกเปลยนความรดานวทยาศาสตรการแพทยทกสาขา

เจาของ กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขทปรกษาดานบรหาร นพ.อภชยมงคล นางจรภรณบณยวงศวโรจน พญ.วารณจนารตน นพ.วนชยสตยาวฒพงศ

ทปรกษาดานวชาการ ภญ.อมราวงศพทธพทกษ พญ.มยรากสมภ ภญ.ดร.จงดวองพนยรตน นางพมพใจนยโกวท ภญ.สภทราอมเอบ ภญ.ดร.สมลปวตรานนท ดร.ปนดดาซลวา

บรรณาธการ สพญ.ดร.เยาวภาพงษสวรรณ

คณะบรรณาธการ ศ.ดร.นพ.สมชยบวรกตต ศ.ดร.นพ.ประเสรฐเออวรากล ศ.ดร.อรษาสตเธยรกล ศ.ดร.พไลพนธพธวฒนะ ดร.อารทตตยพงศ นางสาวจไรโชตธนาทววงศ นายศรศรมโนรถ ดร.อษาวดถาวระ นางกนกพรอธสข นางวชชดาจรยะพนธ นายสธนวงษชร นางสาวมาลนจตตกานตพชย ดร.สวรรณาเธยรองกร นางสรภากรแสงกจพร ดร.วมลเพชรกาญจนาพงศ ดร.ประไพวงศสนคงมน ภญ.ดร.เจรญดปงสทธวงศ ภญ.ดร.วลยลกษณเมธาภทร ดร.อารรตนสงาแสง

เลขานการ นางไพรวรรณบญวงษ

ฝายธรการ นางสาวน�าฝนนอยประเสรฐ นางสาวประสานจลวงษ

ก�าหนดออก ราย3เดอนอตราสมาชก ในประเทศปละ200.-บาท ตางประเทศปละ50.00เหรยญสหรฐอเมรกาส�านกงานวารสาร กรมวทยาศาสตรการแพทย 88/7ซอยตวานนท14ถนนตวานนทนนทบร11000 โทร.0-2951-0000 โทรสาร0-2951-1297พมพท หจก.อรณการพมพ 457/6-7ถนนพระสเมรแขวงบวรนเวศเขตพระนครกรงเทพฯ10200 โทร.0-2282-6033-4

THE BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

The bulletin of the Department of Medical ciences is an offi i l publication oftheDepartmentofMedicalSciences,MinistryofPublicHealth.Itisdevotedtothedisseminationofknowledgeconcerningmedicalsciencesandthefacilitationofco-operationamongscientists.

Owner Department of Medical ciences, Ministry of Public Health Administrative Advisor ApichaiMongkol JurepornBoonyawongvirot

Varunee Jinaratana Wanchai attayawuthipong

Technical Advisor Amara Vongbuddhapitak Mayura KusumJongdee Wongpinairat Pimjai Naigowit

SupatraIm-Erb SumolPavittranon PanaddaSilva

Editor Yaowapa Pongsuwanna

Editorial Board SomchaiBovornkitti PrasertAuewarakul OrasaSuthienkul Pilaipanputhavathana

Aree Thattiyaphong Jurai Chotichanathawewong SiriSrimanoroth UsavadeeThavara

Kanokporn Atisook Wichuda Jariyapanuthon Vongsheree Malinee Chittaganpitchuwanna Tienungoon iripakorn angkitporn

Wimol Petkanchanapong Prapai Wongsinkongman Charoendee Pingsuthiwong Walailuk Matapatara

AreeratSa-ngasang

Secretary Paiwan Boonwong

Administration Namfon NoiprasertPrasan Julwong

Subscription Rate The Bulletin of the Department of Medical ciences is published quarterly. Annual subscription rate is ฿ 200.00 for domestic and

.$50.00forallothercountries.Of i Department of Medical ciences 88/7SoiTiwanond14,Tiwanond Rd.,Nonthaburi11000,Thailand.

Tel.0-2951-0000 Fax:0-2951-1297Printed by AroonkarnphimLtd.,Part. 457/6-7PhraSumenRoad,Bangkok10200 Tel.0-2282-6033-4

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยBULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES


นพนธตนฉบบการพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความชำานาญการวเคราะหอาหารและนำา พ.ศ. 2554-2556 79 กนกพร อธสข จตผกำ สนทดรบ และวชำดำ จงมวำสนำ การพฒนาและทดสอบความถกตองของวธวเคราะหไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทในอาหาร 91โดย LC-MS/MS ทองสข ปำยะนนทน และลดดำ แกวกลำปญญำเจรญ การสรางศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางองสากลผานการพฒนาและการตรวจรบรอง 109ระบบคณภาพ ISO guide 34 ธระพล คชำชวะ และสภำพร ภมอมร การพฒนาการเปนผดำาเนนการแผนทดสอบความชำานาญการตรวจวเคราะหอาหาร 127ทางจลชววทยา ลดำวลย จงสมำนกล กมลวรรณ กนแตง และอจฉรำ อยคง การวเคราะหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลในเนอหม โดยใชเทคนค Exact-matching 142double IDMS: ผลการเขารวมเปรยบเทยบผลการวด APMP.QM-S6 Clenbuterol in Porcine Meat กตตยำ เชยรแมน พรหทย กนแกว ปรยำภรณ พกรอด ศรกฤษณ มำบ�ำรง และปนดดำ ชลวำการพฒนาวธวเคราะหปรมาณเดกซาเมทาโซน และเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณ 157โดยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง จรำนช แจมทวกล สเมธ เทยงธรรม วลยลกษณ เมธำภทร และจตรำ ชยวฒนการพฒนาแผนแปะผวหนงจากสมนไพรบวบก 174 พรศร ประเสรฐวำร จรำนช มงเมอง เสำวณย ทองด ศกดวชย ออนทอง และณฉตรำ จนทรสวำนชยชววทยาของยงพาหะโรคไขเลอดออกและซโรทยปของเชอไวรสเดงกในวงจรการเกดโรค 186ในประเทศไทย อษำวด ถำวระ พำย ภกดนวน อภวฏ ธวชสน จกรวำล ชมภศร ชญำดำ ดพลงำม ยทธนำ ภทรพย อจฉรำ ภม ธรกมล เพงสกล เผดจ สรยะเสถยร และสมชำย แสงกจพร

รายงานจากหองปฏบตการกรณศกษา : ความผดพลาดในการคำานวณสถตจากคาลอการทม 197 สธน วงษชร กตตพงษ เกดฤทธ สรศกด หมนพล มะลวลย หอมจน และพรหมภสสร ดษสระ

สารบญหนา

CONTENTSPage

Original ArticlesDevelopment of Proficiency Testing Quality System on Food 79and Water Analysis (2011-2013) Kanokporn Atisook Jitpaka Suntudrob and Wischada JongmevasanaMethod development and Validation for Determination of Nitrofuran 91Metabolites in Food by LC-MS/MS Thongsuk Payanan and Ladda KaewklapanyacharoenCapacity Building of International Reference Laboratory through 109 Development and ISO guide 34:2009 Assessments Teerapon Kachacheewa and Supaporn PhumiamornDevelopment of Proficiency Testing Providing for Food Microbiological 127Testing Laboratory Ladawan Chungsamanukool Kamonwan Kantaeng and Atchara UkongAnalysis of Clenbuterol in Porcine Meat Utilizing an 142Exact-Matching Double IDMS: Interlaboratory Comparison Result: APMP.QM-S6 Clenbuterol in Porcine Meat Kittiya Shearman Pornhatai Kankaew Preeyaporn Pookrod Sornkrit Marbumrung and Panadda Silva

Method Development for Determination of Dexamethasone and 157 Prednisolone in Traditional Drug by High-Performance Liquid Chromatography Jiranuch Jamtaweekul Sumate Thiangthum Waliluk Matapatara and Chitra Chaiyawat The Development of Transdermal Patch From Centella Asiatica (L.) Urban 174 Pornsri Prasertwaree Jiranuch Mingmuang Saowanee Thongdee Sakwichai Onthong and Nuchattra ChansuwanichBiology of Dengue Vectors and Serotypes of Dengue Virus in infectious 186 Cycle in Thailand Usavadee Thavara Payu Bhakdeenuan Apiwat Tawatsin Jakkrawarn Chompoosri Chayada Khumsawads Yuttana Phusup Atchara Phumee Theerakamol Pengsakul Padet Siriyasatien and Somchai Sangkitporn

Laboratory FindingsFailure in Calculating The Statistics from Logarithm Values: Case Study 197 Suthon Vongsheree Kittipoong Keardrit Surasak Muenphon Maliwan Homchan and Prompussorn Dissara

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยBULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES


บทบรรณาธการ

สวสดทานผอานวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย ปท 57 ฉบบท 2 เมษายน – มถนายน 2558 ทกทาน ฉบบนเลมวารสารเลมหนาขนกวาเดม สบเนองจากการประชมวชาการครงท 23 เรอง National Labolatory System for Global Health Security ระหวางวนท 25-25 มนาคม 2558 ณ อมแพคฟอรม เมองทองธาน จะเหนไดวากรมวทยาศาสตร การแพทย มนกวจยทจะคดคนสงตางๆ ทใหความรและเปนประโยชนมากมายซงกเปนนโยบายของกรมฯ ทจะสงเสรมให นกวทยาศาสตรการแพทยไดมผลงานตพมพเผยแพรแกผสนใจไดน�าไปใชประโยชน

ในวารสารเลมนยงคงมบทความวชาการทเตมไปดวยขอมลทนาสนใจรวม 9 เรอง แยกเปน นพนธตนฉบบ 8 เรอง และรายงานจากหองปฏบตการ 1 เรอง ซงทง 9 เรองนเปนผลงานวชาการทนาสนใจตอการตดตาม

ขอขอบพระคณผทบทวนบทความ (reviewer) ทกรณาเสยสละเวลาอนมคาตรวจแกบทความเพอใหไดผลงาน ทดลงตพมพในวารสาร ขอขอบคณผนพนธทกทานทสงบทความลงเผยแพร และขอบคณผตดตามอานวารสารฯ ซงวารสารฯ ยนดทจะไดรบขอเสนอแนะจากทกทานเพอเปนแนวทางในการปรบปรงวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย ตอไป

ปราณ ชวลตธ�ารง

คาแนะนาในการเตรยมตนฉบบเพอตพมพ ในวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย

ประเภทของบทความ

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย รบตพมพบทความ ประเภทนพนธตนฉบบ รายงานจากหองปฏบตการ กรณศกษา บทความปรทศน บทความทวไป จดหมายถงบรรณาธการ บทบรรณาธการและสารตดตอสน บทความทสงตพมพจะตองไมเคยตพมพ หรอกาลงตพมพในวารสารฉบบอนมากอน ทงนบทความทกเรองจะไดรบการพจารณาตรวจแกจากผทรงคณวฒในสาขาทเกยวของ และกองบรรณาธการขอสงวนสทธในการตรวจแกไขตนฉบบและพจารณาตพมพตามลาดบกอนหลง

ความรบผดชอบ

บทความทตพมพในวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย ถอเปนผลงานทางวชาการ และเปนความเหนสวนตวของผเขยน ไมใชความเหนของกรมวทยาศาสตรการแพทย หรอกองบรรณาธการ

ผเขยนตองรบผดชอบตอบทความของตน

การเตรยมตนฉบบ

ภาษาทใชคอ ภาษาไทยและภาษาองกฤษ ตนฉบบภาษาไทย ควรใชภาษาไทยใหมากทสดเทาทจะทาได คาศพทเฉพาะหรอคาศพทภาษาองกฤษทบญญตเปนภาษาไทยแลว แตยงไมเปนททราบกนอยางแพรหลาย หรอแปลแลวเขาใจยาก ใหใสภาษาองกฤษกากบไวในวงเลบ หรออนโลมใหใชภาษาองกฤษได

ตนฉบบควรพมพบนกระดาษขาวขนาด A4 ใชตวอกษร (font) ชนด Angsana New ขนาดตว

อกษร 16 พมพบรรทดค (หรอแตละบรรทดใหหางอยางนอย 6 มม.) พมพหนาเดยวและใสเลขกากบทกหนา โดยเวนขอบดานซายและดานบน 3.5 ซม. ดานขวาและดานลาง 2.5 ซม.

หนาแรกของตนฉบบประกอบดวยชอเรอง ชอผเขยน ชอผเขยนททาหนาทประสานงานกบ

คณะบรรณาธการ และสถานททางานทสามารถตดตอไดทางไปรษณย และชอเรองโดยยอ (running

title) ทงภาษาไทยและภาษาองกฤษ

หนาทสองเปนบทคดยอ ตองเขยนทงภาษาไทยและภาษาองกฤษ ความยาวไมเกน 250 คา โดยครอบคลมทมาของหวขอวจย วตถประสงค ขอบเขตการวจย วธทาหรอวธการรวบรวมขอมล ผลใชเฉพาะขอมลหลกทสาคญและสถตทใช และสรปโดยเนนหลกการสาคญทพบใหม ทายบทคดยอภาษาองกฤษใหมคาสาคญของบทความ (key word) ไมเกน 5 คา เปนภาษาองกฤษ สาหรบผทไมสนทดภาษาองกฤษควรหาผทชานาญภาษาองกฤษชวยตรวจสอบ

นพนธตนฉบบ ว กรมวทย พ 2558; 57 (2) : 79-90

79วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย

ปท 57 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2558

การพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความชำานาญการวเคราะหอาหารและนำา พ.ศ. 2554-2556

กนกพร อธสข จตผกา สนทดรบ และวชาดา จงมวาสนาส�ำนกคณภำพและควำมปลอดภยอำหำร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 10 February 2015

บทคดยอ การทดสอบความช�านาญการวเคราะหอาหารและน�าเปนองคประกอบส�าคญของการประกนคณภาพหองปฏบตการทดสอบอาหาร เนองจากเปนการประเมนความสามารถของหองปฏบตการจากหนวยงานภายนอก แสดงถงความถกตองเชอถอไดของผลการทดสอบ เพอใหผใชบรการของหองปฏบตการสามารถน�าผลการทดสอบไปใชในการควบคมคณภาพอาหารในการผลต น�าเขา สงออก หรอประกอบการขนทะเบยนต�ารบอาหาร ซงในปจจบนประเทศไทยมหนวยงานใหบรการทดสอบความช�านาญ (proficiency testing provider) จ�านวนไมมาก และโปรแกรมทใหบรการยงไมครอบคลมรายการทดสอบ ท�าใหหองปฏบตการจ�าเปนตองใชบรการจากหนวยงานตางประเทศทมราคาสง ส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร กรมวทยาศาสตรการแพทย จงไดพฒนาและจดการระบบงานการทดสอบความช�านาญใหสอดคลองตามขอก�าหนดของ ISO/IEC 17043: 2010 จนไดรบการรบรองจาก ส�านกบรหารและรบรองระบบงาน กรมวทยาศาสตรบรการตงแตเดอนกนยายน 2555 การพฒนาระบบคณภาพประกอบดวย การวางแผนและก�าหนดเปาหมายความส�าเรจ การด�าเนนการขอรบรอง การรกษาสถานภาพการไดรบการรบรอง และการปรบปรงอยางตอเนอง การไดรบการรบรองแสดงถงความสามารถในการเปนผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญทใหบรการตามมาตรฐานสากล หองปฏบตการสมาชกไดรบประโยชน คอ ไดรบบรการทดสอบความช�านาญทถกตองเชอถอได มคณภาพ โปรงใส และประหยดคาใชจาย สามารถน�าผลการเขารวมทดสอบความช�านาญไปแสดงถงความสามารถของการด�าเนนการของหองปฏบตการในการขอรบรองมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005 ไดอยางมนใจ ความส�าเรจในการพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความช�านาญ ในชวง พ.ศ. 2554 ถง พ.ศ. 2556 น สามารถใชเปนแนวทางใหหนวยงานใหบรการทดสอบความช�านาญน�าไปใชในการพฒนาได

80วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 57 ฉบบท 2 เมษายน - มถนายน 2558

Development of Proficiency Testing Quality System Kanokporn Atisook et al.

บทนำากฎกระทรวงแบงสวนราชการกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข พ.ศ. 2552(1) ก�าหนดใหม

ภารกจเกยวกบการวจยและตรวจชนสตรดานวทยาศาสตรการแพทย โดยมการศกษา วเคราะห วจย และพฒนา องคความรและเทคโนโลยดานวทยาศาสตรการแพทย เพอผลการสรางเสรมสขภาพทดแกประชาชนและสนบสนน

การแกไขปญหาสาธารณสขของประเทศ รวมทงเพอการสนบสนนกระบวนการคมครองผบรโภคของประชาชน โดยม อ�านาจหนาททส�าคญ คอ เปนหองปฏบตการอางองดานการทดสอบคณภาพและมาตรฐานของผลตภณฑสขภาพ สนบสนนและพฒนาระบบประกนคณภาพหองปฏบตการ ซงในปจจบนระบบคณภาพ (quality system) ทใชกนในหองปฏบตการทดสอบ (testing laboratory) และหองปฏบตการสอบเทยบ (calibration laboratory) ทเปนมาตรฐานสากลและยอมรบกนทวโลก คอ ISO/IEC 17025: 2005 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories ซงมขอก�าหนดดานการบรหารและวชาการทยนยนไดวาหองปฏบตการทใชระบบคณภาพนสามารถแสดงความสามารถดานวชาการ (technical competent) สามารถสรางผลการทดสอบทนาเชอถอได (technically valid results)(2) และถาหองปฏบตการทใชระบบคณภาพไดรบการรบรองจากหนวยรบรอง (accreditation body) จะสงผลไปถงการยอมรบผลการทดสอบในการคาระหวางประเทศดวย โดยมาตรฐานนมขอก�าหนดทส�าคญดานบรหารจ�านวน 15 ขอ และดานวชาการจ�านวน 10 ขอ ขอก�าหนดวชาการทส�าคญขอหนงคอ ขอท 5.9 ระบเรอง การประกนคณภาพผลการทดสอบและสอบเทยบ (assuring the quality of test and calibration results) โดยก�าหนดใหหองปฏบตการตองมวธการหรอขนตอนการปฏบตในการเฝาระวงความนาเชอถอ

ของผลทดสอบและสอบเทยบ โดยใชเครองมอ ไดแก วสดอางองรบรอง (certified reference materials) วสดรบรอง (secondary reference materials) การเขารวมเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการ (interlabora-

tory comparison) หรอทดสอบความช�านาญ (proficiency testing; PT) การทดสอบซ�าดวยวธเดมหรอวธอน

การทดสอบตวอยางทเกบไว (retained items) หรอการหาความสมพนธของผลทดสอบส�าหรบคณลกษณะเฉพาะ ของตวอยางทดสอบ ในบรรดาเครองมอทใชในการประกนคณภาพ การเขารวมเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการและการเขารวมทดสอบความช�านาญ เปนกจกรรมทตองมหองปฏบตการอนมาเกยวของอกอยางนอย 1 หองปฏบตการหรอตองมผจดโปรแกรม (PT provider; PTP) กจกรรมทงสองถอไดวาเปนการควบคมคณภาพจากภายนอก

(external quality control) เนองจากหองปฏบตการตองทดสอบหรอวเคราะหตวอยางทไมรคา (unknown sample) เชนเดยวกบการใหบรการทดสอบแกลกคา โดยในตางประเทศม PTP ทมโปรแกรมดานอาหาร ใหบรการในราคาสง ซงอาจเปนเพราะมคแขงไมมาก หรอเพราะคาใชจายในการขนสงตวอยางทมกเปนตวอยางทเนาเสยงาย ตองไดรบการดแลควบคมอณหภม แชเยน หรอแชแขง หองปฏบตการไมมทางเลอกมากนกจ�าเปนตองใชบรการ ดวยการเลงเหนความส�าคญของการเขารวมทดสอบความช�านาญของหองปฏบตการภายในประเทศ และความจ�าเปนในการพงพาตนเอง ในป พ.ศ. 2541 กองอาหาร ปจจบน คอ ส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร (ใชชอยอวา สคอ.) ไดจดแผนทดสอบความช�านาญ “การสอบเทยบผลวเคราะหอะฟลาทอกซน ในตวอยางขาวโพด ถวลสง และนม”(3) ซงเปนสวนหนงของโครงการแกปญหาอะฟลาทอกซนในอาหารและอาหารสตวครบวงจร ด�าเนนการ ในชวง พ.ศ. 2539 ถง พ.ศ. 2543 โดยส�านกงานมาตรฐานผลตภณฑอตสาหกรรมในฐานะผประสานงานโคเดกซ ในขณะนนเปนเจาของโครงการ ไดมอบใหกรมวทยาศาสตรการแพทยเปน PTP เตรยมตวอยาง (PT items) 3 ชนด คอ ขาวโพด ถวลสง และนม โดยไดรบความรและฝกปฏบตในเรองการเตรยมตวอยาง การทดสอบความเปนเนอเดยวกน และการทดสอบความคงตว จาก U.S. Food and Drug Administration สหรฐอเมรกา เพอด�าเนนการในสวนการประกนคณภาพผลการวเคราะหของหองปฏบตการทเขารวมโครงการ จ�านวน 26 แหง และไดมการจดโปรแกรม

อยางตอเนองในชอ “การทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง” จนถง พ.ศ. 2556 รวม 15 รอบ (rounds) จากตนแบบการจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญอะฟลาทอกซน ตอมาในป



การพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความช�านาญ กนกพร อธสข และคณะ

พ.ศ. 2549 ไดมการขยายขอบขายการใหบรการทดสอบความช�านาญดานเคมอนๆ เรอยมา ไดแก น�าทางเคม โลหะหนกในอาหาร วตถเจอปนในอาหารและเครองดม สารกาเฟอนในเครองดม สารอาหารในนมโค สารเคม

ก�าจดศตรพชในไขมน และในป พ.ศ. 2556 เพมขอบขายการทดสอบความช�านาญดานจลชววทยา ในชวงเรมตนการด�าเนนการจดการตวอยาง ตดตอสมาชก พรอมทงประเมนผลสมาชก ตามวธทก�าหนด

ใน ISO/IUPAC/AOAC INTERNATIONAL Harmonized Protocol 1993 และ ISO/IEC Guide 43-1 ซงเปนแนวทางการพฒนาและการด�าเนนงานทดสอบความช�านาญ และเพอใหลกคาสมาชกมความมนใจในการ ด�าเนนงาน และเปนทยอมรบของหนวยงานรบรองความสามารถหองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 ซงใชผลการเขารวมทดสอบความช�านาญในการประเมน ในป พ.ศ. 2554 ไดปรบปรงพฒนาระบบการด�าเนนงาน

ใหสอดคลองกบ ISO/IEC 17043: 2010 Conformity assessment-General requirements for proficiency testing ซงประกาศใชแทน ISO/IEC Guide 43-1 ตงแตป พ.ศ. 2553 เพอเปนขอก�าหนดให PTP ใชเปนแนวปฏบตและใหหนวยรบรอง PTP ใชในการใหการรบรอง จงไดวางแผนและก�าหนดเปาหมายความส�าเรจ ในการขอรบรอง และด�าเนนการจนไดรบการรบรองจากหนวยรบรองในทสดเมอเดอนกนยายน 2555 การไดรบ

การรบรองแสดงถงความสามารถในการเปนผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญทใหบรการตามมาตรฐานสากล เพอใหหองปฏบตการสมาชกไดรบประโยชน คอ ไดรบบรการทดสอบความช�านาญทถกตองเชอถอได มคณภาพ โปรงใส เปนกลาง ประหยดคาใชจาย มงมนทจะด�ารงไวซงระบบคณภาพ และพฒนาปรบปรงบรการอยางตอเนองเพอ

ความยงยน ความส�าเรจในการพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความช�านาญของ ในชวง พ.ศ. 2554 ถง พ.ศ. 2556 น จะเปนประโยชนตอหนวยงานใหบรการทดสอบความช�านาญในดานอนๆ โดยสามารถน�าไปใชเปนแนวทางในการพฒนาระบบคณภาพ รวมทงเปนการเสรมสรางความเขมแขงของหองปฏบตการภายในประเทศไดในขณะเดยวกน

วธดำาเนนการ1. การวางแผนและกำาหนดเปาหมาย/ตวชวด

มการวางแผนอยางตอเนอง 3 ป คอ พ.ศ. 2554 ถง พ.ศ. 2556 เพอใหการด�าเนนการทดสอบความช�านาญของ สคอ. มการใชระบบคณภาพและไดรบการรบรองตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 ภายในป 2555 จ�านวนอยางนอย 1 แผน และขยายการขอรบรองในปตอมา 2556 เพมอยางนอย 1 แผน

2. การบรหารจดการเพอขอรบรอง2.1 เตรยมความพรอมของบคลากรในระบบคณภาพ จดอบรมใหบคลากรทกระดบ ตงแตผบรหารสงสดของระบบจนถงผปฏบตงาน ไดรบความรเกยวกบมาตรฐาน

ISO/IEC 17043: 2010 และเขาใจบทบาทหนาทในระบบคณภาพ โดยผปฏบตงานทเกยวของกบการเตรยมตวอยาง และประเมนผล จะตองไดรบการอบรมความรเกยวกบสถตทใชในการทดสอบความช�านาญ

2.2 การจดท�าเอกสารคณภาพ ศกษามาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 และจดท�าคมอคณภาพ ขนตอนการปฏบต แบบฟอรมบนทก

ทงดานการบรหารระบบคณภาพและดานวชาการ ครอบคลมทกกจกรรมทเกยวของกบการด�าเนนงาน

3. การดำาเนนการตามระบบคณภาพ ไดแก การแตงตงคณะกรรมการทปรกษาวชาการ (technical advisory committee) การวางแผนงาน (scheme design and planning) การด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญ (scheme operation) การควบคมบนทกและขอมลสมาชก (control of records) การตรวจตดตามคณภาพภายใน (internal audit) และการประชมทบทวนการบรหารงาน (management review)



4. การขอรบรองความสามารถเปนผจดโปรแกรมทดสอบความชำานาญจากสำานกบรหารและรบรองหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ โดยมขนตอนดงน

4.1 ตดตอกบหนวยรบรอง เพอขอทราบเงอนไขขอก�าหนดของการรบรอง4.2 สงเอกสารขอการรบรอง 4.3 รบการตรวจเบองตน (pre-visit) โดยหวหนาผตรวจประเมนและผประสานงาน เพอประเมนสภาพ

ความพรอมและความสอดคลองกบมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 4.4 รบตรวจประเมนจรง (on-site assessment) โดยคณะผตรวจประเมนและผประสานงาน พจารณา

เอกสาร ซกถาม และเฝาดการปฏบต ใชเวลา 2 วนท�าการ คณะผตรวจประเมนประชมพจารณาผลการตรวจประเมน และแจงขอบกพรองและ/หรอขอสงเกตทพบในการประชมปดการตรวจประเมน โดยใหโอกาสผจดโปรแกรมซกถามหรอชแจงเหตผลเพมเตมกรณมขอสงสยหรอมความเหนทแตกตางจนไดขอยตรวมกน ผ ตรวจประเมนและ ผจดโปรแกรมลงนามรบทราบ โดยก�าหนดระยะเวลาใหสงหลกฐานแกไขขอบกพรองและ/หรอขอสงเกตทพบให แลวเสรจภายใน 3 เดอน นบจากวนทตรวจประเมน

4.5 ประสานงานผรบผดชอบสงหลกฐานแกไขขอบกพรองหรอขอสงเกต ภายในเวลาทก�าหนด

5. การรกษาสถานภาพและการพฒนาอยางตอเนอง5.1 รบตรวจประเมนเฝาระวง (surveillance) โดยคณะผตรวจประเมนและผประสานงาน ตามเวลาท

ก�าหนด คอ 1 ปหลงจากการตรวจประเมนจรงครงแรก5.2 พฒนาและสนบสนนผลกดนหนวยงานภายใน สคอ. เพอขยายขอบขายขอรบรองเพมขน

ผลจากการด�าเนนการตามแผนเพอใหบรรลเปาหมายทไดวางไวตอเนอง ในชวง พ.ศ. 2554 ถง 2556 มผล

การด�าเนนการแยกเปนรายป ดงน1. ผลการด�าเนนการ ในชวงตลาคม 2553 ถงกนยายน 2554: 1.1 จากการส�ารวจความพรอม ประกอบดวย บคลากรทมความรความสามารถและมความมงมน

ความพรอมของเครองมออปกรณในการเตรยมตวอยาง หองปฏบตการทมความสามารถในการทดสอบความเปน

เนอเดยวกน ความคงตว และใหคาก�าหนด (assigned value) มหลกฐานการไดรบการรบรองตามมาตรฐาน

ISO/IEC 17025: 2005 จากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ จงก�าหนดเปาหมายและเลอกแผนทดสอบความช�านาญทมความพรอมจ�านวน 2 แผน ไดแก แผนการวเคราะหอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง และแผนการวเคราะห สารเคมก�าจดศตรพชในอาหาร

1.2 ส�ารวจจ�านวนบคลากรทเกยวของกบกจกรรมทดสอบความช�านาญเปาหมาย และสงเขารบ

การอบรมขอก�าหนดตามมาตรฐาน และความรสถตทใชในการด�าเนนงาน ซงจดโดย คณะอนกรรมการสอบเทยบผลระหวางหองปฏบตการของกรมวทยาศาสตรการแพทย จ�านวน 7 คน

1.3 แตงตงบคลากรทเหมาะสมเพอท�าหนาทส�าคญในระบบ ไดแก ผจดการคณภาพ (PT-QM) ผจดการวชาการ (PT-TM) ผประสานแผนฯ (scheme coordinator) ผควบคมเอกสาร (document control officer; DCO) รวมทงแตงตงผ ปฏบตหนาทแทนหรอผชวยในทกต�าแหนง ตาม ISO/IEC 17043: 2010 ขอ 5.1.5




1.4 แตงตงคณะกรรมการทปรกษาวชาการ (technical advisory committee) ประกอบดวยบคคลทมความรเชยวชาญดานเทคนคในการเตรยมตวอยางและสถตทใช มหนาทในการก�าหนดรปแบบและวางแผนการทดสอบความช�านาญ ชบงและแกปญหาทอาจเกดขนจากการเตรยมตวอยาง ใหความคดเหนและเสนอแนะเกยวกบ

ผลของสมาชก และตอบสนองตอผลสะทอนกลบ (feedback) จากสมาชก ตาม ISO/IEC 17043: 2010 ขอ 4.4.1.5 1.5 จดท�าเอกสารคณภาพและอนมตใช ดงน - คมอคณภาพ รหส QM PT 20 Revision No. 00 อนมตใชเมอ 4 กรกฎาคม 2554 - ขนตอนการปฏบตงาน ขอก�าหนดดานบรหาร จ�านวน 11 เรอง ไดแก การรกษาความเปนกลาง

และปองกนผลประโยชนทบซอน การควบคมเอกสาร การทบทวนค�ารอง ขอเสนอและขอสญญา การจดการขอรองเรยนและขออทธรณ การควบคมงานทไมเปนไปตามขอก�าหนด การปฏบตการแกไข การปฏบตการปองกน การจดการขอมลการทดสอบความช�านาญโดยระบบอเลกทรอนกส การควบคมบนทก การตรวจตดตามคณภาพภายใน และการทบทวนการบรหาร

- ขนตอนการปฏบตงาน ขอก�าหนดดานวชาการ จ�านวน 12 เรอง ไดแก การวางแผน การทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตว สถตทใชในการทดสอบความช�านาญ การแบงบรรจและการแจกจายตวอยาง การรายงานผลการทดสอบความช�านาญ และการรกษาความลบสมาชก

- แบบบนทกกจกรรมตามขอก�าหนดดานบรหาร ไดแก Master list เอกสารคณภาพในระบบ การแจกจายเอกสาร บนทกทบทวนเอกสารคณภาพประจ�าป บนทกการทบทวนค�ารอง ขอเสนอและขอสญญา บนทกการจดการขอรองเรยน บนทก Compliant log บนทกการควบคมงานทไมเปนไปตามขอก�าหนด บนทก Nonconforming work log บนทกการแกไขขอบกพรอง บนทก Corrective action request log บนทก

การปฏบตการปองกน บนทก Preventive action request log บนทกการส�ารองขอมลหรอไฟลทจดเกบดวยคอมพวเตอร บนทกแผนการตรวจตดตามคณภาพภายใน บนทก Audit checklist และบนทกขอบกพรอง/ขอสงเกตจาก internal audit

- แบบบนทกกจกรรมตามขอก�าหนดดานวชาการ ไดแก บนทกการเตรยมตวอยาง บนทก

การทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตว บนทกการทวนสอบโปรแกรมส�าเรจรปในการทดสอบความเปน

เนอเดยวกน แบบใบสมครเขารวมทดสอบความช�านาญ แบบตอบรบตวอยาง บนทกขอมลผลวเคราะหของสมาชก

แบบเสนอความคดเหนของคณะกรรมการทปรกษาวชาการ และแบบรายงานผลการทดสอบความช�านาญ 1.6 สมมนาสมาชก จ�านวน 100 คน ในวนท 26 กรกฎาคม 2554 โดยมวทยากรบรรยายความร

เรอง การประกนคณภาพผลการทดสอบของหองปฏบตการ และการรบฟงความคดเหนและผลสะทอนกลบจากสมาชก เพอน�าขอมลเขาประชมทบทวนบรหารตอไป

1.7 ไดรบการตรวจตดตามคณภาพภายใน ด�าเนนการโดยคณะอนกรรมการสอบเทยบผลระหวาง หองปฏบตการของกรมวทยาศาสตรการแพทย เมอวนท 8 กนยายน 2554 คณะผตรวจตดตาม พบขอบกพรอง ดานบรหาร 3 ขอ ดานวชาการ พบขอบกพรอง 3 ขอ และขอสงเกต 1 ขอ ด�าเนนการแกไขแลวเสรจเมอ 10 ตลาคม 2554

1.8 ประชมทบทวนบรหารระบบคณภาพ ในวนท 16 กนยายน 2554 โดยผจดการคณภาพเปน

ผรบผดชอบการจดการประชม ผบรหารสงสดของระบบคณภาพเปนประธานการประชม มวาระการประชมครอบคลม การพจารณาความเหมาะสมของนโยบายและขนตอนการปฏบตงาน การทบทวนรายงานจากการบรหาร ผลของ การตรวจตดตามคณภาพภายในทผานมา การปฏบตการแกไขและปองกน ผลการตรวจประเมนจากหนวยรบรอง (เนองจากยงไมไดรบการตรวจประเมน จงไมมการพจารณาวาระน) การเปลยนแปลงปรมาณงาน ผลสะทอนกลบจากสมาชก ขอรองเรยน หรออทธรณ ขอเสนอแนะในการปรบปรง และปจจยทเกยวของอนๆ



2. ผลการด�าเนนการ ในชวงตลาคม 2554 ถงกนยายน 2555: 2.1 วางแผนการขอรบรองความสามารถผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญ จากกรมวทยาศาสตรบรการ

โดยก�าหนดตวชวด คอ จ�านวนแผนทไดรบการรบรองอยางนอย 1 แผน ภายในเดอนกนยายน 2555 ก�าหนดผรบ

ผดชอบและผก�ากบตดตาม ด�าเนนการตามแผนทวางไวและแกปญหาทอาจเกดขน โดยมกจกรรมส�าคญ ดงน 2.1.1 ประชมวางแผนโดยคณะกรรมการทปรกษาวชาการ ตาม ISO/IEC 17043: 2010

ขอ 4.4.1.3 และจดท�าเอกสารรายละเอยดแผนจากมตทประชม ในวนท 11 ตลาคม 2554 2.1.2 ฝกอบรมบคลากรทเกยวของ หลกสตร ขอก�าหนด ISO/IEC 17043: 2010 และสถต

ทใช ตามมาตรฐาน ISO 13528: 2005 ไดแก อบรมภายนอก จดโดยกรมวทยาศาสตรบรการ 1 ครง 2 วน มผเขาอบรม จ�านวน 2 คน และอบรมภายใน 1 ครง 2 วน มผเขาอบรม จ�านวน 20 คน

2.2 ตรวจตดตามคณภาพภายใน ขอก�าหนดดานวชาการ รวมทงการเฝาดการเตรยม แบงบรรจและแจกจายตวอยาง เมอวนท 12 เมษายน 2555 พบขอบกพรอง 4 ขอ แกไขแลวเสรจเมอ 24 พฤษภาคม 2555 ขอก�าหนดดานบรหาร ตรวจตดตามเมอวนท 30 กรกฎาคม 2555 พบขอบกพรอง 2 ขอ แกไขแลวเสรจเมอ 11 กนยายน 2555

2.3 ประชมทบทวนบรหาร เมอวนท 20 มนาคม 2555 2.4 ยนขอรบรอง มกระบวนการ ดงน ศกษากฎระเบยบและเงอนไขการขอการรบรองผจดโปรแกรม

ทดสอบความช�านาญหองปฏบตการ (LA-R-06)(4) กรอกเอกสารประกอบค�าขอรบรองฯ (LA-F-202) และยนใหหนวยรบรอง พรอมทงจดสงเอกสาร ไดแก คมอคณภาพ ขนตอนการด�าเนนงาน และรายงานฉบบสมบรณฉบบ

ลาสด ในเดอนมกราคม 2555 โดยหนวยรบรองไดเขามาตรวจประเมนเบองตน (pre-visit) ในวนท 20 กมภาพนธ 2555 โดยพบระบบบรหารและเอกสารทยงไมเปนไปตามขอก�าหนดจ�านวน 8 ขอ และรายงานผลการตรวจเบองตนวา หนวยงานมความพรอมทจะไดรบการตรวจประเมน หากปรบปรงและแกไขขอบกพรองแลวเสรจภายในเวลา 30 วน

ซงผจดการคณภาพและผประสานแผนฯ ไดแกไขปรบปรงตามทไดรบแจงและสงเอกสารหลกฐานภายในเวลาทก�าหนด หลงจากนน วนท 13-14 และ 18 มถนายน 2555 หนวยรบรองไดเขาตรวจประเมนจรง (on-site) พบขอบกพรองจ�านวน 7 ขอ เปนดานบรหาร 1 ขอ และดานวชาการ 6 ขอ คอ ขอบกพรองทไมเปนไปตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 ขอ 5.1 องคกร ขอ 4.4 การออกแบบ ขอ 4.7 การวเคราะหขอมลและการประเมนผล และขอ 4.8 รายงาน และพบขอสงเกตจ�านวน 5 ขอ ผจดการคณภาพและผประสานแผนฯ แกไขขอบกพรองและสงเอกสาร หลกฐานเมอวนท 7 สงหาคม 2555 และหนวยรบรองพจารณาใหการรบรอง ตามใบรบรองความสามารถผจดโปรแกรมการทดสอบความช�านาญหองปฏบตการ หมายเลขรบรองระบบงานท ทดสอบความช�านาญ-0004 วนท 18 กนยายน 2555 จ�านวน 2 แผน คอ แผนฯ อะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง ด�าเนนการ 1 รอบตอป และแผนฯ สารเคมก�าจดศตรพชในไขมนสตว ด�าเนนการ 1 รอบตอ 18 เดอน

3. ผลการด�าเนนการ ในชวงตลาคม 2555 ถงกนยายน 2556: 3.1 วางแผนการขอขยายการรบรองความสามารถผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญเพมเตม

โดยก�าหนดตวชวด คอ จ�านวนแผนทไดรบการรบรองเพมขนอยางนอย 5 แผน ภายในเดอนกนยายน 2556 จากประสบการณการไดรบการรบรองในป 2555 จงก�าหนดเปาหมาย และเลอกแผนทดสอบความช�านาญทมความพรอม ไดแก แผนฯ การวเคราะหน�าทางเคม แผนฯ การวเคราะหโลหะในน�า แผนฯ การวเคราะหวตถกนเสยในอาหาร แผนฯ การวเคราะหสสงเคราะหในอาหาร และแผนฯ การวเคราะหกาเฟอนในเครองดม พรอมนตองด�ารงรกษาสถานภาพการไดรบรองการรบรองเดม โดยมกจกรรมส�าคญ ดงน

3.1.1 ประชมวางแผนโดยคณะกรรมการทปรกษาวชาการ ในวนท 9 ตลาคม 2555 และจดท�าเอกสารรายละเอยดแผนจากมตทประชม




3.1.2 ฝกอบรมบคลากรทเกยวของ หลกสตร ขอก�าหนด ISO/IEC 17043: 2010 และสถตทใช ตามมาตรฐาน ISO 13528: 2005 โดยอบรมภายใน 2 ครง 4 วน มผเขาอบรม จ�านวน 25 คน

3.2 ส�ารวจความพงพอใจผใชบรการ โดยการสงแบบส�ารวจความพงพอใจ จ�านวน 90 ชด ทางไปรษณย ในชวงเดอนธนวาคม 2555 ไดรบการตอบกลบมา 49 ชดคดเปนรอยละ 54 น�าผลการส�ารวจเขาประชมทบทวนบรหาร

3.3 ตรวจตดตามคณภาพภายในขอก�าหนดดานวชาการ รวมทงการเฝาดการเตรยมแบงบรรจและแจกจายตวอยาง จ�านวน 6 แผน ยกเวน แผนฯ สารเคมก�าจดศตรพชในไขมนสตว ซงไมมการเตรยมตวอยางในปน คอ

- แผนฯ วตถเจอปน (กรดเบนโซอกและกรมซอรบก) ในอาหาร ตรวจวนท 28 มกราคม 2556 - แผนฯ กาเฟอนในเครองดม ตรวจวนท 26 กมภาพนธ 2556 - แผนฯ อะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง ตรวจวนท 24 เมษายน 2556 - แผนฯ สสงเคราะหในอาหาร ตรวจวนท 21 พฤษภาคม 2556 - แผนฯ น�าเคม ตรวจวนท 6 มถนายน 2556 - แผนฯ โลหะในน�า ตรวจวนท 26 กรกฎาคม 2556 พบขอบกพรอง 2 ขอ แกไขแลวเสรจภายในเวลาทก�าหนด (30 วน) สวนขอก�าหนดดานบรหาร ตรวจตดตามเมอวนท 21 มถนายน 2556 พบขอบกพรอง 3 ขอ

แกไขแลวเสรจภายในเวลาทก�าหนด 3.4 ประชมทบทวนบรหาร เมอวนท 18 มนาคม 2556 3.5 ยนขอรบรอง กรอกเอกสารประกอบค�าขอรบรองฯ และจดสงเอกสารทก�าหนด ในชวงเดอนมนาคม

2556 ทงนเพอเฝาระวงขอบขายทไดรบการรบรองแลวจ�านวน 2 แผน และเพอขยายขอบขาย จ�านวน 5 แผนหนวยรบรอง ตรวจประเมนวนท 2-3 กรกฎาคม 2556 พบขอบกพรองดานบรหาร 4 ขอ และดานวชาการ 5 ขอ คอ ขอบกพรองทไมเปนไปตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 คอ ขอ 5.1 องคกร (2 ขอ) ขอ 5.3 การควบคมเอกสาร ขอ 5.14 การตรวจตดตามคณภาพภายใน ขอ 4.4 การออกแบบ ขอ 4.6 การด�าเนนการ (2 ขอ) และ ขอ 4.8 รายงาน พบขอสงเกต 4 ขอ ผจดการคณภาพและผประสานแผนฯ แกไขขอบกพรองและสงเอกสาร หลกฐานวนท 5 สงหาคม 2556 และหนวยรบรองพจารณาใหการรบรองวนท 19 กนยายน 2556 เพมขนอก 5 แผน รวมไดรบรอง 7 แผน ในการใหบรการ รวมมหองปฏบตการสมาชกทงภาครฐและเอกชน รวมมากกวา 100 แหง โดยจ�านวนสมาชกของแตละแผนฯ แตกตางกน (ตารางท 1)

18 กนยายน 2555 1. การวเคราะหสารเคมก�าจดศตรพชออรกาโนคลอรนในไขมนสตว 16 17 -* 2. การวเคราะหอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง 41 43 40

19 กนยายน 2556 3. การวเคราะหน�าทางเคม (สารทงหมด ความกระดางทงหมด คลอไรด 78 80 83 ฟลออไรดไนเตรท และซลเฟต) 4. การวเคราะหโลหะในน�า (สารหน แคดเมยม เหลก แมงกานส ตะกว 44 49 45 และทองแดง) 5. การวเคราะหกาเฟอนในเครองดม 19 21 28 6. การวเคราะหวตถเจอปนในเครองดม (สอนทรยสงเคราะห) 25 24 25 7. การวเคราะหวตถเจอปนในอาหารเหลวและกงเหลว (กรดเบนโซอก 28 33 33 และกรดซอรบก)

* ไมมการด�าเนนการในป 2556

ตารางท 1 ชอแผนทดสอบความช�านาญ วนทไดรบการรบรอง และจ�านวนหองปฏบตการสมาชก

วนทไดรบรอง แผนทดสอบความช�านาญ จ�านวนสมาชก (หองปฏบตการ)

2554 2555 2556



วจารณบทบาทหนาทของส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร กรมวทยาศาสตรการแพทย ในฐานะหองปฏบตการ

วเคราะหวจยเพอใชขอมลในการควบคมคณภาพอาหารตามพระราชบญญตอาหาร พ.ศ. 2522 มบคลากรทมความรความสามารถ มการสงสมประสบการณในการวเคราะหอาหาร ไดรบการยอมรบจากตางประเทศ เชน ไดรบมอบหมายจากสถาบนมาตรวทยาแหงชาตใหท�าหนาทการวดแทนหรอทเรยกวา Designated Institute ดานการตรวจวเคราะหสารพษตกคางในอาหาร ในป พ.ศ. 2553 และไดรบแตงตงเปน ASEAN Food Reference Laboratory (AFRL) ดานโลหะหนกในอาหาร และไดรบการรบรองความสามารถหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005 มาตงแตป 2550 จนถงป 2556 ไดรบการรบรองแลวถงจ�านวน 224 รายการ(8) ซงความสามารถทไดมการน�ามาใช ในการใหบรการทดสอบความช�านาญฯ อาหารและน�าทงดานเคมและดานจลชววทยา โดยในป พ.ศ. 2556 มการใหบรการจ�านวน 10 แผน มหองปฏบตการทเปนสมาชกจ�านวนมากกวา 200 แหงทงในประเทศและประเทศเพอนบาน

ในภมภาคอาเซยน หองปฏบตการสมาชกจะไดประโยชนจากการเขารวมทดสอบความช�านาญอยางสม�าเสมอ คอ ม หลกฐานการควบคมคณภาพจากภายนอก (independent evidence) แสดงความใชไดของวธวเคราะหทหองปฏบตการใชเปนประจ�า และเปนเครองมอ (tool) ในการพฒนาความสามารถหองปฏบตการหากพบวาผลการประเมน

ไมนาพอใจ และในบางโปรแกรมทคา assigned value เปนคาอางองรบรอง ยงสามารถใชเปนเครองมอในการพฒนาความถกตอง (accuracy) และความสอบกลบไดของการวด (traceability of measurement) อกดวย ในดานเศรษฐกจ การเขารวมทดสอบความช�านาญกบกรมวทยาศาสตรการแพทย เออประโยชนในการลดคาใชจายจาก การเขารวมทดสอบความช�านาญกบตางประเทศ ดงจะเหนไดจากการเขารวมแผนฯ อะฟลาทอกซนกบโปรแกรม FAPAS® ราคามากกวา 20,000 บาท ในขณะทคาใชจายในการเขารวมทดสอบกบกรมวทยาศาสตรการแพทย ราคา 2,000 บาท สามารถประหยดไดถง 1 ใน 10 โดยไดรบบรการทเทาเทยมกนในดานคณภาพของการด�าเนนการและค�าแนะน�าทางวชาการ ดงนน สมาชกทมมากกวา 200 หองปฏบตการจงสามารถประหยดเงนตราทเปนคาใชจาย ในการเขารวมทดสอบความช�านาญกบตางประเทศไดอยางมาก

มาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 เปนมาตรฐานนานาชาตทมขอก�าหนดทวไปเพอแสดงความสามารถ

ของผด�าเนนการทดสอบความช�านาญและส�าหรบการรบรอง เนองจากขอก�าหนดดานบรหารสอดคลองกบ ISO/IEC 17025: 2005 เมอ สคอ. ซงเปนหองปฏบตการทมการใหบรการทดสอบทใชระบบคณภาพ ISO/IEC 17025 และ ไดรบการรบรอง ตงแต พ.ศ. 2550 มความมงหมายในการขอการรบรองระบบคณภาพทดสอบความช�านาญ จงมปจจยสนบสนนใหสามารถวางแผนและก�าหนดเปาหมายการพฒนาได โดย สคอ. ม เอกสารคณภาพและขนตอน

การปฏบตงานของระบบ ISO/IEC 17025 เมอน�ามาศกษา พบวา ในบางขอก�าหนดสามารถใชเอกสารขนตอน

การปฏบตงานรวมกนได เชน การพฒนาบคลากร การจดซอวสดและบรการ สวนขอก�าหนดอนทไมครอบคลมการด�าเนนการทดสอบความช�านาญ ตองจดท�าเพมเตมใหสอดคลองกบมาตรฐานและเงอนไขของหนวยรบรอง เนองจาก สคอ. เปนหนวยงานขนาดใหญ มขาราชการและพนกงานรวมประมาณ 200 คน มหองปฏบตการถง 11 หอง เพอใหบรรลเปาหมายการบรหารและน�าระบบคณภาพ ISO/IEC 17043 มาใช จงจ�าเปนตองแตงตงผจดการคณภาพ และทมงานผจดการวชาการ ของกจกรรมทดสอบความช�านาญขนแยกจากระบบคณภาพ ISO/IEC 17025 ผจดการคณภาพม หนาทในการผลกดนใหมการใชระบบคณภาพและตดตามเฝาระวง ตรวจสอบตลอดเวลาและรบผดชอบในการจดท�า ทบทวน แกไข เอกสารคณภาพ ด�าเนนการตรวจตดตามคณภาพภายในอยางมประสทธภาพ จดใหมการประชมทบทวนบรหาร และประสานงานกบหนวยรบรอง รวมทงการแกไขขอบกพรองทไดรบ ในสวนการใหบรการผจดการคณภาพรบผดชอบในการรบขอรองเรยนเพอปรบปรงบรการ ด�าเนนการส�ารวจความพงพอใจหรอประชมรวมกบสมาชก นอกจากนน ยงเปนผทบทวนและอนมตรายงานการประเมนผลสมาชก ผจดการคณภาพและทมงานวชาการจงจ�าเปนตองเปนผมความรในขอก�าหนดสามารถตความขอก�าหนดมาสการปฏบตและประยกตใชใหเหมาะสมกบหนวยงาน

และมความรและประสบการณดานเทคนคการวเคราะหและสถต




นอกเหนอจากการด�าเนนงานดานบรหารจดการตามขอก�าหนดแลว ขอก�าหนดดานวชาการ ขอ 4.1 ไดใหความส�าคญกบความสามารถ (competence) ของ PTP และม Note วา ISO/IEC 17025 สามารถใชแสดงถง ความสามารถของหองปฏบตการทท�าหนาททดสอบ PT items ได เนองจากหนวยงานมนโยบายไมจางเหมาชวงแก Sub-contractor ในกจกรรมใดๆ ซงใน ISO/IEC 17043: 2010 ขอ 5.5.1 ก�าหนดวาตองไมจางเหมาชวง 3 กจกรรม คอ การวางแผน การประเมนผล และการอนมตรายงาน จงด�าเนนการทกกจกรรม ในการก�าหนดเปาหมายการ ขอรบรองในแตละป จงเลอก scheme ทรายการทดสอบทใชในการประเมนความเปนเนอเดยวกนและความคงตวไดรบการรบรอง ISO/IEC 17025 แลว

ขอก�าหนดดานวชาการ ขอ 4.4 การออกแบบ PT scheme ระบถงการจดท�าเอกสารการวางแผนด�าเนนงาน PT scheme (ขอ 4.4.1) โดยใชหลกฐานรายงานการประชมคณะกรรมการทปรกษาวชาการ ซงระบรายละเอยดหวขอการประชมครบถวนตามทก�าหนดไวภายใตขอ 4.4.1.3 a) ถง u) ในสวนขอก�าหนดทระบถงการเตรยม PT items ในแตละ PT scheme ไดจดท�าเอกสารขนตอนการเตรยม การทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตว และวธทางสถตทเหมาะสมมาประเมน โดยใชวธและเกณฑทก�าหนดใน ISO 13528: 2005 หรอ IUPAC 2006(11) ความเปนเนอเดยวกนจะถกทดสอบและประเมนผลหลงจากแบงบรรจและกอนสงใหสมาชกทกโปรแกรม ซงผลตองผานเกณฑยอมรบจงจะจดสงใหสมาชก และความคงตวจะถกทดสอบในสภาวะตางๆ ตามความเหมาะสม เชน ทดสอบสภาวะสง โดยทดสอบหลงน�ามาตงทงไวทอณหภมภายนอกหองปฏบตการ 3 วน หรอทดสอบตวอยาง หลงจากเกบในอณหภมต�ากวา -15 �C จนถงสปดาหสดทายของเวลาทก�าหนด เปนตน ดงนนจงยนยนความมนใจกบสมาชกวา PT items ทไดรบมคณสมบตเหมาะสมมความเปนเนอเดยวกนและคงตวเพยงพอในชวงเวลาทก�าหนดใหสมาชกสงผล หากมผลของการประเมนไมเปนไปตามเกณฑทก�าหนด กจะมขนตอนการปฏบตโดยตองใหขอมลแกสมาชกในรายงานฉบบสมบรณ และตองน�าความไมคงตวมาประมาณคา Measurement uncertainty ของคา assigned value

คา assigned value เปนคาทถกน�ามาใชในการเปรยบเทยบกบผลของสมาชก เพอประเมนสมาชกนน

ในโปรแกรมทไดรบการรบรอง สวนใหญใชคา Robust average โดยใชสถต Algorithm A ตาม ISO 13528: 2005 ซงมความเหมาะสมเนองจากจ�านวนสมาชกคอนขางมาก คอ มากกวา 30 แหง ยกเวนโปรแกรมทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหสารเคมก�าจดศตรพชออรกาโนคลอรนในไขมน(12) ใชคาอางองรบรอง (Certified reference value) จากการวเคราะหโดยวธ Isotope Dilution Mass Spectrometry (IDMS) ซงเปนวธวเคราะหขนสง ทางมาตรวทยา คา assigned value ถอเปนคาจรง (true value) มคาความไมแนนอนนอยซงหมายถงมสายโซ ของการสอบกลบไดทสนเขาใกล SI Unit และในโปรแกรมนยงรองขอใหสมาชกรายงานคาความไมแนนอนของคาทรายงานมาดวย เพอเปรยบเทยบกบคาอางองโดยใช En-score ซงสามารถชบงความสมเหตสมผลของแหลง ความไมแนนอนทสมาชกน�ามาประเมนได

การเฝาระวง (monitor) ระบบคณภาพทใช โดยการตรวจตดตามภายในอยางมประสทธภาพ ด�าเนนการโดยบคลากรทเปนอสระจากกจกรรมนนๆ และไดรบการฝกอบรม ในขอก�าหนดขอ 5.14.1 ก�าหนดวาตองตรวจตดตามครอบคลมทกขอก�าหนด รวมทงการเตรยม การจดเกบและการแจกจายตวอยาง PT items รวมทงกระบวนการรายงาน ดงนนการวางแผนตรวจตดตามจงตองสอดคลองกบชวงเวลาการเตรยมตวอยางของแตละแผน จากการตรวจตดตามภายในชวงป 2554 ถง 2556 ผลพบขอบกพรองดานบรหารรวม 9 ขอ และดานวชาการรวม 9 ขอ สงทพบคอ ความไมเปนปจจบนของค�าสงตางๆ โครงสรางองคกร ขนตอนการปฏบตงาน หรอ Standard Operation Procedure (SOP) ไมครบถวนไมเปนปจจบน จงหาสาเหตทแทจรงและปองกนการเกดซ�า โดยก�าหนดแผนการทบทวนปรบปรงค�าสงตางๆ ในเดอนตลาคม เพอใหสอดคลองกบวาระการปรบเปลยนบคลากรของราชการ และก�าหนดแผนทบทวนเอกสารคมอ/ขนตอนในเดอนกรกฎาคมของทกป การตรวจตดตามคณภาพภายในก�าหนดใหด�าเนนการอยางนอย

1 ครงตอป แตหากมปญหาหรอขอรองเรยน จ�าเปนตองมการตรวจตดตามเพมเตม



การรบรองความสามารถ (accredit) การทดสอบความช�านาญ ด�าเนนการโดยหนวยรบรอง (accreditation body) ในประเทศไทยหนวยรบรองผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญคอ กรมวทยาศาสตรบรการ ซงไดลงนาม

ขอตกลงวาดวยการยอมรบรวม (Mutual Recognition Arrangement, MRA) กบ Asia Pacific Laboratory Accreditation Cooperation, (APLAC) และ International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) เมอ พ.ศ. 2549(12) มขอก�าหนดเพมเตมจากมาตรฐาน ISO/IEC 17043 คอ ก�าหนดใหมการตรวจตดตามคณภาพภายในทกกจกรรมใหครบถวนภายใน 1 ป มการทบทวนระบบบรหารงานคณภาพอยางนอยปละ 1 ครง และมการเกบรกษาบนทกระบบคณภาพไมนอยกวา 3 ป 6 เดอน(7) ในการรบรองคณะผตรวจประเมน ประกอบดวย

ผตรวจประเมนระบบ และผตรวจประเมนวชาการทมความรดานสถต ตรวจประเมนหองปฏบตการ ในป พ.ศ. 2555 และ 2556 โดยไดพบขอบกพรอง และขอสงเกต ท�าใหมโอกาสในการปรบปรงระบบการด�าเนนการทส�าคญ คอ

สถตใชในการทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตวของตวอยาง PT items ท�าใหบคลากรไดน�ามาตรฐาน ISO 13528: 2005 และ IUPAC 2006 มาศกษาและปรบใชใหเหมาะสมกบสภาพตวอยางอาหารทมสารปนเปอน

ปรมาณนอย เชน อะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสงทใชตวอยางทปนเปอนตามธรรมชาตน�ามาผสมกบตวอยางทไมมการปนเปอนใหไดปรมาณระดบทตองการ และไดจดท�าเอกสาร SOP สถตทใชในการทดสอบความช�านาญ ระบวธการทางสถตอยางละเอยดพรอมตวอยางการค�านวณในทกขนตอน ไดแก การทดสอบความเปนเนอเดยวกน โดยทดสอบความแตกตางภายในตวอยาง (within sample variation) ทดสอบความแตกตางระหวางตวอยาง (between sample variation) การทดสอบความคงตว การหาคาก�าหนด การค�านวณคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญ (σPT) และการค�านวณ performance statistics และไดจดการฝกอบรมภายในใหผประสานแผนฯ ไดเขาใจและสามารถปฏบตไดอยางถกตอง

ปจจยทเออตอการพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความช�านาญจนประสบผลส�าเรจ คอ วสยทศนของ ผบรหารและนกวชาการระดบสงของกรมฯ ในการน�าระบบคณภาพมาใชตงแตกอน พ.ศ. 2540 พรอมทงสงเสรมสนบสนนการพฒนาบคลากร ในสวนของส�านกฯ บคลากรทเกยวของทกระดบ มสวนส�าคญตอความส�าเรจ โดยเฉพาะผอ�านวยการ ทงในอดตและปจจบน ซงเปนผบรหารสงสดของระบบ ทกคนลวนไดใหความส�าคญ ตระหนกถงบทบาทหนาทของตนในระบบคณภาพ มการวางเปาหมายอยางชดเจน และมงมนในการด�าเนนการสเปาหมายทตงไว การใชกระบวนการสอสารอยางเหมาะสมภายในทมงาน การพดคยปรกษาหารออยางไมเปนทางการ และการประชมตามวาระทก�าหนด ความสามคครวมแรงรวมใจ เปนสวนส�าคญอกสวนหนงทท�าใหเกดการพฒนาปรบปรงอยางตอเนองและยงยน ในปงบประมาณ 2557 จงวางเปาหมายขยายขอบขายการใหบรการการทดสอบความช�านาญการวเคราะหอาหาร ทางจลชววทยาและขอรบรองเพมขน อยางไรกตามพบวายงมปญหาและอปสรรคบาง ไดแก ภาระและปรมาณงาน

ทเพมขนจากแผนงานทวางไว ในกรณการเกดเหตภยพบตธรรมชาต น�าทวม การเกดปญหาสารพษสารปนเปอน

ในอาหารฉบพลนซงมผลกระทบตอผบรโภคในประเทศ ซง สคอ.ตองมสวนในการแกไขและบรรเทาปญหาอยางเรงดวน นอกจากนนงบประมาณของหนวยงานทมจ�ากดเปนอปสรรคส�าคญในการพฒนาระบบสารสนเทศททนสมย

สรปส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร ไดด�าเนนการพฒนาระบบคณภาพการทดสอบความช�านาญการ

ตรวจวเคราะหอาหารเพอใหสอดคลองกบมาตรฐานสากล ISO/IEC 17034: 2010 ในชวง พ.ศ. 2554 ถง 2556 โดยการวางแผน ก�าหนดเปาหมาย ด�าเนนการใชระบบคณภาพ ตรวจตดตามคณภาพภายใน ขอรบรองความสามารถ

ผจดโปรแกรมกบกรมวทยาศาสตรบรการ และไดรบการรบรองใน พ.ศ. 2555 จ�านวน 2 แผน และมการพฒนา อยางตอเนองจนไดรบการรบรองใน พ.ศ. 2556 เพมขนจ�านวน 5 แผน รวม 7 แผน ท�าใหมหลกประกนไดวาสมาชก




จะไดรบบรการทมคณภาพจากผจดทมความรและประสบการณในการวเคราะหอาหารและน�า ไดรบตวอยางทมความเปนเนอเดยวกนและความคงตวทยอมรบได มการรกษาความลบสมาชก ไดรบรายงานทประเมนผลโดยวธทางสถต ทเหมาะสมและมค�าแนะน�าทางวชาการทด ซงเปนการเสรมสรางคณภาพของหองปฏบตการดานอาหารและแสดงถง การพงพาตนเองไดอยางยงยน

เอกสารอางอง 1. กฎกระทรวงแบงสวนราชการกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข พ.ศ. 2552 ราชกจจานเบกษา เลม 126 ตอนท 98 ก

(ลงวนท 28 ธนวาคม 2552). 2. ISO/IEC 17025: 2005. General requirements for the competence of testing and calibration

laboratories. 2nd ed. Geneva, Switzerland: ISO; 2005. 3. กนกพร อธสข, อมรา วงศพทธพทกษ. การสอบเทยบผลวเคราะหอะฟลาทอกซน ในตวอยางขาวโพด ถวลสง และ นม.

ว กรมวทย พ 2543; 42(1): 10-9. 4. Thompson M, Wood R. The international harmonized protocol for the proficiency testing of

(chemical) analytical laboratories. J AOAC Int 1993; 76(4): 926-940. 5. ISO/IEC Guide 43-1: 1997. Proficiency testing by interlaboratory comparisons --Part 1: Develop-

ment and operation of proficiency testing schemes. Geneva, Switzerland: ISO; 1997. 6. ISO/IEC Guide 43-2: 1997. Proficiency testing by interlaboratory comparisons -- Part 2: Selection

and use of proficiency testing schemes by laboratory accreditation bodies. Geneva, Switzerland: ISO; 1997.

7. ISO/IEC 17043: 2010. Conformity assessment -- General requirements for proficiency testing. Geneva, Switzerland: ISO; 2010.

8. ส�านกบรหารและรบรองหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ. ขอก�าหนด กฎระเบยบ และเงอนไขการรบรองความสามารถ

ผจดโปรแกรมการทดสอบความช�านาญหองปฏบตการ (LA-R-06). กรงเทพฯ : กรมวทยาศาสตรบรการ; 2555. 9. สนตกจ นลอดมศกด, ปราณ นาคประสทธ, มงคล เจนจตตกล. การพฒนาระบบคณภาพหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC

17025: 2005 ของส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร. ว กรมวทย พ 2556; 55(2): 63-77. 10. ISO 13528: 2005. Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons.

Geneva, Switzerland: ISO; 2005. 11. Thompson M, Ellison SLR, Wood R. The international harmonized protocol for the proficiency

testing of analytical chemistry laboratories (IUPAC technical report). Pure Appl Chem 2006; 78(1): 145-96.

12. วชาดา จงมวาสนา, รตยากร ศรโคตร, กนกพร อธสข. การประเมนความสามารถหองปฏบตการตรวจวเคราะหสารเคมก�าจด

ศตรพชกลมออรกาโนคลอรนในไขมน. ว กรมวทย พ 2554; 53(2): 113-30. 13. ส�านกบรหารและรบรองหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ. [ออนไลน]. 2558; [สบคน 1 มกราคม 2558]; [1 หนา].

เขาถงไดจาก : URL: http://www.dss.go.th/index.php/2012-06-24-18-31-45/2012-06-25-07-43-32.html



Development of Proficiency TestingQuality System on Food and Water Analysis

(2011-2013)

Kanokporn Atisook Jitpaka Suntudrob and Wischada JongmevasanaBureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences, Tiwanond Road, Nonthaburi 11000, Thailand.

ABSTRACT Proficiency testing (PT) on food and water analysis is a major component in quality assurance of food testing laboratories. It provides external independent evidence of the validity and comparability of measurement result based on the interlaboratory comparison approach. It can ensure that laboratory’s customer can use the analysis results for control, improvement, importing or export-ing their food products. There is not many domestic proficiency testing providers in Thailand at present and their services are in limited test. Testing laboratories are necessary to participate in PT programs from foreign countries and their costs are high. Bureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences has developed and managed its quality system to comply with ISO/IEC 17043: 2010 requirements and has been accredited by Department of Sciences Services since September 2012. The process of quality system development concludes planning and setup target achievement, preparing and request for accreditation, maintaining accreditation status and continuous improvement. ISO/IEC 17043 accreditation can show that accredited PT provider is competence to operate PT schemes on a consistent basis. The advantages of PT provider accreditation also include confidentiality of laboratory participants to get accurate and qualified services and reduction of cost compare to foreign PT. Result of PT participation from accredited PT provider therefore can be objective evidence of competent laboratory for ISO/IEC 17025: 2005 accreditation. The achievement of quality system development from 2011 to 2013 can be used as guidance for other PT providers.

Key words: Proficiency testing, Food and water analysis, ISO/IEC 17043: 2010, accreditation




การพฒนาและทดสอบความถกตองของวธวเคราะห

ไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทในอาหารโดย LC-MS/MS

ทองสข ปายะนนทน และลดดา แกวกลาปญญาเจรญ ส�ำนกคณภำพและควำมปลอดภยอำหำร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 10 February 2015

บทคดยอ ไดพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในอาหาร จ�านวน 4 ชนด ซงเปน

อนพนธของยาฆาเชอแบคทเรยทมการใชในการรกษาโรคตดเชอในสตว คอ furazolidone, furaltadone, nitrofurantoin

และ nitrofurazone โดยสารกลมนจะถกยอยสลายอยางรวดเรว และตกคางในเนอสตวในรปอนพนธ (metabolites) ไดแก 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolodinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) และ semicarbazide (SEM) ซงกลมสหภาพยโรป (EU) ประกาศหามใชสารกลมน เนองจาก

แนวโนมเปนสารกอมะเรง การตรวจวเคราะหปรมาณสารตกคางไดถกพฒนาโดยวธ LC-MS/MS โดยการยอยตวอยางดวยกรด hydrochloric เจอจาง เพอใหสารตกคางหลดออกจากสวนทจบอยกบโปรตนในตวอยาง พรอมทงท�าปฏกรยา derivatization แลวท�าการสกดดวย ethyl acetate หลงจากนนดงไขมนออกดวย hexane ตรวจวเคราะหชนดและปรมาณดวยเครอง LC-MS/MS วธดงกลาวมขดจ�ากดของการตรวจพบ (limit of detection, LOD) ของ AOZ และ AMOZ เทากบ 0.1 ไมโครกรมตอกโลกรม AHD และ SEM เทากบ 0.5 ไมโครกรมตอกโลกรม คาขดจ�ากดของการวดเชงปรมาณ (limit of quantitation, LOQ) ของ AOZ และ AMOZ เทากบ 0.3 ไมโครกรมตอกโลกรม AHD และ SEM เทากบ 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ชวงการวเคราะหทใหความสมพนธ เปนเสนตรง (linear working range) เทากบ 0.3-5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม โดยมคา correlation coefficient ในชวง 0.9978-0.9999 โดยมความแมน (accuracy) แสดงดวยคาเฉลย % recovery อยในชวง 65-120% และความเทยง (precision) แสดงดวย %RSD อยในชวง 0.1-15.2 จากการพสจนความใชไดของวธพบวาเปนไปตามหลกเกณฑ และเงอนไขทส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาก�าหนด และเกณฑการควบคมคณภาพผลการวเคราะหท European

Communities ก�าหนด ไดด�าเนนการส�ารวจปรมาณการตกคางของสารไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในเนอสตว เครองใน

สตวน�า น�าผง นมผง ไขผง และแปง ในชวงป พ.ศ. 2554-2556 รวมทงสน 579 ตวอยาง ตรวจพบ 13 ตวอยาง คดเปนรอยละ 2.2 ตรวจพบ AOZ และ SEM ในสตวน�า 8 ตวอยาง ปรมาณทตรวจพบ นอยกวา 1.0 - 2.4 และ 2.2 ไมโครกรมตอกโลกรม ตามล�าดบ และพบ SEM ในนมผง ไขผง และแปง 5 ตวอยาง ปรมาณทตรวจพบ นอยกวา 1.0 - 3.5 ไมโครกรมตอกโลกรม


Determination of nitrofuran metabolites in food Thongsuk Payanan and Ladda Kaewklapanyacharoen

บทนำาสารกลมไนโตรฟแรนส ประกอบดวย ฟราโซลโดน (furazolidone) ฟรลทาโดน (furaltadone)

ไนโตรฟราโซน (nitrofurazone) และไนโตรฟรานโทอน (nitrofurantoin) ซงเปนยาเชอแบคทเรย (Antibacterial agent) ทสงเคราะหขนนยมใชกนอยางกวางขวางในการรกษาโรคตดเชอภายในล�าไส โรคตดเชอในระบบทางเดนปสสาวะและโรคผวหนงตดเชอในสตว เชน วว ควาย สกร เปด ไก ปลา และกง(1) ตลอดจนใชเปนยาฆาเชอแบคทเรย

ในการเลยงผง สตรโครงสรางของสารกลมนประกอบไปดวยวงแหวนฟแรนสเกาะดวยไนโตรกรป เรยกวา 5-nitro-furaldehyde มลกษณะเปนผงสเหลอง ไมมกลน ไมมรส ละลายน�าไดเลกนอย และจะถกยอยสลายอยางรวดเรว ในสตว กลายเปน metabolites ซงจะจบตวตามเนอเยอตางๆ เรยกวา tissue-bound metabolites หรอ protein-bound metabolites ซงจะมความคงตวกวา parent drugs และจะตกคางในเนอเยอของสตว ซง metabolites ของฟราโซลโดน ฟรลทาโดน ไนโตรฟรานโทอน และไนโตรฟราโซน คอ 3-amino-2-oxazolididone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) และ semicarbazide (SEM) ตามล�าดบ ซงสารกลมนมแนวโนมเปนสารกอมะเรง (carcinogenic) และท�าใหเกด

การกลายพนธในสตว (genotoxic) ถาไดรบการบรโภคในระยะเวลานาน เปนผลท�าใหในหลายประเทศ เชน อเมรกา ออสเตรย แคนาดา ญปน สงคโปร และประเทศในกลมสหภาพยโรป (EU) ประกาศหามใชสารกลมนกบสตวทใชเปนอาหาร(2) ประเทศไทยไดมการประกาศหามใชสารกลมนผสมในอาหารเพอการเลยงสตวเชนกน ป พ.ศ. 2541 กระทรวงเกษตรและสหกรณไดออกประกาศหามใชสารเคมภณฑชนดฟราโซลโดนและไนโตรฟราโซนผสมในอาหารและหาม

น�าเขาอาหารสตวทมสวนผสมของสารน ตอมาในป พ.ศ. 2542 ประกาศดงกลาวไดรบการปรบใหครอบคลมสารกลม

ไนโตรฟแรนสทงหมด(3) ป พ.ศ. 2536 กระทรวงสาธารณสขไดออกประกาศฉบบท 151 เรอง ก�าหนดวตถทหามใช ในอาหาร โดยก�าหนดใหอาหารทกชนดตองตรวจไมพบการปนเปอนของสารกลมไนโตรฟแรนส(4) พรอมกนนส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา ไดออกประกาศ เรอง หลกเกณฑ เงอนไข และวธการตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหาร ก�าหนดวาจะตองใชวธตรวจ และหองปฏบตการทมความสามารถในการตรวจพบปรมาณสารปนเปอนสาร AOZ และ AMOZ ไดอยางนอยต�ากวา 0.3 ไมโครกรมตอกโลกรม AHD และ SEM ไดอยางนอยต�ากวา 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม(5)

ในชวงป พ.ศ. 2545-2546 สหภาพยโรปไดแจงผานระบบการเตอนภยส�าหรบอาหารและผลตภณฑอาหาร (Rapid Alert System for Food and Food Product, RASFF) วาตรวจพบยาปฏชวนะกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ตกคางในกงกลาด�าแชแขงและเนอไกแชแขงจากประเทศไทย จน ไตหวน อนเดย เวยดนาม เอกวาดอร และบราซล และในป พ.ศ. 2547 ถง 2550 ยงคงตรวจพบการตกคางของสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท โดยเฉพาะ AOZ และ SEM ในอาหารประเภท กง น�าผง ไขไก แปง เนอสตวบรรจกระปอง และอาหารส�าหรบทารก จากกลมประเทศแถบเอเชย เชน ไทย มาเลเซย อนโดนเซย เวยดนาม จน อนเดย บงคลาเทศ ดงนนทางกลมสหภาพยโรปจงไดออกมาตรการควบคมสนคาจากประเทศดงกลาวอยางเขมงวดตาม Commission Decision 2002 และ Council Directive 96/23/EC(6), (7), (8), (9) โดยใหมการตรวจสอบสารตกคางในสนคาดงกลาวทก shipment จากปญหา ดงกลาวสะทอนใหเหนวาคณภาพของอาหารทประชาชนบรโภคภายในประเทศอาจมการตกคางของสารกลมน

อยเชนกน การวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนสตกคางในอาหาร โดยทวไปจะตรวจวดในรปของสารอนพนธทจบอยกบ

เนอเยอตาง ๆ ดงนนจงตองท�าการแยกสารเหลานออก โดยการยอยสลายพนธะดวยกรดไฮโดรคลอรก (HCl) ไดสาร metabolites ซงมขนาดโมเลกลเลกมากยากตอการตรวจสอบ ดงนนจงตองท�าใหสารเหลานอยในรปสารอนพนธทมขนาดของโมเลกลใหญขนโดยผานขบวนการ derivatization โดยสารทนยมใชเปนตวท�าใหเกดอนพนธคอ 2-NBA (2-nitrobenzaldehyde) แลวท�าใหสารบรสทธ (clean up) ซงมเทคนคหลายรปแบบแลวแตความซบซอน



วเคราะหไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทในอาหาร ทองสข ปายะนนทน และลดดา แกวกลาปญญาเจรญ

ของ matrix นนๆ เชน การใช SPE cartridge, liquid-liquid partition เปนตน ท�าใหเสยเวลาในการเตรยมตวอยาง และคาใชจายสง แลวท�าการตรวจวดชนดและปรมาณโดยเครอง UV photodiode array, ELISA, LC-MS หรอ LC-MS/MS(10), (11), (12), (13) ส�าหรบงานวจยนไดพฒนาวธการเตรยมตวอยางจาก McCracken RJ และ Kennedy DG(1) โดยท�าการสกดดวยวธ total residue และปรบปรมาณสารเคมทใชในขนตอน derivatization ใหเหมาะสม เพยงพอกบสารเปาหมายทตองการเปลยนเปนสารอนพนธ (derivative) เทานน และท�าใหสารบรสทธดวย hexane ซงวธดงกลาวนสามารถวเคราะหชนดตวอยางไดหลากหลาย เชน เนอสตว เครองในสตว แปง นมผง ไขผง น�าผง เตรยมตวอยางไดรวดเรว ใชปรมาณสารเคมนอย ประหยดคาใชจาย ตรวจวดดวยเครอง LC-MS/MS ซงเปนเครองมอทมความไวและความจ�าเพาะสง สามารถตรวจสอบสารทมปรมาณนอยไดอยางแมนย�า

ไดท�าการทดสอบความถกตองของวธ (method validation) โดยใชเนอกง เนอไก น�าผง นมผง และ ไขผง เปนตวแทน (representative matrix) ท�าการวเคราะห method blank, matrix blank, limit of detection, limit of quantitation, linearity and working range, accuracy และ precision ตาม EURACHEM Guide 1998(14) และไดเขารวมการเปรยบเทยบผลการวเคราะหระหวางหองปฏบตการในการทดสอบความช�านาญ (Proficiency testing) กบหนวยงานทเชอถอได เพอยนยนวาวธทไดมความถกตอง เหมาะสม

สามารถน�าไปใชตรวจวเคราะหตวอยางเพอควบคมคณภาพอาหารตามกฎหมาย และเพอทราบสถานการณการตกคางเปนการเฝาระวงความปลอดภยใหกบผบรโภค นอกจากนยงใชเปนขอมลพนฐานในการวางแผนใหกบหนวยงาน

ทเกยวของ เพอปองกนและเฝาระวงการใชสารเหลานตอไป

วสดและวธการสารเคมและสารมาตรฐาน

สารมาตรฐาน : 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxa-zolodinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) (ผลตภณฑของ Witega Laboratorien Berlin, purity > 99%), semicarbazide (SEM) (ผลตภณฑของ CHEM SERVICE, purity 99%) และ internal standard AOZ-d4 (purity > 98%), AMOZ-d5 และ SEM-13c (purity > 99%) ทงหมดเปนผลตภณฑของ Witega Laboratorien Berlin

สารเคม : methanol (MeOH), ethylacetate (C4H8O2) และ hexane (C6H14) เปน HPLC grade, 2-nitrobenzaldehyde (C7H5NO3), trisodium phosphate dodecahydrate (Na3PO4.12H2O), hydrochloric acid (HCl), sodium hydroxide pellets (NaOH) และ ammonium acetate (CH3COONH4) เปน AR grade (ภาพท 1)

เครองมอและอปกรณเครองชง 3 ต�าแหนง และ 5 ต�าแหนง, refrigerated centrifuge, vortex mixer, turbo nitrogen

evaporator temperature controlled, เครองบดเนอ, micro pipette ขนาด 10-200, 20-200 และ 100-1000 ไมโครลตร, screw cap centrifuge tube ขนาด 50 มลลลตร, test tube ขนาด 10 มลลลตร, micro-spin filter tube 0.45 µm PVDF, เครอง LC-MS/MS ประกอบดวย binary pump, autosampler, micro vacuum degasser, thermostated column compartment: Agilent 1100 series, detector ชนด triple quadrupole mass spectrometer: API 4000 และคอลมนทใชในการแยกสารคอ zorbax SB C-18 150 mm x 3 mm, 5 µm ส�าหรบ mobile phase ทใชเปนระบบตวท�าละลาย 2 ชนด ซงตวท�าละลาย A คอ 0.5 mM CH3COONH4 และตวท�าละลาย B คอ methanol โปรแกรมทใชในการแยกสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท คอ gradient



โดยใช flow rate 0.6 ml/min เวลาทใชในการวเคราะหทงหมด 15 นาท โดยมสภาวะของ mass spectrometer ดงน

- ion spray voltage: 5200 Volts- temperature (TEM): 450 องศาเซลเซยส- collision gas (CAD): nitrogen: 5 psig- curtain gas (CUR): 13 psig- ion spray nebulizer gas (GAS-1): 52 psig- TIS heater gas (GAS-2): 58 psig- entrance potential (EP): 10 Volts

ภาพท 1 โครงสรางของสารกลมไนโตรฟแรนส และอนพนธของสารกลมไนโตรฟแรนส




ส�าหรบการวเคราะหโดย MS/MS นนสารจะถกท�าใหเปนไอออนบวกโดย electrospray ionization (ESI) ไอออนทไดจะถกวเคราะหดวย Selective Reaction Monitoring (SRM) mode โดยศกษา mass ท m/z (ตารางท 1)

ตารางท 1 MS/MS fragmentation condition

component precursor ion product ion Dwell time DP CE CXP (m/z) (m/z) (ms) (volts) (volts) (volts)

NP-AOZNP-AMOZNP-AHDNP-SEMNP-AOZ-d4NP-AMOZ-d5NP-SEM-13c

236.3 ± 0.5335.2 ± 0.5249.3 ± 0.5209.3 ± 0.5 240.3 ± 0.5340.2 ± 0.5212.2 ± 0.5

104.0 ± 0.5 (secondary) 134.1 ± 0.5 (primary) 262.0 ± 0.5 (secondary)291.3 ± 0.5 (primary) 104.0 ± 0.5 (secondary) 134.1 ± 0.5 (primary) 166.2 ± 0.5 (secondary) 192.2 ± 0.5 (primary) 134.1 ± 0.5 296.3 ± 0.5 168.0 ± 0.5

150150150150150150150150150150150

4040464658583232323232

3924452340261526262626

20205811

72424242424

ตวอยาง1. การทดสอบความใชไดของวธ ใชเนอกง เนอไก น�าผง นมผง และไขผง เปนตวแทนของกลมเนอสตว

และเครองใน เนอสตวน�า น�าผง นม ไข และแปงในการทดสอบวธ2. การส�ารวจปรมาณตกคางในอาหาร พ.ศ. 2554 - 2556 โดยวเคราะหตวอยางอาหารรวม 579 ตวอยาง

ไดแก เนอสตวและเครองใน 190 ตวอยาง เนอสตวน�า 201 ตวอยาง น�าผง 9 ตวอยาง นมผง 83 ตวอยาง ไขผง 36 ตวอยาง และแปง 60 ตวอยาง (ตารางท 2)

2554 16 7 5 38 8 42555 92 129 2 30 21 262556 82 65 2 15 7 30รวม 190 201 9 83 36 60

ตารางท 2 จ�านวนตวอยางอาหารตรวจวเคราะหในป 2554 - 2556

ป พ.ศ. ชนดตวอยาง/จ�านวนตวอยาง เนอสตวและเครองใน เนอสตวน�า น�าผง นมผง ไขผง แปง

วธวเคราะหการสกด (extraction)

ตวอยางเนอสตว เครองในทบดละเอยด น�าผง ชงตวอยาง 1 กรม ตวอยางนมผง แปง และไขผง ชงตวอยาง 0.5 กรม ใสในหลอด screw cap centrifuge tube ขนาด 50 มลลลตร เตม internal standard, AOZ- d4, AMOZ-d5 และ SEM-13c ทระดบ 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม เตม 0.2 M HCl 5 มลลลตร เขยาใหพอเขากน



เตม 100 mM 2-NBA 50 ไมโครลตร ปนดวย vortex mixer ประมาณ 1 นาท และ incubate ทอณหภม 37 ± 2 องศาเซลเซยส นาน 18 ชวโมง น�าตวอยางตงทงใหเยนทอณหภมหอง เตม 0.3 M Na3PO4.12H2O ปรมาตร 500 ไมโครลตร ปรบ pH เปน 7.0 ± 0.5 ดวย 2 M NaOH ปนดวย vortex mixer ประมาณ 1 นาท สกดดวย ethyl acetate 10 มลลลตร และ 5 มลลลตร ตามล�าดบ โดยเขยาดวย shaker เบาๆ centrifuge ท 3,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท ดดชน organic solvent รวมใสในหลอด centrifuge tube ระเหยชน organic solvent จนแหง

การทำาใหสารบรสทธ (clean - up)ละลาย residue ดวย hexane 2 มลลลตร และสารละลายผสมของ MeOH: 0.5 mM CH3COONH4

(1:1) 1 มลลลตร ส�าหรบตวอยางเนอสตว น�าผง และ 500 ไมโครลตร ส�าหรบตวอยางนมผง แปง ไขผง จากนนน�าไปปนดวย vortex mixer วางทงใหแยกชน ดดชน hexane ทง เตม hexane 2 มลลลตร สกดซ�า เพอก�าจดไขมน

อกครง ถายสารละลายตวอยางใส micro-spin filters น�าไป centrifuge ทความเรว 5,500 รอบตอนาท นาน

10 นาท เทสารละลายทกรองไดใสใน HPLC vials สชา น�าไปวเคราะหชนดและปรมาณโดยเครอง LC-MS/MS

การทดสอบความถกตองของวธวเคราะห (method validation)การสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve)

เตรยม matrix – matched calibration curve โดยชง matrix blank จ�านวน 6 หลอด แลวเตมสารมาตรฐาน AOZ, AMOZ, AHD และ SEM 6 ระดบความเขมขน 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 และ 5.0 ไมโครกรม

ตอกโลกรม เตม internal standard ความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ในทกหลอด จากนนท�าการสกด และท�าใหบรสทธเหมอนการสกดตวอยาง สรางกราฟมาตรฐาน ระหวาง (แกน x) อตราสวนความเขมขนของสารมาตรฐาน และความเขมขนของ internal standard (concentration ratio) กบ (แกน y) อตราสวนของ peak area ของสารมาตรฐาน และ peak area ของ internal standard (peak area ratio) ค�านวณหาสมประสทธสหสมพนธของเปยรสน (Pearson correlation coefficient, r)

วเคราะห method blank และ matrix blank method blank: สกดตามวธวเคราะหทพฒนาโดยใชสารเคมทงหมด แตไมมตวอยาง เตม internal

standard ทระดบความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม matrix blank: สกดเนอกง เนอไก น�าผง นมผง และไขผง ตามวธวเคราะห เตม internal standard

ทระดบความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ฉดสารสกด method blank และ matrix blank เขาเครอง LC-MS/MS เพอดวาม mass หรอ peak

รบกวนตรงสารมาตรฐานหรอไม

การหาขดจำากดของการตรวจพบ (limit of detection, LOD)ทดสอบคา LOD โดยเตมสารมาตรฐานลงใน matrix blank ปรมาณใกลเคยงกบระดบทต�าสดของ

matrix matching calibration curve เตม internal standard ทระดบความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม จากนนยนยนคา LOD โดยท�าการทดสอบ 10 ซ�า ผลตองไมพบ false negative และตองใหสญญาณคา signal/noise >3




การหาขดจำากดของการวดเชงปรมาณ (limit of quantitation, LOQ)ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐาน ประมาณ 2 เทาของ LOD และเตม internal standard ทระดบความ

เขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ลงใน matrix blank วเคราะห 10 ซ�า ค�านวณปรมาณเทยบกบสารมาตรฐาน

แลวค�านวณ % recovery, % RSD และ HORRAT

การทดสอบความเปนเสนตรง และชวงการวเคราะห (linearity and working range)ทดสอบโดยเตมสารมาตรฐานลงใน matrix blank ทระดบความเขมขน 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 และ 5.0

ไมโครกรมตอกโลกรม และเตม internal standard ทระดบความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม วเคราะห ระดบละ 3 ซ�า สรางกราฟความสมพนธระหวาง concentration ratio กบ peak area ratio ของสารมาตรฐานทง 4 ชนด ค�านวณหาคา r

การทดสอบความแมน และความเทยง (accuracy and precision)ทดสอบความแมนและความเทยงของการวเคราะหในชวงการวเคราะหทเปนเสนตรงโดยเตมสารมาตรฐาน

3 ระดบความเขมขน ไดแก 0.3, 2.0 และ 5.0 ไมโครกรมตอกโลกรมส�าหรบ AOZ และ AMOZ ทระดบความเขมขน 1.0, 2.0 และ 5.0 ไมโครกรมตอกโลกรมส�าหรบ AHD และ SEM ในชวง linear working rang และเตม internal standard ทระดบความเขมขน 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ลงใน matrix blank วเคราะหระดบละ 10 ซ�า ค�านวณปรมาณเทยบกบสารมาตรฐาน แลวค�านวณคาเฉลย % recovery, % RSD และ HORRAT โดยประเมนผลการทดสอบความถกตองของวธตามเกณฑก�าหนดดงน

ความแมน (accuracy) ก�าหนดเกณฑยอมรบโดยคาเฉลย % recovery อยในชวง 60 -120(15) ความเทยง (precision) เกณฑยอมรบโดยใช HORRAT (Horwitz ratio) ท Codex และ EU ก�าหนดไวท ≤ 2 โดย

HORRAT (Horwitz ratio) ค�านวณจาก

HORRAT = Experimental RSDr Predicted RSDr

การเขารวมการทดสอบความชำานาญ (proficiency testing)เขารวมการเปรยบเทยบผลการวเคราะหระหวางหองปฏบตการในการทดสอบความช�านาญ (proficiency

testing) เกณฑยอมรบ |Z| ≤ 2

การประเมนคาความไมแนนอนของการวเคราะห (uncertainty)การประเมนคาความไมแนนอนของการวด(16) โดยค�านงถงแหลงของความไมแนนอนทกแหลง รวมคา

ความไมแนนอนทงหมด แลวค�านวณคาความไมแนนอนขยายทระดบความเชอมน 95% (k = 2) ในการประเมนคาความไมแนนอนของการวเคราะหตามวธทไดทดสอบ

ปรมาณสารทพบ หนวยเปนไมโครกรมตอกโลกรม (µg/kg) โดยค�านวณความเขมขนของสารทตรวจพบจาก standard curve

โดยใชสมการเสนตรง Y = aX+ b ปรมาณของสารทตรวจพบ, CA (µg/kg) = (Y - b) × CIS(µg/kg)/a โดย X = concentration ratio, CA (µg/kg)/CIS (µg/kg) Y = peak area ratio



CA = conc. of analyte (µg/kg) CIS = conc. of internal standard (µg/kg) a = slope ของ calibration curve b = intercept ของ calibration curve

ผลจากการศกษาการวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ทง 4 ชนด ไดแก AOZ, AMOZ, AHD

และ SEM ภายใตสภาวะทก�าหนด พบวาสามารถสรางกราฟมาตรฐานความสมพนธระหวาง concentration ratio กบ peak area ratio ของสารมาตรฐานดงกลาวไดในชวงความเขมขน 0.3-5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ไดกราฟทเปนเสนตรงมคา r ในชวง 0.9978-0.9999 และเมอวเคราะห method blank ของสารเคมทใชทงหมด และ matrix blank ของตวอยางเนอกง เนอไก น�าผง นมผง และไขผง ไมพบ peak รบกวนในชวงของการตรวจวดสารเปาหมาย

ผลการทดสอบขดจ�ากดของการตรวจพบ (LOD) เทากบ 0.1 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AOZ และ AMOZ และ 0.5 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AHD และ SEM โดยใหสญญาณพคมคาสงกวา 3 เทาของ signal to noise ในทกตวอยาง สวนคาขดจ�ากดของการวดเชงปรมาณ (LOQ) เทากบ 0.3 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AOZ และ AMOZ และ 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AHD และ SEM ผลการพสจนคา LOQ โดยการเตมสารมาตรฐาน วเคราะห 10 ซ�า โดยมคาความแมนจาก % recovery เฉลยในชวง 65-117 %, % RSD ในชวง 0.3-10.9 และความเทยงจาก HORRAT ในชวง 0.01-0.4 (ตารางท 3)

เนอกง 81.2 5.4 0.2 99.2 2.7 0.1 101.1 4.1 0.1 100.3 1.1 0.04เนอไก 96.7 4.4 0.1 100.3 0.3 0.01 99.9 4.8 0.1 80.6 5.8 0.2น�าผง 101.7 7.4 0.2 109.4 3.7 0.1 117.3 3.7 0.1 85.5 6.7 0.2นมผง 93.4 3.7 0.1 99.1 3.8 0.1 65.1 4.7 0.2 86.0 4.5 0.2ไขผง 87.8 9.8 0.1 91.3 10.7 0.2 112.4 3.8 0.1 88.3 10.9 0.4

ตารางท 3 ผลการทดสอบความแมนและความเทยงทระดบ LOQ ของ AOZ, AMOZ, AHD และ SEM

ชนด Nitrofuran metabolites AOZ (0.3 µg/kg) AMOZ (0.3 µg/kg) AHD (1.0 µg/kg) SEM (1.0 µg/kg) %Rec. %RSD HORRAT %Rec. %RSD HORRAT %Rec. %RSD HORRAT %Rec. %RSD HORRAT

ตวอยาง

ผลการทดสอบความเปนเสนตรงและชวงการวเคราะห (linearity and working range) ทชวงความ

เขมขน 0.3-5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ไดกราฟเสนตรง มคา r ในชวง 0.9825-0.9999 (ตารางท 4) การทดสอบคาความแมนและความเทยงของวธวเคราะหทระดบความเขมขน 0.3, 2.0 และ 5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AOZ และ AMOZ ทระดบความเขมขน 1.0, 2.0 และ 5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ส�าหรบ AHD และ SEM วเคราะหระดบละ 10 ซ�า พบวาความแมนทประเมนจาก % recovery เฉลยทง 4 ระดบอยในชวง 61-120% และความเทยง (precision) ทประเมนดวย %RSD และ HORRAT อยในชวง 0.1-15.2 และ 0.0-0.7 (ตารางท 5)




ตารางท 4 แสดงความเปนเสนตรง ทชวงความเขมขน 0.3-5.0 ไมโครกรมตอกโลกรม

กง 0.9999 0.9976 0.9998 0.9978ไก 0.9957 0.9956 0.9985 0.9841น�าผง 0.9978 0.9996 0.9951 0.9998นมผง 0.9950 0.9973 0.9930 0.9848ไขผง 0.9965 0.9995 0.9957 0.9825

ชนดตวอยาง r AOZ AMOZ AHD SEM

ตารางท 5 แสดงผลการทดสอบความแมน และความเทยง ในการวเคราะห AOZ, AMOZ, AHD และ SEM

ชนดตวอยาง สารมาตรฐาน Spiked level % Recovery (n=10)

Min ± SD %RSD HORRAT (µg/kg) Min-Max

เนอกง AOZ 0.3 72.3 - 87.0 81.2 ± 4.4 5.4 0.2 2.0 88.5 - 100.5 97.0 ± 5.4 5.6 0.2 5.0 84.0 - 95.6 90.4 ± 3.9 4.3 0.2 AMOZ 0.3 95.0 - 120.0 99.2 ± 2.7 2.7 0.1 2.0 99.0 - 120.0 102.6 ± 6.2 6.1 0.2 5.0 84.4 - 112.6 94.7 ± 8.7 9.2 0.4 AHD 1.0 100.0 - 106.0 101.1 ± 4.1 1.8 0.1 2.0 119.5 - 120.0 120.0 ± 0.2 0.1 0.01 5.0 119.6 - 120.0 120.0 ± 0.1 0.1 0.0 SEM 1.0 97.5 - 101.0 100.3 ± 1.1 1.1 0.04 2.0 73.0 - 115.0 96.1 ± 12.7 13.2 0.5 5.0 70.4 - 74.6 72.8 ± 1.5 2.1 0.1เนอไก AOZ 0.3 86.7 - 100.3 96.7 ± 4.4 4.5 0.1 2.0 71.0 - 100.0 91.3 ± 8.4 9.2 0.5 5.0 92.8 - 112.0 100.2 ± 5.9 5.9 0.3 AMOZ 0.3 100.0 - 101.0 100.3 ± 0.3 0.3 0.01 2.0 82.0 - 97.5 89.9 ± 5.1 5.7 0.2 5.0 88.4 - 98.4 93.5 ± 3.2 3.4 0.10 AHD 1.0 89.6 - 110.1 99.9 ± 4.8 4.8 0.1 2.0 90.0 - 100.5 98.5 ± 3.7 3.7 0.1 5.0 98.2 - 100.2 99.4 ± 0.7 0.7 0.03 SEM 1.0 72.2 - 86.1 80.6 ± 4.7 5.8 0.2 2.0 85.0 - 100.0 95.5 ± 6.3 6.6 0.3 5.0 97.8 - 118.4 100.9 ± 6.2 6.2 0.04น�าผง AOZ 0.3 88.3 - 109.7 101.7 ± 7.5 7.4 0.2 2.0 88.0 - 109.0 99.8 ± 7.7 7.7 0.3 5.0 94.6 - 108.2 101.0 ± 4.0 3.9 0.2 AMOZ 0.3 98.3 - 111.7 109.4 ± 4.1 3.7 0.1 2.0 100.0 - 101.5 100.5 ± 0.5 0.5 0.02 5.0 99.8 - 101.5 100.3 ± 0.5 0.3 0.02 AHD 1.0 110.0 - 120.0 117.3 ± 4.4 3.7 0.1



ผลการทดสอบความแมนของวธจากการเขารวมการเปรยบเทยบผลการวเคราะหระหวางหองปฏบตการ ในการทดสอบความช�านาญ ในตวอยางไขไก และเนอกง (FAPAS proficiency test No. 02198 และ No. 02201) พบวาผลการประเมนอยในเกณฑยอมรบ โดยในตวอยางไขไกพบสาร AMOZ คา assigned value เทากบ 2.39 ไมโครกรมตอกโลกรม ผลการทดสอบ เทากบ 2.36 ไมโครกรมตอกโลกรม คาการประเมน Z-Score เทากบ -0.1 และตวอยางเนอกงพบสาร SEM คา assigned value เทากบ 1.72 ไมโครกรมตอกโลกรม ผลการทดสอบ เทากบ

1.01 ไมโครกรมตอกโลกรม คาการประเมน Z-Score เทากบ -1.9 นอกจากนยงไดเขารวมทดสอบความช�านาญระหวางหองปฏบตการกบหนวยงานภายในประเทศ ผลการประเมนอยในเกณฑยอมรบ โดยไดท�าการทดสอบในตวอยาง เนอกง พบสาร AOZ, AHD และ SEM คา assigned value เทากบ 2.44, 2.19, 1.81 ไมโครกรมตอกโลกรม

ผลการทดสอบ เทากบ 2.86, 2.66, 2.09 ไมโครกรมตอกโลกรม คาการประเมน Z-Score เทากบ 0.78, 0.98 และ 0.70 ตามล�าดบ

ตารางท 5 แสดงผลการทดสอบความแมน และความเทยง ในการวเคราะห AOZ, AMOZ, AHD และ SEM (ตอ)

ชนดตวอยาง สารมาตรฐาน Spiked level % Recovery (n=10)

Min ± SD %RSD HORRAT (µg/kg) Min-Max

2.0 100.0 - 101.0 100.5 ± 0.4 0.4 0.02 5.0 89.9 - 98.8 93.9 ± 3.2 3.4 0.1 SEM 1.0 80.9 – 88.3 85.5 ± 5.7 6.7 0.2 2.0 89.9 – 101.0 98.3 ± 4.4 4.4 0.2 5.0 94.6 – 101.0 99.6 ± 2.2 2.2 0.1นมผง AOZ 0.3 85.7 – 98.3 93.4 ± 3.5 3.7 0.1 2.0 77.5 – 100.0 91.0 ± 7.0 7.7 0.3 5.0 85.4 – 100.4 95.6 ± 4.6 4.8 0.2 AMOZ 0.3 96.7 – 104.7 99.1 ± 3.9 3.8 0.1 2.0 97.5 – 110.0 102.0 ± 4.3 4.2 0.2 5.0 80.0 – 97.4 89.1 ± 5.7 6.4 0.3 AHD 1.0 60.8 – 69.6 65.1 ± 3.0 4.7 0.2 2.0 89.0 – 100.5 96.8 ± 4.1 4.2 0.2 5.0 100.0 – 120.0 112.0 ± 7.7 6.9 0.3 SEM 1.0 81.8 – 93.6 86.0 ± 3.8 4.5 0.2 2.0 89.0 – 101.0 97.5 ± 4.0 4.1 0.2 5.0 88.6 – 99.2 96.1 ± 3.6 3.7 0.2ไขผง AOZ 0.3 80.0 – 103.3 87.8 ± 8.6 9.8 0.1 2.0 100.0 – 101.0 100.3 ± 0.4 0.4 0.02 5.0 79.0 – 100.4 95.4 ± 7.1 7.5 0.3 AMOZ 0.3 75.3 – 111.3 91.3 ± 9.8 10.7 0.2 2.0 98.1 – 120.0 107.2 ± 7.1 6.6 0.3 5.0 75.8 – 102.8 94.5 ± 8.1 8.6 0.4 AHD 1.0 103.6 – 118.6 112.4 ± 4.3 3.8 0.1 2.0 88.5 – 99.5 94.9 ± 3.9 4.2 0.2 5.0 76.8 – 99.4 91.0 ± 7.7 8.5 0.4 SEM 1.0 72.7 – 108.0 88.3 ± 9.6 10.9 0.4 2.0 70.5 – 120.0 104.4 ± 15.8 15.2 0.7 5.0 70.4 – 90.6 77.4 ± 6.8 8.8 0.4




การประมาณคาความไมแนนอนของการวเคราะหตามวธทไดทดสอบ โดยน�าการวเคราะหสารฟราโซลโดน (AOZ) ในเนอกงเปนตวอยาง พบแหลงทมาของความไมแนนอน ไดแก การชงน�าหนกของตวอยาง คา concentration ratio, C ทอานไดจาก calibration curve สารมาตรฐาน เครองแกววดปรมาตรทใช bias และ precision เมอไดค�านวณคาความไมแนนอนขยาย มคาเทากบ ± 17.8% ทระดบความเชอมน 95% (ตารางท 6 และภาพท 2) และ เมอเปรยบเทยบสดสวนคาความไมแนนอนจากแหลงความไมแนนอนทสงผลตอปรมาณสารจากมากไปหานอย ไดแก ความเทยงของวธวเคราะห (method precision, 63.3%) สารมาตรฐาน (15.5%), ความเบยงเบนจากคาจรง (bias, 13.2%) calibration curve (5.5%) final volume (1.7%) การชงน�าหนกของตวอยาง (sample weight, 0.8%)

1. sample weight 1 g 0.00113 g 0.001132. final volume - calibration 1 ml 0.00028 ml 0.00028 - temperature 1 ml 0.00231 ml 0.002313. calibration curve 1.0 µg/kg 0.00737 µg/kg 0.007374. standard dilution purity 99% 0.25% 0.00252 stock std - calibration (balance) 0.01001 g 0.00019 g 0.01898 - calibration (vol. flask) 10 ml 0.00095 ml 0.00010 - temperature (vol. flask) 10 ml 0.02309 ml 0.00231 working std - calibration (micro pipette) 0.1 ml 0.00052 ml 0.0052 - calibration (vol. flask) 10 ml 0.001640 ml 0.00016 - temperature (micropipette) 0.1 ml 0.00040 ml 0.0040 - temperature (vol. flask) 10 ml 0.03999 ml 0.00405. precision (repeatability) 1.89 µg/kg 0.16 µg/kg 0.084666. bias (recovery) 96.9% 1.7% 0.01754 Combine standard uncertainty 0.08927 Standard uncertainty (uc) = 0.08927 × 1 µg/kg 0.089 µg/kg Expanded uncertainty (U), k = 2, 2 × 0.08927 0.178 µg/kg

ตารางท 6 แหลงทมาและการค�านวณคาความไมแนนอนของการวเคราะห ไนโตรฟแรนส เมทตาโบไลท

component value, x standard relative standard uncertainty, u uncertainty u(x)/x



ภาพท 2 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในเนอกง

CalibrationCalibrationcurve5.5%

Bias13.2%

standardconcentration

15.5%

Precision63.3%

Final volume Sample weight1.7%

เนอสตวและเครองใน 190 0 – – – –เนอสตวน�า 201 8 0.4 – 2.4 – – 2.2น�าผง 9 0 – – – –นมผง 83 1 – – – นอยกวา 1.0ไขผง 36 1 – – – 1.5แปง 60 3 – – – นอยกวา 1.0 – 3.5

รวม 579 13 0.4 – 2.4 – – นอยกวา 1.0 – 3.5

ตารางท 7 การส�ารวจการปนเปอนของสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในอาหาร

ชนดตวอยาง จ�านวนตวอยาง ชนดและปรมาณทพบ (ไมโครกรมตอกโลกรม)

วเคราะห ตรวจพบ AOZ AMOZ AHD SEM




ไดน�าวธการตรวจวเคราะหทไดทดสอบความถกตองของวธน มาตรวจวเคราะหตวอยางในการส�ารวจปรมาณการปนเปอนของสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในชวงป พ.ศ. 2554-2556 โดยวเคราะหตวอยางเนอสตวและเครองใน และสตวน�าทจ�าหนายในเขตจงหวดตางๆ ทวทกภาคในประเทศไทย รวม 96 ตวอยาง และตวอยางอาหาร ทสงตรวจทส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร โดยส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา และภาคเอกชน รวม 483 ตวอยาง ซงในจ�านวนนมตวอยางอาหารสนคาถกอายดทดานอาหารและยาเนองจากคณภาพไมไดมาตรฐาน หรอเปนสนคาสงออกทถกสงกลบ จ�านวน 70 ตวอยาง

ผลการตรวจวเคราะห ตรวจพบไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ในกงสด 8 ตวอยาง แปง 3 ตวอยาง และนมผง ไขผง อยางละ 1 ตวอยาง ชนดสารทพบคอ AOZ และ SEM โดยในตวอยางกงสดตรวจพบการตกคางทง AOZ และ SEM ปรมาณทตรวจพบ 0.4-2.4 ไมโครกรมตอกโลกรม และ 2.2 ไมโครกรมตอกโลกรม ตามล�าดบ สวนแปง นมผง และไขผง ตรวจพบเฉพาะ SEM ปรมาณทตรวจพบนอยกวา 1.0-3.5 ไมโครกรมตอกโลกรม (ตารางท 7)

วจารณการหาปรมาณสารกลมไนโตรฟแรนสตกคางในอาหารสามารถแสดงไดใน 2 ลกษณะ คอ การตกคางแบบ

bound residue และ total residue โดย bound residue นน จะมเทคนคในการวเคราะหโดยตวอยางจะถกน�ามาลางไขมนและสงรบกวนออกกอน ดวย methanol, ethanol และ diethyl ether ตามล�าดบ จากนน hydrolysed ดวยกรด hydrochloric เจอจาง เพอท�าใหสวนของ metabolite หลดออกจากสวนท bound อยกบโปรตนในตวอยาง แลวท�าการ derivatized ใหเกดเปนสารอนพนธของ nitrophenyl (NP) derivative ดวย 2-nitrobenzaldehyde (2-NBA) และแยกออกดวย ethyl acetate จากนนท�าใหสารบรสทธดวย hexane ซงการสกดดวยวธนจะมขนตอนในการสกดทคอนขางยงยากและซบซอน ใชชนดและปรมาณสารเคมจ�านวนมาก จ�ากดเฉพาะตวอยางทเปนเนอสตวเทานน

ส�าหรบวธ total residue นน ตวอยางจะไมมการลางไขมนและสงรบกวนออกจากตวอยางกอน แตจะน�าตวอยางนนมา hydrolysed ดวยกรด hydrochloric เจอจาง แลวจงท�าการ derivatized ดวย 2-nitrobenzaldehyde (2-NBA) ซงวธนเหมาะส�าหรบตวอยางอาหารทมไขมนต�า

วธทพฒนานใชเทคนคการวเคราะหแบบ total residue โดยตวอยางจะถก hydrolysed ดวยกรด hydrochloric เจอจาง จากนนท�าการ derivatized ดวย 2-nitrobenzaldehyde (2-NBA) ซงในขนตอนนไดมการปรบปรมาณของ 2-NBA ทใชใหเหมาะสม เพยงพอกบสารเปาหมายทตองการเปลยนเปนสารอนพนธ (derivative) เทานน เพอลดสงรบกวนอน ท�าใหงายตอการท�าใหสารบรสทธ และท�าการสกดดวย ethyl acetate หลงจากนนท�าใหสารบรสทธยงขนดวย hexane ซงขนตอนการสกดดวยวธนใชระยะเวลานอย ไมยงยาก สามารถตรวจวดสารไดอยางจ�าเพาะ วเคราะหหาสารตกคางไดครงละหลายตวอยางในเวลาเดยวกน และครอบคลมชนดตวอยางไดหลากหลาย เชน เนอสตว เครองในสตว แปง ไขผง น�าผง นมผง เปนตน นอกจากนยงไดท�าการศกษาวธวเคราะหเปรยบเทยบระหวาง bound และ total residue จะพบวาวธ bound residue จะมการลดการรบกวนจาก matrix กอนการสกดไดเลกนอย และเพอใหแนใจวาเมอวเคราะหดวยวธ total residue พบสารไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท มาจากตวอยางจรงหรอมาจากการรบกวนของ matrix ศกษาพบวาเมอน�าไปใชการสกดแบบ bound residue ผลการทดสอบไมมความแตกตาง

วธทศกษานสามารถทดสอบสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ไดทงหมด 4 ชนด ไดแก 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolodinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) และ semicarbazide (SEM) สารทง 4 ชนดนมคา molecular masses อยระหวาง 209.3 และ 335.2 g mol-1 โดยใชเครอง liquid chromatograph (LC) ซงม tandem mass spectrometer



(MS/MS) เปนตวตรวจวด และมการน�าสาร stable isotope, AOZ-d4, AMOZ-d5, SEM-13c เปน internal standard ในการตรวจวเคราะห สามารถชดเชยการสญหายหรอสลายตวของสารทสนใจทอาจเกดขนในขนตอน

การเตรยมตวอยาง และหลกการค�านวณผลจะใชสดสวน (ratio) ระหวางปรมาณสารทสนใจกบสาร internal standard ท�าใหไมตองค�านงถง total recovery ของวธ ซงเปนขอดเหนอกวาการค�านวณโดยใช external standard

จากการตรวจวเคราะหดวยเครองมอ LC-MS/MS ซงเปนเทคนคทมความไว (sensitivity) และ ความจ�าเพาะ (selectivity) สง ใชหลกการ mass spectrometry ตรวจวด ion ของสารทแยกกนดวยคามวลตอประจ (mass-to-charge ratio, m/z) ทแตกตางกนจงมความจ�าเพาะสง และเลอกใชเทคนค electrospray ionization (ESI) เพอใหเกดการไอออไนเซชนดยงขนโดยการเตมสาร ammonium acetate buffer ซงเปนสาร additives ท�าใหการแยกของสารทตองการออกจาก matrix ไดดยงขน ปองกนการเกด co-elute และดวย detector ชนด tandem mass spectrometer ตรวจวดโดยเลอก mass ถง 2 ครง ครงแรกเลอก precursor ion หรอ parent ion จากนนใชกาซเฉอย วงชนท�าใหเกดการ fragmentation ได product ion หรอ daughter ion เลอก product ion 2 ion ทมคา response สง และไมมสารอนรบกวน การตรวจวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโลทนน สาร AOZ เลอก m/z 236.3 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 104.0 กบ 134.1 AMOZ เลอก m/z 335.2 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 262.0 กบ 291.3 AHD เลอก m/z 249.3 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 104.0 กบ 134.1 สวน SEM ใช m/z 209.3 เปน precursor ion และเลอก product ion ท m/z 166.2 กบ 192.2 ในการค�านวณปรมาณสารทง 4 ชนดตามล�าดบ

เนองจากสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ถกก�าหนดใหเปนสารทหามใชในกลมสหภาพยโรปกบสตว ทน�ามาบรโภคโดยเดดขาด และประกาศของส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาได ก�าหนดใหใชวธตรวจวเคราะหสารตกคางกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทโดย AOZ และ AMOZ ต�ากวา 0.3 ไมโครกรมตอกโลกรม AHD และ SEM ต�ากวา 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม ซงวธทไดทดสอบนสามารถใชในการวเคราะหตามขอก�าหนดของส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาได ในการวเคราะหยงไดก�าหนดการควบคมคณภาพเพอใหไดผลทถกตอง ไดแก การเลอก identification point ซงเปนระบบการคดคะแนนเพอการยนยนชนดสารในการแปลผลขอมลโดยการใชจ�านวน parent ion เรมตน และdaughter ion และก�าหนดความแตกตางสงสดทยอมรบได (maximum permitted tolerance) ของ relative ion intensities ตามท European Communities, EC ก�าหนด(6) นอกจากนคา precision ทไดมคา HORRAT นอยกวา 2 ซงเปนไปตามเกณฑของท Codex และ EU ก�าหนดไว นอกจากนยงไดมการวางแผนการควบคมคณภาพภายใน (internal quality control) เพอความมนใจในผลการวเคราะหตวอยางทก batch โดยก�าหนดไวไมเกน 10 ตวอยาง โดยจะท�าการทดสอบ method blank, matrix blank, duplicate analysis และspiked sample ทระดบ 2.0 ไมโครกรมตอกโลกรม คา% recovery ควรอยในชวง 60-120% และ ในป 2556 วธตรวจวเคราะหนไดรบการรบรองความสามารถหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005 จากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการแสดงใหเหนวาวธทไดทดสอบนจงมความเหมาะสมในการใชวเคราะหสารกลม

ไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทเมอพจารณาความสมเหตสมผลของคาความไมแนนอน โดยใชเกณฑการค�านวณจากคา standard

deviation คาความไมแนนอนทควรจะเปนควรนอยกวา 2 เทาของ predicted Horwitz’s RSDr(17) เมอค�านวณ

คาความไมแนนอนทควรจะเปน เทากบ 59.7% แตจากวธนคาความไมแนนอนทพจารณาจากแหลงความไมแนนอนทมผลกระทบตอปรมาณสารมคา 17.8% ซงมคานอยกวาคาทควรจะเปนประมาณ 3.4 เทา หรอมคาเปน 30% ของคาทควรจะเปน ทงนเนองมาจากเปนเทคนคการวเคราะหแบบ internal standard calibration โดยใช internal standard ใสลงในตวอยางและในสารมาตรฐานค�านวณโดยใชสดสวน (ratio) ระหวางปรมาณสารทสนใจกบ




internal standard สามารถชดเชยการสญหายของสารทสนใจทอาจเกดขนในขนตอนการสกด ท�าใหสามารถลดคาความไมแนนอนจากแหลงความไมแนนอนทเกดจาก total recovery ลงได เชน คาความไมแนนอนจากความ

เบยงเบนจากคาจรง (bias) เปนตน นอกจากนการเลอกใชสารมาตรฐานทมคาความไมแนนอนของความบรสทธนอย

มผลท�าใหคาความไมแนนอนของวธลดลงไดเชนกน ไดน�าวธการตรวจวเคราะหทไดน วเคราะหตวอยาง proficiency test เพอเปรยบเทยบผลการวเคราะห

ระหวางหองปฏบตการ ในการทดสอบความช�านาญกบหนวยงานทงภายในและภายนอกประเทศ ซงพบวาผลการประเมนอยในเกณฑยอมรบได (|Z| < 2) ซงการเขารวมทดสอบความช�านาญหรอเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการเปน

การบงชประสทธภาพวธวาเปนวธทยอมรบไดเมอเปรยบเทยบกบวธอนๆ ทเขารวมการทดสอบในรอบเดยวกน ท�าใหยอมรบไดวาวธทไดพฒนานมความแมนเพยงพอส�าหรบการวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท

ส�าหรบผลการตรวจวเคราะหสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทในตวอยาง จ�านวนทงหมด 579 ตวอยาง พบการตกคาง 13 ตวอยาง โดยพบในกง นมผง ไขผง และแปง คดเปนรอยละ 2.2 โดยพบปรมาณมากกวา 1.0 ไมโครกรมตอกโลกรม จ�านวน 9 ตวอยาง เกนคามาตรฐาน ส�าหรบผลการตรวจพบสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลทในกง จากการศกษาวธการเลยงกงพบวา จะใชระบบการเลยงแบบพฒนาหนาแนน (intensive culture) มการใชยาฟราโซลโดน และสารเคมในระหวางขบวนการเลยง ทงวตถประสงคเพอปองกนโรค รกษาโรค และการจดการคณภาพดนและน�าปญหาทเกดขนกบการเพาะเลยงกงทะเลแบบพฒนาหนาแนน คอ การเกดโรคระบาด ท�าใหเกษตรกรใชยาและ/หรอสารเคมเพอการปองกนและรกษาโรค(19), (20), (21) สวนตวอยาง นมผง ไขผง และแปง พบสาร SEM

ทไมไดเกดจากการใชสารนโดยตรง แตอาจเปนไปไดวาความรอนจากกระบวนการผลตเปนสาเหตท�าใหเกดสาร SEM ซงเปนผลพลอยได (by-product) จากสาร azodicarbonamide ซงเปนสารทมความเสถยรทอณหภมหอง แตจะสลายตวทอณหภมสง และสารนยงใชเปนสารทใสในขบวนการผลตแปง (food additive)(22) อกดวย

สรปวธวเคราะหทพฒนาขนสามารถใชในการตรวจสารกลมไนโตรฟแรนส เมตาโบไลท ทง 4 ชนด ไดแก AOZ,

AMOZ, AHD และ SEM มคณลกษณะเฉพาะ แสดงสมรรถนะทผานเกณฑการยอมรบและเหมาะสม มความถกตอง แมนย�า มความไว และความจ�าเพาะตอสารทตองการทดสอบ เหมาะกบการใชงาน (fitness for intended use) และใหผลทกพารามเตอรผานเกณฑยอมรบของสากล ท�าใหผลการทดสอบถกตอง เชอถอได โดยการพสจนความใชไดของวธทดสอบ (method validation) ซงใชเนอไก เนอกง น�าผง นมผง และไขผง เปนตวแทนของกลมเนอสตวและเครองใน เนอสตวน�า น�าผง นม ไข และแปง ซงเปนตามระบบคณภาพของ ISO/IEC 17025: 2005 และเปนไปตามหลกเกณฑและเงอนไขของส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา สามารถน�าวธนไปใชในการตรวจวเคราะห

เพอด�าเนนคดความ หรอเพอเปนการควบคมคณภาพอาหารตามกฎหมาย เพอความยตธรรมทงแกผประกอบการและคมครองผบรโภคตอไปได

กตตกรรมประกาศขอขอบคณนางกนกพร อธสข นกวทยาศาสตรการแพทยเชยวชาญดานมาตรฐานของอาหาร ทใหค�าแนะน�า

ขอเสนอแนะ และตรวจทานตนฉบบ ตลอดจนสนบสนนการศกษาวจยจนบรรลผลส�าเรจในครงน ขอขอบคณ

นางสาวภรพรรณ สงศร และนางสาวสรลกษณ ชยรนทร ทชวยเตรยมและสกดตวอยาง



เอกสารอางอง 1. McCracken RJ, Kennedy DG. Determination of the furazolidone metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone,

in porcine tissues using liquid chromatography-thermospray mass spectrometry and the occurrence of residues in pigs produced in Northern Ireland. J Chromatogr B 1997; 691: 87-94.

2. Valera-Tarifa NM, Plaza-Bolanos P, Romero-Gonzalez R, Martinez-Vidal JL, Garrido-Frenich A. Determination of nitrofuran metabolites in seafood by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. J Food Comp Anal 2013; 30(2): 86-93.

3. ส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสข. ปญหายาตกคางในเนอสตวและแนวทางแกไข. กรงเทพฯ : โรงพมพองคการสงเคราะหทหารผานศก; 2545. หนา 145-146.

4. ประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท 151 (พ.ศ. 2536) เรอง ก�าหนดวตถทหามใชในอาหาร ราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศทวไป เลม 111 ตอนพเศษ 9ง. (ลงวนท 4 กมภาพนธ พ.ศ. 2537) หนา 107.

5. ส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสข. ประกาศส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา เรอง หลกเกณฑ เงอนไข และวธการตรวจวเคราะหการปนเปอนสารเคมบางชนดในอาหารราชกจจานเบกษา เลม 120 ตอนพเศษ 50ง (ลงวนท 24 เมษายน 2546) หนา 28.

6. Commission Decision 2002/657/EC of implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities L 221/8. August 2002.

7. Council Directive 96/23/EC of on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products and repeating Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decision 89/187/EEC and 91/664/EEC. Official Journal of the European Communities L 125/10. April 1996.

8. Regulation (EC) 178/2002 of the European Parliament and of the Council of laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety Authority and laying down procedures in matters of food safety. Official Journal of the European Communities L 31/1. January 2002

9. The Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF). Annual report 2008. Luxembourg: European Commission; 2009.

10. Verdon E, Couedor P, Sanders P. Multi-residue monitoring for the simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone, nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry-in-house validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Anal Chim Acta 2007; 586(1-2): 336-47.

11. Szilagyi S, de la Calle B. Development and validation of an analytical method for the determination of semicarbazide in fresh egg and in egg powder based on the use of liquid chromatography tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta 2006; 572: 113-20.

12. Chu PS, Lopez MI. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of protein-bound residues in shrimp dosed with nitrofurans. J Agric Food Chem 2005; 53(23): 8934-9.

13. Cooper KM, Elliott CT, Kennedy DG. Detection of 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), a tissue-bound metabolite of the nitrofuran furazolidone, in prawn tissue by enzyme immunoassay. Food Addit Contam 2004; 21(9): 841-8.

14. EURACHEM. The fitness for purpose of analytical method: a laboratory guide to method validation and related topics. United Kingdom: LGC (Teddington) Ltd; 1998. p. 5-24.




15. Fajgelj A, Ambrus A. Principles and practices of method validation. Budapest, Hungary; 1999. 16. Ellison SLR, Rosslein M, Williams A, editors. EURACHEM/CITAC Guide: quantifying uncertainty

in analytical measurement. 2nd ed. United Kingdom: EURACHEM; 2000. 17. กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. แนวทางปฏบตการทดสอบความถกตองทางเคมโดยหองปฏบตการเดยว.

นนทบร : กรมวทยาศาสตรการแพทย; 2549. 18. Vass M, Hruska K, Franek M. Nitrofuran antibiotics: a review on the application, prohibition and

residual analysis. Vet Med 2008; 53(9): 469-500. 19. ธงชย นตรฐสวรรณ, วระพร ศรอรรคพรหม. การใชยาและสารเคมในการเลยงกงกลาด�าในอ�าเภอสเกา จงหวดตรง ป 2542.

ตรง : คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลยการประมง สถาบนเทคโนโลยราชมงคล; 2543. หนา 45. 20. ลลา เรองแปน, สถาพร ดเรกบษราคม, เยาวนตย ดนยดล, ยบลรตน ศรแกว. ประสทธภาพของยารกษาโรคกงกลาด�าในทองตลาด

ทยบยงการเจรญของแบคทเรยเรองแสงและวบรโอ. เอกสารวชาการ ฉบบท 19/2540. สงขลา : สถาบนวจยการเพาะเลยงสตวน�าชายฝง กรมประมง; 2540. หนา 10.

21. Gräslund S, Karlsson K, Wongtavatchai J. Responsible use of antibiotics in shrimp farming. Aquaculture Asia Magazine 2002; 7(3): 17.

22. McCracken R, Hanna B, Ennis D, Cantley L, Faulkner D, Kennedy D. The occurrence of semicarbazide in the meat and shell of Bangladeshi fresh-water shrimp. Food Chem 2013; 136(3-4): 1562-7.



Method Development and validation for Determination of Nitrofuran Metabolites

in Food by LC-MS/MS

Thongsuk Payanan and Ladda Kaewklapanyacharoen Bureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences, Tiwanond Road, Nonthaburi 11000, Thailand.

ABSTRACT Method for analysis of metabolites from nitrofuran drugs (furazolidone, furaltadone, nitrofurantoin and nitrofurazone) in food which are mainly employed for the treatment of bacterial diseases in livestock was studied and developed. Nitrofuran drugs are rapidly metabolized to form 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolodinone (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) and semicarbazide (SEM) and also strongly bound to proteins in target animals. Due to their carcinogenicity, nitrofuran drugs were prohibited to use as veterinary drugs in the EU. The development of an analytical method for the simultaneous determination of four nitrofuran metabolites was developed by LC-MS/MS. Sample was digested by diluted hydrochloric acid to release the metabolites from the protein in sample and then a derivatization step was performed. Next, the nitrofuran derivatives have been extracted with ethyl acetate and then defatted with hexane. Afterwards, LC-MS/MS was employed for qualitative and quantitative analysis of these compounds. Limits of detection (LOD) were 0.1 µg/kg for AOZ and AMOZ and 0.5 µg/kg for AHD and SEM. Limit of quantitation (LOQ) were 0.3 µg/kg for AOZ and AMOZ and 1.0 µg/kg for AHD and SEM. Method linear working range was 0.3-5.0 µg/kg with the correlation coefficient ranged from 0.9978-0.9999. The accuracy of method was presented in form of % mean recovery which equals to 65-120% while method precision (0.1-15.2%) was represented with % RSD value. From the validation results, this method was fit for intended use with for the regulations legislated by the Thai Food and Drug Administration and the EU commission. In 2011-2013, the proposed method was performed in meat, offal, aquatic animals, honey, milk powder, egg powder, and flour to inspect the nitrofuran metabolites residue. From 579 samples, the residues were found in 13 samples (2.2%). In 8 aquatic animal samples, AOZ was found in range of less than 1.0 to 2.4 and SEM was found at 2.2 µg/kg. Moreover, SEM was also found in range of less than 1.0 to 3.5 µg/kg in 5 samples of milk powder, egg powder, and flour.

Key words: Nitrofuran metabolites, LC-MS/MS, food




การสรางศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางองสากลผานการพฒนาและการตรวจรบรองระบบคณภาพ

ISO guide 34: 2009

ธระพล คชาชวะ และสภาพร ภมอมร สถำบนชววตถ กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 6 January 2015

บทคดยอ การประกนคณภาพหองปฏบตการอางองในระดบสากล จ�าเปนตองมระบบคณภาพ สถาบนชววตถ เปนหนวยงานควบคมก�ากบของรฐในการประกนคณภาพวคซนและชววตถในหองปฏบตการ เรมจากการตรวจวเคราะหในหองปฏบตการ มระบบคณภาพวาดวยการทดสอบและการสอบเทยบเครองมอ ISO/IEC 17025: 2005 ซงไดพฒนาระบบคณภาพนมาอยางตอเนอง แตในการควบคมคณภาพวคซนนน จ�าเปนตองใชวคซนอางองมาตรฐานเพอควบคมคณภาพผลการทดสอบควบค

ไปกบตวอยางวคซน จงไดสรางศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางองระดบสากลผานการพฒนาระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามมาตรฐาน ISO guide 34: 2009 โดยมการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานหลายชนดในรปผงแหง เพอ

งายตอการจดเกบ ไดนานเนองจากความคงตวสงและทส�าคญงายตอการขนสง มระบบการบรหารจดการวคซนโดยการสรางคลงเกบวคซนมาตรฐานของภมภาค มกระบวนการพฒนาหองปฏบตการอางองดานวคซนโดยการพฒนาบคลากร เพอใหม

ความร ความเขาใจในระบบคณภาพใหม จดท�าเอกสารเพมเตมรวมถงคมอคณภาพ กอนขอรบการตรวจรบรองระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 เปนหนวยงานแรกของกรมวทยาศาสตรการแพทยในป 2557


Capacity Building of International Reference Laboratory Teerapon Kachacheewa and Supaporn Phumiamorn

บทนำาสถาบนชววตถ กรมวทยาศาสตรการแพทย เปนหนวยงานเดยวในประเทศทท�าหนาทควบคมคณภาพ

ผลตภณฑวคซนและชววตถอนๆ โดยเปนหองปฏบตการอางองดานยาชววตถของประเทศ(1) มบทบาททส�าคญคอ

การควบคมร นการผลตโดยเฉพาะวคซนและการตรวจสอบคณภาพทางหองปฏบตการ เพอยนยนวาวคซนม

ความปลอดภยและมประสทธภาพ สามารถกระตนใหรางกายสรางภมคมกนไดดในคนปกต และเนองจากวคซนมลกษณะโครงสรางของโมเลกลทซบซอน มความเบยงเบนในตวสง และวธในการผลตหรอการควบคมคณภาพตองอาศย

วธทางชววธ(2- 4) ทมความเบยงเบนสงเชนกน แมจะปฏบตดวยนกวเคราะห หองปฏบตการและเครองมอเดยวกน

ผลการวเคราะหกยงมความเบยงเบนคอนขางมาก ตองมการควบคมก�ากบทคอนขางเขมงวด จงจ�าเปนตองมการควบคมรนการผลตกอนจ�าหนาย(5) เพอตรวจสอบวาทกรนการผลตมความปลอดภยและมประสทธภาพเหมอนกบทไดรบอนมตเมอขนทะเบยน โดยเฉพาะการทดสอบทางชววธเพอตรวจสอบคาความแรง (potency) พบวาวคซนแตละชนดมวธทจ�าเพาะในการทดสอบแตกตางกน แตทกการทดสอบตองอาศยวคซนอางองมาตรฐานในการทดสอบควบคไปกบตวอยางวคซนทกครง เพอควบคมคณภาพชววตถทงในขนตอนของการขนทะเบยน การควบคมรนการผลต

ตลอดจนการเฝาระวงชววตถหลงจ�าหนาย ซงเกยวของกบกระบวนการประกนและควบคมคณภาพชววตถใหเปนไปตามขอก�าหนดขององคการอนามยโลก จะเหนไดวาวคซนอางองมาตรฐานมความส�าคญเพอยนยนวาผลการทดสอบ

ทางหองปฏบตการมความนาเชอถอและสามารถสอบกลบไดในระดบสากล(6) ซงเดมสถาบนชววตถ ไดจดหา จดเตรยมและสอบเทยบคาวคซนอางองมาตรฐานเพอใชในประเทศ นนหมายถงผผลตในประเทศใชวคซนอางองมาตรฐานเดยวกน

ในการควบคมคณภาพวคซนตวอยางทผลตในประเทศ แตเนองจากผผลตวคซนในประเทศมนอย และผลตภณฑ มจ�านวนไมมาก สถาบนชววตถจงมแนวคดในการจดเตรยมชววตถมาตรฐานในระดบภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใต ขนตงแตป 2547 โดยไดรบเงนสนบสนนจากองคการอนามยโลกประจ�าประเทศไทย โดยมวตถประสงคเพอสรางศกยภาพในการชวยเหลอตนเองในระดบภมภาคของหองปฏบตการควบคมคณภาพวคซน (National Control Laboratory, NCL) ปจจบนชววตถมาตรฐานทเปนวคซนมาตรฐานสากล ตองมการสงซอทกป เพอน�ามาใชในการสอบเทยบคามาตรฐานสากล ซงมราคาแพงและบางชนดไมมการจดเตรยมขนโดยหองปฏบตการขององคการอนามยโลก เนองจากเปนวคซนปองกนโรคเฉพาะภมภาค เชน วคซนปองกนโรคไขสมองอกเสบ เจอ (JE vaccine) เปนตนสถาบนชววตถ จงไดพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานขนและพยายามผลกดนใหสามารถน�าไปใชไดในระดบภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตเนองจากการจดเตรยมวคซนมาตรฐานในระดบภมภาค จะเปนแนวทางหนงของ การขยายขดความสามารถของการเปนหองปฏบตการอางองในระดบสากลรวมถงการพฒนาระบบคณภาพทเกยวของกบการผลตวสดอางอง(7) ซงจะเปนการเพมศกยภาพของการเปนหองปฏบตการอางองเชนเดยวกน ดงนนสถาบน

ชววตถ จงพฒนาศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางอง โดยการพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐาน กระบวนการพฒนาหองปฏบตการดานวคซนโดยการพฒนาบคลากร จดท�าเอกสารคณภาพและอนๆ เพอเตรยมพรอมขอการรบรองระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามขอก�าหนด ISO guide 34: 2009

การดำาเนนการ1. พฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐาน

ไดพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานหลายชนด โดยการพฒนาการจดเตรยมจากเดมในรปของเหลวเปนรปผงแหง เชน วคซนอางองมาตรฐานส�าหรบวคซนคางทม(9) บซจ(10) หด หดเยอรมน และไวรสโรตาโดยปรบสวนประกอบใหไดองคประกอบทเหมาะสมตอการจดเกบในระยะยาว โดยการควบคมคณภาพกอนและหลงการท�าแหงไดแก การศกษาคณลกษณะทางกายภาพของผงแหงทได การชงหาน�าหนกกอนและหลงการบรรจ การตรวจหาปรมาณความชนทหลงเหลอหลงการท�าแหง การตรวจสอบความสามารถในการละลาย การวดคาความเปนกรดดาง (pH) กอนและหลงการบรรจ รวมถงการศกษาคาความแรง และความคงตวของวคซนอางองมาตรฐาน



การสรางศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางองสากลผานการพฒนา ธระพล คชาชวะ และสภาพร ภมอมร

2. กระบวนการพฒนาหองปฏบตการอางองดานวคซนและการพฒนาเพอรองรบระบบคณภาพวาดวยการเปน ผผลตวสดอางอง

ด�าเนนการพฒนาหองปฏบตการอางองดานวคซนหลายดานพรอมดวยการพฒนาศกยภาพของหนวยงาน โดยมจดประสงคเพอรองรบระบบคณภาพใหมทวาดวยการผลตวสดอางองตามขอก�าหนด ISO guide 34: 2009 ดงน

2.1 การพฒนาบคลากร โดยสงเสรมใหบคลากรไดศกษาทบทวนระบบคณภาพในหลายดาน เชน

ระบบคณภาพ ISO/IEC 17025: 2005(8)ระบบคณภาพวาดวยการบรหารจดการ ISO 9001: 2008/2015 หลกปฏบตทด

ในการผลตยาชววตถ (Good Manufacturer Practice) และการศกษาระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางอง ตามขอก�าหนด ISO guide 34: 2009 ไดเชญผเชยวชาญภายนอกทมประสบการณมาบรรยาย เพอใหบคลากรได เรยนรระบบคณภาพจากผมประสบการณจรง รวมถงไดเขารวมการสมมนาทงภาคบรรยายและการอบรมเชงปฏบตการ นอกจากนบคลากรทเกยวของยงไดเรยนรตามขอก�าหนดมาตรฐาน ISO guide 35: 2006 และผานการอบรมเชงปฏบตการ “เรองมาตรฐาน ISO guide 34, ISO guide 35 และ ISO 13528” ความรทไดจากระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 ไดน�ามาศกษาเปรยบเทยบขอก�าหนด ISO/IEC 17025: 2005 กบ ISO guide 34: 2009 เพอดความ

แตกตางของขอก�าหนดกอนด�าเนนการจดท�าเอกสารคณภาพเพมเตมเพอใหสอดคลองกบระบบ ISO guide 34: 20092.2 ด�าเนนการสรางอาคารคลงเกบวคซนของภมภาค ไดเสนอโครงการจดเตรยมคลงเกบวคซนของภมภาค

ตอสถาบนวคซนแหงชาต (มหาชน) โดยไดรบเงนสนบสนนงบประมาณจ�านวน 7.8 ลานบาท ในป 2556 ซงโครงการนไดถกบรรจไวในวาระแหงชาตดานวคซนโดยไดรบความเหนชอบจากคณะรฐมนตร เมอวนท 18 มกราคม

2554 ซงมสถาบนวคซนแหงชาตท�าหนาทประสานและตดตามความกาวหนาของโครงการอยางตอเนอง การกอสราง ไดด�าเนนการแลวเสรจในเดอนกรกฎาคมป 2557 เปนอาคาร 2 ชน ประกอบดวยพนทส�าหรบกอสราง (วดตามแนวหลงคา) วดตามสวนทยาวทสด 26.88 เมตร × สวนทกวางทสด 9.35 เมตร รวม 251.328 ตารางเมตร พนทใชสอย (วดพนทภายในรวมหองแชแขง) กวาง 5 เมตร × ยาว 20 เมตร อาคาร 2 ชน รวม 200 ตารางเมตร สวนปรมาตรหองแชแขง (วดปรมาตรภายใน) กวาง 5 เมตร × ยาว 10 เมตรสง 2.5 เมตร รวมพนทใชสอย 125 ตารางเมตร (ภาพท 1)

ภาพท 1 อาคารคลงวคซนมาตรฐานของภมภาค



2.3 จดท�าคมอควบคมคณภาพการผลตชววตถอางองมาตรฐาน ฉบบภาษาไทยครงแรกเมอวนท 23 กรกฎาคม 2555 และมการปรบ ทบทวนและเพมเตมหลงจากไดรบการตรวจตดตามทงภายในและภายนอก

โดยแกไขเพมเตม ครงท 1 เมอวนท 20 พฤศจกายน 2555 แกไขครงท 2 เมอวนท 20 สงหาคม 2556 แกไขครงท 3 เมอวนท 15 ตลาคม 2556 และแกไขครงลาสด เมอวนท 8 กนยายน 2557 หลงไดรบการตรวจประเมนจรง เพอใหเนอหามความสอดคลองกบระบบขอก�าหนด ISO guide 34 มากยงขน

2.4 จดท�าเอกสารคณภาพวาดวยวธมาตรฐานการปฏบตงาน (Standard Operating Procedure, SOP) และแบบฟอรมการบนทกผลการปฏบตงาน (Worksheet, WS) เพมเตมในหลายฉบบใหสอดคลองกบขอก�าหนดของ ISO guide 34: 2009 มากยงขนรวมทงสน 13 ฉบบ

2.5 การจดท�าฐานขอมลระบบคณภาพในหองปฏบตการด�าเนนการจดท�าฐานขอมลการสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตร ฐานขอมลการประชมฝกอบรม

สมมนาดงานและฐานขอมลเอกสารมาตรฐานการปฏบตงาน เพอใหสามารถตรวจสอบและตดตามขอมลทเปนปจจบน

ในระบบคณภาพ

3. การขอการรบรองระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามขอกำาหนด ISO guide 34: 2009ไดด�าเนนการขอรบรองระบบคณภาพตามมาตรฐาน ISO guide 34: 2009 ในป 2557 โดยขอ

การรบรองวคซนอางองมาตรฐานส�าหรบตรวจสอบคณภาพวคซนคางทม ตอส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย ซงเปนองคกรทท�าหนาทใหการรบรองความสามารถหองปฏบตการดานการแพทย

และสาธารณสข และลงนามในขอตกลงวาดวยการยอมรบรวมดานการรบรองกบองคกรภมภาคเอเชยแปซฟก วาดวยการรบรองหองปฏบตการ (Asia Pacific Laboratory Accreditation Cooperation, APLAC) และในระดบสากล

กบองคกรระหวางประเทศวาดวยการรบรองหองปฏบตการ (International Laboratory Accreditation

Cooperation, ILAC) สถาบนชววตถ ถอเปนหองปฏบตการแรกของกรมฯ ทยนขอการรบรองตามมาตรฐาน ISO guide 34: 2009 โดยไดรบการตรวจประเมนในวนท 10 และ 12 มถนายน 2557 รวม 2 วน โดยผตรวจ ประเมนเปนบคลากรภายนอกกรมวทยาศาสตรการแพทย ซงขอบกพรองและขอสงเกตทไดรบจะน�ามาปรบปรงแกไข

เพอใหระบบมความสมบรณมากยงขน

ผลการดำาเนนการ1. พฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐาน

การจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานในรปผงแหง เปนการท�าแหงแบบเยอกแขง เพอใหวคซนอางองมาตรฐานนนสามารถเกบไดนาน มปรมาณมากเพยงพอตอการใชงานในระยะยาว โดยวคซนทจดเตรยมขนนนมาจากวคซน

อางองมาตรฐานสากลจากหองปฏบตการขององคการอนามยโลก ซงน�ามาพฒนาการผลตและจดเตรยมวคซนมาตรฐานในรปผงแหงตงแตป 2553 (ตารางท 2) โดยจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานส�าหรบวคซนปองกนโรคคางทมและตพมพในวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยในป 2554(9) จากนนในป 2555-2557 ไดพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานส�าหรบตรวจคณภาพวคซนบซจ หด หดเยอรมนและไวรสโรตา ตามล�าดบ ซงสวนใหญอยระหวาง การศกษาความคงตวในระยะยาว เชน วคซนอางองมาตรฐานส�าหรบตรวจสอบคณภาพวคซนปองกนโรคหด และ ระยะสน เชน วคซนอางองมาตรฐานส�าหรบตรวจสอบคณภาพวคซนปองกนโรคหดเยอรมนและไวรสโรตา ยกเวนวคซนอางองมาตรฐานส�าหรบตรวจสอบคณภาพวคซนปองกนโรคคางทมและบซจไดผานการศกษาความคงตวระยะยาวแลวและตพมพในวารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยและวารสารวชาการสาธารณสข(9, 10) ซงส�าหรบวคซนอางองมาตรฐาน




ส�าหรบตรวจสอบคณภาพวคซนปองกนโรคบซจไดรบรางวลผลงานดเดนจากการประชมวชาการประจ�าปของส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาในป 2556 (ตารางท 2)

ตารางท 2 การพฒนาศกยภาพของการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐาน

ปองกนโรคคางทม 2553 ตรวจตดตามเปนระยะๆ กรมวทยาศาสตรการแพทยป 2554ปองกนโรควณโรค 2554 ตรวจตดตามเปนระยะๆ วชาการสาธารณสขป 2557*ปองกนโรคหด 2556 ความคงตว ระยะยาว อยระหวางการพจารณาตพมพปองกนโรคหดเยอรมน 2557 ความคงตว ระยะสน -ปองกนโรคอจจาระรวงใน 2557 ความคงตว ระยะสน -เดกแรกเกดจากไวรสโรตา

วคซนอางองมาตรฐานใชส�าหรบการควบคมคณภาพ

ของวคซนอยระหวางการศกษา ตพมพในวารสารปทผลต

* ไดน�าเสนอผลงานวชาการทส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยาในป 2556 และไดรบรางวลผลงานดเดน

2. กระบวนการพฒนาหองปฏบตการอางองดานวคซนและการพฒนาเพอรองรบระบบคณภาพวาดวยการเปน ผผลตวสดอางอง

จากการพฒนาบคลากรใหมความรระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 เพอรองรบการตรวจประเมน

ในป 2557 นน ไดมการจดเตรยมเอกสารเพมเตมใหสอดคลองกบระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 โดยการทบทวน

เปรยบเทยบกบระบบ ISO/IEC 17025: 2005 ทด�าเนนการอยในหองปฏบตการ (ตารางท 3) พบวามเอกสาร ทตองด�าเนนการเพมเตมทแตกตางจากระบบ ISO/IEC 17025: 2005 อย 3 ขอหลกคอ 1) เรองของค�าศพทและ ค�าจ�ากดความทเปนไปตามระบบคณภาพทเกยวของกบ ISO guide 34: 2009 (ISO/IEC 17000, ISO/IEC 17025, ISO guide 30, ISO guide 9000 และ ISO/IEC guide 99) ไดแกผผลตวสดอางอง ผรบเหมาชวง การผลตวสดอางองวสดอางองรบรอง ความสมพนธของวสดอางอง การสอบกลบไดทางมาตรวทยาและความไมแนนอนของการวด

2) การควบคมงานและหรอวสดอางองทไมเปนไปตามขอก�าหนด 3) ขอก�าหนดดานการผลตและวชาการ ไดแก ขอก�าหนดทวไปทครอบคลมถงการผลตวสดอางองทไดรบการรบรองและทไมไดรบการรบรอง ผ รบเหมาชวง การวางแผนการผลต การจดการวสดและการจดเกบ กระบวนการผลตวสด การประเมนผลขอมล การประเมนความเปนเนอเดยวกน การประเมนความคงตว คณลกษณะ การก�าหนดคาคณสมบตและความไมแนนอน เอกสารและ ใบรบรองส�าหรบผใช และการบรการจดสง

3. การขอการรบรองระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามขอกำาหนด ISO guide 34: 2009สถาบนชววตถ ไดรบการตรวจประเมนระบบคณภาพตามมาตรฐาน ISO guide 34: 2009 ในป

พ.ศ. 2557 โดยมผเชยวชาญจากภายนอกกรมวทยาศาสตรการแพทย มาเปนผตรวจประเมน ในระยะเวลา 2 วน

พบวามขอบกพรองจ�านวน 6 ขอ (ตารางท 4) และขอสงเกตจ�านวน 6 ขอ (ตารางท 5) ขอบกพรองและขอสงเกตทไดรบ

มการแกไขและสงใหกบส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทยเรยบรอยแลวในเดอนกนยายน 2557 รายละเอยดการแกไขตามตารางท 6 ส�าหรบการแกไขขอบกพรองและตารางท 7 ส�าหรบการแกไขขอสงเกต



1. ขอบขาย : ขอก�าหนดครอบคลมการทดสอบและ 1. ขอบขาย : ขอก�าหนดครอบคลมถงการผลตวสดอางอง การสอบเทยบเครองมอ

2. เอกสารอางอง : ISO/IEC 17000 และ VIM 2. เอกสารอางอง : ครอบคลมขอก�าหนด ISO/IEC 17025, ISO guide 30, 31 และ 35 รวมถง ISO guide 98-3, 99, ISO 9000, 10012, 15189 และ 17000

3. ค�าศพทและค�าจ�ากดความ : ISO/IEC 3. ค�าศพทและค�าจ�ากดความ: เปนไปตาม ISO/IEC 17000, 17000 และ VIM ISO/ IEC 17025, ISO guide 30 และ 35, ISO 9000 และ ISO/IEC guide 99 3.1 ผผลตวสดอางอง (Reference material producer) 3.2 ผรบเหมาชวง (Subcontractors) 3.3 การผลตวสดอางอง (Production of a reference material) 3.4 วสดอางอง (Reference material) 3.5 วสดอางองรบรอง (Certified Reference material) 3.6 ความสมพนธของวสดอางอง (Commutability of a reference material) 3.7 การสอบยอนกลบทางมาตรวทยา(Metrological traceability) 3.8 ความไมแนนอนของการวด (Measurement uncertainty)

4.9 การควบคมงานทดสอบและหรอสอบเทยบทไมเปน 4.9 การควบคมงานและหรอวสดอางองทไมเปนไปตามขอ ไปตามขอก�าหนด ก�าหนด

5. ขอก�าหนดดานวชาการ 5. ขอก�าหนดดานการผลตและวชาการ

5.1 ทวไป: ขอก�าหนดวาดวยการวดความถกตองและ 5.1 ทวไป: ขอก�าหนดจะครอบคลมถงการผลตวสดอางองท ความนาเชอถอของการวเคราะหและหรอการสอบเทยบ ไดรบการรบรองและทไมไดรบการรบรอง เครองมอ รวมถงการฝกอบรมบคลากรและการก�าหนด คณลกษณะบคลากร 5.3 ผรบเหมาชวง

5.4 การวางแผนการผลต

5.7 การจดการวสดและการจดเกบ

5.8 กระบวนการผลตวสด

5.11 การประเมนผลขอมล

5.13 การประเมนความเปนเนอเดยวกน

5.14 การประเมนความคงตว

5.15 คณลกษณะ

5.16 การก�าหนดคาคณสมบตและความไมแนนอน

5.17 เอกสารและใบรบรองส�าหรบผใช

5.18 การบรการจดสง

ตารางท 3 การเปรยบเทยบขอก�าหนดระหวางระบบคณภาพ ISO/IEC 17025: 2005 กบ ISO guide 34: 2009

หวขอ ขอก�าหนด ISO/IEC 17025: 2005 หวขอ ขอก�าหนด ISO guide 34: 2009




1. ขอมลผลการฝกอบรมบคลากรใหม ส�าหรบการผลตสารชววตถมาตรฐานอางอง 1 ตามหนงสอท สธ 0603/- ลงวนท 1 สงหาคม 2554 มเกณฑการประเมนผล และการอบรม เรองความร ความเขาใจทางสถตไมเหมาะสม

2. เอกสาร SOP 03 04 017 มรายละเอยดไมครอบคลมตามขอก�าหนด ISO/IEC 1 17025: 2005 ดงน 1. หนา 1/7 ไมไดระบวธการตรวจวาเปน Membrane filtration หรอ Direct inoculation อยางชดเจนในหวขอใหญ 2. หนา 2/7 ขอ 5. หลกการ บรรทดท 3 “…ชววตถอางองมาตรฐานนน ปลอดเชอ จะไมพบตะกอนขนของอาหารเลยงเชอ” ค�าวา “ตะกอน” ไมสอถงการเจรญเตบโต ของเชอทวไป ซงอาจจะขนแตไมมตะกอน 3. หนา 4/7 ขอ 10.6 Negative control มรายละเอยดไมเหมาะสม ไดแก 3.1 ตารางท 1 ไมพบการระบจ�านวนตวอยางททดสอบและ 3.2 ไมพบการทดสอบ Presence of antimicrobial activity 3. การควบคมเอกสารและขอมล ไมถกตอง ดงน 1 1. เอกสาร SOP 03 04 014 เรอง Preparation and calibration of working reference standard preparation for mumps vaccine มรายละเอยดทจ�าเปน และส�าคญไมครบถวนตามการปฏบตงานจรง 2. WS 03 04 029 เรอง Stability study of working reference standard preparation มเนอหาในแตละชวงไมสอดคลองกน เชน การก�าหนดชวงเวลากบ การศกษา Stability เปนตน 3. ไมพบวธ/ขนตอนการวด pH ของ working reference standard preparation ทผลตขน

4. ไมพบ Technical record ทเปนขอมลดบ (First primary data) ในการตรวจวดคา pH 1

5. การท�า Homogeneity ในขนตอนการสมตวอยาง ไมเปนไปตามเอกสาร 1 SOP 03 04 031 และไมพบ Technical record ในการสมตวอยาง

6. ไมพบเกณฑการก�าหนดคา pH (Assignment of property value) 1

ตารางท 4 ขอบกพรองทไดรบจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009

ล�าดบท รายละเอยดขอบกพรองทพบ จ�านวน (เรอง)



ตารางท 5 ขอสงเกตทพบจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009

ล�าดบท รายละเอยดขอขอสงเกตทพบ จ�านวน (เรอง)

1. ไมพบ Validation data ทสนบสนนการด�าเนนการ การขนสงชววตถมาตรฐานอางอง 1 ตามเอกสาร SOP 03 04 032

2. การทบทวนค�าขอ ขอเสนอ และขอสญญา ในเอกสาร QCM บทท 5 และ SOP 03 00 027 1 ไมมการระบ

3. การประชม Management review ตามขอก�าหนด ISO guide 34: 2009 1 ไมครอบคลมวาระ Management system และ Production process มแตการพจารณาเฉพาะทเกยวกบขอบกพรองจากการท�า Internal audit

4. สถานทและสภาวะแวดลอมควรปรบปรง พบหองปลอดเชอ (Cleanroom) หมายเลข 1 214/1 และ 214/2 ทใชส�าหรบการเตรยมวสดอางอง WRP (Working reference preparation) ส�าหรบ Mumps vaccine เปนหองทใชในการวเคราะหหาความแรง พสจนเอกลกษณ ความเปนเนอเดยวกน ความคงตว การสอบเทยบ งานวจยและ พฒนาวคซนชนดอน และผปฏบตงานคนหนง ท�างานกบไวรสหลายชนด หลายผลตภณฑ จงควรตองแสดงใหเหนระบบประกนคณภาพ ทมมาตรการควบคมไมใหเกดขอผดพลาด จากบคลากรจากการปนเปอน และจากการใชหอง Cleanroom ทมากเกนไป 5. Material processing (การด�าเนนงานการผลตวสดอางอง) ควรแกไขดงน 1 1. คมอคณภาพ QCM บทท 23 เรอง กระบวนการตรวจรบวสด หวขอและเนอหา ไมครอบคลมตามขอก�าหนด 2. SOP 03 04 014 เรอง การเตรยมและการสอบเทยบ WRP ฉบบแกไขครงท 7 2.1 หนา 1/9 ขอ 4 นยามและค�ายอ ขอ 4.4 CCID50 (Cell culture infective dose) ไมมค�าวา “50%” ในค�าอธบาย 2.2 หนา 2/9 บรรทดแรก “และค�านวณหาคาเฉลย (Geometric mean; G.M.)…” ไมมค�าวา “เรขาคณต” หลงค�าวาคาเฉลย 2.3 หนา 4/9 ขอ 10 วธด�าเนนการ ไมพบ - ขอ 10.1 การประมาณจ�านวนเซลลและการระบขนาดของ Tissue culture flasks ทใชกบการผลต WRP และใชกบ Control ซงแตกตางกน - ขอ 10.4 Multiplicity of infection (MOI) (จ�านวนไวรส/ จ�านวนเซลล) โดยประมาณ 2.4 หนา 5/9 ขอ 10.9.3 ถง 10.9.4 ไมพบขนตอนการท�าใหเกด Homogeneity 2.5 หนา 6/9 ขอ 10.10.1 “เตม Maintenance medium… ทกหลม” ไมไดระบวา ใหเตมในภาชนะอะไร

6. เอกสาร SOP 03 04 018 หนา 3/6 ขอ 10.1.1 กลาววา Homogeneity ของงานดาน 1 Cell culture ตองมคา %CV < 25% แตในทางปฏบตการตรวจ Homogeneity ตามเอกสาร SOP 03 04 031 ใชการเปรยบเทยบตามตาราง One-way ANOVA




1. ขอมลผลการฝกอบรมบคลากรใหม ส�าหรบ 1. การขยายผล : ไมม การผลตสารชววตถมาตรฐานอางอง ตาม 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม หนงสอท สธ 0603/- ลงวนท 1 สงหาคม 3. การแกไข : ทางกลมชววตถมาตรฐานไดท�าการ 2554 มเกณฑการประเมนผล และการอบรม แกไข SOP การฝกอบรมบคลากรใหมส�าหรบ

เรองความร ความเขาใจทางสถตไมเหมาะสม การผลตสารชววตถมาตรฐานอางอง โดยไดเพม รายละเอยดในการฝกอบรมการตรวจวเคราะหทาง หองปฏบตการเฉพาะดาน โดยมการก�าหนดจ�านวน

ครงการทดสอบใหชดเจนขน 4. การปองกน : ใหความรความเขาใจกบเจาหนาทในการ ใชสถตเพอวเคราะหขอมลหาคาเบยงเบนมาตรฐาน

ตองมผลการทดสอบอยางนอย 3 คาและใหปฏบต ตาม SOP 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

2. Sterility test for mumps vaccine 1. การขยายผล : ไมม ตามเอกสาร SOP 03 04 017 มรายละเอยด 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม ไมครอบคลมตามขอก�าหนด ISO/ IEC 3. การแกไข : ท�าการทบทวน แกไข SOP 03 04 017 17025: 2005 ดงน ฉบบแกไขครงท 5 โดยไดแกไขดงน 1. หนา 1/7 ไมไดระบวธการตรวจวาเปน 1. เปลยนชอเอกสารโดยไดระบวธการตรวจสอบ Membrane filtration หรอ Direct ความปราศจากเชอวาใชวธ direct inoculation inoculation อยางชดเจนในหวขอใหญ หนา 1 of 7 2. หนา 2/7 ขอ 5. หลกการ บรรทดท 3 2. แกไขตดค�าวา “ตะกอน” ออก ใชเปน “ความขน “…ชววตถมาตรฐานอางองนน ปลอดเชอ ของอาหารเลยงเชอ” ขอ 5.0 หลกการ และขอ 14 จะไมพบตะกอนขนของอาหารเลยงเชอ” การรายงานผล ค�าวา “ตะกอน” ไมสอถงการเจรญเตบโต 3. negative control ไดเพมรายละเอยดเพมเตม ของเชอทวไป ซงอาจจะขนแตไมมตะกอน เกยวกบตวอยางทจะตรวจสอบเปน negative 3. หนา 4/7 ขอ 10.6 Negative control control คอใช diluents หรออาหารเลยงเซลล มรายละเอยดไมเหมาะสม ไดแก และ cell fluid ทไดจาก flask cell control 3.1 ตารางท 1 ไมพบการระบจ�านวน ในขนตอนการจดเตรยมชววตถมาตรฐานมาเปน ตวอยางททดสอบและ ตวอยาง negative control ขอ 10.7 3.2 ไมพบการทดสอบ Presence of - ไดเพมตารางแสดงจ�านวนตวอยางทสมมาเพอ antimicrobial activity ตรวจสอบความปราศจากเชอตารางท 1 - ไดท�าการทดสอบ Growth inhibitory effect ของ WRP. Of Mumps vaccine ทปรมาตร สงตรวจ 0.5 ml/cryotube วาเมอทดสอบดวย

ล�าดบท รายละเอยดขอบกพรอง การด�าเนนการแกไข

ตารางท 6 การแกไขขอบกพรองจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009



อาหารเลยงเชอส�าหรบทดสอบความปราศจากเชอ

ปรมาตร 25 ml พบวาปรมาณของ antibiotic ในตวอยางมนอยจนไมสามารถออกฤทธยบยง การเจรญเตบโตของเชอได (เอกสารแนบ 6) 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

3. การควบคมเอกสารและขอมล ไมถกตอง ดงน 1. การขยายผล : ไมม 1. เอกสาร SOP 03 04 014 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : มการใชเอกสารเปน

เรอง Preparation and calibration of คมอหลายฉบบ working reference standard preparation for mumps vaccine 3. การแกไข : รวบรวมเนอหาในคมอฉบบตางๆ ไว มรายละเอยดทจ�าเปนและส�าคญไมครบถวน ใน SOP ฉบบเดยวและทบทวนแกไข ดงน ตามการปฏบตงานจรง 1. ไดมการทบทวนและแกไข SOP 03 04 014 2. WS 03 04 029 เรอง Stability study ฉบบแกไขครงท 8 โดยมการเพมรายละเอยด

of working reference standard วธด�าเนนการดงน preparation มเนอหาในแตละชวง - เพมรายละเอยดการวางแผนการผลต

ไมสอดคลองกน เชน การก�าหนดชวงเวลากบ ชววตถมาตรฐานอางองขอ 10.1 การศกษา Stability เปนตน - เพมรายละเอยดเกยวกบขนาด flask, 3. ไมพบวธ/ขนตอนการวด pH ของ working ปรมาณเซลล/ขนาด flask ใหชดเจน

reference standard preparation ทผลตขน ขอ 10.2 - เพมรายละเอยดเกยวกบจ�านวนไวรสและ establish titer ของสารมาตรฐานขอ 10.3 - ก�าหนดคา MOI ของไวรสคางทม - เพมขนตอนการท�าใหเกดความเปนเนอ

เดยวกนขอ 10.5 - เพมรายละเอยดการตรวจสอบปนเปอน

จากสวนใสทไดจาก flask ของ cell control ขอ 10.10.6 - เพมขนตอนการตรวจสอบเอกลกษณ

ขอ 10.10.7 - เพมขนตอนการตรวจสอบความเปนเนอ

เดยวกน 10.10.9 - เพมขนตอนการจดท�าเอกสารรบรอง คณสมบตและวธการใชงานชววตถมาตรฐาน อางองขอ 10.11.8


ตารางท 6 การแกไขขอบกพรองจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009 (ตอ)






- เพมขนตอนการตรวจสอบความคงตวของ ชววตถมาตรฐานอางองขอ 10.11.9 - เพมแผนภมการผลตชววตถมาตรฐานส�าหรบ

วคซนปองกนโรคคางทมหนา 8 of 13 – 9 of 13 2. ไดมการปรบแก WS ใหสะดวกในการปฏบตงาน

(เอกสารแนบ 13) 3. ไดเพมรายละเอยดขนตอนการวด pH โดย

ใหปฏบตตาม SOP 03 04 031 การศกษาความ

เปนเนอเดยวกนของชววตถมาตรฐานอางอง ทงเรอง จ�านวนตวอยางทสม การสมตวอยาง ขอ 10.10.5 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

4. ไมพบ Technical record ทเปนขอมลดบ 1. การขยายผล : ไมม (First primary data) ในการตรวจวดคา pH 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมมการบนทกผล

การตรวจวดคา pH ใน WS 03 02 009 3. การแกไข : ก�าหนดใหการตรวจ pH ไวในคมอ

การปฏบตงานการเตรยมและการสอบเทยบวคซน

อางองมาตรฐานส�าหรบวคซนปองกนโรคคางทม

(SOP 03 04 014) ฉบบแกไขครงท 9 และเนนย�า ในผปฏบตงานบนทกผลการทดสอบในแบบบนทก

ผลการทดสอบ WS 03 02 009 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

5. การท�า Homogeneity ในขนตอนการสม 1. การขยายผล : ไมม ตวอยาง ไมเปนไปตามเอกสาร SOP 03 04 031 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : และไมพบ Technical record ในการสมตวอยาง 3. การแกไข : ปรบแก WS 03 04 031 ใหเพมเตม

รายละเอยดในการสมตวอยาง 4. การปองกน : ใหปฏบตตาม SOP 03 04 031 อยางเครงครด 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม



1. ไมพบ Validation data ทสนบสนนการ 1. การขยายผล : ท�าการศกษาการใชน�าแขงแหง ด�าเนนการ การขนสงชววตถมาตรฐานอางอง เพอใชในการขนสงชววตถ ตามเอกสาร SOP 03 04 032 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : 3. การแกไข : ศกษาและรายงานผลการศกษาการใช น�าแขงแหงเพอใชในการขนสงชววตถ โดยใชเปน

ตวแทนของชววตถชนดตางๆ ทตองขนสงทอณหภมน 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

2. การทบทวนค�าขอ ขอเสนอ และขอสญญา 1. การขยายผล : ทบทวนเอกสารคมอคณภาพ ในเอกสาร QCM บทท 5 และ SOP 03 00 027 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม ไมมการระบ 3. การแกไข : เพมเนอหาบทท 5 การทบทวนค�าขอ ขอเสนอ และขอสญญาใหชดเจน 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

3. การประชม Management review ตามขอ 1. การขยายผล : ไมม ก�าหนด ISO guide 34: 2009 ไมครอบคลมวาระ 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม Management system และ Production 3. การแกไข : ทบทวนคมอการปฏบตงานการทบทวน process มแตการพจารณาเฉพาะทเกยวกบ การบรหาร (Management Review)

ตารางท 7 การแกไขขอสงเกตจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009

ล�าดบท รายละเอยดขอสงเกตทพบ จ�านวน (เรอง)



6. ไมพบเกณฑการก�าหนดคา pH (Assignment 1. การขยายผล : ไมม of property value) 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ทดสอบ pH เพอเกบ

เปนขอมลประกอบเทานน จงไมไดก�าหนดไว ในเกณฑ 3. การแกไข : ก�าหนดชวงคา pH ทเหมาะส�าหรบ

วคซนคางทมเปน 6.0 - 8.0 ในขอ 10.10.4 SOP 03 04 014 ฉบบแกไขครงท 9 และมการก�าหนด

ใน production plan 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม




ตารางท 7 การแกไขขอสงเกตจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009 (ตอ)


ขอบกพรองจากการท�า Internal audit (SOP 03 00 009) โดยเพมการพจารณาในสวน

ของ ISO Guide 34: 2009 ดวย สวนของ Production process จะใหพจารณาในหวขอ 2.1 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

4 สถานทและสภาวะแวดลอมควรปรบปรง พบ 1. การขยายผล : ไมม หองปลอดเชอ (Cleanroom) หมายเลข 214/1 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม และ 214/2 ทใชส�าหรบการเตรยมวสดอางอง 3. การแกไข : ปญหาปรมาณหองปฏบตทมตองใชงาน

WRP (Working reference preparation) ตรวจสอบผลตภณฑหลายชนดนน ทางสถาบนฯ ส�าหรบ Mumps vaccine เปนหองทใชในการ มาตรการจดการดงน วเคราะหหาความแรง พสจนเอกลกษณ ความเปน - ไดจดท�าตารางจองหองปฏบต และขณะปฏบตการ เนอเดยวกน ความคงตว การสอบเทยบ งานวจย จะไมมการปฏบตงานรวมกบของผลตภณฑ และพฒนาวคซนชนดอน และผปฏบตงานคนหนง หลายๆ ชนดในเวลาเดยวกน จงไมมปญหาเรอง ท�างานกบไวรสหลายชนด หลายผลตภณฑ จงควร cross contamination ตองแสดงใหเหนระบบประกนคณภาพ ทมมาตรการ - มการตรวจสอบประสทธภาพปลอดเชอวายงคง ควบคมไมใหเกดขอผดพลาดจากบคลากร ท�างานไดอยางเปนปกต และกอนเรมปฏบตงาน จากการปนเปอน และจากการใชหอง ผปฏบตงานตองมการเปด UV ตปลอดเชอ Cleanroom ทมากเกนไป และท�าความสะอาดดวย 70% alcohol - มการจดเตรยม SOP ไวในพนทปฏบตงาน

เพอใหผปฏบตงานไดดขณะปฏบตงาน ท�าให ไมเกดความสบสนถงแมผ ปฏบตงานจะม หนาทรบผดชอบผลตภณฑหลายชนด 4. การปองกน : ไมม 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม

5. Material processing (การด�าเนนงานการผลต 1. การขยายผล : ไมม วสดอางอง) ควรแกไขดงน 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม 1. เอกสารคมอคณภาพ QCM บทท 23 3. การแกไข : 1. มการทบทวนและแกไข คมอคณภาพ

เรอง กระบวนการตรวจรบวสด หวขอและ การผลตชววตถมาตรฐานอางอง ฉบบแกไข เนอหา ไมครอบคลมตามขอก�าหนด ครงท 3 บทท 23 กระบวนการผลต 2. SOP 03 04 014 เรอง การเตรยมและ 2. มการทบทวน และแกไข SOP 03 04 014 ฉบบ การสอบเทยบ WRP ฉบบแกไขครงท 7 แกไขครงท 8 โดยมการแกไขเพมเตมดงน 2.1 หนา 1/9 ขอ 4 นยามและค�ายอ - เพมเตมรายละเอยด “50%” ในนยามและ ขอ 4.4 CCID50 (Cell culture infective ค�ายอขอ 4.4



ตารางท 7 การแกไขขอสงเกตจากการตรวจประเมน ISO guide 34: 2009 (ตอ)


dose) ไมมค�าวา “50%” ในค�าอธบาย - การใชคาเฉลย ปจจบนใชคาเฉลย (mean) 2.2 หนา 2/9 บรรทดแรก “และค�านวณหา ไมไดใชคาเฉลยเรขาคณต (geometric mean) คาเฉลย (Geometric mean; G.M.)…” ซงแกไขตามค�าแนะน�าของนกสถต ซงไดแกไข ไมมค�าวา “เรขาคณต” หลงค�าวาคาเฉลย รายละเอยดใน SOP 03 04 014 ฉบบแกไข 2.3 หนา 4/9 ขอ 10 วธด�าเนนการ ไมพบ ครงท 8 ไปแลว ขอ 5.0 - ขอ 10.1 การประมาณจ�านวนเซลล - มการเพมรายละเอยดเกยวกบขนาด flask, และการระบขนาดของ Tissue ปรมาณเซลล/ ขนาด flask และก�าหนดคา MOI culture flasks ทใชกบการผลต ใหชดเจน ในวธด�าเนนการ (Procedures) WRP และใชกบ Control ขอ 10.0 ซงแตกตางกน - เพมขนตอนการท�าใหมความเปนเนอเดยวกน - ขอ 10.4 Multiplicity of infection โดยการกวนดวย magnetic stirrer (MOI) (จ�านวนไวรส/ จ�านวนเซลล) ในขอ 10.10.4 โดยประมาณ - มการระบชนดของ plate ใหชดเจนวาเปน

2.4 หนา 5/9 ขอ 10.9.3 ถง 10.9.4 ไมพบ 96-well flat tissue culture plate ในวธ ขนตอนการท�าใหเกด Homogeneity ด�าเนนการ 2.5 หนา 6/9 ขอ 10.10.1 “เตม 4. การปองกน : ไมม Maintenance medium… ทกหลม” 5. การประเมนผลกระทบ : ไมม ไมไดระบวาใหเตมในภาชนะอะไร

6. Homogeneity ตามเอกสาร SOP 03 04 018 1. การขยายผล : ไมม หนา 3/6 ขอ 10.1.1 กลาววา Homogeneity 2. ผลการวเคราะหหาสาเหต : ไมม ของงานดาน Cell culture ตองมคา %CV < 25% 3. การแกไข : ไดมการปรบแก SOP 03 04 018 ฉบบ

แตในทางปฏบตการตรวจ Homogeneity แกไขครงท 5 โดยอางถง SOP 03 04 031 ฉบบ ตามเอกสาร SOP 03 04 031 ใชการเปรยบเทยบ แกไขครงท 3 ตามตาราง One-way ANOVA 4. การปองกน : มการระบการใชสถตในขนตอน

การวางแผนการผลตชววตถมาตรฐาน




วจารณการพฒนาศกยภาพของการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐาน

เดมสถาบนฯ ไดจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานในรปของเหลว ตอมาเมอไดรบการจดสรรงบประมาณ

จดซอเครองท�าแหงในป 2552 จงไดพฒนาการจดเตรยมจากของเหลวมาเปนผงแหง เนองจากมขอดหลายประการ เชน มความสะดวกในการจดเกบ ใหคาความคงตวทสงสามารถเกบไวใชไดนานหลายปและงายตอการขนสง จงไดเรงพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานหลายชนดโดยเฉพาะวคซนทใชในแผนสรางเสรมภมคมกนในประเทศตงแตป 2553 เชน วคซนปองกนโรคคางทม วณโรค หด หดเยอรมน และวคซนทในอนาคตจะน�ามาใชใน

เดกไทย เชน วคซนปองกนโรคอจจาระรวงในเดกแรกเกดไวรสโรตา วคซนทกชนดทพฒนาขนจะถกน�ามาใชเปนวคซนอางองมาตรฐานของประเทศในอนาคต ซงจะตองถกก�าหนดคาความแรงรวมกบผผลตวคซนในประเทศ เชน วคซนปองกน

โรควณโรค คางทม และหด เปนตน นอกจากนเพอรองรบการจดเกบวคซนอางองมาตรฐาน สถาบนฯ ด�าเนนการจดสรางคลงวคซนมาตรฐานของภมภาคสบเนองจากการเสนอใหประเทศไทยเปนแหลงเกบวคซนมาตรฐานในภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใต ในป พ.ศ. 2553 จากการประชม Regional National Control Laboratory Network Meeting ซงในอนาคตอาคารคลงวคซนมาตรฐานจะถกจดเกบไมเพยงแตวคซนอางองมาตรฐานในประเทศเทานน ยงเปน

สถานทจดเกบวคซนอางองมาตรฐานของภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตดวย

กระบวนการพฒนาหองปฏบตการอางองดานวคซนและการพฒนาเพอรองรบระบบคณภาพวาดวยการเปนผผลตวสดอางอง

เอกสารคณภาพไดถกจดท�าขนใหม จ�านวน 13 ฉบบ เพอรองรบระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางอง ISO guide 34: 2009 และรองรบการตรวจประเมนระบบในป 2557 ซงสถาบนชววตถ ถอเปนหนวยงานแรกของ กรมวทยาศาสตรการแพทย ทยนขอการรบรองจากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย โดยใชระยะเวลา 2 ป ในการพฒนาระบบและบคลากร รวมถงการจดท�าฐานขอมลระบบคณภาพ เช น

ฐานขอมลการสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตร ฐานขอมลการประชมฝกอบรม สมมนาดงานและฐานขอมลเอกสารมาตรฐานการปฏบตงาน เปนตน เพอใหสามารถตรวจสอบและตดตามขอมลทเปนปจจบนในระบบคณภาพ รวมทงงายตอการคนหาและการจดเกบทปลอดภย ซงการจดท�าระบบคณภาพใหมขนในหองปฏบตการถอเปนเรองททาทายความสามารถ เพราะตองใชเวลาศกษาท�าความเขาใจพรอมเปรยบเทยบกบระบบคณภาพทด�าเนนการอยคอ ISO/IEC 17025: 2005 เพอศกษาความแตกตางของขอก�าหนด (ตารางท 3) กอนด�าเนนการจดท�าเอกสารเพมเตม

ซงสวนใหญเอกสารทจดเตรยมขนใหม จ�านวน 13 ฉบบ (ตารางท 1) เปนเรองทเกยวของกบการผลตวสดอางอง ทงสน ซงอาจมการจดเตรยมเอกสารเพมเตมหรอแกไขใหสอดคลองกบระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 มากยงขน

หลงการตรวจประเมน

การขอการรบรองระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามขอกำาหนด ISO guide 34:2009ไดด�าเนนการขอรบรองระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 ในป 2557 จากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ

กรมวทยาศาสตรการแพทย เปนการตรวจประเมนการขอรบรองการผลตวคซคางทมอางองมาตรฐาน เนองจาก

ระบบคณภาพ ISO guide 34: 2009 จะเนนในเรองขอก�าหนดวาดวยการจดเตรยมสารมาตรฐานทางเคมเปนหลก

ซงมความแตกตางจากการจดเตรยมสารมาตรฐานทางชวภาพ ทตองใชสงมชวตในการจดเตรยม ดงนนขอก�าหนด

บางขอใน ISO guide 34: 2009 อาจจะไมเหมาะสมตอการน�ามาใชกบสารมาตรฐานทางชวภาพ เชน ขอก�าหนดวาดวยการทดสอบความไมแนนอนของการวด และการทดสอบทางสถต เปนตน ท�าใหตองมการชแจงรายละเอยดและ



ท�าความเขาใจรวมกนระหวางผตรวจประเมนและผรบการตรวจประเมน อยางไรกตาม สถาบนชววตถ ไดพยายามแกไขปรบปรงสงทเปนขอบกพรอง จ�านวน 6 ขอ และขอสงเกต จ�านวน 6 ขอ ใหสอดคลองกบ ISO guide 34: 2009 เพอการพฒนาระบบคณภาพดงกลาว

สรป การพฒนาระบบคณภาพเพอใหไดมาตรฐานเปนการประกนคณภาพของหองปฏบตการใหเปนทยอมรบ

ในระดบสากล สถาบนชววตถ เปนหนวยงานควบคมก�ากบของรฐในการควบคมคณภาพวคซนและชววตถในหองปฏบตการ ไดพฒนาระบบคณภาพหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005 ซงเปนมาตรฐานทยอมรบทวไป

แตในการควบคมคณภาพวคซนนน จ�าเปนตองใชวคซนอางองมาตรฐานเพอควบคมคณภาพผลการทดสอบควบคไปกบตวอยางวคซน สถาบนฯ จงพฒนาการจดเตรยมวคซนอางองมาตรฐานในรปผงแหง เพองายตอการเกบ จดเกบไดนานเนองจากความคงตวสงและทส�าคญงายตอการขนสง และเพอสรางศกยภาพการเปนหองปฏบตการอางองในระดบสากล กระบวนการพฒนาหองปฏบตการดานวคซนโดยการพฒนาบคลากร การจดระบบบรหารจดการวคซนอางองมาตรฐานตลอดจนการจดเตรยมเอกสารคณภาพทเกยวของกบการผลตวสดอางอง เพอขอรบการตรวจรบรองระบบคณภาพวาดวยการผลตวสดอางองตามมาตรฐาน ISO guide 34: 2009 ของประเทศคาดวาจะไดรบการรบรองในป พ.ศ. 2558 ซงจะท�าใหวคซนอางองมาตรฐานทผลตโดยสถาบนชววตถ เปนทยอมรบในระดบภมภาคและสากล

กตตกรรมประกาศขอขอบคณ บคลากรทกทานของสถาบนชววตถ ทไดใหความรวมมอในการพฒนาระบบคณภาพวาดวย

การผลตวสดอางองของสถาบนฯ และขอขอบคณผอ�านวยการสถาบนฯ นางธระนารถ จวะไพศาลพงศ ทสนบสนนใหมการพฒนาศกยภาพการผลตวคซนอางองมาตรฐานและการขอรบการตรวจประเมนตามระบบ ISO guide 34: 2009

เอกสารอางอง 1. กฎกระทรวงแบงสวนราชการกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข พ.ศ. 2552 ราชกจจานเบกษา เลมท 126 ตอนท 98

ก (ลงวนท 28 ธนวาคม 2552) 2. กองชววตถ กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. ขอก�าหนดชววตถ เลมท 1. นนทบร: บรษท กราฟฟคสเปซ จ�ากด;

2541. 3. กองชววตถ กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. ขอก�าหนดชววตถ เลมท 2. นนทบร: บรษท กราฟฟคสเปซ จ�ากด;

2545. 4. Metz B, van den Dobbelsteen G, van Els C, van der Gun J, Levels L, van der Pol L, et al.

Quality-control issues and approaches in vaccine development. Expert Rev Vaccines 2009; 8(2): 227-38. 5. WHO. Training manual: licensing, lot release, laboratory access. Geneva: World Health

Organization; 2001. 6. WHO technical report series no. 932. Annex 2: recommendations for the preparation, characterization

and establishment of international and other biological reference standards (revised 2004). Geneva: World Health Organization; 2006.




7. ISO Guide 34: 2009. General requirements for the competence of reference material procedures. Geneva: International Organization for Standardization; 2009.

8. ISO/IEC 17025: 2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Geneva: International Organization for Standardization; 2005.

9. อศจรรย อาเมน, จรเดช ปจฉม, พรหมฉตร เจรญพฒน, ณฐกานต มงงามทรพย, สภาพร ภมอมร. การศกษาหาสตรต�ารบท เหมาะสมในการท�าแหงวคซนคางทมอางองมาตรฐาน. ว กรมวทย พ 2554; 53(2): 97-112.

10. สภาพร ภมอมร, อศจรรย อาเมน, จรเดช ปจฉม, สรนดดา รวมพร, สกลยาณ ไชยม. การประเมนความคงตวของวคซนบซจชนดผงแหงส�าหรบใชเปนวคซนอางองมาตรฐานในประเทศ. วารสารวชาการสาธารณสข 2557; 23(2): 369-80.



Capacity Building of International Reference Laboratory through

Development and ISO guide 34: 2009 Assessments

Teerapon Kachacheewa and Supaporn Phumiamorn Institute of Boilogical Products, Department of Medical Sciences, Tiwanon Road, Nonthaburi 11000

ABSTRACT Quality system, a major infrastructure of a reference laboratory, the Institute of Biological Products (IBP), as the National Control and Reference Laboratory for biological products, was primarily implemented with the ISO/IEC 17025:2005 for assuring its testing competency. In addition to vaccine quality testing, reference vaccines are significantly required for perceptible analysis. Consequently, the laboratory competency was extended through another quality system, the ISO Guide 34:2009, the requirements for reference materials producer. Several lyophilized reference vaccines have been produced for simple and long storage; and uncomplicated transportation purpose as well due to their good stability. The regional reference vaccines bank was established for well management of the quality system. Staff development for better understanding of knowledge concerned as well as quality manual preparation and documentation have been processed. The IBP was the first organization under the Department of Medical Sciences which requested for ISO Guide 34: 2009 assessment in B.E. 2557.

Key words: reference material producer, ISO Guide 34: 2009




การพฒนาการเปนผดำาเนนการแผนทดสอบความชำานาญการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา

ลดาวลย จงสมานกล กมลวรรณ กนแตง และอจฉรา อยคงส�ำนกคณภำพและควำมปลอดภยอำหำร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 3 April 2015

บทคดยอ การทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาเปนการประเมนความสามารถในการตรวจวเคราะหและพฒนาระบบคณภาพของหองปฏบตการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา หองปฏบตการสวนใหญใชบรการทดสอบความช�านาญจากตางประเทศซงมราคาแพง ปจจบนประเทศไทยมผด�าเนนการเพยง 1-2 ราย และไมครอบคลมรายการตรวจวเคราะหทางจลชววทยาทจ�าเปนดงนนเพอเปนทางเลอกหรอทดแทนการใชบรการจากตางประเทศและเพมศกยภาพของกรมวทยาศาสตรการแพทยในการพฒนาหองปฏบตการ ในป พ.ศ. 2554 ส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร (สคอ.) จงไดเรมโครงการการใหบรการทดสอบ

ความช�านาญทางจลชววทยา โดยในขนแรกไดจดท�าโครงการน�ารองเพอศกษาทดลองเตรยมตวอยางทดสอบความช�านาญและสงตวอยางทดสอบรายการ Salmonella spp. และ Staphylococcus aureus ใหแกหนวยงานตรวจวเคราะหอาหาร ทางจลชววทยาของกรมวทยาศาสตรการแพทย 16 แหง และใหทกหนวยงานรายงานผลการตรวจภายในเวลาทก�าหนด ซง จากผลทไดรบเปนการยนยนวาตวอยางทเตรยมสามารถใชทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาได จงขยายการใหบรการแก หองปฏบตการทงภาครฐและเอกชนอยางตอเนองคอปงบประมาณ 2555 ใหบรการ 2 รายการทดสอบไดแก Salmonella spp. และ S.aureus แตละรายการทดสอบใหบรการรายการละ 2 รอบ รวม 4 รอบ มสมาชกรวม 109 ราย ปงบประมาณ 2556 เพมขอบขายการใหบรการอก 2 รายการทดสอบ ไดแก Listeria monocytogenes และจ�านวนจลนทรยรายการละ 1 รอบ

รวม 4 รอบ มสมาชกรวม 177 ราย และปงบประมาณ 2557 ขยายขอบขายการใหบรการเปน 7 รายการทดสอบ โดยเพมรายการทดสอบจ�านวนจลนทรย, จ�านวน Bacillus cereus, จ�านวน coliforms และจ�านวน Escherichia coli รวม 7 รอบ มสมาชกรวม 356 ราย เฉลยมหองปฏบตการทเขารวมทดสอบฯ ตอรอบเพมขนตามล�าดบคอ ปงบประมาณ 2555-2557 เทากบ

27, 44 และ 51 รายตามล�าดบ ซงหองปฏบตการสมาชกสามารถน�าผลทไดไปประเมนความสามารถในการตรวจวเคราะหและปรบปรงระบบคณภาพของหองปฏบตการ รายการทดสอบทง 7 รายการนไดรบการรบรองความสามารถตามมาตรฐาน

ISO/IEC 17043: 2010 เมอตนป พ.ศ. 2558 การเปนผด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหอาหาร ทางจลชววทยาของ สคอ. เปนการพฒนาและปรบปรงคณภาพหองปฏบตการของประเทศไทยและลดคาใชจายของหองปฏบตการ ตางๆ ในการเขารวมทดสอบความช�านาญกบหนวยงานตางประเทศ


microbiological Proficiency Testing Ladawan Chungsamanukool et al.

บทนำาการทดสอบความช�านาญ (Proficiency Testing, PT) หมายถงการประเมนความสามารถของ

หองปฏบตการในการวเคราะห เปนการเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการตางๆ ทเขารวมในแผนการทดสอบ

ความช�านาญ (Inter-laboratory comparison)(1) โดยผด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญ (PT provider, PTP) จดสงตวอยางทแบงมาจากตวอยางเดยวกนไปยงหองปฏบตการสมาชกในชวงเวลาเดยวกน เพอใหสมาชกตรวจวเคราะหและสงผลภายในระยะเวลาทก�าหนด การเขารวมแผนทดสอบความช�านาญสามารถน�ามาใชชบงคณภาพผลการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการและชบงปญหาของการปฏบตงานทเปนตนเหตท�าใหผลไมสอดคลองกบคาก�าหนด

(assigned value) รวมทงสวนอนๆ ทเกยวของ เชน การรายงานผลทชดเจน การใชหนวยทถกตอง และการสงผลในระยะเวลาทก�าหนด เปนตน

การทดสอบความช�านาญ จดเปนเครองมอส�าคญอยางหนงในการประกนคณภาพผลการทดสอบตาม

มาตรฐานสากล ISO/IEC 17025:2005 ขอ 5.9.1 (b)(2) โดยเปนการประเมนความสามารถของหองปฏบตการ โดยองคกรภายนอก (external quality assessment) และองคกรรบรองความสามารถของหองปฏบตการก�าหนดเปนหลกเกณฑหรอเงอนไขใหหองปฏบตการทประสงคจะขอการรบรองตองมผลการทดสอบน(1) แตเนองจากในปจจบนประเทศไทยม PTP ทางจลชววทยาไมมาก หองปฏบตตรวจวเคราะหอาหารสวนใหญตองเขารวมทดสอบความช�านาญกบหนวยงานในตางประเทศซงมคาใชจายสงมาก ส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร (สคอ.) กรมวทยาศาสตร การแพทย ซงเปนหนวยงานทไดรบการยอมรบในความสามารถดานการตรวจวเคราะหอาหาร และมอ�านาจหนาท ในการใหการสนบสนนและพฒนาระบบคณภาพของหองปฏบตการดานสาธารณสขทงหนวยงานภาครฐและเอกชน(3)

ไดรบการรองขอจากหองปฏบตการตางๆ ใหเตรยมตวอยางส�าหรบเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการและน�าผล

ทไดไปประกอบการยนขอรบการรบรอง ดงนน เพอใหหองปฏบตการทวไปสามารถน�าผลเปรยบเทยบระหวาง หองปฏบตการไปปรบปรงคณภาพการตรวจวเคราะหและยนขอการรบรอง จงได พฒนาการให บรการ ดานการทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาอยางเปนระบบ โดยในขนแรกไดจดท�าโครงการน�ารองเพอทดลองระบบและด�าเนนกจกรรมทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยาในเดอนกนยายน 2554 สมาชก

เรมตนไดแกหองปฏบตการของกรมฯ ทมภารกจดานการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา ซงประกอบดวย

หองปฏบตการในสวนกลาง 2 แหง และศนยวทยาศาสตรการแพทย 14 แหง รายการทดสอบไดแก Salmonella spp. และ Staphylococcus aureus จากนนเดอนพฤศจกายน 2554 สคอ. จงไดด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา โดยใหบรการเตมรปแบบแกสมาชกทงจากภาครฐและเอกชนและน�าระบบมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 มาใช ซงมวตถประสงค คอ 1) เพมศกยภาพดานการเปนผด�าเนนการทดสอบความช�านาญหองปฏบตการดานจลชววทยาของกรมวทยาศาสตรการแพทยและของประเทศ ใหสามารถพงพาตนเองได และทดแทนการน�าเขาจากตางประเทศ ท�าใหประหยดเงนตราของประเทศ 2) พฒนาศกยภาพและเสรมสรางความเขมแขงของ หองปฏบตการวเคราะหอาหารดานจลชววทยาของประเทศไทยใหเปนทยอมรบในระดบสากล

วธการการพฒนาการเปน PTP ทางจลชววทยาเพอใหบรการแกสมาชกทงภาครฐและเอกชน แบงเปน 4 ระยะ

ไดแก การวางแผนขนตน การวางแผนดานการจดการ การด�าเนนการเปน PTP และการด�าเนนการขอรบรองคณภาพ

ตามมาตรฐานสากล ISO/IEC 17043: 2010



การทดสอบความช�านาญทางจลชววทยา ลดาวลย จงสมานกล และคณะ

ระยะท 1: การวางแผนขนตน (Initial planning) เปนการศกษาความพรอมดานเทคนคทางหองปฏบตการ เชน รายการทดสอบและความถหรอรอบการทดสอบ

ทจะใหบรการ ชนดของตวอยางทดสอบ ระดบหรอปรมาณของจลนทรย รวมทงการจดเตรยมตวอยางดวยวธการ ทเหมาะสม เปนตน มขนตอนตางๆ ดงน

1.1 จดตงทมงาน ไดแก นกวทยาศาสตรการแพทยสวนหนง ซงมประสบการณดานการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยาเปนอยางด ไดรบการรบรองความสามารถตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005(2) จากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย

1.2 ส�ารวจและเตรยมความพรอมของสถานท โดยใชพนทของหองปฏบตการตรวจวเคราะหอาหาร ทางจลชววทยา

1.3 ส�ารวจความพรอมของเครองมอ ไดแก เครองท�าใหแหงแบบเยอกแขง (lyophilizer) และวสดอปกรณทจ�าเปนตองใชส�าหรบการท�าแหงเยอกแขง ไดแก ขวดแกวพรอมฝาชนดฆาเชอได (สามารถเขาเครอง autoclave ได) และทนตอความเยนทอณหภมต�าๆ (ต�ากวา -40 องศาเซลเซยส) ส�าหรบเครองมอพนฐานอนๆ ใชเครองมอทมอยในหองปฏบตการ ไดแก autoclave, balance (sensitivity 0.1 กรม), glass bottle with screw cap, glass spreading rod, glass slide, incubator, loop, needle, pH-meter, petri dishes, pipette, safety cabinet, stomacher, stomacher bag, test tube, vortex mixer, water bath

1.4 ศกษาเอกสารเกยวกบขอก�าหนดทวไปของการทดสอบความช�านาญ เชน ISO/IEC 17043: 2010(4), ISO/TS 22117: 2010(5), ISO 13528: 2005(6) เปนตน เพอใหเกดความเขาใจและสามารถจดท�าเอกสารคณภาพ

ใหสอดคลองกบระบบได 1.5 ศกษาคมอการปฏบตงาน เรอง สถตทใชในการทดสอบความช�านาญ(7) (SOP PT 20 T4 401) และ

เลอกใชสถตเฉพาะสวนทเกยวของกบการทดสอบความช�านาญทางจลชววทยา เชน การทดสอบความเบยงเบนภายในตวอยาง (within sample variation) เพอศกษาความแปรปรวน

(variation) หรอความแตกตางของการตรวจวเคราะหซ�าโดยใชสถต Cochran’s test การทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตวของตวอยางทดสอบ โดยทดสอบความเบยงเบน

ระหวางตวอยาง (between sample variation) และวเคราะหความแปรปรวน (One-way ANOVA) การหาคาก�าหนด (assigned value) และ z-score หรอ z′-score เปนตน1.6 ศกษาวธเตรยมตวอยางทดสอบทางจลชววทยาจาก ISO 16140: 2003 / Amd.2011(8)

1.7 ศกษาการสมตวอยางโดยใชโปรแกรมจาก http://www.randomizer.org/form.htm(9)

1.8 จดหาจลนทรยมาตรฐานตางๆ เชน Salmonella Typhimurium (DMST 562), E. coli (DMST 4212), S. aureus (DMST 8840), S. epidermidis (DMST 15505), Listeria monocytogenes (DMST 17303), L. innocua (DMST 9011), B. cereus (DMST 6228) เปนตน แหลงของจลนทรยมาตรฐานคอ ศนยเกบรกษาและรวบรวมสายพนธจลนทรยทางการแพทย สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย โดยจลนทรยทรบมาจะตองทดสอบกอนน�ามาใชงานเพอใหแนใจวาเปนจลนทรยทบรสทธ (pure) มชวต (survive) และมคณสมบตตรงตามตองการ (characteristic) หรอทก�าหนดในวธวเคราะห

1.9 ทดลองเตรยมตวอยางทดสอบทางจลชววทยา ซงตวอยางทดสอบทเตรยมรอบแรกเปนการตรวจ แบบคณภาพ (Qualitative) คอ รายการ Salmonella spp. และ S. aureus ตรวจแบบพบ/ไมพบ โดยเตรยมตวอยางนมพาสเจอรไรสเตมจลนทรยเปาหมาย (target microorganisms) เชน Salmonella spp., S. aureus และจลนทรยแขงขน (non target หรอ competitive microorganisms) และท�าใหแหงแบบเยอกแขง



1.10 ทดสอบความเปนเนอเดยวกน (homogeneity test) และความคงตว (stability) ของ ตวอยางทดสอบ (test material) โดยใชวธมาตรฐานทไดรบการรบรองความสามารถตามมาตรฐาน ISO/IEC

17025:2005(2) จากส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย หมายเลขทะเบยน 4043/501.11 สงตวอยางทางไปรษณยดวนพเศษใหหองปฏบตการของกรมวทยาศาสตรการแพทยทมกจกรรม

ตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา รวม 16 แหง ประกอบดวย ศนยวทยาศาสตรการแพทย 14 แหง และ สคอ. 2 แหงเพอวเคราะหและสงผลกลบภายในเวลาทก�าหนด

ระยะท 2: การวางแผนดานการจดการ (Management planning)เปนการศกษาความเหมาะสมของขนตอนการด�าเนนงานในแตละขนตอน รวมทงระยะเวลาและเอกสารตางๆ

ทจ�าเปน เพอใหสอดคลองกบระบบคณภาพ ISO/IEC 17043: 2010(4) มขนตอนตางๆ ดงน2.1 ทบทวน/จดท�ามาตรฐานการปฏบตงาน (standard operating procedure: SOP) เพอก�าหนด

ระเบยบปฏบตงานใหเปนไปตามขนตอนและสามารถน�าไปปฏบตได2.2 ทบทวน/จดท�าแบบฟอรม (forms) ทใชบนทกผลการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการและอนๆ

เพอใชเกบไวเปนหลกฐานและการทวนสอบ2.3 เขารบการอบรมเพมเตมเรอง ISO/IEC 17043: 2010, ISO 13528: 20052.4 จดระบบฐานขอมลในสวนของการจดเกบขอมลสมาชก ผลการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการ

การประเมนผล ฯลฯ2.5 ก�าหนดระยะเวลาด�าเนนการตางๆ เชน วนเตรยมตวอยางทดสอบ (กอนวนสงตวอยางประมาณ 1 เดอน

กรณทเปนรายการทดสอบใหมๆ จะเรมเตรยมตวอยางทดสอบกอนวนสงตวอยาง 2-3 เดอน) วนทสงตวอยาง ชวงเวลาตรวจวเคราะหของสมาชก วนสดทายของการสงรายงานผล วนสงรายงานฉบบสมบรณ การก�าหนดระยะเวลาตางๆ

ตองมการวางแผนลวงหนาอยางนอย 3 เดอน ซงตองพจารณาใหเหมาะสมกบวนท�าการของหองปฏบตการดวย

เชน ไมตรงกบวนหยดยาว หรอชวงเทศกาลประจ�าป2.6 ศกษาและคดเลอกบรรจภณฑ บรรจหบหอทเหมาะสมส�าหรบตวอยางทดสอบทเปนจลนทรย

ระยะท 3: การดำาเนนการเปน PTP (PTP operation) มขนตอนตางๆ ดงน3.1 เปดรบสมครสมาชกโดยท�าหนงสอเชญสงไปยงหองปฏบตตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา

ทงภาครฐและเอกชน และประชาสมพนธโครงการผานแผนพบและ website ของ สคอ. กรมวทยาศาสตรการแพทย3.2 เตรยมตวอยางทดสอบ (test material) โดยเตมจลนทรยในตวอยางและท�าใหเปนเนอเดยวกน

แบงบรรจในขวดแกว (vial) น�าเขาเครองท�าแหงแบบเยอกแขง (lyophilizer) ปดฝาขวดดวยจกยางและฝาอะลมเนยม ระบหมายเลขก�ากบแตละขวด เกบตวอยางทดสอบไวในทมดทอณหภมหองเพอใหตวอยางทดสอบมความคงตว(5, 10)

การเตมจลนทรยตองพจารณาปรมาณใหเหมาะสมตอรายการทดสอบแตละรายการและเปนไปตามหลกวชาการ(5, 8)

โดยทวไปการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยาสามารถแบงเปนสองกลมใหญๆ คอ การตรวจวเคราะหแบบคณภาพ (qualitative test) คอ การตรวจหาแบบพบหรอไมพบ (detection) เชน L. monocytogenes (พบ/ไมพบ

ตอ 25 กรม), Salmonella spp. (พบ/ไมพบ ตอ 25 กรม), S. aureus (พบ/ไมพบ ตอ 0.1 กรม) และการตรวจวเคราะหแบบปรมาณ (quantitative test) คอ การตรวจแบบนบจ�านวน (enumeration) เชน จ�านวนจลนทรย (cfu/กรม), จ�านวน B. cereus (cfu/กรม), จ�านวน coliforms (MPN/กรม) และจ�านวน E. coli (MPN/กรม) เปนตน




การเตมจลนทรยในการตรวจวเคราะหแบบคณภาพและแบบปรมาณจะแตกตางกน ดงน การตรวจวเคราะหแบบคณภาพ เตมจลนทรยเปาหมาย (target microorganism) ใหเหลอรอดปรมาณต�าๆ คอ ประมาณ 10-100

cfu ตอหนวยทดสอบ และเตมจลนทรยทไมใชเปาหมายหรอจลนทรยแขงขน (non-target microorganisms หรอ competitive microorganisms) ใหเหลอรอดในปรมาณมากกวาจลนทรยเปาหมายอยางนอย 100 เทา(8, 11)

จลนทรยเปาหมายเชน S. aureus เตมปรมาณ 10-100 cfu ตอ 0.1 กรม L. monocytogenes เตมปรมาณ 10-100 cfu ตอ 25 กรม Salmonella spp. เตมปรมาณ 10-100 cfu ตอ 25 กรม การตรวจวเคราะหแบบปรมาณ เตมจลนทรยเปาหมาย (target microorganism) ใหเหลอรอดในปรมาณทอยในชวงของการนบของ

แตละวธ และเตมจลนทรยทไมใชเปาหมายหรอจลนทรยแขงขน (non-target microorganisms หรอ competitive microorganisms) ใหเหลอรอดใกลเคยงตวอยางอาหารในธรรมชาตมากทสด(7) เชน จ�านวนจลนทรยเปาหมายเปน

จ�านวนจลนทรย เตมจลนทรยชนดตาง ๆ (ครอบคลมบกเตรแกรมบวกและแกรมลบ) ปรมาณ 102

ถง 106 cfu ตอกรม B. cereus เตม B. cereus ปรมาณ 102 ถง 106 cfu ตอกรม และจลนทรยแขงขนปรมาณมากกวา

B. cereus อยางนอย 100 เทา coliforms, E. coli, S. aureus เตมจลนทรยดงกลาวปรมาณ 3-110,000 MPN ตอกรมและ

จลนทรยแขงขนปรมาณมากกวาจลนทรยเปาหมายอยางนอย 100 เทา3.3 สมตวอยางเพอทดสอบความเปนเนอเดยวกนและความคงตว โดยใชโปรแกรมจาก http://www.

randomizer.org/form.htm(9)

3.4 ทดสอบความเปนเนอเดยวกน (homogeneity test) ของตวอยางทดสอบ การตรวจวเคราะหแบบคณภาพ สมตวอยางทดสอบทมจลนทรยเปาหมายและตวอยางทดสอบทไมมจลนทรยเปาหมาย (มจลนทรยอนๆ)

ทแบงบรรจแลวอยางละ 10 ขวด ตรวจวเคราะหหาจลนทรยเปาหมายโดยใชวธวเคราะหทเปนมาตรฐาน (standard method) โดยไดรบการรบรองความสามารถตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005(2) จากส�านกมาตรฐาน

หองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย หมายเลขทะเบยน 4043/50 ไดแก L. monocytogenes (พบ/ไมพบ ตอ 25 กรม) ใชวธ ISO 11290-1: 1996/Amd.1: 2004(12)

Salmonella spp. (พบ/ไมพบ ตอ 25 กรม) ใชวธ ISO 6579: 2002/ Cor.1: 2004(13)

S. aureus (พบ/ไมพบ ตอ 0.1 กรม) ใชวธ BAM 2001, Chapter 12(14)

ตวอยางทดสอบทเตมจลนทรยเปาหมายทกขวดตองตรวจพบจลนทรยเปาหมายและตวอยางทดสอบ

ทเตมจลนทรยอนทกขวดตองตรวจไมพบจลนทรยเปาหมาย การตรวจวเคราะหแบบปรมาณ สมตวอยางทดสอบทแบงบรรจแลวจ�านวน 10 ขวด ตรวจตวอยางละ 2 ซ�า (duplicate) โดยใชวธ

วเคราะหทเปนมาตรฐานฯ ไดแก coliforms (MPN/กรม) ใชวธ BAM 2002, updated 2013 Chapter 4(15)

E. coli (MPN/กรม) ใชวธ BAM 2002, updated 2013 Chapter 4(15)



จ�านวนจลนทรย (cfu/กรม) ใชวธ APHA, Compendium 2001, Chapter 6&7(16)

B. cereus (cfu/กรม) ใชวธ BAM 2001, updated 2013 Chapter 4(17)

น�าผลวเคราะหทไดมาเปลยนคาจากหนวย cfu หรอ MPN เปน log10 cfu หรอ log10 MPN ทดสอบ

ความแตกตางภายในตวอยาง (within sample variation) โดยใชสถต Cochran’s test เพอศกษาความแตกตางของการวเคราะหซ�า (precision)

ค�านวณคา C = Dmax 2/∑Di

2

เมอ Di คอ คาแตกตางของคาซ�า คท i Dmax คอ คาแตกตางของคาซ�า คทมากทสด

เปรยบเทยบคา C ทค�านวณไดกบคาวกฤตในตาราง Cochran’s test ทระดบนยส�าคญ 0.05 (5%) โดยจ�านวนซ�าคอคา n จ�านวนตวอยางคอคา k ในตาราง ซงในทนคา n = 2, k = 10 ถาคาทค�านวณไดนอยกวา คาวกฤต แสดงวาไมมความแตกตางของการวเคราะหซ�า ใหทดสอบขนตอไป ถาคา C ทค�านวณไดมากกวาคาวกฤตทระดบนยส�าคญ 0.05 ใหเปรยบเทยบคา C ทค�านวณไดกบคาวกฤตในตาราง Cochran’s test ทระดบนยส�าคญ

0.01 (1%) ถาคาทค�านวณไดนอยกวาคาวกฤตใหใชขอมลทงหมดในการทดสอบขนตอไป ถาคาทค�านวณไดมากกวาคาวกฤต ถอวาคาคนนเปน outlier และใหตดคาทงไปกอนจงทดสอบขนตอไป นนคอทดสอบความแตกตางระหวางตวอยาง (between sample variation) โดยใชการวเคราะหความแปรปรวน one-way ANOVA ค�านวณ

คาเบยงเบนมาตรฐานระหวางตวอยาง (sampling standard deviation; SS) ถาคา F ทค�านวณได นอยกวา F crit. (คาจากตารางทระดบความเชอมน 95%) แสดงวาตวอยางทดสอบมความเปนเนอเดยวกน ถาคา F ทค�านวณไดมากกวา F crit. ใหค�านวณคาเบยงเบนมาตรฐานระหวางตวอยาง (sampling standard deviation; SS) เปรยบเทยบกบ

คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญ (standard deviation for proficiency assessment; σp) ถา SS ไมเกน 0.3 เทาของ σp แสดงวาตวอยางทดสอบมความเปนเนอเดยวกน

3.5 บรรจตวอยางทดสอบในภาชนะและหบหอทเหมาะสมพรอมเอกสารทเกยวของใหสมาชกทางไปรษณยลงทะเบยน

3.6 ทดสอบความคงตวของ (stability) ของตวอยางทดสอบภายหลงวนสดทายทก�าหนดใหสมาชก

ตรวจวเคราะหตวอยางทดสอบ และตรวจวเคราะหโดยใชวธเดยวกบการทดสอบความเปนเนอเดยวกน การตรวจวเคราะหแบบคณภาพ สมตวอยางทดสอบทมจลนทรยเปาหมายและตวอยางทดสอบทไมมจลนทรยเปาหมาย (มจลนทรยอนๆ)

ทแบงบรรจแลวอยางละ 5 ขวดเพอตรวจวเคราะห ตวอยางทดสอบทเตมจลนทรยเปาหมายทกขวดตองตรวจ พบจลนทรยเปาหมายและตวอยางทดสอบทเตมจลนทรยอนทกขวดตองตรวจไมพบจลนทรยเปาหมาย

การตรวจวเคราะหแบบปรมาณ สมตวอยางทดสอบทแบงบรรจแลวจ�านวน 5 ขวดตรวจตวอยางละ 2 ซ�า (duplicate) น�าผลวเคราะห

ทไดมาเปลยนคาจากหนวย cfu หรอ MPN เปน log10 cfu หรอ log10 MPN หาคาเฉลยของขอมลททดสอบ

ความเปนเนอเดยวกน (A) และคาเฉลยของขอมลททดสอบความคงตว (B) เปรยบเทยบคาเฉลยโดยน�าคาเฉลย

ของขอมลททดสอบความเปนเนอเดยวกน (A) ลบดวยคาเฉลยของขอมลททดสอบความคงตว (B) ตวอยางทดสอบมความคงตวตอเมอ A-Bตองไมเกน 0.3 เทาของ σp (A-B≤ 0.3 σp)




3.7 หาคาก�าหนด (assigned value) ของตวอยางทดสอบ การตรวจวเคราะหแบบคณภาพ คาก�าหนดส�าหรบตวอยางทเตมจลนทรยเปาหมายคอพบตอหนวยทดสอบ (เชน 0.1 กรม หรอ 25 กรม)

คาก�าหนดส�าหรบตวอยางทไมเตมจลนทรยเปาหมายคอไมพบตอหนวยทดสอบ การตรวจวเคราะหแบบปรมาณ คาก�าหนดส�าหรบการทดสอบความช�านาญฯ น ใชคาเฉลยโรบสต (robust average) ของผลวเคราะห

จากหองปฏบตการสมาชกทไดรบการประเมนทงหมด (participants’consensus) ค�านวณโดยใช robust analysis: Algorithm A(6)

3.8 หาคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญ (PT standard deviation: p) คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญเปนคาทบอกการกระจายของขอมลในกลม ใชตดสน

ผลการวเคราะหตวอยางทดสอบของหองปฏบตการ ซง PTP เลอกใช p เทากบ 0.50 log10 MPN/g. หรอ 0.25 log10 cfu/g. มาใชในการประเมนคา z-score ของหองปฏบตการทงหมดทไดรบการประเมน

3.9 หาคาความไมแนนอนมาตรฐานของคาก�าหนด (Standard uncertainty of the assigned value)เนองจากการหาคาก�าหนดของตวอยางทดสอบ (X*) ค�านวณโดยใช robust analysis: Algorithm A ดงนน

คาความไมแนนอนมาตรฐานของคาก�าหนด (ux) ซงตดมากบคาก�าหนดเสมอ จงค�านวณไดจาก ux = 1.25 × S*/√n ux = คาความไมแนนอนมาตรฐานของคาก�าหนด S* = คาเบยงเบนมาตรฐานโรบสต (robust standard deviation) n = จ�านวนผลการทดสอบทน�ามาประเมน เพอปองกนขอผดพลาดในการประเมนผลซงมาจากความไมถกตอง (inaccuracy) ในการค�านวณคา

ก�าหนด คาความไมแนนอนมาตรฐานของคาก�าหนด (ux) ควรจะนอยกวาหรอเทากบ 0.3 เทาของคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญ ( p) ในกรณท ux มากกวา 0.3 เทาของ p ตองน�าคา ux มาใชในการประเมนผลดวย

โดยน�าคา ux ไปรวม p

3.10 รวบรวมผลการตรวจวเคราะหของสมาชก ประเมนผลโดยหาคา z-score ของหองปฏบตการ (Individual z-score)

3.11 จดท�ารายงานผลเบองตน (interim report) สมาชกจะไดรบรายงานเบองตน ทประกอบดวยคา assigned value และผลของสมาชก

3.12 จดท�ารายงานผลฉบบสมบรณ (final report) สงใหสมาชก

ระยะท 4: การขอรบรองตามระบบมาตรฐานสากล (Implementation for international accreditation) มขนตอนตางๆ ดงน

4.1 ตรวจตดตามภายใน (internal audit) วนท 10 กมภาพนธ พ.ศ. 25574.2 ยนขอการรบรองและจดสงเอกสารใหหนวยรบรอง (กรมวทยาศาสตรบรการ) วนท 11 มนาคม

พ.ศ. 25574.3 ประชมทบทวนการบรหารงาน (management review) วนท 20 มนาคม พ.ศ. 25574.4 รบการตรวจประเมนจากหนวยรบรองกรมวทยาศาสตรบรการ วนท 24-25 กรกฎาคม พ.ศ. 25574.5 แกไขขอบกพรองและขอสงเกตภายในระยะเวลาทหนวยรบรองก�าหนด (1 เดอน)



ผล1. การวางแผนขนตน

สมาชกทกรายสงผลภายในเวลาทก�าหนด และทกรายมผลการตรวจวเคราะห Salmonella spp. และ S. aureus อยในเกณฑทนาพอใจ (ผลตรงกบคาก�าหนด) คดเปนรอยละ 100 จากผลทไดรบสรปไดวาตวอยางทดสอบทเตรยมนสามารถใชเปนตวอยางทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาได เปนการยนยนวาวธการทใชในการเตรยมตวอยางนมความเหมาะสมทจะใชเปนวธการในการพฒนาการด�าเนนการตอไป

2. การวางแผนดานการจดการ เพอใหการด�าเนนการเปนไปตามมาตรฐานสากล ISO/IEC 17043: 2010 และเพอใหบรการ

หองปฏบตการสมาชกเปนการทวไป (หองปฏบตการภายในและภายนอก) PTP ทางจลชววทยาจงเตรยมความพรอมดานการจดการ โดยจดเตรยมเอกสารคณภาพทจ�าเปนตองใชจ�านวน 3 ฉบบ ไดแก การส มตวอยางทดสอบ

ทางจลชววทยา การจดการตวอยางทดสอบทางจลชววทยา การบรรจหบหอพสดภณฑ และแบบฟอรมจ�านวน 26 ฉบบ

(ตารางท 1) จดท�าแผนการทดสอบความช�านาญการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา (protocol) โดยระบ

หวขอใหครอบคลมขอก�าหนด ISO/IEC 17043: 2010 เชน ชนดตวอยางทดสอบ (PT items) การบรหารจดการตวอยาง (handling of PT items) การตดตอสอสารกบสมาชก (communication participant) เปนตน

จดท�าแผนพบประชาสมพนธ ส�าหรบบรรจภณฑและหบหอทใชบรรจและสงตวอยางทดสอบทเปนจลนทรยพบวาตองบรรจดวยพสดสามชน (triple packaging system) เชน กรณตวอยางทดสอบเปน lyophilized cultures จะน�าตวอยางทดสอบทบรรจในขวดแกว (vial) ปราศจากเชอ ปดฝาขวดดวยจกยางและฝาอะลมเนยม บรรจในถงพลาสตกพรอมวสดกนกระแทก ซอนอกชนใสในกลองพลาสตกชนดทนแตกไมรว และบรรจในกลองพสดอกชน การบรรจดวยพสดสามชน เพอใหเปนไปตามขอก�าหนดของกฎหมาย(18) และองคการอนามยโลกเรองการขนสงเชอโรคตดตอ(11, 12) ทงนจะตดฉลากบนขวดแกวและกลองพลาสตก ซงระบรหสตวอยาง เดอน/ป ทด�าเนนงาน ชอรายการทดสอบ

ตราสญลกษณกรมวทยาศาสตรการแพทยและเครองหมายระวงอนตรายจากเชอโรค (danger biological hazard)(18, 19, 20)

3. การดำาเนนการเปน PTP ทางจลชววทยาปงบประมาณ 2555-2557 มการรบสมาชกภายนอกรวมทงเพมจ�านวนรอบและหรอเพมรายการทดสอบ

อยางตอเนองดงน ปงบประมาณ 2555 ด�าเนนการเปน PTP ทางจลชววทยา 2 รายการทดสอบไดแก Salmonella spp.

และ S. aureus เปนการตรวจหาแบบพบหรอไมพบโดยแตละรายการด�าเนนการปละ 2 รอบ มสมาชกเขารวม

รายการละ 61 และ 48 ราย รวม 109 ราย ปงบประมาณ 2556 เพมขอบขายการใหบรการเปน 4 รายการทดสอบ

ไดแก Salmonella spp., S. aureus, L.monocytogenes และจ�านวนจลนทรยรายการทดสอบละ 1 รอบ รวม

4 รอบ โดย 3 รายการแรกเปนการตรวจหาแบบพบหรอไมพบ สวนจ�านวนจลนทรยเปนการตรวจแบบปรมาณ

(enumeration) มหนวยเปน colony forming unit (cfu) ตอกรม มสมาชกจ�านวน 58, 44, 26 และ 59 ราย ตามล�าดบ รวม 187 ราย ส�าหรบปงบประมาณ 2557 ด�าเนนการ 7 รายการทดสอบ ไดแก Salmonella spp., S.aureus, L.monocytogenes, จ�านวนจลนทรย, B. cereus (cfu ตอกรม), จ�านวน coliforms (Most Probable Number: MPN ตอกรม) และจ�านวน E. coli (MPN ตอกรม) โดยมสมาชกเขารวมจ�านวน 70, 66, 27, 69, 40, 38 และ 46 ราย ตามล�าดบ รวม 356 ราย รวม 4 ป (ปงบประมาณ 2554-2557) มสมาชกสะสมเขารวมการทดสอบจ�านวน 668 ราย เฉลยมหองปฏบตการทเขารวมทดสอบฯ ตอรอบเพมขนตามล�าดบคอ ปงบประมาณ 2555-2557 เทากบ 27, 44 และ 51 ราย ตามล�าดบ (ตารางท 2 และภาพท 1, 2)




1. บนทกการตรวจสอบปรมาตร F PT 20 T3 001 2. บนทกการทดสอบความเปนเนอเดยวกน F PT 20 T4 002 3. บนทกการตรวจนบจ�านวนจลนทรย F PT 20 T4 014 4. บนทกการตรวจวเคราะห L. monocytogenes (MPN/g) F PT 20 T4 015 5. บนทกการตรวจวเคราะห L. monocytogenes/25 กรม (พบ/ไมพบ) F PT 20 T4 016 6. บนทกการตรวจวเคราะห Salmonella spp. (MPN/g) F PT 20 T4 017 7. บนทกการตรวจวเคราะห Salmonella spp. /25 กรม (พบ/ไมพบ) F PT 20 T4 018 8. บนทกการตรวจวเคราะห S. aureus F PT 20 T4 019 9. บนทกการตรวจวเคราะห Coliforms และ Escherichia coli F PT 20 T4 020 10. บนทกการเตรยมตวอยาง F PT 20 T4 021 11. บนทกการทดสอบจลนทรยมาตรฐาน F PT 20 T4 022 12. Sterility Test F PT 20 T4 023 13. บนทกการตรวจวเคราะห B. cereus F PT 20 T4 024 14. ใบสมครเขารวมแผนฯ ทางจลชววทยา F PT 20 T6 012 15. แบบตอบรบตวอยาง F PT 20 T6 014 16. ค�าแนะน�าส�าหรบหองปฏบตการ F PT 20 T6 015 17. แบบรายงานผลทางหองปฏบตการ F PT 20 T6 016 18. บนทกรอบการทดสอบ ประจ�าป F PT 20 T6 031 19. สรปผลการตรวจวเคราะหของหองปฏบตการสมาชก (Detection) F PT 20 T6 032 20. บนทกการท�าลายตวอยางทดสอบความช�านาญ F PT 20 T6 033 21. รายชอสมาชกประจ�าป F PT 20 T6 034 22. สรปผลการตรวจวเคราะหของหองปฏบตการสมาชก (Enumeration) F PT 20 T6 035 23. บนทกการตอบรบตวอยางของสมาชก F PT 20 T6 037 24. การประเมนผลหองปฏบตการสมาชก (Enumeration) F PT 20 T7 001 25. รายงานเบองตน (Detection) F PT 20 T7 002 26. รายงานเบองตน (Enumeration) F PT 20 T7 003

ตารางท 1 รายชอเอกสารคณภาพ (แบบฟอรม) ล�าดบ ชอเอกสาร เลข SOP

รายการทดสอบ 2 2 4 7รอบการทดสอบ 1 4 4 7จ�านวนสมาชก 16 109 177 356จ�านวนสมาชกเฉลยตอรอบ 16 27 44 51

ตารางท 2 ผลการเปนผด�าเนนการแผนทดสอบความช�านาญทางจลชววทยา

รายการ 2554 2555 2556 2557ปงบประมาณ



ภาพท 1 แผนภมแสดงจ�านวนสมาชกระหวางปงบประมาณ 2554-2557

จ�านวนสมาชก2554

2555

2556

2557

109

356

16

177

ภาพท 2 แผนภมแสดงรายการทดสอบและจ�านวนสมาชกการทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาระหวางปงบประมาณ 2554-2557

2554

2555

2556

2557

80

70

60

50

40

30

20

10

0 Salmonella spp. S.aureus L.mono TPC Coliforms E.coli B.cereus

4. การขอรบรองตามระบบมาตรฐานสากลไดรบการตรวจประเมนเมอวนท 24-25 กรกฎาคม พ.ศ. 2557 พบขอบกพรองทางวชาการจ�านวน 4 ขอ

ขอสงเกต 1 ขอ ซงขอบกพรองไดแก 1) ไมพบบนทกการประเมนผลฝกอบรมความสามารถในการปฏบตงาน

2) ไมพบขอมลของสมาชก 1 รายในกราฟแทง (histogram) 3) มการเลอกใชวธการหาคาเบยงเบนมาตรฐานของ การทดสอบความช�านาญ (PT standard deviation: p) ไมเหมาะสม คอเลอกใชคา 0.50 log10 MPN/g หรอ 0.30 log10 MPN/g มาประเมนคา Z-score 4) การหาคาก�าหนดในโปรแกรม excel ไมไดน�าคาคงทมาใช ในการค�านวณ ท�าใหคา robust SD เปลยนจากคา 0.157 เปน 0.154 ส�าหรบขอสงเกตไดแก บนทกหลายฉบบลงขอมลไมครบถวน เชน บนทกการเตรยมอาหารเลยงเชอ บนทกการท�าลายตวอยาง ซงผด�าเนนการฯ แกไขสงให หนวยงานรบรองตามระยะเวลาทก�าหนดและไดรบการรบรองเรยบรอยแลวเมอวนท 26 มกราคม พ.ศ. 2558




วจารณการพฒนาการเปน PTP ทางจลชววทยาใหเปนไปตามมาตรฐานสากลนน โดยปกตผด�าเนนการฯ จะตอง

จดท�าเอกสารคณภาพจ�านวนมากเพอใหสอดคลองกบทกกจกรรมตามขอก�าหนดทจ�าเปนตองด�าเนนการคอ

ISO/IEC 17043: 2010(4) ซงเปนขอก�าหนดทวไปเกยวกบความสามารถในการจดการแผนการทดสอบความช�านาญ

(ดานวชาการ 10 ขอ ดานบรหาร 15 ขอ) และ ISO/TS 22117: 2010(5) ซงเปนขอก�าหนดเฉพาะของการทดสอบความช�านาญของการตรวจวเคราะหอาหารและอาหารสตวทางจลชววทยา มขอก�าหนดทางวชาการ 18 ขอ บางกจกรรมหรอบางขอก�าหนดอาจตองเตรยมหรอจดท�าเอกสารคณภาพหลายฉบบและบางฉบบอาจมการบนทกหลายลกษณะ เชน การควบคมสภาวะแวดลอม (อากาศภายในหองปฏบตการ โตะท�างาน) ในระหวางปฏบตงาน (เตรยมตวอยาง ทดสอบตวอยาง) ตองสะอาด มจลนทรยปนเปอนนอยหรอไมม เครองมอและอปกรณตางๆ ทใช รวมถงวธตรวจวเคราะหและวธทางสถต ตองควบคมใหเปนไปตามขอก�าหนด แตเนองจากหองปฏบตการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยาของ สคอ. ไดรบการรบรองความสามารถของหองปฏบตการตาม ISO/IEC 17025: 2005(2) ตงแตปงบประมาณ 2551 และการใหบรการทดสอบความช�านาญทางเคมบางรายการไดรบการรบรองตาม ISO/IEC 17043: 2010(4) ตงแตปงบประมาณ 2555 PTP ทางจลชววทยาจงไดศกษา ทบทวน และน�าเอกสารคณภาพในระบบดงกลาวมาใช ท�าใหลดภาระดานการจดท�าเอกสารคณภาพลงไดจ�านวนมาก

การเตรยมตวอยางทดสอบนนนบเปนหวใจส�าคญ เนองจากตวอยางทดสอบตองมความเปนเนอเดยวกน

และมความคงตวตลอดระยะเวลาของการตรวจวเคราะห(4, 5) ซงการเตรยมตวอยางทดสอบทางจลชววทยาสวนใหญ ตองเตมจลนทรยเปาหมาย (target microorganism) และจลนทรยทไมใชเปาหมายหรอจลนทรยแขงขน

(non-target microorganisms หรอ competitive microorganisms) และมขนตอนหรอกระบวนการตางๆ เชน การท�าใหแหง (dry) หรอการท�าแหงแบบเยอกแขง (lyophilized) เพอเกบรกษาจลนทรยเหลานไมใหเจรญ

เพมจ�านวนและตองใหเหลอรอดชวตในปรมาณทเหมาะสมตอการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการ เชนในกรณการตรวจหา (detection) คอตรวจแบบพบหรอไมพบ ควรมจลนทรยเปาหมายใหเหลอเทากบหรอนอยกวา 100 เซล

ตอหนวยน�าหนกของตวอยางทตรวจวเคราะห (เชน ตอตวอยาง 0.1 กรม หรอ 1 กรม หรอ 25 กรม) และควรมจลนทรยทไมใชเปาหมายมากกวาจลนทรยเปาหมายอยางนอย 100 เทา เพอใหเกดการเจรญแขงขนระหวางจลนทรยทงสองชนด สวนกรณการตรวจแบบปรมาณ (enumeration) คอ ตรวจแบบนบจ�านวนเปน cfu ตอกรมหรอ MPN ตอกรม

ตองเตมจลนทรยเปาหมายใหเหลอปรมาณทเหมาะสมตอการนบ เชน จ�านวนแบคทเรย ควรมคาในการนบ

จ�านวนระหวาง 25 ถง 250(16) หรอ 10 ถง 300(22) สวนจ�านวน S. aureus หรอ B. cereus ควรมคาระหวาง 20 ถง 200(14, 17) หรอ 10 ถง 150(22) และตองมจลนทรยทไมใชเปาหมายในตวอยางทดสอบ 104 ถง 106 เซล เปนตน

ซงปญหาการเตรยมตวอยางทดสอบใหมจลนทรยเปาหมาย และจลนทรยทไมใชเปาหมายใหเหลอในปรมาณ

ทเหมาะสมตอการน�าไปเปนตวอยางทดสอบส�าหรบแตละรายการจงอาจตองเตมในปรมาณทแตกตางกน เนองจากจลนทรยแตละชนดเมอน�ามาผานกระบวนการเกบรกษาจะมอตราการตายไมเทากน ดงนนการเตมจลนทรยในปรมาณ

ทเทากนจงอาจเหลอรอดชวตไมเทากน ซงโดยปกตแบคทเรยแกรมบวก (เชน S. aureus และ B. cereus เปนตน) จะทนตอสภาพแวดลอมดกวาแบคทเรยแกรมลบ (เชน coliforms, E. coli, Salmonella spp.) ขณะทแบคทเรย

ทสรางสปอรจะทนกวาแบคทเรยทไมสรางสปอร สวนยสตหรอราจะทนความแหงแลงไดดกวาแบคทเรย ดงนน

การเตรยมตวอยางอาหารแตละประเภทโดยการเตมจลนทรยเปาหมายและจลนทรยทไมใชเปาหมายแตละชนดเพอใชเปนตวอยางทดสอบความช�านาญทางจลชววทยา จงตองท�าการศกษาการตายหรอการบาดเจบของจลนทรยนนๆ

เพอทจะไดเตมปรมาณจลนทรยไดอยางถกตอง โดยปกตจลนทรยทผานกระบวนการท�าใหแหงจะมปรมาณลดลง อยางนอย 0.5 log10 cfu หรอ MPN(10) เชน ตองการใหมจลนทรยเปาหมาย 100 เซลตอ 25 กรม (2.0 log10 cfu



ตอ 25 กรม) จากการทดลองพบวา เมอผานกระบวนการท�าใหแหงแบบเยอกแขง ปรมาณจลนทรยจะลดลง 1.0 log10 cfu ดงนนจงตองเตมจลนทรย 3.0 log10 cfu เปนตน

การไดรบขอบกพรองจากการตรวจประเมนในเรองไมพบบนทกการประเมนผลการอบรมความสามารถ

และขอมลของสมาชกทแสดงในกราฟแทง (histogram) ผด�าเนนการไดจดท�าบนทกและขอมลพรอมทงแจงผเกยวของทราบ ส�าหรบเรองของการหาคาก�าหนดและคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญ โดยใช robust analysis algorithym A ซงผด�าเนนการและเจาหนาทเขาใจคลาดเคลอน ไมไดน�าคาคงทในรอบท 1 (iteration 1) แตน�าคาเรมตน (iteration 0) มาใชในการค�านวณรอบท 2 (iteration 2) จงเพมการอบรมในเรองดงกลาว สวนการทผด�าเนนการเลอกคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบความช�านาญแบบคงท 0.3 log10 MPN หรอ

0.5 log10 MPN โดยไมใชคาเบยงเบนมาตรฐานของการทดสอบทค�านวณได robust analysis algorithym A

เพราะผด�าเนนการตองการพฒนาหองปฏบตการสมาชกใหสามารถตรวจไดคาทใกลเคยงกน (precision) และแมนย�า (accuracy) มากขนแบบคงท โดยไมขนกบผลการตรวจวเคราะหของสมาชกในแตละรอบ ปจจบนผด�าเนนการใชคา 0.25 log10 ส�าหรบการตรวจวเคราะหทมหนวยเปน cfu และ 0.5 log10 ส�าหรบการตรวจวเคราะหทมหนวยเปน MPN

ส�าหรบปญหาอนท PTP ทางจลชววทยาประสบเชน ผด�าเนนงานตรวจสอบการช�าระเงนไดยากเนองจากสมาชกบางรายช�าระเงนแลวแตไมไดแจงใหผ ด�าเนนงานทราบ ทงทก�าหนดใหสมาชกสงส�าเนาการช�าระเงนให

ผด�าเนนการดวย ท�าใหตองตรวจสอบทกรอบกอนทจะสงผลใหสมาชก แตในขณะนกรมวทยาศาสตรการแพทยไดพฒนาการจายเงนเปนระบบ electronic payment ท�าใหการช�าระเงนของสมาชกและการตรวจสอบของผด�าเนนการงายขน นอกจากนการรายงานผลของสมาชก สวนใหญจะรายงานผลทาง e-mail ซงในระยะแรกใช e-mail เฉพาะของผด�าเนนการ ท�าใหทมงานไมสามารถตอบหรอรบ e-mail ไดอยางรวดเรว และม mail อนๆ ทไมเกยวของกบการทดสอบความช�านาญ ผด�าเนนการจงขอ e-mail address ใหมกบกรมฯ เปนกรณพเศษ (ปกตขาราชการ 1 คนจะไดรบเพยง 1 e-mail address) และไดรบอนมตแลวเมอตนป พ.ศ. 2558 ซงจะท�าใหการตอบหรอรบการตดตอจากสมาชกสะดวกรวดเรวขน เนองจากทมงานทก�าหนดไวทกคนสามารถโตตอบทาง e-mail ใหมนได นอกจากนบางครงผด�าเนนการไมไดรบผลหรอไดรบผลลาชา (โดยเฉพาะการสง Fax) เนองจากเครองแฟกซทเปนสายตรงจะมประจ�าทฝายบรหารงานทวไปของ สคอ. ดงนน ผด�าเนนงานตองสอบถามจากสมาชกเปนรายๆ

สรปการพฒนาการเปนผด�าเนนการทดสอบความช�านาญหองปฏบตการตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา

มการพฒนาอยางตอเนอง จาก 2 รายการทดสอบ จ�านวนสมาชก 109 ราย เปน 7 รายการทดสอบ จ�านวนสมาชก

356 รายภายใน 3 ป และไดรบการรบรองตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 แสดงถงความส�าเรจและการบรรลวตถประสงค ท�าใหลดคาใชจายของสมาชกและของประเทศ นอกจากนยงท�าใหสามารถน�าขอมลทไดไปประเมนผล

ความสามารถรวมทงพฒนาระบบคณภาพของหองปฏบตการ

กตตกรรมประกาศคณะผเขยนขอขอบคณนายปรชา จงสมานกล ทกรณาใหค�าแนะน�าดานเทคนคและวชาการ นางสาวทพวรรณ

นงนอย ใหค�าแนะน�าดานสถต และนางกนกพร อธสข ผจดการคณภาพตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043: 2010 ซงทกทานสนบสนนการด�าเนนงานทดสอบความช�านาญทางจลชววทยาจนไดรบการรบรองทกรายการทขอรบการรบรอง




เอกสารอางอง 1. ส�านกมาตรฐานหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรการแพทย. นโยบายและหลกเกณฑการทดสอบความช�านาญ การเปรยบเทยบ

ผลทดสอบระหวางหองปฏบตการและการประเมนความสามารถการทดสอบ. SOP No. N 07 15 003 แกไขครงท 08 วนทออกเอกสาร 3 ธนวาคม 2557.

2. ISO/IEC 17025: 2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. 2nd ed. Geneva, Switzerland: ISO; 2005.

3. กฎกระทรวงแบงสวนราชการกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข พ.ศ. 2552. ราชกจจานเบกษา เลม 126 ตอนท 98 ก (ลงวนท 28 ธนวาคม 2552).

4. ISO/IEC 17043: 2010. Confomity assessment -- General requirements for proficiency testing. Ge-neva, Switzerland: ISO; 2010.

5. ISO/TS 22117: 2010. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Specific requirements and guidance for proficiency testing by interlaboratory comparison. Geneva, Switzerland: ISO; 2010.

6. ISO 13528: 2005. Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. Geneva, Switzerland: ISO: 2005.

7. ส�านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร กรมวทยาศาสตรการแพทย. สถตทใชในการทดสอบความช�านาญ. SOP PT 20 T4 401 แกไขครงท 05 วนทออกเอกสาร 19 สงหาคม 2557.

8. ISO 16140:2003/Amd.1:2011. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Protocol for the validation of alternative method. Geneva, Switzerland: ISO; 2011.

9. Research randomizer. 2008. [cited 2011 Aug 24]: [1 screen]. Available from: URL: http://www. randomizer.org/form.htm

10. National Association of Testing Authorities (NATA). Maintenance and preservation of microbial cultures in a laboratory culture collection. Australia; 1992. Technical note 14.

11. ISO 11133:2014. Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production, storage and performance testing of culture media. Geneva, Switzerland: ISO: 2014.

12. ISO 11290-1:1996/Amd. 1:2004. Microbiological of food and animal feeding stuffs - Horizontal method

for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1: Detection method/Amendment 1: Modificaion of the isolation media and the haemolysis test, and inclusive of precision data. Geneva, Switzerland; ISO 2004.

13. ISO 6579:2002/Cor.1:2004(E). Microbiology of food and animal feeding stuffs -- horizontal method for the detection of Salmonella spp. Geneva, Switzerland: ISO: 2004.

14. Bennett RW, Lancette GB. Bacteriological Analytical Manual: chapter 12 Staphylococcus aureus. 2001. [cited 2011 Aug 24]: [6 screens]. Available from: URL: http://www.fda.gov/Food/Food

ScienceResearch/Laboratory Methods/ucm071429.htm 15. Bacteriological Analytical Manual: chapter 4 enumeration of Escherichia coli and the coliform

bacteria. 2002. [cited 2011 Aug 24]: [18 screens]. Available from: URL: http://www.fda.gov/ Food/Food ScienceResearch/Laboratory Methods/ucm064948.htm

16. Downes FP, Ito K, editors. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4th ed. Washington, DC: American Public Health Association; 2001. p. 53-68.

17. Bacteriological Analytical Manual: chapter 14 Bacillus cereus. 2001. [cited 2011 Aug 24]: [5 screens]. Available from: URL: http://www.fda.gov/Food/Food ScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070875.htm



18. กฎกระทรวงสาธารณสข เรองก�าหนดหลกเกณฑการปฏบตของหนวยงานทไดรบยกเวนไมตองขออนญาตในการผลต ครอบครอง จ�าหนาย น�าเขา สงออก หรอน�าผานซงเชอโรคและพษจากสตว พ.ศ.2552. ราชกจจานเบกษา เลม 126 ตอนท 86 ก (ลงวนท 20 พฤศจกายน 2552).

19. Introduction to the transport of infectious substances. In: World Health Organization. Laboratories biosafety manual. 3rd ed. Geneva, Switzerland: WHO; 2004. p. 94-7.

20. Safety in the laboratory. In: World Health Organization. Quality assurance in bacteriology and immunology. 3rd ed. New Delhi, India: WHO; 2012. p. 77-85.

21. Food Examination Performance Assessment Scheme. FEPAS assessment 89. Sand Hutton: Central Science Laboratory; 2004.

22. ISO 7218:2007/Amd.1:2013. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General requirements and guidance for microbiological examinations. Geneva, Switzerland: ISO; 2013.




Development of Proficiency Testing Providing for Food Microbiological

Testing Laboratory

Ladawan Chungsamanukool Kamonwan Kantaeng and Atchara UkongBureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences, Tiwanon Road, Nonthaburi 11000, Thailand.

ABSTRACT Microbiological Proficiency testing (PT) is an external assessment of the performance of microbiological laboratories. It is also a tool for the quality system development. Many laboratories participated in the expensive PT schemes organized from abroad due to the lack of local PT provider. The few local providers existing in Thailand do not cover all necessary test items in food microbiological testing. In order to increase the capability of the Department of Medical Sciences in strengthening the performance of food testing laboratories in Thailand as well as to help laboratories improve their quality and reduce the cost of using the PT provider from abroad, in 2011, the Bureau of Quality and Safety of food (BQSF) launched the project on food microbiological PT. At the initial phase, test materials for Salmonella spp. and Staphylococcus aureus were prepared and sent to 16 food analysis laboratories of DMSc to analyze and submit the result within the established timeframe. The results confirmed that the prepared test materials were appropriate and could be used as PT microbiological samples. Therefore, the PT schemes were operated to service other government and private laboratories. In 2012, two PT schemes were provided for 2 rounds with two test items on Salmonella spp. and S. aureus, and with 109 laboratories participating. In 2013, the scope of service extended to include the 2 new tests of L. monocytogenes, and total plate count, and each test was for one round. The total of participants were 177. In 2014, the PT schemes for B. cereus, coliforms and E. coli were introduced and the total schemes become 7 with 356 participants. The number of participating laboratories increased continuously from 2012 to 2014, (27, 44 and 51 laboratories per round, respectively). In early 2015, all PT schemes were ISO/IEC 17043: 2010 accredited. In conclusion, the development of the PT schemes in microbiological testing of food at the BQSF has facilitated the improvement and development of testing laboratory quality in many laboratories in Thailand and reduced the cost from participation with PTP in foreign countries.

Key words: Proficiency Testing, Microbiology, Laboratory evaluation



การวเคราะหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลในเนอหม โดยใชเทคนค Exact-matching double IDMS:

ผลการเขารวมเปรยบเทยบผลการวด APMP.QM-S6 Clenbuterol in Porcine Meat

กตตยา เชยรแมน พรหทย กนแกว ปรยาภรณ พกรอด ศรกฤษณ มาบำารง และปนดดา ซลวา ฝำยมำตรวทยำเคมและชวภำพ สถำบนมำตรวทยำแหงชำต คลองหำ คลองหลวง ปทมธำน 12120

Accepted for publication, 10 November 2014

บทคดยอ สารเคลนบวเตอรอล (clenbuterol) เปนสารในกลมเบตาอะโกนสท (β-agonists) มการแอบใชเปนตวเรงเนอแดง และเรงการเจรญเตบโตของสตวเลยงเพอเปนอาหาร มการออกกฎหมายหามใชสารเคลนบวเตอรอลในหลายๆ ประเทศ เนองจากสงผลกระทบตอสขภาพ ดงนนฝายมาตรวทยาเคมและชวภาพของสถาบนมาตรวทยาแหงชาต (มว.) จงไดเขารวมเปรยบเทยบผลการวดระดบนานาชาต APMP.QM-S6: Clenbuterol in porcine meat ซงเปนการวดสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง เทคนคการวดทใช คอ เทคนค exact-matching double IDMS โดยมขนตอนดงน คอ การท�าปฏกรยาไฮโดรไลซสในสภาวะดาง (alkaline hydrolysis) การตกตะกอนโปรตนดวยกรด (acid precipitation) การก�าจดไขมน (defattening) การสกดตวอยางแบบของเหลว-ของเหลว (liquid-liquid extraction) การสกดตวอยางแบบของแขง (solid phase extraction, SPE) แลวท�าการวเคราะหดวยเครองมอ high performance liquid chromatography tandem mass spectrometer (HPLC-MS/MS) ผลการวดมสมบตการสอบกลบได (metrological traceability) เนองจากมการประเมนความบรสทธของสารมาตรฐานทใช ผลการวดในตวอยาง APMP.QM-S6 พบทระดบความเขมขน 5.0 µg/kg มคาความไมแนนอนของการวดท 5.0% และผลการเขารวมเปรยบเทยบผลการวด APMP.QM-S6 ของประเทศไทย สอดคลองกบสถาบนมาตรวทยาประเทศอนๆ เปนอยางด โดยคาอางองของการเปรยบเทยบผลการวด (Supplementary Comparison Reference Value, SCRV) มคาเทากบ 5.216 µg/kg และคาความไมแนนอน 0.131 µg/kg



การวเคราะหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลในเนอหม โดยใชเทคนค Exact-matching double กตตยา เชยรแมน และคณะ

บทนำาสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอล (clenbuterol) โครงสรางดงภาพท 1 เปนสารในกลมเบตาอะโกนสท

(β-agonists) ซงในทางการแพทยใชผลตยารกษาคน สารเคลนบวเตอรอลมสรรพคณในการขยายหลอดลม รกษาโรคหอบหด ชวยใหกลามเนอมดลกคลายตว ชวยใหกลามเนอขยายตว และเพมการสลายตวของไขมนทสะสมในรางกาย แตอาจมผลขางเคยง เชน ท�าใหมอาการกลามเนอสน หวใจเตนเรวกวาปกต กระวนกระวาย วงเวยน ปวดศรษะ เปนตน(1)

อยางไรกตาม มการลกลอบน�าสารเคลนบวเตอรอลมาใชผดวตถประสงค คอ ใชเปนสารเรงเนอแดงโดยผสมในอาหาร และน�าส�าหรบเลยงหม เพอใหหมมเนอแดงมาก มไขมนนอยซงท�าใหไดราคาด(2)

การบรโภคเนอสตวทมสารเรงเนอแดงตกคางอย จะสงผลตอการท�างานของระบบประสาททควบคมการท�างานของกลามเนอหวใจ กลามเนอเรยบของหลอดเลอด หลอดลม กระเพาะปสสาวะ เปนตน อาจมอาการมอสน กลามเนอกระตก ปวดศรษะ หวใจเตนเรวผดปกต กระวนกระวาย วงเวยนศรษะ บางรายมอาการเปนลม นอนไมหลบ คลนไส อาเจยน มอาการทางจตประสาท และเปนอนตรายมากส�าหรบหญงมครรภ ผทเปนโรคหวใจ ความดนโลหตสง เบาหวาน และโรคไฮเปอรไทรอยด(1) การตรวจวดการตกคางของสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอล สามารถตรวจไดจากการตกคางทสวนตางๆ ของสกร ไดแก เครองใน ตบ ไต เนอ และไขมน นอกจากนยงพบในปสสาวะดวยเชนกน ซงสามารถ

ตรวจวดการตกคางไดโดยใชเครองมอ LC-MS/MS หรอ GC-MS(3)

ภาพท 1 สตรโครงสรางทางเคมของสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอล (Clenbuterol)

ภาพท 1 สตรโครงสรางทางเคมของสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอล (Clenbuterol)

คณะกรรมาธการโครงการมาตรฐานอาหาร FAO/WHO (Codex Alimentarius Commission - CAC) ไดก�าหนดมาตรฐานอาหารใหมระดบปรมาณสารเคลนบวเตอรอลทยอมใหตกคางสงสด (Maximum Residue Limit, MRL) ในเนอสตว (muscle) ทระดบ 0.2 µg/kg (Codex Alimentarius, Maximum Residue Limits for Clenbuterol, year of adoption 2003)(4)

กจกรรมการเขารวมเปรยบเทยบผลการวด (International laboratory comparison) เปนภารกจส�าคญของสถาบนมาตรวทยาแหงชาตในการเปนตวแทนของประเทศไทย เพอแสดงความสามารถในการวดในรายการนนๆ ดงนนในกลางป 2556 สถาบนมาตรวทยาแหงชาต (มว.) ไดเขารวมเปรยบเทยบผลการวดนานาชาตระดบภมภาคเอเชยและแปซฟก (Asia-Pacific Metrology Programme, APMP) ในรายการ APMP.QM-S6: clenbuterol in porcine meat โดยมสถาบนมาตรวทยาแหงเขตปกครองพเศษฮองกง (Government Laboratory, Hong Kong, China (GLHK)) เปนเจาภาพ หองปฏบตการของสถาบนมาตรวทยาแหงชาต หรอหองปฏบตการทท�าหนาทแทนสถาบนมาตรวทยาแหงชาต (designated institute) จากประเทศตางๆ เขารวมเปรยบเทยบผลการวดรวมทงหมด


Analysis of Clenbuterol in Porcine Meat Utilizing an Exact-Matching Kittiya Shearmanacharoen el al.

7 หองปฏบตการ ไดแก บราซล ไทย จน ฮองกง กรซ เมกซโก และนวซแลนด นอกจากนยงม 2 หองปฏบตการ จากประเทศไทยทมความเชยวชาญ และมประสบการณในการวดเขารวมเปรยบเทยบผลการวดแบบ pilot study (APMP.QM-P22) ซงถกจดควบคไปดวย โดยผจดไดก�าหนดใหแตละหองปฏบตการทเขารวมโครงการจะตองท�าการวเคราะหหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง(5)

เทคนคการวเคราะหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลทหองปฏบตการวเคราะหอนทรยเคมของ มว. น�ามาใชในการเขารวมเปรยบเทยบผลการวดนานาชาตครงน คอ เทคนค exact-matching double IDMS ซงมศกยภาพเปนวธมาตรฐานปฐมภม (primary method) และสามารถสอบกลบไปยง SI units ได(6, 7) โดยอาศยหลกการเตมไอโซโทป (isotopic analogue) ของสารทตองการวด (D9-clenbuterol) ททราบปรมาณแนนอนลงในทงสารมาตรฐาน (calibration standard) และตวอยาง (sample) ในปรมาณเทากน ซงจะเรยกวา calibration blend solution และ sample blend solution ปรมาณของสารเคลนบวเตอรอลใน calibration blend solution จะถกเตมใหเทากบในตวอยางทไดคามาคราวๆ กอนหนาน จากนนท�าการวดความเขมของพค (peak intensity) ของไอออนสารมาตรฐาน (clenbuterol) เอง และตว isotopic analogue (D9-clenbuterol) โดยใช mass spectrometer และวดการเปลยนแปลงอตราสวนของจ�านวนไอโซโทป และค�านวณความเขมขนของสารทสนใจจากสมการท (1)(8)

wzc, my, mz.c, RB (1) mx, my, c RB, C

โดยท wx, mz, c คอ ความเขมขนของสารทวเคราะหในตวอยาง และใน calibration standard ตามล�าดบ wx, mz, c คอ มวลของตวอยาง และมวลของ calibration standard ตามล�าดบ wy, my, c คอ มวลของ isotopic analogue ทเตมลงในตวอยาง และใน calibration standard ตามล�าดบ และ RB, RB, C คอ อตราสวนของจ�านวน isotope ทเตมลงในตวอยาง และใน calibration blend ตามล�าดบ

รายงานฉบบนไดน�าเสนอวธการวเคราะหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอล โดยใชเทคนค exact-matching double IDMS การประมาณคาความไมแนนอนและการสอบกลบไดทางมาตรวทยาของผลการวด รวมถงผลของ การเขารวมเปรยบเทยบผลการวด APMP.QM-S6 เพอเปนการเผยแพรความรใหแกหองปฏบตการทดสอบในประเทศไดน�าไปประยกตใชในการพฒนาวธการวเคราะหของหองปฏบตการตนเอง และสามารถปรบปรงเพอใหไดผลการวด

ทมความถกตองมากขน

วสดและวธการตวอยาง

ตวอยาง APMP.QM-S6 เปนตวอยางเนอหม ทผานการท�าใหแหงดวยกระบวนการ freeze dried และ มการบดใหละเอยด ลกษณะตวอยางเปนผงสน�าตาลออน บรรจอยในขวดสชา ปรมาณ 2 g โดยตวอยางไดผาน

การฉายรงสแกมมา (12 kGy, 18 hours) ผจดไดระบวาตวอยางมความเขมขนอยในชวง 1 g/kg - 50 µg/kg และก�าหนดใหมการวเคราะหความชนในตวอยางหมบดแหง เพอใชในการรายงานผลออกมาเปน mass fraction

ของสารเคลนบวเตอรอลตอน�าหนกแหง

สารมาตรฐานและสารเคมสารมาตรฐาน : clenbuterol.HCl ผลตภณฑ Dr. Ehrenstorfer, D9-clenbuterol.HCl ผลตภณฑ

Dr. Ehrenstorfer

wx = wz, c




สารเคม : acetonitrile (HPLC grade LAB-SCAN), dichloromethane (AR grade LAB-SCAN), hexane (HPLC grade LAB-SCAN), methanol (HPLC grade LAB-SCAN), sodium hydroxide AR grade, conc. HCl (SIGMA-ALDRICH), ethyl acetate (HPLC grade LAB-SCAN), 2-propanol, acetic acid (AR grade MERCK), phosphate buffer (pH 6.0), Tris buffer (pH 8.0), Protease Type XIV of Streptomyces griseus, (SIGMA), formic acid, KH2PO4 AR grade, KOH (LOBA CHEMIE)

เครองมอและอปกรณเครองชง มความละเอยด 5 ต�าแหนง, 2 ต�าแหนง, shaking incubator, centrifuge (Eppendorf 5810

centrifuge, Fronine Laboratory), evaporator (Caliper TurboVap, Life Scinece, Inc.) และ LC-MS/MS

(Shimadzu LC system equipped with API 4000 QTRAP MS/MS, AB Sciex) คอลมนทใชคอ Phenomenex Gemini, 5 µ, C18, 110 Å (150 × 4.6 mm) และ Guard column คอ Phenomenex C18

(4.0 × 2.0 mm), Injection volume: 5 µL, Column temperature: 40 �C, Sample temperature: 15 �C โดยใชสภาวะของเครอง LC-MS/MS (ตารางท 1 และตารางท 2) ท�าการวเคราะหดวย Multiple Reaction Monitoring (MRM) ESI positive mode

0.10 System Controller Start 1.00 Pumps Pump B conc. 5 3.00 Pumps Pump B conc. 15 3.01 Pumps Pump B conc. 40 10.00 Pumps Pump B conc. 50 12.00 Pumps Pump B conc. 95 13.00 Pumps Pump B conc. 5 15.00 System Controller Stop

ตารางท 1 สภาวะของเครอง HPLC ส�าหรบใชในการหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง

Time (min) Module Event Parameter

Clenbuterol* 277.1 > 203.0 0.1 50 10.0 24 15Clenbuterol** 277.1 > 168.1 0.1 50 10.0 42 15D9-clenbuterol* 286.2 > 204.1 0.1 48 10.0 24 15D9-clenbuterol** 286.2 > 169.1 0.1 48 10.0 42 15

ตารางท 2 สภาวะของเครอง MS/MS ส�าหรบใชในการหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง

Analyte Reaction Dwell Declustering Entrance Collision Collision Cell Time (s) Potential, Potential, Energy, Exit Potential, EP (eV) DP(eV) CE (eV) CXP (eV)

หมายเหต : ส�าหรบ *คอไอออนหลก (primary ion) ทใชในการวเคราะหหาปรมาณ (quantification) และ **คอ ไอออนรอง (secondary ion) ทใชในการยนยน (confirmation)



การเตรยมสารละลายและสารมาตรฐานสารมาตรฐานเคลนบวเตอรอลเปนสารมาตรฐานทหาซอมาจากตวแทนจ�าหนายในประเทศไทย ทงนทางหอง

ปฏบตการไดท�าการประเมนความบรสทธของสารโดยใช mass balance approach ดวยเทคนค high performance liquid chromatography UV-detector (HPLC-UV) ในการหาปรมาณ organic impurities/related structure impurities, ใชเทคนค Thermogravimetric analysis (TGA) ในการหาปรมาณ volatile and non-volatile residues และใชเทคนค Karl Fischer titration (KFT) ในการหาปรมาณน�า ในการเตรยมสารละลายมาตรฐานจะใชเครองชงทมความละเอยดเลขหลงจดทศนยม 5 ต�าแหนง และไดรบการสอบเทยบ โดยชงสารมาตรฐานของแขงมาอยางต�า 10 mg ลงในขวดแกวสชาขนาด 40 mL จากนนเตม methanol ประมาณ 25 g แลวท�าการชง น�าหนกของสารละลายอยางถกตองอกครง จะไดสารละลายมาตรฐานตงตน (stock standard solution) ทมความเขมขนเปนหนวย mass fraction, mg/g โดยความเขมขนค�านวณจากน�าหนกของสารมาตรฐานในหนวย mg ตอน�าหนกรวมของสารมาตรฐานและตวท�าละลายในหนวย g การเตรยมสารละลาย intermediate standard solution เตรยมโดยการเจอจางสารละลาย stock standard solution ดวย methanol โดยการชงเชนเดยวกน แลวค�านวณความเขมขนของสารละลายทเตรยมไดในหนวย mg/g ส�าหรบ working solution หรอทเรยกวาสารละลายมาตรฐานทน�าไปใชงานจรง สามารถเตรยมไดในท�านองเดยวกน สารละลายทงหมดทไดจากการเตรยมจะเกบรกษาไวทอณหภม 4 �C และจะตองท�าการเตรยม working solution ใหมเสมอส�าหรบแตละ batch ของการทดลอง นอกจากนสารละลาย stock solution, intermediate solution และ working solution ของ Isotopically-labelled analogue (D9-clenbuterol) สามารถเตรยมไดในท�านองเดยวกนกบสารละลายมาตรฐานเคลนบวเตอรอลดงทกลาวมาขางตน

การหาความชนในตวอยางชงน�าหนกตวอยางหมบด 0.5 g ดวยเครองชงมความละเอยด 5 ต�าแหนง แลวน�าไปเกบใน dessicator

ซงมสาร anhydrous calcium sulphate (DRIERITE®) เปนสารดดความชน หลงจากเกบทอณหภมหองเปนระยะเวลาอยางต�า 20 วน น�าออกมาชงน�าหนกทเหลอ ค�านวณน�าหนกทหายไปเปนคาความชน จากนนน�าไปเกบตอใน dessicator เปนระยะเวลา 10 วน แลวน�ามาชงอกครง ท�าซ�าไปเรอยๆ จนกวาน�าหนกทไดคงท ซงการหาความชน

ในตวอยางจะตองท�าไปพรอมๆ กนกบการวเคราะหตวอยาง

วธวเคราะหขนตอนการเตรยมตวอยางประกอบดวย 6 ขนตอนทส�าคญ คอ การเตรยม blends การท�าปฏกรยา

ไฮโดรไลซส (hydrolysis) ตอดวยการตกตะกอนดวยโปรตน (protein precipitation) การก�าจดไขมนในเนอสตว (defattening) การสกดตวอยางแบบของเหลว-ของเหลว (liquid-liquid extraction) และการสกดตวอยางแบบของแขง (solid phase extraction, SPE) สดทายน�าไปวเคราะหดวยเครองมอ LC-MS/MS

1. การเตรยม blends สองชนด คอ calibration blend (CB, สารมาตรฐาน) และ sample blend

(SB, ตวอยาง) ส�าหรบ calibration blend เตรยมจากตวอยางหมบดแหงทไมมการปนเปอนของสารเคลนบวเตอรอล 0.5 g (sample blank) และท�าการเตมสารละลายมาตรฐานเคลนบวเตอรอลใหมปรมาณใกลเคยงกบปรมาณ

เคลนบวเตอรอลในตวอยางทหาคาไดคราวๆ จากเทคนค external calibration curve ส�าหรบ sample blend เตรยมโดยการชงตวอยางหมบดแหง APMP.QM-S6 ปรมาณ 0.5 g แลวท�าการเตมสารละลาย D9-clenbuterol ลงในทง sample blend และ calibration blend ในปรมาณทมคาจ�านวนโมลเทากบจ�านวนโมลของสารละลาย

มาตรฐานเคลนบวเตอรอล (ทถกเตมลงไปใน calibration blend กอนหนาน) จากนนเตมสารละลาย เตม

Tris buffer pH 8.0 ปรมาณ 10 mL




2. การท�าปฏกรยาไฮโดรไลซส (hydrolysis) โดยการเตมเอนไซม protease type XIV of Streptomyces griseus ปรมาณ 100 µL (50 g/1 mL ของ tris buffer, pH 8) และปนผสม จากนน incubate ไวท 55 �C เปนเวลา 16 ชวโมง (ขามคน) ปนผสมใหเขากน ปลอยใหเยนทอณหภมหอง

3. วธการตกตะกอนโปรตน (protein precipitation) โดยการปรบสารละลายใหเปนกรด (pH = 1) ดวยกรดไฮโดรคลอรกเขมขน (ประมาณ 350 µL) และปนสารละลายผสม ปลอยทงไว 10 นาท ใหโปรตนตกตะกอน ท�าการแยกเกบเฉพาะสวนทเปนสารละลายโดยน�าตวอยางเขาเครองหมนเหวยงตะกอนทความเรว 4,000 รอบตอนาท ท 4 �C เปนเวลา 10 นาท เกบสารละลายสเหลองใสหลอดพลาสตกใหม โดยกรองผานตวกรองใยแกวขนาด 1 µm จะไดสารละลายสเหลองออนประมาณ 10 mL

4. วธการก�าจดไขมนในเนอสตว (defattening) โดยการเตม hexane 10 mL ปนผสม แลวน�าเขา เครองหมนเหวยงตะกอนทความเรว 4,000 รอบตอนาท ท 4 �C เปนเวลา 5 นาท แยกสวนสารละลาย hexane ออกแลวปรบสารละลายของเหลวใหเปนดาง (pH = 9.5 – 10) ดวย 10 M NaOH (ประมาณ 500 µL)

5. วธการสกดตวอยางแบบของเหลว-ของเหลว (liquid-liquid extraction) สกดตวอยางดวยตวท�าละลายผสม ethyl acetate: isopropanol (99:1, v/v) จ�านวน 3 ครง ครงละ 5 mL น�าเขาเครองหมนเหวยงตะกอนทความเรว 4,000 รอบตอนาท ท 4 �C เปนเวลา 5 นาท เกบสวนสารละลายอนทรย (ชนบน) แลวระเหยสวนทสกดไดใหแหงดวยเครองระเหยตวท�าละลายภายใตกาซไนโตรเจนทอณหภม 45 �C เตม methanol 100 mL และเตมสารละลาย phosphate buffer (pH = 6.0) 5 mL แลวท�าการ sonicate 1 นาท

6. วธการสกดตวอยางแบบของแขง (solid phase extraction, SPE) โดย clean-up ตวอยางดวย VertiPak™ C8/SCX SPE Tubes 6 mL ใชสภาวะดงน คอ condition: methanol 2 mL, equilibrate: Milli-Q water 2 mL และ phosphate buffer (pH =6.0) 2 mL, loading: บรรจตวอยางประมาณ 5 mL, wash 1: ลางดวย 1 M acetic acid 1 mL ท�าใหแหงภายใตสญญากาศ, wash 2: ลางดวย methanol 2 mL ท�าใหแหง ภายใตสญญากาศ และ elute: ชะดวยตวท�าละลายผสม ethyl acetate : ammonia (32%), 97:3 (v/v) 12 mL (6 mL × 2 ครง)

ระเหยสวนทสกดไดใหแหงดวยเครองระเหยตวท�าลายภายใตกาซไนโตรเจนทอณหภม 45 �C เตมสารละลายผสม 0.1% formic acid ในตวท�าละลาย Milli-Q water: acetonitrile (9:1, v/v) ปรมาณ 750 µL ผสมโดย sonicate กรองดวย PTFE filter 0.2 µm ใสขวดเพอฉดเขาเครอง LC-MS/MS

การคำานวณหาปรมาณโดย Exact-Matching Calibrationส�าหรบการค�านวณหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลเกดจากการน�าอตราสวนพนทพคทวดไดทง primary

และ secondary ions ใน sample blend และ calibration blend มาค�านวณโดยใชสมการท (2)

(2)

wx คอ mass fraction ของ clenbuterol ในตวอยางเนอหมบดแหงทตองการหา มหนวย µg/kgwZ, C คอ mass fraction ของ clenbuterol ใน calibration standard มหนวย µg/kgmx คอ มวลของตวอยางเนอหมบดแหงทชงมาเพอใชในการเตรยม sample blend มหนวย gmy คอ มวลของสารละลาย internal standard (D9-clenbuterol) ทเตมลงไปในตวอยางเนอหม

บดเพอเตรยม sample blend มหนวย g



mZ, C คอ มวลของสารละลายมาตรฐาน clenbuterol ทเตมลงไปเพอใชเตรยม calibration blend

มหนวย gmy, C คอ มวลของสารละลาย internal standards (D9-clenbuterol) ทเตมลงไปเพอเตรยม

calibration blend มหนวย gR,

B และ R,B, C คอ อตราสวนพนทพคทวดไดใน sample blend และใน calibration blend ตามล�าดบ

โดยค�านวณจากไอออนของ clenbuterol หารดวยไอออนของ D9-clenbuterolFP และ FE คอ method precision effect, interference effect และ extraction effect

ตามล�าดบ ซงจะก�าหนดใหมคาเทากบ 1 แตจะน�าคาความไมแนนอนจากผลกระทบเหลานมารวมอยในการประมาณ

คาความไมแนนอนของการวดรวม (combined standard uncertainty)FP คอ dry mass correction factor ซงไดมาจากการหาความชนในตวอยางหมบดแหง

การประมาณคาความไมแนนอนของการวดการประมาณคาความไมแนนอนของการวด ยดหลกการตาม Eurachem Guide(9) และ JCGM 100:2008

(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement)(10) ส�าหรบการประมาณคาความไมแนนอน

ของการวดจากการใชเทคนค exact-matching double IDMS นน จะขนอยกบสมการหลกทใชในการค�านวณ

(สมการท 2) และการรวมคาความไมแนนอนของการวดจากแหลงตางๆ สามารถรวมกนไดดงสมการท (3)

(3)

โดยท u(wz, c) เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของ mass fraction ของสารละลายมาตรฐาน clenbuterol ทใชในการเตรยม calibration blend ค�านวณจากคาความไมแนนอนมาตรฐานของความบรสทธของ clenbuterol น�าหนกของสารทใชในการเตรยมสารละลายมาตรฐาน และการเปรยบเทยบสารละลายมาตรฐาน (standard comparison) u(my), u(my,c), u(mx), u(mz,c) เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของน�าหนกตางๆ ค�านวณจาก bias และ precision ของเครองชง

FP เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของปจจย precision ของวธ ซงค�านวณจาก standard deviation of the mean (sdm) ของการท�าซ�า

FE เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของปจจยจากการสกด ซงค�านวณมาจาก bias ของการสกด liquid-liquid extraction และ solid phase extraction

FI เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของปจจยจากตวรบกวนใน mass spectrometer (interference effect) ซงค�านวณมาจาก bias ระหวาง primary ion pair และ secondary ion pair

Fdrymass เปนคาความไมแนนอนมาตรฐานของปจจย dry mass correction ซงค�านวณมาจากการวเคราะหหาคาความชนในตวอยาง

ส�าหรบคาความไมแนนอนจาก R'B และ R'B, C ซงเปนคาความไมแนนอนทเกดจากการวด isotope amount ratios ใน sample blend และ calibration blend ตามล�าดบ จะถอวาถกคดรวมอยในปจจย precision ของวธอยแลว ซงถาหากมปจจยอะไรกตามทสงผลกระทบตอการวด ratio R'B และ R'B, C กจะถอวามผลนอยมาก




และสามารถหกลางกนไดในทสด เนองจากทง sample blend และ calibration blend ถกเตรยมใหเหมอนกน (exact-matched) ทงในเรองความเขมขน, ตวกลาง และ isotope ratio

การควบคมคณภาพของการวเคราะหเนองจากไมมวสดอางองรบรองของสารเคลนบวเตอรอลทอย ในตวกลางทเหมอนกบตวอยางจรง

(ในเนอหม) ทวเคราะห ดงนนการควบคมคณภาพ (quality control, QC) จงด�าเนนการจากการวเคราะห spiked sample จ�านวน 2 ซ�า ทกครงควบคไปกบการวเคราะหตวอยางจรง โดยใหคา accuracy (% recovery) และ precision (% RSD) อยในชวงเกณฑก�าหนด

ผลผลจากการวดคาความชนในตวอยางหมบด APMP.QM-S6 ไดคาความชนเทากบ 1.07% ± 0.04%

(k = 2.0 ทระดบความเชอมน 95%, n = 4) ซงคาความชนทไดน�าไปใชในการค�านวณ mass fraction ของสาร เคลนบวเตอรอลตอน�าหนกตวอยางแหงตอไป ผลจากการประเมนความบรสทธของสารมาตรฐานเคลนบวเตอรอล โดยใชเทคนค HPLC-UV, TGA และ KFT ไดคาความบรสทธ 99.32 % ± 0.13% (k = 2.0 ทระดบความเชอมน

95%) นอกจากนผลจากการควบคมคณภาพของการวเคราะหโดยการใช spiked sample ท�าการสราง control chart ตลอดชวงระยะเวลาของการวเคราะห ไดผลอยในชวงเกณฑทยอมรบ ทง accuracy (% recovery, ในชวง 95% - 105%) และ precision (% RSD < 3%)

ผลการตรวจวเคราะหสารเรงเนอแดงในตวอยาง APMP.QM-S6 ดวยเทคนค exact-matching double IDMS โดยคาทหองปฏบตการรายงาน เกดจากคาเฉลยจากการวเคราะห 3 การทดลอง (iterations) โดยแตละ การทดลองท�าการวเคราะห 4 ซ�า และมการปรบแกคาดวยคาความชนทวดได มคาเฉลย และคาความไมแนนอนเทากบ 5.00 µg/kg ± 0.25 µg/kg (k = 2.03 ทระดบความเชอมน 95%) ซงคาอางองของโปรแกรมเปรยบเทยบผลการวด (Supplementary Comparison Reference Value, SCRV) เทากบ 5.216 µg/kg ± 0.131 µg/kg (k = 2.78 ทระดบความเชอมน 95%)(11) แหลงของความไมแนนอนของการวดหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหงแสดงรายละเอยด (ตารางท 3) และเมอเทยบเปนสดสวนแหลงของความไมแนนอนจากแหลงตางๆ (ภาพท 2) พบวาแหลงความไมแนนอนทใหญทสดมาจาก precision ของวธ (49%) รองลงมาจากตวรบกวน (interference) ในระบบ mass spectrometer (20%) จากการสกด (extraction, 17%) และแหลงความไมแนนอนจากการเตรยมสารมาตรฐาน (my , 14%) ส�าหรบแหลงความไมแนนอนจากแหลงอนๆ เชน จากการชง (my , mz,c , mx , my, c) และจากปจจย dry mass correction (Fdrymass) มขนาดเลกมากเมอเทยบกบจาก 4 แหลงทกลาวมา

ตารางท 3 Uncertainty budget ของการวดหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง

wz,c (µg/kg) 8.3414 0.076265 0.9143%my (g) 0.28809 0.000049 0.0172%mz,c (g) 0.28933 0.000049 0.0171%mx (g) 0.51371 0.000049 0.0096%my, c (g) 0.29174 0.000049 0.0170%

Parameter (unit) Typical value Standard Relative standard uncertainty uncertainty (%)



Parameter (unit) Typical value Standard Relative standard uncertainty uncertainty (%)

ตารางท 3 Uncertainty budget ของการวดหาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง (ตอ)

Fdrymass (1) 0.98928 0.000061 0.0062%FP (1) 1.000 0.01697 1.697%FE (1) 1.000 0.0100 1.000%FI 1.000 0.0110 1.097%Combined relative standard uncertainty 2.43%

ภาพท 2 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวดปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง

ภาพท 2 สดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวดปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง

เมอเปรยบเทยบคาท มว. (NIMT) รายงานกบคาทรายงานโดยประเทศอนๆ ทเขารวม พบวาหองปฏบตการ สวนใหญไดผลการวดอยในชวงของคาอางอง และคาความไมแนนอนของ SCRV ของโปรแกรมการเปรยบเทยบ

ผลการวดทเสนอโดยเจาภาพผจด ยกเวนหองปฏบตการ A และ F (ตารางท 4)




ตารางท 4 คาปรมาณสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง และ expanded uncertainty (ทระดบความเชอมน 95%) รายงานโดยประเทศตางๆ ทเขารวม APMP.QM-S6(11)

A 4.43 0.82 มว. (NIMT) 5.00 0.25 B 5.18 0.50 C 5.30 0.40 D 5.30 0.68 E 5.30 0.29 F 9.97 0.89คาอางอง (SCRV) 5.216 0.131

NMIs/DIs Mass fraction (µg/kg) on dry Expanded uncertainty mass basis (µg/kg)

หมายเหต : เนองจากเปนการเผยแพรผลการวดของประเทศอนดวย จงใชสญลกษณ A, B, C, D, E และ F

แทนชอของประเทศอนๆ ทเขารวม

การสอบกลบไดทางมาตรวทยาของผลการวดผลการวดสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหงทไดสามารถสอบกลบไดทางมาตรวทยาโดยการเชอมโยง

ไปสหนวยการวดทไดมาจาก SI คอ หนวย mass fraction ซงรายงานในหนวย µg/kg สามารถแปลงหนวยไดเปน g/g เทากบ 1 (SI coherent derived unit “one”(1)) ในการอธบายความสามารถในการสอบกลบไดของผลการวดครงน สามารถแสดงผาน 3 กระบวนการดวยกน กลาวคอ กระบวนการแรกสารมาตรฐานเคลนบวเตอรอลทน�ามาใชในการเตรยมเปน calibrator ไดรบการประเมนคาความบรสทธโดยใชเทคนค HPLC-UV, TGA และ KFT ซง คาความบรสทธทไดมสมบตในการสอบกลบไดทางมาตรวทยา กระบวนการทสอง ทกขนตอนในการเตรยมสารละลายมาตรฐานหรอการเตรยมตวอยาง จะเตรยมโดยการใชเครองชงทไดรบการสอบเทยบ ซงจะท�าใหผลการวดทไดจากเครองชง คอ มวล (mass) สามารถสอบกลบไดทางมาตรวทยา ผานกโลกรมของ มว. ไปยงกโลกรมมาตรฐานของโลก (prototype of the kilogram) ซงมอยหนงเดยวในโลกท BIPM ณ กรงปารส กระบวนการทสาม คอ วธการวดทน�ามาใชคอ เทคนค exact-matching double IDMS ซงเปนทยอมรบกนวาเปน primary ratio method โดยอาศยหลกการวด isotope number ratio ท�าใหผลการวดมความถกตองสง และไดมการประมาณคาความไมแนนอนของการวดอยางละเอยดรอบคอบ โดยไดมการน�าปจจยอนๆ ทนอกเหนอจากสมการการค�านวณหลก ทอาจจะมผลตอ

การวด มาคดรวมอยในการประมาณคาความไมแนนอนสดทายอกดวย เมอ 3 กระบวนการดงกลาวไดเกดขน จงท�าผลการวดสารเคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหงมสมบตการสอบกลบไดทางมาตรวทยา และสามารถเขยนเปน

metrological traceability chain (ภาพท 3)



โดยจดสงสดของโซการสอบกลบไดทางมาตรวทยาเปน หนวย SI (SI coherent derived unit “one” (1)) สญลกษณสเหลยมจตรส (แทนหนวยเอสไอ kg) สเหลยมคางหม (แทนหนวยเอสไอ mol/mol) และสเหลยมขนมเปยกปน (แทนการวด isotope number ratio) จะตดอยกบกลอง “measurement procedure” แสดงหนวย

การวดทเกยวของ ซงจะทาบเชอมโยงไปยงสวนบนสดของโซ ตวเลข 1 และ 2 ทระบไวในกลองสเหลยมทงสามชนดแทน primary measurement procedure 1 และ measurement procedure 2 ตามล�าดบ มกจกรรมเกดขน 2 กจกรรมทท�าใหเกดเปนโซ คอ ถายคา (assign) และสอบเทยบ (calibrate) โดย measuring system จะท�าหนาทในการถายคา (assign) และตว calibrator จะท�าหนาทในการสอบเทยบ (calibrate) ซงผลทไดคอ ผลการวด

(measurement results) จะประกอบดวยคาปรมาณ (quantity value = value + measurement unit) และลางสดของโซกระบวนการ calibration hierarchy จะท�าใหมคาความไมแนนอนของการวด (relative measurement uncertainty, RMU) เพมขน

วจารณวธการวดสารเรงเนอแดงในหมบดแหงโดยเทคนค exact-matching double IDMS เปนวธทใชในการวด

เพอความถกตองสง สามารถน�าไปใชในการวดตางๆ เชน เพอใหคาอางอง (certified value) แกวสดอางองรบรอง (Certified Reference Material, CRM) ใหคาอางองแกโปรแกรมทดสอบความช�านาญ (proficiency testing scheme, PT) หรอใหคาอางองกรณทมขอโตแยงของผลการวด

เทคนค exact-matching double IDMS นอกจากจะตองท�าให peak area หรอสญญาณทได mole ratio ทงใน calibration blend และ sample blend มความใกลเคยงกนใหมากทสดแลว ชนดของตวกลาง (matrix)

ภาพท 3 โซการสอบกลบไดทางมาตรวทยา (metrological traceability chain) ของผลการวดปรมาณสาร เคลนบวเตอรอลในเนอหมบดแหง




จะตองใกลเคยงกนดวย เนองจากผลกระทบจากตวกลางนเปนปญหาหลกในการวเคราะหทางดานเคมทจะท�าใหเกดความผดพลาดในการวเคราะหได ซงอาจจะเนองมาจากผลของ matrix suppression หรอ matrix enhancement ดงนนในการวเคราะหดวยเทคนค exact-matching double IDMS จงตองเตรยม calibration blend ใน matrix blank ชนดเดยวกนหรอใกลเคยงกบตวอยางจรงใหมากทสด เพอใหผลกระทบจากปจจยนทงในตวอยาง และ ใน calibration blend มปรมาณเทากน และถอวาสามารถหกลางกนไดในทสด

การประเมนความบรสทธของสารมาตรฐานทน�ามาใชมความจ�าเปน เนองจากเปนสวนส�าคญทท�าใหผล

การวดนนมสมบตการสอบกลบไดทางมาตรวทยา (metrological traceability) ทงนขอตกลงของการเปรยบเทยบผลการวดดานเคมในระดบนานาชาต (ทงระดบโลก, CCQM และระดบภมภาคเอเชยแปซฟก, APMP) ไดก�าหนดวาผลการวดของประเทศผเขารวมแบบ key comparison/supplementary comparison จะสามารถน�าคามาคด

รวมเปนคาอางอง KCRV/SCRV ไดกตอเมอผลการวดนนม metrological traceability กลาวคอ การวดนน

จะตองมการใชสารมาตรฐานทเปน CRM หรอถาไมสามารถจดหาสารมาตรฐานทเปน CRM ได กจะตองมการประเมนความบรสทธของสารมาตรฐานทน�ามาใช

การวเคราะหสารในกลมเบตาอะโกนสท (β-agonists) จดวาเปนการวดทมความทาทายสง เนองจากสารเหลานจะจบกบไขมน หรอโปรตน ซงจะตองมวธการเตรยมตวอยางทด ตองมนใจไดวาสารเหลานจะหลดออกมาหมดเวลาท�าการสกด นอกจากนสภาวะทใชในการไฮโดรไลซสเพอใหสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลหลดออกมาจากเนอเยอสตวมความส�าคญมาก การเตมเอนไซมลงไปในสภาวะความเปนกรด-เบส ทเหมาะสมจะชวยใหประสทธภาพ

การไฮโดรไลซสมความสมบรณมากขน ซงจากการทดลองไดลองใชวธการไฮโดรไลซสทงในสภาวะกรด(12) และ สภาวะเบส(13) โดยการไฮโดรไลซสในสภาวะกรด (pH 5.2) จะใชเอนไซม β-Glucuronidase (incubate at 37 �C, 16 hours) พบวาผลการวดในตวอยาง APMP.QM-S6 ทไดจากการท�าซ�าไมสอดคลองกน ไดคาทกระจายกนมาก แตเมอเปลยนเปนการไฮโดรไลซสในสภาวะเบส (pH 8.0) โดยใชเอนไซม protease type XIV of Streptomyces griseus (incubate at 55 �C, 16 hours) พบวาใหผลการวดในตวอยาง APMP.QM-S6 จากการท�าซ�าทสอดคลองกนเปนอยางด ดงนนจงเลอกใชวธการไฮโดรไลซสในสภาวะเบส ส�าหรบการก�าจดตวรบกวนโปรตนสามารถ

ท�าไดงายโดยการเตมกรดลงไปท�าใหโปรตนเสยสภาพ (degradation) จากนนจะเกดการแยกชนโปรตนออกมา ซงงายตอการก�าจดทง ไขมนเปนตวรบกวนทมขวต�าซงจะพบมากในตวอยางทเปนเนอสตวสามารถก�าจดออกได

โดยการเตม hexane ซงเปนตวท�าละลายทไมมขว นอกจากนการใชเทคนค liquid-liquid extraction และ solid phase extraction (SPE) เปนการก�าจดสารอนทรยตวอนๆ ทไมสนใจ โดยอาศยสภาพความเปนขวทตางกนและ การเลอกใชตวท�าละลายทเหมาะสมเปนการลดตวรบกวนใน mass spectrometer ซงสงผลใหผลการวดทไดม

ความถกตองมากยงขน คาความไมแนนอนของการวดทไดจากเทคนค exact-matching double IDMS มขนาดเลกมากเมอเทยบ

กบเทคนคอนๆ เชน external calibration curve หรอ standard addition เนองจากในสมการการค�านวณหลก

มพารามเตอรทเกยวของ คอ mass (uncertainty จากการชงจะมขนาดเลกมาก) ความเขมขนของ working standard ซงถกเตรยมโดยการชง (gravimetric preparation) ท�าให uncertainty มขนาดเลกเชนกน ปจจยหลกของแหลงความไมแนนอนจงมาจากการวเคราะหซ�า (method precision) ล�าดบการฉดตวอยางโดยใชเทคนค

bracketing(14) (การฉดคนระหวาง calibration blend และ sample blend) นอกจากจะชวยในเรอง instrumental drift แลว ยงชวยให precision ของผลการวดดยงขนดวย

จากการเขารวมเปรยบเทยบการวด APMP.QM-S6 หองปฏบตการวเคราะหอนทรยเคม ฝายมาตรวทยาเคมและชวภาพของ มว. ไดแสดงศกยภาพในการวดทงไดผลการวดทสอดคลองกบผลจากหองปฏบตการของสถาบนมาตรวทยาแหงชาตของประเทศอนๆ และมคาความไมแนนอนของการวดทมขนาดเลก นอกจากนผลจากการเขารวม



เปรยบเทยบผลการวดในระดบนานาชาต APMP.QM-S6 ยงเปนการทดสอบความใชไดของวธทไดท�าการพฒนา (method validation) อกดวย หองปฏบตการวเคราะหอนทรยเคม ไดผานการประเมนระบบคณภาพ ISO/IEC 17025: 2005 (ผาน peer review, pathway C) เมอเดอนเมษายน 2557 ในรายการวดอนๆ รวมถงรายการนดวย นบเปนกาวส�าคญทน�าไปสการประกาศความสามารถของการวดโดยการ claim CMC (Calibration Measurement Capability) บนเวบไซตของ BIPM ซงเปนแผนทจะด�าเนนการตอไปในป 2558 และปจจบนรายการวด

สารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลไดเปดใหบรการอยางเปนทางการแกผจดโปรแกรมทดสอบความช�านาญ หรอ

ผผลต CRM ทตองการคาอางองรบรอง

สรปจากการทหองปฏบตการวเคราะหอนทรยเคมไดพฒนาวธการวดสารเรงเนอแดงเคลนบวเตอรอลในเนอหม

บดแหง โดยใชเทคนค exact-matching double IDMS และไดใชวธนเขารวมเปรยบเทยบผลการวดระหวางประเทศ และไดผลการเปรยบเทยบทมความถกตองสง มคาความไมแนนอนของการวดขนาดเลกและผลการวดมความสอบกลบไดทางมาตรวทยานน ถอวาเปนการประกาศความสามารถในการวดครงนใหประเทศอนๆ ไดรบร ใหตางประเทศยอมรบในมาตรฐานการวดทางดานเคม วามความเทาเทยมกบนานาชาต และสถาบนมาตรวทยาแหงชาตสามารถกระจาย เผยแพรความสามารถในการวดดานน ใหแกหองปฏบตการในประเทศไทยทท�าการตรวจวดสารเคลนบวเตอรอล

เพอสามารถวดไดอยางถกตอง มความนาเชอถอ และสอบกลบได โดยผานการผลตวสดอางองรบรอง (CRM) หรอการก�าหนดคาอางองใหกบโปรแกรมทดสอบความช�านาญ (PT) ตอไป

กตตกรรมประกาศส�าหรบการเปรยบเทยบการวดครงนไดรบความอนเคราะหจาก สพ.ญ.สจตตรา พงศววฒน จากส�านก

ตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว ในการใหค�าปรกษา รวมทงอนเคราะหใหยมสารเคมบางสวน

และขอขอบคณ มว. ทใหการสนบสนนในเรองคาใชจายตางๆ ทเกดขนระหวางทไดท�าการวเคราะหในครงน

เอกสารอางอง 1. Spiller HA, James KJ, Scholzen S, Borys DJ. A descriptive study of adverse events from clenbuterol

misuse and abuse for weight loss and bodybuilding. Subst Abus 2013; 34(3): 306-12. 2. Kuiper HA, Noordam MY, van Dooren-Flipsen MM, Schilt R, Roos AH. Illegal use of beta-adrenergic

agonists: European community. J Anim Sci 1998; 76(1): 195-207. 3. Elliott CT, McEvoy JD, McCaughey WJ, Shortt DH, Crooks SR. Effective laboratory monitoring for

the abuse of the beta-agonist clenbuterol in cattle. Analyst 1993; 118(4): 447-8. 4. Codex Alimentarius Commission. Maximum residue limits for clenbuterol. [online]. 2012; [cited 2014 Apr

17]; [1 screen]. Available from: URL: http://www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/vetdrugs/details.html; jsessionid=0DB0C8B130F8E59454A24F70BD22F850?id=13

5. Sin DWM, Ho C, Yip YC. APMP supplementary comparison and pilot study clenbuterol in porcine meat (APMP.QM-S6 and APMP.QM-P22). Hong Kong, China: Government Laboratory (GLHK); 2013.

6. Richter W. Primary methods of measurement in chemical analysis. Accredit Qual Assur 1997; 2(8): 354-9.




7. De Bièvre P, Peiser HS. Basic equations and uncertainties in isotope-dilution mass spectrometry for traceability to SI of values obtained by this primary method. Fresenius J Anal Chem 1997; 359(7-8): 523-5.

8. Mackay LG, Taylor CP, Myors RB, Hearn R, King B. High accuracy analysis by isotope dilution mass spectrometry using an iterative exact matching technique. Accred Qual Assur 2003; 8(5): 191-4.

9. Ellison SLR, Williams A, editors. EURACHEM/CITAC Guide: quantifying uncertainty in analytical measurement. 3nd ed. United Kingdom: EURACHEM; 2012.

10. JCGM 100:2008 Evaluation of measurement data -- guide to the expression of uncertainty in

measurement. JCGM; 2008. 11. Sin DWM, Ho C, Yip YC. Draft a report of APMP.QM-S6 APMP supplementary comparison

clenbuterol in porcine meat. Hong Kong, China: Government Laboratory, (GLHK); 2014. 12. Shao B, Jia X, Zhang J, Meng J, Wu Y, Duan H, et al. Multi-residual analysis of 16 β-agonists in pig

liver, kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Food Chemistry 2009; 114: 1115-21.

13. สจตตรา พงศววฒน. เอกสารการประชม ASEAN Food Reference Laboratory for Veterinary Drug Residues (AFRL for VDR) เรอง Analytical method for beta-agonists.วนท 13-16 สงหาคม 2556. ปทมธาน: ส�านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว; 2556.

14. Muaksang K. Development of reference methods and reference materials for trace level antibiotic residues in food using IDMS [dissertation]. Sydney, Australia: The University of New South Wales; 2009.



Analysis of Clenbuterol in Porcine Meat Utilizing an Exact-Matching Double IDMS:

Interlaboratory Comparison Result: APMP.QM-S6 Clenbuterol in Porcine Meat

Kittiya Shearman Pornhatai Kankaew Preeyaporn Pookrod Sornkrit Marbumrung Panadda SilvaChemical Metrology and Biometry Department, The National Institute of Metrology, Thailand (NIMT), Klong 5, Klong Luang, Pathumthani, 12120

ABSTRACT Clenbuterol is a type of β-agonist which has been used as an illegal growth promoter in meat production. The presence of clenbuterol in meat for human consumption is a health risk for consumers and is therefore forbidden in many countries. The Organic Analysis Laboratory of the National Institute of Metrology, Thailand (NIMT) participated in the interlaboratory comparison, APMP.QM-S6: Clenbuterol in porcine meat. The measurement method used was the exact-matching double isotope dilution mass spectrometry (IDMS) technique. This measurement procedure involved

alkaline hydrolysis, acid precipitation, defattening, liquid-liquid extraction, solid phase extraction (SPE) clean-up and analysis of sample extracts by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) operating in positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The purity of clenbuterol standard obtained from the in-house purity assessment utilized metrological traceability of measurement results. The mass fraction of clenbuterol in APMP.QM-S6 sample reported by NIMT was 5.0 µg/kg with 5.0% relative expanded uncertainty (at the 95 % confidence interval) which was in agreement with results from other metrology institutes. The Supplementary Comparison

Reference Value (SCRV) was 5.216 µg/kg ± 0.131 µg/kg.

Key words: Clenbuterol, exact-matching double IDMS, interlaboratory comparison




การพฒนาวธวเคราะหปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณ

โดยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง

จรานช แจมทวกล สเมธ เทยงธรรม วลยลกษณ เมธาภทร และจตรา ชยวฒนส�ำนกยำและวตถเสพตด กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 27 January 2015

บทคดยอ วธวเคราะหหาปรมาณเดกซาเมทาโซน (dexamethasone) และเพรดนโซโลน (prednisolone) ทปนปลอม

ในยาแผนโบราณถกพฒนาขนโดยใชเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ใชคอลมน Hypersil BDS RP-8 มสวนผสมของ acetonitrile และน�าเปนสารละลายตวพา และเตรยมตวอยางโดยเทคนคการสกดแยกสารดวยตวดดซบของแขง (Solid Phase Extraction, SPE) จากการทดสอบความถกตองของวธ พบวามชวงการวเคราะหทใหความสมพนธเปนเสนตรงท 250-12,500 ไมโครกรมตอลตร โดยมคาสมประสทธสหสมพนธของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน เทากบ 0.9987 และ 0.9988 ตามล�าดบ ความแมนและความเทยงของวธโดยการเตมสารละลายเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในตวอยางทความเขมขนแตกตางกน 3 ระดบ คอ 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร พบวาคารอยละการคนกลบของสารมาตรฐาน อยในชวง 100.30-104.53 และ 100.02-102.18 ตามล�าดบ และรอยละของคาเบยงเบนมาตรฐานสมพทธของความเทยง อยในชวง 0.04-2.01 และ 0.15-2.47 ตามล�าดบ ปรมาณต�าสดทวเคราะหปรมาณไดของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน มคาเทากบ 250.14 และ 249.30 ไมโครกรมตอลตร ตามล�าดบ จงกลาวไดวาวธทพฒนาขนนมความเหมาะสมในการน�าไปใชในการเฝาระวงการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลนในยาแผนโบราณไดอยางมประสทธภาพ


method Development for Determination of Dexamethasone and Prednisolone Jiranuch Jamtaweekul et al.

บทนำา เดกซาเมทาโซน (Dexamethasone) มชอทางเคมวา 9-Fluoro-11β, 17, 21-trihydroxy-16α-

methylpregna-1, 4-diene-3, 20-dione สตรโมเลกล C22H29FO5 น�าหนกโมเลกล 392.47 มลกษณะเปนผลก

สขาว ไมมกลน ไมละลายน�า และเพรดนโซโลน (Prednisolone) มชอทางเคมวา 11β, 17, 21-Trihydroxypreg-na-1, 4-diene-3, 20-dione สตรโมเลกล C21H28O5 น�าหนกโมเลกล 360.45 มลกษณะเปนผลกสขาว ละลายน�าได เลกนอย (รปท 1)(1, 2, 3)

เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนจดเปนยาในกลมคอรตโคสเตยรอยด (corticosteroid)(4) ซงเปนยาควบคมพเศษ ตามประกาศกระทรวงสาธารณสข เรอง ยาควบคมพเศษ ฉบบลงวนท 26 พฤษภาคม 2521(5) ในทางการแพทยใชเปนยาตานอกเสบและแกแพ ใชรกษาอาการแพชนดรนแรงหรอเรอรง เชน หอบหด แพยา โรคภมแพ ทางผวหนง หรอกลมโรคออโตอมมน เชน อณฑะอกเสบจากคางทม โรคไตรว (nephrotic) เอสแอลอ (Systemic Lupus Erythematosus, SLE) เปนตน ผทใชยาชนดนตองอยในความดแลของแพทยอยางใกลชด เพราะหากไดรบตดตอกนเปนระยะเวลานานอาจท�าใหเกดอาการบวมน�า กระเพาะอาหารทะล กระดกพรน ภมคมกนรางกายต�าท�าใหตดเชอไดงาย อาจเกดโรคแทรกซอนทเปนอนตรายถงแกชวตได ยากลมคอรตโคสเตยรอยดมผลตอรางกายเกอบทกระบบ ตองระมดระวงในการใชยาชนดนในผปวยโรคความดนโลหต โรคหวใจ และโรคเบาหวาน(6) (ภาพท 1)

ภาพท 1 สตรโครงสรางทางเคมของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน

ในปงบประมาณ 2553 ส�านกยาและวตถเสพตดไดท�าการตรวจวเคราะหการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลนในผลตภณฑยาแผนโบราณ ดวยเทคนครงคเลขผวบาง (Thin-layer Chromatography) จ�านวน 302 ตวอยาง ตวอยางสวนใหญสงตรวจโดยผบรโภคและส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา ผลการตรวจพบวาม

การปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน จ�านวน 53 ตวอยาง คดเปนรอยละ 17.5(7) โดยพบการปนปลอม

ในตวอยางทงในรปแบบยาลกกลอน ยาเมดรปทรงกระบอก ยาผง และยาแคปซล ตวอยางทพบการปนปลอมของ เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนมกมขอความแสดงสรรพคณแกปวดเมอย ปวดตามขอ แกอมพฤกษ อมพาต ฯลฯ ไมมเลขทะเบยนต�ารบยา ไมทราบแหลงผลตทแนชด และพบวาผบรโภคสวนใหญมกเปนกลมผสงอาย ผมโรคประจ�าตว เชน หอบหด หรอผทท�างานหนก ท�าใหมอาการปวดเมอย จงเปนผทมความเสยงสงทจะไดรบยาแผนโบราณทไมปลอดภย แมหนวยงานคมครองผบรโภคดานสาธารณสขจะไดด�าเนนการรณรงคเพอปองกนและแกไขปญหาดงกลาวอยางตอเนอง แตยงคงตรวจพบการปนปลอมในจ�านวนใกลเคยงกบทเคยตรวจพบในปทผานมา ซงอาจเปนผลมาจากกระแสความนยมการใชสมนไพรเพอรกษาโรค โดยมความเชอมนในสรรพคณและมนใจวาไมมอนตรายหรอมพษ

นอยกวายาแผนปจจบน แตกลบมผฉวยโอกาสปนปลอมตวยาดงกลาวในผลตภณฑยาแผนโบราณเพอหวงผลทาง



การพฒนาวธวเคราะหปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน จรานช แจมทวกล และคณะ

การคา และยงพบการปนปลอมสารดงกลาวในยาแผนโบราณและยาทมาจากสมนไพรในตางประเทศ เชน สงคโปร มาเลเซย สหรฐอเมรกา(8, 9) การทจะท�าใหประชาชนตระหนกถงพษภยและมความรความเขาใจในการเลอกซอผลตภณฑยาแผนโบราณใหมากขน จงจะตองรถงปรมาณการปนปลอมยาแผนปจจบนดงกลาวในผลตภณฑยาแผนโบราณ

เพอประโยชนตอตวผบรโภคและแพทยผรกษาผปวยทไดรบยาแผนโบราณทมการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลน โดยกอนหนานมการศกษาเกยวกบการตรวจเอกลกษณและหาปรมาณสารสเตยรอยดทปนปลอมในยาทมาจากสมนไพร(10, 11, 12) อาหารสตว(13) ปสสาวะ(14) ดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสงทใช ตวตรวจวดเปนยว(10, 11, 12) หรอแมสสเปกโทรมเตอร(14) นอกจากนยงมวธมาตรฐานในการหาปรมาณเดกซาเมทาโซนทระบในต�าราฟารมาโคเปยของสหรฐอเมรกาทใชเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง และใชสารละลายตวพาแบบ isocratic ทมสวนผสมระหวาง acetonitrile และน�า(1) แตเนองจากในปจจบนส�านกยาและวตถเสพตด

มวธมาตรฐานส�าหรบการตรวจเอกลกษณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณหรอยาทมาจากสมนไพรดวยเทคนครงคเลขผวบางเทานน อกทงวธการดงกลาวมขนตอนการสกดทยงยาก ตองใชคลอโรฟอรมซงเปนตวท�าละลายอนทรยทมความเปนพษ(15) และยงไมมวธมาตรฐานส�าหรบการตรวจวเคราะหหาปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน

ในยาแผนโบราณหรอยาทมาจากสมนไพรซงมความหลากหลายขององคประกอบทางเคม จ�าเปนอยางยงทตองแยก สงรบกวนการตรวจวดปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนออก ลดขนตอนการสกด เพมประสทธภาพการแยก และใชวธทไมยงยากซบซอน ดงนนจงไดศกษาและพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมสเตยรอยดดงกลาวในยาแผนโบราณดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสงทมตวตรวจวดเปนยว ซงวธนนยมใชในการตรวจเชงปรมาณ เนองจากใหผลรวดเรว ไมยงยาก ถกตองและแมนย�า

วสดและวธการสารมาตรฐานและสารเคม

สารมาตรฐานเดกซาเมทาโซนของส�านกยาและวตถเสพตด ความบรสทธรอยละ 99.20 รนผลต 652008, สารมาตรฐานเพรดนโซโลนของต�าราฟารมาโคเปยสหรฐอเมรกา ความบรสทธรอยละ 99.40 รนผลต N1J277, Methanol HPLC grade ผลตภณฑของ Mallinckrodt ประเทศสหรฐอเมรกา, Acetonitrile HPLC grade ผลตภณฑ

ของ Mallinckrodt ประเทศสหรฐอเมรกา, น�าความบรสทธสง (Type I water) ผลตจากเครองของ Millipore ประเทศสหรฐอเมรกา

เครองมอและอปกรณ เครองโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง ผลตภณฑของ Waters Millipore Corporation

ประเทศสหรฐอเมรกา รน 2695-2996, คอลมน Hypersil BDS C8 ขนาด 4.6 × 150 มลลเมตร บรรจอนภาคขนาด 5 ไมโครเมตร ผลตภณฑของ Thermo Scientific ประเทศสหรฐอเมรกา, การดคอลมน Phenomenex C8 ขนาด 3.0 × 4.0 มลลเมตร ผลตภณฑของ Phenomenex Inc. ประเทศสหรฐอเมรกา, ตวดดซบ Chromobond®

Cartridge รน HRX เปน hydrophobic polystyrene-divinylbenzene ขนาดความจ 200 มลลกรม ผลตภณฑของ MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG ประเทศสหพนธสาธารณรฐเยอรมน, เครองผสมสารละลาย ผลตภณฑของ Fisher Scientific ประเทศสหรฐอเมรกา รน 232, เครองหมนเหวยง ผลตภณฑของ Precision Scientific ประเทศสหรฐอเมรกา, เครองเขยาความถสง ผลตภณฑของ Elma ประเทศสหพนธสาธารณรฐเยอรมน รน Elmasonic S100H, เครองชง ผลตภณฑของ Mettler Toledo ประเทศสหรฐอเมรกา รน AT261, แผนเมมเบรน

ส�าหรบกรองชนดไนลอน ผลตภณฑของ Vertical Chromatography Co., Ltd. ประเทศไทย ขนาด 0.45 ไมครอน เสนผาศนยกลาง 13 มลลเมตร



ตวอยาง ตวอยาง เปนตวอยางทไดจากผลตภณฑยาแผนโบราณรปแบบลกกลอนและรปแบบผงทไดจากการสง

ตวอยางมาทดสอบกบทางส�านกยาและวตถเสพตด ซงไดตรวจสอบดวยเทคนครงคเลขผวบางแลววาไมพบ

การปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน โดยบดรวมใหเปนเนอเดยวกน น�ามาอบท 55-60 องศาเซลเซยส จนแหงและบดซ�าอกครง บรรจในภาชนะปดสนทปองกนแสงและความชน

การเตรยมสารละลายตวอยางชงผงตวอยาง 14 กรม ละลายใน 25% v/v methanol จ�านวน 200 มลลลตร ปนแยกตะกอนดวย

เครองหมนเหวยงความเรวสง

การเตรยมสารละลายมาตรฐาน สารละลายมาตรฐาน dexamethasone Stock Solution (DSS) และ prednisolone Stock Solution

(PSS) แยกเตรยมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนใน 25% v/v methanol ใหแตละชนดมความเขมขน 2 มลลกรมตอมลลลตร

สารละลายมาตรฐานผสม (Mixed Standard Solution, MSS) ปเปตสารละลายมาตรฐาน DSS และ PSS อยางละ 20.0 มลลลตร ลงในขวดปรบปรมาตร ขนาด 50.0 มลลลตร และปรบปรมาตรดวย 25% v/v methanol

สารละลายมาตรฐานส�าหรบกราฟมาตรฐาน เตรยมสารละลายมาตรฐาน MSS ในสารละลายตวอยาง โดยปรบปรมาตรดวย 25% v/v methanol น�ามาสกดดวยตวดดซบของแขงใหมระดบความเขมขนสดทาย เทากบ 250, 1,250, 2,500, 5,000, 7,500, 10,000 และ 12,500 ไมโครกรมตอลตร

การเตรยมตวอยางดวยเทคนคการสกดดวยตวดดซบของแขง (Solid Phase Extraction, SPE)ชงผงตวอยางน�าหนก 0.35 กรม ใสในหลอดทดลองทมฝาปด เตม 25% v/v methanol จ�านวน 10.0

มลลลตร น�าไปผสมดวยเครองผสมสารละลายอยางนอย 1 นาท น�าไปเขยาสารดวยความถสงตอเปนเวลา 5 นาท

จากนนปนแยกตะกอนดวยเครองหมนเหวยงความเรวสงประมาณ 4,000 รอบ/นาท เปนเวลา 5 นาทเตรยมความพรอมของตวดดซบทบรรจใน cartridge ดวย methanol และน�า อยางละ 3 มลลลตร ปเปตสารละลายใสทไดหลงจากการปนแยกตะกอนแลว จ�านวน 3 มลลลตร ใสลงใน cartridge จากนน

ใส 5% v/v methanol จ�านวน 3 มลลลตร ลงใน cartridge เพอขจดสารทไมจบกบตวดดซบออก และชะสาร เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนออกมาดวย methanol จ�านวน 6 มลลลตร

การพฒนาวธการศกษาการแยกเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง

ฉดสารละลายมาตรฐานผสมระหวางเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน สารละลายตวอยางทเตมสารละลายมาตรฐานโดยใชสารละลายตวพาทมสวนผสมของ acetonitrile และน�า ในอตราสวน 40:60, 30:70 และใชสารละลายตวพาแบบ gradient program (ตารางท 1)




การศกษาการดดซบของตวกรองฉดสารละลายมาตรฐานผสมผานและไมผานแผนเมมเบรนส�าหรบกรองชนดไนลอน ขนาด 0.45 ไมครอน

เสนผาศนยกลาง 13 มลลเมตร และค�านวณรอยละของการดดซบสารของตวกรอง โดยตองไมมากกวารอยละ 5(16)

การตรวจวเคราะหโดยเครอง HPLCปเปตสารละลายตวอยางทเตรยมไดจาก SPE จ�านวน 2.0 มลลลตร และน�า จ�านวน 2.0 มลลลตร ผสม

ใหเขากน น�าไปกรองผานเมมเบรนชนดไนลอน ขนาด 0.45 ไมโครเมตร ใสขวดส�าหรบวเคราะหปรมาณดวยเครอง HPLC โดยมสภาวะของเครองดงตอไปน

คอลมน : Hypersil BDS C 8, 5 ไมโครเมตร ขนาด 4.6 × 150 มลลเมตร การดคอลมน : C8 ขนาด 4.0 × 3.0 มลลเมตร อณหภมคอลมน : 30 �Cสารละลายตวพา : Gradient program (ตารางท 1)อตราการไหล : 0.8-1.5 มลลลตรตอนาทเครองตรวจวด : Diode array detector, ความยาวคลนท 190-400 นาโนเมตรปรมาตรทฉด : 80 ไมโครลตร ฉดสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยาง อยางละ 80 ไมโครลตร จ�านวน 3 ซ�า สรางกราฟมาตรฐาน

แสดงความสมพนธระหวางความเขมขนและพนทใตพคและหาปรมาณของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในหนวยไมโครกรมตอลตร จากสมการเสนตรง

Y = AX + B ……………………………(1)

Y คอ พนทใตพคA คอ ความชนของเสนกราฟX คอ ความเขมขนของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน (ไมโครกรมตอลตร)B คอ จดตดแกน Y จากสมการ (1) จะไดความเขมขนของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน (ไมโครกรมตอลตร) ซงเมอน�าไป

แทนคาในสมการ (2) จะไดปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทอยในตวอยางทงหมด (m) m = X × Dilution factor × 10-3 ………………………………...(2)

M = m/W ………………………………..(3)

0.0 1.0 28 72 3.0 1.2 22 78 5.0 0.8 25 75 12.0 0.8 30 70 14.0 1.5 28 72 15.0 1.5 28 72 16.0 1.0 28 72

ตารางท 1 สารละลายตวพาแบบ Gradient program

เวลา (นาท) อตราการไหล (มลลลตร/นาท) Acetonitrile (%) น�า (%)



Dilution factor เทากบ 10 × 6/3 × 4/2 = 40 m คอ ไมโครกรมของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน ในตวอยาง M คอ ปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน ในหนวยไมโครกรมตอกรม W คอ ปรมาณตวอยางทน�ามาวเคราะห (กรม)

การทดสอบความถกตองของวธ (Method Validation)(17, 18, 19)

การทดสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟ (Chromatographic system suitability)ฉดสารละลายมาตรฐานผสมทระดบความเขมขน 6,000 ไมโครกรมตอลตร ซ�า 5 ครง เขาเครอง HPLC

ค�านวณรอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) ตองไมมากกวา 2.0, tailing factor ของพคเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนตองไมมากกวา 2.0 และ resolution ระหวางพคเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนตองไมนอยกวา 2

การทดสอบความจำาเพาะเจาะจง (Specificity)โดยการฉดตวท�าละลาย สารละลายมาตรฐานผสม สารละลายตวอยางทไม มการปนปลอมของ

เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน จ�านวน 5 ตวอยาง เขาเครอง HPLC จากโครมาโทแกรมตองไมมการรบกวนของสารอนๆ

ตอพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน

การทดสอบความเปนเสนตรง (Linearity)ฉดสารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทเตมในสารละลายตวอยางและผานการสกด

ดวย SPE ทระดบความเขมขน 250, 1,250, 2,500, 5,000, 7,500, 10,000 และ 12,500 ไมโครกรมตอลตร แตละระดบความเขมขนฉดซ�า 3 ครง เขาเครอง HPLC น�าคาเฉลยแตละความเขมขนมาสรางกราฟมาตรฐานหาความสมพนธระหวางความเขมขนและพนทใตพค ค�านวณคาสมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient, r) ซงคาทไดควรมคาใกลเคยง 1

การทดสอบความแมน (Accuracy) ชงผงตวอยางน�าหนก 0.35 กรม เตมสารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทระดบ

ความเขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร ระดบความเขมขนละ 3 ซ�า น�าไปตรวจวเคราะหดวยเครอง HPLC ค�านวณรอยละการคนกลบ (% Recovery) ทระดบความเขมขน 500 และ 6,000 ไมโครกรมตอลตร ตองมรอยละการคนกลบอยในชวง 80-110 และทระดบความเขมขน 12,000 ไมโครกรมตอลตร ตองมรอยละ การคนกลบอยในชวง 90-107(18, 19)

การทดสอบความเทยง (Precision)ความทำาซำาได (Repeatability)

เตรยมตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทระดบความเขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร ความเขมขนละ 3 ซ�า น�าไปตรวจวเคราะหดวยเครอง HPLC โดยค�านวณคารอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ ซงจะคดเปนชวงทระดบความเขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร ตองมรอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธไมมากกวา 10.5, 7.4 และ 5.2 ตามล�าดบ(18, 19)




Intermediate precisionตรวจวเคราะหตวอยางทเตมสารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทระดบความ

เขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร ความเขมขนละ 3 ซ�า วเคราะห 3 วน น�าไปค�านวณทางสถต โดยวธ Analysis of variance (ANOVA) เพอพจารณาความแตกตางของผลวเคราะหระหวางวน

การทดสอบความทน (Ruggedness)ตรวจวเคราะหตวอยางทมการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน จ�านวน 8 ซ�า โดยนกวเคราะห

2 คน แลวน�าไปค�านวณทางสถตโดยวธ t-test เพอพจารณาความแตกตางของผลวเคราะหของนกวเคราะห 2 คนการตดสนความแตกตางของผลวเคราะหใหพจารณาจากคา p-value ถาคา p-value มากกวา 0.05

ถอวาไมมความแตกตางอยางมนยส�าคญตรวจวเคราะหตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานทระดบ 6,000 ไมโครกรมตอลตร ดวยคอลมน 2

รนการผลต แลวน�าไปค�านวณรอยละความแตกตางสมพทธ (Relative Percent Difference, RPD) เพอพจารณา ความแตกตางของผลวเคราะหของคอลมนทงสองรนการผลต

การตดสนความแตกตางของผลวเคราะหใหพจารณาจากรอยละความแตกตางสมพทธ ตองมคาไมมากกวา 3.0

การทดสอบหาขดจำากดของการตรวจพบ (Limit Of Detection, LOD)ฉดสารละลายตวอยางผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทระดบความเขมขนทใหขนาดสญญาณเปน

3 เทาของขนาดสญญาณรบกวน ซงเปนความเขมขนต�าสดทตรวจพบได

การทดสอบหาขดจำากดของการวดปรมาณ (Limit Of quantitation, LOQ)ฉดสารละลายตวอยางผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทระดบความเขมขนทใหขนาดสญญาณ

เปน 10 เทาของขนาดสญญาณรบกวน และน�าคาประมาณการของปรมาณต�าสดทตรวจวเคราะหเชงปรมาณไดมาเตรยมสารละลายทความเขมขนดงกลาว และฉดเขาเครอง HPLC โดยค�านวณรอยละของคาการคนกลบ (% Recovery) ตองอยในชวงยอมรบไดคอรอยละ 80-110 และคารอยละการเบยงเบนสมพทธตองไมเกนรอยละ 10.5(18, 19)

การตรวจปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณดวยวธทพฒนาขนน�าตวอยางยาแผนโบราณชนดยาเมด ยาผง และยาน�า ทสงตรวจทส�านกยาและวตถเสพตด จ�านวน 15 ตวอยาง

เพอหาวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในตวยาดงกลาวดวยวธทพฒนาขน

ผลการศกษาการแยกเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง

ผลการแยกเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสง โดยการใชสารละลายตวพาแบบ gradient program ตาม (ตารางท 1) สามารถแยกพคเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลนออกจากพครบกวนอนๆ ได (ภาพท 2)



การศกษาการดดซบของตวกรองจากการฉดสารละลายมาตรฐานทผานเมมเบรน พบวาพนทใตพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน

ลดลงคดเปนรอยละ 0.39 และ 0.30 ตามล�าดบ

การทดสอบความเหมาะสมของระบบโครมาโทกราฟจากการฉดสารละลายมาตรฐานผสมพบพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทเวลาประมาณ 13.8 นาท

และ 7.8 นาท ตามล�าดบ โดยมคา tailing factor ของยาทงสองตวเทากบ 1.0 และคารอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธของการฉดสารละลายมาตรฐานผสมทระดบความเขมขน 6,000 ไมโครกรมตอลตร ซ�า 5 ครง เทากบ 0.1 และ 0.3 ตามล�าดบ และมคา resolution ระหวางพคเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน เทากบ 13.2 ซงแสดงถงความเหมาะสม

ของระบบโครมาโทกราฟในการตรวจวเคราะหตอไปได

การทดสอบความจำาเพาะเจาะจงจากการฉดสารละลายตวอยางทไมมการปนปลอมของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน สารละลายมาตรฐาน

ผสม สารละลายตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานทระดบความเขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร เขาเครอง HPLC ซงไมพบพคของสารอนมารบกวนพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน (ภาพท 3)

ภาพท 2 โครมาโตแกรมของสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางทไมพบการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลน (A), (B) และ (C) สารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในสารละลายตวพาผสม

ระหวาง acetonitrile และน�า อตราสวน 40:60, 30:70 และแบบ gradient program ตามล�าดบ (D) และ (E) สารละลายตวอยางทไมพบการปนปลอมของสารสเตยรอยดในสารละลายตวพาผสมระหวาง acetonitrile และน�า อตราสวน 40:60 และ 30:70 ตามล�าดบ (F) สารละลายตวอยางทเตมสารมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในสารละลายตวพาแบบ gradient




การทดสอบความเปนเสนตรง (Linearity)จากการฉดสารละลายมาตรฐานผสม เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทเตมลงในสารละลายตวอยาง

ในชวงความเขมขน 250.14-12,507.18 และ 249.30-12,464.76 ไมโครกรมตอลตร ตามล�าดบ ไดกราฟเปนเสนตรงตลอดชวงความเขมขน โดยมคาสมประสทธสหสมพนธ (correlation coefficient, r) เทากบ 0.9987 และ 0.9988 ตามล�าดบ (ภาพท 4 และ 5)

ภาพท 3 โครมาโตแกรมการทดสอบความจ�าเพาะเจาะจงของสารละลาย (A) สารละลายตวอยางทไมพบการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน 5 แหลง (B) สารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน (C) สารละลายตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทความเขมขน 500 ไมโครกรมตอลตร หลงผาน SPE (D) สารละลายตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทความเขมขน 6,000 ไมโครกรมตอลตร หลงผาน SPE (E) สารละลายตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทความเขมขน

12,000 ไมโครกรมตอลตร หลงผาน SPE



1400000

1200000 y = 106.37 ×+ 4030.9R2 = 0.9987

Peak ar

ea

Concentration (µg/L)

1000000

800000

600000

400000

200000

00 5000 10000 15000

3500000

3000000 y = 231.89 ×+ 10651R2 = 0.9988

Peak ar

ea

Concentration (µg/L)

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

00 5000 10000 15000

ภาพท 4 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของเดกซาเมทาโซนและพนทใตพค

ภาพท 5 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของเพรดนโซโลนและพนทใตพค




การทดสอบความแมน (Accuracy) โดยการเตมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนท 3 ระดบความเขมขน ไดรอยละ

ของการคนกลบ (% recovery) ของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนอยในชวงรอยละ 100.30-104.53 และ 100.02-102.18 ตามล�าดบ (ตารางท 2)

500.29 512.54 522.97 104.53 2.01 500.29 533.59 500.29 522.79 6,003.45 6,193.98 6,187.99 103.07 0.12เดกซาเมทาโซน 6,003.45 6,179.54 6,003.45 6,190.45 12,006.90 12,044.35 12,042.60 100.30 0.04 12,006.90 12,037.76 12,006.90 12,045.69

498.59 511.52 498.70 100.02 2.47 498.59 497.68 498.59 486.90 5,983.08 6,105.15 6,113.58 102.18 0.25เพรดนโซโลน 5,983.08 6,104.71 5,983.08 6,130.88 11966.17 11,993.03 11,993.29 100.23 0.15 11966.17 11,975.14 11966.17 12,011.71

ตารางท 2 ผลการทดสอบความแมน (Accuracy) และความเทยง (Precision)

ชนดของ ปรมาณทเตม ปรมาณทพบ คาเฉลยของปรมาณทพบ คาเฉลยของ รอยละสารละลายมาตรฐาน (ไมโครกรมตอลตร) (ไมโครกรมตอลตร) (ไมโครกรมตอลตร) รอยละ การเบยงเบน ทเตม การคนกลบ มาตรฐานสมพทธ (%RSD)

การทดสอบความเทยง (Precision)จากการฉดสารละลายตวอยางทมการเตมสารละลายมาตรฐานเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนท 3 ระดบ

ความเขมขน ความเขมขนละ 3 ซ�า พบวาวธนมความสามารถท�าซ�าได โดยมคารอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (%RSD) อยในชวง 0.04-2.01 และ 0.15-2.47 ตามล�าดบ (ตารางท 2)

จากการทดสอบ Intermediate precision โดยการวเคราะหซ�า 3 วน วนละ 3 ซ�า ท 3 ระดบความเขมขน และน�าไปทดสอบสถต Analysis of variance (ANOVA)(20) พบวาผลการวเคราะหทง 3 วน ไมมความแตกตาง อยางมนยส�าคญทางสถต โดยมคา p-value ของการวเคราะหเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนอยท 0.50 และ 0.10 ตามล�าดบ (ตารางท 3)



การทดสอบความทน (Ruggedness)นกวเคราะห 2 คน วเคราะห 8 ซ�า น�าไปทดสอบสถต t-test พบวาผลการวเคราะหไมมความแตกตาง

อยางมนยส�าคญทางสถต โดยมคา p-value ของการวเคราะหเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนอยท 0.48 และ 0.94 ตามล�าดบ (ตารางท 4)

จากการเปลยนคอลมนรนผลตท 8447 และ 12341 พบวาผลการวเคราะหไมแตกตางกน โดยคารอยละความแตกตางสมพทธ (Relative Percent Difference, RPD) ของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนอยท 0.32 และ 0.95 ตามล�าดบ

ตารางท 3 ผลการทดสอบความเทยงในการวเคราะหซ�าในแตละวน

1 500 522.97 ± 2.01 498.70 ± 2.47 6,000 6187.99 ± 0.12 6113.58 ± 0.25 12,000 12042.60 ± 0.04 11,993.29 ± 0.15 2 500 483.62 ± 1.77 538.52 ± 0.48 6,000 6149.25 ± 0.04 6145.09 ± 0.08 12,000 12007.12 ± 0.04 11983.14 ± 0.14 3 500 508.96 ± 0.43 532.29 ± 0.39 6,000 6155.33 ± 0.26 6101.75 ± 0.23 12,000 12099.32 ± 0.97 12016.24 ± 0.94 p-value (between day) 0.50 0.10

วนท ระดบความเขมขนทศกษา ปรมาณเฉลยทตรวจพบ (ไมโครกรมตอลตร ± %RSD) (ไมโครกรมตอลตร) เดกซาเมทาโซน เพรดนโซโลน

1 1847.72 ± 1.25 1,472.71 ± 4.92 2 1814.19 ± 7.05 1,475.48 ± 5.45

p-value (between analyst) 0.48 0.94

ตารางท 4 ผลการทดสอบความเทยงในการวเคราะหซ�าโดยการเปลยนนกวเคราะห

นกวเคราะหท คาเฉลยของปรมาณเดกซาเมทาโซน คาเฉลยของปรมาณเพรดนโซโลน (ไมโครกรมตอลตร ± %RSD) (ไมโครกรมตอลตร ± %RSD)

การทดสอบหาขดจำากดของการตรวจพบ (Limit Of Detection, LOD) และขดจำากดของการวดปรมาณ (Limit Of quantitation, LOQ)

ปรมาณต�าสดทตรวจพบเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน มคาเทากบ 128.34 และ 124.95 ไมโครกรมตอลตร ตามล�าดบ และปรมาณต�าสดทวเคราะหปรมาณไดของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน มคาเทากบ 250.14 และ 249.30 ไมโครกรมตอลตร ตามล�าดบ โดยปรมาณต�าสดทวเคราะหปรมาณไดของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน มคารอยละการคนกลบอยในชวง 90.66-95.60 และ 89.44-96.86 ตามล�าดบ และคารอยละการเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ เทากบ 2.21 และ 2.63 ตามล�าดบ




การตรวจปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณดวยวธทพฒนาขนผลการตรวจวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในตวอยาง จ�านวน 15

ตวอยาง พบการปนปลอมทงเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลน จ�านวน 2 ตวอยาง พบการปนปลอมเดกซาเมทาโซนอยางเดยว จ�านวน 7 ตวอยาง และไมพบการปนปลอมสารดงกลาว จ�านวน 6 ตวอยาง โดยตรวจพบปรมาณการปนปลอม

เดกซาเมทาโซนในชวง 57.67-246.65 สวนในลานสวน และพบปรมาณการปนปลอมเพรดนโซโลน 1967.78 สวนใน

ลานสวน สวนอก 1 ตวอยางตรวจพบเพรดนโซโลน 22.04 สวนในลานสวน แตมปรมาณต�ากวาขดจ�ากดของ การวดปรมาณ

วจารณวธการตรวจเอกลกษณการปนปลอมของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณดวยเทคนค

รงคเลขผวบาง ซงพฒนาโดยส�านกยาและวตถเสพตด ไมสามารถหาปรมาณการปนปลอมของตวยาดงกลาวได จงไดพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมของตวยาดงกลาวในยาแผนโบราณ ซงดดแปลงมาจากการหาปรมาณ

เดกซาเมทาโซนดวยเทคนคโครมาโทกราฟชนดของเหลวประสทธภาพสงในต�าราฟารมาโคเปยของสหรฐอเมรกา(1)

โดยใชสารละลายตวพาแบบ isocratic ทมสวนผสมของ acetonitrile และน�า โดยมอตราสวน 1:2 และพบวาม

การศกษาวเคราะหหาปรมาณของสเตยรอยดในยาแผนโบราณ(10, 11) โดยใชสารละลายตวพาแบบ isocratic เชนเดยวกบต�าราฟารมาโคเปยของสหรฐอเมรกา แตมสวนผสมของ acetonitrile และน�า ในอตราสวน 30:70 โดยในวธการ ดงกลาวสามารถแยกพคสารละลายมาตรฐานผสมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนออกจากกนได แตไมสามารถแยกสารรบกวนในสารละลายตวอยางออกจากพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนไดอยางสมบรณ ซงจะมผลตอ

ความถกตองของการวเคราะหหาปรมาณสารดงกลาว (ภาพท 2) เนองจากยาแผนโบราณและยาทมาจากสมนไพรมความหลากหลายขององคประกอบทางเคม ดงนนในการศกษาครงนจงตองใชสารละลายตวพาทมสวนผสมของ acetonitrile และน�า แบบมการเปลยนองคประกอบของสารละลายตวพาแบบ gradient program ตาม

ตารางท 1 สามารถแยกพคเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนไดอยางมประสทธภาพและไมพบการรบกวนจาก

องคประกอบทหลากหลายของสมนไพรตางๆ ในสตรต�ารบ การเตรยมตวอยางโดยใชเทคนคการสกดแยกดวยตวดดซบของแขงสามารถก�าจดสารรบกวนการตรวจ

วเคราะหบางสวนออกไปได โดยตวดดซบของแขงทเลอกใชเปน hydrophobic polystyrene-divinylbenzene adsorbent resin มคณสมบตเหมาะสมในการสกดแยกตวยาส�าคญในตวอยางไดหลายรปแบบ ทงจากยาเมด

ยาครม จากปสสาวะ หรอเลอดได(21, 22) โดยในการสกดแยกตองเตรยมความพรอมของตวดดซบทบรรจใน cartridge ดวย methanol และน�ากอนเสมอ เพอใหตวดดซบมความเหมาะสมกบสารละลายทน�ามาสกด และชวยใหอนภาคของสารทสนใจสมผสกบตวดดซบใหไดมากทสด โดยหลงจากผานสารละลายตวอยางลงในตวดดซบของแขงและชะสาร ทไมตองการออกดวย 5%v/v methanol เนองจากเปนการวเคราะหเชงปรมาณ ตองรอใหตวดดซบแหงกอนแลวจงชะเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนออกดวย methanol จ�านวน 6 มลลลตร ในสวนของคอลมน เลอกใชคอลมนชนด reverse phase C8 พรอมการดคอลมน reverse phase C8 เนองจากหางาย ราคาไมแพง และมสภาพไมมขว เชนเดยวกบ C18 แตจ�านวนคารบอนนอยกวา จงท�าใหพคของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลกถกซะออกมาไดเรวกวาคอลมนชนด reverse phase C18

ในการศกษานไดเลอกตวอยางยาแผนโบราณสองรปแบบ คอ ยาลกกลอน และยาผง เปนตวแทนของยาแผนโบราณทน�ามาศกษา เนองจากเปนรปแบบของยาแผนโบราณทมองคประกอบของสมนไพรหลายชนด อกทงในขนตอนการท�าใหเปนเมดยาลกกลอนตองมสารยดเกาะ เชน น�าผง น�าแปง ส�าหรบยาผงซงสวนใหญ คอยาหอม เปนยาผงทมองคประกอบของสมนไพรมากกวา 40 ชนด จงครอบคลมองคประกอบของสมนไพรทอาจมผลตอการตรวจวเคราะหได



ดงนนวธทพฒนาขนจงมความเปนไปไดในการทจะน�าไปประยกตใชตรวจวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมของ เดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณรปแบบอนๆ ได เชน ยาแคปซล ยาเมด ยาน�า และยากวน

วธทพฒนาขนสามารถหาปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนทปนปลอมในยาแผนโบราณได อางอง หลกการประเมนความถกตองตาม ICH Guideline(17) โดยไมพบวามการรบกวนจากสารอนซงแสดงถงความจ�าเพาะของวธ เมอทดสอบความเปนเสนตรงดวย standard addition ในชวง 250-12,500 ไมโครกรมตอลตร ไดคาสมประสทธความสมพนธ ใกลเคยง 1 แสดงวาวธนมความเปนเสนตรงตลอดชวงทท�าการศกษา ผลการทดสอบความถกตองของวธวเคราะหหาปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณ พบวาทระดบความเขมขน 500, 6,000 และ 12,000 ไมโครกรมตอลตร คาเฉลยรอยละการคนกลบของเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนอยในชวง 100.30-104.53 และ 100.02-102.18 ตามล�าดบ และวธนมความทนตอการเปลยนแปลงทงนกวเคราะห และรนของคอลมนได

ทงน เมอน�าวธวเคราะหหาปรมาณทพฒนาขนไปใชตรวจหาการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในตวอยางยาแผนโบราณทสงตรวจกบส�านกยาและวตถเสพตด จ�านวน 15 ตวอยาง ใหผลสอดคลองกบวธการตรวจเอกลกษณดวยเทคนครงคเลขผวบางททางส�านกยาและวตถเสพตดใชอย โดยพบการปนปลอมทงเดกซาเมทาโซนและ เพรดนโซโลน จ�านวน 2 ตวอยาง ปนปลอมเดกซาเมทาโซนเพยงอยางเดยว จ�านวน 7 ตวอยาง และเมอวเคราะหหาปรมาณการปนปลอมสารดงกลาวดวยวธทพฒนาขน พบวาปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนอยในชวง 57.67-246.65 สวนในลานสวน และพบตวอยางยาแผนโบราณ 1 ตวอยาง ทมการปนปลอมเพรดนโซโลนในปรมาณ 1967.78 สวนในลานสวน สวนอกหนงตวอยางพบการปนปลอมเพรดนโซโลนแตมปรมาณต�ากวาขดจ�ากดของการวดปรมาณ ดงนนวธการดงกลาวทพฒนาขนนสามารถตรวจเอกลกษณและหาปรมาณการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนไดในคราวเดยวกน จงนาจะเปนอกทางเลอกหนงส�าหรบการตรวจวเคราะหการปนปลอมสารดงกลาวในยาแผนโบราณ และการศกษานจะเปนประโยชนมากยงขนเมอศกษารวมกบการส�ารวจพฤตกรรมการบรโภคยาแผนโบราณของประชาชนเพอสอสารความเสยงและแจงเตอนภยในการบรโภคยาแผนโบราณทมการปนปลอมเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนตอไป

สรปวธการตรวจวเคราะหปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณทพฒนาขนนเปนวธทมความ

จ�าเพาะ ความเทยง และความแมนย�าสง สามารถทจะน�าไปใชวเคราะหหาปรมาณเดกซาเมทาโซนและเพรดนโซโลนในยาแผนโบราณในหองปฏบตการได ซงจะเปนประโยชนในการสอสารความเสยงและแจงเตอนภยจากการใชยาแผนโบราณทมการปนปลอมตวยาแผนปจจบนดงกลาวเพอเปนการคมครองผบรโภคตอไป

กตตกรรมประกาศขอขอบคณเจาหนาทกลมตรวจคณภาพเภสชภณฑทางเคม-ฟสกส ส�านกยาและวตถเสพตด ทชวยจดเตรยม

อปกรณ และตวอยางทใชในงานวจยครงน และขอขอบคณผอ�านวยการส�านกยาและวตถเสพตดทใหการสนบสนน

ทางดานงบประมาณและขอเสนอแนะ ท�าใหการศกษาครงนลลวงดวยด

เอกสารอางอง 1. The United States Pharmacopeia-The National Formulary. 32nd ed. Rockville: United States

Pharmacopeia Convention; 2009. p. 2083-7, 3368-70. 2. Dexamethasone. [online]. [cited 2012 Oct 6]: [8 screens]. Available from: URL: http://en.wikipedia.

org/wiki/Dexamethasone




3. Prednisolone. [online]. [cited 2012 Oct 6]: [4 screens]. Available from: URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Prednisolone

4. คณะกรรมการแหงชาตดานยา. บญชยาหลกแหงชาต พ.ศ. 2551. พมพครงท 2. นนทบร: ส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสข; 2552. หนา 40.

5. กองควบคมยา ส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา. รวมกฎหมายดานยา ออกตามความในพระราชบญญตยา พ.ศ. 2510 และฉบบแกไขเพมเตม. นนทบร: ส�านกงานคณะกรรมการอาหารและยา กระทรวงสาธารณสข; 2546. หนา 223.

6. Reynolds JEF, editor. Martindale: the extra pharmacopoeia. 30th ed. London: The Pharmaceutical Press; 1993. p. 712-22.

7. ส�านกยาและวตถเสพตด กรมวทยาศาสตรการแพทย. รายงานประจ�าป 2553. กรงเทพฯ: โรงพมพส�านกงานพระพทธศาสนา แหงชาต; 2554.

8. Siri DNBC, Lai CS, Haris MRHM. Screening of adulterants in unregistered herbal products in Malaysia. Der Pharma Chemica 2013; 5(2): 278-85.

9. คณะเภสชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย. อยาใหสเตยรอยดลอยนวล (อกตอไป). ยาวพากษ. [วารสารออนไลน]. 2555; [สบคน 2 ธ.ค. 2556]; 5(15): [32 หนา]. เขาถงไดจาก: URL: http://www.thaidrugwatch.org/download/series/series15.pdf

10. Ku YR, Wen KC, Ho LK, Chang YS. Solid-phase extraction and high performance liquid chromatographic determination of steroids adulterated in traditional Chinese medicines. J Food Drug Anal 1999; 7(2): 123-30.

11. Ku YR, Liu YC, Lin JH. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic analysis of prednisone adulterated in a foreign herbal medicine. J Food Drug Anal 2001; 9(3): 150-2.

12. Klinsunthorn N, Petsom A, Nhujak T. Determination of steroids adulterated in liquid herbal medicines using QuEChERS sample preparation and high-performance liquid chromatography. J Pharm Biomed Anal 2011; 55(5): 1175-8.

13. Gonzalo-Lumbreras R, Muñiz-Valencia R, Santos-Montes A, Izquierdo-Hornillos R. Liquid chromatographic method development for steroids determination (corticoids and anabolics): application to animal feed samples. J Chromatogr A 2007; 1156(1-2): 321-30.

14. Thevis M, Schänzer W, Geyer H, Thieme D, Grosse J, Rautenberg C, et al. Traditional Chinese medicine and sports drug testing: identification of natural steroid administration in doping control urine samples resulting from musk (pod) extracts. Br J Sports Med 2013; 47(2): 109-14.

15. ศนยขอมลพษวทยา กรมวทยาศาสตรการแพทย. คลอโรฟอรม. [ออนไลน]. 2543; [สบคน 2 ธ.ค. 2556]; [3 หนา]. เขาถงไดจาก: URL: http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_toxic/a_tx_1_001c.asp?info_id=78

16. Kiehm K, Dressman JB. Evaluation of drug adsorption to membrane filters under biowaiver test conditions. Dissolution Technology 2008 [cited 2011 Dec 11]; [5 screens]. Available from: URL: http://www.dissolutiontech.com/DTresour/200811Articles/DT200811_A02.pdf

17. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of analytical procedure: text and methodology Q2(R1). Geneva, Switzerland: ICH Steering Committee; 2005.

18. กรมวทยาศาสตรการแพทย. แนวปฏบตการทดสอบความถกตองของวธวเคราะหทางเคมโดยหองปฏบตการเดยว. นนทบร: กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข; 2549.

19. AOAC guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals. 2002; [cited 2010 Feb 12]; [38 screens]. Available at: URL: http://www.aoac.org/imis 15_prod/AOAC_Docs/StandardsDevelopment/SLV_Guidelines_Dietary_Supplements.pdf



20. ชศร วงศรตนะ. เทคนคการใชสถตเพอการวจย. พมพครงท 8. กรงเทพฯ: เทพเนรมตการพมพ; 2544. 21. New chromobond HR-X from macherey-nagel. 2008. [cited 2010 Jan 9]: [1 screen]. Available from:

URL: http://www.labmate-online.com/news/chromatography/1/macherey-nagel_gmbh/new_chro-mabond_hr-x_from_macherey-nagel/1303/

22. Thurman EM, Mills MS. Solid-phase extraction: principles and practice. New York: John Wiley & Sons; 1998. p. 45-81.




Method Development for Determination of Dexamethasone and Prednisolone in Traditional Drug by High-Performance

Liquid Chromatography

Jiranuch Jamtaweekul Sumate Thiangthum Waliluk Matapatara and Chitra ChaiyawatBureau of Drug and Narcotic, Department of Medical Sciences, Thiwanond Road, Nonthaburi 11000

ABSTRACT The quantitative determination of the adulterated dexamethasone and prednisolone in traditional drug was developed by using high performance liquid chromatography (HPLC) with reversed phase C8 column (Hypersil BDS) and a mixture of acetonitrile and purified water as a mobile phase. The sample solution was cleaned up by solid phase extraction (SPE). The method validation data showed good linearity at the concentration range of 250-12,500 µg/L with the correlation coefficient of 0.9987 and 0.9988 for dexamethasone and prednisolone, respectively. Accuracy and precision were performed by adding 500, 6,000 and 12,000 µg/L of each of dexamethasone and prednisolone to sample matrix. The percentages of recovery were 100.30-104.53 and 100.02-102.18 for dexamethasone and prednisolone, respectively. The relative standard deviations of dexamethasone and prednisolone were 0.04-2.01 and 0.15-2.47, respectively. The limit of quantitation of dexamethasone and prednisolone are 250.14 and

249.30 µg/L, respectively. Therefore, the developed HPLC method is suitable for surveillance of the dexamethasone and prednisolone adulterants in traditional herbal medicines.

Key words: dexamethasone, prednisolone, traditional drug, solid phase extraction, high performance liquid chromatography



การพฒนาแผนแปะผวหนงจากสมนไพรบวบก

พรศร ประเสรฐวาร จรานช มงเมอง เสาวณย ทองด ศกดวชย ออนทอง และณฉตรา จนทรสวานชยสถำบนวจยสมนไพร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท อ�ำเภอเมอง นนทบร 11000

Accepted for publication, 11 March 2015

บทคดยอ บวบก เปนสมนไพรทมการน�ามาใชเปนยา เครองส�าอาง อาหารเสรม และผลตภณฑสขภาพ สารสกดบวบกมฤทธทางเภสชวทยา ไดแก ฤทธสมานแผล ลดการเกดคลอยด และฤทธตานจลชพ การน�าสงยาสผวหนงเปนการพฒนาเภสชภณฑ

ในรปแผนแปะทออกฤทธไดนาน เพอลดความถในการใช สะดวกในการบรบาลทางเภสชกรรม โดยแผนแปะผวหนงทเตรยมเพอศกษาในครงนประกอบดวยชน backing และชน adhesive ทมการเตมสารสกดสมนไพร ศกษาความแตกตางของ พอลเมอร เชน ethyl cellulose (EC), eudragit E 100, eudragit NE 30 D และ hydroxypropyl methyl cellulose ในความเขมขนตางๆ กน (1.0%, 2.0% และ 3.0% w/v) ส�าหรบชน backing และชน adhesive รวมทง plasticizer 2 ชนด คอ triacetin และ dibutyl phathalate (DBP) จากการศกษาพบวา EC 2.0% และ triacetin 30%

เปนพอลเมอรทเหมาะสมในการเตรยมแผนแปะในชน backing ซงแผนแปะผวหนงทไดมความใส ยดหยน และแขงแรง โดยเครองทดสอบแรงดง (Tensile Tester) และมความพรนนอย เมอสองดวยกลอง Scanning Electron Microscope (SEM) แผนแปะชน adhesive พอลเมอรทเหมาะสมคอ eudragit NE 30 D 6.0% และ DBP 0.5% เมอทดสอบ

การซมผานของแผนแปะสมนไพรดวย Franz’s Diffusion Cell การวเคราะหปรมาณสารส�าคญทซมผานแผนแปะสมนไพรดวยวธ HPLC พบวามปรมาณ madecassoside และ asiaticoside ซมผาน คดเปน 41.2% และ 94.7% ตามล�าดบ ผลจาก

การศกษานสามารถใชเปนขอมลในการน�าสมนไพรมาพฒนาในรปแบบน�าสงยาผานผวหนงใหม ๆ ส�าหรบในผปวยแผลกดทบ



พฒนาแผนแปะผวหนงจากสมนไพรบวบก พรศร ประเสรฐวาร และคณะ

บทนำาปจจบนรปแบบยาทไดรบความนยมมากทสดคอ รปแบบยารบประทาน ซงงายตอการบรหารยา สะดวก

ปลอดภย และไมกอใหเกดความเจบปวด แตพบวามขอเสยหลายประการ เชน ยาอาจถกท�าลายไดในทางเดนอาหาร การเกดเมตาบอลซมของยาทตบ (Hepatic first pass metabolism) ยาอาจถกท�าลายในกระเพาะอาหาร และ ความไมสม�าเสมอของยาในระดบเลอด ซงผลตภณฑทใชทางผวหนงมหลายรปแบบ เชน ครม ขผง โลชน สารสะลาย และแผนแปะ (Transdermal patch) โดยผลตภณฑแตละชนดมวตถประสงคในการดดซมผานเขาสผวหนงท แตกตางกน ถาตวยาส�าคญมการซมผานไมมากนก อาจใหผลการรกษาแบบเฉพาะท (Local effect) แตถาตวยาส�าคญสามารถซมผานชนผวหนงไดลกจนถงเนอเยอดานในเขาสกระแสเลอดได และสามารถออกฤทธแบบทวรางกาย (systemic effect)(1) ดงนนจงเปนทมาของการพฒนาแผนแปะผวหนงจากสมนไพรบวบก เพอใหตวยาปลดปลอย

เขาสรางกายไดสม�าเสมอ เพมประสทธภาพในการรกษา ลดจ�านวนครงในการใชยา หลกเลยงความเจบปวดจากการ ใชยาฉด เพมความสะดวกในการบรหารยา และสามารถแกไขขอบกพรองของรปแบบยารบประทานได

บวบก มชอวทยาศาสตรวา Centella asiatica (L.) Urban วงศ Apiaceae (Umbelliferae) สมนไพรชนดนมการน�ามาใชเปนยาและผลตภณฑสขภาพ มรายงานวาสารสกดของบวบกมสารกลม triterpene เชน asiatic acid และ madecassic acid และอนพนธของ triterpene ester เชน asiaticoside และ madecassoside(2) ซงแสดงฤทธทางเภสชวทยาหลายดานคอ ฤทธสมานแผล(3, 4) ลดการเกดคลอยด(5) ลดการอกเสบ ลดการเกดแผล

ในกระเพาะอาหารเนองจากภาวะความเครยด(6) ฤทธตานจลชพ(7) และฤทธในการหามเลอด เปนตน โครงสรางของผวหนง

ผวหนงคนจดเปนอวยวะทมขนาดใหญมากทสด คดเปนสดสวนรอยละ 12-16 ของน�าหนกตว ท�าหนาทควบคมความรอน การสญเสยน�าออกจากรางกาย และปองกนไมใหสารแปลกปลอมจากภายนอกเขาสรางกาย

ผวหนงเปนเยอเลอกผานทสามารถใหสารทชอบน�าและไมชอบน�าผานได แบงตามโครงสรางไดเปน 3 ชน คอ

หนงก�าพรา (Epidermal), หนงแท (Dermis) และชนไขมนใตผวหนง (Subcutaneous fat layer) หนงก�าพรา เปนชนของผวหนงทส�าคญทสดในการน�าสงยาทางผวหนง ประกอบดวยชน stratum corneum ซงเปนอปสรรค

ทส�าคญตอการน�าสงยาสผวหนง ถดเขามาคอ ชนหนงแท ประกอบดวย หลอดเลอด ทอน�าเหลอง ระบบประสาท และตอมเหงอ มหนาทล�าเลยงออกซเจนและสารอาหารใหกบเนอเยอ โดยระบบไหลเวยนนมความส�าคญในกระบวนการซอมแซมบาดแผล(8) ชนในสดคอ ชนไขมนใตผวหนง เปนชนทมความส�าคญในการเปนฉนวนปองกนความรอนและควบคมอณหภมรางกายใหปกต ตลอดจนปองกนอนตรายจากภายนอก(9)

ระบบน�าสงยาทางผวหนงแบงได 5 ชนด(1)

1. ระบบควบคมการแพรโดยแผนกาว (Pressure adhesive matrix devices) 2. ระบบควบคมการปลดปลอยดวยเมมเบรน (Membrane moderated devices) 3. ระบบควบคมดวยพอลเมอรแผนกาวเมมเบรน (Adhesive membrane system)4. ระบบแหลงเกบตวยาขนาดจว (Microreservoir system) 5. ระบบควบคมดวยพอลเมอรเมทรกซชนดไมยดตด (Non - adhesive polymeric matrix devices)การเตรยมแผนแปะสมนไพรบวบกเพอควบคมอตราการปลดปลอยตวยาในอตราคงท เปนการเพม

ประสทธภาพของยา(1) ประกอบดวย Backing layer เปนชนทปองกนตวยาซมผาน และปองกนสงแวดลอมจากภายนอกเขาสผลตภณฑ และชน Adhesive layer เปนชนทเตมสารสกดสมนไพรบวบก โดยสารส�าคญกระจายอยบน

พอลเมอรชนน และมคณสมบตในการยดเกาะผวหนง ซงผลตภณฑแผนแปะผวหนงจากสมนไพรบวบกทมฤทธ ฆาเชอจลชพ รวมทงซอมแซมเนอเยอทเสยไป สามารถน�าไปใชรกษาในผปวยทมบาดแผลได และเพอเปนขอมล

ในการน�าสารสกดสมนไพรมาพฒนาในรปแบบเภสชภณฑใหม ๆ ตอไป


Development of Transdermal Patch from Centella asiatica (L.) Urban Pornsri Prasertwaree et al.

วสดและวธการสารเคม

Hydroxypropyl Methyl Cellulose (HPMC), Ethyl Cellulose (EC), Eudragit E100, Triacetin, Dibutyl Phthalate (DBP), Polyethylene Glycol 400 (PEG 400), Polyvinyl Pyrrolidone K 30 (PVP K30), Sodium Hydroxide Pellets GR ISO, Monobasic Potassium Phosphate (KH2PO4)

เครองมอและอปกรณScanning Electron Microscope (SEM) (Hitachi รน S510), Cutting Machine (DUMBBELL

รน SDAP 100N), Tensile Tester (Tinius Olsen รน H25KS), Franz Diffusion Cell (Logan Model SFDC-6)

1. การเตรยมสารสกดสมนไพรบวบก น�าตวอยางสมนไพรบวบกจากจงหวดนนทบรมาตรวจสอบสมนไพรดงกลาววาเปน Centella asiatica (L.)

Urban จรง โดยน�ามาศกษาเปรยบเทยบกบตวอยางธรรมชาตจากจงหวดพทลง ซงเปนตวอยางทนกพฤกษศาสตร ของสถาบนวจยสมนไพร เกบมาจากธรรมชาต และน�ามาตรวจระบชนดตามหลกพฤกษอนกรมวธานพช พบวาเปนพชในวงศ Apiaceae ชอวทยาศาสตรวา Centella asiatica (L.) Urban(10) จดท�าตวอยางพรรณไมแหงไวในพพธภณฑพช กรมวทยาศาสตรการแพทย หมายเลขตวอยางคอ DMSC 5185 และน�ามาตรวจคณภาพทางเคมโดยวธทระบไว ในต�ารายาสมนไพรไทย (THP, 2004) น�าสมนไพรบวบกมาลางและท�าความสะอาด ผงใหแหง จากนนอบทอณหภม 45 �C 24 ชวโมง จนแหง น�าสมนไพรทอบแหงมาท�าการบดสกดดวย 95% ethanol ดวย Soxhlet apparatus น�าสารละลายทไดจากการสกดมาระเหยแหงดวยเครอง Rotary evaporator สกดแยกสวนดวยตวท�าละลาย

ethyl acetate ท�าใหสารสกดทไดแหงดวยเครอง Freeze dryer และวเคราะหปรมาณสารส�าคญดวย HPLC

2. การเตรยมชน Backing ของแผนแปะเตรยมสารละลายชน backing โดยเปรยบเทยบพอลเมอร 2 ชนด คอ Ethyl Cellulose (EC) และ

Eudragit E 100 และเปรยบเทยบ plasticizer 2 ชนด คอ Triacetin เปรยบเทยบกบ Dibutyl Phathalate (DBP) อบทอณหภม 50 �C เปนเวลา 6 ชวโมง โดยเตรยม 2% สารละลายพอลเมอร และ 30%, 40% และ 50% plasticizer โดยค�านวณจากปรมาณของพอลเมอร ตามล�าดบ (ตารางท 1)

ตารางท 1 การพฒนาสตรต�ารบในชน backing

EC 2 g 2 g 2 g - - -Eudragit E 100 - - - 2 g 2 g 2 gTriacetin 0.6 g 0.8 g 1.0 g - - -DBP - - - 0.6 g 0.8 g 1.0 gEthanol qs to 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml

Rx. 1 2 3 4 5 6




3. การเตรยมชน Adhesive ทเตมสารสกดสมนไพรบวบก เตรยมชน adhesive ดวย Eudragit NE 30 D เปรยบเทยบกบ Hydroxypropyl Methyl Cellulose

(HPMC) ปรมาณ 4%, 5% และ 6% ลงใน DI water ตามล�าดบ และ 0.5% DBP เตมสารสกดสมนไพรบวบก

1% และ 2% ตามล�าดบ พรอมทงคนตลอดเวลา จากนนเทลง petri dish และน�าไปอบทอณหภม 70 �C เปนเวลา 12 ชวโมง

4. การประเมนคณสมบตของแผนฟลมในชน backing4.1 การศกษาทางกายภาพ ลกษณะความใส ความเรยบ4.2 การวดความพรนของแผนฟลม โดยเครอง Scanning Electron Microscope (SEM)

(Hitachi รน S510) 4.3 การทดสอบเชงกลของแผนฟลมโดยเครอง Tensile Tester (Tinius Olsen รน H25KS)

5. การทดสอบการปลดปลอยสารสำาคญจากแผนแปะสมนไพร โดย Franz’s Diffusion Cell (Logan Model SFDC-6)

1. เตรยม Phosphate Buffer pH 5.8 2. เตรยมแผน nylon membrane filters 3. อน medium ใหมอณหภม 37 �C แลวใสลงในตว cell โดยระวงไมใหมฟองอากาศเกดขน ภายในตว cell4. เตรยมแผนแปะสมนไพรทใชทดสอบ โดยตดใหมขนาดเทาเสนผาศนยกลางของ cell แลวน�าไปวางบน

ตว cell ทมแผน membrane รองอย 4.1 เรมจบเวลาตงแตแผนแปะสมนไพรสมผสกบ medium 4.2 สมตวอยางปรมาตร 500 µl ตามเวลาทก�าหนด (15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210,

240, 270, 300, 330, 360, 390 และ 420 นาท ตามล�าดบ) โดยเกบตวอยางสารละลายทซมผานจากแผนแปะสมนไพร จากนนน�ามาวเคราะหปรมาณสารส�าคญจากสารละลายทซมผานจากแผนแปะสมนไพรดวย HPLC

ผล1. การเตรยมสารสกดสมนไพรบวบก

การควบคมคณภาพทางเคม โดยการวเคราะหปรมาณความชนและปรมาณสารส�าคญดวย High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) พบวาสารสกดบวบกมปรมาณความชน 6.3% (w/w) และ มปรมาณสาร madecassoside และ asiaticoside เปน 0.9% (w/w) และ 0.47% (w/w) ตามล�าดบ

2. การเตรยมชน Backing ของแผนแปะพบวา Ethyl Cellulose (EC) ต�ารบท 1-3 และ Eudragit E 100 ต�ารบท 4-6 ใหแผนฟลมมลกษณะ

ใกลเคยงกน (ภาพท 1) ซงเหมาะในการน�าไปพฒนาเปนแผนแปะสมนไพรได แตในการศกษาต�ารบทประกอบดวย Eudragit E 100 ไมสามารถลอกออกจาก petri dish ได



3. การเตรยมชน Adhesive ทเตมสารสกดสมนไพรบวบก พบวาพอลเมอรทง 2 ชนด คอ Eudragit NE 30 D และ HPMC ใหแผนแปะทมลกษณะภายนอก

เหมอนกนคอ ความใส แต HPMC ไมมคณสมบตในการยดเกาะผวหนงเหมอน Eudragit NE 30 D จงน�า Eudragit NE 30 D ทเตมสารสกดสมนไพรบวบก 1% และ 2% (ภาพท 2) มาท�าการศกษาในขนตอนตอไป

ต�ารบท 1 ต�ารบท 2 ต�ารบท 3

ต�ารบท 4 ต�ารบท 5 ต�ารบท 6

A B

ภาพท 1 แสดงแผนฟลมทเตรยมจาก Ethyl Cellulose ต�ารบท 1-3 และ Eudragit E 100 ต�ารบท 4-6 ตามล�าดบ

ภาพท 2 แผนฟลม เตมสารสกดสมนไพรบวบก (A) 1% และ (B) 2% ตามล�าดบ




4. การประเมนคณสมบตของแผนฟลมในชน backing 4.1 การศกษาทางกายภาพ ลกษณะความใส ความเรยบผลจากการเปรยบเทยบชนดของพอลเมอร พบวา Ethyl Cellulose เมอเปรยบเทยบกบ Eudragit

E 100 แสดงลกษณะทางกายภาพทเหมอนกนคอ ฟลมมความใสใกลเคยงกน (ภาพท 3)

ภาพท 3 แสดงแผนฟลมทเตรยมจาก (A) Ethyl Cellulose และ (B) Eudragit E 100 ตามล�าดบ A B

A B

ผลจากการเปรยบเทยบชนดของ plasticizer พบวา Triacetin และ DBP ไดแผนฟลมทมความเรยบ

ตางกนเลกนอย โดย Triacetin ไดแผนฟลมทมความเรยบกวา DBP (ภาพท 4)

ภาพท 4 แสดงแผนฟลมชน backing ทเตรยมจาก plasticizer 2 ชนด คอ (A) Triacetin และ (B) Dibutyl Phathalate ตามล�าดบ



4.3 การทดสอบเชงกลของแผนฟลมโดยเครอง Tensile Testerพบวาพอลเมอร ทเหมาะสมส�าหรบแผนฟลมชน backing คอ EC และ plasticizer ทเหมาะสม คอ

Triacetin โดยแผนฟลมทไดมความใส เรยบ ทกต�ารบ (ภาพท 6)

4.2 การวดความพรนของแผนฟลมโดยเครอง Scanning Electron Microscope (SEM)ในการศกษา plasticizer เพอเตรยมชน backing พบวาต�ารบทใช Triacetin แสดงลกษณะความพรน

ของแผนฟลมนอยกวา คอ ฟลมมลกษณะเรยบมากกวาต�ารบทใช DBP (ภาพท 5)

ภาพท 5 แสดงลกษณะความพรนของแผนฟลม เปรยบเทยบ plasticizer 2 ชนด คอ (A) Triacetin และ (B) Dibutyl Phathalate ตามล�าดบ

A B C

ภาพท 6 แสดงแผนฟลมชน backing ทมความเขมขนของ Triacetin เทากบ (A) 30%, (B) 40% และ (C) 50% ตามล�าดบ

จากการทดสอบเชงกล พบวาปรมาณ plasticizer ทเหมาะสมในต�ารบคอ 30% เมอเทยบกบ 40% และ 50% ตามล�าดบ ต�ารบทม 30% Triacetin ใหแผนฟลมทมความแขงแรงมากทสด (ตารางท 2)




5. การทดสอบการปลดปลอยสารสำาคญจากแผนแปะสมนไพร โดย Franz’s Diffusion Cell ส�าหรบแผนฟลมชน adhesive พบวา 6% Eudragit NE 30 D และ 0.5% DBP ใหแผนฟลมทมลกษณะ

ดทสดคอ มความใส และยดหยนด ผลการวเคราะหปรมาณสารส�าคญจากแผนแปะสมนไพรทเตมสารสกดสมนไพรบวบก 1% และ 2%

โดยเกบตวอยางตามเวลาทก�าหนด พบวามการปลดปลอยสารส�าคญ madecassoside และ asiaticoside หมดทเวลา 135 นาท และ 180 นาท ตามล�าดบ มปรมาณ madecassoside และ asiaticoside ทถกปลดปลอยออกมา คดเปน 41.2% (w/w) และ 94.7% (w/w) (ภาพท 7)

1. EC 30% Triacetin 0.1140 38.16 0.1370 0.1340 38.82 38.92 0.1510 39.40

2. EC 40% Triacetin 0.1420 31.72 0.1490 0.1487 33.12 32.23 0.1550 31.84

3. EC 50% Triacetin 0.1380 30.40 0.1420 0.1507 29.12 28.59 0.1720 26.24

4. EC 30% DBP 0.1640 13.36 0.1530 0.1583 16.98 15.02 0.1580 14.72

5. EC 40% DBP 0.1380 11.88 0.1240 0.1347 10.85 10.94 0.1420 10.10

*6. EC 50% DBP - - - - - - - - -

* เนองจากฟลมทไดมลกษณะนมมาก ไมสามารถน�ามาทดสอบได

ตารางท 2 แสดงคาความแขงแรงของแผนฟลมทความเขมขนตาง ๆ โดยเครอง Tensile Tester

พอลเมอร Plasticizer ความหนา คาเฉลย Braek (N) คาเฉลย (N) (มลลเมตร) (มลลเมตร)



ภาพท 7 แสดงปรมาณการซมผานของ madecassoside (MS) และ asiaticoside (AS) ในแผนแปะสมนไพรบวบก 1% และ 2% ณ เวลาทก�าหนด

วจารณในการศกษาพบวาพอลเมอรทใชในการเตรยมชน backing สามารถเตรยมเปนแผนฟลมไดมลกษณะ

ใกลเคยงกน โดยความพรนของแผนฟลมจะบงชถงความเรยบของแผนฟลมชน backing ไดด โดยพบวาสามารถท�าใหเกดแผนฟลมใสไดไมแตกตางกน ทง EC และ Eudragit E 100 แต Eudragit E 100 ไมสามารถลอกแผนฟลมออกจากภาชนะ ท�าใหไมสามารถน�าแผนฟลมไปศกษาตอได โดยพอลเมอรมความเฉพาะเจาะจงกบชนดของ plasticizer ทใชรวมกน พบวาพอลเมอรทเตรยมโดย EC และ plasticizer ทใช DBP ใหแผนฟลมทมความ

เปราะบางมากและไมมความยดหยน ซงสอดคลองกบรายงานทมผ วจยมาแลว(11) เมอน�ามาทดสอบเชงกลของ แผนฟลม พบวา EC ใหความแขงแรงของฟลมทแตกตางกน ขนอยกบปรมาณของ Triacetin ในแตละต�ารบ สวน

พอลเมอร ทใชในการเตรยมชน adhesive คอ Eudragit NE 30 D โดยปรมาณ DBP มผลตอแผนแปะ โดยปรมาณ DBP ทเหมาะสมจะชวยใหแผนแปะมความยดหยนพอเหมาะ หากปรมาณ DBP ไมเหมาะสมจะท�าใหแผนแปะม




ความมนมากเกนไป ไมยดหยน(12) ซงแผนแปะทไดมคณสมบตทดกวา HPMC เพราะแผนแปะทไดมคณสมบต ในการยดเกาะผวหนงไดดกวา มความยดหยนดกวา โดยสามารถน�ามาตดสนในการเลอกพอลเมอรทเหมาะสมในการพฒนาต�ารบแผนแปะสมนไพร

เมอทดสอบการปลดปลอยสารส�าคญจากแผนแปะสมนไพรบวบก โดย Franz’s Diffusion Cell พบวาแผนแปะสมนไพรบวบก 1% และ 2% มการปลดปลอยสารส�าคญ madecassoside และ asiaticoside หมดทเวลา 135 นาท และ 180 นาท ตามล�าดบ ซงทงสองสตรต�ารบมแนวโนมทปลดปลอยสารส�าคญ madecassoside และ asiaticoside ในทศทางเดยวกน ซงหากมการเตมสารสกดสมนไพรเพมขน ผลตภณฑแผนแปะสมนไพรจะมการ ปลดปลอยทนานขน เพอยดระยะเวลาในการบรหารยาและลดความถในการใชยา จงเปนประโยชนตอการน�าไปใชใน

ผปวยทมบาดแผล ดวยสรรพคณของบวบกทมฤทธตานจลชพ และฤทธสมานแผล

สรปEC 2% และ Triacetin 30% เปนพอลเมอรทเหมาะสมในการเตรยมแผนแปะชน backing ทดทสด

ซงแผนแปะทไดมความใส ยดหยน และแขงแรง สวนแผนแปะชน adhesive พอลเมอรทเหมาะสมคอ Eudragit NE 30 D 6% และ DBP 0.5% ใหลกษณะแผนแปะสมนไพรทมลกษณะทด สามารถยดตดบนผวหนง มการปลดปลอยสารส�าคญ madecassoside และ asiaticoside คดเปน 41.2% และ 94.7% ตามล�าดบ เมอทดสอบการซมผานดวย Franz’s Diffusion Cell และวเคราะหปรมาณสารส�าคญดวย HPLC แผนแปะสมนไพรบวบก 1% และ 2%

มการปลดปลอยสารส�าคญ madecassoside และ asiaticoside หมดทเวลา 135 นาท และ 180 นาท ตามล�าดบ

กตตกรรมประกาศขอขอบคณ คณสภาวรรณ จงธรรมวฒน คณอสราภา เบยวทงนอย ส�านกรงสและเครองมอแพทย

กรมวทยาศาสตรการแพทย ทใหความอนเคราะหการทดสอบเชงกลของแผนฟลม และคณพฤกษวรรณ เจตนจนทร คณปฐมพงษ สทธสมาน สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย ทใหความอนเคราะห การวดความพรนของแผนฟลม

เอกสารอางอง 1. ปราณต โอปณะโสภต. ระบบน�าสงยา. พมพครงท 3. นครปฐม: คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยศลปากร; 2557. 2. จรานช มงเมอง, จารย บนสทธ, ประไพ วงศสนคงมน, อศวชย ชวยพรม, ธดารตน บญรอด. ขอก�าหนดคณภาพทางเคม

ของสารสกดดวยน�าของบวบก. วารสารการแพทยแผนไทยและการแพทยทางเลอก. 2551; 6(2) ฉบบเสรม: 73. 3. Hong SS, Kim JH, Li H, Shim CK. Advanced formulation and pharmacological activity of hydrogel

of the titrated extract of C. asiatica. Arch Pharm Res 2005; 28(4): 502-8. 4. Shetty BS, Udupa SL, Udupa AL, Somayaji SN. Effect of Centella asiatica L (Umbelliferae) on

normal and dexamethasone-suppressed wound healing in Wistar Albino rats. Int J Low Extrem. Wounds 2006; 5(3): 137-43.

5. Health Concerns. Wound healing: an online reference. [online]. [8 screens]. Available from: URL: http://www.lef.org/protocols/prtcl-111.shtml

6. Chatterjee TK, Chakraborty A, Pathak M, Sengupta GC. Effects of plant extract Centella asiatica (Linn.) on cold restraint stress ulcer in rats. Indian J Exp Biol 1992; 30(10): 889-91.



7. Tschesche R, Wulff G. Über die antimikrobielle Wirksamkeit von Saponinen. Z Naturforschg 1965; 20b: 543-546.

8. Williams AC. Transdermal and topical drug delivery. London: The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain; 2003. p. 1-13.

9. Flynn GL. Cutaneous and transdermal delivery: processes and systems of delivery. In: Banker GS, Rhodes CT, editors. Modern Pharmaceutics. Drugs and the pharmaceutical sciences vol. 72. New York: Marcel Dekker; 1995. p. 239-298.

10. Hedge IC, Lamond JM. Umbelliferae (apiaceae). In: Flora of Thailand vol. 5 part 4. Bangkok: Chutima Press; 1992. p. 447-448.

11. Suwannachote K, Rittidej GC. Development of transdermal patch comprising Centella asiatica extract. Adv Mater Res 2010; 93-94: 389-92.

12. จตรลดา วรรณอารยนชย, กลวรรณ ศรสวนนท, โมเรศ ศรบานไผ, การพฒนาสตรต�ารบยา Diclofenac ในรปแบบแผนแปะผวหนง. กรงเทพฯ : ภาควชาอตสาหกรรม คณะเภสชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย; 2546.




The Development of Transdermal Patch From Centella asiatica (L.) Urban

Pornsri Prasertwaree Jiranuch Mingmuang Saowanee Thongdee Sakwichai Onthong and Nuchattra ChansuwanichMedicinal Plant Research Institute Department of Medical Sciences, Tiwanond Road, Nonthaburi 11000, Thailand.

ABSTRACT Asiatic pennywort or Centella asiatica (L.) Urban is a Herbal medicine, which is used for medicines, cosmetics, food supplement and health products. The pharmacological activities of pennywort are for wound healing, keloid treatment and antimicrobial activity. Transdermal drug patch for pennywort developed to reduce frequency for product usage per day. This helps for the pharmacy administration. The developed transdermal delivery system, was comprised of backing layer and adhesive layer which loaded herbal extraction. Different polymers such as ethyl cellulose (EC), eudragit E 100, eudragit NE 30 D, hydroxypropyl methyl cellulose with various concentrations (1.0%, 2.0% and 3.0% w/v) for backing layer and adhesive layer were studied. In addition, two plasticizers triacetin and dibutyl Phathalate (DBP) were also studied for the transdermal delivery system. The result demonstrated that 2.0% EC and 30% triacetin was suitable for backing layer in transdermal patch because transdermal patch was clear, flexible durable for tensile tester and contained few porosity detected by Scanning Electron Microscope (SEM). The preparation adhesive layer from polymer 6.0% eudragit NE 30 D and 0.5% DBP is the most appropriate for the system. The cell diffusion study by Franz’s method using high performance liquid chromatograph (HPLC) demonstrated that both active ingredients in pennywort, madecassoside and asiaticoside are found at 41.2% and 94.7%, respectively. The results of this study are use for new transdermal device for bedsore’s patient.

Key word: Transdermal Patch, Centella asiatica (L.) Urban, Franz’s Diffusion Cell



ชววทยาของยงพาหะโรคไขเลอดออกและซโรทยปของเชอไวรสเดงกในวงจรการเกดโรคในประเทศไทย

อษาวด ถาวระ* พาย ภกดนวน* อภวฏ ธวชสน* จกรวาล ชมภศร* ชญาดา ขำาสวสด*ยทธนา ภทรพย* อจฉรา ภม** ธรกมล เพงสกล*** เผดจ สรยะเสถยร** สมชาย แสงกจพร**สถำบนวจยวทยำศำสตรสำธำรณสข กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000**คณะแพทยศำสตร จฬำลงกรณมหำวทยำลย เขตปทมวน กรงเทพมหำนคร 10330***คณะเทคนคกำรแพทย มหำวทยำลยสงขลำนครนทร สงขลำ 90110

Accepted for publication, 29 May 2015

บทคดยอ คณะผวจยไดออกส�ารวจและเกบตวอยางยงลายบาน (Aedes aegypti) และยงลายสวน (Ae. albopictus) จากภาคตางๆ ของประเทศไทย เพอน�ามาตรวจวเคราะหการตดเชอไวรสเดงกซโรทยปตางๆ รวมถงศกษาขอมลดานชววทยาทเกยวของกบ

การเกดโรคไขเลอดออกของยงพาหะทงสองชนดดงกลาว ผลการส�ารวจในพนท 25 จงหวดของประเทศไทยพบยงพาหะ ทงสองชนดไดในทกจงหวด โดยพบยงลายบานไดจนถงระดบความสง 1,509 เมตรเหนอระดบน�าทะเล ในขณะท ยงลายสวนพบไดจนถงระดบความสง 1,928 เมตร ทงนพบวายงทงสองชนดมนสยชอบกดดดเลอดคนตางไปจากเดมโดยเรมกดตงแตเชามดจนถงพลบค�า นอกจากนยงพบอกวายงทงสองชนดออกหากนในเวลากลางคนอกดวย ผลการศกษาอตรา การกดของยงทงสองชนดพบวายงลายบานมอตราการกดสงสดในฤดรอน ในขณะทยงลายสวนมอตราการกดสงสดในฤดหนาว และจากการศกษาอตราการตดเชอของยงพาหะในธรรมชาต โดยตรวจหาเชอไวรสเดงกในยงทงสองชนด

ท จบไดในพนทว จยทง 25 จงหวดดวยเทคนค semi-nested RT-PCR ผลพบเชอไวรสเดงกทง 4 ซโรทยป ในยงทงสองชนดทจบไดในพนทวจย ไดแก DEN-1, DEN-2, DEN-3 และ DEN-4 โดยทอตราการพบเชอไวรสเดงก

แตละซโรทยปในยงลายบานและยงลายสวนแตกตางกนในแตละจงหวด ทงนยงลายบานมอตราการตดเชอไวรสเดงก

สงกวายงลายสวน คาสงทสดพบในภาคใตเทากบรอยละ 37.75 ในยงลายบาน ขณะทคาสงสดในยงลายสวนพบในภาคใตเชนกนเทากบรอยละ 24.2 นอกจากนยงตรวจพบเชอไวรสเดงกในลกน�ายงและยงเพศผแสดงวามการถายทอดเชอจากยงรนแม ไปสรนลก ท�าใหเกดวฏจกรการตดเชอของยงในธรรมชาต และพบวามเชอไวรสเดงกสองซโรทยป ภายในยงตวเดยวกนอกดวย ซงพบทงในยงลายบานและยงลายสวน ปรากฏการณนบงบอกวาพนททพบนนๆ มความเสยงตอการระบาดของโรคไขเลอดออกเนองจากยงคงมเชออยในยงพาหะ จ�าเปนตองแนะน�าใหประชาชนปองกนตนเองจากการถกยงกดและก�าจดแหลงเพาะพนธยง

ชววทยาของยงพาหะโรคไขเลอดออกและซโรทยปของเชอไวรสเดงก อษาวด ถาวระ และคณะ



บทนำาโรคไขเดงกและไขเลอดออกเกดจากการตดเชอไวรสเดงกประกอบดวย 4 ซโรทยป คอ ไวรสเดงกซโรทยป 1

(DEN-1), ไวรสเดงกซโรทยป 2 (DEN-2), ไวรสเดงกซโรทยป 3 (DEN-3) และ ไวรสเดงกซโรทยป 4 (DEN-4)ตดตอโดยผานการกดของยงพาหะ(1) ในประเทศไทยมรายงานพบยงพาหะโรคไขเลอดออกทส�าคญ 2 ชนด ไดแก

ยงลายบาน (Ae. aegypti) และยงลายสวน (Ae. albopictus) โดยมยงลายบานเปนพาหะหลก(2) ปจจบนถงแมจะมการผลตวคซนส�าหรบโรคดงกลาว แตพบวายงคงเปนแควคซนทอยในระหวางการทดลองและผลทไดยงไมครอบคลมทกซโรทยปของไวรสเดงกและทกชวงอายของกลมประชากร(3, 4) จงนบไดวาโรคไขเลอดออกเปนโรคทยงคงเปนปญหาสาธารณสขทส�าคญมากโรคหนงของประเทศ

การเฝาระวงเกยวกบผปวยและเชอไวรสไขเลอดออก เปนหนงในแนวทางการควบคมโรคไขเลอดออกทส�าคญ แตถงแมจะมการเฝาระวงผปวยและสมตวอยางเลอดน�ามาตรวจ แตการพบผปวยและเชอไวรสไขเลอดออกในผปวยน มกเรมเขาสชวงตนของการระบาดแลว ซงหากมาตรการในการควบคมโรคไมมประสทธภาพและรวดเรวพอ โรคจะแพรกระจายออกไปอยางกวางขวางจนเกนก�าลงทจะควบคม(5) เหตนจงจ�าเปนตองหามาตรการทมประสทธภาพในเชงรก

และมการประชาสมพนธแจงเตอนภยกอนเกดการระบาดแทนการเฝาระวงโดยใชขอมลผปวยดงกลาวขางตนปจจบนขอมลพนฐานดานชววทยา นเวศวทยาและการตดเชอไวรสเดงกในยงทเปนปจจบน ส�าหรบ

น�าไปใชแจงเตอนภยและควบคมยงพาหะใหมประสทธภาพยงไมม ประกอบกบในบางพนทของประเทศไทยยงคงมรายงานจ�านวนผปวยไขเลอดออกสงขน ทงทเจาหนาทสาธารณสขจงหวดไดด�าเนนการควบคมยงลายบานซงเปนพาหะหลกอยางสม�าเสมอ ท�าใหเกดสมมตฐานวาสาเหตการปวยดวยโรคไขเลอดออกอาจเกดจากยงลายสวนทเปนพาหะรองซงมแหลงเพาะพนธแตกตางกนดวย โดยทยงลายบานมแหลงเพาะพนธทส�าคญอยในภาชนะบรเวณชายคาบาน เชน

ตมใสน�าดมน�าใช บอคอนกรตในหองน�า จานรองขาตกนมด ยางรถยนต จานรองกระถางตนไม เปนตน ในขณะท ยงลายสวนมแหลงเพาะพนธทส�าคญอยนอกชายคาบาน และสวนใหญเปนสงทมในธรรมชาตและวสดเหลอทง เชน กระบอกไมไผ กะลามะพราว โพรงตนไม ขวดพลาสตกและขวดแกว เปนตน(6) ปจจบนการรณรงคก�าจดลกน�ายงพาหะสวนใหญพงเปาไปทแหลงเพาะพนธของยงลายบาน ท�าใหไมครอบคลมไปถงแหลงเพาะพนธของยงลายสวน จงท�าใหความชกชมของยงลายสวนเพมมากขนและวฏจกรของโรคไขเลอดออกยงคงมอย ซงตองปรบกลยทธในการควบคม

ยงพาหะ การศกษาศกยภาพในการเปนพาหะโรคไขเลอดออกของยงลายบานเปรยบเทยบกบยงลายสวนในแตละภาคของประเทศไทย ตลอดจนศกษาขอมลดานชววทยาและนเวศวทยาทเกยวกบการเปลยนแปลงพฤตกรรมของยงลายบานและยงลายสวน จะไดขอมลทเปนประโยชนตอการแจงเตอนภยโรคไขเลอดออก และชวยกระตนใหประชาชนตนตวในการรวมมอจดการแหลงเพาะพนธยง อกทงสามารถน�าขอมลไปปรบใชประกอบการวางแผนควบคมโรคไขเลอดออก ลกษณะการน�าเสนอจะใชภาษาและวธการทสามารถเขาใจไดงาย เพอใหเจาหนาททเกยวของ น�าขอมลไปเผยแพร สประชาชนเพอกอใหเกดความกระตอรอรนทจะรวมมอควบคมพาหะน�าโรค ผลการวจยจะไดเกดประโยชนตอสาธารณะ

วสดและวธการการคดเลอกพนทวจย

พนทวจยเปนพนททเสยงตอโรคไขเลอดออก ซงเกดโรคไขเลอดออกซ�าซากในรอบ 5 ป และอยในเขตอตสาหกรรมหรอแหลงทองเทยว โดยคดเลอกจ�านวน 25 จงหวดทวทกภาคของประเทศ ประกอบดวยพนทในภาคกลาง 6 จงหวด ไดแก นนทบร นครปฐม สพรรณบร นครสวรรค เพชรบร และประจวบครขนธ ภาคเหนอ 5 จงหวด ไดแก เพชรบรณ ตาก พษณโลก เชยงราย และเชยงใหม ภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 6 จงหวด ไดแก นครราชสมา ขอนแกน

Biology of Dengue Vectors and Serotypes of Dengue Virus in infectious Cycle in Thailand Usavadee Thavara el al.


หนองคาย บรรมย รอยเอด และอบลราชธาน ภาคตะวนออก 2 จงหวด ไดแก ระยอง และจนทบร ภาคใต 6 จงหวดไดแก สราษฎรธาน นครศรธรรมราช กระบ ตรง สงขลา และพทลง โดยด�าเนนการเกบขอมลระหวางป พ.ศ. 2549-2553

การหาอตราการตดเชอไวรสเดงกของยงลายบานและยงลายสวน เกบตวอยางยงลายบาน (Ae. aegypti) และยงลายสวน (Ae. albopictus) ดวยการใชสวงโฉบในพนทวจย

25 จงหวด โดยเกบตวอยางจงหวดละ 2 อ�าเภอๆ ละ 2 ต�าบล โดยแบงเกบตวอยางยงแตละบานเปน pool ของ ระยะลกน�า ตวเตมวยเพศผ และตวเตมวยเพศเมย pool ละ 5 ตว รวมอยางนอย 160 pools ตอจงหวด

ส�าหรบการเกบตวอยางเพอหาอตราการตดเชอ 2 ซโรทยปในยงตวเดยวกน ตวอยางยงลายบานและยงลายสวนเพศเมย จะถกตรวจแยกเปนตวเดยว ชนดละ 50 ตวตอจงหวด ทงนการจ�าแนกชนดของยงลายใชหลก

อนกรมวธานของแมลง(7) จากนนตวอยางลกน�าและยงตวเตมวยทเกบไดจะถกแชในไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen) เพอน�ากลบมาตรวจหาเชอไวรสเดงกทง 4 ซโรทยปดวยวธ semi-nested reverse transcription-polymerase chain reaction (semi-nested RT-PCR) เพอหาซโรทยปของเชอเดงกในยง แลวน�าผลการศกษาทไดมา เปรยบเทยบกบขอมลซโรทยปในคนในพนทเดยวกน (ทมาของขอมลซโรทยปในผปวย : จากหองปฏบตการ ฝายอาโบไวรส สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข) โดยแสดงผลในรปของกราฟ

วธ semi-nested RT-PCRสกดอารเอนเอของไวรสเดงกจากยงระยะตวเตมวยและลกน�า โดยใชชดส�าเรจรป Invisorb® Spin Virus

RNA MiniKit ตามวธทระบในคมอการใชงาน จากนนน�าอารเอนเอทไดมาเพมจ�านวนสารพนธกรรมดวยวธ semi-nested RT-PCR โดยใชไพรเมอร D1 (5'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3'), TS1 (5'-CGTCTCAGTGATCGGGGG-3'), TS2 (5'-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3'), TS3 (5'-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3') และ TS4 (5'-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3')(8)

ปฏกรยา RT-PCR ประกอบดวย 2X Reaction Mix (0.4 mM dNTP,3.2mM MgSO4) ปรมาตร 12.5 µl, ไพรเมอร D1, TS1, TS2, TS3 และ TS4 ชนดละ 1.0 µl, อารเอนเอตวอยางปรมาตร 5.0 µl, Super Script III TM Taq (ผลตภณฑของ Invitrogen®) จ�านวน 1.0 µl แลวเตม ddH2O จนครบปรมาตร 25.0 µl โดยใชขนตอน ดงนคอ ขนตอนการสงเคราะห cDNA โดยใชอณหภม 55 �C เปนเวลา 30 นาท ตามดวยขนตอนการแยกสายดเอนเอทไดใหเปนเสนเดยวโดยใชอณหภม 94 �C เปนเวลา 2 นาท และขนตอนการเพมปรมาณสายดเอนเอจ�านวน 40 รอบซงประกอบดวยการใชอณหภม 94 �C, 50 �C และ 72 �C ชวงอณหภมละ 30 วนาท และสดทายจงท�าการสงเคราะหดเอนเอสายใหมทอณหภม 72 �C โดยใชเวลา 7 นาท หลงจากปฏกรยา RT-PCR เสรจสน ผลตภณฑทไดจากปฏกรยาจะถกน�าไปตรวจสอบขนาดดเอนด โดยใชวธแยกดวยกระแสไฟฟาบน agarose gel ทมความเขมขนรอยละ 2 โดยทขนาดของผลตภณฑพซอารจากไวรสเดงกซโรทยป DEN-1, DEN-2, DEN-3 และ DEN-4 มขนาด 482 bp, 119 bp, 290 bp และ 392 bp ตามล�าดบ สดทายจงท�าการบนทกขอมลจากการถายภาพเปรยบเทยบกบขนาด

ดเอนเอมาตรฐานเพอวเคราะหผลตอไป

การศกษาชววทยาและนเวศวทยาของยงลายบานและยงลายสวนศกษาพฤตกรรมการกดของยงลายบานและยงลายสวนในพนทอ�าเภอบางบวทอง จ.นนทบร โดยอาสาสมคร

6 คนนงจบยงในภาคสนามทกชวโมงๆ ละ 20 นาท โดยเรมจบตงแตเวลา 06.00 น. จนถง 06.00 น. ของวนถดไป




จากนนน�ายงทจบไดมาจ�าแนกชนด เพศ ตามหลกอนกรมวธานของแมลง(7) แลวค�านวณหาอตราการกดเปนจ�านวนยง/คน/ชวโมงและศกษาขอมลดานการแพรกระจายของยงลายบานและยงลายสวนบนพนทสงในจงหวดเชยงใหม ไดแก อทยานแหงชาตดอยสเทพ-ปย สถานเกษตรหลวงอางขาง และอทยานแหงชาตดอยอนทนนท พนทสงในจงหวดเชยงราย ไดแก ดอยตง โดยเกบตวอยางยง ทงระยะลกน�าและตวเตมวยในพนทดงกลาวและน�ากลบมาจ�าแนกชนดในหองปฏบตการ

ผลอตราการตดเชอไวรสเดงกของยงลายบานและยงลายสวน

ผลการศกษาพบวาอตราการตดเชอไวรสเดงกของยงลายบานและยงลายสวนในภาคใตของประเทศไทย

มอตราการตดเชอสงสดคอรอยละ 37.75 และ 24.24 (ภาพท 1)จากเชอไวรสเดงกทตรวจพบในยงลายบานและยงลายสวน เมอวเคราะหซโรทยปพบวา พบทง 4 ซโรทยป

โดยพบซโรทยป DEN-1 และ DEN-2 มากทสด นอกจากนพบวาซโรทยปของเชอไวรสเดงกทตรวจพบในผปวย

ตงแตป พ.ศ. 2549-2553 มากทสดคอ ซโรทยป DEN-1 (ภาพท 2)

ภาพท 2 ซโรทยปของเชอไวรสเดงกในยงลายบาน (Ae. aegypti) ยงลายสวน (Ae. albopictus) และในผปวยระหวาง ป พ.ศ. 2549– 2553

ภาพท 1 อตราการตดเชอไวรสเดงกของยงลายบาน (Ae. aegypyi) และยงลายสวน (Ae. albopictus) ในภาคตางๆ ของประเทศไทย ระหวางป พ.ศ. 2549 - 2553

อตราการตดเชอไวรสเดงก (%

)

ซโรทยปทตรวจพบ (%

)



เมอวเคราะหซโรทยปของเชอไวรสเดงกในยงลายบาน ยงลายสวน และผปวย ในป พ.ศ. 2549-2553 โดยแยกตามภาคตางๆ พบวาเชอไวรสเดงกซโรทยป DEN-1 ถกตรวจพบมากทสดในยงลายสวนและผปวยในทกภาคของประเทศไทย (ภาพท 3)

ภาพท 3 อตราการตดเชอไวรสเดงกแตละซโรทยปของยงลายบาน (Ae. aegypti) ยงลายสวน (Ae. albopictus) และจากขอมลผปวย ในป พ.ศ. 2549–2553 แยกตามภาคตางๆ ของประเทศไทย

นอกจากน ผลการศกษายงพบอตราการตดเชอไวรสเดงกในยงลายเพศผยงลายบานและยงลายสวน

ทงสองชนด รอยละ 19.5 (780/4,000 pools) และพบอตราการตดเชอไวรสเดงกในลกน�ารอยละ 18.7 (748/4,000 pools) ทงนยงพบการตดเชอไวรสเดงก 2 ซโรทยปในยงตวเดยวกน ทงในยงลายบานและยงลายสวนเพศเมยอกดวย โดยทใน

ยงลายบานซโรทยปทพบในยงตวเดยวกน คอ DEN-1 กบ DEN-4, DEN-1 กบ DEN-2 และ DEN-2 กบ DEN-4 โดยพบอตราการตดเชอไวรสเดงกรอยละ 1.6 (4/250 pools), 1.2 (3/250 pools) และ 0.4 (1/250 pools) ตามล�าดบ สวนในยงลายสวนซโรทยปทพบในยงตวเดยวกนคอ DEN-2 กบ DEN-3 ซงพบอตราการตดเชอไวรส

เดงกรอยละ 6.8 (17/250 pools)

ชววทยาและนเวศวทยาของยงลายบานและยงลายสวนผลการศกษาพฤตกรรมการกดของยงลายบานและยงลายสวน พบวายงลายบานมอตราการกดสงสด

ในฤดรอนคอ ชวงเวลา 06.00-10.00 น. และ18.00-19.00 น. รองลงมาในฤดฝน คอ ชวงเวลา 09.00 -10.00 น., 15.00-16.00 น. และ 18.00-19.00 น. และอตราการกดต�าสดในฤดหนาว คอ ชวงเวลา 07.00-08.00 น., 10.00-11.00 น. และ 17.00-18.00 น. (ภาพท 4)

ภาคเหนอ ภาคตะวนออกเฉยงเหนอ ภาคกลาง ภาคตะวนออก ภาคใต




สวนยงลายสวนมอตราการกดสงสดในฤดหนาว คอ ชวงเวลา 16.00-17.00 น. และ 18.00-19.00 น. รองลงมาคอฤดรอนในชวงเวลา 06.00-10.00 น., 12.00-13.00 น. และ 18.00-19.00 น. และอตราการกดต�าสด

ในฤดฝนในชวงเวลา 16.00-17.00 น. (ภาพท 5)

อตราการกด (ตว/คน

/ชวโม

ง)

ชวงเวลานงจบยง

ภาพท 5 อตราการกดของยงลายสวน (Ae. albopictus) ในชวงฤดรอน ฤดฝน และฤดหนาว

จ�านวนยงฤดรอนจ�านวนยงฤดฝนจ�านวนยงฤดหนาว

อตราการกด (ตว/คน

/ชวโม

ง)

ชวงเวลานงจบยงภาพท 4 อตราการกดของยงลายบาน (Ae. aegypti) ในชวงฤดรอน ฤดฝน และฤดหนาว

จ�านวนยงฤดรอนจ�านวนยงฤดฝนจ�านวนยงฤดหนาว



จากการส�ารวจยงลายบานและยงลายสวนบนพนทสงในจงหวดเชยงใหม ณ อทยานแหงชาตดอยสเทพ-ปย สถานเกษตรหลวงอางขาง อทยานแหงชาตดอยอนทนนท และพนทดอยตง จงหวดเชยงราย พบวาพบยงลายบาน

จนถงระดบความสง 1,509 เมตร เหนอระดบน�าทะเล (ดอยตง) แตทระดบความสง 1,928 เมตร (ดอยอางขาง) พบเฉพาะยงลายสวน ในขณะททระดบความสง 2,565 เมตร (ดอยอนทนนท) ส�ารวจไมพบยงลายทงสองชนด

วจารณงานวจยนศกษาเกยวกบอตราการตดเชอไวรสเดงก ในยงพาหะไขเลอดออกไดแก ยงลายบาน

(Ae. aegypti) และยงลายสวน (Ae. albopictus) ในภาคตางๆ ของประเทศไทย พบวาอตราการตดเชอไวรสเดงกทงในยงลายบานและยงลายสวน พบสงสดในภาคใต โดยเมอพจารณาถงสภาพภมศาสตรและภมอากาศของภาคใตของประเทศไทยแลวพบวามอากาศรอนชนและฝนตกเกอบตลอดทงป ซงเปนลกษณะทเหมาะตอการเจรญเตบโตของ ยงพาหะ ประกอบกบเปนพนททอดมไปดวยแหลงเพาะพนธ เนองจากมการท�าสวนยางพาราและปาลมน�ามนเปนจ�านวนมาก ทงนยงอดมไปดวยแหลงทองเทยวทางธรรมชาตอยางอทยาน น�าตกและสวนสาธารณะ จงท�าใหจ�านวนยงพาหะ ทพบมจ�านวนมากกวาภาคอนๆ(9) และพบรายงานผปวยไขเลอดออกสงในทกป โดยเฉพาะอยางยงในป 2550 และ 2553 ซงพบอตราปวยสงสดในภาคใต เมอเทยบกบภาคอนๆ (137.96 ตอประชากรแสนคน และภาคเหนอ 73.25 ตอประชากรแสนคน และส�าหรบใน พ.ศ. 2553 ซงเปนปทพบผปวยไขเลอดออกสงมาก (116,947 ราย, ส�านกโรคตดตอน�าโดยแมลงป 2553) โดยพบอตราปวยสงสดในภาคใต (332.21 ตอประชากรแสนคน) รองลงมา คอ ภาคเหนอ (179.61 ตอประชากรแสนคน) ภาคกลาง (166.04 ตอประชากรแสนคน) และภาคตะวนออกเฉยงเหนอ (138 ตอประชากร แสนคน) เนองจากภาคใตมจ�านวนผปวยสงสด และมจ�านวนยงพาหะสง จงท�าใหพบอตราการตดเชอไวรสเดงก ในยงสงตามไปดวย จะเหนไดวาหากอตราการตดเชอไวรสเดงกในยงสงจะพบอตราปวยไขเลอดออกสงดวยเชนกน

อนงยงพบวาอตราการตดเชอไวรสเดงกในยงลายบานสงกวาในยงลายสวนในทกภาคของประเทศไทย ซงอาจเนองจากลกษณะนสยการหาเหยอของยงลายบานซงหาแหลงเลอดภายในบานท�าใหมโอกาสเจอแหลงเลอดมากกวายงลายสวน ประกอบกบลกษณะแหลงเพาะพนธของยงลายบานทเกดจากวสดทมนษยสรางขน เชน ตมน�า บอคอนกรต เปนตน

ซงจะมน�าเตมตลอดเวลาแมแตในฤดแลง ท�าใหยงลายบานสามารถเพาะพนธไดตลอดทงป(10) ตรงกนขามกบยงลายสวนทหากนในสวนท�าใหมโอกาสเจอแหลงเลอดนอยกวา และแหลงเพาะพนธของยงลายสวนยงอยกลางแจงจงอาจแหงในฤดรอน และถกชะท�าลายโดยน�าฝนไดงายกวาอกดวย(11) พบอตราการตดเชอไวรสเดงกในยงลายสวนรอยละ 2.8-24.2 โดยพบสงสดในภาคใตเชนกนซงจากการคนพบดงกลาวเปนขอบงชวายงคงมยงลายสวนทเปนพาหะ อยในพนท ซงหากตองการตดวงจรโรคไขเลอดออก จ�าเปนอยางยงทจะตองควบคมยงลายสวนเหลานดวย

เมอพจารณาถงซโรทยปของไวรสเดงกทตรวจพบในยงลายบานตามภาคตางๆ พบวาภาคเหนอ

ภาคตะวนออก และภาคกลาง ตรวจพบซโรทยป DEN-2 มากทสด ภาคตะวนออกเฉยงเหนอพบซโรทยป DEN-1 มากทสดและภาคใตพบซโรทยป DEN-3 มากทสด ในขณะทในยงลายสวนตรวจพบซโรทยป DEN-1 มากกวา ซโรทยปอนๆ ในทกภาค ยกเวนภาคใตพบซโรทยป DEN-1, DEN-2 และ DEN-4 มจ�านวนใกลเคยงกน อนงในภาพรวมทงประเทศในยงลายบานตรวจพบเชอไวรสเดงกซโรทยป DEN-2 สงสด สวนในยงลายสวนพบ

ซโรทยป DEN-1 สงสด ในขณะทในผปวยพบซโรทยป DEN-1 สงสด ทงนในพนททมซโรทยปไมครบทง 4 ซโรทยป ประชากรในพนทนนจะเสยงตอการเปนโรคไขเลอดออก

นอกจากนยงตรวจพบเชอไวรสเดงก 2 ซโรทยปภายในยงตวเดยวกนอกดวยซงตรงกบรายงานผล

การวจยทพบไดทงในผ ปวย(12) และในตวยง(13) ปรากฏการณนบงบอกวาพนทนน มความเสยงในการระบาด

ของโรคไขเลอดออกและพบการตดเชอไวรสเดงกในยงลายเพศผทงยงลายบานและยงลายสวนสงถงรอยละ 19.5 และในลกน�ายงรอยละ 18.7 อกดวย สอดคลองกบรายงานของ Thavara et al(13) และ Chompoosri(14) ซงพบไดจาก




การตรวจเชอไวรสชคนกนยาในยงลายบานและยงลายสวนดวยเชนกน(8) แสดงใหเหนวามการถายทอดเชอจากยงรนแมไปสรนลก (transovarial transmission) ท�าใหเกดเปนวฏจกรการตดเชอของยงในธรรมชาต ซงยากตอการตดวงจรการระบาดของโรคไขเลอดออก

จากผลการศกษานเวศวทยาของยงลายบานและยงลายสวน พบยงทงสองชนดไดในทกจงหวดทวจย โดยสามารถพบยงลายบานไดจนถงระดบความสง 1,509 เมตรเหนอระดบน�าทะเล ในขณะทยงลายสวนพบไดจนถงระดบความสง 1,928 เมตร ขอมลดงกลาวชใหเหนวาการระบาดของโรคไขเลอดออกในพนทภเขาสงของประเทศไทย (สงกวา 1,500 เมตรเหนอระดบน�าทะเล) มโอกาสสงทพาหะจะเปนยงลายสวน ดงนนการควบคมโรคไขเลอดออก

ในหมบานชาวเขาจงควรใหความส�าคญกบแหลงเพาะพนธของยงลายสวนใหมากขนดวยสภาพภมอากาศและอณหภมเปนตวแปรทส�าคญอยางมากตอยงพาหะน�าโรคไขเลอดออก เนองจากมผล

ตอระยะเวลาพฒนาในวงชวตของยงพาหะ ซงอาจชวยยดชวตของยงพาหะออกไปท�าใหมเวลาในการสงผานเชอนานขน หรอท�าใหระยะเวลาทใชในการเจรญเตบโตลดลงท�าใหปรมาณของยงพาหะเพมมากขนและมอตราการกดสงขน เปนตน(15-18) ทงนประเทศไทยตงอยในภมศาสตรเขตรอนชนทอณหภมของทง 3 ฤด (ฤดรอน ฤดฝน และฤดหนาว) แตกตางกนไมมาก แตมปรมาณความชนและน�าฝนทเปนปจจยส�าคญตอการระบาดของโรคไขเลอดออก(18) แตกตางกนชดเจน ซงจากการศกษาพฤตกรรมการกดของยงลายทงสองชนดในแตละฤดพบวา ยงลายบานมพฤตกรรมการกดเปลยนแปลงไปจากรายงานของ Yasuno และ Tonn(19) ทพบวายงลายมอตราการกดสงทสด 3 ชวโมงกอนพระอาทตยตกดนคอ เวลาประมาณ 14.00 – 17.00 น. โดยการทดลองนพบวาในฤดรอนและฤดฝนยงลายบานมชวงเวลากดสงหลายชวงในแตละวน โดยทชวงเวลาการกดสงสดในฤดรอนพบในชวงเชาระหวางเวลา 06.00-10.00 น. และชวงเยนเวลา 18.00-19.00 น. ฤดฝนชวงเวลาการกดสงสดม 3 ชวง คอเวลา 09.00-10.00 น., 15.00-16.00 น. และ 18.00-19.00 น. ในขณะทฤดหนาวชวงเวลาการกดสงสดม 3 ชวงคอเวลา 07.00-08.00 น., 10.00-11.00 น. และ 17.00-18.00 น. นอกจากนยงพบอกวายงทงสองชนดมพฤตกรรมกดในชวงกลางคนดวย

ผลการศกษาพฤตกรรมการของยงลายสวนพบวา ฤดรอนชวงเวลาการกดสงสดม 3 ชวงคอ เวลา 06.00-10.00 น., 12.00-13.00 น. และ 18.00-19.00น. ฤดฝนชวงเวลากดสงสดคอ เวลา 16.00-17.00 น. และฤดหนาวชวงเวลากดสงสดม 2 ชวงคอ 15.00-16.00 น. และ 18.00-19.00 น. พบวายงลายสวนมอตราการกดสงสดในฤดหนาว ซงอาจเปนเพราะในปทท�าการวจยมประมาณน�าฝนมากท�าใหแหลงเพาะพนธของยงลายสวนทอยกลางแจงถกชะท�าลาย จนท�าใหเวลาในการเพมจ�านวนของยงในชวงฤดฝนชะลอตวและเรมเพมมากขนในชวงตนของฤดหนาว ซงปรากฏการณดงกลาว ท�าใหเกดการเลอนเวลาการระบาดได(11) ผลจากการศกษาพฤตกรรมการการกดของยงในแตละฤดนจงสามารถสรปไดวาสภาพภมอากาศมผลอยางมากตอพฤตกรรมการกดของยงลาย

สรปจากการศกษาขอมลดานชววทยาทเกยวของกบการเกดโรคไขเลอดออกของยงลายบานและยงลายสวน

พบวาชวงเวลาทยงทงสองชนดชอบกดดดเลอดคนเปลยนแปลงไปจากเดมโดยเรมกดตงแตเชามดจนถงพลบค�ารวมทงในเวลากลางคนดวย ทงนยงลายบานมอตราการกดสงสดในฤดรอน ในขณะทยงลายสวนมอตราการกดสงสดในฤดหนาว จากการศกษาอตราการตดเชอไวรสเดงกของยงทงสองชนดในธรรมชาต พบวายงลายบานมอตราการตดเชอไวรสเดงกมากกวายงลายสวน และตรวจพบเชอไวรสเดงกไดในลกน�ายงและยงเพศผ นอกจากนยงตรวจพบเชอไวรสเดงก

สองซโรทยปภายในยงตวเดยวกน ทงในยงลายบานและยงลายสวนอกดวย



กตตกรรมประกาศขอขอบคณ ผชช.สรภ อนนตปรชา และเจาหนาทฝายอาโบไวรส ส�าหรบขอมลซโรทยปของเชอไวรส

ในผปวย และเจาหนาทฝายชววทยาและนเวศวทยา สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข ส�าหรบการออกส�ารวจและ เกบตวอยางภาคสนาม รวมถงเจาหนาทจากส�านกงานปองกนควบคมโรคและส�านกงานสาธารณสขจงหวด ทชวย

ประสานงานการเกบตวอยางในพนทวจย และขอขอบคณ ผทว.ปราณ ชวลตธ�ารง ผชช.นวพร อนนตสนกล

และคณอารรตน สงาแสง ทไดใหค�าแนะน�าตลอดจนตรวจแกผลงาน

เอกสารอางอง 1. Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev 1998; 11(3): 480-96. 2. Strickman D, Kittayapong P. Dengue and its vectors in Thailand: introduction to the study and

seasonal distribution of Aedes larvae.Am J Trop Med Hyg 2002; 67(3): 247-59. 3. Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic

problem in the 21st century. Trends Microbiol 2002; 10(2): 100-3. 4. Capeding MR, Tran NH, Hadinegoro SR, Ismail HI, Chotpitayasunondh T, Chua MN, et al.

Clinical efficacy and safety of a novel tetravalent dengue vaccine in healthy children in Asia: a phase 3, randomised, observer-masked, placebo-controlled trial. Lancet 2014; 384(9951): 1358-65.

5. ตวงพร ศรสวสด, ชยวฒน วาสะศร, บรรณาธการ. คมอการปองกนและควบคมโรคไขเลอดออกส�าหรบองคกรปกครอง สวนทองถน. นนทบร : กลมโรคไขเลอดออก ส�านกโรคตดตอน�าโดยแมลง กระทรวงสาธารณสข; 2551.

6. Arunachalam N, Tana S, Espino F, Kittayapong P, Abeyewickreme W, Wai KT, et al. Eco-bio-social determinants of dengue vector breeding: a multicountry study in urban and periurban Asia. Bull World Health Organ 2010; 88(3): 173-84.

7. Rueda LM. Pictorial keys for the identification of mosquitoes (Diptera: Culicidae) associated with dengue virus transmission. Zootaxa 2004; 589: 1-60.

8. Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992, 30(3): 545-51.

9. Thavara U, Tawatsin A, Pengsakul T, Bhakdeenuan P, Chanama S, Anantapreecha S, et al. Out-break of chikungunya fever in Thailand and virus detection in field population of vector mosquitoes, Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus Skuse (Diptera: Culicidae). Southeast Asian J Trop Med Public Health 2009; 40(5): 951-62.

10. Thavara U, Tawatsin A, Chansang C, Kong-ngamsuk W, Paosriwong S, Boon-Long J, et al. Larval occurrence, oviposition behavior and biting activity of potential mosquito vectors of dengue on Samui Island, Thaland. J Vector Ecol 2001; 26(2): 172-80.

11. Wongkoon S, Jaroensutasinee M, Jaroensutasinee K. Climatic variability and dengue virus transmission in Chiang Rai, Thailand. Biomedica 2011; 27: 5-13.

12. Wang WK, Chao DY, Lin SR, King CC, Chang SC. Concurrent infections of two dengue virus serotypes among dengue patients in Taiwan. J Microbiol Immunol Infect 2003; 36(2): 89-95.

13. Thavara U, Siriyasatien P, Tawatsin A, Asavadachanukorn P, Anantapreecha S, Wongwanich R, et al. Double infection of heteroserotypes of dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) and serological features of dengue viruses found in patients in southern Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health 2006; 37(3): 468-76.




14. Chompoosri J, Thavara U, Tawatsin A, Anantapreecha S, Siriyasatien P. Seasonal monitoring of dengue infection in Aedes aegypti and serological feature of patients with suspected dengue in 4 central provinces of Thailand. Thai J Vet Med 2012; 42(2): 185-93.

15. Watts DM, Burke DS, Harrison BA, Whitmire RE, Nisalak A. Effect of temperature on the vector efficiency of Aedes aegypti for dengue 2 virus. Am J Trop Med Hyg 1987; 36(1): 143-52.

16. Russell RC. Mosquito-borne arboviruses in Australia: the current scene and implications of climate change for human health. Int J Parasitol 1998; 28(6): 955-69.

17. Karim MN, Munshi SU, Anwar N, Alam MS. Climatic factors influencing dengue cases in Dhaka city: a model for dengue prediction. Indian J Med Res 2012; 136(1): 32-9.

18. Reiter P. Climate change and mosquito-borne disease. Environ Health Perspect 2001; 109(Suppl 1): 141-61.

19. Yasuno M, Tonn RJ. A study of biting habits of Aedes aegypti in Bangkok, Thailand. Bull World Health Organ 1970; 43(2): 319-25.



Biology of Dengue Vectors and Serotypes of Dengue Virus in infectious Cycle in Thailand

Usavadee Thavara* Payu Bhakdeenuan* Apiwat Tawatsin*

Jakkrawarn Chompoosri* Chayada Khumsawads* Yuttana Phusup* Atchara Phumee** Theerakamol Pengsakul*** Padet Siriyasatien** Somchai Sangkitporn*

*National Institute of Health, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand**Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand***Faculty of Medical Technology, Prince of Songksla University, Songkhla 90110, Thailand. Running title: Biology of Dengue Vectors and Serotypes of Dengue Virus1

ABSTRACT Biological studies on dengue vectors, Aedes aegypti and Ae. albopictus and prevalence of dengue viruses found in both species were carried out in 25 provinces of Thailand. Both vectors were usually found in all provinces; however, Ae. aegypti and Ae. albopictus could be found up to 1,509 and 1,928 meters above sea level, respectively. It was found that the biting rhythm of dengue vectors was different from previous studies. Both species frequently fed on humans during daytime from dawn to dusk, but they sometimes also seek for blood meal at night. Biting rates of Ae. aegypti were high in summer while those of Ae. albopictus were in winter. The semi-nested RT-PCR technique was used to detect dengue virus in both species to demonstrate prevalence of the virus in mosquito vectors. It was found that 4 serotypes of dengue viruses were detected in both vector collected from 25 provinces. The prevalence of each serotype of dengue viruses found in each vector varied from province to province, while the infection rates in Ae. aegypti were higher than those of Ae. albopictus. Occurrence of dengue viruses found in larvae and adult male mosquitoes reveals the role of transovarial transmission of dengue viruses in field populations of the vectors and elucidates circulation of dengue viruses in vectors in endemic areas. Double infections of two serotypes of dengue viruses were also detected in individual Ae. aegypti and Ae. albopictus. The incidence of multi-serotypes of dengue viruses found in field populations of both vectors in the same areas is suspected to initiate epidemic of dengue fever. Therefore, it needs to get rid of larval breeding places and personal protection from mosquito bites.

Key words: Aedes aegypti, Aedes albopictus, Biology, Dengue infection rate




กรณศกษา : ความผดพลาดในการคำานวณสถตจากคาลอการทม

สธน วงษชร* กตตพงษ เกดฤทธ** สรศกด หมนพล* มะลวลย หอมจน* และพรหมภสสร ดษสระ* *ส�ำนกมำตรฐำนหองปฏบตกำร กรมวทยำศำสตรกำรแพทย ถนนตวำนนท นนทบร 11000**ส�ำนกโรคตดตอน�ำโดยแมลง กรมควบคมโรค ถนนตวำนนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 11 March 2015

บทคดยอ ไดทบทวนคาสถตของผลงานวจยการตรวจปรมาณไวรส ซยโตเมกาโลไวรส (Cytomegalo virus, CMV) ทน�าเสนอในวารสารระดบนานาชาต (J Mol Diagn. Mar 2009; 11(2): 87-92.) พบความผดพลาดจากการค�านวณทละเลยกฎการค�านวณตวเลขลอการทม ท�าใหคาเฉลยคณตศาสตรต�ากวาคาทถกตอง คาเบยงเบนมาตรฐานทค�านวณจากคาลอการทมโดยตรงมคาผดพลาดในทางต�ากวาคาทถกตอง ท�าใหไดขอสรปทผดพลาดวา ผลเฉลยจากการวเคราะหจากหองปฏบตการ 23 แหง ไดผลไมแตกตางจากคาอางอง และสงผลใหสถตทงหมดทใชคาเบยงเบนมาตรฐานผดพลาดทงหมดคอ Pair t-test, 95% Confidence Intervals, Coefficient of Variance, Correlation Coefficient และสงผลตอขอสรปของผประพนธ ทวาผลตรวจวเคราะหปรมาณ CMV ระหวางหองปฏบตการทง 4 ระดบนน มคาไมแตกตางกน ท�าใหผประพนธลดความส�าคญเรองความผนแปรของคา CMV load ในการเปรยบเทยบระหวางหองปฏบตการ แตไปใหความส�าคญกบเชอมาตรฐานทใช ในการเปรยบเทยบ


failure in Calculating The Statistics from Logarithm Values: Case Study Suthon Vongsheree el al.

บทนำาลอการทมเปนวธการน�าเสนอและค�านวณขอมลตวเลขยกก�าลงใหสะดวกขน สวนประกอบของตวเลขลอการทม

ม 2 สวน คอ ตวเลขหนาจดทศนยม (Characteristic) ระบระดบเลขยกก�าลง ตวเลขหลงจดทศนยม (Mantissa) แสดงตวเลขนยส�าคญของการวด ในบทความนจะใชลอการทมฐาน 10 โดยละคาฐานไวในทเขาใจ ลอการทม ประดษฐขนโดย John Napier of Merchiston นกคณตศาสตร นกฟสกส นกดาราศาสตร และ นกเทวศาสตร ชาวสกอต

ผมชวตอย ค.ศ. 1550-1617 ไดตพมพลอการทมครงแรกเมอ ค.ศ. 1614 ทเมองเอดนเบรก เปนภาษาละตน ชอ Merifici Logarithmorum Descriptio และแปลเปนภาษาองกฤษใน ค.ศ. 1616

กฎพนฐานในการค�านวณลอการทมทเกยวของใชแค การบวกและการลบเลขลอการทมใหเปนการคณและการหาร ตามล�าดบ ดงตวอยางขางลาง

การบวก log M + log N = log (M*N)ตวอยางการค�านวณ log 5+log 2 = log (5*2) = log 10 = 1ขณะท log 5 = 0.699, log 2 = 0.301 หากบวกคาลอการทมโดยตรงจะได log 7 ซงมคา antilog 7 = 0.845การลบ log M- log N = log (M/N) ตวอยางการค�านวณ log 5-log 2 = log (5/2) = log 2.5 = 0.398 หากน�าคาลอการทมมาลบโดยตรงจะได log 3 ซงมคา antilog 3 = 0.477จะเหนวาการค�านวณทใชคาลอการทมจ�าเปนตองใชกฎการค�านวณของลอการทม ไมใชการบวกหรอลบตวเลข

ลอการทมโดยตรง ทางเลอกส�าหรบผไมสนทด อาจแปลงคาลอการทมกลบเปนตวเลขยกก�าลง ซงเปนคาสมบรณ

ทใชค�านวณโดยตรงได

วธการ ในบทความนจะใชขอมลระดบไวรส CMV จากการเปรยบเทยบระหวาง 23 หองปฏบตการ ทรายงาน

ในวารสาร J Mol Diagn. Mar 2009; 11(2): 87–92 เรอง Multi-Site PCR-Based CMV Viral Load Assessment-Assays Demonstrate Linearity and Precision, but Lack Numeric Standardization. A Report of the Association for Molecular Pathology ซงไดรบอนญาตใหใชขอมลจากเจาของลขสทธ บรษท Elsevier Inc., ใชโปรแกรมสถตของเอกเซล แตเปลยนขอมลลอการทมเปนคาสมบรณกอนค�านวณตวสถตทงหมด แลวแปลงคาทค�านวณไดเปนลอการทม (ตารางท 1 และ 2)



กรณศกษา: ความผดพลาดในการค�านวณสถตจากคาลอการทม สธน วงษชร และคณะ

1 4.12 4.37 5.08 5.97 2 * * 4 4.78 3 3.27 4.04 5.18 5.74 4 2.92 3.89 5.01 5.75 5 2.54 3.17 4.47 5.02 6 3.02 3.64 4.79 5.94 7 3.53 4.72 5.77 6.58 8 3.06 3.98 4.97 6.02 9 2.79 3.59 4.76 5.7 10 3.36 4.31 5.27 6.25 11 2.77 3.84 4.92 5.93 12 2.98 3.76 4.63 5.68 13 2.59 3.8 4.71 5.66 14 4.08 5.2 6.1 7.25 15 2.04 3.2 4.26 5.56 16 2.71 3.68 4.73 5.67 17 * 3.45 4.14 4.75 18 2.51 3.5 4.62 5.63 19 * 3.29 4.3 4.97 20 2.6 3.68 4.72 5.68 21 2.53 3.54 4.46 5.47 22 2.3 2.95 3.74 4.83 23 3.41 4.3 5.04 5.45 Mean 2.96 3.81 4.77 5.66

(ทมา: ประยกตจากตารางท 2 ของเอกสารอางอง 2 ไดรบอนญาตใหใชได จากเจาของลขสทธ บรษท Elsevier Inc.,)

คาเฉลยระดบ CMV load จากสมาชก 23 หองปฏบตการ

Laboratory CMV Viral DNA Panels 2.70 copies/ml 3.70 copies/ml 4.70 copies/ml 5.70 copies/ml

ตารางท 1 ขอมลระดบ CMV load, copies/ml จาก 23 หองปฏบตการ ในคาลอการทม * คาทไมแสดงในตารางเปนคาทต�ากวา 50 copies/ml



ผลคาของตวสถตจากวารสารทศกษาทค�านวณจากคาลอการทมโดยตรง และไมท�าตามกฎการค�านวณบวก

หรอลบคาลอการทมเปรยบเทยบกบคาตวสถตทค�านวณจากคาสมบรณไดแสดงรายละเอยดในตารางท 2 ดงน1. คาเฉลยทางคณตศาสตรทแสดงในวารสารเปนคาทค�านวณผดอยางชดเจน เนองจาก 1.1 ค�านวณคาเฉลยทางคณตศาสตรจากคาลอการทมโดยไมท�าตามกฎการบวกคาลอการทม 1.2 คาทต�ากวาขดจ�ากดในการตรวจท 50 copies/ml พบ 3 คา เมอตรวจตวอยางอางองท 500

copies/ml และคาทต�ากวาขดจ�ากดในการตรวจท 50 copies/ml พบ 1 คา เมอตรวจตวอยางอางองท 5000 copies/ml ถกละเลยไมน�ามาค�านวณดวย ทงๆ ทอาจจะมคา ตงแต 0 - 50 copies/ml ท�าใหคาเฉลยทางคณตศาสตร สงกวาคาทควรจะเปน

จากตารางท 2 คาอางองของเชอมาตรฐานทใชมคาลอการทมเปน 2.7, 3.7, 4.7 และ 5.7 หรอ 500, 5000, 50000, 500000 copies/ml ขณะทคาเฉลยทางคณตศาสตรในวารสารเปน 2.96, 3.81, 4.77, 5.66 หรอ 912, 6457, 58884 และ 4570888 copies/ml ตามล�าดบ เมอทดสอบทางสถตดวย Paired t-test, two tail, t = 0.345, p = 0.376 สรปวาคาทไดจาก 23 หองปฏบตการ ไมแตกตางจากคาอางอง

หากค�านวณคาเฉลยทางคณตศาสตรโดยใชกฎการบวกของลอการทมจะไดคาเฉลยลอการทมเปน 3.33, 3.81, 4.77, 5.66 หรอ 2156, 16147, 138298 และ 1404755 copies/ml ตามล�าดบ เมอทดสอบทางสถตดวย Paired t-test, two tail, t = 25.8855, p = 0.0008 สรปวาคาทไดจาก 23 หองปฏบตการ แตกตางจากคาอางองอยางมนยส�าคญทางสถต

2. คาเบยงเบนมาตรฐานและสถตอนๆ ทใชคาเบยงเบนมาตรฐานรวมในการค�านวณทแสดงในวารสาร เปนคาทค�านวณผดอยางชดเจนเพราะไมท�าตามกฎการลบคาลอการทมรวมถงความผดพลาดในขอ 1.1 และ 1.2

2.1 คาเบยงเบนมาตรฐานในวารสารเปน 0.54, 0.53, 0.53, 0.58 คดเปน 3.5, 3.4, 3.4, 3.8 copies/ml ตามล�าดบ ซงเปนไปไมได หากการขดจ�ากดในการตรวจหาอยท 50 copies/ml

หากค�านวณคาเบยงเบนมาตรฐานโดยใชกฎการลบของลอการทมจะไดคาเบยงเบนมาตรฐานลอการทม เปน 3.57, 4.53, 5.43 และ 6.56 หรอ 3684, 33816, 271659, 3656718 copies/ml ตามล�าดบ

2.2 คาสมประสทธความแปรปรวน (Coefficient of Variance). ในวารสารเปน 18.40%, 13.86%, 11.17% และ 10.20% ขณะทค�านวณจากคาสมบรณเปน 171%, 209%, 196%, 256% ตามล�าดบ ท�าใหขอสรปของผประพนธผดพลาด ทวา คาทเปลยนแปลงในระดบ 3-5 เทา มนยส�าคญตอการรกษา

2.3 คาระดบความเชอมนรอยละ 95 จากวารสารทค�านวณเปนคาลอการทม 0.24, 0.22, 0.22, 0.24 หรอประมาณ 1.7 copies/ml ตามล�าดบ ซงเปนไปไมไดหากการขดจ�ากดในการตรวจหาอยท 50 copies/ml

หากค�านวณคาระดบความเชอมนรอยละ 95 โดยใชกฎการลบของลอการทมจะไดคาระดบ

ความเชอมนรอยละ 95 ลอการทม เปน 1.56, 1.89, 2.22, 2.68 หรอ 1615, 14130, 119058, 1602598 copies/ml ตามล�าดบ




วจารณสรปความผดพลาดจากการละเลยกฎการค�านวณคาลอการทมและผลกระทบในการค�านวณคาสถตตางๆ

ทน�าเสนอในวารสาร J Mol Diagn. Mar 2009; 11(2): 87–92 เรอง Multi-Site PCR-Based CMV Viral Load Assessment-Assays Demonstrate Linearity and Precision, but Lack Numeric Standardization. A Report of the Association for Molecular Pathology. ดงน

1. คาเฉลยทางคณตศาสตรทแสดงในวารสารเปนคาทค�านวณผด ไดคาต�ากวาคาทเปนจรงตามการทดลอง สงผลใหผรายงานสรปวา คา CMV load ทไดจากหองปฏบตการ 23 แหง ไมแตกตางจากคาอางอง ทงๆ ท คาดงกลาว แตกตางจากคาอางองอยางมนยส�าคญทางสถต หากผวจยไดค�านวณอยางถกตอง จะตองยตการศกษาในขนตอไป แลวเรมตนวเคราะหหาสาเหตแหงความผดพลาดน

2. คาเบยงเบนมาตรฐานและสถตอนๆ ทใชคาเบยงเบนมาตรฐานรวมในการค�านวณทแสดงในวารสารเปนคาทต�ากวาคาทเปนจรง ท�าใหสรปวาความแมนย�าระหวางหองปฏบตการ อยในระดบทเปรยบเทยบกนได และไดแสดงคาความแมนย�าทต�ากวาจะเปนจรงได อาท คาเบยงเบนมาตรฐานในวารสารเปนคาลอการทมเปน 0.54, 0.53, 0.53,

2.70 (500) 3.70 (5000) 4.70 (50000) 5.70 (500000) copies/ml copies/ml copies/ml copies/ml

ตารางท 2 เปรยบเทยบคาตวสถตทค�านวณจากขอมลลอการทมโดยตรง กบคาตวสถตทค�านวณจากคาสมบรณ โดย CMV load ของตวอยางอางองเปน copies/ml อยในคาลอการทมและคาสมบรณ แสดงในวงเลบ

1. คาทค�านวณจากลอการทม โดยตรง 1.1 คาเฉลยคณตศาสตร 2.96 (912) 3.81 (6457) 4.77 (58884) 5.66 (457088) 1.2 คาเบยงเบนมาตรฐาน 0.54 (3.5) 0.53 (3.4) 0.53 (3.4) 0.58 (3.8) 1.3 คาสมประสทธความ แปรปรวน (%) 18.40 13.86 11.17 10.20 1.4 คาระดบความเชอมน 0.24 (1.7) 0.22 (1.7) 0.22 (1.7) 0.24 (1.7) รอยละ 95 (+/-)2. คาทค�านวณจากคาสมบรณ หรอใชกฎการบวก หรอ ลบคาลอการทมแลวแปลง กลบเปนคาลอการทม 2.1 คาเฉลยคณตศาสตร 3.33 (2156) 4.21 (16147) 5.14 (138298) 6.15 (1404755) 2.2 คาเบยงเบนมาตรฐาน 3.57 (3680) 4.53 (33800) 5.43 (272000) 6.56 (3660000) 2.3 คาสมประสทธความ แปรปรวน (%) 171 209 196 256 2.4 คาระดบความเชอมน รอยละ 95 (+/-) 3.57 (1610) 4.53 (14100) 5.53 (111000) 6.56 (1602598)



0.58 คดเปน 3.5, 3.4, 3.4, 3.8 copies/ml ตามล�าดบ ซงเปนไปไมได หากขดจ�ากดในการตรวจหาอยท 50 copies/ml

3. คาสถตทใชคาเบยงเบนมาตรฐานในการค�านวณผดพลาดทงหมด เชน คาสมประสทธความแปรปรวน และคาระดบความเชอมนรอยละ 95 ไดคาต�าเกนจะเปนจรงในทางปฏบตได โดยแสดงคาสมประสทธความแปรปรวน เพยง 10-20% สวนคาระดบความเชอมนรอยละ 95 บวกลบเพยง 2 copies/ml ท�าใหผวจยสรปผดวาผลตรวจ ทเปลยนแปลงในระดบ 3-5 เทา มนยส�าคญตอการรกษา

สรปการค�านวณชดขอมลทเปนลอการทมตองท�าตามกฎของลอการทม หากค�านวณโดยเพกเฉยตอกฎท�าแบบ

ตวเลขปกตจะไดผลลพธทางคณตศาสตรทผดพลาด ผลการวเคราะหทางสถตผดพลาด ไดผลสรปทผดพลาด และอาจน�าไปสการใชงานทางคลนกทผดพลาด หากเปนผลงานวจยวทยาศาสตรการแพทย ในบทความทใชเปนกรณศกษา ครงน สรปวาผลตรวจ CMV load ระหวาง 23 หองปฏบตการ มคาไมแตกตางกนหรอ เปรยบเทยบกนไดนน เปน

การสรปทผดพลาดเนองจาก ไดละเลยการใชกฎการค�านวณลอการทม ซงแททจรงแลว ผลตรวจ CMV load ระหวาง 23 หองปฏบตการ มคาแตกตางกนอยางมนยส�าคญทางสถต และผวจยตองคนหาสาเหตของความแตกตางกน กอนทจะเปรยบเทยบคา CMV load ระหวางหองปฏบตการตอไป ผเขยนบทความไดแสดงวธการและขอควรระวงไวในกลมเฟสบก อ เลนนง https://www.facebook.com/groups/labqualitycenter เรอง ค�านวณลอการทม

ระวงพลกลอก ตงแต พ.ศ. 2555 แตไมมประจกษพยานทเปนวารสารตพมพ ขอมลจากวารสารฉบบนจงเปนเพยงตวอยางการค�านวณทละเลยความหมายและกฎของลอการทม

เอกสารอางอง 1. John Napier. [online]. 2014 [cited 2014 Oct 16]: [6 screens]. Available from: URL: http://en.wikipedia.

org/wiki/John_Napier 2. Wolff DJ, Heaney DL, Neuwald PD, Stellrecht KA, Press RD. Multi-site PCR-based CMV viral load

assessment-assays demonstrate linearity and precision, but lack numeric standardization: a report of the association for molecular pathology. J Mol Diagn 2009; 11(2): 87-92.

3. การค�านวณคาลอกการทม. [ออนไลน]. 2558; [สบคน 28 ม.ค. 2558]; [3 หนา]. เขาถงไดจาก: URL: https://www.facebook. com/groups/labqualitycenter




Failure in Calculating The Statistics from Logarithm Values: Case Study

Suthon Vongsheree* Kittipoong Keardrit** Surasak Muenphon* Maliwan Homchan* and Prompussorn Dissara**Bureau of Laboratory Quality Standards, Department of Medical Sciences, Tiwanond Road, Nontaburi 11000. Thailand. **Bureau of the Vector-Borne Diseases, Department of Diseases Control, Tiwanond Road, Nontaburi 11000. Thailand.

ABSTRACT The statistics of an article on multi-center evaluation of the viral loads (Cytomegalo virus, CMV) presented in international journals (J Mol Diagn. Mar 2009; 11 (2): 87-92., were reviewed to check the validity of statistical calculation by using logarithmic rules. There were gross errors in log calculation of the means CMV loads which lead to missed conclusion that CMV loads amongst 23 laboratories were not different from the reference values, statistically. The Standard deviations (SD) was missed calculated from the log values directly, resulting in lower SD, compared to those calculated by using the absolute values. All statistics those using SD were miss-calculated : the pair t-test, 95% confidence intervals, Coefficient of Variance, Correlation Coefficient and affected the conclusions of the author that there was no difference in CMV load determination amongst these 23 laboratories. Hence, the significant CMV load variation amongst 23 laboratories were neglected and the need for reference materials were over-emphasized.

Key words: miss calculation, Logarithmic data, error means and SD

✄

„∫ ¡—§√‡ªìπ ¡“™‘°

«“√ “√°√¡«‘∑¬“»“ µ√å°“√·æ∑¬å

™◊ËÕ.................................................................................................................................................

∑’ËÕ¬Ÿà.............................................................................................................................

Õ“™’æ......................................................................................................................................

‚∑√»—æ∑å..................................................................................

µâÕß°“√√—∫ «“√ “√°√¡«‘∑¬“»“ µ√å°“√·æ∑¬å ‡«≈“ 1 ªï (4 ©∫—∫) ‡ªìπ‡ß‘π 200.- ∫“∑

µ—Èß·µàªï....................................................................................

æ√âÕ¡π’È‰¥â àß ∏π“≥—µ‘ µ—Î«·≈°‡ß‘π‰ª√…≥’¬å

‡ß‘π ¥

—Ëß®à“¬ π“ß “«πÈ”Ωπ πâÕ¬ª√–‡ √‘∞

ÀâÕß ¡ÿ¥°√¡«‘∑¬“»“ µ√å°“√·æ∑¬å

´Õ¬‚√ßæ¬“∫“≈∫”√“»π√“¥Ÿ√ ∂ππµ‘«“ππ∑å

ππ∑∫ÿ√’ 11000 ‚∑√. 0-2589-9850-8 µàÕ 99339

—Ëß®à“¬ ª≥Ω. °√–∑√«ß “∏“√≥ ÿ¢ √À— ‰ª√…≥’¬å 11000

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทย

วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยจดท�าโดยกรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขเพอเผยแพรผลงานวจยและแลกเปลยนความรดานวทยาศาสตรการแพทยทกสาขา

เจาของ กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขทปรกษาดานบรหาร นพ.อภชยมงคล นางจรภรณบณยวงศวโรจน พญ.วารณจนารตน นพ.วนชยสตยาวฒพงศ

ทปรกษาดานวชาการ ภญ.อมราวงศพทธพทกษ พญ.มยรากสมภ ภญ.ดร.จงดวองพนยรตน นางพมพใจนยโกวท ภญ.สภทราอมเอบ ภญ.ดร.สมลปวตรานนท ดร.ปนดดาซลวา

บรรณาธการ สพญ.ดร.เยาวภาพงษสวรรณ

คณะบรรณาธการ ศ.ดร.นพ.สมชยบวรกตต ศ.ดร.นพ.ประเสรฐเออวรากล ศ.ดร.อรษาสตเธยรกล ศ.ดร.พไลพนธพธวฒนะ ดร.อารทตตยพงศ นางสาวจไรโชตธนาทววงศ นายศรศรมโนรถ ดร.อษาวดถาวระ นางกนกพรอธสข นางวชชดาจรยะพนธ นายสธนวงษชร นางสาวมาลนจตตกานตพชย ดร.สวรรณาเธยรองกร นางสรภากรแสงกจพร ดร.วมลเพชรกาญจนาพงศ ดร.ประไพวงศสนคงมน ภญ.ดร.เจรญดปงสทธวงศ ภญ.ดร.วลยลกษณเมธาภทร ดร.อารรตนสงาแสง

เลขานการ นางไพรวรรณบญวงษ

ฝายธรการ นางสาวน�าฝนนอยประเสรฐ นางสาวประสานจลวงษ

ก�าหนดออก ราย3เดอนอตราสมาชก ในประเทศปละ200.-บาท ตางประเทศปละ50.00เหรยญสหรฐอเมรกาส�านกงานวารสาร กรมวทยาศาสตรการแพทย 88/7ซอยตวานนท14ถนนตวานนทนนทบร11000 โทร.0-2951-0000 โทรสาร0-2951-1297พมพท หจก.อรณการพมพ 457/6-7ถนนพระสเมรแขวงบวรนเวศเขตพระนครกรงเทพฯ10200 โทร.0-2282-6033-4

THE BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

The bulletin of the Department of Medical sciences is an official publication of theDepartmentofMedicalSciences,MinistryofPublicHealth.Itisdevotedtothedisseminationofknowledgeconcerningmedicalsciencesandthefacilitationofco-operationamongscientists.

Owner Department of Medical sciences, Ministry of Public Health Administrative Advisor ApichaiMongkol JurepornBoonyawongvirot Varunee Jinaratana Wanchai sattayawuthipong

Technical Advisor Amara Vongbuddhapitak Mayura Kusum Jongdee Wongpinairat Pimjai Naigowit SupatraIm-Erb SumolPavittranon PanaddaSilva Editor Yaowapa Pongsuwanna

Editorial Board SomchaiBovornkitti PrasertAuewarakul OrasaSuthienkul Pilaipanputhavathana Aree Thattiyaphong Jurai Chotichanathawewong SiriSrimanoroth UsavadeeThavara Kanokporn Atisook Wichuda Jariyapan suthon Vongsheree Malinee Chittaganpitch suwanna Tienungoon siripakorn sangkitporn Wimol Petkanchanapong Prapai Wongsinkongman Charoendee Pingsuthiwong Walailuk Matapatara AreeratSa-ngasang

Secretary Paiwan Boonwong

Administration Namfon Noiprasert Prasan Julwong

Subscription Rate The Bulletin of the Department of Medical sciences is published quarterly. Annual subscription rate is ฿ 200.00 for domestic and us.$50.00forallothercountries.

Office Department of Medical sciences 88/7SoiTiwanond14,Tiwanond Rd.,Nonthaburi11000,Thailand.

Tel.0-2951-0000 Fax:0-2951-1297Printed by AroonkarnphimLtd.,Part. 457/6-7PhraSumenRoad,Bangkok10200 Tel.0-2282-6033-4


ว กรมวทย พ 57 (2) เม.ย. - ม.ย. 2558 B

ull Dept M

ed Sci 57 (2

) April - June 2015

ว กรมวิทย พ 57 (2) เม.ย. - มิ.ย....

Documents