1

A N A N éés S anyagcsere szabs S anyagcsere szabáályozlyozáása, sa,

öösszefsszefüüggggéései a C anyagcsersei a C anyagcseréévelvel

A regulA reguláácicióóval kapcsolatos dival kapcsolatos diáák (a tk (a tööbbi a mbbi a műűkkööddéés isms isméétltléése):se):Nitrát asszimiláció: 10-16, 19-31NIF: 33, 36-40, 42Szulfát asszimiláció: 43-47C, N, S asszimiláció összefüggései: 48-51

2

A nA nöövvéények Nnyek N--forrforráásaisai

pKa – 9,3lúgos talaj

Savas talaj

>1-5 mM

20-200 µM

1-100 µM

N – 5-10%-a,10% N2O

NN--feleslegfelesleg

NN--hihiáányny

FlFlóóravravááltozltozáássAcacia – D-Afrika

A szervetlen tápelemek közül a N limitálja leggyakrabban a növény növekedését. A légköri nitrogén, mint N-forrás felhasználására csak a nitrogén fixáló baktériumokkal szimbiózisban élő növények képesek. Aerob talajokban a legfontosabb N-forrás a nitrát, bár az ammónium iont - fajtól függően különböző mértékben – is képesek hasznosítani. A nitrát nem kötődik a talajszemcsékhez, gyorsan diffundál, könnyen kimosódva a talajvizeket szennyezi. Koncentrációja a talajban nagyságrendileg különbözhet mind szezonálisan, mind helyről-helyre még kis távolságokban is. Az ammónium ion kötődik a negatívan töltött talajszemcséken, tehát viszonylag lassú a diffúziója. Ha a gyökerek közelébe kerül, akkor azonban könnyebben veszik fel, mint a nitrátot. A talajban lévő aminosavakat is fel tudják venni a növények, de a lassú diffúzió alatt a talajban lévő mikroorganizmusok a nagy részét felhasználják. Jelentősége a magasabban fekvő, hideg helyeken lehet, ahol a szerves anyag mineralizációja lassú. A N-túltáplálás a volatilizációt és denitrifikációt növeli. Ez magas hőmérsékleten, anaerob körülmények közt kerül előtérbe (talajműveléstől is függ). Ezek a N-gázok környezetszennyezők. A túl sok N-nel történő műtrágyázás tehát plusz költség és környezetszennyező is. A N-hiány viszont erősen csökkenti a produkciót, és új fajok invázióját eredményezi (pl. N-fixáló ausztrál Acacia spp. elterjedése Dél-Afrikában, vagy az USA-ban, Angliában kimutatott flóraváltozások). Nagyon fontos tehát megérteni a szabályozó folyamatokat.

3

A nitrA nitráát asszimilt asszimiláácicióó folyamatafolyamata

reduktreduktáánsns,,energiaenergia

ééssszszéénvnvááz z igigéényny

Lágyszárúak: levél (NADH-NR)Fásszárúak:

gyökér(csúcs)(NADPH/NADH-NR)

NRT

CNT

Általában a legtöbb lágyszárú növény a hajtásban építi be a nitrátot, míg a fás növényekben a gyökerekben mutatható ki a legnagyobb aktivitás. A gyökér hossztengelye mentén a NR aktivitás fejlődési állapottól függő gradienst mutat, a legnagyobb aktivitás közvetlenül a gyökércsúcs közelében található.

A növényekben három fő NR izoforma mutatható ki: NADH, NADPH, vagy NADH/NADPH függő NR. A gyökerek a NADH-val és a NADPH-val (kb. 20%-ban) működő izoformát is tartalmazzák.

4

ReduktReduktáánsbiztosnsbiztosííttááss a leva levéélbenlben

A levélsejtbe a nitrát transzporteren (NT) bejutó nitrát redukciójához, bár a nitrát reduktáz(NR) a citoplazmában működik, a reduktáns fotoszintetikus eredetű és a plasztiszbanképződik. A NADPH malát formájában (amelyet a NADPH-malát dehidrogenáz (NMDH) hoz létre a kloroplasztiszban) a dikarboxilát transzportereken keresztül jut ki a citoplazmába (oxálacetát-malát csere). A citoplazmában a NADH-függő malát dehidrogenáz (MDH) termeli a NADH-t a nitrát redukcióhoz. A nitrit, ami a kloroplasztisz nitrit transzporteren(CNT) jut be a plasztiszba és a nitrit reduktáz (NiR) katalizálja, redukciójához az elektronok a Fd közvetítésével közvetlenül a fotoszintetikus elektrontranszportláncbólszármaznak.

5

SzSzéénvnvááz biztosz biztosííttáása a levsa a levéélbenlben

Az ammónia beépüléséhez szükséges szénváz is végső soron a fotoszintetikusan fixált CO2-ból származik. A trióz-P-transzporteren már redukált szénvegyület, DHAP (GA3P) jut ki a citoplazmába, ami a glikolízis reakciói során foszfoenol piruváttá (PEP) alakul. A növényekben általánosan (nemcsak a C4-esekben) jelenlévő PEP-karboxiláz oxálacetáttá(OAA) alakítja, ami karboxilát transzporteren keresztül bejut a mitokondriumba. A Krebs(trikarbonsav) ciklusban keletkező citrát egy része az OAA-tal cserélődve kijut a citoplazmába, ahol citoplazmatikus akonitáz és NADP-izocitrát dehidrogenáz izoenzimek-ketoglutaráttá alakítják. Az így képződő -ketoglutarát karboxilát transzporterközvetítésével (malát/ketoglutarát csere) jut be a kloroplasztiszba (ld. köv. dia).

6

AmmAmmóónia (re)asszimilnia (re)asszimiláácicióó

55--10x10x

CNT

A NR során képződő, ill. a fotorespirációkor felszabaduló ammónia a glutamin szintetáz-glutamát szintáz (GS-GOGAT) renszer segítségével, a kloroplasztiszban történőbeépüléséhez szükséges energia és reduktáns szintén fotoszintetikus eredetű.

7

SzSzéénvnvááz biztosz biztosííttáása a gysa a gyöökkéérbenrben

A gyökéren keresztül felvett nitrát egy része/a talajból felvett ill. a nitrát redukciójakor képződő ammónium ionok a gyökérsejtek plasztiszaiban redukálódnak/épülnek be. A szénváz (2-oxoglutarát(2OG)=-ketoglutarát) a mitokondriális pool-ból származhat, ill. hasonlóképpen, mint a levélben a citoplazmában citrátból szintetizálódhat. A glikolízisbenfelhasználódó szénvegyületek azonban, a levéltől eltérően, a floémben odaszállított szénhidrátok lebontásából származnak.

8

ReduktReduktáánsbiztosnsbiztosííttááss a gya gyöökkéérbenrben

NADPHNADPH--NR (NR (~~ 20%)20%)

(oxidatív foszforiláció)

A gyökérben a reduktánsokat is az odaszállított cukrok lebontása biztosítja. A nitrát redukcióhoz szükséges reduktánsok a citoplazmában a glikolízis/oxidatív pentóz-P ciklus (OPP) során képződnek (NADH- és NADPH- specifikus NR-ok). A nitritredukcióhoz/ammónia beépüléshez (GOGAT) szükséges redukált Fd a plasztiszban is folyóOPP során képződő NADPH felhasználásával a NADPH/Fd oxidoreduktáz segítségével képződik. A GS működéséhez szükséges ATP az oxidatív foszforiláció során képződik, és adenilát transzporterek közvetítésével jut ki a mitokondriumból és jut be a plasztiszba.

9

A nitrA nitráát redukcit redukcióó öösszefoglalsszefoglaláásasa

GyGyöökkéérr LevLevééll

NitrNitráát redukcit redukcióó fásszárúak lágyszárúak

NitrNitráát felvt felvéételtelenergiaforrás (ATP) glukóz-6P(légzés) DHAP ((fotosz.)

NitrNitráát redukcit redukcióóhelye citoplazma citoplazmareduktáns (NADH/NADPH) glikolízis/OPP NMDH/MDH

Nitriti redukciNitriti redukcióóhelye plasztisz plasztiszreduktáns Fd (NADPH - OPP) Fd (fotosz e-tr)

NHNH44++ asszimilasszimiláácicióó

helye plasztisz plasztiszATP (GSGS) mito e-tr fotosz. e-trreduktáns (GOGATGOGAT) Fd (NADPH - OPP) Fd (fotosz. e-tr)szénváz (PEPC, PEPC, iCDHiCDH) -ketoglutarát -ketoglutarát

10

A nitrA nitráát asszimilt asszimiláácicióó öösszefsszefüüggggéései a sei a metabolikus metabolikus éés fejls fejlőőddéési folyamatokkalsi folyamatokkal

gygyöökkéérr-- levlevééll-- virágzás szeneszcenciafejlfejlőőddééss fejlfejlőőddééss

NitrNitráát asszimilt asszimiláácicióó

NN--metabolizmusmetabolizmus CC--metabolizmusmetabolizmus

energiatermenergiaterm.. primerprimer malmaláátt C-prekurzorfolyamatokfolyamatok akceptorakceptor (pH (pH regulregul.).)

felvfelvéételtel de de novonovo fotorespfotoresp.. asavasavNHNH44 asszimasszim. . NHNH44 asszimasszim.. szintszintééziszis

vakuolum protein speciálisttáárolroláás s ééss szintézis anyagokremobilizremobilizáácicióó (tetrapirrol)

Sejt Sejt éés egs egéész nsz nöövvéény szintenny szinten

-- SzabSzabáályozott metabolikus folyamatoklyozott metabolikus folyamatok

-- nitrognitrogéén metabolizmusn metabolizmus (nitrát felvétel és efflux; tárolás/remobilizáció; nitrát redukció;

ammónia asszimiláció: de novo és fotorespiráció során képződött; aminosav

szintézis)

- szszéén anyagcseren anyagcsere

-- Energia és reduktánsok (cukorszármazékok, malát)

- pH regulpH reguláácicióó (malát szintézis)

- szénváz (oxoglutarát, asav prekurzorok)

- SzabSzabáályozott nlyozott nöövekedvekedéési si éés fejls fejlőőddéési folyamatoksi folyamatok

-- gygyöökkéér, levr, levéél morfoll morfolóógia, hajtgia, hajtáás gys gyöökkéér arr aráány csny csöökkenkkenéés (Ns (N--hihiáány)ny)

-- korai virkorai viráágzgzáás indukcis indukcióója ja éés s szeneszcenciaszeneszcencia (N(N--hihiáány)ny)

11

A nitrA nitráát asszimilt asszimiláácicióó szabszabáályozlyozáásasa

- Nitrát asszimiláció változása- nitrát reduktáz aktivitás változása- aminosav szintézis változásai

- C metabolizmus átprogramozása- reduktáns-biztosítás (malát, Fd),- C-váz biztosítása (oxoglutarát)- pH reguláció (malát)

TranszkripciTranszkripcióós s éés poszts poszt--transzkripcitranszkripcióós szints szintűűszabszabáályozlyozááss

A NO3- indukálja mind a nitrát asszimilációt, mind a C metabolizmus reprogramozását, ami

reduktánsokat és C vázat biztosít a nitrát asszimilációhoz.

12

A nitrA nitráát t reduktreduktáázzaktivitaktivitáás s

szabszabáályozlyozáásasa

InaktInaktíívvNRNR

A NR aktivitA NR aktivitááss-- transzkripcitranszkripcióós, s, -- transzltranszláácicióós s ééss-- poszttranszlposzttranszláácicióóss

szinten is szinten is regulregulááltlt

Inaktiváció5-20 min

A nitrát megoszlik a vakuoláris és az aktív citoplazmatikus poolközt. Mivel a vakuoláris pool csak remobilizáció után áll rendelkezésre, a nitrát fluxus (a citoplazmatikus nitrát cc. változása) a legfontosabb transzkripciós szintűszabályozó tényező. A NR fél-életideje csak néhány óra. A NiR a NR-zal együtt transzlációs szinten is regulált. A NR fény hiányában foszforilációval és a dimer 14-3-3 protein kötésével, amihez Mg is szükséges, inaktiválódik. A szignál transzdukciós út nem ismert, de a kináz aktiválásában Ca-függő protein kinázok(CDPK) is részt vesznek. A protein degradációja nem függ a NR ilyen inaktiválásától, fényen és sötétben is hasonló sebességgel megy. Tehát a NR aktivitás nemcsak a NR aktiváltsága miatt magas fényen, hanem mert a fény serkenti a nitrát felvételt, transzlokációt és a NR transzkripcióját és transzlációját is.

A 14-3-3 proteinek (30 kDa) egy homológ protein családot alkotnak, amelyek minden eukarióta sejtben megtalálhatók a citoplazmában, a kloroplasztiszban és a sejtmagban is. Legjellegzetesebb tulajdonságuk más proteinekkel való kapcsolódási képességük, ami ezen proteinek aktivációjával vagy inaktivációjával jár.

13

MiMiéért fontos a NR rt fontos a NR aktivitaktivitáás gyors s gyors

poszttranszlposzttranszláácicióóssszabszabáályozlyozáása?sa?

Normál körülmények közt (magas nitrát, alacsony nitrit cc) nitrát redukció.NiR gátlódásakor NO képződés (NR NiR aktivitás – RuBisCO!).

-- Nitrit felhalmozNitrit felhalmozóóddáássmutagmutagéén, karcinogn, karcinogéénn

-- Szuperoxid kSzuperoxid kéépzpzéés (NADHs (NADHOO22))

-- NO felhalmozNO felhalmozóóddáás (NR s (NR NiRNiR--kkééntnt is is mműűkköödhet) dhet) peroxinitrilperoxinitril gygyöökk

O2•-

ONOO-

Tyr

peroxinitril

A nitrit mutagén és karcinogén: nukleotidbázisok amino csoportjával diazo-vegyület mutáció (citozin uracil). Sav formájában szabadon diffundál a membránon keresztül, és nagyon toxikus a fotoszintetikus apparátusra.

A RuBisCO oxigenáz aktivitásához hasonlóan a NR NiR aktivitása (NO képződéshez vezet) is elkerülhetetlen.

A NR képes a NADH-ról az oxigénre is elektront transzportálni szuperoxid képződése mellett. Ez viszont a NO-dal reagálva erősen toxikus peroxinitril gyökök (ONOO-) képződéséhez vezet. Ezek képesek a Tyr oldalláncok nitrálására, ami megváltoztatja az aktivitást.

A NO jelmolekula is, amiről kimutatták, hogy elősegíti a sztómazáródást, befolyásolja a növekedést és fejlődési folyamatokat.

14

A A ggéénexpresszinexpresszióó szabszabáályozlyozáásasa

A nitrát a NR és a NiR expresszióját is indukálja, míg a redukált N represszálja. A fény (fitokróm) és cukor indukció fajtól függően változó.

15

A A ggéénexpresszinexpresszióó szabszabáályozlyozáása: nitrsa: nitráát I.t I.

> 1000 gén regulált. Nitrát

EgyEgyééb enzimek:b enzimek:

NiRNiRáázzNRT, CNTNRT, CNT

(GS), GOGAT(GS), GOGATNMDH, PEPCNMDH, PEPCPK, CS, PK, CS, iCDHiCDH,,

NRT – nitrát transzporter, CNT – kloroplasztisz nitrit transzporter, NMDH – NADP-almasav dehidrogenáz (kloropl.), PEPC – PEP karboxiláz, PK – piruvát kináz, CS – citrátszintáz, iCDH – izocitrát-dehidrogenáz

16

A A ggéénexpresszinexpresszióó szabszabáályozlyozáása: nitrsa: nitráát II.t II.

R-NI – plazmamembránhoz kötött receptor NRnitrát box – promoter szekvencia a nitráttal indukálható génekben

- konstitutíve expresszálódó, a promoterhez kötődő protein faktor

<10 μM

A NR (és más nitráttal indukálható gének) indukciója nem igényel protein szintézist. A DNS-hez kötődő protein faktorok konstitutíve expresszálódnak. Feltételezik, hogy a nitrát szignál nem a faktor kötődését idézi elő, hanem megváltoztatja a transzkripciót aktiváló képességét.

A metabolit repressziót a gombákban (és lehetséges, hogy a növényekben is) Zn-finger DNS-hez kötődő proteinek közvetítik, amelyek GATA DNS motívumokhoz kötődnek.

1717

FFéényreceptoroknyreceptorok: : FitokrFitokróómm

DimerDimer proteinproteinKovalensen kKovalensen kööttöött 1 bilin/proteintt 1 bilin/protein

660 nm660 nm

PrPr PfrPfr730 nm730 nm

(Asp)

(Ca2+/CAM, G-protein)

Fitokromobilin

Bae et al. (08) ARPB – Fényreceptorokat ld. mld. méég Erdei Lg Erdei Láászlszlóó: N: Nöövekedvekedééss-- éés s fejlfejlőőddéésséélettanlettan.

A fitokrómok (PHY) dimer proteinek, két azonos apoproteint tartalmaznak, melyek kovalensen kötik a kromofort, a fitokromobilint, ami lineáris tetrapirrol. Minden növényi PHY tartalmaz egy N terminális fotoszenzor domént, és egy C terminális dimerizációs és kináz domént.

A PHY-k sötétben, fiziológiásan inaktív (Pr) formában szintetizálódnak. Vörös fényt (660 nm) abszorbeálva a Pr aktív Pfr formává izomerizálódik; ez a folyamat reverzibilis, a távoli vörös fény visszafordítja (730 nm). A Pfr forma a citoszolban vagy a sejtmagban (miután a sejtmagba transzlokálódott) kölcsönhat egyéb proteinekkel, amelyek szerepet játszanak a fényválasz kiváltásában. A jelátvitelben Ca-kalmodulin (pl. a sejtfal megnyúlás csökkentése), ill. G-protein függő szignál transzdukciós utak (pl. antocianinszintézis) jelenlétét mutatták ki.

1818

A A fitokrfitokróómm fféényinduknyindukáált vlt vááltozltozáásaisai

DomDomééneknek

Szenzor

DimerizációsSmag szignalizáció

Kinase

FitokromobilinFitokromobilin

Möglich et al. (10) ARPB, Bae et al. (08) ARPB

A fitokromobilin C15-C16 kettős kötésének reverzibilis fotoizomerizációja a komplex strukturális változását okozza (az N- and C-terminális domének kölcsönhatása megszűnik). Ez szabaddá teszi azokat a doméneket, amelyek más proteinekkel valókölcsönhatásokban vesznek részt.

19

A A ggéénexpresszinexpresszióó szabszabáályozlyozáása: sa: fitokrfitokróómm

HH++TF (bZIP)

A fitokróm fény hatására aktív Pfr formává alakul, ami foszforilálódhat, de a nem foszforilált forma aktívabb. A szignál transzdukció komponensei közt legáltalánosabbak a HY5/HYH (bázikus leucin cipper transzkripciós faktorok bZIP). Ezek foszfoproteinek, de erősebben kötődnek a promoter régiókhoz, ha defoszforilálódnak. A defoszforilációs reakciókat protein foszfatázok (PP) katalizálják. A NR és sok fotoszintézisben szerepet játszó komponens génjei ezen az úton aktiválódnak. A NIR, a GS és a GOGAT szintén indukálódnak fény hatására fitokróm közreműködésével, de egyéb szignál transzdukciós úton. A fény fotoszintézis útján is stimulálja a génexpressziót (nitrát felvétel, transzlokáció és asszimiláció génjei). A szignál nem ismert, elképzelhető, hogy proton fluxus vagy valamilyen cukor (triózP). Aktív fotoszintézis esetén a sztrómalúgosodik, protonkiválasztás történik a citoplazmába, az acidifikáció pedig aktiválja a NR-t. A gyökérbe irányuló cukortranszport aktiválja a transzportereket (NITR, nitrit transzporter;NRT, nitrát transzporter), emiatt a gyökérbeli nitrát felvétel is fényfüggő.

20

A NR posztA NR poszt--transzkripcitranszkripcióós szabs szabáályozlyozáásasa

in vitro

proteinfoszfatáz

proteinkinázok

A fotoszintA fotoszintééziszis-- stimulstimuláálja a protein lja a protein

foszfatfoszfatáázokatzokat-- ggáátolja a protein tolja a protein kinkináázz

aktivaktiváállóóddáást/aktivitst/aktivitáástst

A gének transzkriptum szintjei gyakran napi ciklust mutatnak, de a megfelelő protein szintek mérsékelten változnak, amit leginkább a protein stabilitása szab meg. A hosszú sötét periódus alacsony transzkript szintje azonban általában csökkent protein szinttel jár együtt.

Mind a NR és NIR transzkriptumok napi ritmust mutatnak, de csak a NR protein szintje mutat jelentős napi változást. A NR aktivációja protein foszfatázzal történődefoszforilációnak köszönhető, amelyet a fotoszintézis aktivál, de a kloroplasztiszból a citoplazmába történő jeltovábbítás útja nem ismert. Sötétben a NR-t az SNRK1 kináz (invitro Ca-dependens kináz is) foszforilálja. Ez sötétben szintetizálódik és foszforiláltformában aktív, fény hatására defoszforilálódik (inaktiválódik). A foszforilált NR (NR-P) 14-3-3 proteint köt, és így inaktiválódik.

21

SzabSzabáályozlyozáás protein s protein foszforilfoszforiláácicióóvalval

SzaharSzaharóózz szintszintéézis zis helyetthelyett

szerves sav szintszerves sav szintééziszis

SzabSzabáályozlyozáás az s az enzim enzim

foszforilfoszforiláácicióójjáávalval

1414--33--3 proteinek!3 proteinek!

*

GluGlu –– allosztalloszt. . regulregul..

SPS – szaharózP-szintetáz

Az egyéb citoplazmában működő enzimek esetében is alapvetően a protein foszforiláció/defoszforiláció a poszt-transzlációs protein módosítás mechanizmusa.

A 14-3-3 proteinek a szénhidrát metabolizmus enzimeinek (szaharóz-P szintáz és keményítő szintáz) aktivitását is befolyásolják.

A Glu a PEPCáz allosztérikus regulátora.

22

SzabSzabáályozlyozáás TR/s TR/TrxTrx rendszerrelrendszerrel

SzabSzabáályozlyozáás az s az enzim enzim

redukciredukcióójjáávalval(FTR/(FTR/TdTd))

NMDH, DCT, NMDH, DCT, NiRNiR, GS, GOGAT, GS, GOGAT

A kloroplasztiszban viszont a redox reguláció (Fd/tioredoxin reduktáz: FTR, tioredoxin: Td rendszer) szabályoz számos folyamatot. A Td-ok kis proteinek (kb. 12 kDa) amelyek a prokariótákban és az eukariótákban (különböző kompartmentekben különbözők) is előfordulnak. Erősen konzervatív aktív helyük, WC(G/P)PC, diS csoportot tartalmaz, amely reverzibilis redox átalakulásra képes a diS és ditiol állapotok közt.

Hasonlóan a Calvin ciklus egyes enzimeihez (GA3PDH, Fr1,6BPáz, Se1,7BPáz, PRkináz), néhány enzimet, amely a redukált cukrok és dikarboxilátoklétrehozásában (NMDH – NADP-malát dehidrogenáz) és a citoplazmába valótranszportjában (DCT 1 – dikarboxilát transzporter) játszanak szerepet, az FTR/Td rendszer aktivál. A MNDH tehát nemcsak szubsztrát (NADPH) tekintetében függ a fotoszintézistől, hanem az enzim aktivációja is fotoszintézisfüggő. A nitrát asszimiláció kloroplasztiszbanlokalizált enzimei (NiR, GS, GOGAT) is kötnek Td-okat (tehát a redox reguláció ezek aktivitását is befolyásolja).

23

FFéény ny éés ss sööttéét szabt szabáályozlyozááss

Fotoszintézis, fotorespirációMalát söntNitrát transzport (sejt, vakuolum)Nitrát redukció és asszimiláció

OPPNitrit redukcióAmmónia asszimiláció

PII (N/C metabolizmus szenzor és transzkripciós faktor prokariótáknál), a nitrittranszportot befolyásolja, de nem sokat tudunk a funkciójáról a magasabbrendűnövényekben.

24

A nitrA nitráát asszimilt asszimiláácicióó napi vnapi vááltozltozáásaisai

A nitrát asszimiláció napi periodicitást mutat, ami

ggéénexpresszinexpresszióóss éés s poszttranszlposzttranszláácicióóss vvááltozltozáások ksok köövetkezmvetkezméényenye

OptimOptimáális klis köörrüülmlméényeknyekmagas nitrát cckedvező fényviszonyok

Reggelre:Reggelre:NO3

- red N NRMegvilMegviláággííttáás elejs elejéén:n:

NR – éles maximum (fitokrómhatás)

A nitrát asszimiláció és az egyéb metabolikus folyamatok kölcsönhatásai és kölcsönös regulációja a nitrát asszimiláció diurnális ritmusában nyilvánul meg. A magasabbrendű növényekben a gének 10-30%-ának, köztük számos nitrát asszimilációval összefüggő komponens génexpressziója, napi ritmust mutat. A NR és a NIR transzkriptumok szintje kora reggel maximális. Ez összefügg a a nitrát szignál magas és a produktum represszió alacsony szintjével. A megvilágítás első órájában megfigyelt éles maximum azonban direkt (fitokrómindukált) fényregulációra is utal.

25

TranszkriptumTranszkriptum, enzimaktivit, enzimaktivitáás, s, metabolitmetabolit szintekszintekreggelreggel dede dudu ééjjeljjel

TranszkriptumTranszkriptum- nitrát redukció NIA,NII NIA NIA NIA- NH4

+ asszim. GLN2 ()- C-metabolizmus PPC GLU,cPK,mCS ()

ICDH,AGPS

EnzimaktivitEnzimaktivitááss- nitrát felvétel (NRT) 0.75 → (30%)- nitrát redukció (NR, NiR) 1.50 (0.75) *- NH4

+ asszim. 1.00 GS,GOGAT - PEPC - cPK, mCS, cICDH (ADPG-PPáz) ()

MetabolitMetabolit(NH4

+),Gln NH4+,Gln

Gly, Ser citrátmalát malát

CS – citrát szintáz, ICDH – izocitrát-dehidrogenáz, PK – piruvát kináz, NIA - (NR), NII - (NiR), PEPC – PEP-karboxiláz; GLN – GS, GLU – GOGAT, AGPS – ADPG-PP-áz regulátor su transzkriptum.

A nitrát redukció folyamatához szorosan kapcsolódik a nitrát felvétel, a pH reguláció, a szénhidrát ellátás, az ammónium asszimiláció és az aminosav szintézis. Reggelre az éjszaka is folyó nitrát transzport következtében megnő a citoplazmatikus nitrát pool és ennek következtében a NIA (NR) transzkriptum szintje. A NR protein szinten is mutatja a napi változásokat, a fotoperiodus első részében (de) mutatva maximumot. A megvilágítás uis stimulálja a transzlációt és gyors poszt-transzlációs aktivációt okoz. A fényperiódus elsőrészében a nitrát redukció (ammónium, Gln képződés) 2x gyorsabb, mint a nitrát felvétel, ami citoplazmatikus nitrát pool gyors csökkenését váltja ki. A NIAtranszkriptum (NR) szint, ami a citoplazmatikus nitrát cc-tól, azaz a nitrát felvétel és redukció egyensúly-eltolódásától függ, tehát már a de folyamán lecsökken. (Valószínűleg a citoplazmatikus nitrát cc-tól függ a vakuolumba történő transzport is.) A GS (transzkriptum: GLN2) működés fontos már a kezdeti szakaszban, mert különben NH4

+ halmozódna fel (ami a fotoszintetikus e-tr szétkapcsolója), ill. NH3

formájában elveszhetne a fixált nitrogén a sztómákon keresztül. A Gln nem represszálja a nitrát redukciót. Valószínűleg nem jó szabályozó szignál, mert a C3-as növényekben a Gln szintje nem elsősorban a növény nitrogénellátottságától, hanem a fotorespiráció mértékének változásától függ. A nagymértékű nitrát redukció lúgosítja a citoplazmát, a citoplazma pufferkapacitása kicsi, a pufferolásmalát felhalmozással történik. A levélben nappal felhalmozódó malát csökkenti a NR aktivitást, ami a NIA transzkriptum szint erős csökkenésével kapcsolt. A malátéjjel a gyökérbe szállítódik, ahol dekarboxilálódik, a HCO3

--ot a gyökér leadja.

26

A du-i időszakban a nitrát redukció kb. a felére csökken, ill. éjszaka elhanyagolható. Ezek a változások a NIA transzkriptum szint, a NR protein (degragáció, ami fényen és sötétben is egyaránt folyik, előtérbe kerül) és aktivitás (termék gátlás), valamint a citoplazmatikus NADH csökkenésével, ill. a sötétedés után a NR poszt-transzlációs inaktivációjával függenek össze. Ezeket a megfigyeléseket alátámasztja, hogy a NR mutánsokban – gyengébb NR aktivitás – a nitrát redukció később inaktiválódik, NH4

+-tápláláskor a GS aktivitás éjjel is megmarad. A NR-éhoz hasonló poszt-transzlációs inaktiváció (P, 14-3-3-protein) a N és C metabolizmus számos enzimére jellemző (a NiRazonban nem inaktiválódik, csak degradálódik). A nap második felében a nitrát asszimilációés asav szintézis kerül előtérbe. Ez a C metabolizmus enzimei (cPK, mCS, NADP-ICDH) (NR mutánsokkal, amelyek nitrátot halmoznak fel, kimutatható, hogy ezen enzimek transzkripcióját is a nitrát indukálja, ugyanakkor az AGPS transzkriptumot, ami az ADPG-PP-áz – keményítő szintézis – regulátor alegysége, gátolja), valamint a GOGAT gén (GLU) génexpressziós (Gln) és metabolikus (2OG) aktivációjának következménye. A metabolitokközül a nitrát redukció szabályozásában a Glu, az Asn és a Cys szerepét mutatták ki (különböző asavkeverékeket és asavakat szívattak fel a levágott levéllel). A Glu szintje diurnálisan kevéssé változik a levélben, tehát a nitrogénellátottság érzékelése szempontjából jó szignál. A Glu feedback regulálja a nitrát asszimilációt (NR transzkripcióját represszálja, a GOGAT aktivitás feedback inhibitora, PEPC és cPK allosztérikusgátlója). A cukrok optimális körülmények közt nem befolyásolják a transzkripciót, de az alacsony cukorszint csökkenti a NIA transzkriptum szintet és a NR mennyiségét, csökken az asav, protein, Chl és másodlagos anyagok szintézise is. Ilyenkor a NR poszt-transzkripciós szabályozásában fontos szerepe van az Asn-nak, mert bár az asav szintézis csökken, de Asnnő és feedback gátolja a NR-t. Az alacsony cukorszint akkor is gátolja a nitrát redukciót, ha a nitrát szint magas (a növény ilyenkor C és N limitált lesz). A NR-t a Cysis gátolja, valószínűleg N-anyagcserét és a kénanyagcserét összehangoló szignál.

27

Az aktivitAz aktivitáás fs fáázisaizisai

1. nitr1. nitráát redukcit redukcióó éés pH reguls pH reguláácicióó

NR (NR (NIANIA, , NIANIA), ), NiRNiR ((NIINII, , NIINII), PEPC aktivit), PEPC aktivitááss (NO(NO33--))

NHNH44++, , GlnGln, , malmaláátt mennyismennyiséégege

2. amm2. ammóónia asszimilnia asszimiláácicióó éés s asavasav szintszintééziszis

PK, CS, PK, CS, iCDHiCDH, GOGAT, GOGAT ((NONO33--, , GlnGln/2OG/2OG))

citrcitráátt,, 22--oxoglutaroxoglutaráátt,, GluGlu, AA, AA

3. cs3. csöökkenkkenőő aktivitaktivitááss (represszi(represszióó, , inaktivinaktiváácicióó, degrad, degradáácicióó))

nitrnitráát asszimilt asszimiláácicióó termterméékei:kei: GluGlu (NR, GOGAT, PEPC)(NR, GOGAT, PEPC),, CysCys

CC--anyagcsereanyagcsere: : szszéénhidrnhidráátoktok ((AsnAsn))

CS – citrát szintáz, iCDH – izocitrát-dehidrogenáz, PK – piruvát kináz, NIA - (NR), NII - (NiR), PEPC – PEP-karboxiláz,

A fényperiódus első részében a nitrát redukció (ammónia, Gln) 2x gyorsabb, mint a nitrát felvétel és kb. 50%-kal haladja meg az ammónia asszimiláció sebességét. Ez a nitrát cc. gyors csökkenéséhez és ammónium,glutamin, glycin és szerin felhalmozódáshoz vezet. Hasonló maximumot mutat a NiRáz és a PEPCáz génexpressziója, ez utóbbi a pH regulációhoz szükséges (nitrát redukció lúgosít) malát szintézissel függ össze. Később megfigyelhető a PK, CS, és ICDH-1 génexpressziók emelkedése, ami helyreállítja a nitrát redukció és ammónium metabolizmus egyensúlyát. Az ammónium szétkapcsoló (tilakoidok) és az ammónia a sztómákon keresztül kijuthat, ezért hatékonyabb Gln-t felhalmozni és az ammónium asszimilációt a GOGAT reakció szintjén regulálni. A Glu az ammónium asszimiláció első olyan produktuma, amely nem változik nagyon a napi ciklus során, és ami a legtöbb aminosav és a N-tartalmú speciális anyagcseretermék direkt vagy indirekt kiindulási anyaga, a PEPCáz és a PK fontos allosztérikusregulátora. További regulátorok a N anyagcsere metabolitjai, pl a cisztein, az aszparagin, valamint a malát. Az alacsony szénhidráttartalom teljesen gátolja a nitrát asszimilációt, tekintet nélkül a nitrogén metabolizmus szignáljaira. A nitrát felvétel éjjel is folytatódik, feltöltve a levél nitrát készletet.

A nitrát asszimiláció növényfajtól, fejlődési állapottól és a környezeti hatásoktól függően különböző mértékben történik a levélben és a gyökérben. Függ a transpiráció sebességétől (nitrát gyorsan a xilémbe kerül) és a gyökér szénhidrát ellátottságától. Gyökérben kissé más periodicitás: nappal citoplazmatikus NR, éjjel plazmamembrán-kötött NR indukálódik.

28

A nitrA nitráát metabolizmus szabt metabolizmus szabáályozlyozáása: sa: ÖÖsszefoglalsszefoglaláássA szabA szabáályozlyozáás cs céélpontjailpontjai

-- transzporterektranszporterek: NRT, CNT: NRT, CNT-- NR aktivitNR aktivitáás s <<<<NiRNiR aktivitaktivitááss-- ammammóónia asszimilnia asszimiláácicióó enzimei: GS, GOGATenzimei: GS, GOGAT-- szszéénasszimilnasszimiláácicióó enzimei:enzimei:

((szaharszaharóózz--PP--szintszintáázz), ), ADPGADPG--pirofoszforilpirofoszforiláázz,,PEPC, PEPC, cPKcPK, , mCSmCS, NADP, NADP--ICDHICDH

-- reduktreduktáánsknskéépzpzééss enzimeienzimei (NMDH(NMDH))A szabA szabáályozlyozáás szintjeis szintjei

-- transzkripcitranszkripcióós szints szintűű ((óóra, nap) (ra, nap) (nitrnitráát, t, fitokrfitokróómm, , GluGlu))-- poszttranszlposzttranszláácicióóss (min, (min, óóra) (ra) (P, 14P, 14--33--3, 3, redoxredox, , GluGlu))

SzabSzabáályozlyozóó faktorokfaktorok-- nitrnitráát, t, malmaláátt-- fféény: ny: fitokrfitokróómm, energia, , energia, CC--vegyvegyüületekletek-- metabolitokmetabolitok: : GluGlu (N(N--anyagcsere), anyagcsere), CysCys (S(S--anyagcsere)anyagcsere)

AsnAsn ((CC--anyagcsereanyagcsere)!)!

29

NNöövekedvekedéési/fejlsi/fejlőőddéési folyamatok regulsi folyamatok reguláácicióójaja

- BefolyBefolyáásolt folyamatoksolt folyamatok- gyökérelágazás- levél expanzió

- VVáálaszreakcilaszreakcióókk- integrált (hajtásgyökér szignalizáció)- lokális (függ az integráló szignáltól is!)

- gyors (nitrát transzport)- lassú (oldalgyökér növekedés, levélfejlődés)

A NO3- nemcsak a metabolikus folyamatok fontos regulátora, hanem

növekedési/fejlődési folyamatokat is befolyásol, mint pl. a gyökérelágazás és a levélexpanzió. Magasabbrendű növényekben a NO3

- szignalizáció fontos aspektusa, hogy mind lokális, mind integrált szignál transzdukciós utak léteznek, sőt az integrált válaszreakciók befolyásolják a lokális válaszreakciót, a kétféle válasz is integrálódik.

30

Gyors Gyors vváálaszlasz--

reakcireakcióók: k: transzportranszpor--

terekterek

C C éés N anyagcsere s N anyagcsere koordinkoordináácicióójaja

NN--ellelláátottstottsáágtgtóól l ffüüggggőő szabszabáályozlyozááss

Plazmamembrán NR?

LokLokáális szignlis szignáál l transzdukcitranszdukcióó

NONO33-- szenzorszenzor

Amikor a növények NO3--ban gazdag talajrészhez érnek, egy gyors (min

nagyságrendű) fiziológiai válasz figyelhető meg: egy gyors és átmeneti növekedés a NO3-

felvételben, ami a NRT gének megnövekedett expressziójának köszönhető. A válasz szenzora lehet a plazmamembránban lokalizált NR vagy az AtNRT1.1 transzporter. Ez a lokális válasz azonban integrált a növény N-ellátottságával, ami domináns, és feedbackregulálja a transzportereket transzkripciós, transzlációs és poszt-transzlációs szinten, a szignál és a szignál transzdukciós út azonban nem ismert (asavak, regulátor proteinek?, hajtásban szintetizálódó citokininek). A szénhidrátellátás napi fluktuációja, azaz a floémenkeresztül a gyökérbe kerülő szénhidrátok is fontos pozitív szignálok a nitrát transzporterek(AtNRT2.1 és AtNRT1.1) expressziójában. Ez segítheti a NO3

- felvétel és a fotoszintézis kölcsönös regulációját.

31

LassLassúú vváálaszreakcilaszreakcióók: oldalgyk: oldalgyöökkéér nr nöövekedvekedééss

LokLokáális vlis váálaszreakcilaszreakcióó

IntegrIntegráált vlt váálaszreakcilaszreakcióókk

cukrok

D-ciklin

OldalgyOldalgyöökkéér r elongelongáácicióó

ANR1 – nitrát regulált MADS-box TF génjeAXR4 (ARF) – „auxin response factor” génje

gygyöökkéér elr eláágazgazáás, s, oldalgyoldalgyöökkéér r elongelongáácicióó

Amikor a növények NO3--ban gazdag talajrészhez érnek, nemcsak a nitrát

felvétel gyors növekedése, hanem egy lassú fejlődési válasz is megfigyelhető: laterális gyökér proliferáció ebben a talajrétegben. Ez részben lokális válasz, a NO3

- indukálja egy ANR1 transzkripciós faktor szintézisét elősegítve. Az oldalgyökér proliferáció azonban akkor a legintenzívebb, ha az egész növény N-ellátottsága alacsony, azaz távoli regulátor mechanizmusok is befolyásolják. Az auxin, mint a legfontosabb növényi növekedés regulátor, ami a hajtásban szintetizálódik és a gyökerekbe transzportálódik, fontos szerepet játszik a hajtás-gyökér kommunikációban, a gyökérbe irányuló auxin transzport gátlása uisjelentősen csökkenti a gyökérelágazást. Kimutatták, hogy alacsony nitrát cc. (NRT1.1. a szenzora – nemcsak transzporter, hanem receptor is) gátolja az auxin akkumulációját a gyökércsúcsban, és így a laterális gyökérnövekedést is. A magas N-ellátottság (Gln/Glu?) viszont egy miRNS szintjének emelésével gátolja az auxin response faktor génexpresszióját, és így az oldalgyökérnövekedést. Arra utaló eredmények is vannak, hogy a gyökérbe kerülőszénhidrátok is korrelálnak az oldalgyökér denzitással. A szaharóz a D-ciklinek egyik tagját, amely az oldalgyökér primordiumok képződésekor expresszálódik és sejtosztódást indukál, regulálja.

32

LassLassúú vváálaszreakcilaszreakcióók: levk: levéél expanzil expanzióó

ZeatinZeatin ribozid

A levélexpanzió különösen érzékeny a NO3--ellátás fluktuációira: amikor

nem áll rendelkezésre elég nitrát, a levélexpanzió leáll, de ez gyorsan revertálható a nitrátellátás helyreállításával (specifikus nitrátra, az ammóniumtáplálás nem revertálja). Mind sejtosztódásbeli, mind megnyúlással kapcsolatos változások hozzájárulnak a levélnövekedéshez. A levélnövekedés gátlása szoros korrelációt mutatott a Z-típusúcitokininek (zeatin and zeatin ribozid) mennyiségének csökkenésével a xilémben. Tehát a citokinin képződés változása a gyökérben lehet az a távoli jel, ami regulálja a levél morfogenezist a nitrátellátással összhangban. A nitrát indukálja a citokinin szintézis kezdeti lépését katalizáló AtIPT3 (citokinin szintáz=AMP-izopenteniltranszferáz) génexpresszióját. A levelekben kétkomponensű regulátor rendszerek (His-to-Asp foszfo-relay szignaltranszdukciós utak) expressziója indukálható citokininekkel vagy N-hiányos növények gyökereinek nitráttal való ellátásával.

33

ÚÚj j eredmeredméényeknyek

MMóódszerekdszerek- Transzkriptomika- forward genetika- reverz genetika - miRNS kutatás

EredmEredméényeknyek- receptorok- TF-ok- kinázok- miRNS

Castaings et al. (2011) nem megtanulandó

Molecular players in N signalling and regulation. Schematic representation of players involved in N signalling. For simplicity, all players are presented in the same cell, which might not be the case in a plant. The dual-affinity nitrate transport NRT1.1 has a double role for transport and signalling of nitrate. The CBL-interacting protein kinaseCIPK23 regulates the affinity of NRT1.1 for nitrate. CIPK8 is involved in the nitrate-regulated mRNA accumulation of several nitrate-regulated genes. The putative transcription factor (TF) NLP7 is also necessary for full nitrate induction of gene expression. One direct target promoter seems to be the promoter of NRT2.1, a high affinity nitrate transporter. The LOB domain-containing TFs LDB37/38/39 are negative regulators of nitrate-mediated gene expression and they are involved in the regulation of anthocyanin synthesis. ANR1, another TF, regulates lateral root growth in response to nitrate. Regulation by the circadian clock pathway takes place via CCA1, a TF regulated by reduced N compounds such as glutamine. Regulation by microRNAs (miR393 and miR167) connects auxin to nitrate signalling via the auxin-responsive TF ARF8 and the auxin-binding protein ABF3. Further miRNAs are regulated by the N status of the plant (miR169 and miR398) and might play regulatory roles.

34

A A nitrogennitrogenáázz mműűkkööddéésese

NADH/Fd OROR

MoFeMoFe--proteinprotein

FeFe--proteinprotein

FeMocoFeMoco

PP

4Fe4Fe--4S4S ATPATPFizolFizolóógigiááss szabszabáályozlyozáás: energias: energia-- éés s reduktreduktáánsellnselláátottstottsáágg

E1-E8

35

EnergiaEnergia-- éés s reduktreduktáánsbiztosnsbiztosííttááss

MalMaláátt::

-- energiaforrenergiaforráás s

(aerob l(aerob léégzgzéés)s)

-- reduktreduktáánsns forrforrááss

((citrcitráátt ciklus: ciklus:

NADH)NADH)

NADH/NADH/FdFd OROR

Bakteroid metabolizmus: Heldt Fig. 11.8

36

Az ammAz ammóónia benia beééppüülléésese

reduktáns,energia

szénváz

A nitrát redukciója során képződő ammónium a plasztiszban lokalizált GS és GOGAT segítségével épül be, míg a nodulusz parenchimasejtjeiben a GS (Gln szintézise) a citoplazmában, a GOGAT (Glu szintézise) a plasztiszban történik.

37

NIF vagy nitrNIF vagy nitráát redukcit redukcióó

16 ATP + 8e16 ATP + 8e--

8e8e--

NitrNitráát t –– metabolikusan csmetabolikusan csöökkenti a kkenti a NIFNIF--tt–– ggáátolja a tolja a NIFNIF--ss ggéének nek expressziexpresszióójjáátt–– ggáátolja a tolja a nodulnoduláácicióótt

38

A nitrA nitráát metabolikus szabt metabolikus szabáályozlyozóó hathatáásaisai

NitrátCHONOred N

NO-LegHgl

NO

posztranszlációstranszkripciós

A nitrát a NIF folyamatát is gátolja: 1.) N-áz és NR-áz kompetíciója a szénhidrátokért (nitrát csökkenti a szénhidrát transzportot SPS!) 2.) NO a N-ázhoz/leghgl-hoz kapcsolódva (oxigén parciális nyomásának csökkentése) gátolhatja a NIF-t, 3.) feedback génexpresszió gátlás - fixált nitrogén miatt.

39

A A ggéénexpresszinexpresszióó szabszabáályozlyozáásasa

CentrCentráális lis nitrognitrogéénfelhasznfelhasz--nnáálláástst szabszabáályozlyozóó ggééneknek

f.f.

OO22 tenzitenzióó FixFixáált nitroglt nitrogéénn

NONO33--

NONO33--

A Náz expressziója csak alacsony O2 cc-nál következik be. A FixLprotein (kétkomponensű regulációs rendszer része) szabályozza azt a regulációs kaszkádot, ami a NIF-hoz szükséges gének transzkripcióját aktiválja. A FixLalacsony O2 cc-nál autofoszforilálódik, majd foszforilálja a FixJ-t. A foszforiláltFixJ (transzkripciós faktor) aktiválja a NifA és FixK transzkripcióját, amelyek azután különböző nif és fix gének expresszióját szabályozzák.

Az NtrC géntermék foszforilált állapotban aktiválja a nifA,L regulátor géntermékek, ezek pedig a nif gének szintézisét. A NtrB géntermék a GlnB géntermékkel (PII, a NtrB géntermék kofaktora) a körülményektől függően foszforilálja az NtrC génterméket. Ha ez a kofaktor aktivált állapotban van (a GlnDgéntermék aktiválja alacsony redukált nitrogén szint esetén), akkor az NtrBgéntermék kinázként működve aktiválja a nitrogénfixációt.

40

A A noduluszfejlnoduluszfejlőőddééssindukciindukcióójaja

Jobb fent: S. meliloti expressing a green fluorescent protein gene (GFP). Cell wallsare counter-stained with propidium iodine (red).

Lent: Frugier (08) TIPS

A citokininek szerepe az infekciós folyamatokban és a nodulációban: A Nod-faktor érzékelése LysM (lysin motif-containing) receptorokkal Ca/CAM szignalizáció (CCaMK – Ca/CAM protein kináz, NSP1/2, ENR transzkripciós faktorok: TF) révén citokinin szintézist indukál, ami szignál transzdukciós út (HK –His kináz, RR – response regulators) közreműködésével génexpressziót (NIN – az infekciós fonal képződéséhez szükséges) eredményez. A szignál transzdukciós út egy részét helyettesítheti a baktériumok által termelt citokininszerű anyagok (Rhizobium pTZS) bejutása. Az epidermiszben termelt citokinin vagy egy messenger molekula ( de novo citokinin szintézist indukál a cortex-ben) a cortex-bediffundálhat (a), ahol citokinin receptorok (LHK1, MtCRE1) érzékelik és szignál transzdukciós út (RR-ok, TF-ok) közreműködésével nodulusz organogenezistörténik. A citokininek a noduláció lokális (b,c) és szisztémikus (d) feed-backregulációját is szignalizálhatják.

41

A A noduluszfejlnoduluszfejlőőddééss loklokáális szablis szabáályozlyozáásasa

NodNod--faktorfaktor

hormonvhormonváált. lt.

organogenezisorganogenezis

1. Gy1. Gyöökkéérszrszőőr gr göörbrbüüllééssetiletiléén n –– sfalsfal regenerregeneráácicióóROS ROS –– szab. infekciszab. infekcióóENOD40 ENOD40 –– sejtciklus szab.sejtciklus szab.

2. 2. NoduluszNodulusz indukciindukcióó-- uridinuridin etiletiléén (n (kitinkitináázokzok): ):

3. 3. CitokininCitokinin: : -- auxinauxin//citokinincitokinin

sejtosztsejtosztóóddáás indukcis indukcióóENOD gENOD géének aktivnek aktiváácicióójajaszszéénhidrnhidráát szint nt szint nöövelvelééss

4. 4. NoduluszNodulusz fejlfejlőőddééss-- auxinauxin//citokinincitokinin

sejtosztsejtosztóóddáás gs gáátltlááss-- GH3/ENOD40GH3/ENOD40

szszáállllííttóó--elemek elemek nnöövv..-- GA GA –– elongelongáácicióó

E E -- --amilamiláázz-- ABA/LOX/NOABA/LOX/NO

organogenezisorganogenezis

NONO33--

NONO33--

ACC: 1-aminociklopropán-1-karbonsav, GH3 – auxin responsive promoter, LOX –lipoxigenáz, MtLAX – auxin szintézissel kapcsolatos gén, ccd –cortical celldivision, ENOD – early nodulin.

A noduluszok primordiumai fajtól függően a külső vagy belső kérgi régióban keletkeznek, amelyekben már az invázió előtt megtörténik a citoszkeleton, a citoplazma és a membránrendszer reorganizációja. A kérgi sejtosztódás az infekciós csatorna növekedésével egyidejűleg folyik. A protoxylém zónában sztele-bőlkidiffundáló uridin stimulálja a sejtosztódást. A floém pólusoknál a sejtosztódást a periciklusból kidiffundáló etilén

(ACC oxidáz szintetizálja) gátolja. Az auxin kettős szerepet játszik a nodulációban: a kezdeti auxin transzport gátlás (Rhizobium manipulálhatja az auxin transzportot) csökkenti az auxin/citokinin arányt, ami kedvez a sejtosztódás megindulásának, később azonban a magasabb auxinszint gátolja a sejtosztódást. A citokininsejtosztódást indukál, ENOD géneket aktivál, elősegíti a szénhidrát ellátást. Az etilén pozitívan befolyásolja az infekciós fonal növekedését, negatívan befolyásolja a noduluszfejlődést (kitinázokat indukál, amelyek lebontják a Nod faktorokat, gátolja az auxintranszportot). A gibberellinek (GA) elősegítik a sejtosztódást és elongációt, valamint a nitrogénfixáló baktériumok energiaellátását.

A nitrát jelenléte a talajban (>1-5 mM) lokálisan gátolja a nodulációt(infekciót, nodulusz primordium iniciációt). A nitrát gátolja az ENOD40 indukcióját. Feltételezik, hogy a nitrát az auxintranszportot/gyökér auxinérzékenységét befolyásolva növeli az auxin/citokinin arányt, viszont a noduláció megindulásához az auxin/citokinin szint csökkenése szükséges. Ugyanakkor a N-hiány növeli a flavonoid szintézisben résztvevő gének expresszióját, hasonlóan, mint a foszfát a mikorrhiza kialakulását.

42

A A nodulnoduláácicióó autoregulautoreguláácicióójaja: mut: mutáánsoknsok

Nodulusz képződésmagas talaj N szintnél

Receptor-kináz

(fotomorfogenezis)

Hiperinfekció, de csaklimitált zónában

etilén receptor gén

Fény erősen gátolja anoduluszképződést

bZip transzkripciós f.

Fotomorfogenetikusfejlődést befolyásolja

**

A szimbiotikus NIF hasznos a növények számára. A túl sok nodulusz, azonban megzavarja a gazdanövény növekedését azzal, hogy túl sok energiát von el a növénytől. Az egyensúly fenntartására a szimbionta növények szisztémikus negativfeedback regulátor rendszerrel rendelkeznek (a noduláció autoregulációja), amely távoli szignalizációval szabályozza a noduluszok számát a nodulációs zónában. Keveset tudunk azonban a reguláció mechanizmusáról. Hatékony módszer ennek a tanulmányozására a mutánsok vizsgálata.

43

A A noduluszfejlnoduluszfejlőőddééss

integrintegráált lt szabszabáályozlyozáásasa

GyGyöökkéér szignr szignáállNod-faktor (citokinin?)

HajtHajtáás szigns szignáállmetil-jazmonátABABrassinolid

(CDPK, CaMDPK)

Az autoregulációban mind gyökér, mind hajtásban lokalizált szignál transzdukciós rendszerek szerepet játszanak. A hajtásban lokalizált regulációs mutánsok vagy a gyökéreredetű autoregulációs jel érzékelésében és/vagy a hajtáseredetűautoregulációs jel átvitelében sérültek. A gyökéreredetű mutánsok viszont a gyökérből jövőjel átadásában vagy a hajtáseredetű jel érzékelésében defektesek. Ezek a mikorrhizaképzésben is sokszor defektesek, mert sok közös aspektusa van a nodulációval.

A gyökéreredetű jel a Nod faktor lehet, ami tehát kettős szerepet tölt be, pozitívan regulálja a noduluszfejlődést, és szisztemikusan (citokinin?)represszálja mind a nodulációt, mind a mikorrizálást. A hajtáseredetű szignálok a levelekből jönnek. Brasszinolid (BL), egy brasszinoszteroid, ABA, és metil-jazmonát (MeJA) játszhat szerepet az autoregulációban. A CCaM-DPK (Ca,CaM dependent protein kinase) lehet tagja a szignál transzdukciós láncnak.

44

SzulfSzulfáát asszimilt asszimiláácicióó

GyGyöökkéér!r!

Takahashi et al. (2011) ARPB

Az enzimek és a transzporterek piros betükkel jelöltek, a szaggatott vonal hipotetikus utakat jelöl.

Metabolitok: APS – adenozin-5’-foszfoszulfát; Cyst – cisztationin; GS-X – glutationkonjugátum, Hcy – homoCys; OAS – O-acetylSer;

OPH – O-foszfohomoSer; PAPS – 3’-foszfoadenozin-5’-foszfoszulfát; R-OH – hidroxilprekurzor; SAH – S-adenozilhomoCys; SAM – S-adenozilMet;

X-CysGly – ciszteinilglicin konjugátum.

Enzimek és transzporterek: APK – APS kináz; APR – APS reduktáz; ATPS – ATP szulfuriláz; CBL – cisztationin -liáz;

CGS – cisztationin -szintáz; CLT – tiol transzporter; -ECS – -GluCys szintetáz; GGT –-glutamil transzferáz; GSHS – glutation szintetáz;

GST – glutation-S-transzferáz; MRP – ABC transzporter; MS – Met szintetáz; OAS-TL –OAS(tiol)liáz; SAM – S-adenozilMet szintetáz;

SAT – Ser transzacetiláz; SiR – szulfit reduktáz; SOT – szulfotranszferáz; SULTR –szulfát transzporter; TS – Thr szintáz.

45

A szulfid a kloroplasztiszban, a legtöbb OAS a mitokondriumban képződik, a Cys szintézis fő helye pedig a citoplazma. Tehát hatékony szulfid, OAS és Cystranszportnak kell léteznie az organelláris membránokon keresztül. A PAPS-ot a szulfotranszferázok használják fel a citoplazmában a glukozinolátok képződéséhez, ill. protein Tyr-ok szulfatációjához. A glukozinolátok lebomlási termékei toxikusak és riasztóanyagok (növényevők, patogének elleni védekezésben is fontosak, sőt antikarcinogénhatásuk is van). Flavonoidok, jazmonátok, brassinosteroidok szulfatálását is végzik (aktivitáshiány törpe fenotípust eredményez). A hormonális hatású szulfatált pentapeptidek(fitoszulfokinek) sejtosztódást stimulálnak (hiányuk korai öregedést okoz).

A GSH, amely a sejt redox állapotának regulációjában (GSH reduktáz, glutaredoxinok) és a detoxifikációban (GST, fitokelatinok) játszik szerepet, szintézis regulációjában a fő tényező a -ECS, ami transzkripciós és poszttranszlációs szabályozás alatt is áll. Ez utóbbi redox szabályozás: két intramolekuláris diS híd állapota befolyásolja (oxidált formában aktív – a sejt oxidáltabb állapota, ami stresszek hatására következhet be, aktiválja).

A TS-t a SAM aktiválja, ugyanakkor csökkenti a CGS mRNS stabilitását. SAM csökkenéskor a TS aktivitása kisebb és az OPH felhasználás a Met szintézis irányába nagyobb lesz.

46

A szulfA szulfáát t asszimilasszimiláácicióószabszabáályozlyozáásasa

TranszkripciTranszkripcióóss

OASOAS

GSHGSH

szaharszaharóózz

hormonokhormonok

PosztPoszt--transzltranszláácicióóss

APR (APR (tioltioldimerdimer→→monomermonomer))

ATPSATPS--APRAPR--SiRSiR komplexkomplex

--ECS ECS –– redoxredox regulreguláácicióó

CC

NN

SS

APRAPR

SULTRSULTR

Kopriva (2006)

A szulfát asszimiláció elsősorban a transzporterek és az APR transzkripció szintjén szabályozott, de poszttranszkripciós regulációs mechanizmusok is beleszólhatnak. Pl. az APR dimer t feleslegben lévő tiolokinaktív monomerré redukálják, ill. kimutatták, hogy az ATPS, APR, és a SiR szulfát redukáló komplexet alkotnak a plasztiszban. A reguláció mechanizmusa azonban még kevéssé tisztázott. A S-ellátottság hajtás gyökér szignalizációjábanvalószínűleg a GSH játszik szerepet.

A legfontosabb transzkripciót befolyásoló regulátorok a szaharóz (C-anyagcsere), az OAS (N-anyagcsere) és a GSH (S-anyagcsere).

A növényi hormonok is fontos szerepet játszanak. A citokininek a transzporterek expresszióját befolyásolják. A jazmonát számos szulfát asszimilációban szerepet játszó gén expresszióját indukálja, és a jazmonát szintézis génjeit a szulfát hiány up-regulálja. Mind a jazmonát, mind a szalicilátok APR mRNS szint és aktivitásnövekedést indukálnak. Az ABA indukálja a citoplazmatikus OAS:TL-t.

A szulfát asszimiláció fejlődési állapottól is függ. A legintenzívebb a fiatal szövetekben, ahol a leginkább szükséges a protein szintézishez.

47

A szulfid beA szulfid beééppüülléés szabs szabáályozlyozáásasa

OAS:TLOAS:TL

SATSAT

CSCCSC

O-acetilSer-tiol liáz (OAS:TL, dimer), piridoxál foszfát prosztetikus csoporttal működik. Ser-acetiltranszferáz (SAT, trimer) és OAS:TL enzimek egy kis része komplexet képez (Cys szintáz komplex). Különböző komplexstruktúrák lehetnek a különböző növényfajokban (Arabidopsis: két SAT trimer dimerje kapcsolt egy OAS:TL dimerrel; szójában 3 OAS:TL dimer kötődik egy SAT trimerhez). A kötődéskor a SAT flexibilis C terminális része az OAS:TL katalitikus helyét tartalmazó barázdába fekszik be, inaktiválva a kötődő OAS:TL-t. Az utóbbi tehát a SAT reguláló alegységeként viselkedik, és csak amikor OAS:TL-t köt, akkor szintetizál OAS-t. A komplexképződést az OAS, ami kompetál a kötőhelyért a SAT C-terminális részével, megszünteti, a szulfid pedig (az OAS felhasználásával) elősegíti. Magához a Cys szintézishez szabad OAS:TL kell.

48

A sejt kA sejt kéénn--anyagcseranyagcserééje je

SO2+H2O →HSO3– +H+

SO32– +2H+

SO32- + H2O+O2

SOSO4

2- + H2O2

SO32- + H2O2

*SO4

2- + H2O

Cys sulfhidriláz

piruvát

Szulfit oxidáz (SO): szulfitolízis ellen véd

* - nem enzimatikus

A szulfit oxidációja állatokban, mikroorganizmusokban és növényekben is kimutatható. Növényekben egy peroxiszómában lokalizált molibdoenzim, a szulfit oxidáz (SO, Mocokofaktorral működik, mint a NR) katalizálja. A reakcióban az elektron akceptor a molekuláris oxigén, a termékek szulfát és hidrogén peroxid. A szulfitot a hidrogén peroxidis képes nem-enzimatikusan oxidálni. Ez a folyamat és a peroxiszómában lokalizált katalázdetoxifikálja a hidrogén peroxidot. A SO biztonsági szelepként működik, ami detoxifikáljaa felesleges szulfitot és megvédi a sejteket a szulfitolízistől: a szulfit (vagy a SO2 nagy cc-ban), mint nukleofil ágens, megnyitja a diS hidakat, ami protein inaktivációt okoz. A SO másik funkciója, hogy a sejtanyagok dekompozíciójakor keletkező redukált kénvegyületeket lebontja. Minden szövetben konstitutívan expresszálódó, állandó protein szintet mutató, poszt-transzlációs szinten regulált enzim. Általában a sejtek az összeférhetetlen reakcióutakat különböző kompartmentekbe lokalizálják: a szulfát asszimiláció a kloroplasztiszban, a szulfit oxidáció a peroxiszómában zajlik. Ezek az organellumok szoros kapcsolatban vannak a fotorespiráció során is, ami a szulfit átjutását is biztosítja. A szulfit oxidáció végtermékeként keletkező szulfát végső soron a vakuolumbantárolódik, ill. exportálódik a sejtből.

49

RegulReguláácicióó kkéénhinhiáány esetny esetéénn

transzporterek

ATPS

APR

ROS

Takahashi et al. (2011) ARPB

Szulfát hiány, ill. OAS felhalmozódás hatására a transzporter és az APR gének transzkripciója nő.

A SLIM1 transzkripciós faktor a kénhasznosítás globális regulátora. Kénhiány esetén a szulfát felvételt és a glukozinolát bioszintézist ellentétesen regulálja. Kénhiányos állapotban azonban az APR transzkriptum szintje nem a SLIM1 közreműködésével szabályozott. A miR395 (amelynek szintjét a SLIM1 szulfát limitáció esetén növeli) elsősorban az ATPS és egyes transzporterek mRNS-einek poszttranszkripciós degradációját okozza.

A MYB transzkripciós faktorok a glukozinolát bioszintézis pozitív regulátorai, a primer kénasszimiláció enzimeinek génexpresszióját is pozitívan szabályozzák, biztosítva s szubsztrátellátást a glukozinolát szintézishez. Kénhiányos állapotban a SLIM1 negatívan szabályozza (a MYB faktorokra gyakorolt hatással) a glukozinolát szintézist.

A kénhiányos állapot csökkenti a nitrogén- és szénasszimilációt, és oxidatív stresszt indukál. Bizonyos stresszhatások (nehézfémek) a S metabolizmust stimulálják (fitokelatin szintézis).

A CSC (SAT és OAS:TL asszociáltan) a fő metabolikus szabályozó. Kénhiányos állapotban a szulfid csökken, OAS halmozódik fel, ami inaktiválja.

A jazmonát szintézis génjeit a szulfát hiány up-regulálja. A hosszúidejű kénhiányos állapot auxin szignálokat is indukál.

50

A szA széén, nitrogn, nitrogéén n éés ks kéén asszimiln asszimiláácicióókköölcslcsöönhatnhatáásaisai

51

A kA kéén, szn, széén n éés nitrogs nitrogéén asszimiln asszimiláácicióóöösszehangolt regulsszehangolt reguláácicióója.ja.

Nitrát felvétel,redukció

A C-asszimiláció csökkenése redukálja a N-asszimilációt (Asn). A redukált S-vegyületek (Cys, GSH) aktiválják a N redukció kulcsenzimét, a NR-t, a redukált N-vegyületek (Glu, Gln) viszont stimulálják a szulfát redukció kulcsenzimét, az APR-ttranszkripciós szinten. Uezek a vegyületek feed-back regulálják a saját bioszintetikus reakcióútjaikat. A S-asszimiláció stimulációja N-limitált körülmények közt nem történik meg S-limitáltság esetén sem. Ez arra utal, hogy a redukált N-vegyületek szükségesek a S-asszimilációs enzimek de-repressziójához.

52

A szA széén, nitrogn, nitrogéén n éés ks kéén asszimiln asszimiláácicióóa Ca C44--es nes nöövvéényekbennyekben

Zea Zea FlaveriaFlaveria

Kopriva_PhRes05

Általában az egyszikű C4-es növényeknél a kukoricáéhoz hasonló eloszlást találtak. A kétszikű C4-es Flaveria fajoknál (BSC is tartalmaz PSII-t) a szulfát redukciómindkét sejttípusban megtalálható. A lokalizáltság okairól nem sokat tudunk. A szulfát asszimiláció feedback gátlója viszont nem a GSH, hanem a Cys a kukoricában.

53

A szA széén, nitrogn, nitrogéén n éés ks kéén asszimiln asszimiláácicióóöösszefsszefüüggggéései: sei: ÖÖsszefoglalsszefoglalááss

A fotoszintézis fontossága:szénváz-, energia- és reduktáns donor

A fotoszintA fotoszintéézis nemcsak C, hanem N zis nemcsak C, hanem N éés S asszimils S asszimiláácicióó is!is!C C →→ N 20N 20--2525

S 1S 1

CC--metabmetabolizmus NN--metabmetabolizmus SS--metabolizmusmetabolizmus2OG2OG

Glu S2- Cys,GSHGlcGlc, , szahszah.. AsnAsn

OAS

LokLokáális/integrlis/integráált vlt váálaszreakcilaszreakcióókk: nitrát/hormonok, cukrok