A D1 PROTEIN MUTÁCIÓ HATÁSA A KETTES FOTOKÉMIAI RENDSZER ENERGIA-

HASZNOSÍTÁSÁRA ELTÉRŐ VÍZELLÁTÁSÚ NÖVÉNYEKBEN

Ph.D. értekezés

Bajkán Szilvia

Témavezető: Prof. Dr. Lehoczki Endre

Biológia doktori iskola

Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar Növénybiológiai Tanszék

Szeged 2011

1

TARTALOMJEGYZÉK

Rövidítések és jelölések jegyzéke 4

1. Bevezetés 6

2. Irodalmi áttekintés 8

2.1. Az elnyelt fényenergia sorsa a fotoszintézis során 8

2.1.1. A fény fotokémiai hasznosulása 8

2.1.2. A többlet elnyelt fényenergia sorsa és káros hatásai a növények leveleiben 11

2.1.3. A fény káros hatásaival szemben kialakult fotoprotektív mechanizmusok 12

2.1.4. A nem-fotokémiai kioltás és lokalizációja magasabbrendű növényekben 13

2.1.5. A xantofillok szerepe a hődisszipáció folyamatában, a xantofill ciklus-függő és

független nem-fotokémiai kioltás 17

2.1.6. A PsbS fehérje szerepe a hődisszipáció folyamatában 20

2.2. A vízdeficit hatása a magasabbrendű növények fotoszintézisére 22

2.2.1. A vízhiány fokozatainak jellemzése, a sztomatikus és a nem-sztomatikus limitáció

értelmezése 22

2.2.2. A védekező/szabályozó folyamatok szerepe a vízhiány kivédésében 25

2.2.3. Stratégiák a vízhiány tolerálására 27

2.3. Az atrazin rezisztencia 28

3. Célkitűzés 32

4. Anyag és módszer 33

4.1. A vizsgált növényi anyag 33

4.2. Növénynevelés, vízmegvonás 33

4.3. Reciprok keresztezések kivitelezése, genetikai analízis 34

4.4. A növény vízellátásának vizsgálata 35

4.4.1. Sztómasűrűség vizsgálata 35

2

4.4.2. A levelek relatív víztartalmának meghatározása 36

4.4.3. A levélszövetek átlagos vízpotenciáljának mérése 36

4.4.4. Sztóma konduktancia mérése 36

4.5. Elektron mikroszkópia 37

4.6. Gázcseremérések 37

4.6.1. CO2 asszimilációs ráta meghatározása a fényintenzitás függvényében 37

4.6.2. CO2 asszimilációs ráta meghatározása az intercelluláris CO2 koncentráció

függvényében 38

4.7. Klorofill fluoreszcencia mérések 38

4.7.1. Gyors klorofill a fluoreszcencia indukció (OJIP görbe) mérése 38

4.7.2. Modulációs klorofill a fluoreszcencia mérés, fotoprotektív folyamatok vizsgálata

40

4.7.3. A PSII-ben elnyelt fényenergia megoszlásának vizsgálata 42

4.8. Fotoszintetikus pigmenttartalom meghatározás 43

4.9. DNS izolálás és PCR amplifikáció, PsbS és PsbA (D1) fehérjéket kódoló DNS

szakaszok szekvenálása 44

4.10. Immunoblot analízis 45

4.11. Statisztikai analízis 45

5. Eredmények 46

5.1. Az elnyelt fényenergia hasznosításának összehasonlító vizsgálata a S. nigrum kétféle

biotípusában és a különböző növénynemzedékekben 46

5.1.1. A S. nigrum biotípusok és vonalak fotoszintetikus jellemzése 46

5.1.2. Az NPQ és az elnyelt fényenergia allokációja a PSII-ben 52

5.1.3. A S. nigrum vonalak sejtmagi hibrid státuszának igazolása 58

5.2. A vízdeficit hatásának összehasonlító vizsgálata S. nigrum kétféle biotípusában és a

különböző növénynemzedékekben 61

5.2.1. A vízdeficit hatása a növények vízállapotára és a gázcseréjére 61

5.2.2. A vízdeficit hatása az elnyelt fényenergia fotokémiai hasznosítására 70

3

5.3. Egyes nukleáris öröklődésű faktorok hatása a fotoszintetikus fényenergia

hasznosításra 76

6. Eredmények megvitatása 79

7. Összefoglalás 91

8. Summary 97

9. Irodalomjegyzék 103

10. Függelék 115

11. Publikációs lista 117

12. Köszönetnyilvánítás 119

4

RÖVIDÍTÉSEK ÉS JELÖLÉSEK JEGYZÉKE A [µmol m-2 s-1] CO2 asszimilációs ráta

Amax maximális CO2 asszimilációs ráta

Jmax ribulóz 1,5-biszfoszfát regenerációjának maximális sebessége az A/Ci görbe analízise során

AS atrazin-szenzitív, vad-biotípusú szülő

AR atrazin-rezisztens, D1 protein mutáns biotípusú szülő

Ant anteraxantin

Ca [µmol mol-1] légköri CO2 koncentráció

Chl klorofill

Ci [µmol mol-1] sejtek közötti (intercelluláris) CO2 parciális nyomása

Ci/Ca látszólagos karboxilációs hatásfok

Cyt citokróm

DEi de-epoxidációs index

DH1 enyhén vízhiányos állapot 5-7 nap vízmegvonást követően (dehydration state1)

DH2 közepesen vízhiányos állapot 13-15 nap vízmegvonást követően (dehydration state2)

DH3 erősen vízhiányos állapot 18-19 nap vízmegvonást követően (dehydration state3)

F1, F2, F6 a kétféle szülő biotípus keresztezéseiből származó első, második és hatodik nemzedék

Fo alapfluoreszcencia szint sötétadaptált állapotban

Fm maximális fluoreszcencia szint sötétadaptált állapotban

F’o alapfluoreszcencia szint fényadaptált állapotban

F’m maximális fluoreszcencia szint fényadaptált állapotban

F állandósult (steady-state) fluoreszcencia szint

Fd ferredoxin

Fv/Fm a kettes fotokémiai rendszer primer fotokémiájának maximális hatásfoka sötétadaptált állapotban

F’v/F’

m a kettes fotokémiai rendszer nyitott reakciócentrumainak relatív fotokémiai hatásfoka

gs [mmol m-2 s-1] sztóma konduktancia

HPLC magas nyomású folyadék kromatográfia (High Pressure Liquid Chromatography)

IRGA hordozható infravörös gázelemző készülék (Infrared Gas Analyzer)

LHCII kettes fotokémiai rendszer klorofill a/b kötő, fénybegyűjtő pigment-protein komplexe

JETR [μmol e- m-2 s-1] lineáris fotoszintetikus elektrontranszport sebessége

JNO [μmol m-2 s-1] nem-regulált energia disszipáció sebessége

JNPQ [μmol m-2 s-1] regulált energia disszipáció sebessége

NADP nikotinamid adenin dinukleotid foszfát

NPQ nem-fotokémiai kioltás

OJIP gyors klorofill fluoreszcencia tranziens, nevét a nevezetes pontok (O-J-I-P) jelölései alapján kapta

PAM pulzus amplitudó modulált klorofill fluoriméter

PEA fotoszintetikus hatékonyságmérő készülék (Plant Efficiency Analyzer)

PC plasztocianin

PCR polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction)

Pi inorganikus foszfát

5

PPFD fotoszintetikusan aktív foton denzitás (Photosynthetically Active Photon Flux Density) (400-700 nm)

PQ plasztokinon

PQH2 plasztokinol

PSI egyes fotokémiai rendszer

PSII kettes fotokémiai rendszer

P680 reakciócentrum klorofill a a kettes fotokémiai rendszerben

QA kettes fotokémiai rendszer elsődleges kinon elektron akceptora

QB kettes fotokémiai rendszer másodlagos kinon elektron akceptora

qE a nem-fotokémiai kioltás energia (ΔpH)-függő komponense

qI a nem-fotokémiai kioltás lassan relaxálódó komponense

qT “state” átmenet

qP fotokémiai kioltási koefficiens

1 – qP a kettes fotokémiai rendszerre ható gerjsztési nyomás

RC reakciócentrum

RH1 rehidratált állapot a DH1 szakaszból 24 óra után (rehydration state1)

RH2 rehidratált állapot a DH2 szakaszból 24 óra után (rehydration state2)

RH3 rehidratált állapot a DH3 szakaszból 24 óra után (rehydration state3)

Rubisco ribulóz 1,5-biszfoszfát karboxiláz oxigenáz

RuBP ribulóz 1,5-biszfoszfát

RWC relatív víztartalom (Relative Water Content)

TL termolumineszcencia

Vio violaxantin

Zea zeaxantin

ε a Rubisco enzim aktivitása és/vagy extrahálható mennyisége (karboxilációs hatékonyság), mely az A/Ci

görbe lineáris szakaszának kezdeti meredeksége

φ látszólagos kvantumhatásfok: CO2 asszimiláció aktinikus fényre adott válaszgörbéjének kezdeti

meredeksége, mely a beeső fotonáram-sűrűségen alapul

ΦDL fényben disszipálódott hőenergia frakciója

ΦDD sötétben történő energiaveszteség

ΦE többlet energia frakció

ΦNO nem-regulált (konstitutív) energia disszipáció hatásfoka

ΦNPQ regulált termális energia disszipáció hatásfoka

ΦPSII kettes fotokémiai rendszer fotokémiájának hatásfoka

Ψ [MPa] levél vízpotenciál

6

1. BEVEZETÉS

A növények a napok többségében ki vannak téve a fényintenzitás dinamikus változásának, és

gyakran több fényenergiát nyelnek el, mint amennyit hasznosítani tudnak a fotoszintézis

során. Az elnyelt többlet gerjesztési energia károsíthatja a fotoszintetikus apparátust

(szingulett oxigén, reaktív oxigén fajták képződése által). Ezért a fény fotokémiai hasznosulási

folyamata mellett olyan fotoprotektív mechanizmusoknak is ki kellett alakulniuk, amelyek az

elnyelt energiatöbbletet veszélytelen módon elvezetik a rendszerből. Egy ilyen folyamat a

nem-radiatív energia disszipáció (hődisszipáció). Ezt a mechanizmust a klorofill

fluoreszcencia fényfüggő, nem-fotokémiai kioltásaként (NPQ) definiáljuk. Az NPQ

legnagyobb komponense a gyorsan relaxálódó, ΔpH-függő qE komponens. Az NPQ

mechanizmusa csak részben ismert, de kialakulásának feltételei az tilakoid lumen alacsony

kémhatása, de-epoxidált xantofillok képződése, PsbS és fénybegyűjtő komplex (LHC)

fehérjék protonációja.

Az ez idáig vizsgált atrazin-rezisztens (AR) gyomnövényekben (Chenopodium album,

Epilobium adenocaulon, Erigeron canadensis, Senecio vulgaris, Solanum nigrum) kimutatták

a csökkent mértékű NPQ kapacitást, ezen belül a csökkent qE komponenst (Váradi et al.,

2003). Eddigi ismereteink szerint az NPQ kialakulását nukleárisan kódolt faktorok határozzák

meg, habár a kettes fotokémiai rendszer (PSII) reakciócentrum D1 fehérjét kódoló psbA gén –

amely a rezisztens növényekben a mutációt hordozza – a kloroplasztisz genom része. Ezért

nem világos, hogy a D1 fehérje milyen hatással van az antennában végbemenő hődisszipáció

kialakulására.

Reciprok keresztezéseket végeztünk a Solanum nigrum vad-típusú és atrazin-rezisztens

biotípusai között, és az ebből származó hibridekkel (F1, F2 egészen az F6-ig) vizsgálatokat

folytattunk annak érdekében, hogy közelebb jussunk annak a kérdésnek a megválaszolásához,

milyen kapcsolat van a D1 protein mutáció és a PSII antennájában elnyelt fényenergia

allokációja között: ezen belül tanulmányoztuk a qE komponens és az allokációs mintázat

öröklődését.

Ismeretes az atrazin-rezisztens növények eltérő hőmérséklet-érzékenysége és

adaptációs képessége (Ducruet & Lemoine, 1985), illetve fokozott fényérzékenységükről

egyaránt beszámoltak (Hart & Stemler, 1990). Napjainkban a vízhiány (szárazság) az egyik

7

legfontosabb környezeti tényező, amely a növény növekedését/produktivitását limitálja.

Természetes körülmények között a vízdeficit gyakran együtt jár a magas hőmérséklettel

és/vagy a magas fotonáram-sűrűséggel (fénygátlás). Tudomásunk szerint a vízdeficit

(szárazság) fotoszintézisre gyakorolt hatásait ez idáig nem vizsgálták még D1 protein mutáns

növényekben. Ezért a dolgozatom másik fő témájának a vízdeficit hatásának tanulmányozását

választottam a Solanum nigrum gyomnövény kétféle biotíopusában, annak a kérdésnek a

megválaszolására, vajon a vízdeficit befolyásolja-e a D1 protein mutáns növények fitneszét.

8

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. Az elnyelt fényenergia sorsa a fotoszintézis során

2.1.1. A fény fotokémiai hasznosulása

A fotoszintézis folyamata a fény elnyelésével veszi kezdetét, amely különböző pigment

molekulák segítségével valósul meg. Növényekben az elsődleges fényelnyelő pigment a

klorofill a (Chla). A fény elnyelése által a gerjesztett Chl molekula négy lehetséges úton

veszítheti el a gerjesztési energiáját: alapállapotba kerülhet fotonkibocsátással

(fluoreszcencia); hő formájában; részt vehet energiatranszferben, amikor is átadhatja az

energiáját egy másik molekulának; vagy a gerjesztési energia kémiai reakciót eredményez (1.

ábra).

1. ábra Egymással versengő folyamatok a PSII-ben, amelynek során egy gerjesztett állapotban lévő klorofill molekula visszatérhet az alapállapotba.

9

A levelek által elnyelt fényenergia eloszlásának kvantifikálása a fotoszintézis kutatás egyik

fontos aspektusává vált. A különféle folyamatok, pl. fotoszintézis, fotorespiráció, víz-víz és

xantofill ciklus, melyek hozzájárulnak a fotoszintetikus apparátus fotoprotekciójához, két

kategóriába sorolhatók: a fotokémia és a termális disszipáció folyamatai. Miután ezek

kompetitívek, a Chl fluoreszcencia hatásfokának változása alapján következtethetünk az

említett folyamatok hatásfokában bekövetkező változásokra (Schreiber et al., 1994), melyet a

PSII (2. ábra) fotokémiai hatásfokával (ΦPSII) és az NPQ paraméterrel jellemeznek (Genty et

al., 1989; Bilger et al., 1995).

2. ábra A PSII főbb alkotórészei, a D1/D2 reakciócentrum proteinek az elektrontranszportlánc komponenseivel és a fénybegyűjtő antenna komplexek a tilakoid membránba ágyazódva J. Nield (Imperial College London, UK) nyomán.

A fotoszintézis során a növények, algák és egyes baktériumok a Napból származó

fényenergiát átalakítják és azt energiában gazdag, szerves vegyületekben tárolják. A

fotoszintézis folyamata két szakaszra bontható: az ún. fényszakaszban a lineáris

10

elektrontranszport során keletkezik az adenozin-trifoszfát (ATP) és a redukált nikotinamid-

adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH), mely molekulák a sötétben is lejátszódó ún.

sötétszakaszban a széndioxid szénhidrátokká történő biokémiai átalakításának feltételei. A

NADPH legfőbb fogyasztója a CO2 asszimiláció, de ezen kívül a szulfát és a nitrát redukció

folyamataiban is felhasználásra kerül.

Léteznek nem asszimilációt előidéző elektrontranszport folyamatok is, melyek

lejátszódásának valószínűsége megnövekedhet bizonyos körülméyek között. Például a

szárazság hatása napjainkban egy igen fontos környezeti tényezővé vált, melynek

következtében a fokozódó sztómazáródás csökkenti a kloroplasztiszok CO2 ellátását, és az

oxigén felé irányuló nem-asszimilációs elektrontranszport (fotorespiráció, Mehler-reakció)

valószínűsége megnövekszik. Ezek a mechanizmusok a többletenergiának egy biztonságos

módon történő disszipációját teszik lehetővé (Osmond & Grace, 1995). A fotorespiráció

(glikolát-ciklus) (Cornic et al., 1989; Renou et al., 1990; Tourneux & Peltier, 1995; Flexas &

Medrano, 2002), mely folyamat a C3 típusú növényekre jellemző, a fotoszintézis egy

lehetséges alternatív útjaként jelentős lineáris elektrontranszportot képes fenntartani, így

nagymértékben biztosíthatja a többlet gerjesztési energia elvezetését. Az oxigén egyes

fotokémiai rendszer (PSI) általi fotoredukciója (Mehler-reakció, Asada, 1999) úgy tűnik, csak

elenyésző mértékben járul hozzá az energia-disszipáció folyamatához. Haupt-Herting és Fock

(2002) fejtegetései alapján a Mehler-reakció folyamán bekövetkező fotoredukció egy nem-

enzimatikus folyamat, mely függ az elektrontranszport sebességétől, és tényleges

hozzájárulása a gerjesztési energia felhasználásához valószínűleg abban az esetben csökken,

amennyiben pl. szárazság hatására csökken az elektrontranszport sebessége.

A PSII-n belüli ún. ciklikus elektrontranszport esetében is felvetődött az a lehetőség,

hogy hozzájárulhat a többlet gerjesztési energia eltávolításához (Chow, 1994; Whitmarsh et

al., 1994), jóllehet in vivo létezése meggyőző módon nem bizonyított. Ebben a folyamatban

valószínűleg részt vesz a D1/D2 reakciócentrumhoz (RC) szorosan kötődő citokróm b559

heterodimer fehérje, ami feltevések szerint aktuális redoxpotenciáljától függően a RC Chl

(P680+) donoraként vagy a feofitin akceptoraként funkcionálhat, ekképpen védheti a PSII-t a

fénykárosodástól (Whitmarsh et al., 1994). A PSI körüli ciklikus elektrontranszport során a

redukált ferredoxin (Fd) molekula elektront ad át a citokróm (Cyt) b6/f komplex kitüntetett

helyén kötődő kinon vagy szemikinon molekulának, melynek eredményeként a Cyt b6/f részt

11

vesz a tilakoid membránon keresztüli ΔpH létrehozásában és fenntartásában. E

mechanizmusról ugyancsak feltételezik, hogy fontos szerepet tölt be a fotoprotekcióban

(Heber & Walker, 1992). Minthogy a ciklikus elektrontranszport során NADPH nem

keletkezik, a tilakoid membránon keresztüli proton gradiens másfelől ATP szintézist indukál,

ez a folyamat ATP/NADPH arány regulációjára szolgál.

2.1.2. A többlet elnyelt fényenergia sorsa és káros hatásai a növények leveleiben

A növények a természetben gyakorta ki vannak téve a fényintenzitás rapszodikus

változásának, így olykor több fényenergiát nyelnek el, mint amennyit hasznosítani képesek

fotoszintézisük során. Az elnyelt fényenergia mennyiségének növekedésével a fotoszintetikus

teljesítmény – amelyet a genetikai adottságon túl az adott élőhelyen a növényt érő

fényintenzitás-maximumok határoznak meg – egy telítési fázisig képes növekedni, míg a

beeső fény elnyelése továbbra is lineárisan növekszik. A leveleket érő napsugárzás kb. 80%-át

nyelik el a fotoszintetikus pigment molekulák (Björkman & Demmig, 1987), míg az energia

kisebb hányada reflektálódik a levelek felszínéről, vagy áteresztik azt a levél szövetei. Az

abszorbció révén a pigment molekulákban kialakult gerjesztett állapot energiája a

töltésszétválasztást követően fotokémiai reakciót eredményezhet. A fotoszintézis során nem

hasznosuló többlet energia frakció a növényekben kialakult fotoprotektív mechanizmusok

működése során eliminálódik. A gerjesztési energiatöbblet ezek után is megmaradó része

krónikus károsodást okozhat a fotoszintetikus apparátusban, amihez az is hozzájárul, hogy a

PSII működése során molekuláris oxigén fejlődik, ami a megnövekedett mennyiségű,

hosszabb élettartamú triplett gerjesztett állapotú Chla molekulákkal (3Chla*) kölcsönhatásba

lépve szingulett oxigén képződést eredményez. Kimutatták ezenkívűl más reaktív oxigén

formák, mint például a szuperoxid-gyökanion, hidroxil-gyök, hidrogénperoxid, illetve egyéb

szerves gyökök képződését is. Mindezek a tilakoid membrán irreverzibilis, oxidatív

károsodásához (fénygátlás) vezethetnek (Hurry et al., 1996), valamint pigment-, ill. fehérje-

degradációt okozhatnak (Andersson & Barber, 1996; Aro et al., 1993). Hatástalanításuk

érdekében számos antioxidáns molekula és enzimrendszer működik a kloroplasztiszban,

amelyek képesek befogni a fotoszintézis által szükségszerűen termelt reaktív oxigén formákat

(Asada, 1994; Foyer et al., 1994; Polle, 1997).

12

2.1.3. A fény káros hatásaival szemben kialakult fotoprotektív mechanizmusok

A természetben a növényeknek alkalmazkodniuk kell a fény intenzitásának és spektrális

tulajdonságainak gyakori változásához. Az evolúció során többszintű adaptációs hálózat

alakult ki, amelynek segítségével a fotoszintetizáló organizmusok megbirkóznak a

fényviszonyok fluktuációjával. Ezek két csoportba sorolhatók: (i) a fényelnyelés

szabályozásával és (ii) a befogott fényenergia sorsával kapcsolatos adaptációs

mechanizmusok. A teljes egyed szintjén megvalósuló adaptáció például a levél-orientáció

szabályozása (Björkman & Powles, 1987). Ez néhány, árnyék típusú, alacsony fotoszintetikus

kapacitással bíró növény esetében igen hatékonyan működik, melyek egyszer-egyszer ki

vannak téve a közvetlen napsugárzásnak. A sivatagi növények egy része szervetlen anyagokat

(pl. sókristályok) halmoz fel a levélfelszínen, vagy levegővel töltött szőröket fejleszt, hogy

növelje a levél reflexióját, ezáltal csökkentve az elnyelt fény mennyiségét. Sejtszinten a

fényelnyelést a kloroplasztiszok mozgása szabályozhatja (Chow et al., 1988), mely relatíve

gyorsan, percek alatt valósul meg, de csupán kb. 10-20%-kal csökkenti azt (Brugnoli &

Björkman, 1992).

A molekuláris szintű adaptációs mechanizmusok gyakran összetett, fényfüggő

génexpresszió szabályozás eredményei, melyek transzkripciós, transzlációs és poszt-

transzlációs szinteken valósulnak meg (Kloppstech, 1997). E folyamatok napokat, heteket

vehetnek igénybe és a tilakoid membrán szintjén jelentős összetételbeli és szerkezeti

változásokat foglalnak magukban. Egy ezek közül a PSI és PSII antenna méreteinek fény általi

módosulása, mely egy igen konzervált jelenség (Anderson et al., 1995). Magas fényintenzitás

mellett nőtt növényekben az antennaméret mindig kisebb, mint az árnyéknövényekben. A

fényviszonyoktól függően megváltozik az egy RC-ra jutó, külső fénybegyűjtő komplexek

(LHC) mennyisége, ezáltal megváltozik az adott fotokémiai rendszer abszorpciós

hatáskeresztmetszete. Egy másik, hosszútávú akklimatizációs módosulás a PSI és PSII

arányának változása, és a PSII RC-ok szubpopulációjának inaktiválódása (Anderson et al.,

1988; Melis, 1991). Például az erdő lombkoronája által megszűrt fényben (több távoli vörös

fény) nőtt árnyéknövények nagyobb PSII/PSI aránnyal bírnak, ezzel kompenzálva a vörös

fény kisebb mennyiségét, mely a PSII gerjesztéséhez szükséges (Anderson & Osmond, 2001).

13

A rövidtávú adaptációk, melyeket génexpresszió változások nem kísérnek,

másodperceken és perceken belül mennek végbe, és semlegesítik a fényviszonyok gyors

változásainak hatásait, úgymint a diurnális változások a fény mennyiségében és minőségében,

az időjárás által előidézett pillanatnyi fluktuációk, és a lombozat általi fényszűrés (Anderson

& Osmond, 2001). A legjobban dokumentált adaptáció, amely “state” átmenetként (qT) ismert

(Bonaventura & Mayers, 1969), perces időskálán mozog, működése alacsony/közepes

fényintenzitások mellett hatékony, pl. akkor, amikor a fényintenzitás nem limitálja a

fotoszintézist (Horton & Hague, 1988). A plasztokinon (PQ) készlet (Horton, 1981; Allen et

al., 1981) és a Cyt b (Gal et al., 1987) redoxállapotai mintegy szenzorként/jelátalakítóként

működnek és egy protein kináz aktivációjában vesznek részt (Bennett, 1977; 1979). A PSII-

nek a PSI-hez képest mutatkozó viszonylagos túlgerjesztése során ez a kináz néhány LHCII

komplexet foszforiál (ún. mobil LHCII) (Mullet, 1983), melyek ledisszociálnak a PSII-ről,

csökkentve az antenna tényleges méretét, és az elnyelt energiát a PSI felé továbbítják.

A PSII hatékonyságának szabályozása (Weiss & Berry, 1987; Genty et al., 1989)

reverzibilisen, nem-lineárisan függ a fényintenzitástól, holott a nyitott RC-ok száma és a PSII

hatásfoka között lineáris összefüggést feltételeztek. A linearitástól való eltérés legésszerűbb

magyarázata az, hogy a PSII antennában megnyílik egy csatorna, mely a többlet gerjesztési

energia disszipációját lehetővé teszi. Ez Chl fluoreszcencia mérésekkel, az ún. fluoreszcencia

kioltás analízis módszerével nyomonkövethető, pl. pulzus amplitudó modulációs (PAM)

technikával (Schreiber, 1986). Az analízis egyik paramétere, az NPQ, a többlet energia

disszipációjának nagyságát méri a PSII-ben zárt RC-ok esetében. A PSII hatásfoka fordított

lineáris összefüggést mutatott az NPQ-val (Genty et al., 1989). Eszerint a PSII hatásfokát egy

nem-radiatív energia disszipáció, NPQ-alapú folyamat kontrollálhatja, melyet a tilakoid

membránon keresztül felépülő proton gradiens (ΔpH) vált ki (Oxborough & Horton, 1988).

2.1.4. A nem-fotokémiai kioltás és lokalizációja magasabbrendű növényekben

Többlet fényenergia elnyelése esetén a csökkent fotokémiai kioltás a szingulett gerjesztett

Chla (1Chla*) életidejének és a triplett Chla (3Chla*) keletkezés valószínűségének

megnövekedéséhez vezet a spinváltó átmenet során. A 3Chla* reakcióba lép az alapállapotban

triplett oxigénnel (3O2) és reaktív oxigén formákat hoz létre, amelyek elősegíthetik a

14

fotoinhibíció és az oxidatív stressz kialakulását (Barber & Andersson, 1992). E károsító

folyamatok ellensúlyozására fotoprotekciós mechanizmusok inicializálódnak, melyek

eliminálják a reaktív oxigén formákat (Asada, 1999) vagy a 1Chla* disszipációján keresztül

megakadályozzák ezek létrejöttét (Niyogi, 2000; Külheim et al., 2002). Ez utóbbit a Chla

fluoreszcencia fényfüggő, nem-fotokémiai kioltásaként definiáljuk.

Általában az NPQ-t technikailag három kompenensre osztják a relaxációs kinetikáikat

alapul véve: a relaxáció gyors (qE), közepes (qT), és lassú (qI) fázisai szerint (Horton &

Hague, 1988), melyek az energiafüggő kioltásnak, a “state” átmenetnek, és a fotoinhibíciós

kioltásnak tudhatók be (Quick & Stitt, 1989). Az első komponens, a visszacsatolásos

gerjesztési energia lecsengetés (qE) reverzibilis, gyorsan aktiválódik a növekvő

fényintenzitással, és gyorsan, tíz perc, relaxálódik a sötétben, amely mind közül a legjobban

tanulmányozott folyamat. E folyamat lehetővé teszi a többlet gerjesztési energia hőként való

disszipációját, ezáltal védelmet nyújtva a fotoszintetikus pigmentek, fehérjék és lipidek

fotooxidációja és károsodása ellen, mely folyamat különben a fotoszintézis

fotoinhibícióját/fotoinaktivációját okozhatná, illetve, mely folyamat a növények

produktivitására, fitneszére jelentős befolyással bír természetes körülmények között

(Krivosheeva et al., 1996; Ögren & Rosenqvist, 1992; Ögren & Sjöström, 1990). A kioltás e

típusa egy finoman szabályozott folyamat, amelyben a fő szabályozó tényezők a kloroplasztisz

tilakoid membránon keresztül kiépülő proton gradiens (ΔpH) (Wraight & Crofts, 1970;

Briantais et al., 1979), a xantofill ciklus, azaz a violaxantin (Vio) konverziója anteraxantinná

(Ant) és zeaxantinná (Zea) (Demmig et al., 1987; Demmig-Adams, 1990; Demmig-Adams &

Adams, 1992; Niyogi et al., 1997), és a PsbS fehérje, amely a két, lumen felőli protonálható

csoportja (E122 és E226) révén érzékeli az alacsony lumenális pH-t (Funk et al., 1995; Li et

al., 2000; 2004; Niyogi et al., 2005). Chlb illetve Lhc fehérje hiányos mutánsok, vagy

olyanok, melyekben módosult a PSII antenna struktúra szerveződése, erőteljes NPQ

csökkenést mutatnak, amely bizonyítja az antenna fehérjék szerepét az NPQ aktiválásában

(Briantais, 1994; Kovács et al., 2006; de Bianchi et al., 2008).

Az NPQ tényleges molekuláris mechanizmusa nem ismert, jóllehet számos hipotézis és

feltételezett kioltó (quencher) létezik: energia transzfer Chl-ról Zea-ra az LHCII-ben (Frank et

al., 2000); elektrontranszfer egy karotinoidról Chl-ra létrehozván egy Zea-Chl vagy lutein

(Lut)-Chl töltés transzfer állapotot (Holt et al., 2005; Avenson et al., 2009); direkt vagy

15

indirekt kioltás a PsbS fehérje által (Li et al., 2000; Niyogi et al., 2005); energia transzfer Chl-

ról Lut-re az LHCII-ben (Horton et al., 1991; Ruban et al., 2007) az LHCII aggregáció vagy

konformáció változásához kapcsolódva; valamint az LHCII aggregációja által kialakult távoli

vörös fényt kibocsátó kioltó Chl-Chl töltés transzfer állapot (Miloslavina et al., 2008).

Egyesek feltételezik a PSII RC kioltás meglétét (Finazzi et al., 2004; Ivanov et al., 2008), amit

a Zea-független kioltás egy további típusaként tartanak számon. Néhányan úgy vélik, hogy a

Lut általi kioltás a Zea-függő kioltás kiegészítőjeként funkcionálhat (Niyogi et al., 2001; Li et

al., 2009). Johnson és munkatársai (2009) munkája azt az elképzelést támogatja, hogy mind a

Zea-független, mind a Zea-függő kioltás a PsbS-függő mechanizmusból ered, amelyet a Zea

modulál (Crouchman et al., 2006).

Míg a gyorsan relaxálódó qE jól jellemzett, a lassabb qT és qI fázisok még mindig

vitatottak, és gyanítják, hogy talán több, mint egy mechanizmus is hozzájárulhat a

kialakulásukhoz. A qI-t hagyományosan a PSII fotoinhibíciójának tulajdonították (Somersalo

& Krause, 1988), mely összefüggésben van a fotokémiai rendszer koordinált degradációjával

és helyreállításával (Powles & Björkman, 1982; Kyle, 1987; Krause, 1988; Aro et al., 1993;

Long et al., 1994; Murata et al., 2007). Később széles körben elfogadottá vált, hogy a legtöbb

esetben a fotoinhibíció alacsony mértékű, és a qI a qE-hez hasonlóan a gerjesztési energia

hődisszipációjából származik. Különböző hipotézisekkel próbáltak magyarázatot találni a qI

látszólagos irreverzibilitására: tartós transzmembrán ΔpH (Gilmore & Yamamoto, 1992),

stabil fehérje protonáció (Horton et al. 1994), inaktív PSII RC-ok felhalmozódása (Briantais et

al., 1992; Schansker & van Rensen, 1999), vagy a Zea stabil kötődése a CP29 proteinhez

(Färber et al., 1997).

A qT komponens “state” átmenettel való kapcsolatát néhányan szintén

megkérdőjelezik, és manapság úgy vélik, hogy a PSI-ről PSII-re történő, az energia

újraeloszlása magas fényintenzitás esetén elhanyagolható (Walters & Horton, 1991; 1993),

illetve a qT-nek más eredetet feltételeznek (Schansker et al., 2006).

Az NPQ mechanizmusát tekintve számos ellentmondásos bizonyíték létezik. Még

tisztázásra vár, hogy vajon a fényindukált, reverzibilis NPQ a de-excitáció egyetlen

mechanizmusát képviseli-e egyetlen helyen, melyet a PsbS és a Zea kombinált működése idéz

elő (Johnson et al., 2009), vagy több párhuzamos és nagyrészt független mechanizmust foglal

magában, melyek a PSII antenna különböző részein működnek. Különböző antenna

16

komplexek szisztematikus eliminációja az NPQ kapacitás csökkenéséhez vezet (Andersson et

al., 2001; 2003; Kovács et al., 2006), jóllehet az NPQ még a megszakított (intermittent) fény

körülmények mellett nevelt, Chlb hiányos mutáns növényekben sem tűnt el egészen, amikor

csupán a PSII “core” komplex felhalmozódása figyelhető meg (Härtel & Lokstein, 1995;

Härtel et al., 1996). Egy újabb modell szerint az NPQ-nak legalább három független

mechanizmusa vagy helye létezik (Lambrev et al., 2010). Betterle és munkatársai (2009)

feltételezik, hogy egy antenna hetero-oligomer fényindukált disszociációja szükséges az NPQ

kialakulásához, mely két monomer Lhcb fehérjét (CP29 és CP24) és a trimer LHCII-M

(közepesen kötött, M) komplexet tartalmazza.

Általánosan az a nézet terjedt el, hogy az NPQ az LHCII-ben lokalizálódik (Horton et

al., 1996). Ezt támasztják alá a következő megfigyelések: a kioltás összefüggésben van az

antenna fluoreszcencia szignifikáns csökkenésével, miközben valamennyi RC nyitott

állapotban van (Fo) (Horton & Ruban, 1993), amely folyamat 77K hőmérsékleten tovább tart,

és az LHCII-ből származó kioltott fluoreszcencia sávokkal van kapcsolatban (Ruban et al.,

1991); leveleken mért időfelbontásos fluoreszcencia adatok is alátámasztják az antennában

végbemenő kioltást (Genty et al., 1992); hőemisszió direkt mérésével NPQ körülmények

mellett kimutatták, hogy ez 1,4 μs-on belül megy végbe, mely sokkal gyorsabb, mint a PSII-

ben bekövetkező rekombinációs folyamatok becsült sebessége (Mullineaux et al., 1994);

keresztkötő vegyületek blokkolják az NPQ-t, valamint az izolált LHCII komplexek

átszerveződését, ami elősegíti a hődisszipáció kialakulását (Ilioaia et al., 2008); az NPQ és az

LHCII azonos módon reagál számos tényező esetében: antimicin A, tercier aminok és

magnézium ionok hatására (Noctor et al., 1993; Ruban et al., 1994); az NPQ igen

nagymértékben függ a kizárólagosan LHCII-kötött xantofilloktól, a Lut-től és a Zea-tól

(Ruban et al., 1994; Niyogi et al., 2001). Horton és munkatársai (2005) hipotézise szerint az

LHCII-ben lokalizálódó qE Chl-Chl és/vagy xantofill/Chl kölcsönhatásokat foglal magában. E

modell az LHCII négy különböző strukturális/funkcionális állapotát írja le – nem-protonált és

protonált állapotok, Vio vagy Zea kötődése mellett. E jelenlegi aggregációs modell állítása

szerint az NPQ a PSII antenna makrostruktúrájától függ, semmint egyetlen fehérjétől. Az

LHCII fehérjék egzakt szupramolekuláris rendezettsége mintegy előfeltétele lehet az

energiafüggő kioltásnak. A xantofill ciklus pigmentek nagyobb része inkább gyengén kötődhet

a trimer LHCII-höz. A xantofill ciklus karotinoidokat allosztérikus szabályozóknak vélik,

17

melyek a fénybegyűjtő komplexek periferiális allosztérikus oldalaihoz kötődnek (L2, V1

helyek) (Horton et al., 2005).

2.1.5. A xantofillok szerepe a hődisszipáció folyamatában, a xantofill ciklus-függő és független

nem-fotokémiai kioltás

A PSII antenna egy magasan szervezett, dinamikusan működő rendszer, mely képes a RC-hoz

érkező gerjesztés mennyiségét összehangolni a fiziológiai szükséglettel (Horton et al., 1996).

Az energiaáramlás szabályozása a többlet gerjesztés hődisszipációján keresztül valósul meg a

PSII antennájában. Az in vivo kialakuló maximális qE kapcsolatban van az epoxi-xantofill

violaxantin anteraxantinon keresztüli zeaxantinná való enzimatikus de-epoxidációjával a

xantofill ciklus működése során (3. ábra) (Demmig-Adams, 1990). A fotokonvertibilis

xantofill ciklus pigmentek legnagyobb része a trimer LHCII-höz kapcsolódik a külső V1

kötőhelyen (Ruban et al., 1999; 2002a; Caffarri et al., 2001; Liu et al., 2004). A trimer LHCII

két, más típusú xantofillt is köt internálisan: két luteint az L1 és L2 helyeken és egy neoxantint

az N1 helyen (Liu et al., 2004).

Úgy tartják, két eltérő kioltási mechanizmus létezik, az egyikben (I. típus) a Zea, a

másikban (II. típus) a Lut a közreműködő. Úgy gondolták, hogy az I. típusú mechanizmusban

a qE obligát módon függ a Zea-tól, mely mintegy a gerjesztett Chl kioltójaként működik a

töltés transzfer állapot kialakulása során. Az I. típus meglétére az a megfigyelés szolgált

bizonyítékul, hogy egy, kb. 1000 nm-nél elnyelő, karotinoid gyök kation kialakulása

kölcsönös össszefüggést mutatott a qE mértékével (Holt et al., 2005). Újabban úgy tartják,

hogy a Zea gyök kation kialakulása kizárólagosan a minor antenna komplexek L2 kötőhelyén

megy végbe (Ahn et al., 2008; Avenson et al., 2008), a kioltáshoz így a Zea reverzibilis

beillesztése szükséges ebbe a belső környezetbe. Mivel úgy találták, hogy e kation igen

csekély mértékben hat a minor antenna komplexek gerjesztett-állapot életidejére, felmerült az,

hogy in vivo a komplexek nagyszámban vehetik fel azt a konformációt a ΔpH kialakulásának

eredményeként, amelyben ez a kation képes kialakulni (Avenson et al., 2008). Igazolták

továbbá azt is, hogy a Zea gyök kation a trimer LHCII-ben is létrejöhet (Amarie et al., 2007).

Mivel azonban a Chla gerjesztett-állapot életidejére ez a hatás igen csekélynek bizonyult, arra

18

jutottak, hogy az I. típusú mechanizmus nem lehet felelős a qE kialakulásáért (Amarie et al.,

2007; Dreuw & Wormit, 2008).

3. ábra A xantofill ciklus komponensei. A fotokémiai telítési fényintenzitást meghaladó erősségű megvilágítás hatására a de-epoxidáz enzim működésbe lép és két lépésben eltávolítja a lánc végi oxigén atomokat, ezáltal megnövelve a konjugált kettős kötések számát (9-ről 11-re). A de-epoxidáció percek alatt lezajlik, míg a fordított irányú folyamat (epoxidáció) ennél lassab, több percet, esetleg órát vesz igénybe.

A II. típusú mechanizmus esetében a qE az LHCII fehérjék egy belső sajátsága; a

fehérje konformációjának változása módosítja a kötött pigmentek konfigurációját, valamint az

L1 helyen kötött xantofill (rendes körülmények között Lut) hatékony kioltóvá válását

19

eredményezi (Ruban et al., 2007; Ilioaia et al., 2008). A II. típusú mechanizmus létezése a

trimer LHCII aggregátumok tanulmányozása révén nyert bizonyságot (Ruban et al., 2007),

melynek folyamán arra a következtetésre jutottak, hogy az energia disszipáció a Chla-ról az

L1 helyen kötődő Lut felé történő energiatranszferrel valósul meg. Ez a kioltási mechanizmus

olyan mértékben csökkenti a Chla gerjesztett-állapot életidejét, mely teljes egészében

magyarázatul szolgálhat a qE-re in vivo. Egy másik LHCII kötött xantofill (neoxantin)

konformációjában bekövetkező változás kölcsönösen összefügg a kioltás mértékével. Ez a

konformáció változás olyan sebességgel megy végbe in vivo, amely a qE nagyságával

korrelációt mutat. A Horton és munkatársai (1991; 2005) által javasolt II. típusú kioltási

modellben a Zea nem kioltóként, hanem mintegy allosztérikus regulátor működik, amely e

belső LHCII kioltási folyamat ΔpH érzékenységét szabályozza.

Habár az I. és II. típusú mechanizmusok az LHCII-n belül eltérő helyeken található

xantofillokat foglalnak magukban, hasonlóságok is vannak közöttük: úgy hiszik, mindkét

folyamat magában foglal egy ΔpH által kiváltott, PsbS fehérje által mediált konformáció

változást (Ruban et al., 2007; Ahn et al., 2008). Valószínűleg mindkét mechanizmus

hozzájárulhat az in vivo qE kialakulásához, mivel a folyamat végbemegy mind Zea

jelenlétében, mind hiányában (Adams et al., 1990; Crouchman et al., 2006). A sötétadaptált

levelek megvilágítása során kialakuló NPQ kinetikája két komponensből áll: az első gyorsan

kialakul és Zea független; a második, lassabb komponens korrelál a Vio de-epoxidációval és

ezért Zea-függőnek mondhatjuk (Adams et al., 1990; Ruban & Horton, 1999). Az NPQ

mindkét komponense qE típusú: gyorsan relaxálódnak a sötétben (Adams et al., 1990),

mindkettő függ a PsbS-től (Li et al., 2000), és mindkettőt fokozza a PsbS túlexpressziója (Li et

al., 2002b; Crouchman et al., 2006).

Az 535 nm-en mért abszorbció változásról (ΔA535) úgy tartják, hogy a PSII antennában

végbemenő konformáció változásból ered, mely a kioltott állapot kialakulását kíséri (Ruban et

al., 1993b; Bilger & Björkman, 1994). Johnson és munkatársai (2009) úgy találták, a ΔA535

érzékeny mind a monomer minor, mind a trimer LHCII fehérjék elvesztésére. Tehát a ΔA535

összefüggést mutatott mind a Zea-függő, mind a Zea-független qE komponensekkel, ez

utóbbiban a rövidebb hullámhosszak felé való elmozdulásban a xantofillok részvétele

tükröződik. Ezek az eredmények (Johnson et al., 2009) a korábbiakkal együtt, bizonyítani

látszanak a Lut fontosságát a maximális, teljes qE kialakulásában (Pogson et al., 1998; Pogson

20

& Rissler, 2000). Feltételezik, hogy a Lut hiányában a PSII antennafehérjék szerkezetében

bekövetkező destabilizáció (Lokstein et al., 2002; Havaux et al., 2004), az egyes monomerek

szintjén, hátrányosan befolyásolja a kioltott állapot kialakulásához vezető konformáció

változások létrejöttét. Az npq2 és lut2npq2 mutáns Arabidopsis thaliana (A. thaliana)

növényekben a Zea konstitutív jelenléte a ΔA535 amplitudójának növekedését eredményezte,

miközben lut2npq2 mutánsokban ezt a növekményt a qE csökkenése kísérte (Johnson et al.,

2009). Ez az eredmény, egyetértésben mások megfigyelésével (Kalituho et al., 2006), arra

enged következtetni hogy az abszorpció változás nem tükrözi közvetlenül egy kioltó molekula

kialakulását. Ezért a ΔA535 abszorpció változásról Johnson és munkatársai (2009) úgy tartják,

hogy az azokat a szerkezeti változásokat jeleníti meg, melyek összefüggésben vannak a qE

Zea általi felerősödésével. Igazoltnak látszik tehát, hogy mind a Zea-független, mind a Zea-

függő qE komponens egyazon mechanizmusból származik a PSII antennájában. Mindkettő

preferenciálisan az LHCII fluoreszcencia emmissziós sávokat oltja ki (Ruban et al., 1991),

valamint mindkét qE komponens amplitudója kisebb volt Lut hiányában (Pogson et al., 1998;

Niyogi et al., 2001). A monomer minor és a trimer LHCII fehérje-összetétel módosítása

befolyással bír mindkét mechanizmusra, és mindkét folyamatot konformáció változások

kísérték, melyek hatására nagyon hasonló abszorpció változásokat tapasztaltak a Soret

régióban (Johnson et al., 2009). Úgy hiszik, hogy ezek a megfigyelések megfelelnek a II.

típusú mechanizmusnak, amely magában foglalja az LHCII konformáció változása által

aktivált L1 helyen kötődő xantofillt, mely változás a neoxantin eltorzulásához vezet (Ruban et

al., 2007), valamint a V1 hely de-epoxidációs állapota ezt mintegy allosztérikusan szabályozza

(Horton et al., 2005). Ez a folyamat feltételezések szerint néhány vagy minden Lhcb tartalmú

antennakomplexben bekövetkezhet (Ruban et al., 1996; Mozzo et al., 2008). Johnson és

munkatársai (2009) lehetséges alternatívája értelmében az I. típusú mechanizmus előfordulhat

mind a trimer LHCII, mind a monomer minor antennában, illetve a Zea hiányában a Lut

kation foglalhatja el a helyét kioltóként.

2.1.6. A PsbS fehérje szerepe a hődisszipáció folyamatában

A sejtmagi npq4 gén által kódolt PsbS fehérje egy 22 kDa tömegű PSII alegység, amely a

fénybegyűjtő komplex család tagja, és ami Zea-kötő tulajdonsággal is rendelkezik (Jansson,

21

1999). A PsbS fehérjének, a legtöbb LHC fehérjétől eltérően, melyek három transzmembrán

hélixet tartalmaznak, négy transzmembrán hélixe van, valamint pigmentkötő tulajdonságai is

eltérnek más LHC fehérjékétől.

Az npq4 deléciós mutáns A. thaliana növényekben a PsbS fehérje teljesen hiányzik.

Ezekben a mutánsokban a qE nem alakul ki 5-10 perc megvilágítás után, azonkívül a

jellegzetes ΔA535 szintén hiányzott e mutánsokból (Li et al., 2000; Ruban et al., 2002b). E

növények megnövekedett fényérzékenységét fotoinhibíciós körülmények között (Li et al.,

2002a), valamint csökkent növekedésüket és magprodukciójukat (Külheim et al., 2002) a qE

látszólagos hiányának tudták be.

A PsbS fehérjéről feltételezték, hogy a tilakoid membránban, a qE kialakulásának

helyén kulcsfontosságú, fotoprotektív szerepet tölt be (Li et al., 2000; 2004), később pedig azt,

hogy mind a ΔpH érzékelőjeként (Dominici et al., 2002; Li et al., 2004), mind a vélelmezett

karotinoid Zea kioltó kötőhelyeként működik (Li et al., 2004). Azonban ez a teória később

megkérdőjeleződött, mivel a PsbS protein Zea hiányában is betöltötte funkcióját (Crouchman

et al., 2006), és a rekonstituált fehérje nem kötött semmilyen pigmentet (Dominici et al., 2002;

Bonente et al., 2008). Az npq4 A. thaliana mutánsok levelein és izolált kloroplasztiszain

végzett kísérletek alapján Horton és munkatársai (2000) azt az alternatív magyarázatot

javasolták, hogy a PsbS fehérje indirekt módon, mintegy a konformáció változások

modulátoraként működik, előidézve az LHCII-n belüli kioltást. Egyesek azt feltételezik, hogy

a ΔpH kialakulásának következtében a PsbS oligomerizációs állapota megváltozhat és ezáltal

áthelyeződhet a tilakoid membránban (Bergantino et al., 2003; Teardo et al., 2007). Mások

szerint a PsbS hatással lehet a tilakoid membrán dinamikára, összefüggésben a gránum

szerkezet kialakulásával (“stacking”) és a PSII-LHCII komplexek makroorganizációjával

(Kiss et al., 2008; Betterle et al., 2009). Tehát az elmúlt évek kutatásai alapján úgy tűnik, a

PsbS fehérje szerepet játszhat a ΔpH-érzékeny NPQ beindításában, lehetővé téve egy vagy

több LHCII antennafehérje szerkezeti változását, amely az NPQ állapot indukciójához

szükséges (Horton et al., 2000; 2008; Dominici et al., 2002; Teardo et al., 2007; Kiss et al.,

2008; Betterle et al., 2009; Johnson et al., 2009). Legújabban Johnson és Ruban (2010)

kimutatták, hogy az npq4 növények kompetens fotoprotektív energia disszipációs

mechanizmussal bírnak, azonban ez jóval lassabban alakul ki és relaxálódik, mint a vad

típusban. E mutánsok leveleiben a meghosszabbított megvilágítás/sötétség hatására a vad

22

típushoz rendkívül hasonló változásokat figyeltek meg a kulcs fluoreszcencia kioltási

paraméterek és a ΔA535 abszorpció változás tekintetében. Ezenfelül mások úgy találták, hogy

az NPQ kialakulását és relaxációját a PsbS meggyorsítja a túlexpresszáló vonalakban a vad

típushoz képest (Crouchman et al., 2006). Kimutatták, hogy a ΔA535, mely a vörös-eltolódott

Zea szubpopuláció kialakulásából származik az NPQ alatt (Ruban et al., 1993a; 2002), nem

igényel PsbS-t. A Zea szubpopuláció lehetséges eredete azonban ma még egy nyitott kérdés.

Johnson és Ruban (2010) kutatási eredményei rávilágítottak arra, hogy a kioltó nem a PsbS-en

lokalizálódik; az NPQ a fehérje hiányában is kialakul, ekképpen a ΔpH-t a tilakoid membrán

még mindig érzékeli, valószínűleg bizonyos LHCII fehérjék savas csoportjai által, melyeket

diciklohexilkarbodiimid kötőhelyekként azonosítottak (Walters et al., 1994; 1996). Ezek

szintén azt a nézetet támogatják, mely szerint az LHCII és/vagy a minor antenna fehérjék az

NPQ helyeként funkcionálhatnak (Ruban et al., 2007; Ahn et al., 2008). A PsbS fehérje qE

kialakulásában betöltött kinetikai szerepének pontos mechanizmusa jelenleg még nem ismert.

Johnson és Ruban (2010) az npq4 növényekben a megváltozott NPQ kinetika elsődleges

okának a rigidebb és kevésbé flexibilis PSII makroorganizációját (Kiss et al., 2008; Betterle et

al., 2009) tekintik, mely támogatja azt az elképzelést, hogy a PsbS egy dimanikai szerepet

játszik a tilakoid membrán szerveződésében (Teardo et al., 2007). E nézet szerint a PsbS

lokalizációja megváltozhat az NPQ állapotban, előidézvén bizonyos obligát változást a PSII

makroorganizációjában (Betterle et al., 2009), mely ellenkező esetben inkább lassú lenne;

avagy a PsbS mintegy vektor működhet, amely a protonokat az LHCII fehérjék felületén

koncentrálja, ezzel elősegítve azok NPQ állapotba való gyors átkapcsolását.

2.2. A vízdeficit hatása a magasabbrendű növények fotoszintézisére

2.2.1. A vízhiány fokozatainak jellemzése, a sztomatikus és a nem-sztomatikus limitáció

értelmezése

A növények életük során gyakran ki vannak téve a szárazságnak, ami az alacsony

talajvíztartalom vagy az atmoszférikus vízhiány következménye. A fotoszintézis valamint a

sejtnövekedés azok közé a folyamatok közé tartoznak, amelyek a szárazság által elsődlegesen

érintettek (Chaves, 1991). A szárazság hatásai lehetnek közvetlenek, mint például a sztómákon

23

vagy a mezofillumon keresztüli diffúzió limitációja, amely csökkenti a széndioxid

elérhetőségét (Flexas et al., 2004; 2007), vagy a fotoszintetikus metabolizmus módosulása

(Lawlor & Cornic, 2002), avagy mint másodlagos hatások jelentkezhetnek oxidatív stresszként

(Chaves & Oliveira, 2004). Ez utóbbi a többszörös stresszkörülmények alatt javarészt

bekövetkezik (Chaves & Oliveira, 2004) és súlyosan befolyásolhatja a fotoszintézist (Ort,

2001).

A gázcserenyílások záródása figyelhető meg a levelek turgorának csökkenésekor, az

atmoszférában a relatív páratartalom csökkenése esetén, vagy a gyökér által termelt kémiai

jelmolekulák hatására. Az atmoszférikus széndioxidnak a kloroplasztisz sztrómába, vagyis a

fotoszintézis helyére való bejutásának számos limitáló faktora van (sztomatikus és nem-

sztomatikus limitáció). A CO2 először a külső környezetből a levelek sejtközötti járataiba

diffundál a sztómákon keresztül, melyek nyitottsága szabályozza a légudvarba jutó CO2

mennyiségét (Farquhar & Sharkey, 1982; Assmann et al., 1988). A gázcserenyílások e

szabályozó szerepét sztomatikus limitációnak nevezzük. A sztomatikus limitáció relatív

mértéke a vízdeficit erősségétől függ. Enyhe szárazság alatt a sztómazáródás az első lépés,

amelyet szükségszerűen a fotoszintetikus széndioxid asszimiláció csökkenése követ (Chaves,

1991; Cornic & Briantais, 1991). Enyhe stressz esetén az alacsony sztóma vezetőképességnek

(gs) protektív hatásía lehet, elősegítve a vízmegőrzést és növelve ezzel a növény

vízhasznosítási képességét. Rendszerint a sztómák válaszreakciói szorosabb összefüggést

mutatnak a talaj nedvességtartalmának mint a levél vízállapotának megváltozásával. Ezek

alapján feltételezik, hogy a sztómák reagálnak a dehidratált gyökerek produktumaira (pl. az

abszcizinsav), mint kémiai jelmolekulákra (Davies & Zang, 1991). Lawlor (2002) kutatásai

szerint a növényi sejtek szénmetabolizmusának megváltozása valószínűleg szintén előfordul a

dehidráció korai szakaszában. A szárazságtűrő fajok a sztómaműködésük szabályozása révén

bizonyos mértékű szén-asszimilációt képesek fenntartani szárazság alatt, vagy a vízhiány

megszűntekor gyorsan nyitják sztómáikat. A vízdeficit korai biokémiai hatásai magukban

foglalják a fotofoszforilációban bekövetkező változásokat (az ATP mennyiségének

csökkenése a ribulóz 1,5-biszfoszfát (RuBP) regenerációjának csökkenéséhez vezet) (Tezara

et al., 1999), amelynek mértéke fajfüggő (Lawlor & Cornic, 2002).

Ahogyan a sztómák záródnak, a CO2 moláris frakciója csökken a levelek

kloroplasztiszaiban. Ezáltal a ribulóz 1,5-biszfoszfát karboxiláz oxigenáz (Rubisco) enzim

24

CO2 ellátása meggyengül, amelynek következményeként a C3 típusú növények RuBP

oxigenációja emelkedik és a fotoszintetikus elektronok fő fogyasztójává válik. Megfigyelték a

fotoszintetikus aktivitás csökkenését magas fényintenzitás és hőmérséklet mellet, és vízhiány

hatására az energia disszipáció mértékének fokozódását a fotoszintetikus apparátusban. Az ún.

nem-sztomatikus limitáció elemei közé tartozik a mezofillum limitáció. A mezofill

konduktancia (gm) (Flexas et al., 2004; 2007) megváltozása kapcsolatban lehet a sejtközötti

járatok szerkezetének fizikai módosulásával a levél fonnyadásakor (Lawlor & Cornic, 2002),

vagy a biokémiai változásokkal (bikarbonát → CO2 konverzió), és/vagy a membrán

permeabilitással (akvaporinok). Genty és munkatársai (1998) kutatásai azonban arra

világítottak rá, hogy a CO2 diffúzióval szembeni internális rezisztencia javarésze a sejteken

belüli folyadékfázisban található. Ezt a nézetet támogatják mások is (Flexas et al., 2006;

2008), a gm ezek alapján inkább biokémiailag szabályozott, semmint egyszerűen a levél

anatómiai tulajdonságai által. Vízmegvonásos kísérletekkel demonstrálták, hogy a CO2

asszimiláció intenzitásának szignifikáns csökkenése a számottevően megnövekedett

metabolikus limitációnak, semmint a sztómalimitációnak tudható be (Lawlor, 2002; Flexas et

al., 2006). A lecsökkent fotoszintetikus elektron felhasználás egy közvetlen következménye

annak, hogy a szárazság az elérhető CO2 mennyiségének csökkenését idézi elő, ill. növeli

egyéb alternatív elektrontranszport utak kialakulásának valószínűségét, úgymint a

fotorespiráció és a Mehler-reakció (Cornic & Freseau, 2002). A metabolikus limitáció

biofizikai és biokémiai folyamatok következménye, melyek működése C3 növényekben

bizonyos mértékben tisztázott (Lawlor, 2002; Flexas et al., 2006). A Rubisco tartalmának

(Tezara et al., 2002) és aktivitásának (Tenhunen et al., 1984) megváltozását; az ATP

lecsökkent szintézisét ill. a RuBP regenerációjának csökkenését (Flexas & Medrano, 2002); a

klorofill tartalom lecsökkenését ill. az alacsonyabb fotokémiai hatásfokot (Ögren & Öquist,

1985; da Silva & Arrabaça, 2004; Flexas et al., 2006) a metabolikus limitáció elemeinek

tekintik.

Tartós stresszkörülmények alatt megfigyelhető a Rubisco enzim deaktivációja alacsony

intercelluláris CO2 koncentráció (Ci) esetén (Meyer & Genty, 1998). Amikor a szárazság

mellett a növényeket egyéb stresszhatások is érik, úgymint magas fényintenzitás és

hőmérséklet, valószínűsíthető a fotoinhibíció bekövetkezése is. A CO2 megkötést limitáló

körülmények között a redukáló erők keletkezése gyorsabb, mint azok Calvin ciklus általi

25

felhasználása. A hosszantartó száraz periódus alatt a levél víztartalma lényegesen visszaesett

borsó növényekben, ami a PSII “core” komplexek mennyiségének jelentős csökkenéséhez

vezetett. A megmaradó PSII komplexek funkcionálisan működőképesnek bizonyultak, illetve

újraszerveződtek. A vizsgálatok alapján a CP43 komplex valamint a D1 protein fokozottan

degradálódtak szárazság alatt (Girardi et al., 1996). Mások is alátámasztják ezt a megfigyelést,

miszerint a nagyobb PSII fehérjék egyensúlyi szintje, beleértve a D1 és a D2 proteineket, a

szárazság előrehaladtával csökken, ami feltehetőleg a megnövekedett degradációnak

köszönhető. A vízdeficitnek a PSII proteinek metabolizmusára gyakorolt hatása indokolhatja,

különösképpen a RC fehérjék esetében, a PSII fotokémiájának károsodását (He et al., 1995).

Továbbá kimutatták, hogy a vízmegvonás hatására nagyobb mértékben emelkedik a PSII-β

inaktív centrumok mennyisége a szárazságra érzékeny borsó változatokban, mint a szárazságra

toleránsakban (Yordanov et al., 1997; Gonzales et al., 2001). A membránlipideknek

kulcsfontosságú szerepük van a növényi sejtek szintjén a rezisztencia kialakulásában a

különféle környezeti faktorokhoz történő akklimatizáció során (Kuiper, 1980; Suss &

Yordanov, 1986). Erős vízhiány esetén zavart szenved a membránlipidek és proteinek közötti

asszociáció, valamint enzimaktivitás csökkenés és a membrán kettősréteg transzport

kapacitásának csökkenése tapasztalható (Caldwell & Whitman, 1987). A szárazságra érzékeny

növényekben számottevően nagyobbnak bizonyult a zsírsavbontás stimulációja, mint a

szárazságra toleránsabb változatokban (Sahsah et al., 1998). A neutrális lipidek

mennyiségének csökkenése a levélben főként a monogalaktozil-diacil-glicerol (MGDG)

tartalom csökkenésének köszönhető, és az MGDG/digalaktozil-diacil-glicerol (DGDG) arány

ugyancsak lecsökkent (Benhassaine-Kesri et al., 2002).

2.2.2. A védekező/szabályozó folyamatok szerepe a vízhiány kivédésében

A növények számos protektív mechanizmust fejlesztettek ki fotoszintetikus apparátusuk

védelme érdekében a környezeti faktorok károsító hatásaival szemben. Bohnert és Shen (1999)

kutatásai szerint csaknem univerzális válaszreakciónak tekinthető stresszkörülmények alatt,

beleértve a szárazságot is, az ozmotikus szabályozás révén különféle kompatibilis

ozmotikumok felhalmozása. Az ozmoreguláció a növény számára kedvezőbb vízpotenciál

grádiens kialakulását teszi lehetővé, ezáltal hozzájárul a sejt turgorának fenntartásához (Zhang

26

et al., 1999). Így a vízhiány bizonyos mértékig elkerülhető vagy jelentős mértékben

csökkenthető. Ezek a vegyületek főként alkilaminok vagy polihidroxil vegyületek, valamint

szacharidok és ezek polihidroxil származékai. A stresszfiziológiában általánosan elfogadott

szerepük az ozmoreguláció, ezen kívül más funkcióval is rendelkezhetnek, nevezetesen az

enzimek és a membránszerkezet védelmét biztosítják, valamint a reaktív oxigén gyökök

eliminálásában is részt vehetnek.

Szárazság alatt a többlet redukáló erő elleni fotoprotektív mechanizmusok igen

fontosak. Ezek a fotokémiával versengenek az elnyelt energiáért, amely a PSII hatásfokának

csökkenéséhez vezet (Genty et al., 1989). Az egyik legfontosabb fotoprotektív mechanizmus a

növényekben, hogy elkerüljék vagy csökkentsék a fotoszintetikus apparátusuk károsodását, a

klorofill fluoreszcencia nem-fotokémiai kioltása (Ruban & Horton, 1995), melynek során a

gerjesztési többletenergia hőként disszipálódik a PSII antenna komplexében. Golding és

Johnson (2003) vizsgálataik során azt a megfigyelést tették, hogy az ‘aktív’ PSI centrumok

aránya megemelkedett a száraz periódus alatt. Feltételezéseik szerint ezek elsődlegesen a

ciklikus elektrontranszportban vesznek részt, amely a ΔpH fokozásával hozzájárul a nem-

fotokémiai kioltás fenntartásához, és megvédi a PSII-t. A regulált termális disszipáció

valamiképpen magában foglalja a xantofill ciklust (Demmig-Adams & Adams, 1996) és a

lutein ciklust (Matsubara et al., 2001), jóllehet utóbbi szerepe nem teljesen világos még. A

levelek alacsony víztartalma mellett a CO2 asszimiláció és ezáltal az ATP felhasználás

csökken, miközben a funkcionális elektrontranszport működése proton akkumulációt

eredményez a tilakoid lumenben, ami a Zea és az Ant képződésének kedvez. Úgy vélik, hogy

a fotoprotektív folyamat működése által elvezetődik az energia a reakciócentrumokból (Ruban

& Horton, 1995). Vannak azonban olyan kísérleti adatok is, amelyek nem támasztják alá azt a

megállapítást, miszerint a xantofill ciklus jelentős vagy specifikus szerepet játszik az elnyelt

fényenergia közvetlen energia disszipációjában (Schindler & Lichtenthaler, 1994). Tambussi

és munkatársai (2002) kutatásai szerint a fluoreszcencia nem-fotokémiai kioltása, valamint a

Zea+Ant tartalom a közepes vízhiány következtében szignifikánsan megemelkedett. Jóllehet,

az erős szárazság által indukált xantofillok mennyiségének további növekedése nem hozható

kapcsolatba a hődisszipáció mértékének emelkedésével. Kimutatták továbbá a β-karotin

tartalom erős szárazság által kiváltott szignifikáns emelkedését, amely az antioxidáns

védekezés fokozódását jelezheti.

27

A fotorespiráció szintén részt vehet a fotoszintetikus apparátus védelmében a magas

fényintenzitás károsító hatásával szemben, ahogyan ez a jelenség szárazság alatt néhány faj

esetében megfigyelhető (Chaves et al., 2003). A fotorespiráció által termelt

hidrogénperoxidnak szerepet tulajdonítanak a jelátvitelben és az akklimatizáció

folyamataiban, amikor a CO2 hozzáférése limitált (Noctor et al., 2002). Az antocianinok

felhalmozódása, melyek a fotooxidatív károsodást védik ki a sejtekben, különösen fontosak

lehetnek öregedő levelekben, melyekből így hatékony tápanyag visszanyerés folyik a növény

raktározó kompartmentumaiba (Feild et al., 2001).

2.2.3. Stratégiák a vízhiány tolerálására

A növény túlélőképessége az egész növényre jellemző mechanizmusoktól függ, melyekkel

megfelelően tud reagálni a sejtszintű vízhiányra. A szárazságtűrési stratégiák különbözőek

lehetnek. A szárazságot toleráló növények a dehidratáltság ellenére képesek az élettani

funkcióik megtartására. Az elkerülő stratégia esetén a növények még a nedves évszakban

befejezik az életciklusukat, a száraz periódus előtt. A vízpotenciál csökkenését kivédő

növények képesek fenntartani a szövetek hidratáltságát, ezen belül vagy vízmegőrző stratégiát

követnek, vagy a vizet továbbra is nagy mennyiségben fogyasztják, de gondoskodnak annak

pótlásáról, például mélyebb gyökérzet segítségével. A CAM (Crassulaceae Acid Metabolism)

növények adaptációs előnyben vannak, mivel azok nappal zárva tarthatják a sztómáikat,

csökkentve ezzel a párolgási veszteséget, és lehetővé téve ezzel túlélésüket erősen vízhiányos,

sokszor félsivatagi, sivatagi körülmények között is.

A zárvatermők egy csoportja, melyeket újraéledő növényeknek nevezünk, képesek a

szélsőséges vízvesztést is elviselni (Bernacchia & Furini, 2004); a hosszú száraz periódus alatt

nyugalomban maradnak, majd a rehidráció után újraélednek. A dehidráció számos

transzkriptum expresszióját indukálja az újraéledő növényekben, ezek közül a védő funkcióval

rendelkező géntermékek közül azonosították a LEA (Late Embryogenesis Abundant)

fehérjéket, melyek a citoplazmában magas szinten fejeződnek ki a dehidráció és/vagy a

vegetatív növényi szövetek abszcizinsav-kezelésének következtében. Általában a cukrok

koncentrációjának megemelkedése is megfigyelhető a deszikkáció kezdetekor ezekben a

28

növényekben, ezek hatásosak lehetnek az ozmotikus szabályozásban, vagy a

membránstruktúrát és a fehérjéket stabilizálhatják.

2.3. Az atrazin rezisztencia

A herbicid-rezisztens gyomnövények felbukkanása főként a művelés alatt álló

területekhez kapcsolódik. A triazin-típusú gyomírtószerek reguláris és intenzív használata a

különböző gyomnövények esetében rezisztens biotípusok felszaporodását eredményezte. A D1

fehérje, ami a PSII RC alkotója, nem csupán a PQ redukciójának a színtere, hanem herbicidek

kötőhelyeit is tartalmazza. A PSII-t gátló herbicidek specifikusan és hatékonyan blokkolják a

PQ redukcióját azáltal, hogy kompetitíven kiszorítják a QB kinon formáját a kötőhelyéről

(Velthuys, 1981; Arntzen et al., 1982; Vermaas et al., 1983). A QB kiszorítása után az

inhibítorok szerkezetüktől függően elfoglalják a QB kötőhelyének különböző, de átfedő

részeit, meggátolván a QA felőli elektronáramot a PQ készlet irányába. A gyomnövényekben

előforduló 2-kloro-4-(etilamino)-6-(izopropilamino)-triazin (atrazin) rezisztencia a PSII RC 32

kDa móltömegű, D1 fehérjéjét kódoló, psbA kloroplasztiszban lokalizált gén

pontmutációjának tulajdonítható (Hirschberg et al., 1984; Gressel, 1985), melynek

következtében a D1 protein láncának 264-es pozíciójában szerin helyett glicin (Ser264→Gly)

jelenik meg (Hirschberg & McInthosh, 1983; Hirschberg et al., 1984). Ez nemcsak az

atrazinnak a QB kötőhelyhez való affinitását csökkenti drasztikusan, ami a rezisztencia okának

tekinthető, hanem a QB kötődését is módosítja (Pfister & Arntzen, 1979). Ezáltal lelassul a QA

és QB közötti elektronátadás sebessége, ugyanis a kötődési affinitás erősen függ a D1 protein

szerinjének hidroxil csoportja és a QB karbonil csoportja (4. A ábra), és az atrazin aminoetilén

csoportja közötti hidrogénhidas kötéstől (4. B ábra) (Arntzen et al., 1979; Pfister & Arntzen,

1979; Trebst, 1991). Az atrazin rezisztenciát kísérő számos, ún. pleiotróp hatás között a

lassúbb PSII elektrontranszport sebességet, a PSII-höz kötődő fotokémiai folyamat kisebb

hatékonyságát és az AR növények gyengébb produktivitását is általánosan megfigyelték (Holt

et al., 1981; Ort et al., 1983; Ireland et al., 1988). Számos szerző úgy tartja, hogy a tilakoid

membránok lipid és zsírsav összetételében észlelhető különbségek okozhatják az AR

biotípusok magas hőmérsékletekkel szembeni kisebb toleranciáját (Ducruet & Lemoine, 1985,

Havaux, 1989), amely magyarázhatja a gyengébb produktivitást is.

29

4. ábra A QB (A) és az atrazin (B) kölcsönhatásának sematikus ábrázolása a D1 fehérje QB kötőhelyén (Fuerst & Norman, 1991). A hidrogénhíd kötéseket szaggatott, a hidrofób kölcsönhatást pontozott vonalak jelölik. Az atrazin bekötődése korlátozza a PQ kötődését. A mutáció (Ser264→Gly) révén az alacsonyabb fokú hidrogénhíd kötés gyengíti az atrazin (és a PQ) kötődési tulajdonságait.

Nevezetesen, az AR növény kloroplasztiszai több MGDG-t, viszont kevesebb DGDG-t és

foszfatidil-gliceridet tartalmaznak az AS növényhez képest. A kloroplasztiszok összes lipidje

az AR biotípus esetében nagyobb mérvű telítetlenséget mutat, amely a glikolipid frakció

nagyobb linolénsav és kisebb palmitinsav tartalmának köszönhető. A foszfolipidek zsírsav

összetétele a foszfatidil-glicerid kivételével nem különbözött. Az AR növények tilakoid

membránjainak lipid mátrixa a fluoreszcencia polarizációs mérések tanúsága szerint nagyobb

fluiditást mutat az AS növényekéhez viszonyítva (Lehoczki et al., 1985). Az AR biotípusok

nagyobb fényérzékenységéről és a fénygátlással szembeni nagyobb érzékenységről egyaránt

beszámoltak (Holt et al., 1981, Hart & Stemler, 1990; Curwiel et al., 1993; Sundby et al.,

1993a; Váradi et al., 1994; Darkó et al., 1996; 2000).

A sötétadaptált triazin-rezisztens biotípusú növények levelei nagyobb mennyiségben

tartalmaznak redukált QA-t, mint a vad típusé (Pfister & Arntzen, 1979), ami limitálhatja a

töltésszétválasztások számát, csökkentve ezáltal a PSII hatásfokát. Fluoreszcencia kioltás

analízis vizsgálatok szintén alátámasztották a QA- magasabb “steady-state” koncentrációjának

30

meglétét (Curwiel et al., 1993; Sundby et al., 1993b; Darkó et al., 1995; 1996). Ez

feltételezhetően a mutációval összefüggő lassabb QA- reoxidáció következénye lehet (Váradi

et al., 1994). A Chla indukciós görbe kezdeti szakaszában a triazin-rezisztens növényekben

legtöbbször magasabb Fi szintet mértek (Arntzen et al., 1979; Pfister & Arntzen, 1979;

Ducruet & Lemoine, 1985; Gressel, 1985; Schönfeld et al., 1987), ami a QA prompt

fotoredukciójának sebességét mutatja (Melis, 1985). A Váradi és munkatársai (2003) által

vizsgált valamennyi AR növény egyértelműen csökkent fotokémiai hatásfokkal (qP)

rendelkezett valamennyi fényintenzitáson.

Schönfeld et al., (1987) ATP szintézis vizsgálatai nem mutattak eltérést Phalaris

paradoxa növények vad és mutáns biotípusai között, nem tapasztaltak változást a tilakoid

membránon keresztüli protongradiens kiépülésében, ekképpen a foszforiláció folyamata nem

különbözött a két biotípusban. Vitatható azonban az a tény, hogy a mutáns növényekben a QA-

QB között megfigyelhető 3-10-szer lassabb elektrontranszfer vajon hogyan korlátozhatja a

teljes fotoszintetikus elektrontranszportláncot állandósult körülmények között megvilágítás

után, vagy vajon a mutáció hatása csupán közvetetten jelentkezik az alacsonyabb

fotoszintetikus aktivitásban (Ort et al., 1983; Ireland et al., 1988). A válasz nem nyilvánvaló,

mivel a fotoszintetikus elektrontranszport limitáló lépése fiziológiás körülmények között

általában a PQ készlet Cyt b6/f komplex általi oxidációja (Genty & Harbinson, 1996).

Alacsony fényintenzitásokon az AR típusok CO2 fixáció sebessége alacsonyabb, mint a vad

típusé. A fényintenzitás emelkedésével ez a különbség csökken, és telítési fényintenzitásokon

a kétféle biotípus értékei hasonlóak (Holt et al., 1981; Ort et al., 1983; Váradi et al., 2003),

néhány esetben az AR mutáns felül is múlja a vad típust (Schönfeld et al., 1987).

Először Váradi és munkatársai (1994) bizonyították, hogy a Conyza canadensis AR

biotípusában alacsonyabb a xantofill ciklus aktivitása. Kimutatták továbbá, hogy az AR

biotípusokban nagyobb sebességgel működik a D1 protein degradációs/helyreállítási

folyamata (turn over) (Sundby et al., 1993a; Darkó et al., 2000). Elképzelhetőnek tartják, hogy

a magasabb fényérzékenység a megemelkedett D1 protein turn over-nek (Sundby et al.,

1993a) és/vagy in vivo a xantofill ciklus alacsonyabb aktivitásának (Váradi et al., 1994; Darkó

et al., 1995) köszönhető. Továbbá az NPQ alacsonyabb mértékét detektálták AR növényekben

magas fényintenzitás mellett (Szigeti & Lehoczki, 2003). Nem találtak szignifikáns és

egyértelmű különbségeket a xantofill ciklus készlet méretében a kétféle biotípus között

31

(Váradi et al., 2003). E feltételezés szerint az alacsonyabb qE (az NPQ energiafüggő frakciója)

és az alacsonyabb mennyiségű Zea létrejöttéért felelőssé tehető egyik mechanizmus talán az

alacsonyabb sebességű fotoszintetikus elektrontranszport, amely a tilakoid membránon

keresztüli kisebb ΔpH létrejöttét eredményezheti, mely alacsonyabb Vio de-epoxidációt von

maga után. Darkó és munkatársai (2000) kimutatták, hogy a Vio de-epoxidáz enzim kapacitása

a Conyza canadensis kétféle biotípusából izolált tilakoidokban azonos.

Számos gyomfaj AR biotípusa árnyékos nevelési környezetnek megfelelő

levélanatómiai jelleget és kloroplasztisz ultrastruktúrát mutat, beleértve a nagyobb mértékű

gránumosodást. A mutáció következtében a fotoszintetikus apparátus szerkezete is változik: a

csökkent Chl a/b arányt és a fénybegyűjtő Chl-fehérje komplexek nagyobb mennyiségét írták

le D1 fehérje mutáns növényekben (Burke et al., 1982; Holt & Goffner, 1985; Lemoine et al.,

1986). A Váradi és munkatársai (2003) által tanulmányozott valamennyi faj AR biotípusa

következetesen alacsonyabb Chl a/b aránnyal bírt a vad, atrazin-szenzitív (AS) típusokhoz

képest. Ez jelezheti a PSII/PSI arány eltolódását és/vagy egy relatíve magasabb LHC antenna

méretet, ez utóbbi pedig eredményezheti egy nagyobb mennyiségű többlet gerjesztési energia

kialakulását a fotoszintetikus apparátusban (Váradi et al., 2003). Ez az árnyéklevél tulajdonság

(Fedtke, 1979) a gyenge xantofill ciklus aktivitással együtt jól magyarázhatja néhány faj AR

biotípusában a magas fényérzékenységet és a magas gerjesztési nyomást, különösen alacsony

fényintenzitásokon (Váradi et al., 2003).

Habár az atrazin rezisztencia molekuláris bázisa az eddigi kutatások szerint a D1

protein egyetlen pontmutációján lokalizálódik, felmerül a kérdés, miként gyakorolhat ez ilyen

összetett hatást a teljes növény szintjén. Miután a D1 protein egy kloroplasztiszban kódolt

fehérje, az atrazin rezisztencia anyai úton öröklődik (Souza Machado et al., 1978). Ugyanazon

az élőhelyen gyűjtött AR és AS növények is különbözhetnek egyes sejtmagban kódolt olyan

tulajdonságokban, amelyek bizonyos fokig kompenzálhatják az atrazin rezisztenciát kísérő

negatív fiziológiai következményeket (McCloskey & Holt, 1990). Izonukleáris biotípusokkal

– amelyek kizárólag az atrazin rezisztencia tulajdonságában különböznek – végzett kutatások

eredményei azonban igazolták, hogy a megváltozott kloroplasztisz működés az AR

biotípusban az egész növény szintjén korlátozza a fotoszintézist, a növekedést és a

produktivitást (McCloskey & Holt, 1990; Beversdorf et al., 1988; Darmency & Pernes, 1989;

Gressel & Ben-Sinai, 1985; Stowe & Holt, 1988; van Oorschot & Leeuwen, 1989).

32

3. CÉLKITŰZÉS

A többlet gerjesztési energia fényindukált termális disszipációja fontos szerepet játszik a PSII

antennarendszerében megvalósuló energia-áramlás szabályozásában. A termális disszipáció

kapacitását a klorofill fluoreszcencia nem-fotokémiai kioltásaként (NPQ) határoztuk meg.

Ismeretes, hogy az S264G D1 protein mutáns AR gyomnövények alacsonyabb NPQ és qE

kapacitással rendelkeznek, mint vad-típusú AS párjaik (Váradi et al., 2003). Az NPQ

kialakulásában ez idáig azonosított tényezők sejtmagi gének szabályozása alatt állnak. Nem

világos, hogy a PSII reakció centrum D1 fehérjéje, amelyet a kloroplasztisz genomban a psbA

gén kódol, milyen hatással van az antennában végbemenő hődisszipáció kialakulására. Ezért

munkám során célul tűztem ki a következőket:

Milyen kapcsolat van a D1 protein mutáció és a PSII antennájában elnyelt fényenergia

allokációja között: a fotokémiai hasznosítás és a termális disszipáció?

A klorofill a fluoreszcencia analízis és a fotoprotektív folyamatok vizsgálata segítségével

az alacsonyabb NPQ, illetve a qE komponens értelmezése a D1 protein mutáns

növényekben.

Ennek megválaszolására reciprok keresztezésekkel hibridek létrehozása, melyeken

tanulmányozható a PSII allokációs mintázata, a qE és a gyors Chl fluoreszcencia

paraméterek öröklődése; sejtmagi és citoplazmatikus (kloroplasztisz) faktorok szerepe a

qE szabályozásában.

Ismeretes az atrazin-rezisztens növények eltérő hőmérséklet-érzékenysége és adaptációs

képessége (Ducruet & Lemoine, 1985), illetve fokozott fényérzékenységükről egyaránt

beszámoltak (Hart & Stemler, 1990). Tudomásunk szerint a vízdeficit (szárazság)

fotoszintézisre gyakorolt hatásait ez idáig nem vizsgálták még D1 protein mutáns

növényekben. Kíváncsiak voltunk, vajon a vízdeficit befolyásolja-e a mutáns növények

fitneszét. E kérdéskörben az alábbi célokat tűztem ki:

A progresszív vízmegvonás hatásának megfigyelése intakt növények leveleinek

vízállapotára, gázcseréjére és fotoszintetikus hatékonyságára.

33

4. ANYAG ÉS MÓDSZER

4.1. A vizsgált növényi anyag

A kísérleti növényeim természetes körülmények között természetes módon szelektálódott vad-

típusú, AS és D1 protein mutáns, AR Solanum nigrum L. (fekete csucsor) gyomnövények

voltak. Az atrazin rezisztencia oka az általunk vizsgált gyomnövényben a psbA gén

pontmutációja a 264-ik kodonban, amely a Ser264→Gly aminosavcserét eredményezi a D1

fehérjén. (Hirschberg & McIntosh, 1983; Gawronski et al., 1992). A laboratóriumunkban

elérhető különböző D1 protein mutáns gyomnövények (Chenopodium album L. (fehér

libatop), Conyza canadensis L. (betyárkóró), Epilobium adenocaulon L. (jövevény füzike),

Senecio vulgaris L. (közönséges aggófű) és Solanum nigrum L. (fekete csucsor)) közül azért

esett a választásunk a fekete csucsorra, mert sikeresen nevelhető laboratóriumi körülmények

között, viszonylag rövid az életciklusa, jól kezelhető levelei vannak a gázcseremérések

szempontjából, valamint szülő vonalakból (AS és AR) hagyományos keresztezési eljárással

laboratóriumi körülmények között sikeresen produkáltunk hibrideket.

Összehasonlító tanulmányokat végeztem továbbá két, csökkent NPQ-val rendelkező

Arabidopsis thaliana L. (A. thaliana) mutáns vonal felhasználásával. Vad típusként a

Columbia-0 ökotípust (Col-0) használtam. A két mutáns vonal az antiszensz lhcb2 és a psbS

deléciós npq4-1 voltak. Míg az előbbiben a kettes fénybegyűjtő pigment-fehérje komplexek

(LHCII) fő alkotó elemei, az Lhcb1 és Lhcb2 fehérjék majdnem teljesen hiányoznak az Lhcb2

antiszensz konstrukció kifejeződése miatt (Ganeteg et al., 2001; Andersson et al., 2003; Ruban

et al., 2003), az utóbbiban a psbS gén deléciója következtében a PsbS fehérje teljesen hiányzik

(Li et al., 2000; 2002b).

4.2. Növénynevelés, vízmegvonás

A S. nigrum növények nevelésénél a magokat először petricsészébe helyeztük, amelyben

nedves szűrőpapíron, sötétben egy héten át csíráztak szobahőmérsékleten. A kicsírázott

magokat kertészeti földbe helyeztük, majd a kikelt növényeket tenyészedényekbe ültettük át.

A növényeket növénynevelő kamrákban neveltük, ahol a maximális fotoszintetikusan aktív

34

radiáció értéke 350 µmol foton m-2 s-1 volt (16 h fényperiódus, 25/20oC nappali/éjszakai

hőmérséklet, kb. 50-60%-os relatív páratartalom mellett). A növényeket kétnaponta öntöztük a

kísérletek alatt, a 35-40 napos növényeket tekintettük jó vízellátású kontrollnak. A vetés utáni

kb. 40-42. napon a növények egy részétől megvontuk az öntözést, és gázcsereméréseket

végeztünk három-négy naponta, hogy a vízdeficit hatásait tanulmányozzuk. A növények

vízállapotát és gázcseréjét jellemző paraméterek alapján három szakaszt különítettünk el a

vízdeficit időbeni vizsgálata során: enyhe szárazság (5-7 nap vízmegvonást követően),

közepes szárazság (13-15 nap), és erős szárazság (18-19 nap), melyeket DH1 (dehydration

state 1), DH2 (dehydration state 2), és DH3 (dehydration state 3) jelöléssel illettük. A vízhiány

egyes szakaszaiban a növények egy részét a rehidráció után 24 órával tovább vizsgáltuk, és

RH1, RH2 vagy RH3 (rehydration sate 1, 2 és 3) jelöléssel illettük. A vízhiány periódusa alatt

gázcsereméréseket a DH2 állapotig folytattunk, mivel a sztómazáródás következtében a DH3

szakaszban már a CO2 asszimilációs ráta értéke alacsonyabb volt, mint 1 µmol m-2 s-1.

Méréseinket rendre a növények legfiatalabb, teljesen kiterült, azonos pozícióban lévő levelein

végeztük.

Az A. thaliana növények magvait kertészeti földet tartalmazó tenyészedényekbe

helyeztük, növénynevelő kamrákban csíráztattuk és neveltük, ahol a maximális

fotoszintetikusan aktív radiáció értéke 350 µmol foton m-2 s-1 volt (16 h fényperiódus, 25/20oC

nappali/éjszakai hőmérséklet, kb. 50-60%-os relatív páratartalom mellett). Méréseinket rendre

a kb. hat hetes növények legfiatalabb, teljesen kiterült levelein végeztük.

4.3. Reciprok keresztezések kivitelezése, genetikai analízis

Az AS és AR S. nigrum szülő biotípusok reciprok keresztezésével F1 hibrideket hoztunk létre.

A levélszél típusát figyelmen kívül hagyva, véletlenszerűen kiválasztottunk 15 darab AS és 15

darab AR biotípusú növényt, melyek a női (♀) szülőpopulációul szolgáltak. Hasonlóképpen,

15 darab AR és 15 darab AS növényegyedet választottunk hím (♂) szülőpopulációul a

reciprok keresztezésekhez. A 15-15 AS és AR anyaként szolgáló növényeken a bimbós

állapotban lévő virágok éretlen portokjait eltávolítottuk, mielőtt az önmegporzás végbement

volna, majd a vad-típusú AS (♂) pollent az AR (♀) növények bibéjére transzferáltuk, és az

AR (♂) növények pollenjét a vad-típusú, AS (♀) növények bibéjére vittük át. A megporzást a

35

növénynevelő kamrákban végeztük, ezzel kizárva a rovar általi megporzás lehetőségét. A

sikeres megtermékenyítés aránya kb. 50%-os volt; átlagosan 20 virág/növényt poroztunk meg,

és ebből kb. tíz darab virág termékenyült meg, majd hozott magot, kb. 20-25 mag/termés

hozammal. Az első reciprok keresztezésből származó F1 hibrideket ARF1 és ASF1-nek

definiáltuk. Miután e heterozigóta F1 növényekben megtörtént az önbeporzás (a S. nigrum

önbeporzó), létrejöttek az F2 nemzedékű magok, melyeket ASF2 és ARF2-nek neveztünk. Az

F2 növényeket használtuk a levélszél alak vizsgálathoz annak bizonyítására, hogy a mendeli

levélszél tulajdonság szegregációja megtörtént-e. A szülő populációban három különböző

levélszél típust találtunk, melyek Hardy-Weinberg eloszlást mutattak. A különböző levélszél

típusok várható gyakoriságát a Hardy-Weinberg szabály alapján számoltuk ki. További

keresztezéseket folytattunk, melyekben épszélű ASF2 (♀) és csipkézett AR (♂) szülőt vagy

csipkézett ARF2 (♀) és épszélű AS (♂) szülőt használtunk, hogy létrehozzuk az F3

utódnövényeket (ASF3 és ARF3). Hasonlóan, épszélű ASF3 (♀) és csipkézett AR (♂) szülőt

vagy csipkézett ARF3 (♀) és épszélű AS (♂) szülőt kereszteztünk, mellyel létrehoztuk az F4

hibrideket (ASF4 és ARF4), és így tovább az F6 nemzedékig. A S. nigrum szülő és hibrid

vonalakban az S264G mutáció meglétét a psbA gén részleges megszekvenálásával

bizonyítottuk. Valamennyi S. nigrum vonal esetében a csíranövényeket közvetlenül 8 kg aktív

hatóanyag/hektár atrazinnal permeteztük, illetve felhasználva a mutáció jól ismert

manifesztálódásait, vizsgáltuk a növények gyors Chla fluoreszcencia indukciós görbéit. Az F2

növényi anyag sejtmagi hibrid státuszát a teljesen kifejlődött levelek morfológiájának

vizsgálatával igazoltuk.

4.4. A növény vízellátásának vizsgálata

4.4.1. Sztómasűrűség vizsgálata

A gázcserenyílások számát a levelek abaxiális felületéről készült lenyomatok felhasználásával

határoztuk meg 1 mm2-es felületen egy digitális CCD kamerával felszerelt reflexiós és

fluoreszcencia mikroszkóp segítségével, amely egy komputerhez csatlakozott. A számolást a

Computer Assisted Microscope Methods with Image-Pro Plus 3.0 Software segítségével

végeztük el. Az átlagos sztómaszámot 116 növényről származó 116 levél vizsgálatával kaptuk

36

meg biotípusonként, egy levélen belül hatszoros ismétléssel A növények három független

növénynevelésből származtak.

4.4.2. A levelek relatív víztartalmának meghatározása

A kontroll körülmények és a vízhiány szakaszainak jellemzésére meghatároztuk a levelek

relatív víztartalmát (RWC) a következő képlet felhasználásával: (FW – DW)/FWS, ahol az FW

a levelek friss tömege, a DW a levelek száraz tömege 24 órán át 85oC-on szárítószekrényben

való szárítást követően, valamint az FWS a 24 órán keresztül vízben úsztatott levelek friss

tömege grammban [g] kifejezve.

4.4.3. A levélszövetek átlagos vízpotenciáljának mérése

A levélszövetek átlagos vízpotenciálját nyomásmérő kamrával (Model 600, PMS Instruments

Company, USA) határoztuk meg. Az eljárás során a frissen levágott levelet egy légmentesen

záródó kamrába helyeztük úgy, hogy abból csak a vágott felület nyúlt ki. A kamrán belül

lassan emeltük a nyomást (nitrogén felhasználásával) mindaddig, míg a kinyúló vágott

felületen a növény szállítóelemeiből kipréselődő nedvesség csepp formájában meg nem jelent.

Az ennek eléréséhez szükséges nyomást a kamrához kapcsolt nyomásmérőről olvastuk le.

4.4.4. Sztóma konduktancia mérése

A levelek abaxiális felületén a gázcserenyílások vezetőképességét a DELTA T műszergyártó

cég (UK) AP4 típusú diffúziós porométerével határoztuk meg a növénynevelő kamrákban,

ahol a körülmények a Növénynevelés, vízmegvonás fejezetben leírtak szerint alakultak. A

sztómakonduktanciát az A/Ci görbék felvételekor szintén mértük az LCPro+ infravörös

gázelemző készülékkel (IRGA; ADC, UK) (lásd: Gázcseremérések fejezet).

37

4.5. Elektron mikroszkópia

A kloroplasztisz tilakoid struktúrájának vizsgálata transzmissziós elektron mikroszkópiával

történt. A növények leveleiből kis darabokat vágtunk ki, melyeket 1% glutáraldehidben

fixáltunk két órán át. A minták foszfát pufferes (0,1 M, pH 7,2) mosását követően 2%-os

ozmium tetroxidban egy órán át utófixáltuk őket. Ezután dehidratáltuk a levéldarabokat etanol

gradiens sorozatain keresztül, majd propilénoxid mosás után, araldit gyantába ágyaztuk őket.

Egy Leica UCT ultramicrotome segítségével vékony szekciókat vágtunk, melyeket uranil

acetáttal és ólom citráttal festettünk meg. Az így kapott preparátumainkat egy Opton 902

elektron mikrószkóp segítségével tanulmányoztuk.

A levelek abaxiális felületének levélszőreit scanning elekron mikroszkópiával

tanulmányoztuk. A vizsgálandó levéldarabkák víztelenítése céljából, azokat többlépcsős

etanol-, majd aceton gradiens sorozaton vittük át, lépcsőnként 30-30 percig tartva a mintákat

az oldatban. Végül a mintákat kritikus pont szárítóban háromszor átmostuk széndioxiddal. A

víztelenített mintákat mintatartóra rögzítettük, majd aranyréteget vontunk a felületükre. Az

előkészített minta felületéről scanning elektron mikroszkóppal 60-szoros nagyítású fotókat

készítettünk.

4.6. Gázcseremérések

4.6.1. CO2 asszimilációs ráta meghatározása a fényintenzitás függvényében

Az asszimilációs ráta (A) aktinikus fényre adott válaszgörbéit LCA-3 típusú infravörös

gázelemző készülékkel (ADC, UK) vettük fel. A gázáramlás sebessége 300 ml perc-1 volt,

rotaméterrel szabályozott. A leveleket tíz percig sötétadaptáltuk a levélkamrában a mérések

előtt, majd a fotoszintézist aktiváló fehér fény intenzitását 30-1250 μmol foton m-2 s-1 között

változtattuk, a leveleket hőszűrőn (Melles Griot, USA) keresztül diavetítővel (150 W/24 V

halogén izzó) világítottuk meg. Tíz perces megvilágítás valamennyi fényintenzitáson elegendő

volt a szén-dioxid asszimiláció egyensúlyi értékének eléréséhez. A referencia levegő

széndioxid tartalmát 360 µmol CO2 mol-1-ra állítottuk be, és a levegő oxigéntartalma 21%

38

vagy 1% v/v volt. Az asszimilációs ráta értékeit a műszer szofvere számította ki von

Caemmerer és Farquhar (1981) egyenletei alapján.

4.6.2. CO2 asszimilációs ráta meghatározása az intercelluláris CO2 koncentráció

függvényében

Az asszimilációs rátának az intercelluláris CO2 koncentrációtól (Ci) való függését a környezeti

CO2 koncentráció (Ca) 0 és 1500 µmol CO2 mol-1 intervallum közötti változtatásával 21% O2

tartalmú levegőben határoztuk meg LCpro+ IRGA készülékkel. A levél felületére beeső

fotonáram-sűrűséget 800 µmol foton m-2 s-1-ra állítottuk be. Először 360 µmol CO2 mol-1

koncentráción akklimatizáltuk a megvilágított levelet tíz percen keresztül. Ezt követően az

asszimiláció sebességét valamennyi CO2 koncentráción tíz perces inkubáció után határoztuk

meg. Az adatokat ezután grafikusan ábrázoltuk a szoftver által számított intercelluláris CO2

koncentráció függvényében (Farquhar et al., 1990), és lineáris regresszióval meghatároztuk a

görbék kezdeti meredekségét 0-200 µmol CO2 mol-1 intervallumban, amely érték arányos a

Rubisco enzim aktivitásával és/vagy extrahálható mennyiségével. Az A/Ci görbék további

analízise során figyelembe vettük a CO2 asszimiláció telítési értékét (Jmax), amely tükrözi a

RuBP regenerációjának maximális sebességét.

4.7. Klorofill fluoreszcencia mérések

4.7.1. Gyors klorofill a fluoreszcencia indukció (OJIP görbe) mérése

A gyors klorofill fluoreszcencia tranziens (OJIP görbe) méréseket a HandyPEA (Plant

Efficiency Analyser) fotoszintetikus hatékonyságmérő készülékkel (Hansatech Instruments,

UK) végeztük. A 30 percen át sötétadaptált leveleket folyamatos fénnyel (λ = 650 nm, 3000

μmol foton m-2 s-1 fotonáram-sűrűség) 1 s-ig világítottuk meg. A fényforrást egy három

fénykibocsátó diódából (LED) álló rendszer alkotta. A fluoreszcenciát 700 nm-nél nagyobb

hullámhosszakon detektáltuk nagy időfelbontásban és különböző adatgyűjtési sebesség mellett

(10 μs-tól 1 s-ig). Az OJIP tranziensek további analízisét az ún. JIP-teszttel (Strasser et al.,

2000; Tsimilli-Michael & Strasser, 2008), illetve a Biolyzer 4HP szoftverrel végeztük. Az 1.

39

táblázat tartalmazza a dolgozatomban fellelhető alap és származtatott fluoreszcencia

paramétereket, a speciális energia fluxusok, hatásfokok, valamint az ún. fotoszintetikus

teljesítmény indexek képleteit és ezek leírásait.

1. táblázat Az OJIP klorofill a fluorszcencia tranziens analízise (paraméterek, képletek) Fluoreszcencia paraméterek

Ft

Fluoreszcencia intenzitás t időpontban aktinikus megvilágítás mellett

Fo = F20μs

Sötétadaptált minta alapfluoreszcencia intenzitása t = 20 μs időpillanatban (valamennyi PSII RC nyitott)

Fm = FP

Sötétadaptált minta maximális fluoreszcencia intenzitása (valamennyi PSII RC zárt)

Fv = Fm – Fo

Maximális változó fluoreszcencia

FJ = F2ms

Fluoreszcencia intenzitása a J inflexiónál (t = 2 ms)

FI = F30ms

Fluoreszcencia intenzitása az I inflexiónál (t = 30 ms)

Származtatott fluoreszcencia paraméterek

VJ = (F2ms – Fo)/(Fm – Fo)

Relatív változó fluoreszcencia a J inflexiónál, mely tükrözi mind a QA

– akkumulációjának, mind re-oxidációjának sebességét

VI = (F30ms – Fo)/(Fm – Fo)

Relatív változó fluoreszcencia az I inflexiónál, mely a plasztokinol (PQH2) re-oxidációjának sebességét tükrözi

Mo = 3,571 × (F300μs – Fo)/(Fm – Fo)

Fluoreszcencia tranziens V = f(t) approximatív kezdeti meredeksége (ms-1), a RC-k záródásának nettó sebessége; (3,571 szorzót használtunk, mivel az Fo szintet t = 20 μs-nál határoztuk meg 50 μs helyett)

Specifikus energia fluxusok (*QA-redukáló) PSII reakciócentrumok arányában kifejezve

ABS/RC = Mo × (1/VJ) × (1/(Fv/Fm))

Abszorpciós fluxus per RC

TRo/RC = Mo × (1/VJ)

Befogott energia fluxus (QA redukcióhoz vezető) per RC

ETo/RC = Mo × (1/VJ) × (1 – VJ)

Elektrontranszport fluxusa (a QA--on túlra definiált) per RC

DIo/RC = (ABS/RC) – (TRo/RC)

Disszipált energia fluxusa per RC

REo/RC = (REo/ETo) × (ETo/RC)

PSI végső elektron akceptor redukciójának fluxusa per RC

*QA-redukáló, fotokémiailag aktív PSII RC-kat megkülönböztetik stressz hatására konformáció változáson átment, QA-nem-redukáló, fotokémiailag nem aktív PSII RC-tól (lásd: Strasser et al., 2004).

40

1. táblázat (folytatás) Hatásfokok és fluxus arányok

ϕPo = TRo/ABS = 1 – (Fo/Fm) = Fv/Fm

PSII primér fotokémiájának maximális hatásfoka

ϕEo = ϕPo × ψEo = ETo/ABS = 1 – (FJ/Fm) = ϕPo × (1 – VJ)

Elektrontranszport hatásfoka a köztes elektron hordozók irányában (azaz egy elnyelt foton milyen hatásfokkal eredményez elektrontranszportot a QA

–-n túl)

ϕRo = ϕPo × ψEo × δRo = REo/ABS = 1 – (FI/Fm) = ϕPo × (1 – VI)

A PSI végső elektron akceptorok redukciójának hatásfoka az elnyelt fotonok arányában

ϕDo = 1 – ϕPo = DIo/ABS = Fo/Fm

Energia disszipáció hatásfoka

ψEo = ETo/TRo = (Fm – FJ)/(Fm – Fo) = 1 – VJ Annak a valószínűsége, hogy egy RC által befogott exciton egy elektront az elektrontranszportláncba juttat a QA

–-n túl

ψRo = REo/TRo = ψEo × δRo = 1 – VI Annak a valószínűsége, hogy egy RC által befogott exciton egy elektront az elektrontranszportláncba juttat a QA

– felől a PSI végső elektron akceptorokhoz

δRo = REo/ETo = (Fm – FI)/(Fm – FJ) = (1 – VI)/(1 – VJ)

Annak a valószínűsége, hogy egy elektron a köztes elektron akceptorok felől a PSI végső elektron akceptorokhoz jut

Fotoszintetikus teljesítmény indexek

PIabs = (RC/ABS) × (ϕPo/(1 – ϕPo)) × (ψEo/(1 – ψEo))

A PSII által elnyelt fotonoktól a köztes elektron akceptorok redukciójáig tartó energia konverziót jellemző fotoszintetikus teljesítmény index (Performance Index, PI)

PItotal = PIabs × (δRo/(1 – δRo))

A PSII által elnyelt fotonoktól a PSI végső elektron akceptorokig tartó energia konverziót jellemző teljes fotoszintetikus teljesítmény index

4.7.2. Modulációs klorofill a fluoreszcencia mérés, fotoprotektív folyamatok vizsgálata

A Chl fluoreszcencia paraméterek steady-state szintjét 60 percig sötétadaptált leveleken a

Dual Channel Modulated Fluorometer-rel (FMS2, Hansatech, UK) mértük; a van Kooten és

Snel (1990) szerinti nómenklatúrát használtuk. A fluoreszcencia alapszintjét (Fo) a

41

sötétadaptált leveleken egy gyenge (λ = 583 nm) 4,8 kHz-en modulált fénnyel gerjesztettük. A

levelek maximális fluoreszcenciáját (Fm a sötétadaptált és F’m a fényadaptált levélben,

utóbbinál 1600 µmol foton m-2 s-1 aktinikus fénnyel 15 percen át világítottuk a levelet) 1 s

időtartamú, fehér, telítési fényimpulzussal (4300 µmol foton m-2 s-1) indukáltuk (Hansatech

PLS1 halogén lámpa). A PSII fotokémiájának optimális hatásfokát az Fv/Fm formulával

jellemeztük, ahol Fv = Fm – Fo. A Stern-Volmer nem-fotokémiai kioltási paramétert az NPQ =

(Fm – F’m)/F’

m egyenlettel számoltuk ki Bilger és Björkman (1990) alapján. Az NPQ

energiafüggő qE komponensét Thiele és munkatársai (1997) módszere szerint határoztuk meg

a qE = (Fm/F’m) – (Fm/F’’

m) alapján, ahol az F’’m a maximális fluoreszcencia szint az aktinikus

fény kikapcsolását követő tíz perces sötétrelaxáció után.

A modulált Chl fluoreszcencia paraméterek aktinikus fényre adott válaszgörbéit és

időfüggvény görbéit sötétadaptált leveleken mértük a PAM 200 (Teaching PAM, Walz,

Németország) pulzus amplitudó modulált fluorométerrel; a van Kooten és Snel (1990) szerinti

nómenklatúrát használtuk. A fényintenzitás-függés mérések esetén a 60 percig sötétadaptált

levélen meghatároztuk a fluoreszcencia alapszintjét (Fo) és a maximális fluoreszcencia

hozamot (Fm) egy 1 s időtartamú (λ≈650 nm) telítési fényimpulzussal (3000

µmol foton m-2 s-1) (mely elegendő valamennyi PSII RC záródásához). Ezt követően öt percen

keresztül 210 µmol foton m-2 s-1 aktinikus fénnyel történő előmegvilágítást alkalmaztunk,

mely elősegítette a minta fényadaptálódását, valamint néhány Calvin-ciklus enzim

aktivációját, majd elkezdődött a görbe fevétele, mely 60-1250 µmol foton m-2 s-1

intervallumban, tíz lépcsőben valósult meg; valamennyi fényintenzitás időtartama öt perc volt.

A maximális Chl fluoreszcencia paraméter kioltott szintjeit (F’m) és a steady-state

fluoreszcencia hozamokat (F) valamennyi fényintenzitáson meghatároztuk a megvilágítás

végén. Az egyes fényintenzitásokon az aktinikus fény kikapcsolása után 5 s időtartamú távoli

vörös fényt alkalmaztunk, hogy meghatározzuk az F’o értékeket. A mért paraméterekből (Fo,

Fm, F’o, F’

m és a steady-state fluoreszcencia szint, F) kiszámítottuk a PSII maximális hatásfokát

Fv/Fm sötétadaptált levélen, a fotokémiai kioltási koefficiens értékét qP = (F’m – F)/(F’

m – F’o),

a PSII RC-ra ható gerjesztési nyomást 1 – qP, a PSII fotokémiájának relatív hatásfokát (ΦPSII =

(F’m – F)/F’

m = ΔF/F’m) és a nem-fotokémiai kioltási paraméter NPQ = (Fm – F’

m)/F’m értékét

Schreiber és munkatársai (1986), Genty és munkatársai (1989), Bilger és Björkman (1990)

szerint. A PSII-n keresztüli lineáris elektrontranszport sebességének kiszámításához (JETR) a

42

következő egyenlet alapján jutottunk: JETR = ΦPSII × PPFD × 0,84 × 0,5 (Schreiber et al.,

1994), ahol a PPFD a fotoszintetikusan aktív foton denzitás (Photosynthetically Active Photon

Flux Density) a levélfelületen; a 0,5 faktor a két fotoszisztéma között feltételezhetően

egyenlően megoszló gerjesztésre utal, és a 0,84 faktor a beeső fény levél által elnyelt hányada.

A mérések során a PSII gerjesztéséhez vörös (λmax = 655 nm) aktinikus fényt használtunk.

Az NPQ indukcióját és sötétrelaxációját két órán át sötétadaptált leveleken határoztuk

meg. A leveleket 15 percen keresztül 1250 μmol foton m-2 s-1 vörös fénnyel világítottuk meg,

amelyet tíz perces sötét követett. Az első 1 s időtartamú 3000 μmol foton m-2 s-1

fényintenzitású telítési impulzus a megvilágítás kezdete után a tizedik másodpercben érkezett,

és 60 s-ként ismétlődött a mérés végéig.

4.7.3. A PSII-ben elnyelt fényenergia megoszlásának vizsgálata

A PAM 200 készülékkel mért Chl fluoreszcencia paramétereket (Fo, Fm, F’o, F’

m és F)

felhasználva két modell alapján meghatároztuk a PSII antennájában elnyelt fényenergia sorsát,

mely egyrészt fotokémiailag hasznosulhat, másrészt termálisan disszipálódhat a környezetbe.

Demmig-Adams és munkatársai (1996) modellje szerint a fotokémia által hasznosuló

energia frakciót a ΦPSII = (F’v/F’

m) × qP formulával definiáltuk, ahol az F’v/F’

m a nyitott PSII

RC-ok fotokémiájának hatásfoka (F’v = F’

m – F’o) és a qP = (F’

m – F)/(F’m – F’

o) a fotokémiai

kioltási koefficiens. A hődisszipációt az 1 – F’v/F’

m képlettel definiáltuk, mely felosztható a

sötétben bekövetkező energiaveszteség ΦDD = 1 – Fv/Fm és a fényben disszipálódó hőenergia

frakcióira ΦDL = Fv/Fm – F’v/F’

m. A többlet energia frakciót (ΦE), amely nem hasznosul a

fotokémia folyamán, és hőként sem disszipálódik, az (F’v/F’

m) × (1 – qP) képlettel számoltuk

ki.

A Hendrickson és munkatársai (2004) által leírt ún. PSII komplementer hatásfokok

koncepciója szerint a PSII fotokémiájának hatásfoka a ΦPSII = (F’m – F)/F’

m = ΔF/F’m egyenlet

alapján számolható. A nem-fotokémiai energia disszipáció regulált és nem-regulált módon

mehet végbe, és ezeket a ΦNPQ = (F/F’m) – (F/Fm) és ΦNO = F/Fm képletekkel határoztuk meg.

A JNPQ és a JNO energia disszipáció sebességeket a JETR meghatározásával azonos módon

becsültük meg.

43

4.8. Fotoszintetikus pigmenttartalom meghatározás

A HPLC és spektrofotometriás pigment meghatározás céljából korongokat vágtunk ki a

levelek azonos részeiből, és folyékony nitrogénben tároltuk azokat. A Chl és összkarotinoid

tartalom meghatározását 80%-os acetonos extraktumban Lichtenthaler (1987)

spekrofotomeriás módszere alapján végeztük. A HPLC analízis kivitelezése Váradi és

munkatársai (2003) módszere szerint történt. A pigmentek feltárását Eppendorf csövekben,

cseppfolyós nitrogénben történt mechanikai feltárást követően, 85:15 arányú aceton-víz

extraháló oldattal végeztük, 24 órára hűtőszekrénybe helyezve, majd az elegyet centrifugálva

(10 perc, 9000×g). A xantofill ciklus összkészletének meghatározásához a szilárd maradékot

acetonnal kétszer újra extraháltuk. A pigmentek szétválasztásához 5 μm átlagos

szemcseméretű, 25 cm-es C18 fordított fázisú (Nucleosil vagy Hypersil) oszlopon (A)

acetonitril-víz (9:1, v/v) – (B) etilacetát oldószerrendszerrel gradiens elúciót alkalmaztunk

(térfogatáram: 1 ml min-1; a B% (v/v) az injektálástól mért 18. percben zérusról indulva

lineáris felfutással elérte a 32%-ot, majd hat perc alatt a 100%-ot, s újabb hat percig ezt az

értéket tartotta, ezt követően pedig tíz percen át az A-eluenssel hoztuk egyensúlyba az

oszlopot). A xantofill ciklus pigmentek mennyiségét 450 nm-nél detektáltuk, standard

anyagként a Roĉhe (Svájc) cégtől származó tiszta zeaxantin szolgált. A kapott kromatogramok

integrálása után, a meghatározott területek alapján kiszámoltuk a violaxantin (Vio),

anteraxantin (Ant) és zeaxantin (Zea) mennyiségét, vagy %-os megoszlását. A xantofill ciklus

komponenseinek egymásba való átalakulását a xantofill ciklus pigmentek de-epoxidációs

állapotával DEi = [½ × Ant + Zea]/[Vio + Ant + Zea] jellemeztük. A xantofill ciklus

készletének méretét a Vio + Ant + Zea (µmol m-2) összmennyiségeként számítottuk ki. A

méréseket kezdetben LKB 2249 gradiens pumpa, 20 µl-es Rheodyne injektor, Nucleosil-100

C18/5 µm/250×4,6 mm oszlop, LKB 2151 UV/VIS detektor (450 nm), Nelson interface &

software/IBM XT összeállítású műszersoron, későbbiekben hűthető automata mintaváltóval

felszerelt, PC-vezérelt Perkin-Elmer Series 200 HPLC berendezésen végeztük.

44

4.9. DNS izolálás és PCR amplifikáció, PsbS és PsbA (D1) fehérjéket kódoló DNS

szakaszok szekvenálása

Négy hetes S. nigrum vonalak leveleiből ZenoGene Plant DNA Isolation Kit (Zenon

Biotechnológiai kft., Magyarország) felhasználásával növényi össz-DNS-t izoláltunk a gyártó

utasításai szerint. A psbS és a psbA gének PCR amplifikációjához 50 ng DNS-t használtunk

templátként. Három psbS-specifikus primer pár (2. táblázat) segítségével ~600 bp, ~1360 bp és

~159 bp átfedő fragmenteket szaporítottunk fel a két S. nigrum szülői vonalból. A SniD1

primerekkel (2. táblázat) a D1 protein mutáns (AR, ARF2, ARF6) és a vad-típusú (AS, ASF2,

ASF6) vonalakban felszaporíttattuk a psbA gén 386 bp-os DNS fragmentjét, mely tartalmazta

az A G nukleotid cserét (S264G mutáció). A PCR ciklusok a következők voltak: denaturáció

94oC 3 perc, azután 94oC 30 s, 60oC 30 s, 72oC 15-60 s 35 cikluson át, majd a reakciót egy 4

perces 72oC-os lépéssel fejeztük be. Az amplifikáció termékeit 2%-os agaróz gélben

választottuk el, majd a fragmenteket visszaizoláltuk az Agarose DNA Isolation Kit segítségével

(Zenon Biotechnológiai kft., Magyarország) és pGEM-T Easy vektorba (Promega Corp., USA)

klónoztuk a gyártó utasításainak megfelelően. A szekvenálási reakciót ABI BigDye Terminator

v3.1 kittel végeztük, és a termékeket ABI3100 mikrokapilláris lézer szekvenátoron futattuk

(Applied Biosystems Inc., USA).

2. táblázat A psbS és a psbA gének PCR amplifikációjához használt primer szekvenciák

Primer Primer szekvencia Pr-SniF1 5’-TGAAGTTGTTAAGAATAAGC-3’

Pr-SniR1 5’-TCATTATTCTATTAAAGGCT-3’

Pr-SniF2 5’-GGCCGTGTTGCTATGATT-3’

Pr-SniR2 5’-TAATCCTGGTACTGGCAAAT-3’

Pr-SniStop-F1 5’-CAGGTGTCCCAATCAAT-3’

Pr-SniStop-R1 5’-CTACACATAAGTCATACACA-3’

SniD1_F1 5’-CCCAATCGGTCAAGGAAGTTTTT-3’

SniD1_R1 5’-CAGGCCAAGCAGCTAGGAAGAAGT-3’

45

4.10. Immunoblot analízis

A levelek PsbA (D1) és PsbS fehérje tartalmait immunoblot analízissel határoztuk meg. 2,3

cm2-nek megfelelő területű korongokat vágtunk ki az AS és az AR S. nigrum leveleiből,

melyeket folyékony nitrogénben fagyasztottunk, majd finom porrá őröltünk, és 500 μl

Laemmli puffer (100 mM TRIS pH 6,8, 4% SDS, 10% glicerol, 200 mM DTT, 5 mM PMSF)

hozzáadásával elhomogenizáltunk. A homogenizátumokat 90oC-on öt percig inkubáltuk,

amelyet egy 20 perces 37oC-os inkubáció követett, majd a fehérjéket SDS-poliakril-amid

gélelektroforézissel (Laemmli, 1970) választottuk el 1 mm vastag, 15%-os gélen 37,5:1 akril-

amid:biszakrilamid arány mellett. Minden egyes zsebbe 5 μl mintát vittünk fel.

Az elválasztott fehérjéket nitrocellulóz membránra (Protran, Schleicher & Schuell)

blottoltuk át metanol tartalmú pufferrel (25 mM TRIS, 192 mM glicin, 20% metanol). A

nitrocellulóz membránokat 5%-os tejport tartalmazó TBS-T pufferben (10 mM TRIS pH 8,0,

0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20) két órán át blokkoltuk, és két órán keresztül inkubáltuk PsbA

és PsbS (Agrisera) fehérjék elleni elsődleges antitestekkel, melyeket 5% tejport tartalmazó

TBS-T pufferben hígítottunk ki (1:6000 és 1:3000 arányban). A membránokat háromszor öt

percig mostuk TBS-T pufferben és kecskéből származó anti-nyúl IgG torma peroxidázzal

(HRP) konjugált másodlagos ellenanyaggal (Millipore) két órán át inkubáltuk 1:5000 hígítási

arányban 5% tejport tartalmazó TBS-T pufferben. Háromszor öt perces TBS-T pufferrel

történő mosás után az immunoblottolt membánokat öt percen át inkubáltuk ECL plus HRP

szubsztrátban (GE Healthcare Bio-Sciences) és a kemilumineszcenciát Hyperfilm ECL

fotografikus filmen (GE Healthcare Bio-Sciences) detektáltuk. Az előhívott filmet

digitalizáltuk és 1D Scan programcsomag segítségével analizáltuk.

4.11. Statisztikai analízis

A vizsgálati eredmények statisztikai feldolgozásához és kiértékeléséhez a Student t-tesztet

használtuk, a gyakorisági eloszlások hasonlóságát χ2 próbával ellenőriztük. A dolgozatban a

szignifikáns eltéréseket különböző tévedési valószínűségi szinteken jelöltük (a, b és c 0,1, 1 és

5%).

46

5. EREDMÉNYEK

5.1. Az elnyelt fényenergia hasznosításának összehasonlító vizsgálata a S. nigrum kétféle

biotípusában és a különböző növénynemzedékekben

Egy anyai öröklődésű faktor, a D1 fehérje hatásának vizsgálata céljából a S. nigrum AS és AR

szülő biotípusai között reciprok keresztezéseket végeztünk az F6 nemzedékig. Az így nyert

izonukleáris növényvonalak fotoszintetikus jellemzése mellett vizsgáltuk a D1 fehérje S264G

mutációjának hatását az elnyelt fényenergia sorsára. A keresztezések sikerességét, vagyis a

különböző vonalak sejtmagi hibridstátuszának meglétét egy mendeli tulajdonság

öröklődésének nyomonkövetésével bizonyítottuk.

5.1.1. A S. nigrum biotípusok és vonalak fotoszintetikus jellemzése

A 3. táblázatban a S. nigrum vonalak néhány állandósult (steady-state) fotoszintetikus

paraméterét mutatom be. Az infravörös gázelemző segítségével meghatározott maximális

asszimilációs ráták (Amax) közel azonosak voltak az AS és AR szülő biotípusokban, valamint

ezek reciprok keresztezéseiből való F1 és F2 hibridekben is. Valamennyi AR vonal (AR,

ARF1, ARF2) sötétadaptált leveleiben a PSII maximális hatásfoka (Fv/Fm) alacsonyabbnak

bizonyult, mint a vad típusokban (AS, ASF1, ASF2). Szignifikáns különbségek adódtak az

NPQ és a qE kioltási koefficiens értékeiben nemcsak a szülői AS és AR biotípusok között,

hanem ezek F1 és F2 utódaiban is (Student t-teszt). Az anyától örökölt vad

fenotípusú/genotípusú (AS, ASF1, ASF2) vonalakban a steady-state NPQ szintje elérte a kb.

2,6 értéket, ezzel szemben valamennyi AR vonalban (AR, ARF1, ARF2) az NPQ kb. 50%-kal

alacsonyabb volt (4. táblázat). Az NPQ gyorsan relaxálódó komponense, a ΔpH-függő qE,

még kifejezettebb, 60-70%-os esést mutatott az AR vonalakban a vad típusokhoz képest. A

lassan relaxálódó vagy qI értékek viszont megnőttek az AR vonalakban a qE rovására.

Az alkalmazott nevelési körülmények között az AR vonalak kissé alacsonyabb összes

Chl (a + b) tartalmakkal bírtak, és szignifikánsan alacsonyabb Chl a/b arányokkal, mint az AS

párjaik (4. táblázat). Azonban nem találtunk szignifikáns eltéréseket az AS és AR típusokban a

karotinoid összetétel, a xantofill ciklus készlet méret, vagy a xantofill ciklus készlet méret és

47

Chl tartalom aránya tekintetében. A megvilágított levelekben a xantofill de-epoxidációs index

(DEi) 20%-kal bizonyult alacsonyabbnak valamennyi AR vonalban (3. táblázat), habár a

különböző S. nigrum vonalak xantofill ciklus készlet méretében nem volt szignifikáns eltérés.

3. táblázat A különböző S. nigrum vonalak fotoszintetikus tulajdonságai

Biotípus Paraméter

AS AR ASF1 ARF1 ASF2 ARF2

Amax (μmol m-2 s-1) 18,4 ± 1,4 17,5 ± 1,7 17,8 ± 1,6 17,9 ± 1,5 18,1 ± 1,2 17,8 ± 1,4

Fv/Fm 0,830 ± 0,014 0,815 ± 0,015 0,824 ± 0,012 0,809 ± 0,019 0,825 ± 0,010 0,811 ± 0,012

NPQ 2,53 ± 0,21 1,32 ± 0,19a 2,65 ± 0,22 1,24 ± 0,15a 2,59 ± 0,18 1,33 ± 0,21a

qE 2,18 ± 0,12 0,72 ± 0,14a 2,24 ± 0,16 0,75 ± 0,17a 2,28 ± 0,20 0,81 ± 0,25a

qI 0,35 ± 0,03 0,60 ± 0,10c 0,41 ± 0,04 0,49 ± 0,06 0,31 ± 0,04 0,52 ± 0,16

DEi 0,67 ± 0,01 0,53 ± 0,02a 0,67 ± 0,02 0,55 ± 0,03a 0,65 ± 0,02 0,52 ± 0,02a

AS, vad biotípus; AR, D1 mutáns; ASF1 és ARF1, a szülői AS és AR biotípusok reciprok keresztezésiből való F1 hibridek; ASF2 és ARF2, F2 hibridek; Amax, maximális asszimilációs ráta (µmol m-2 s-1); Fv/Fm, PSII maximális hatásfoka; NPQ, steady-state nem-fotokémiai kioltás (1600 μmol foton m-2 s-1, 15 perc); qE, az NPQ gyorsan relaxálódó komponense; qI, az NPQ lassan relaxálódó komponense; DEi, a xantofill pigmentek steady-state de-epoxidációs indexe (½ × Ant + Zea)/(Vio + Ant + Zea). Az adatok három független kísérletből 12 ismétlés átlagai ± SD. Az “a és c” szignifikáns eltérést jelölik a kétféle biotípus között 0,1 és 5%-os tévedési valószínűségi szinten.

4. táblázat A különböző S. nigrum vonalak pigment összetétele

Biotípus Pigment

AS AR ASF1 ARF1 ASF2 ARF2 Chl a (μmol m-2) 212 ± 8 191 ± 5 220 ± 8 181 ± 8 216 ± 5 194 ± 3

Chl b (μmol m-2) 67 ± 4 71 ± 3 70 ± 4 76 ± 2 69 ± 4 71 ± 4

Chl a/b 3,17 ± 0,02 2,71 ± 0,04a 3,12 ± 0,03 2,36 ± 0,06a 3,14 ± 0,02 2,72 ± 0,03a

Karotinoidok (μmol m-2) 83 ± 2 78 ± 2 86 ± 4 82 ± 2 83 ± 3 81 ± 2

Chl (a+b)/Karotinoidok 3,36 ± 0,2 3,36 ± 0,2 3,37 ± 0,1 3,13 ± 0,2 3,43 ± 0,2 3,27 ± 0,2

Vio+Ant+Zea (μmol m-2) 15,7 ± 1,4 14,4 ± 1,7 15,6 ± 1,9 14,6 ± 1,0 15,6 ± 0,5 14,9 ± 1,2

(Vio+Ant+Zea)/(Chl (a+b)) (μmol mmol-1) 56 ± 3 54 ± 3 54 ± 4 57 ± 5 55 ± 2 56 ± 4

Az adatok három független kísérletből öt ismétlés átlagai ± SD. Az “a” szignifikáns eltérést jelöli a két biotípus között 0,1%-os tévedési valószínűségi szinten

48

A 5. ábrán a különböző S. nigrum vonalakban néhány fluoreszcencia kioltási paraméter

fényintenzitás függésének összehasonlítását mutatom be: (a) a PSII fotokémiájának hatásfoka

(ΦPSII); (b) a lineáris elektrontranszport ráta (JETR); és (c) a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1

– qP). Az emelkedő fényintenzitással a ΦPSII fokozatosan csökkent, míg a JETR és az 1 – qP

növekedett valamennyi biotípusban és vonalban. A ΦPSII és a JETR (5. a és b ábrák)

szignifikánsan alacsonyabb értékeket vettek fel a növekvő fényintenzitásokkal az AR

vonalakban, mint a vad, AS típusokban. Az AR vonalakban a PSII-re ható gerjesztési nyomás

(5. c ábra), ezáltal a redukált QA koncentrációja, szignifikánsan magasabb volt a közepes és a

magas fényintenzitásokon, mint az AS párjaikban (p=0,01).

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

0 500 10000

50

100

150

200

250

0 500 10000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

ΦP

SII

PPFD (µmol m-2 s-1)

(a)

J ETR

PPFD (µmol m-2 s-1)

(b)

1−qP

PPFD (µmol m-2 s-1)

(c)

5. ábra A PSII fotokémiájának hatásfoka (ΦPSII, a), a lineáris elektrontranszport ráta (JETR, b) és a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1 – qP, c) fényintenzitás függése a vad-típusú (AS, ASF2, ASF6) és a D1 mutáns (AR, ARF2, ARF6) S. nigrum vonalakban. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . Az adatok három független kísérletből 12 ismétlés átlagai. A SD a szülő (AS és AR) populációkban van feltüntetve.

A S. nigrum növények mért és a relatív változó (Ft – Fo)/(Fm – Fo) Chl fluoreszcencia

tranzienseinek átlagértékei a 6. a és b ábrákon láthatók. Megállapíthatjuk, hogy mindkét

biotípusban a kinetikák tipikus OJIP tranzienseket mutatnak. A 20 µs-nál mért fluoreszcencia

szintet tekintettük Fo-nak, a J szintet kb. 1,5-2 ms-nál, az I szintet kb. 30 ms-nál és a

maximális, P szintet (Fm) kb. 200 ms-nál éri el a tranziens az AS vonalakban, és később, kb.

280 ms-nál az AR biotípusokban. Szemmel láthatóan az S264G D1 mutáció hatással van a

49

tranziensek alakjára, és a szülő biotípus és a megfelelő hibridjei nem különböztek egymástól.

Az AR típusokban az Fo és FJ szintek szignifikánsan magasabb értékeket mutattak (p=0,05),

az Fm szintek pedig alacsonyabbakat (az ARF2 kivételével), mint az AS párjaikban. Az FI

tranziens kevésbé kifejezetten jelent meg az AR, mint az AS típusban, azonban szignifikáns

különbség csupán az F2 hibridek esetében adódott.

0.01 0.1 1 10 100 10000

500

1000

1500

2000

2500(a)

O

P

I

J

Chl

a fl

uore

szce

ncia

(rel

. egy

ség)

Log idõ (ms)

O

0.01 0.1 1 10 100 10000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 (b)P

I

J AS ASF2 ASF6 AR ARF2 ARF6

Nor

m. C

hl a

fluo

resz

cenc

ia

Log idõ (ms)

6. ábra Gyors Chl fluoreszcencia tranziensek (OJIP) AS (üres szimbólum) és AR (teli szimbólum) S. nigrum biotípusok leveleiben és hibridjeikben, melyeket 1 s időtartamig, 3000 μmol foton m-2 s-1 fotonáram-sűrűséggel világítottunk meg. AS és AR, szülő, és

; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . A mért görbéket logaritmikus időskálán ábrázoltuk (a). A (b) panel a változó fluoreszcenciára (Fv) normalizált görbéket mutatja, (Ft – Fo)/(Fm – Fo). Az adatok három független kísérlet egyikét reprezentálják, ahol n = 16.

A 5. táblázatban bemutatom a S. nigrum vonalakra jellemző JIP-teszt paramétereket. Az AR

növényekben a PSII primér fotokémiájának maximális hatásfoka (ϕPo = Fv/Fm) szignifikánsan

alacsonyabbnak bizonyult AS párjaikkal szemben. A RC-ok záródásának nettó sebessége, azaz

a normalizált fluoreszcencia görbe kezdeti meredeksége (Mo), szignifikánsan megnőtt a QA

redukált formájának fokozott felhalmozódása miatt (VJ) az AR típusokban.

50

5. táblázat JIP-teszt paraméterek a különböző S. nigrum vonalakban

Biotípus

JIP-teszt paraméter AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

φPo (Fv/Fm) 0,821 ± 0,007 0,801 ± 0,011a 0,826 ± 0,003 0,793 ± 0,023a 0,829 ± 0,003 0,796 ± 0,026a

φDo 0,179 ± 0,007 0,199 ± 0,011a 0,174 ± 0,003 0,207 ± 0,023a 0,171 ± 0,003 0,204 ± 0,026a

Mo 0,787 ± 0,108 0,906 ± 0,062a 0,769 ± 0,048 0,913 ± 0,086a 0,728 ± 0,045 0,986 ± 0,091a

VJ 0,382 ± 0,036 0,497 ± 0,014a 0,382 ± 0,013 0,517 ± 0,024a 0,374 ± 0,016 0,528 ± 0,013a

VI 0,784 ± 0,034 0,776 ± 0,020 0,768 ± 0,028 0,727 ± 0,019b 0,762 ± 0,026 0,761 ± 0,025

ψEo 0,618 ± 0,036 0,505 ± 0,021a 0,618 ± 0,013 0,486 ± 0,023a 0,626 ± 0,016 0,471 ± 0,013a

φEo 0,507 ± 0,025 0,405 ± 0,019a 0,511 ± 0,011 0,385 ± 0,025a 0,519 ± 0,015 0,373 ± 0,019a

ψRo 0,216 ± 0,034 0,224 ± 0,021 0,232 ± 0,015 0,258 ± 0,019b 0,237 ± 0,029 0,244 ± 0,029

φRo 0,177 ± 0,027 0,179 ± 0,016 0,192 ± 0,023 0,218 ± 0,018 0,197 ± 0,022 0,193 ± 0,026

δRo 0,348 ± 0,041 0,447 ± 0,038a 0,376 ± 0,042 0,573 ± 0,065a 0,379 ± 0,032 0,518 ± 0,064a

ETo/RC 1,285 ± 0,064 0,872 ± 0,044a 1,242 ± 0,050 0,862 ± 0,060a 1,218 ± 0,036 0,876 ± 0,059a

REo/RC 0,426 ± 0,044 0,422 ± 0,049 0,483 ± 0,064 0,496 ± 0,086 0,462 ± 0,045 0,441 ± 0,055

PIabs 29,60 ± 5,62 18,77 ± 3,59a 31,79 ± 3,27 16,85 ± 4,93a 34,98 ± 3,57 15,42 ± 3,41a

PItotal 16,29 ± 4,94 15,12 ± 3,56 19,31 ± 3,91 22,15 ± 3,29c 19,22 ± 4,14 16,80 ± 4,08c Az adatok három független kísérlet egyikét reprezentálják, ahol n = 16. Az “a, b, és c” szignifikáns eltérést jelölik a két biotípus között 0,1, 1 és 5%-os tévedési valószínűségi szinten. Magyarázat: φPo (Fv/Fm), PSII primér fotokémiájának maximális hatásfoka; φDo, energia disszipáció hatásfoka; Mo, fluoreszcencia tranziens V = f(t) approximatív kezdeti meredeksége (ms-1), a RC-k záródásának nettó sebessége; VJ, relatív változó fluoreszcencia a J inflexiónál, mely tükrözi mind a QA

– felhalmozódásának, mind re-oxidációjának sebességét; VI, relatív változó fluoreszcencia az I inflexiónál, mely a plasztokinol re-oxidációjának sebességét tükrözi; ψEo, annak a valószínűsége, hogy egy RC által befogott exciton egy elektront az elektrontranszportláncba juttat a QA

–-n túl; φEo, elektrontranszport hatásfoka a köztes elektron hordozók irányában (azaz egy elnyelt foton milyen hatásfokkal eredményez elektrontranszportot a QA

–-n túl); ψRo, annak a valószínűsége, hogy egy RC által befogott exciton egy elektront az elektrontranszportláncba juttat a QA

– felől a PSI végső elektron akceptorokhoz; ϕRo, a PSI végső elektron akceptorok redukciójának hatásfoka az elnyelt fotonok arányában; δRo, annak a valószínűsége, hogy egy elektron a köztes elektron akceptorok felől a PSI végső elektron akceptorokhoz jut; ETo/RC, elektrontranszport fluxusa (a QA

--on túlra definiált) per RC; REo/RC, PSI végső elektron akceptor redukciójának fluxusa per RC; PIabs, a PSII által elnyelt fotonoktól a köztes elektron akceptorok redukciójáig tartó energia konverziót jellemző fotoszintetikus teljesítmény index; PItotal, a PSII által elnyelt fotonoktól a PSI végső elektron akceptorokig tartó energia konverziót jellemző teljes fotoszintetikus teljesítmény index.

51

További informatív paraméterek értékei, úgymint (i) annak a valószínűsége, hogy egy RC által

befogott exciton egy elektront az elektrontranszportláncba juttat a QA–-n túl (ψEo), (ii) az

elektrontranszport fluxusa per RC (ETo/RC) és (iii) a fotoszintetikus teljesítmény index (PIabs)

valamennyien szignifikánsan csökkentek, míg az energia disszipáció hatásfoka (ϕDo)

megemelkedett az AR típusokban, az AS vonalakhoz képest (5. táblázat). A mutációt hordozó

vonalak PIabs értékei 50%-os csökkenést mutattak, ami a szignifikánsan alacsonyabb

gerjesztési energia befogási aránynak ϕPo/(1 – ϕPo), valamint a gerjesztési energia

elektrontranszportba történő kisebb arányú konverziójának ψEo/(1 – ψEo) köszönhető (7. ábra).

-75 -50 -25 0 25 50 75 100 125

Relatív változás (%) az AR típusban az AS-hez képest

P F2 F6

PIabs

RC/ABS

ϕPo/(1-ϕPo)

ψEo/(1-ψEo)

δRo/(1-δRo)

PItotal

7. ábra A D1 protein mutáció hatása a fotoszintetikus teljesítmény indexekre (PIabs és PItotal), és komponenseikre, nevezetesen: (1) a QA-redukáló RC-ok per PSII antenna Chl (RC/ABS); (2) a gerjesztési energia befogás és disszipáció aránya (QA

--ig definiálva) (ϕPo/(1 – ϕPo); (3) az elektrontranszportba történő gerjesztési energia konverzió (és konkurrens disszipáció) aránya (QA

--n túlra definiálva) (ψΕo/(1 – ψΕo)); (4) a redukált köztes elektron akceptorok felől a PSI végső akceptorokhoz eljutó és el nem jutó elektronok aránya (δRo/(1 – δRo)). AS és AR szülő populáció, a S. nigrum vad és D1 mutáns biotípusai; P, szürke oszlop, szülő populáció; és ezek F2 és F6 hibridjei, rendre F2 és F6, fehér és fekete oszlopok. A vízszintes oszlopok a különböző paraméterek relatív változásait jelölik %-ban az AR típusban az AS-hez viszonyítva. Az adatok három független kísérlet egyikét reprezentálják, ahol n = 16.

52

Az OJIP tranziensekből JIP-teszt analízissel nyomonkövethető az elektronok

vándorlása a redukált köztes elektron akceptoroktól (QB, PQ, Cyt b6/f és plasztocianin) a PSI

akceptor oldali komponenseinek (NADP+ és Fd) redukciójáig, valamint meghatározható a

teljes, a PSI végső akceptorokig tartó, fotoszintetikus teljesítmény index (PItotal) (5. táblázat).

Annak a valószínűsége, hogy egy elektron a köztes elektron akceptorok felől a PSI végső

elektron akceptorokhoz jut (δRo), szignifikánsan megemelkedett az AR vonalakban AS

párjaikhoz képest, miközben nem találtunk szignifikáns eltéréseket a kétféle biotípusban a PSI

végső elektron akceptorok redukciójának fluxusa per RC tekintetében (REo/RC), a PSI végső

elektron akceptorok redukciójának hatásfokában az elnyelt fotonok arányában (ϕRo), valamint

annak a valószínűségében sem, hogy egy RC által befogott exciton egy elektront az

elektrontranszportláncba juttat a QA– felől a PSI végső elektron akceptorokhoz (ψRo). A PItotal a

fotoszintetikus teljesítmény index (PIabs) és a δRo/(1 – δRo) arányszám szorzata, amely a

redukált köztes elektron akceptorok felől a PSI végső akceptorokhoz jutó elektronok aránya. A

δRo/(1 – δRo) arányszám emelkedésének köszönhető teljesítmény-növekedés valószínűleg

kompenzálhatja a PSII akceptor oldali alacsonyabb elektronáram-sebességet az AR típusban,

nem szignifikáns mértékben eltérő PItotal értékeket eredményezve ezzel a kétféle biotípusban

(5. táblázat).

5.1.2. Az NPQ és az elnyelt fényenergia allokációja a PSII-ben

A 8. ábra bemutatja az NPQ fényintenzitástól való függését (a), és 1250 μmol foton m-2 s-1

aktinikus fénnyel történő indukcióját valamint sötétrelaxációját (b). Jellemzően a

fényintenzitás emelkedésével az NPQ növekedett valamennyi biotípusban és vonalban. Az AR

szülő biotípus és hibridjei szignifikánsan alacsonyabb NPQ kapacitással bírtak, mint az AS

párjaik (8. a ábra). A ΦPSII, JETR, NPQ és 1 – qP paraméterek fényintenzitás függése a PSII

működésének lecsökkent regulációs képességéről árulkodik valamennyi AR típusban (AR,

ARF2, ARF6) az AS párjaikkal szemben (AS, ASF2, ASF6) (5. a, b, c és 8. a ábrák). A

sötétadaptált levél megvilágítása után az NPQ kialakulása során két fázis különíthető el, egy

gyors és egy lassú. Az AS típusokban egy gyors kezdeti emelkedés figyelhető meg, mely kb.

60 s alatt éri el az 1,1 értéket, és jórészt független a xantofill ciklus működésétől (8. b ábra),

melyet egy xantofill ciklus függő, lassabb emelkedés követ, 15 perc alatt elérve a közel

53

steady-state 1,7 értéket. Ezt követően az aktinikus fény kikapcsolása után az NPQ

relaxálódott, melynek féléletideje az AS típusokban kb. 2,8 ± 0,2 perc volt.

0 500 10000.0

0.5

1.0

1.5

2.0 AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

PPFD (μmol m-2 s-1)

(a)

NP

Q

0 10 200.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Idõ (min)

(b)

8. ábra Az NPQ aktinikus fényre adott válaszgörbéi (a) és az NPQ indukciója (1250 μmol foton m-2 s-1, 15 perc) és sötétrelaxációja (b) AS (üres szimbólum) és AR (teli szimbólum) S. nigrum biotípusok leveleiben. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . Az adatok három független kísérletből 12 ismétlés átlagai. A SD a szülő (AS és AR) populációkban van feltüntetve.

Az AR biotípusban viszont az NPQ legnagyobb része a megvilágítás első percében kialakult,

de a gyors kezdeti fázis kb. 25%-kal volt alacsonyabb, mint az AS típusokban. Majd némileg

lassan emelkedett és elérte az 1,1-hez közeli steady-sate értéket. Az NPQ relaxáció féléletideje

kb. 5,0 ± 0,3 perc volt az AR típusok esetében.

A D1 fehérje mutáció hátterének és lehetséges következményeinek megértése

érdekében megvizsgáltuk a PSII antenna által elnyelt fényenergia sorsát. Az elnyelt energia

egyrészt fotokémiailag hasznosulhat, másrészt a disszipatív folyamatok eliminálhatják a PSII

antennarendszeréből. A 9. ábra az elnyelt fényenergia PSII-ben történő megoszlásának

fényintenzitás függését mutatja be Demmig-Adams és munkatársai (1996) modellje alapján.

Mindkét biotípusban a fotokémia által hasznosuló energia frakció (ΦPSII) csökkenő tendenciát

mutatott a beeső fényintenzitás növelésekor, míg a fényben disszipált energia (ΦDL) illetve az

54

ún. többletenergia disszipáció (ΦE) egyaránt növekedett a fényintenzitás emelkedésével. Az

AS és AR szülő biotípusok között és a megfelelő hibridjeik között jellegzetes különbségek

mutatkoztak (9. a és b ábrák). A ΦPSII szignifikánsan, kb. 30%-kal volt kisebb valamennyi AR

vonalban, azonban a ΦDL kb. 35%-kal, a ΦE pedig kb. 80%-kal megemelkedett az AR

típusokban AS párjaikhoz képest.

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AS ASF2 ASF6

ΦDD

ΦDL

ΦPSII

ΦE

PPFD (μmol m-2 s-1)

Ene

rgia

allo

káci

ó a

PS

II-be

n

PPFD (μmol m-2 s-1)0 500 1000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

AR ARF2 ARF6

(b)(a)

ΦDD

ΦDL

ΦPSII

ΦE

9. ábra Az elnyelt fényenergia megoszlása a PSII-ben Demmig-Adams és munkatársai (1996) modellje szerint az AS (üres szimbólum) (a) és az AR (teli szimbólum) (b) S. nigrum biotípusok leveleiben és ezek hibridjeiben. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . ΦE, ΦPSII, ΦDL és ΦDD: rendre, a többletenergia, a PSII fotokémiára hasznosuló energia, a fényben történő hődisszipáció és a sötétben történő energiaveszteség frakciói. A nyíllal jelölt, görbék közti területek a megfelelő hatásfokokkal arányosak. Az adatok három független kísérletből 6-7 ismétlés átlagai. A SD a szülő (AS és AR) populációkban van feltüntetve.

Egy ennél egyszerűbb modell alkalmazásával (Hendrickson et al., 2004)

mennyiségileg meghatároztuk a gerjesztési energia allokációját (10. ábra), amely három

egymást kiegészítő PSII hatásfokon alapszik. A gerjesztési energia hasznosulhat a fotokémia

55

által (ΦPSII), illetve eliminálódhat a regulált hődisszipáció (ΦNPQ) és a nem-regulált

(konstitutív) energia disszipáció (ΦNO) során a PSII-ben. A 10. ábrán láthatók a ΦPSII, ΦNPQ és

ΦNO fényintenzitás függéseinek összehasonlítása a S. nigrum vonalakban (10. a, c és e ábrák);

valamint a fotokémiában hasznosuló elektronok transzportjának sebessége (JETR), a regulált

(JNPQ) és a nem-regulált disszipációs folyamatok sebességei (JNO) (10. b, d és f ábrák),

amelyek a leveleken meghatározott Fm, F’m és F fluoreszcencia paraméterekből számolhatók.

A ΦPSII értékei közel azonos sebességgel csökkentek a kétféle biotípusban a fényintenzitás

növekedésével, azonban az AR következetesen alacsonyabb értékeket vett fel (10. a ábra)

(ahogy ezt már az 5. a és 9. ábrákon is szemléltettem), mialatt a JETR növekedési üteme az AR

típusokban hangsúlyosabban lecsökkent (10. b és 5. b ábrák). A ΦNPQ és JNPQ (10. c és d

ábrák) aktinikus fényre adott válaszgörbéi az AS és AR szülő biotípusokban, valamint a

hibridjeikben is megegyeztek. Alacsony fényintenzitásokon a JNPQ igen alacsony volt, majd

exponenciálisan emelkedett a fényintenzitással mindkét biotípusban (10. d ábra). A ΦNO

értékeiben szignifikáns emelkedést (kb. 60-80%) tapasztaltunk az AR vonalakban az AS

párjaikkal összevetve (p=0,001) (10. e ábra), ami enyhén emelkedett a fényintenzitással. Az

AS növényekben a ΦNO értékek a sötétadaptált mintákra jellemző Fo/Fm értékeket közelítették,

és a fényintenzitás emelkedése gyakorlatilag nem befolyásolta a hatásfokot. A konstitutív

energia disszipáció sebességei (JNO) mindkét típusban lineárisan emelkedtek, az emelkedés az

AR típusokban szignifikánsan meredekebb volt (10. f ábra).

Az NPQ kialakulásában a PsbS fehérjének kulcsfontosságú szerepet tulajdonítanak.

Felmerült, hogy egy esetleges pontmutáció a psbS génben részben magyarázhatná az AR

biotípus alacsonyabb fény-indukált NPQ kapacitását, ezért meghatároztuk a S. nigrum AS és

AR biotípusainak psbS génszekvenciáját annak érdekében, hogy felfedjük a PsbS fehérje

esetleges aminosav változásait. A psbS génre specifikus primer párokat (primerek Pr-SniF1,

Pr-SniR1, Pr-SniF2, Pr-SniR2 és Pr-SniStop-F1, Pr-SniStop-R1, lásd: Anyag és Módszer

fejezet 2. táblázata) terveztünk és szintetizáltattunk a S. nigrum egy közeli rokona, a S.

sogarandinum PsbS cDNS szekvenciájának (Gén Bank nyilvántartási szám: AF311720)

ismert nukleotid sorrendje alapján. Az AS és AR biotípusokban a teljes hosszúságú psbS gén

szekvenciájában négy nukleotidot érintő különbséget kaptunk. Ezek közül kettő intronokban

lokalizált, a másik két változás, a két érintett kodon harmadik pozíciójában található, amelyek

56

nem változtatják meg az aminosav kódot: GGT GGC mindkettő glicint kódol és

ACC ACT mindkettő treonint kódol.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

50

100

150

200

250

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0

50

100

150

200

250

0 500 10000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 500 10000

50

100

150

200

250

ΦPS

II

AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

(a) (b)

J ETR

(µm

ol e

- m-2 s

-1)

(c)

ΦN

PQ

(d)

J NP

Q (µ

mol

m-2 s

-1)

(e)

ΦN

O

PPFD (µmol m-2 s-1)

(f)

J NO (µ

mol

m-2 s

-1)

PPFD (µmol m-2 s-1)

10. ábra A PSII komplementer hatásfokainak (Hendrickson et al., 2004) és e folyamatok sebességeinek fényintenzitás függése AS (üres szimbólum) és AR (teli szimbólum) S. nigrum biotípusok leveleiben, és hibridjeikben. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . Grafikonok: (a, b) a fotokémiai energia konverzió hatásfoka ΦPSII; (c, d) a regulált energia disszipáció hatásfoka ΦNPQ; (e, f) a nem-regulált energia disszipáció hatásfoka ΦNO. JETR, JNPQ, JNO, rendre a lineráis elektrontranszport, a regulált hődisszipáció és a nem-regulált energia disszipáció sebességeit jelölik. Az adatok három független kísérletből 12 ismétlés átlagai. A SD a szülő (AS és AR) populációkban van feltüntetve.

57

Tehát a szekvencia analízis alapján a S. nigrum növény AS (Gén Bank nyilvántartási szám:

DQ632747) és AR (Gén Bank nyilvántartási szám: DQ632748) biotípusaiban azonosak a PsbS

fehérjék, azaz nem tartalmaznak aminosav eltérést (11. ábra). A S. nigrum biotípusok DNS

szekvenciájából levezetett aminosav szekvencia nagyfokú homológiát mutat a Genebank-ban

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) megtalálható egyéb PsbS fehérje szekvenciákkal.

1 38 MAQTMLL---TANAKVDLRSKESLVERLKPKPLSSLFLPSLPLRFSSSST 39 85 NASSSKFTSTTVALF-KSKAK-APPKKVAPPKQKEKVEDGIFGTSGGIGF 86 * * * * 135 TKQNELFVGRVAMIGFAASLLGEAITGKGILAQLNLETGIPIYEAEPLLL 136 183 FFILFNLLGAIGALGDRGRFIDDPAPATGLEKAVIPPGKSFKSALGLSEG 184 * * 232* GPLFGFTKANELFVGRLAQLGIAFSIIGEIITGKGALAQLNFETGVPINE 234* 265 IEPLLLFNIAFFFFAAINPGTGKFITDEED*.........

11. ábra A S. nigrum PsbS fehérjéjének várható aminosav szekvenciája. A számozás az A. thaliana szekvenciáján alapul. A hasítási helyet, ahol a fehérjét elvágtuk a kloroplasztisz targeting alatt, nyíl jelzi. A csillagok azt a nyolc darab vélt H+-kötő aminosavat jelölik, melyek várhatóan a tilakoid lumennel szemben helyezkednek el.

A PsbS fehérje expressziós szintje fontos tényező lehet a növény teljes NPQ

kapacitásának meghatározásakor. Immunoblot módszerrel specifikus antitestek alkalmazásával

megvizsgáltuk a PsbS és a D1 fehérjék expresszióját, hogy felfedjük, vajon a PsbS fehérje

szerepet játszik-e az AS és AR vonalak eltérő NPQ kapacitásában (12. ábra). A PsbS és PsbA

western blotjainak denzitometriai analízisén végzett student t-teszt nem mutatott szignifikáns

eltérést a fehérje mennyiségében az AS és az AR vonalak között (p=0,05). Azonfelül e két

kulcsfehérje aránya gyakorlatilag változatlan maradt a biotípusokban.

58

12. ábra S. nigrum növény AS

és AR szülő, valamint ezek

reciprok keresztezéseiből

származó F2 és F6

utódnövények PsbA (D1) és

PsbS fehérjéinek tipikus

immunoblot analízise és ezek

relatív tartalma. A relatív

fehérje tartalom adatai átlag

± SD (n = 5-6).

5.1.3. A S. nigrum vonalak sejtmagi hibrid státuszának igazolása

Mivel a psbA gén citoplazmatikus, a psbS gén pedig sejtmagi öröklődésű, fontos azt

megerősítenünk, hogy az AS és az AR szülő biotípusok reciprok keresztezése sikeres volt-e.

Független belső indikátorként egy mendeli tulajdonságot, a levélszél alakjának öröklődését

követtük nyomon, mely bizonyítja az F2 növényi anyag sejtmagi hibrid státuszának meglétét. A

levélszél tekintetében síma, csipkézett vagy köztes típust találtunk (13. ábra), amelyek

különböző gyakorisággal fordultak elő a szülő populációkban (6. táblázat). Miként az F2

nemzedék levélszél típusának várható – a Hardy-Weinberg modell szerint kalkulált –

szegregációja és a kísérletesen megfigyelt adatok nem különböztek szignifikánsan (7. táblázat;

P<0,05; χ2 teszt), biztonsággal megállapíthattuk, hogy a levélszél alakja a mendeli szabályok

szerint öröklődött, mely az F2 populáció hibrid státuszának meglétét bizonyítja.

D1

PsbSA

S

ASF2

AS

F6

AR AR

F2

AR

F6

0

1000

2000

3000

4000

5000

AS

ASF2

ASF6 AR

ARF2

ARF6

Prot

ein

tart

alom

(rel

. egy

ség)

PsbSPsbA

59

13. ábra A S. nigrum levélszéle síma, csipkézett vagy köztes típusú volt.

6. táblázat A S. nigrum szülő populáció levélszél típusai és

az NPQ (vagy qE) karakterisztika

Levélszél típus gyakoriság Szülő populáció

síma köztes csipkézett

NPQ (vagy qE)

Atrazin-szenzitív 0,67 0,11 0,22 Magas

Atrazin-rezisztens 0,01 0,11 0,88 Alacsony

n = 208 mindkét szülőpopuláció estetében

7. táblázat S. nigrum F2 populáció tulajdonságai és az NPQ (vagy qE) tulajdonság

Különböző levélszéltípusú

növények darabszáma Genetikai keresztezés Eredménysíma köztes csipkézett

Atrazinra adott

válasz

NPQ (vagy qE)

Megfigyelt 13 31 41 szenzitív ♀♀ × rezisztens ♂♂

Várható* 14 22 49 Mind

szenzitív Magas

Megfigyelt 22 52 68 rezisztens ♀♀ × szenzitív ♂♂

Várható* 14 53 75 Mind

rezisztens Alacsony

*A szülőkben és az F1 populációban előforduló allélgyakoriságok alapján határoztuk meg

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

Csipkézett szélűSíma, épszélű Részlegesencsipkézett-hullámos

60

Valamennyi F1 és F2 utódnövény (F6 nemzedékig), mely AS ♀ × AR ♂ keresztezésből való

volt, AS, és valamennyi utódnövény, amely AR ♀ × AS ♂ keresztezésból származott, AR

biotípusú volt, amely bizonyította a kloroplasztisz-DNS által kódolt atrazin rezisztencia anyai

öröklődését. Az alacsonyabb NPQ (vagy qE) tulajdonság az anyai öröklődésű AR jelleget

követte. Annak bizonyítására, hogy a D1 fehérje valóban hordozza-e az S264G mutációt az

AR vonalakban, megszekvenáltuk a fehérjének a mutációt is kódoló DNS szakaszát.

Valamennyi megszekvenált rezisztens vonal AR, ARF2 és ARF6 D1 fehérjéje hordozta a

mutációt, mely a Ser264 Gly aminosav cseréért felelős, míg a szenzitív vonalakban (AS,

ASF2, ASF6) ugyanabban a pozícióban szerin volt kódolva. A reciprok keresztezések ASF6

és ARF6 generációjával folytatott kísérletek igazolták, hogy a D1 mutáns biotípusban

megfigyelt fluoreszcencia paraméterek különbségeit, beleértve az NPQ-t is, a kloroplasztisz

genom határozza meg.

61

5.2. A vízdeficit hatásának összehasonlító vizsgálata S. nigrum kétféle biotípusában és a

különböző növénynemzedékekben

5.2.1. A vízdeficit hatása a növények vízállapotára és a gázcseréjére

A továbbiakban a vízhiány (szárazság) fotoszintézisre gyakorolt hatásának összehasonlítását

mutatom be S. nigrum AS és AR biotípusaiban. A szárazság napjainkban igen fontos

környezeti tényezővé vált, amely a növekedés gátlását eredményezi a fotoszintézis limitálása

révén. A vetés utáni kb. 40-42. napon, amikor a növényeket jó vízellátású kontroll állapotúnak

definiáltuk, egy részüktől megvontuk az öntözést. A növények vízállapotát és gázcseréjét

jellemző paraméterek alapján három szakaszt különítettünk el a vízhiány időbeni vizsgálata

során: enyhe szárazság (5-7 nap vízmegvonást követően), közepes szárazság (13-15 nap), és

erős szárazság (18-19 nap), melyeket DH1 (dehydration state 1), DH2 (dehydration state 2), és

DH3 (dehydration state 3) jelöléssel illettük. A vízmegvonás különböző szakaszaiban a

növények egy részét a rehidráció után tovább vizsgáltuk, és RH1, RH2 vagy RH3 (rehydration

sate 1, 2 és 3) jelöléssel illettük (lásd: Anyag és Módszer fejezet).

A sztómasűrűség a levél abaxiális felületén kissé különbözött a jó vízellátású kontroll

AS és AR szülő biotípusokban (28 ± 4 mm-2 és 20 ± 4 mm-2). A progresszív vízdeficit hatására

a sztóma vezetőképesség (gs), a levél vízpotenciál (Ψ) és a levél relatív víztartalom (RWC)

értékei csökkentek (14. a, b ábrák és 8. táblázat). A gs és a Ψ paraméterek értékei (kb. 490

mmol m-2 s-1 és -0,34 MPa) közel azonosak voltak a kontroll biotípusokban (14. a és b. ábrák),

és az RWC (kb. 91%) szintén nem különbözött az AS és AR növényekben (8. táblázat). A

vízmegvonást követő ötödik napon (DH1) erőteljes sztóma konduktancia csökkenés

mutatkozott mindkét biotípusban (14. a ábra). A sztómazáródás mértéke szignifikánsan

nagyobbnak bizonyult az AS, mint az AR típusban (14. a ábra), miközben az RWC (kb. 90%)

és a Ψ (-0,38 MPa) értékekben még nem mutatkozott változtás a kontrollokhoz képest (8.

táblázat és 14. b ábra). Majd a vízhiány további szakaszában a drasztikus gs csökkenést a Ψ

csökkenése is követte. Azonban az AR típusban a gs és Ψ csökkenése lassabban és kevésbé

kifejezetten valósult meg, mint az AS párjában A vízdeficit DH2 (13-15 nap) szakaszában az

RWC értékeiben jelentős visszaesés történt, mely hasonló mértékű volt (60-80%) a kétféle

biotípusban, a gs értékek mindkét biotípusban a nullát közelítették, a Ψ értékei pedig elérték a

62

-2,5 MPa-t. A DH3 szakaszban a levelek fonnyadtsága miatt a vízpotenciál mérése már nem

volt kivitelezhető, a gs értéke nulla volt, a RWC értékei a kétféle biotípusban hasonló

mértékben 30-55%-ra csökkentek (8. táblázat).

Kontroll DH1 DH1/DH2 DH1/DH2 DH20

100

200

300

400

500

600

g s (mm

ol H

2O m

-2 s

-1)

AS AR

c

(a)

Kontroll DH1 DH1/DH2 DH1/DH2 DH2

-3.0

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

Ψ (M

Pa) c

c

5-6 nap 7-8 nap 10-11 nap 15-16 nap

5-6 nap 7-8 nap 10-11 nap 15-16 nap

(b)

14. ábra A vízmegvonás hatása a sztóma konduktanciára (gs) (a) és a levél vízpotenciáljára (Ψ) (b) S. nigrum AS (üres oszlop) és AR (teli oszlop) biotípusaiban. Az adatok három független kísérletből 9-11 ismétlés átlagai ± SD. A “c” szignifikáns eltérést jelöli a két biotípus között 5%-os tévedési valószínűségi szinten.

8. táblázat A relatív víztartalom alakulása a S. nigrum AS és AR biotípusában

Relatív víztartalom alakulása a vízhiány hatására (%)

Biotípus Kontroll DH1 (5-7 nap) DH2 (13-15 nap) DH3 (18-19 nap)

AS 91,6 ± 1,8 89,0 ± 2,3 60-80 30-55

AR 91,4 ± 1.3 90,1 ± 2,4 60-80 30-55

A napok a vízmegvonás időtartamát jelölik a vízhiány egyes szakaszaiban

63

A szárazság elsődleges célpontjai közé tartozik a fotoszintézis. A 15. ábrán jó

vízellátású kontroll, vízhiányos (DH1 és DH2) és rehidratált (RH2) S. nigrum növények intakt

levelein meghatározott CO2 asszimiláció (A) fényintezitás függését láthatjuk. A méréseket

fotorespirációs és nem-fotorespirációs körülmények között végeztük (360 µmol CO2 mol-1, és

21% illetve 1% v/v O2). A két, jó vízellátású kontroll AS és AR szülő biotípusban nem

tapasztaltunk szignifikáns eltéréseket a maximális asszimilációs rátákban (Amax) még nem-

fotorespirációs körülmények között sem (15. a és b ábrák). A kétféle biotípus fénylégzésének

sebessége (15. c ábra), mely az 1% és 21% O2 tartalmú levegőben meghatározott

asszimilációs ráták különbségéből számolható, sem tért el szignifikánsan egymástól. A

vízhiány a sztómák záródásához vezet (14. a ábra), ami a CO2 fixáció mértékének csökkenését

eredményezte mindkét biotípusban (15. d és e ábrák). Az AR növény fotoszintézisének

intenzitása a DH1 szakaszban magasabbnak bizonyult (15. d és e ábrák) a fényintenzitás

növekedésével, mint az AS párjáé. A fénylégzés intenzitásának fénytelítési értékei közel

azonosak maradtak a kontrollokéhoz képest (15. f ábra), tehát a fénylégzés mértéke a kisebb

CO2 megkötés sebessége mellett megemelkedett. A közepes fokú szárazság esetén (DH2) a

CO2 asszimiláció intenzitásában további esést figyelhettünk meg mindkét biotípusban (15. g

és h ábrák), és az AR továbbra is némileg felülmúlja a vad AS típust. A fotorespiráció

abszolút értékeiben csökkenést tapasztaltunk mindkét biotípusban (kontrollok és DH1-hez

képest 15. i ábra). A vízhiány harmadik szakaszában (DH3) mérhető sztóma konduktancia és

CO2 asszimiláció már nem volt észlelhető. A vízhiány egyes szakaszaiban a növények egy

részét rehidratáltuk, és 24 óra elteltével azt tapasztaltuk, hogy a CO2 fixálás sebessége enyhén

növekedett, illetve részlegesen visszaállt (15. j és k ábrák, RH2). A növények

fotorespirációjának számított sebességei az RH2 állapotú növényekben alacsonyabbak voltak

mind a DH2, mind a kontrollokhoz képest, és közel azonos értékeket vettek fel a kétféle

rehidratált biotípusban (15. l ábra). Mialatt a fotorespiráció intenzitásának abszolút értékei a

vízmegvonás hatására csökkentek a kontrollokéhoz képest, a fotorespiráció mértéke, vagyis a

Rubisco enzim által katalizált oxigenáció a karboxilációhoz viszonyítva megemelkedett.

64

-5

0

5

10

15

20

25

-5

0

5

10

15

20

25

-5

0

5

10

15

20

25

-5

0

5

10

15

20

25

-5

0

5

10

15

20

25

-5

0

5

10

15

20

25

0 500 1000-5

0

5

10

15

20

25

0 500 1000 0 500 1000-5

0

5

10

15

20

25

(a)

Kontroll

Kontroll 21% O2

φAS=0,044

φAR=0,039C

(b)

1% O2

φAS=0,061

φAR=0,051C

(c)

AS AR

Kontroll

DH1

φAS=0,020φAR=0,025

21% O2 1% O2

(d) (e)

DH1

φAS=0,042φAR=0,045

(f)

DH1

(g)

DH2

φAS=0,009φAR=0,009

21% O2 1% O2

(h)

DH2

φAS=0,019φAR=0,028

(i)

DH2

(j)

CO

2 ass

zim

iláci

ó se

bess

ége

(µm

ol C

O2 m

-2 s

-1)

PPFD (µmol m-2 s-1)

RH2

φAS=0,028φAR=0,025

21% O2 1% O2

(k)

RH2

PPFD (µmol m-2 s-1)

φAS=0,042φAR=0,040

(l)

Foto

resp

iráci

ó (µ

mol

CO

2 m-2 s

-1)

PPFD (µmol m-2 s-1)

RH2

15. ábra A CO2 asszimiláció (A) és a fénylégzés sebességének fényintenzitás függése progresszív vízmegvonás és rehidráció alatt 360 µmol CO2 mol-1 koncentráció mellett és 25-28ºC hőmérsékleten. a, d, g, j, 21% v/v O2; b, e, h, k,: 1% v/v O2; c, f, i, l, fotorespiráció számított értékei (A1% - A21%), AS, a S. nigrum vad biotípusa (üres szimbólum); AR, a S. nigrum D1 mutáns biotípusa (teli szimbólum). Kontroll: jó vízellátású; DH1: enyhe szárazság; DH2, közepes szárazság; RH2: rehidratált DH2-ből. φ, a fotoszintézis relatív hatásfoka, a görbe lineáris szakaszának kezdeti meredekségéből számolva. Az adatok három független kísérletből 5-7 ismétlés átlagai ± SD. A “c” szignifikáns eltérést jelöli a két biotípus között 5%-os tévedési valószínűségi szinten.

65

Míg a kontroll és a rehidratált növényekben a fotorespiráció mértéke kb. 26-31%-os volt

mindkét biotípusban, addig a DH1 és DH2 szakaszokban jelentősen magasabb értékeket

kaptunk, ez rendre kb. 53% és 38%-nak adódott az AS és AR típusokban gyenge vízhiány

esetén (DH1), illetve 62% és 55%-nak a DH2 szakaszban.

A kontroll AR típusban a látszólagos kvantumhatásfok (φ), vagyis a görbe kezdeti

meredeksége (kb. 15%-kal) alacsonyabb volt, mint az AS párjában (15. a és b ábrák). A

vízhiány alatt (DH1 és DH2) a φ csökkenését figyelhettük meg mindkét biotípusban (15. d, e,

g és h ábrák). Nem-fotorespirációs feltételek mellett az AR magasabb hatásfokkal bírt (15. e és

h ábrák), mint az AS párja, míg fotorespirációs körülmények között ezek közel azonosak

voltak (15. d és g ábrák) a kétféle biotípusban a DH1 és a DH2 szakaszokban. A növények

rehidratálása után 24 órával a hatásfokok jelentősen megemelkedtek a vízhiányos állapothoz

képest, és hasonló értékeket vettek fel a kétféle biotípusban (15. j és k ábrák).

A sejtek közötti, intercelluláris CO2 koncentráció (Ci) függvényében meghatározott

CO2 asszimiláció (A/Ci görbe) hasznos indikátor lehet a vízhiány fotoszintézisre gyakorolt

hatásának tanulmányozásában. A 800 µmol foton m-2 s-1 levélfelületre beeső fényintenzitás

mellett meghatározott A/Ci görbék azonosak voltak az AS és az AR szülő biotípusokban (16. a

ábra). Az A/Ci görbe kezdeti meredeksége (ε), mely a Rubisco enzim aktivitására és/vagy

extrahálható mennyiségére jellemző érték (karboxilációs hatékonyság), megegyezett a kétféle

kontroll biotípusban (16. a ábra). A vízhiány (DH1 és DH2) az ε értékeket negatívan

befolyásolta, azonban az AR esetében jelentősen kisebb mértékű csökkenés mutatkozott, mint

az AS párjában (16. b és c ábák). Az A/Ci görbe kezdeti szakaszát követően, a magasabb Ci

értékeknél a RuBP regenerációjának sebessége (Jmax) és az inorganikus foszfát (Pi)

elérhetősége válik az asszimiláció sebességének meghatározójává. A progresszív vízhiány

mindkét biotípusban szignifikánsan csökkentette a RuBP regenerációjának sebességét (16. b

és c ábrák). Az adatok további analízise során megvizsgáltuk a vízhiány hatását a látszólagos

karboxilációs hatásfok (Ci/Ca) és a sztóma konduktancia (gs) értékeire légköri CO2

koncentráció (Ca) függvényében (17. ábra). A Ci/Ca és a gs a kétféle kontroll biotípusban nem

különböztek (17.a ábra). A gs tranziensen emelkedett kb. 300 µmol CO2 mol-1 koncentrációig

majd egy gyors csökkenés (600 µmol CO2 mol-1 koncentrációig) után egy lassabb csökkenés

következett a legmagasabb Ca értékig (17. a ábra, gs). A Ci/Ca arány egy enyhe visszaesés után

felvette a kb. 0,75 értéket, mely közel állandó maradt mindkét biotípusban (17. a ábra).

66

0

10

20

30

0 500 1000

0

10

20

30

0 500 1000 0 500 1000

A

(µm

ol C

O2 m

-2 s

-1) Kontroll

εAS=0,100εAR=0,107

(a) (b)

DH1

εAS=0,056

εAR=0,090C

(c)

AS AR

DH2

εAS=0,042εAR=0,070

(d)

A (µ

mol

CO

2 m-2 s

-1)

Ci (µmol mol-1)

RH1

εAS=0,064εAR=0,072

(e)

Ci (µmol mol-1)

RH2

εAS=0,057εAR=0,066

(f)

Ci (µmol mol-1)

RH3 εAS=0,035εAR=0,033

16. ábra A CO2 asszimilációs ráta (A) az intercelluláris CO2 koncentráció (Ci) függvényében. AS, a S. nigrum vad biotípusa (– –); AR, a S. nigrum D1 protein mutáns biotípusa (– –). Kontroll: jó vízellátású; DH1: enyhe szárazság; DH2, közepes szárazság; RH1, RH2 és RH3: rehidratált növény a DH1, DH2 és DH3 szakaszból. A méréseket LCpro+ IRGA készülékkel végeztük, a levélfelületen a beeső fényintenzitás 800 µmol foton m-2 s-1, a levélkamra hőmérséklete 25-28ºC volt. ε, a Rubisco enzim aktivitása és/vagy extrahálható mennyisége, mely a görbe lineáris szakaszának kezdeti meredeksége. Az adatok három független kísérletből 5-7 ismétlés átlagai ± SD. A “c” szignifikáns eltérést jelöli a kétféle biotípus között 5%-os tévedési valószínűségi szinten.

A vízhiány a sztómazáródás inicializálása által csökkentette a sztóma vezetőképességet, így a

Ci/Ca arányt is (17. b és c ábrák). Enyhe vízhiány esetén (17. b ábra, DH1) a biotípusok közötti

különbség jól észlelhető az AR típus javára. Az idő előrehaladtával (17. c ábra, DH2) a

csökkenés folytatódott, és a kétféle biotípus között fennálló különbség mérséklődött illetve el

67

is tűnt. A növényeknek a szárazság különböző szakaszaiból történő rehidratálása (RH1, RH2

és RH3) után a helyreállási folyamatoknak köszönhetően mindkét biotípusban emelkedni

kezdett a CO2 asszimiláció intenzitása, azonban csak részleges helyreállást tapsztaltunk a Jmax

értékében a magas intercelluláris CO2 koncentrációknál (16. d, e és f ábrák). A 17. d, e és f

ábrák azt mutatják, hogy a Ci/Ca arány csaknem teljesen helyreállt, és elérte a kontroll

növényekre jellemző értékeket mindkét biotípusban, a gs helyreállása azonban csak

részlegesen valósult meg.

0.0

0.5

1.0

1.5

0 500 1000 15000.0

0.5

1.0

1.5

0 500 1000 1500 0 500 1000 1500

Ci/C

a, gs (m

ol H

2O m

-2 s

-1)

(a)Kontroll

gs, AS Ci/Ca, AS gs, AR Ci/Ca, AR

(b)DH1

(c)DH2

Ci/C

a, gs (m

ol H

2O m

-2 s

-1)

Ca (µmol mol-1)

(d)RH1

Ca (µmol mol-1)

(e)RH2

Ca (µmol mol-1)

(f)RH3

17. ábra A látszólagos karboxilációs hatásfok (Ci/Ca, és , az AS és az AR biotípusokban) és a sztóma konduktancia (gs, és , az AS és az AR biotípusokban) válaszgörbék a légköri CO2 koncentráció (Ca) függvényében S. nigrum leveleiben. Kontroll: jó vízellátású; DH1: enyhe szárazság; DH2, közepes szárazság; RH1, RH2 és RH3: rehidratált növény a DH1, DH2 és DH3 szakaszból. A méréseket LCpro+ IRGA készülékkel végeztük, a levélfelületen a beeső fényintenzitás 800 µmol foton m-2 s-1, a levélkamra hőmérséklete 25-28ºC. Az adatok három független kísérletből 5-7 ismétlés átlagai.

68

Választ kerestünk arra, hogy a S. nigrum szülő AR biotípusának a vízállapot és a

gázcsere szempontjából mutatott toleránsabb viselkedése a vízhiánnyal szemben a D1 fehérje

mutációjához köthető-e, ezért vizsgálatokat folytattunk a reciprok keresztezésekből származó

hibrid növényekkel is. A gázcsere vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a szülő biotípusok

közötti, a vízhiány alatt fennálló különbség eltűnt az F2 hibridek AS és AR típusai között

(ASF2 és ARF2). Mind a fotoszintetikusan aktív fényre adott válaszgörbék (18. ábra), mind az

A/Ci görbék esetében (9. táblázat) az ASF2 és ARF2 jó vízellátású kontrollok értékei szinte

azonosak voltak a szülőkéivel. A vízhiány (DH1 és DH2) által indukált csökkenés szinte

azonos mértékű volt az F2 hibridek kétféle biotípusában, mely értékek a vízhiánynak kitett AR

szülő értékeit közelítették. Az adatok további analízise során a gs és a Ci/Ca paraméterek is azt

mutatták, hogy a kétféle szülő biotípusban tapasztalt különbségek elmosódtak az F2

nemzedékben (adatok nincsenek bemutatva). Ugyanezt a megállapítást tehetjük a

sztómasűrűség vizsgálatokkal kapcsolatban is (24 ± 8 mm-2 és 25 ± 7 mm-2 az ASF2 és ARF2–

ben).

9. táblázat A S. nigrum szülő és F2 hibridek Jmax értékeinek összehasonlítása

Biotípus Kezelés Jmax

(µmol m-2 s-1) Jmax

(µmol m-2 s-1) Kezelés Biotípus

Kontroll 31,40 ± 3,77 29,59 ± 4,07 Kontroll

DH1 10,11 ± 1,16 18,91 ± 2,31 DH1

DH2 6,10 ± 1,24 11,30 ± 1,81 DH2

RH1 31,61 ± 4,82 30,98 ± 3,67 RH1

RH2 25,41 ± 3,04 22,17 ± 2,79 RH2

AS

RH3 16,64 ± 3,32 16,12 ± 2,07 RH3

ASF2

Kontroll 33,15 ± 3,77 29,36 ± 3,58 Kontroll

DH1 19,51 ± 2,70b 19,94 ± 3,94 DH1

DH2 11,31 ± 2,47c 10,54 ± 1,91 DH2

RH1 31,74 ± 3,50 31,55 ± 2,71 RH1

RH2 26,98 ± 2,84 21,65 ± 1,49 RH2

AR

RH3 14,75 ± 2,51 15,04 ± 1,89 RH3

ARF2

AS és AR, ASF2 és ARF2 a S. nigrum szülő vad és D1 mutáns, F2 nemzedék vad és D1 mutáns biotípusai. A szülő AS és AR adatok a 16. ábra adataiból származnak. A kezelések, mérési körülmények, mérési eljárás ugyanazok, mint a 16. ábrán. A “b és c” szignifikáns eltérést jelölik a két biotípus között 1 és 5%-os tévedési valószínűségi szinten

69

0

5

10

15

20

25

0 500 10000

5

10

15

20

25

0 500 1000

φKontroll=0,045φDH1=0,030φDH2=0,017

A

(µm

ol m

2 s-1)

(a)21% O2

AS, Kontroll AS, DH1 AS, DH2

φKontroll=0,061φDH1=0,046φDH2=0,036

(c) 1% O2

φKontroll=0,039φDH1=0,027φDH2=0,015

A (µ

mol

m2 s

-1)

PPFD (µmol m-2 s-1)

(b)21% O2

AR, Kontroll AR, DH1 AR, DH2

φKontroll=0,057φDH1=0,038φDH2=0,032

PPFD (µmol m-2 s-1)

(d) 1% O2

18. ábra A CO2 asszimilációs ráta (A) aktinikus fényre adott válaszgörbéi progresszív vízhiány alatt. a és b, 21% v/v O2; c és d, 1% v/v O2; 360 µmol CO2 mol-1 koncentráció mellett és 25-28ºC hőmérsékleten. ASF2, a S. nigrum vad-biotípusú F2 hibridje (üres szimbólum); ARF2, a S. nigrum D1 protein mutáns biotípusú F2 hibridje (teli szimbólum). Jó vízellátású kontroll, – – és – –; DH1: enyhe szárazság, – – és – –; DH2, közepes szárazság, – – és – –. φ, látszólagos kvantumhatásfok, a görbe lineáris szakaszának kezdeti meredeksége. Az adatok 5-7 ismétlés átlagai ± SD.

70

5.2.2. A vízdeficit hatása az elnyelt fényenergia fotokémiai hasznosítására

A gyenge (DH1) illetve a közepes (DH2) vízhiány szakaszaiban a PSII-re jellemző

funkcionális fluoreszcencia kioltási paraméterekben nem tapasztaltunk változást a jó

vízellátású kontrollokhoz képest. Változások az erős szárazságnak (DH3) kitett növények

esetében léptek fel először.

Az erős vízhiány (DH3) hatására mind az NPQ mind az 1 – qP megemelkedtek a jó

vízellátású kontrolljaikhoz képest valamennyi növényvonalban (19. a, b, és 8. a, 5. c ábrák).

Az NPQ a kétféle vízhiányos biotípusban azonos sebességgel nőtt a fényintenzitás

növekedésével, az AR vonalak (AR, ARF2, ARF6) közel telítési fényintenzitáson enyhén

felülmúlták AS párjaikat (AS, ASF2, ASF6) (19. a ábra). A JETR és a ΦPSII aktinikus fényre

adott válaszgörbéi alapján megállapíthatjuk, hogy ezek a jó vízellátású kontrolljaikhoz képest

(10. a és b ábrák) az erős szárazság hatására közel azonos értékekre estek vissza a kétféle

biotípusban (20. a és b ábrák). Fontos megvizsgálnunk, hogy míg a jó vízellátású kontroll AR

vonalakban a ΦPSII, JETR és NPQ (10. a, b és 8. a ábrák) szignifikánsan alacsonyabbak voltak a

növekvő fényintenzitások mellett, és a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1 – qP) (5. c ábra)

szignifikánsan magasabbnak bizonyult, mint az AS párjaikban, addig az erős szárazság

következtében jelentősen megváltozott ez a kép (20. a, b és 19 a, b ábrák). Míg az alacsonyabb

NPQ kapacitással rendelkező kontroll AR típusban szignifikánsan magasabb volt a PSII-re

ható gerjesztési nyomás, addig ez az erős szárazság hatására közel azonos értékekre

emelkedett a kétféle biotípusban és hibridjeikben a kontrollokhoz képest (19. b ábra). A

vízhiány az NPQ növekedését indukálta, amely kb. 18%-os és igen drasztikus, kb. 250%-os

volt közel telítési fényintenzitáson az AS és az AR vonalakban a jó vízellátású kontrolljaikhoz

képest (19. a és 8. a ábrák). Tehát, míg a kontroll AR vonalak kb. 55%-kal alacsonyabb NPQ

kapacitással bírtak AS párjaikkal összehasonlítva közel telítési fényintenzitáson, addig az erős

szárazságnak (DH3) kitett AR vonalak esetében ez a kép megfordult, és kb. 15%-os

emelkedést figyelhettünk meg az AS párjaikkal szemben. A szülő biotípus és a megfelelő

hibridjei a vízhiányos mintákban sem mutattak különbségeket az általunk vizsgált paraméterek

esetén.

71

0 500 10000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

PPFD (μmol m-2 s-1)

NPQ

PPFD (μmol m-2 s-1)

AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

(a)

1-qP

(b)

19. ábra Az erős szárazság (DH3) hatása a nem-fotokémiai kioltás (NPQ, a), és a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1 – qP, b) fényintenzitás függésére vad (AS, üres szimbólum) és D1 mutáns (AR, teli szimbólum) S. nigrum vonalakban. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . Az adatok 12 ismétlés átlagai, SD a szülő (AS és AR) populációban van feltüntetve.

Az erősen vízhiányos (DH3) növények esetében a ΦPSII és a JETR értékei gyakorlatilag

nem különböznek a kétféle szülő biotípusban és hibridjeikben (20. a és b ábrák). A regulált

energiadisszipáció hatásfokának (ΦNPQ) és sebességének (JNPQ) fokozódását figyelhetjük meg

valamennyi vízhiányos S. nigrum vonalban a jó vízellátású kontrollokhoz képest (20. c, d és

10. c, d ábrák). A ΦNPQ és JNPQ görbéi szinte azonosak voltak az AS és AR vonalakban. A nem-

regulált hődisszipáció hatásfoka (ΦNO) és sebessége (JNO) az AS vonalakban a vízhiány

hatására megemelkedett a kontrollokhoz viszonyítva (20. e, f és 10. e, f ábrák). Az AR

típusokban a ΦNO kismértékben növekedett a kontrollokhoz képest, azonban ezt egy csökkenő

tendencia követte a fényintenzitás emelkedésével, és közel telítési fényintenzitáson a jó

vízellátású kontroll értékeket közelítették. A JNO a kontrollokéhoz képest szintén csökkenést

mutatott az AR típusokban (20. e, f és 10. e, f ábrák). Statisztikailag nem mutatható ki

szignifikáns különbség a vízhiányos AS és AR biotípusok és hibridjeik között egyik paraméter

esetében sem (20. ábra).

72

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

100

200

300

0.0

0.2

0.4

0.6

0

100

200

300

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

0 500 10000

100

200

300

ΦP

SII

AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

(a) (b)

J ETR

(µm

ol e

- m-2 s

-1)

(c)

ΦN

PQ

(d)

J NP

Q (µ

mol

m-2 s

-1)

(e)

ΦN

O

PPFD (µmol m-2 s-1)

(f)

J NO (µ

mol

m-2 s

-1)

PPFD (µmol m-2 s-1)

20. ábra Az erős szárazság (DH3) hatása a PSII komplementer hatásfokok és sebességeik aktinikus fényre adott válasz görbéire AS (üres szimbólum) és AR (teli szimbólum) S. nigrum biotípusok leveleiben, és hibridjeikben. AS és AR, szülő, – – és – –; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . (a, b) fotokémiai energia konverzió ΦPSII; (c, d) regulált energia disszipáció ΦNPQ; (e, f) nem-regulált energia disszipáció ΦNO. Az adatok 12 ismétlés átlagai, a SD a szülő (AS és AR) populációban van feltüntetve.

73

Az AS és AR vonalakban a ΦNO elérte a kb. 0,3 értéket, amit a fényintenzitás emelkedése nem

befolyásolt (20. e ábra). A konstitutív energia disszipáció sebességei (JNO) lineárisan

emelkedtek szinte azonos sebességgel a kétféle biotípusban (20. f ábra). Összevetve a jó

vízellátású kontrollok és az erős vízhiánynak (DH3) kitett növények ún. PSII komplementer

hatásfokait, elmondhatjuk, hogy valamennyi vízhiányos AS biotípusban (AS, ASF2, ASF6) a

fotokémiai hatásfok (ΦPSII) kb. 60%-kal esett vissza közel telítési fényintenzitáson a jó

vízellátású kontrolljaikhoz képest, azonban az AR vonalakban (AR, ARF2, ARF6) ez csupán

kb. 45%-ot jelentett. A kétféle biotípus a vízhiány hatására mintegy ugyanarra a szintre

csökkent, azonban a kontroll AS vonalak szignifikánsan magasabb fotokémiai hatásfokkal

bírtak, mint AR párjaik. Továbbá a regulált energia disszipáció frakciója (ΦNPQ) rendre kb.

40% és 50%-kal emelkedett meg a vízhiányos AS és AR típusokban a jó vízellátású

kontrolljaikhoz képest. Eközben a nem-regulált energia disszipáció a vízhiány hatására 33%-

kal nőtt az AS típusban, míg 20%-kal csökkent az AR vonalakban közel telítési

fényintenzitáson.

A 21. ábra a három PSII komplementer hatásfok és az NPQ indukcióját (1250 μmol

foton m-2 s-1, 15 perc) és sötétrelaxációját (10 perc) szemlélteti jó vízellátású kontroll, erősen

vízhiányos (DH3) és rehidratált (RH3) S. nigrum vonalakban. Az AS és AR biotípusok között

szignifikáns különbség adódott a ΦPSII értékeiben az AS vonalak javára a kontroll és a 24

órával a rehidratálás (RH3) után helyreállt növények esetében (21. a és c ábrák), míg az erős

szárazságnak kitett növényekben közel azonos értékekre esik vissza a hatásfok (21. b ábra). Az

NPQ és a ΦNPQ alakulásának összevetése során láthatjuk, hogy míg a kontroll és rehidratált

(RH3) AR vonalak szignifikánsan alacsonyabb fotoprotektív NPQ kapacitással bírnak (21. g és

i ábrák), a regulált energia disszipáció hatásfoka (ΦNPQ), mely a fényindukált fotoprotektív

folyamatokkal van összefüggésben, a kétféle biotípusban gyakorlatilag megegyezik (21. d és f

ábrák, kontroll és RH3), és a sötétben teljesen relaxál.

74

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

0 5 10 15 20 250.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25

ΦP

SII

(a)Kontroll

AS AR ASF2 ARF2 ASF6 ARF6

(b)DH3

(c)RH3

ΦN

PQ

(d)

(e)

(f)

NP

Q

(g)

(h)

(i)

ΦN

O

Idõ (min)

(j)

Idõ (min)

(k)

Idõ (min)

(l)

21. ábra Az erős szárazság (DH3) hatása a PSII komplementer hatásfokok és az NPQ indukció (1250 μmol foton m-2 s-1, 15 perc) és sötétrelaxáció válasz görbéire AS (üres szimbólum) és AR (teli szimbólum) S. nigrum biotípusok leveleiben, és hibridjeikben. AS és AR, szülő, – – és –

–; ASF2 és ARF2, és ; ASF6 és ARF6, és . a, b, c – fotokémiai energia konverzió ΦPSII, rendre kontroll, DH3, RH3; d, e, f – regulált energia disszipáció ΦNPQ, rendre kontroll, DH3, RH3; g, h, i – nem fotokémia kioltás NPQ, rendre kontroll, DH3, RH3; j, k, l – nem-regulált energia disszipáció, rendre kontroll, DH3, RH3 ΦNO. Az adatok 12 ismétlés átlagai, a SD a szülő (AS és AR) populációban van feltüntetve.

75

A vízhiány hatására jelentős NPQ növekedéssel szembesültünk mindkét biotípusban és

hibridjeikben is a kontrolljaikhoz képest, azonban az AR típusokban messzemenően nagyobb

növekményt tapasztaltunk, mint AS párjaikban (21. h ábra). A sötétadaptált levél megvilágítása

után a vad AS típusokban az NPQ lassan kezdett emelkedni, és kb. 8 perc alatt érte el az 1,7

értéket, majd ez közel változatlan maradt a megvilágítás végéig. Az AR biotípusban az NPQ

jelentősen gyorsabban alakult ki, és kb. a negyedik percben elérte a 2,5 értéket, majd enyhe

csökkenés után a megvilágítás végén ez kb. 2,2-re mérséklődött. A fény kikapcsolása után az

NPQ nem relaxálódott teljesen egyik biotípusban sem, statisztikailag nem mutatható ki

különbség a biotípusok között. A ΦNPQ görbék alakja (21. e ábra) szorosan tükrözte az NPQ

görbék menetét (21. h ábra) a vízhiányos növényekben, ami a jó vízellátású növényi anyag

estében nem mondható el. A kontrollokban és a vízhiány után rehidratált növényekben (21. j és

l ábrák) a ΦNO, vagyis a konstitutív energia veszteség szignifikánsan magasabb volt az AR

vonalakban, azonban a vízmegvonás megfordította ezt a tendenciát. Az AR vonalakban kissé

lecsökkent, míg az AS típusokban megemelkedett a ΦNO, mely különbség a megvilágítás

végére mérséklődött a kétféle biotípus között, de némiképpen megmaradt az AS típus

magasabb értéke (21. k ábra). Míg a vízhiányos AR vonalakban az aktinikus fény kikapcsolása

nem befolyásolta a ΦNO értékét, addig az AS vonalakban ez lecsökkent, hasonlóan a kontroll és

a rehidratált növények esetében.

76

5.3. Egyes nukleáris öröklődésű faktorok hatása a fotoszintetikus fényenergia

hasznosításra

Csökkent NPQ kapacitással bíró A. thaliana mutánsokat széles körben alkalmaznak manapság

az NPQ mechanizmusának tanulmányozásában. Az NPQ kialakulásának fontos tényezői közé

tartoznak a nukleárisan kódolt PsbS és az LHC proteinek. Npq vagy lhc mutáns S. nigrum

növényeket ez idáig nem izoláltak; D1 protein mutáns A. thaliana vonalhoz nem sikerült

hozzájutnunk, ezért két csökkent NPQ kapacitással bíró Arabidopsis vonalat

tanulmányoztunk, melyek nukleáris mutációt hordoztak, hogy közelebb jussunk az anyai

öröklődésű D1 protein S264G mutáció és a csökkent NPQ folyamatok kapcsolatának

megértéséhez a S. nigrum növényekben.

Az alkalmazott nevelési körülmények között a vad-típusú Col-0 és az npq4 mutáns

növények közel azonos Chl (a+b) tartalmakkal bírtak (11. táblázat), míg az lhcb2 vonal

enyhén magasabb Chl (a+b) tartalommal rendelkezett a vad típussal összehasonlítva. Mindkét

mutáns vonalban megemelkedett a Chl a/b arány a vad típushoz képest, azonban az npq4

mutánsban az emelkedés igen csekély volt.

11. táblázat Különböző A. thaliana vonalak pigmentösszetétele

Arabidopsis vonalak Pigment

Col-0 (vad típus) lhcb2 npq4

Chl (a+b) (μmol m-2) 129 ± 4 143 ± 3 128 ± 3

Chl a/b 2,57 ± 0,1 3,16 ± 0,2c 2,87 ± 0,2

Karotinoidok (μmol m-2) 41 ± 4 43 ± 4 46 ± 5

Chl (a+b)/Karotinoidok 3,2 ± 0,1 3,5 ± 0,4 2,8 ± 0,2

Vio+Ant+Zea (μmol m-2) 12,3 ± 1,6 13,8 ± 1,5 12,5 ± 1,1

(Vio+Ant+Zea)/(Chl (a+b)) (μmol mmol-1) 93 ± 6 96 ± 2 98 ± 4

DEi 0,60 ± 0,03 0,54 ± 0,04 0,58 ± 0,03

Az adatok három független kísérletből 5 ismétlés átlagai ± SD. A “c” szignifikáns eltérést jelöli a vad típus és a mutáns vonal között 5%-os tévedési valószínűségi szinten.

77

Nem találtunk szignifikáns eltéréseket a három Arabidopsis vonal között a karotinoid

összetétel, a xantofill ciklus készlet méret, vagy a xantofill ciklus készlet méret és Chl tartalom

aránya tekintetében, sem a xantofill ciklus pigmentek de-epoxidációs indexében (DEi). A 22.

ábrán összehasonlítom a lineáris elektrontranszport sebesség (JETR) (a), az NPQ kapacitás (b)

és a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1 – qP) (c) fényintezitás függéseit a három Arabidopsis

vonalban. A JETR és az NPQ értékei emelkedtek a növekvő fényintenzitással valamennyi A.

thaliana vonalban, noha mindkét mutánsban az NPQ értékei alul maradtak a vad típusnak. Az

lchb2 növényekben az NPQ kissé alacsonyabb értékről indult, mint az npq4 mutánsban, és

ezek maximális értéke kb. 50%-kal volt kisebb, mint a vad típusé. A JETR fényintenzitás

függése közel azonos volt a vad és az lhcb2 vonalban, azonban az npq4 mutáns magas

fényintenzitásokon kissé alacsonyabb értéket produkált. Az NPQ kapacitás és a PSII-re ható

gerjesztési nyomás között, ahogy ez várható volt, fordított összefüggést kaptunk. Az npq4

mutánsokat magasabb 1 – qP érték jellemezte, így magasabb redukált QA koncentráció,

valamennyi fényintenzitáson, a vad típushoz képest (22. c ábra). Azonban az antiszensz lhcb2

növényekben ez kissé alacsonyabbnak bizonyult, mint a vad típsuban.

0 500 10000

50

100

150

(a)

J ETR

PPFD (μmol m-2 s-1)0 500 1000

0.0

0.5

1.0

1.5

(b)

Col-0 lhcb2 npq4

NP

Q

PPFD (μmol m-2 s-1)

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

(c)

1 - q

P

PPFD (μmol m-2 s-1)

22. ábra A fotoszintetikus elektrontranszport sebesség (JETR, a), a nem-fotokémiai kioltás (NPQ, b) és a PSII-re ható gerjesztési nyomás (1 – qP, c) aktinikus fényre adott válaszgörbéi három Arabidopsis vonal leveleiben. Col-0, ; lhcb2, ; npq4, . Az adatok három független kísérletből 6 ismétlés átlagai ± SD.

78

Mind az lhcb2, mind az npq4 növények szignifikánsan érzékenyebbek voltak a magas

fényintenzitás által indukált fénygátlásra, mint a vad típus, melyet az Fv/Fm paraméterrel

jellemeztünk (0,805 ± 0,066 → 0,138 ± 0,044 és 0,827 ± 0,007 → 0,112 ± 0,053 az lhcb2 és

az npq4 vonalakban, a Col-0 vad típusban pedig 0,832 ± 0,007 → 0,353 ± 0,062, kontroll

körülmények között mérve illetve magas fényintenzitással (1400 μmol foton m-2 s-1) 4 órán

keresztüli megvilágítás után). Α ΦPSII aktinikus fényre adott válasz görbéi alapján valamennyi

Arabidopsis vonal közel aznonos PSII hatásfokkal bírt (23. a ábra). Az lhcb2 és az npq4

vonalakban a ΦNPQ alacsonyabb volt, mint a vad típusban (23. b ábra). Úgy tűnik, hogy az

alacsonyabb ΦNPQ értékek jól korrelálnak a csökkent NPQ kapacitással mindkét mutáns

vonalban (22. b ábra). A ΦNPQ görbék alakja a két mutánsban hasonlóságot mutatott azok NPQ

görbéinek alakjával (22. b és 23. b ábrák). A két mutáns vonalban a ΦNO értékei meghaladták a

vad típusét valamennyi fényintenzitáson, melynek maximuma kb. 0,44 volt, míg a vad

típusban csupán kb. 0,3. Ez a növekmény az alacsonyabb fotoprotektív kapacitás mintegy

lehetséges kompenzációjaként szolgálhat (23. c ábra).

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

(a)

ΦPS

II

PPFD (μmol m-2 s-1)

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

(b)

Col-0 lhcb2 npq4

ΦN

PQ

PPFD (μmol m-2 s-1)

0 500 10000.0

0.2

0.4

0.6

(c)

ΦN

O

PPFD (μmol m-2 s-1)

23. ábra A PSII komplementer hatásfokok aktinikus fényre adott válaszgörbéi. ΦPSII, fotokémiai energia konverzió (a); ΦNPQ, regulált energia disszipáció (b); ΦNO, nem-regulált energia disszipáció (c) három Arabidopsis vonal leveleiben. Col-0, ; lhcb2, ; npq4, . Az adatok három független kísérletből 6 ismétlés átlagai ± SD.

79

6. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

A PSII D1 RC fehérje valamennyi oxigénfejlesztő fotoszintézist folytató élő szervezetben

megtalálható. Szerkezete erősen konzervált, mely azt engedi feltételezni, hogy a fehérje

alapvető funkciója az evolúció során optimalizálódott. Valamennyi természetes módon

kiszelektálódott AR gyomfaj PSII RC-a egy szerkezetileg módosult D1 fehérjét tartalmaz,

mely a plasztokinon (QB) kötőhelyhez közeli Ser264→Gly aminosav cserének tudható be

(Gronwald, 1994; Tian & Darmency, 2006; Trebst, 1991).

Erős napsugárzás következtében a növények az elnyelt többletenergiát nem képesek a

fotoszintetikus elektrontranszporton keresztül hasznosítani. Ilyenkor a többlet gerjesztési

energia termális disszipációja indukálódik, mely a PSII fotoprotekcióját hivatott biztosítani.

Az NPQ a kloroplasztiszok tilakoid membránjában végbemenő folyamatok eredményeként

alakul ki, többek között a tilakoid lumenének alacsony kémhatása, a PsbS és az LHC fehérjék

protonációja, valamint a Zea képződése által. Az NPQ domináns, gyorsan relaxálódó

frakcióját, mely a ΔpH-tól függ, energiafüggő kioltásnak nevezik (qE). Az ez idáig

tanulmányozott D1 protein mutáns gyomfajokra a PSII működésének csökkent hatékonysága

jellemző: az alacsonyabb fényindukált fotokémiai kioltás (qP), mely fokozza a PSII-re ható

gerjesztési nyomást (1 – qP), az alacsonyabb PSII hatásfok (ΦPSII), a lassabb

elektrontranszport sebesség (JETR) közvetlenül a D1 fehérje működésével vannak

kapcsolatban. Ezek a mutánsok csökkent nem-fotokémiai kioltási kapacitással (NPQ, qE)

bírnak, melyet eddigi tudásunk alapján sejtmagban kódolt faktorok szabályoznak. A S. nigrum

növényekben az atrazin rezisztenciát, egyetértésben korábbi munkákkal (Darkó et al., 1996;

2000; Váradi et al., 2003), az NPQ (qE) kapacitás jelentős csökkenése kíséri (3. táblázat és 8.

ábra) (Bajkán et al., 2010). Néhány kétszikű gyomfaj AR biotípusaiban a JETR 30%-kal

bizonyult alacsonyabbnak, mint AS párjaikban, mely az alacsonyabb PSII fotokémiai

hatásfokot tükrözi, ezenkívül 20%-kal kisebb Zea képződés és az NPQ (qE) kapacitásban 50-

70%-os csökkenés volt tapasztalható (Váradi et al., 2003).

Módosult NPQ kapacitással rendelkező Arabidopsis mutánsokkal végzett kutatások

során fény derült az alacsony NPQ néhány lehetséges okára, úgymint a PsbS fehérje hiánya

vagy mutációja (Li et al., 2000; 2002b; Niyogi, 1999; Peterson & Havir, 2001), az alacsony

xantofill ciklus kapacitás és a Vio de-epoxidáz enzim hiánya vagy mutációja (Niyogi et al.,

80

1998; Peterson & Havir, 2000), a ΔpH kialakulásának gátlása (Goss et al., 2008; Pfündel et

al., 1994), vagy az LHCII antiszensz inhibíciója (Andersson et al., 2001; Kovács et al., 2006).

A szakirodalomban elfogadott tény, hogy az NPQ függ a tilakoid lumen alacsony

kémhatásától, ami események sorozatát indítja be, melyben bennefoglaltatik a

pigmentösszetétel megváltozása és a PSII antenna komplexek szerkezeti újrarendeződése.

A szakirodalom szerint az NPQ kialakulásában esszenciális faktorok sejtmagi gének

által kódoltak (Funk et al., 1995; Li et al., 2000; Bugos & Yamamoto, 1996; Jansson, 1999),

habár a D1 fehérjét kódoló psbA gén a kloroplasztisz genom része. Nem világos, hogy a D1

fehérje milyen hatással van az antennában végbemenő hődisszipáció kialakulására. Ezért nem

zárható ki az, hogy a S. nigrum és más gyomfajok (Darkó et al., 1996; 2000; Váradi et al.,

1994; 2003) AS és AR biotípusai között tapasztalható különbség az NPQ (qE) kapacitásban a

biotípusok genetikai hátterének eltéréséből adódik, semmint a D1 fehérje mutációnak

köszönhető. Hogy ezt az eshetőséget feltárjuk, reciprok keresztezéseket végeztünk a S. nigrum

kétféle szülő biotípusa között, és az ebből származó hibridekkel (F1, F2 egészen az F6-ig)

vizsgálatokat folytattunk. Azt feltételeztük, hogy ha a vad AS és a D1 mutáns AR biotípusok

különböznek egymástól az NPQ-val összefüggő nukleárisan kódolt tulajdonságokban, a

reciprok keresztezések a utód-generációkban az NPQ tulajdonságokat változtatni fogják.

Azonban azt találtuk, hogy az NPQ kapacitásbeli különbséget nem befolyásolták a sejtmagi

szabályozó faktorok a hibridekben egészen az F6 generációig (8. ábra) (Bajkán et al., 2010).

Ezt az a tény is támogatja, hogy a szekvencia analízis alapján a S. nigrum AS és AR

biotípusaiban azonosak voltak a PsbS fehérjék, azaz nem tartalmaztak aminosav eltérést (11.

ábra), és a PsbS és D1 fehérjék expressziójában sem találtunk különbségeket (12. ábra)

(Bajkán et al., 2010).

A reciprok keresztezésekből való D1 protein mutáns S. nigrum vonalak (AR, ARF2,

ARF6) az elnyelt energiát kevésbé hatékonyan hasznosították fotokémiára (ΦPSII), mint a vad

biotípusok (AS, ASF2, ASF6) és a köztes elektron akceptorok felé irányuló elektrontranszport

sebessége (JETR) 30%-kal bizonyult alacsonyabbnak közel telítési fényintenzitáson (5. a és b

ábrák) (Bajkán et al., 2010). A D1 protein mutáció hátterének és lehetséges

következményeinek jobb megértése végett két modellt használtunk, hogy meghatározzuk az

elnyelt fényenergia megoszlását, mely egyrészt fotokémiailag hasznosulhat a PSII-ben (ΦPSII),

másrészt disszipatív folyamatok eliminálhatják regulált és nem-regulált utakon keresztül. Az

81

NPQ paraméter a hődisszipáció sebességével arányos, azonban nem nyújt kvantitatív

információt arról, hogy mekkora energiafrakció disszipálódott el hőként a PSII

antennarendszerében. Hendrickson és munkatársai (2004) modellje a fotoszintetikus energia-

átvitel területén már korábban is létező, jól definiált hatásfokokon alapszik, úgymint a ΦPSII

(Genty et al., 1989), ΦNPQ, ΦNO (Cailly et al., 1996), illetve hatékonyan különíti el ez utolsó

kettőt, a regulált és nem-regulált energia disszipációs folyamatokat; kiküszöböli az ún.

többletenergia frakció problematikáját, nem úgy, mint Demmig-Adams és munkatársai (1996)

modellje, mely abban különbözik az előzőtől, hogy az ő kalkulációjukban a többletenergia

frakció (ΦE) is bennefoglaltatik, mely nem hasznosul a fotokémia folyamatában és termálisan

sem disszipálódik el. A PSII energia allokációjának összehasonlító analízise Demmig-Adams

és munkatársai (1996) modellje alapján azt mutatta, hogy a különböző gyomfajok AS és AR

biotípusaiban a fotoszintetikus energia konverzió megváltozott szabályozása a D1 protein

mutációval volt összefüggésben (Váradi et al., 2003). Ugyanakkor a fényadaptált AR

növények alacsonyabb NPQ szintje és megnövekedett energia disszipációs kapacitása között

ellentmondás tárult fel (Váradi et al., 2003). A PSII fotokémiára történő energia-felhasználás

(ΦPSII) az aktinikus fényre adott válaszgörbék alapján szignifikánsan alacsonyabb volt a S.

nigrum AR vonalaiban (AR, ARF2, ARF6) mint a vad típusokban (AS, ASF2, ASF6),

azonban a D1 fehérje mutáció nem volt hatással a fényben disszipált hőenergia frakciójára

(ΦDL) vagy inkább kissé emelte azt, az alacsonyabb NPQ kapacitás ellenére (9. ábra).

Ugyanakkor a többletenergia disszipációja (ΦE) szintén szignifikánsan magasabb volt a S.

nigrum D1 mutáns vonalaiban (9. ábra). Az elnyelt többletenergia másfelől reaktív oxigén

formák képződéséhez vezethet az antennában és/vagy redukálhatja a molekuláris oxigént,

mely potenciálisan károsíthatja a fotoszintetikus rendszert. Kato és munkatársai (2003) szerint

a többletenergia frakció a PSII fotoinhibíciójának sebességi állandóját határozza meg a

levelekben. Az AR vonalak alacsonyabb Chl a/b aránya AS párjaikhoz képest (4. táblázat)

(Bajkán et al., 2010) jelezheti a fotoszintetikus apparátus egy relatíve nagyobb fénybegyűjtő

antenna méretét (Burke et al., 1982; Holt & Goffner, 1985; Lemoine et al., 1986), amely

nagyobb mennyiségű többlet gerjesztési energia jelenlétéhez vezethet az antennában.

A Hendrickson és munkatársai (2004) által leírt modell a PSII antennájában elnyelt

fényenergia sorsának az előbbinél egy egyszerűbb becslését nyújta. A szignifikánsan

alacsonyabb ΦPSII értékek az AR vonalakban jelzik, hogy az elnyelt fényenergiának kisebb

82

hányada alakult át kémiailag kötött energiává a fotokémiai töltésszétválasztás során, mint az

AS vonalakban (10. a ábra). Ez jól korrelál az alacsonyabb fotoszintetikus teljesítmény

indexszel (PIabs), különösen a gerjesztési energia befogásának lecsökkent arányával az AR

vonalakban (5. táblázat és 7. ábra). A PSII fotokémiájának lecsökkent hatásfoka (ΦPSII) vagy a

ΦNPQ vagy a ΦNO vagy mindkét folyamat feltétlen növekedését eredményezi. A ΦNPQ és a ΦNO

paraméterek azt az energia frakciót mérik, mely két, egymással versengő, nem-produktív

folyamat által disszipálódhat: míg a ΦNPQ a szabályozási folyamatok által indukálódik, ezzel

szemben minden egyéb nem-fotokémiai energia-veszteséget a ΦNO képvisel. A S. nigrum

szülő biotípusai és hibridjei között nem találtunk különbséget a ΦNPQ értékeiben (10. c ábra),

viszont a qE lecsökkent a ΦNO növekedése mellett az AR vonalakban (3. táblázat és 10. e

ábra). Mind a ΦNPQ mind a ΦDL a ΔpH-, Zea- és PsbS által szabályozott fotoprotektív NPQ

mechanizmussal vannak kapcsolatban. A PSII akceptor oldali kisebb sebességű

elektrontranszport (JETR) ar AR vonalakban (10. b ábra) korlátozhatja a lumenális proton

akkumulációt. Továbbá a D1 protein fény által indukált magasabb degradációs/helyreállítási

folyamata az AR gyomokban (Sundby et al., 1993a; Darkó et al., 2000) maga után vonhat egy

megnövekedett ATP igényt, ami az ATPáz enzimen keresztül magasabb proton effluxot

eredményezhet, mely szintén hozzájárulhat a tilakoid membránon keresztüli proton gradiens

kiépülésének csökkenéséhez. Ez magyarázatot adhat a 20%-kal alacsonyabb xantofill de-

epoxidációra, amely pedig hozzájárulhat a qE csökkenéséhez. Tehát nem zárható ki, hogy a

QA és a QB közötti elektrontranszport lassulása a D1 protein mutáns növényekben (Pfister &

Arnzten, 1979; Bowes et al., 1980) a lumen mérsékelt acidifikációját okozza, azonban a

szakirodalomban általánosan elfogadott tény az, hogy a teljes fotoszintetikus

elektrontranszport sebesség-limitáló lépése normál fiziológiás körülmények között a Cyt b6/f

komplex általi PQ készlet oxidációja (Genty & Harbinson, 1996). A CO2 asszimiláció (3.

táblázat) (Bajkán et al., 2010) és a fotorespiráció sebességei (3. táblázat és 15. c ábra) sem

változtak a mutáció hatására, ami azt mutathatja, hogy a QA és QB közötti elektrontranszport

lassulása ellenére sem a PSII limitálja a teljes elektrontranszportlánc sebességét az AR

növényekben. Haehnel (1984) és Graber (1987) kutatásai alapján a rezisztens növényekben a

QA és QB közötti elektrontranszport sebesség 0,3-0,4 ms körüli értékének lelassulása 1-3 ms-ra

még mindig kb. tízszer gyorsabb mint a PQ készlet oxidációjának 15-25 ms-os félideje.

83

Érdekes módon a qE lecsökkenését nem kíséri a ΦNPQ változása. Mivel a ΦNPQ-t nem

érintette a D1 protein mutációja, az egyéb nem-fotokémiai energia veszteségek hatásfoka, a

ΦNO, megemelkedett, mely a csökkent fotokémiai energia konverzió kompenzációs

mechanizmusának tekinthető az AR vonalakban (10. e ábra). A ΦNO értelmezésére számos,

részben különböző magyarázat létezik (Klughammer & Schreiber, 2008), de általában úgy

definiálják, hogy az elnyelt fényenergiának az a frakciója, amely nem hasznosul a

fotoszintetikus elektrontranszport során, és nem is eliminálódik a regulált hődisszipáció

folyamatán keresztül, hanem passzív módon hő és fluoreszcencia formájában disszipálódik. A

magasabb ΦE vagy ΦNO értékek és az alacsonyabb ΦNPQ/ΦNO arány a D1 protein mutáns

vonalakban a fotoprotektív folyamatok szuboptimális kapacitását tükrözik (Klughammer &

Schreiber, 2008), mely végső soron a fotokémiai apparátus károsodásához vezet, mivel a ΦE

és a ΦNO frakció nagyobb hányada azt az elnyelt energiát képviseli, melyet nem lehet a

regulált mechanizmusok által a PSII antennarendszeréből eltávolítani. Következésképpen a

természetes módon kiszelektálódott D1 mutáns gyomok magasabb érzékenysége a

fotoinhibícióra (Holt et al., 1981; Hart & Stemler, 1990; Sundby et al., 1993a; Darkó et al.,

1996; 2000; Váradi et al., 1994; 2003) nem meglepő, ha figyelembe vesszük, hogy a

fotoinhibíció fő célpontja a PSII RC-ok D1 fehérjéje (Barber & Andersson, 1992; Aro et al.,

1993).

Összehasonlító tanulmányt végeztünk két, csökkent NPQ kapacitással rendelkező A.

thaliana mutáns vonallal abban bízva, hogy közelebb jutunk a S. nigrum D1 protein mutáns

biotípusának eltérő energia megoszlásának magyarázatához. Mivel megváltozott NPQ

tulajdonsággal rendelkező mutáns vonalat a S. nigrum növényfaj esetében tudomásunk szerint

ez idáig nem izoláltak, és a D1 protein mutáns A. thaliana vonalhoz nem jutottunk hozzá, ezért

az A. thaliana npq4-1 deléciós mutánsával és az lhcb2 antiszensz vonallal végeztünk

vizsgálatokat. Míg előzőben a psbS gén deléciója következtében a PsbS fehérje teljesen

hiányzik, utóbbiban az LHCII fő alkotóelemei, az Lhcb1 és 2 fehérjék csaknem teljesen

hiányoznak az Lhcb2 antiszensz konstrukció kifejeződése miatt. Mindkét vonal az

irodalomban jól ismert és jellemzett (Li et al., 2000; 2002b; Ganeteg et al., 2001; Andersson

et al., 2003; Ruban et al., 2003). Ezekben a növényekben kb. 50%-os csökkenést tapasztaltunk

az NPQ értékeiben közel telítési fényintenzitáson a vad típushoz képest (22. b ábra), miközben

a JETR és a ΦPSII paraméterek értékei közel azonosak voltak mindhárom vonalban (22. a és 23.

84

a ábrák). A Hendrickson és munkatársai (2004) modelljének alkalmazása azt mutatta, hogy az

aktinikus fényre adott válaszgörbék esetében az alacsonyabb NPQ kapacitás, sőt magának a

görbének az alakja is egyértelműen tükröződik a ΦNPQ görbék alacsonyabb amplitudójában és

felfutásában mindkét mutáns vonalban (22. b és 23. b ábrák) (Bajkán et al., 2011, közlésre

elfogadva). Az alacsonyabb ΦNPQ értékekkel párhuzamosan a ΦNO megemelkedését

tapasztaltuk (23. c ábra). Az npq4-1 és az lhcb2 A. thaliana mutánsok alacsonyabb

fotoprotektív kapacitása következetesen tükröződött tehát az alacsonyabb ΦNPQ értékekben,

azonban érdekes módon a S. nigrum D1 protein mutáns biotípusában a kisebb NPQ kapacitás

mellett azonos ΦNPQ-t tapasztaltunk a vad és a mutáns biotípusokban. Habár a PsbS és az LHC

proteinek nukleárisan kódoltak, a D1 protein a kloroplasztisz genom része. Úgy gondoljuk,

hogy a különféle megváltozott NPQ tulajdonsággal rendelkező mutánsokon végzett biokémiai

és molekuláris genetikai tanulmányok közvetlenül nem illeszthetők rá a D1 protein mutáns

biotípusú növények esetére a tanulmányozott mutációk alapvető különbségei miatt. Az A.

thaliana növények magas és alacsony NPQ kapacitással rendelkező természetes változataival

végzett újkeletű kutatások arra utalnak, hogy az NPQ kapacitásban meglévő különbségek

néhány, eddig még nem ismert faktor szabályozása alatt állhatnak (Jung & Niyogi, 2009).

A D1 fehérje mutáció következményeként a gyors Chl fluoreszcencia tranziensek

alakja különbözött a kétféle biotípusban és a megfelelő hibridjeikben (6. ábra). Hasonló

különbségeket az OJIP tranziensek alakjában korábban is leírtak Chlamydomonas D1 protein

mutánsaira és néhány gyom esetében (El-Lithy et al., 2005; Kohno et al., 2000; Srivastava et

al., 1995; van Rensen et al., 2001). Az OJIP tranziensek kinetikáját a QA redox állapotának

változásai határozzák meg, de egyúttal a fotoszintetikus elektrontranszportlánc redukcióját is

tükrözi. A tranziensek J és I szintjei és I-P fázisa a QA redox állapotával, a PQ készlet redox

állapotával és a PSI elektron akceptor oldalán lévő végső akceptorok redox állapotával

függenek össze (Tsimilli-Michael & Strasser, 2008). Jóllehet az így kapott eredmények nem

nyújtanak információt egy állandósult körülményre jellemző fotoszintetikus aktivitásról,

csupán betekintést engednek egy sötétadaptált minta optimális-maximális hatékonyságába. A

sötétadaptált leveleken mért gyors Chl fluoreszcencia tranziensek analízise egyértelműen

jelezte a PSII működésének gyengülését az akceptor oldalon (úgymint az excitonok RC-ok

általi befogásának hatásfoka, a QA redukált formájának gyors felhalmozódása, ekképpen a

PSII RC-ok gyors záródása, az elektrontranszport hatásfoka, az elektrontranszfer fluxusa per

85

RC) az AR vonalakban, összehasonlítva AS párjaikkal (5. táblázat). Eszerint az AS és az AR

biotípusok közötti fő különbség a PSII köztes elektron akceptor készlet feltöltésének

kinetikájában van, ahogyan ezt van Rensen és munkatársai (2001) is fejtegették. A PIabs

fotoszintetikus teljesítmény indexben a PSII komplex mind strukturális, mind működési

jellemzése bennefoglaltatik. A D1 fehérje mutáció csakugyan csökkentette a PSII

működésének intenzitását, amely jól látszik a PIabs 50%-os esésében, ami valószínűleg

okozhatja az alacsonyabb NPQ kialakulását, ahogyan ezt már korábban mások is feltételezték

(Darkó et al., 2000; Váradi et al., 2003). Azonban a ΦNPQ és a CO2 asszimiláció fénytelítési

sebességeinek hasonló értékeire a S. nigrum AS és AR vonalaiban ez nem ad magyarázatot (3.

táblázat) (Váradi et al., 2003; Bajkán et al., 2010).

A PSI végső akceptorainak redukcióját jellemző gyors Chl fluoreszcencia paraméterek

(REo/RC, ϕRo, ψRo) nem különböztek szignifikánsan a kétféle biotípusban és azok hibridjeiben.

A δRo paraméter azonban, mely annak a valószínűségét fejezi ki, amellyel egy elektron a köztes

elektron akceptorok felől a PSI végső akceptorokhoz eljut, az AR biotípusokban jelentősen

megnövekedett (5. táblázat és 7. ábra). A megemelkedett δRo paraméter a VJ növekedéséből

adódott, míg a VI nem különbözött szignifikánsan a biotípusokban. A JIP-teszt analízis során a

D1 protein mutáns vonalakban magasabbnak bizonyul az az arányszám (δRo/(1 – δRo)), mely azt

jellemzi, hogy egy elektron a redukált köztes akceptorok felől a PSI végső akceptorokhoz jut.

Ez feltételezhetően kompenzálhatja a PSII akceptor oldali alacsonyabb elektronáram-sebességet

és a PIabs-t, és hasonló PItotal értékeket eredményez a S. nigrum biotípusaiban (5. táblázat). A

hasonló PItotal értékek valószínűsítik a redukáló erők összehasonlítható mennyiségének

kialakulását a PSI akceptor oldalán mindkét biotípusban. A PSI körüli ciklikus

elektrontranszportról néhányan azt tartják, hogy jelentős elektronáramot képes fenntartani és

ezáltal hozzájárul a lumen acidifikációjához (Miyake et al., 2004; Munekage et al., 2004).

Termolumineszcencia (TL) vizsgálatok a Chenopodium album AR biotípusában kimutatták az

AG sáv meglétét, mely azokból a PSII centrumokból származik, melyekben az oxidált QB-t a

PQ készlet felőli, sztróma reduktánsokból származó, reverz irányú elektrontranszport redukálja

(Sundblad et al., 1988). Ennek a TL sávnak a kialakulásához ciklikus elektrontranszport és

magas lumen protonkoncentráció szükséges (Ducruet et al., 2005). A REo/RC, ϕRo, ψRo JIP-

teszt paraméterek hasonlósága a biotípusokban és különösképpen a megnövekedett δRo az AR

vonalakban valamennyien a PSI végső akceptorainak (Fd, NADP) redukcióját tükrözik, ami az

86

AG sáv jelenlétével együtt egy aktív PSI körüli ciklikus elektrontranszportra és hozzákötött

protontranszferre utal.

Összegzésként elmondható, hogy a psbA gén által kódolt, erősen konzervált D1

protein szerepét az elnyelt többletenergia termális disszipációjának hatékony kialakulásában

esszenciálisnak véljük, miként ezt a kloroplasztisz genomban kódolt S264G D1 mutáció és az

alacsony NPQ kapacitás együtt-öröklődése igazolta. Az eredményeink azt mutatják, hogy az

általunk vizsgált Chl fluoreszcencia tulajdonságokat, úgymint az OJIP tranzienseket és a JIP

teszt paramétereket, az NPQ-t és a PSII antennája által elnyelt energia allokációs mintázatot a

D1 protein befolyásolja az AS és az AR biotípusú S. nigrum növények leveleiben.

A szárazság napjainkban igen fontos környezeti tényezővé vált, mely a növekedés

gátlását eredményezi a fotoszintézis folyamatának limitálása révén. Természetes körülmények

között a vízdeficit gyakran együtt jár a magas hőmérséklettel és/vagy a magas

fényintenzitással (fénygátlás). Ismeretes, hogy a magas fényintenzitással (Sundby et al.,

1993a; Váradi et al., 1994; Darkó et al., 1996; 2000) és hőmérséklettel (Ducruet & Lemoine,

1985, Havaux, 1989) szemben az AR gyomoknak kisebb a toleranciájuk, mint a vad-típusú

párjaiknak. Kíváncsiak voltunk arra, hogy a szárazság, mint abiotikus faktor, hogyan

befolyásolja az atrazin rezisztenciát hordozó S. nigrum növényekben az elnyelt fényenergia

sorsát a vad biotípussal összehasonlítva; a vízdeficit befolyásolja-e a mutáns növények

fitneszét.

A jó vízellátású kontroll AS és AR S. nigrum szülő biotípusokban a sztómák

vezetőképessége (gs) közel azonosnak bizonyult, melyet az AR biotípusra jellemző

alacsonyabb sztómasűrűség nem befolyásolt (14. a ábra). Korábbi kutatások nem találtak

különbséget az AS és az AR biotípusok között a sztómasűrűséget illetően és a sztómák

működésében (Ort et al., 1983; Holt & Goffner, 1985). A CO2 asszimiláció aktinikus fényre

adott válaszgörbéi szintén hasonlóak voltak a kétféle kontroll biotípus leveleiben (15. a ábra)

egyetértésben korábbi munkákkal (Váradi et al., 2003), habár PSII-n keresztüli lineáris

elektrontranszport sebessége (JETR) szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult az AR

biotípusban (5. b ábra, JETR). Enyhe szárazság alatt a sztómazáródás az első lépés, amelyet

szükségszerűen a fotoszintetikus reakciók megváltozása követ (Cornic & Briantais, 1991).

Vízhiány esetén a levelek asszimilációs rátája visszaesik, sőt mi több ez már akkor is

tapasztalható, mielőtt a levelek vízállapotában változások játszódnának le, amikor a levegő

87

páratartalmának (Bunce, 1981) vagy a talaj vízpotenciáljának csökkenése bekövetkezik

(Gollan et al., 1986). Valóban, az öntözés megvonása után először a gs esett vissza, melyet

röviddel ezután, néhány nap múlva, a RWC és a levelek átlagos vízpotenciáljának (Ψ)

csökkenése is követett mindkét biotípusban (14. ábra és 8. táblázat). Szembetűnő volt, hogy az

AR biotípusban a szárazság által indukált csökkenés a vízháztartási paraméterekben később

ment végbe, mint a vad típusban. A kétféle biotípus között a legnagyobb különbség főképpen

az enyhe szárazság szakaszára (DH1) tehető, majd ez a különbség az idő előrehaladtával

mérséklődött és meg is szűnt a DH2 szakaszban (14. ábra). Az AR biotípus levélszöveteinek

magasabb átlagos vízpotenciálja progresszív vízhiány alatt együtt járt a gázcserenyílások

nagyobb mértékű nyitottságával és a magasabb gs értékekkel.

Enyhe vízhiány mellett (DH1) a CO2 asszimiláció intenzitásának csökkenése valóban a

sztómák vezetőképességének csökkenésével mutatott inkább összefüggést, mint a levél

vízháztartási paramétereivel (RWC, Ψ) (15. ábra). Kimutatták, hogy a száraz periódus

fokozhatja a fotorespiráció mértékét (Cornic & Fresneau, 2002), ami szárazság idején

hozzájárulhat a fotoszintetikus apparátus védelméhez a fény általi károsodással szemben

(Chaves et al., 2003). A fotorespiráció (az 1% és 21% O2 tartalmú levegőben meghatározott

asszimilációs ráták különbsége) mértékének emelkedését tapasztaltuk vízdeficit alatt a S.

nigrum mindkét biotípusában (15. d-i ábrák). A fotorespiráció mértéke, vagyis a

fotorespirációs szén veszteség az AR biotípusban alacsonyabbnak bizonyult, mint az AS

párjában, ami jól korrelál a sztómák nagyobb vezetőképességével, mely lehetővé teszi a CO2

jobb hozzáférhetőségét a Rubisco enzim számára a kloroplasztiszok sztrómájában. Ezalatt az

AS biotípusban a nagyobb mértékű sztómazáródás a CO2 kisebb elérhetőségét vonta maga

után (Ci csökkenése), melynek következtében a Rubisco enzim oxigenációs aktivitása

megnövekedhetett a karboxiláció rovására.

A vízhiány alatt – a legtöbb esetben – a tilakoid membrán szerkezete ép maradt

mindkét biotípusban (Függelék 1. ábra). A rehidrációt követően a helyreállási folyamatok

végbementek, melynek köszönhetően 30 perccel a rehidráció után azt tapasztaltuk, hogy a CO2

asszimiláció megindult és egy gyors emelkedés után egy lassabb fázis következett (adatok

nincsenek bemutatva). 24 óra elteltével a rehidráció után a helyreállási folyamatoknak

köszönhetően a kloroplasztiszok a sejtfal mellett szorosan helyezkedtek el (Függelék 1. ábra).

88

A jó vízellátású kontroll biotípusok A/Ci görbéi gyakorlatilag nem különböztek a

kétféle biotípusban, és a Rubisco aktivitása és/vagy extrahálható mennyisége (ε) és a RuBP

regenerációjának maximális sebessége (Jmax) szintén nagyon hasonlóak voltak (16. a ábra és 9.

táblázat). Néhányan úgy gondolják, hogy a Rubisco csökkent aktivitása és/vagy mennyisége

(Castrillo et al., 2001; Parry et al., 2002; Tezara et al., 2002) vagy a RuBP regenerációjának

elégtelen kapacitása (Tezara et al., 1999; Thimmanaik et al., 2002) a fotoszintézis limitáló

faktorai lehetnek főként vízdeficit esetén (Bota et al., 2004). A vízmegvonás által indukált

CO2 asszimiláció és az ε csökkenése az AR biotípusban szignifikánsan alacsonyabb mértékű

volt, mint az AS párjában (16. b és c ábrák). Az ε paraméterről azt tartják, hogy a

karboxilációs hatásfokot tükrözi, és általában a Rubisco enzim aktivitásával van

összefüggésben (von Caemmerer, 2000). A növények rehidrációját követően 24 óra elteltével

az A/Ci görbék amplitudója emelkedésnek indult (RuBP regenerációja), azonban a görbe

kezdeti meredekségéből számolt Rubisco aktivitás közel változatlan maradt (16. ábra).

A S. nigrum AS és AR szülő biotípusok reciprok keresztezéseiből származó

szárazságnak kitett F2 hibridek gázcsere vizsgálatai azt mutatták, hogy a szülő populációban

meglévő különbség megszűnt az F2 hibridek esetében (ASF2 és ARF2) (9. táblázat és 18.

ábra), és a kétféle biotípus (ASF2 és ARF2) a szülő AR típus értékeit közelítette a vízhiány

alatt. Elképzelhető, hogy a szülő AR biotípus horgas, kampós alakú levélszőrei, melyek a levél

felületére kissé ráhajoltan helyezkedtek el (Függelék 2. ábra), hozzájárult a nagyobb

vízmegtartó képesség kialakulásához. A fotoszintetikus teljesítmény mérsékeltebb visszaesése

mellett, a nagyobb sztómanyitottság és a kedvezőbb levél vízpotenciál értékek együttes

mutatkozása felveti az ozmotikumok nagyobb felhalmozódásának lehetőségét az AR

növényekben, amely mérsékelheti az RWC-ben amúgy megmutatkozó vízvesztés káros

élettani hatásait. Az AR biotípusra jellemző kampós levélszőrök is szerepet játszhatnak,

növelve a levélfelületi diffúziós határréteg vastagságát, míg az AS típus egyenes szőrei a levél

felszínére közel merőlegesek voltak, ezáltal kisebb hatást kifejtve. Rendszerint a sztómák

válaszreakciói szorosabb összefüggést mutatnak a talaj nedvességtartalmának, mint a levél

vízállapotának megváltozásával. Ezek alapján feltételezik, hogy a sztómák reagálnak a

dehidratált gyökerek produktumaira (pl. az abszcizinsav), mint kémiai jelmolekulákra (Davies

& Zang, 1991). Ismeretes, hogy néhány növényfajban a szárazság hatására kifejezettebb

abszcizinsav-függő sztómazáródás megy végbe (Riera et al., 2005). Elképzelhető, hogy a S.

89

nigrum AR biotípusában kisebb mértékű lehet az abszcizinsav által mediált sztómazáródás a

vélhetően fokozottabb vízmegtartó képesség miatt, mint az AS típusban. A szárazság elleni

egyik védekező mechanizmus a növényekben a rendelkezésre álló víz konzerválása, mely pl. a

sztómaszám lecsökkentésével valósulhat meg (Schulze, 1986), ez azonban az itt alkalmazott

kísérleti elrendezésben nem játszhatott szerepet.

Az eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a S. nigrum AR

biotípusának vízhiánnyal szembeni fokozottabb toleranciája nem köthető az S264G D1 protein

mutációjához, mivel a reciprok keresztezésekből származó, a szülő populációkban meglévő

különbségek az F2 hibridekben elmosódtak. Úgy feltételezzük, hogy az általunk tapasztalt

különbség a szülő populációknak az élőhelyhez való alkalmazkodása során a sejtmagi

genetikai háttér módosulásával alakulhatott ki, vagy a számos pleiotrop hatás egyike, amely a

szelektálódott populációban az önbeporzás következtében fennmaradhatott. Megállapíthatjuk,

hogy az atrazin-rezisztens biotípus rosszabb fitnesze nem magyarázható a vízhiánnyal

szembeni tolerancia-csökkenésével.

A fotokémiai energia konverzió (ΦPSII) és a JETR értékei igen jelentősen, közel azonos

értékre estek vissza mindkét biotípusban és hibridjeikben is az erős vízdeficit (DH3)

következményeként a kontroll növényekéhez képest (20. a, b és 10. a, b). Az AR vonalakban

drasztikus emelkedést tapasztaltunk az NPQ paraméter értékében a jó vízellátású

kontrollokhoz képest, mialatt az AS vonalakban jóval kisebb mértékű volt ez az emelkedés

(19. a és 21. h ábrák). Érdekes módon mind a fényintenzitás-függés, mind a kinetikai

vizsgálatok során az NPQ görbék amplitudója és felfutása tükrözte a ΦNPQ görbékéét a

vízhiányos növényekben (19. a, 20. c, 21. e és h ábrák), nem úgy, mint a kontrollok esetében

(21. g, d, h és e ábrák). Szárazság alatt a regulált termális disszipáció fokozódása a

fénybegyűjtő komplexekben valamiképpen magában foglalja a xantofill ciklust (Demmig-

Adams & Adams, 1996) és a lutein ciklust (Matsubara et al., 2001), jóllehet utóbbinak szerepe

nem teljesen világos még. Amikor a CO2 fixációja gátolt a szárazság alatt, a szabályozó

folyamatok révén visszaesik az elektrontranszport sebessége, ezáltal egyensúlyt teremtve az

elektronok lecsökkent szükségletével és minimálisra csökkentve a reaktív oxigén formák

keletkezését. Ugyanakkor az NPQ megnövekszik, hogy mérsékelje a PSII-n lévő gerjesztési

nyomást. Golding és Johnson (2003) vizsgálataik során azt a megfigyelést tették, hogy az

‘aktív’ PSI centrumok aránya megemelkedett a száraz periódus alatt. Feltételezéseik szerint

90

ezek elsődlegesen a ciklikus elektrontranszportban vesznek részt, amely a ΔpH fokozásával

hozzájárul az NPQ fenntartásához, és megvédi a PSII-t. Viszont, amennyiben feltesszük, hogy

a fokozott PSI aktivitás segít kiigazítani a lassúbb lineáris elektrontranszport okozta ΔpH

elmaradást, fel kell tételeznünk, hogy a de-epoxidációban, NPQ és qE folyamatokban meglévő

tagadhatatlan hiányt más, akár az S264G mutáció pleiotrop hatása, mint pl. a lipidösszetétel és

a membrán fluiditás jelentős megváltozásai is okozhatják. Érdekes módon, míg a kontoll AR

vonalakban az alacsonyabb NPQ kapacitás mellett közel azonos ΦNPQ és szignifikánsan

magasabb ΦNO értékeket kaptunk, addig az erős szárazságnak kitett AR növények leveleiben a

drasztikusan lecsökkent fotokémiai hatásfok mellett erőteljesen megnőtt a regulált energia

disszipáció frakciója, mely tükrözte a megnövekedett NPQ-t és kissé csökkent a nem-regulált

utak általi energia disszipáció hatásfoka a kontrollokhoz képest. Ezzel szemben a vízhiányos

AS vonalak NPQ kapacitása csak kis mértékben emelkedett a kontrollokhoz képest, amely a

ΦNPQ-ban is tükröződött, míg a ΦNO enyhén megnőtt a kontrollokhoz képest. Úgy tűnik tehát,

hogy az AR vonalakban (AR, ARF2, ARF6) az erős szárazság által indukált fotoprotekciós

folyamatok hatékonyabban működhetnek, mint az AS párjaikban (AS, ASF2, ASF6). Azonban

ennek magyarázatához további vizsgálatokra lenne szükségünk. Az erős szárazságnak kitett

szülő populációk és megfelelő hibridjeik a vizsgált fluoreszcencia tulajdonságokban nem

különböztek egymástól, tehát e folyamatok a D1 protein mutációhoz köthetők. A vízhiányos

mintában (DH3) a rehidratálás után a plasztiszszerkezet helyreállását tapasztaltuk (Függelék 1.

ábra), illetve a kontrollokhoz hasonló NPQ kinetika és energia allokációs mintázat is visszaállt

mindkét biotípusban (21. i ábra).

91

7. ÖSSZEFOGLALÁS

Az oxigénfejlesztő fotoszintézis során a PSII molekuláris szerkezetének és működésének két

egymással ellentétes követelményt kell kielégítenie. Egyrészt a napsugarak hatékony

begyűjtése szükséges a fotoszintetikus eletrontranszportlánc meghajtásához és annak optimális

sebességének fenntartásához. Másrészt a klorofill gerjesztett állapota és a molekuláris oxigén

jelenléte egy potenciálisan letális környezetet teremt, amely a fehérjéket, lipideket és a

fotoszintetikus membrán pigmentjeit irreverzibilisen károsíthatja. Ennek kivédésére a

fotokémiai rendszer egyes kofaktorai, úgymint a karotinoidok, amelyek a szingulett oxigén

hatástalanításában és a 3Chl* befogásában játszanak szerepet, illetve fotoprotektív

mechanizmusok vannak jelen, amelyek a magas fényintenzitás által indukálódnak, és a 1Chl*

deaktivációját idézik elő.

Váradi és munkatársai (2003) kutatásai arra világítottak rá, hogy valamennyi vizsgált

atrazin-rezisztens gyomfaj, mely hordozta a PSII reakciócentrum D1 proteinjének Ser264→Gly

mutációját, egy lecsökkent fotoszintetikus hatékonyságú PSII-vel rendelkezett, ami az

alacsonyabb fotokémiai kioltásban (qP), mely fokozza a PSII-re ható gerjesztési nyomást (1 –

qP), a PSII hatásfokának (ΦPSII) és a lineáris elektrontranszport sebességének csökkenésében

(JETR) nyilvánult meg. Ezekben a mutánsokban a Zea fényindukált képződése és a termális

disszipáció csökkent mértékűnek bizonyult. Mindezen megfigyelésekből arra következtettek,

hogy ezen mutánsok nagyobb fényérzékenységének hátterében az elnyelt fény fotokémiai

hasznosulásának és a nem-fotokémiai energia disszipáció arányának kedvezőtlen eltolódása

állhat.

Az NPQ molekuláris mechanizmusa csak részben ismert, de kialakulásának feltételei

jól behatárolhatóak: a tilakoid lumenének alacsony kémhatása, de-epoxidált xantofillok

képződése, a PsbS és más LHCII fehérjék protonációja. Eddigi ismereteink szerint az NPQ

kialakulását nukleárisan kódolt faktorok határozzák meg (Funk et al., 1995; Li et al., 2000;

Bugos & Yamamoto, 1996; Jansson, 1999), habár a D1 fehérjét kódoló psbA gén – amely a

rezisztens növényekben a mutációt hordozza – a kloroplasztisz genom része (Morden &

Golden, 1989). Nem világos, hogy a D1 protein hogyan járulhat hozzá az antennában

végbemenő, hatékony nem-fotokémiai hődisszipáció kialakulásához.

92

Napjainkban a vízhiány az egyik legfontosabb abiotikus stressztényezővé vált, amely a

növény növekedését/produktivitását limitálja a fotoszintézis gátlásán keresztül. Ismeretes az

atrazin-rezisztens növények eltérő hőmérséklet-érzékenysége és adaptációs képessége

(Ducruet & Lemoine, 1985), illetve fokozott fényérzékenységükről egyaránt beszámoltak

(Hart & Stemler, 1990). Természetes körülmények között a vízdeficit gyakran együtt jár a

magas hőmérséklettel és/vagy a magas fényintenzitással (fénygátlás). Felvetődött az a kérdés,

vajon a vízdeficit befolyásolja-e a D1 protein mutáns növények fitneszét.

A célkitűzésekben megfogalmazottak alapján a reciprok keresztezések alanyaként a

Solanum nigrum gyomfaj atrazin-szenzitív és rezisztens biotípusait választottam a

laboratóriumunkban meglévő D1 protein mutáns gyomfajok közül. Ez a faj eredményesen

nevelhető laboratóriumi körülmények között, viszonylag rövid életciklussal bír, jól kezelhető

levelei vannak a gázcseremérések szempontjából, valamint a szülő populációk hagyományos

keresztezési eljárással laboratóriumi körülmények között könnyen hibridizálhatók. A klorofill

a fluoreszcencia indukció és JIP teszt paraméterek, a PSII energia allokációs mintázata, a DNS

szekvencia analízis és az immunoblot vizsgálatok, a levélszél öröklődésének nyomonkövetése,

a CO2 asszimiláció és vízháztartási paraméterek vizsgálata által kapott eredményeket

áttekintve az alábbi megállapításokat teszem:

• A S. nigrum gyomnövény AS és AR szülő biotípusok reciprok keresztezésének sikerességét

egy mendeli tulajdonság, a levélszél alak öröklődésének nyomonkövetésével igazoltuk,

mely bizonyította az F2 növényi anyag sejtmagi hibrid státuszának meglétét. Az F2

nemzedék levélszél alakjának várható – a Hardy-Weinberg modell szerint számolt –

szegregációja és a kísérletesen megfigyelt adatok nem különböztek szignifikánsan, mely

bizonyította az F2 populáció hibrid státuszának meglétét.

• A vizsgált szülői és hibrid vonalak esetében a D1 protein mutánsokban általánosan

megfigyelhető volt az in vivo klorofill fluoreszcencia mérésekből számított PSII lineáris

elektrontranszport sebesség, a fotokémiai kioltási koefficiens és a nem-fotokémiai kioltás

csökkenése, ezen belül a gyorsan relaxálódó qE komponens csökkenése.

• A reciprok keresztezések eredménye azt mutatta, hogy az NPQ kapacitásbeli különbségeket

nem befolyásolták a sejtmagi szabályozó faktorok a hibridekben egészen az F6 generációig.

Ezzel összhangban van az az eredmény is, hogy a szekvencia analízis alapján a S. nigrum

93

AS és AR biotípusaiban azonosak voltak a PsbS fehérjék, azaz nem tartalmaztak aminosav

eltérést, és a PsbS és D1 fehérjék expressziójában sem találtunk különbséget.

• A xantofill ciklus aktivitására vonatkozó méréseim alapján megállapítottam, hogy a D1

protein mutációval rendelkező valamennyi AR vonal kb. 20%-kal csökkent de-epoxidációs

képességgel rendelkezett. A xantofill ciklus készletek nagysága között a kétféle biotípusban

és hibridjeikben nem mutatható ki különbség. A xantofill ciklus kisebb kapacitásával

részben megmagyarázható az NPQ (vagy qE) folyamatok csökkenése az AR biotípusokban.

• Az alkalmazott kétféle PSII energia allokációs modell eredményei alapján megállapítottam,

hogy az elnyelt fényenergiának kisebb hányada alakult át kémiailag kötött energiává a

fotokémiai töltésszétválasztás során (ΦPSII), amely összefüggésbe hozható az AR vonalak

50%-kal alacsonyabb fotoszintetikus teljesítmény indexével (PIabs), főképpen a gerjesztési

energia befogásának lecsökkent hatékonysága (ϕPo/(1 – ϕPo)) következtében. Az AR

vonalakra jellemző csökkent fényindukált fotoprotektív NPQ (vagy qE) kapacitás ellenére a

regulált hődisszipáció hatásfokát (ΦNPQ vagy ΦDL) nem befolyásolta a D1 protein mutáció.

A kisebb PSII hatásfok mintegy kompenzációs mechanizmusaként ezáltal a nem-regulált

energiaveszteség frakciójának (ΦNO vagy ΦE) szignifikáns megnövekedését tapasztaltam a

mutáns vonalakban, amely a disszipáció nem fotoprotektív módját jelenti és így közvetlenül

hozzájárulhat az AR növények gyengébb fitneszéhez.

• Megállapítottam, hogy az AR vonalak sötétadaptált levelein mért gyors klorofill

fluoreszcencia tranziensek (OJIP) analízise egyértelműen jelezte a PSII működésének

gyengülését az akceptor oldalon (úgymint az excitonok RC-ok általi befogásának hatásfoka,

a QA redukált formájának gyors felhalmozódása, ekképpen a PSII RC-ok gyors záródása, az

elektrontranszport hatásfoka, az elektrontranszfer fluxusa per RC). A D1 fehérje mutáció

csökkentette a PSII működésének intenzitását, amely jól látszik a PIabs 50%-os esésében,

ami hozzájárulhat az alacsonyabb NPQ kialakulásához. Azonban a ΦNPQ és a maximális

asszimilációs ráta (Amax) hasonló értékeire a S. nigrum AS és AR vonalaiban ez nem ad

magyarázatot. Megállapítottam, hogy a PSI végső akceptorainak redukcióját jellemző JIP-

teszt paraméterek (REo/RC, ϕRo, ψRo) nem különböztek szignifikánsan a kétféle biotípusban

és hibridjeikben. A δRo paraméter azonban, mely annak a valószínűségét fejezi ki, amellyel

egy elektron a köztes elektron akceptorok felől a PSI végső akceptorokhoz eljut, az AR

biotípusokban jelentősen megnövekedett. Ez feltételezhetően kompenzálhatja a PSII

94

akceptor oldali alacsonyabb elektronáram sebességet és a PIabs-t, és hasonló PItotal értékeket

eredményez a S. nigrum biotípusaiban.

Az eredményeink azt mutatják, hogy az általunk vizsgált klorofill fluoreszcencia

tulajdonságokat, úgymint a gyors Chl fluoreszcencia tranzienseket és a JIP teszt paramétereket,

a PSII antennája által elnyelt energia allokációs mintázatot és az NPQ-t a D1 protein

befolyásolja az AS és AR biotípusú S. nigrum növények leveleiben. Az erősen konzervált D1

protein szerepét az elnyelt többletenergia nem-fotokémiai hődisszipációjának hatékony

kialakulásában esszenciálisnak véljük, ahogyan ezt a kloroplasztisz genomban kódolt S264G

D1 protein mutáció és az alacsony NPQ (vagy qE) kapacitás együtt-öröklődése igazolta.

A vízdeficit hatására vonatkozó megállapítások:

• Megállapítottam, hogy az aktinikus fényre adott válaszgörbék alapján, valamint az

intercelluláris CO2 koncentrácó függvényében meghatározott, egységnyi levélfelületre

vonatkoztatott CO2 asszimilációs ráták gyakorlatilag nem különböztek a kétféle szülő

biotípusban. A vízháztartási paraméterek értékei, sztóma konduktancia, levél relatív

víztartalom, levél vízpotenciál (gs, RWC, Ψ) szintén nagyon hasonlóak voltak a kétféle

biotípusban, és az AR biotípus alacsonyabb sztómasűrűsége nem befolyásolta a gs-t.

• A progresszív vízhiány mindkét biotípusban előidézte a sztómák záródását, csökkentve a

kloroplasztiszba jutó CO2 mennyiségét, s mindez a gs, az intercelluláris CO2 koncentráció

és a CO2 asszimiláció intenzitásának csökkenésében mutatkozott meg. Ezt követően

néhány nap késéssel az egyéb vízháztartási paraméterek (Ψ, RWC) értékeiben is

csökkenést figyeltem meg. Az asszimilációs ráta csökkenésével párhuzamosan a

fotorespiráció mértékének fokozódását figyeltem meg progresszív vízhiány alatt.

Megállapítottam, hogy az AR biotípus a vízháztartási paraméterek és a CO2 asszimiláció

alapján toleránsabb volt a vízmegvonással szemben. A vízháztartási paraméterek és az

asszimilációs ráta csökkenése később következett be az AR biotípusban, mint az AS

párjában. Ezt tükrözte a kisebb mértékű fotorespiráció, a magasabb maximális

asszimilációs ráta (Amax), a nagyobb karboxilációs hatékonyság (ε) és a RuBP nagyobb

95

regenerálódási sebessége (Jmax) is. A vízmegvonás előrehaladtával a kétféle biotípus

közötti különbség mérséklődött, illetve a közepes vízhiány szakaszában el is tűnt.

• A reciprok keresztezésekből származó F2 hibridekkel folytatott vizsgálatok eredményei

alapján megállapítom, hogy a szülő AR biotípus szárazsággal szembeni nagyobb

toleranciája nem köthető a D1 protein mutációhoz, mivel a szülő populációkban meglévő

tulajdonságok az F2 nemzedékben elmosódtak. Feltételezem, hogy az általam tapasztalt

különbség a szülő populációknak az élőhelyhez való alkalmazkodása során a sejtmagi

genetikai háttér módosulásával alakulhatott ki, vagy a számos pleiotrop hatás egyike,

amely a szelektálódott populációban az önbeporzás következtében fennmaradhatott.

Megállapítom továbbá, hogy az atrazin-rezisztens biotípus rosszabb fitnesze nem

magyarázható a vízhiánnyal szembeni tolerancia-csökkenésével.

• A PSII hatásfoka (ΦPSII) és a lineáris elektrontranszport sebessége mindkét erősen

vízhiányos biotípusban és hibridjeikben közel azonos értékekre estek vissza. Valamennyi

AR vonalban drasztikus NPQ növekedést figyeltem meg, míg a vad-típusú AS párjaikban

kisebb mértékű volt ez az emelkedés. Meglepő módon a ΦNPQ és az NPQ összefüggést

mutatott, nem úgy, mint a kontroll növények esetében. A ΦNO, mint komplementer

folyamat, az AR vonalakban kissé lecsökkent, míg a vad típusú párjaikban megemelkedett

a jó vízellátású kontrolljaikhoz képest.

• A progresszív vízhiánynak kitett szülő populációk és megfelelő hibridjeik a vizsgált

fluoreszcencia tulajdonságokban nem különböztek egymástól, így e folyamatok a D1

protein mutációhoz köthetők, szemben a CO2 asszimilációbeli különbségekkel. A

vízhiányos mintában a rehidratálás után a plasztiszszerkezet helyreállását, illetve a

kontrollokhoz hasonló PSII energia allokációs mintázat és NPQ kinetika visszaállását

tapasztaltam mindkét biotípusban.

Úgy tűnik tehát, hogy az AR vonalakban a klorofill fluoreszcencia vizsgálatok alapján az erős

szárazság által indukált fotoprotekciós folyamatok hatékonyabban működhetnek, mint az AS

párjaikban. Ezt részben magyarázhatná a PSI körüli ciklikus elektrontranszport fokozódása,

amely a ΔpH létrehozásával hozzájárul az NPQ fenntartásához, és mérsékli a PSII-n lévő

gerjesztési nyomást. Szárazság alatt a regulált termális disszipáció fokozódása a fénybegyűjtő

komplexekben valamiképpen magában foglalja a xantofill ciklust és a lutein ciklust, habár

96

utóbbi szerepe nem teljesen világos még. A kloroplasztisz vízdeficit hatására végbemenő

szerkezeti újra-rendeződése szintén hozzájárulhat valamilyen formában a hatékonyabb

hődisszipáció kialakulásához az AR növényben. Ezt alátámasztani látszik az a tény, hogy a

rehidratálás után a plasztiszszerkezet helyreáll, melynek következtében visszaáll a

kontrollokhoz hasonló PSII energia allokációs mintázat és NPQ kinetika mindkét biotípusban

és hibridjeikben. Azonban e jelenség magyarázatához további vizsgálatokra lenne szükségünk.

97

8. SUMMARY

In the course of oxygenic photosynthesis the molecular structure of PSII should satisfy two

antagonistic criteria. On one hand it should be organized so that is suitable for the efficient

collection of light and to transferring the excitation energy to the reaction centres to drive the

electron transport chain. On the other hand the excited chlorophyll molecules in the presence

of molecular oxygen represent a potentially lethal environment which can irreversibly damage

the proteins, lipids and other components of the photosynthetic membrane. In order to

counteract this process some sort of photoprotective mechanism had to be evolved which

comes into effect under high light condition and deactivates singlet excited chlorophylls

(1Chl*). Also, certain cofactors of the photosynthetic machinery, such as carotenoids, play a

significant role in scavenging singlet oxygen (1O2*) and/or in relaxation of triplet excited

chlorophylls (3Chl*).

It has been shown by Váradi and co-workers (2003) that all of the atrazine-resistant

weed species in their investigation, which carried a mutation of Ser264→Gly on their D1

protein of PSII reaction centre, exhibited diminished PSII activity. This was described by a

decrease in photochemical quenching (qP), which also means higher excitation pressure on

PSII (1 – qP), and by a decrease of both the PSII efficiency (ΦPSII) and the linear electron

transport rate (JETR). In these mutants the light-induced formation of zeaxanthin and the

thermal dissipation of excess energy were both impaired. The authors concluded that in these

mutants the increased sensitivity to light can be attributed to the non-favourable change in the

ratio of photochemical utilization and non-photochemical quenching (NPQ) of the absorbed

light.

Although the exact molecular mechanism of NPQ is not yet fully understood several of

its preconditions are well known, such as acidification of the thylakoid lumen, de-epoxidation

of the xantophyll-cycle pigments and/or protonation of PsbS and other light-harvesting

complexes (LHCs). There is a general consensus that NPQ is controlled by factors that are

encoded in the nucleus (Funk et al., 1995; Bugos & Yamamoto, 1996; Jansson, 1999; Li et al.,

2000). Since the D1 protein encoding psbA gene, which carries the mutation in the atrazine-

resistant plants, is localized in the chloroplast genome (Morden & Golden, 1989), it is not

98

entirely clear in what way the D1 protein can contribute to the formation of efficient non-

photochemical dissipative processes in the antenna.

Nowadays, drought stress has become one of the most important abiotic factors, which

limits the growth and/or productivity of the plants via inhibiting the photosynthetic machinery.

The different sensitivity of the atrazine-resistant plants to the ambient temperature and their

ability to adapt to various environmental conditions are well documented (Ducruet &

Lemoine, 1985) as well as their increased susceptibility to high light (Hart & Stemler, 1990).

In their natural environment the lack of water often goes hand in hand with high ambient

temperature and/or elevated light levels (photoinhibition). This led us to raise the question

whether the drought stress can influence the fitness of the D1 protein mutant plants.

In order to pursue this investigation I selected the atrazine-sensitive and resistant (AS

and AR) biotypes of Solanum nigrum out of the D1 protein mutant weed species that we had

access to in our laboratory. This particular weed can be efficiently grown in laboratory

conditions; they have a fairly short life-cycle, their leaves are very suitable for gas exchange

measurements and the parent populations can easily be hybridized by standard cross breeding

methods. Throughout this investigation I have focussed my interest on the chlorophyll a

fluorescence induction and JIP test parameters, the energy allocation pattern in PSII, DNA

sequence and immunoblot analysis, the inheritance of leaf margin, CO2 assimilation and the

properties of water balance. The results can be summarized as follows:

• The turn out of the reciprocal crossing of the AS and AR biotypes of S. nigrum were

analyzed by following the inheritance of a Mendelian trait of the plants, the leaf margin.

Since the expected segregation of leaf margin type in F2 – calculated according to the

Hardy-Weinberg model – and the observed numbers did not differ significantly, it thus

justifies the hybrid status of the F2 population.

• Using in vivo Chla fluorescence techniques I managed to show, in the D1 mutants of both

the parent and their hybrid lines, a decrease in the PSII linear electron transport rate, in the

photochemical quenching parameter, and a drop off in the NPQ and its fast relaxing qE

component, in particular.

• The results of the reciprocal crossings proved that the differences in the NPQ capacity

between the AS and AR types is not influenced by the regulatory factors in the nuclei of

99

the hybrids down to the F6 generations. This finding is in accordance with the DNA

analysis of the AS and AR biotypes of S. nigrum, which showed no alteration in the amino

acid sequence of the PsbS protein and there were no differences in the expression of the

PsbS and D1 proteins, either.

• Investigating the xanthophyll-cycle activity I found that all AR lines, possessing the

mutation on the D1 protein, exhibited a roughly 20% decrease in their aptitude for de-

epoxidation, however, in the two biotypes and their hybrids, there was no significant

difference in the size of their xanthophyll-cycle pool. The reduced capacity of the

xanthophyll-cycle in the AR biotypes can partially explain the impaired NPQ (or qE)

processes found in these plants.

• The two models used in determining the energy allocation pattern in PSII led me to

conclude that during the photosynthetic charge separation a smaller fraction of the absorbed

light energy was converted to chemically stored energy (ΦPSII) in the AR lines, which can

be related to the 50% lower photosynthetic performance index (PIabs), and in particular, the

drop in the efficiency in capturing the excitation energy (φPo/(1 – φPo)). Despite the lower

light induced photoprotective NPQ (or qE) capacity of the AR lines the efficiency of the

regulated thermal dissipation of the excitation energy (ΦNPQ or ΦDL) was not affected by the

mutation on the D1 protein. As a compensatory mechanism to counteract the lower PSII

efficiency in the mutant lines a significant increase in the non-regulated energy losses (ΦNO

or ΦE), which represents the non-photoprotective way of energy dissipation, was found,

potentially contributing to the lower fitness of the AR plants.

• The analysis of the fast Chl a fluorescence transients (OJIP) of the dark-adapted leaves of

the AR biotypes revealed a decline in PSII performance on the acceptor side (as indicated

by the decreasing efficiency of the RCs in capturing the excitation energy, the fast

accumulation of reduced QA and the fast closure of PSII RCs, the efficiency of electron

transport and the electron transfer flux per RC). The mutation on the D1 protein impaired

the functioning of PSII, as implied from the 50% decline in PIabs, which, in turn, can

contribute to the lower NPQ capacity. However, this cannot explain the similar values of

ΦNPQ and maximal assimilation rate (Amax) in the AS and AR lines of S. nigrum. The JIP

test parameters (REo/RC, φRo, ψRo), characterizing the reduction of the final electron

acceptors of PSI, were found to be within statistical significance in both biotypes and in

100

their hybrids. However, the δRo parameter, which represents the efficiency to transfer an

electron from the intersystem electron carriers to reduce the final electron acceptors on the

acceptor side of PSI, has increased significantly in the AR lines. This, presumably, can

compensate the slower electron flow rate on the acceptor side of PSII as well as the lower

PIabs, and yields similar PItotal values in both biotypes of S. nigrum.

These results show, that the D1 protein has an influence on the Chl a fluorescence properties,

such as the fast Chl fluorescence transients and the JIP test parameters, as well as on the

energy allocation patterns in PSII and the NPQ of both the AS and AR biotypes of S. nigrum.

We believe that the highly conserved D1 protein plays an essential role in the formation of

thermal dissipation processes to de-activate the excess excitation energy, as it was

demonstrated by the co-inheritance of the S264G mutation on the D1 protein, which is

encoded in the chloroplast genome, and the low levels of NPQ (or qE) capacity.

The main findings of our investigation concerning the effects of drought stress are as follows:

• The results show that the CO2 assimilation rates per unit leaf surface area, based on the

evaluation of the actinic light response curves as a function of intercellular CO2

concentration, did not differ significantly in the two parent biotypes. The water balance

parameters, such as the stomatal conductance (gs), the relative water content of the leaves

(RWC) and the water potential (Ψ), were very much alike in the two biotypes and even the

larger stoma density in the AR biotype had practically no effect on gs.

• In both biotypes the progressive water famine led to the closure of the stomata, preventing

CO2 intake by the chloroplasts, which manifested in a decrease of the intercellular CO2

concentration as well as a drop in gs and the in CO2 assimilation rate. This was followed,

after a few days, by a decline in other water balance parameters (RWC, Ψ). Parallel with

the decrease in the CO2 assimilation rate, a rise in the extent of photorespiration was

observable as a consequence of the gradual water deficit. Based on the water balance

parameters and the CO2 assimilation rate one can conclude that the AR biotype was more

tolerant towards the detention of water: both the water balance parameters and the CO2

assimilation rate started decreasing somewhat later in the AR biotype than in its AS

101

counterpart. This was also substantiated by a weaker photorespiration, a higher rate of

maximal assimilation (Amax), increased carboxylation efficiency (ε) and a higher

regeneration rate of RuBP (Jmax). The difference between the two biotypes gradually

diminished with the progression of water detention and it practically disappeared during

the intermediate phase of dehydration.

• The results of the investigations with the F2 generation of the reciprocal cross breeding

shows that the higher drought tolerance of the parent population of the AR biotype cannot

be linked to the D1 mutation as the traits present in the parent population become blurred

in the F2 generation. We argue that the differences seen in the parent population are the

consequence of their adaptation to the environment, causing alterations in the genetic

material of the nuclei, or the result of one of the several pleiotropic effects, which could

sustain in the selected population via the self-pollination. We also conclude that the lower

fitness of the AR lines cannot be explained by their weakened tolerance towards water

detention.

• In both biotypes and their hybrids, which suffered severe dehydration, the magnitude of

PSII efficiency and that of the linear electron transport rate drops back to similar levels.

The NPQ has increased dramatically in all AR lines, whereas the increase was much less

pronounced in their AS counterparts. Surprisingly, we could observe a correlation between

ΦNPQ and NPQ, unlike in the case of their well watered controls. The levels of ΦNO,

representing a complementary process, were found to be somewhat decreased in the AR

lines, while an increase was observed in the wild-type plants as compared to their well

watered control pairs.

• As the fluorescence properties of the parent populations, which went through progressive

dehydration, and their corresponding hybrids were found to be very similar the

aforementioned observations can be linked to the mutation on the D1 protein, unlike the

differences in CO2 assimilation. After rehydration the membrane structure of chloroplast

was largely restored and similarly the energy allocation pattern of PSII and the NPQ

kinetics were found to be much like to those observed in the control plants, in both

biotypes.

102

Based on the fluorescence parameters it seems reasonable to conclude that the photoprotection

mechanisms induced by severe water detention are more efficient in the AR lines than in their

AS counterparts. This can be, up to a certain extent, substantiated by the enhancement of the

cyclic electron flow around the PSI, which can contribute to maintaining the NPQ by building

up a transmembrane ΔpH, hence lessening the excitation pressure on PSII. The augmentation

of the regulated thermal dissipative processes in the light-harvesting complex under drought

stress conditions can somehow involve the xanthophyll- and lutein-cycles, however, the exact

role of the latter in this process has not yet fully understood. In the AR plants the structural re-

arrangement of chloroplasts, as a result of water detention, can also contribute, to some extent,

to a more efficient thermal dissipation mechanism. This can be supported by the fact that, after

re-hydration, the membrane structure of the chloroplasts is mostly restored, which leads to

similar energy allocation patterns in PSII and NPQ kinetics in both biotypes and in their

hybrids, as compared to those in their controls. However, in order to gain a better

understanding of this phenomenon further investigations are required.

103

9. IRODALOMJEGYZÉK Adams WW, Demmig-Adams B, Winter K (1990) Relative contributions of zeaxanthin-related and

zeaxanthin-unrelated types of ‘high-energystate’ quenching of chlorophyll fluorescence in spinach leaves exposed to various environmental conditions. Plant Physiol 92: 302-309

Ahn TK, Avenson T, Ballottari M, Cheng YC, Niyogi KK, Bassi R, Fleming GR (2008) Architecture of a charge-transfer state regulating light harvesting in a plant antenna protein. Science 320: 794-797

Allen JF, Bennett J, Steinback KE, Arntzen CJ (1981) Chloroplast protein phosphorylation couples plastoquinone redox state to distribution of excitation energy between photosystems. Nature 291: 1-5

Amarie S, Standfüss J, Barros T, Kühlbrandt W, Dreuw A, Wachtveitl J (2007) Carotenoid radical cations as a probe for the molecular mechanism of nonphotochemical quenching in oxygenic photosynthesis. J Phys Chem B 111: 3481-3487

Andersson B, Barber J (1996) Mechanisms of photodamage and protein degradation during photoinhibition of photosystem II. In: Baker NR ed. Photosynthesis and the Environment. Kluwer Academic Publ, Dordrecht, pp 101-121

Andersson J, Walters RG, Horton P, Jansson S (2001) Antisense inhibition of the photosynthetic antenna proteins CP29 and CP26: Implications for the mechanism of protective energy dissipation. Plant Cell 13: 1193-1204

Andersson J, Wentworth M, Walters RG, Howard CA, Ruban AV, Horton P, Jansson S (2003) Absence of the Lhcb1 and Lhcb2 proteins of the light-harvesting complex of photosystem II – effects on photosynthesis, grana stacking and fitness. The Plant Journal 35: 350-361

Anderson JM, Chow WS, Goodchild DJ (1988) Thylakoid membrane organisation in sun/shade acclimation. Aust J Plant Physiol 15: 11-26

Anderson JM, Chow WS, Park YI (1995) The grand design of photosynthesis: acclimation of the photosynthetic apparatus to environmental cues. Photosynth Re; 46: 129-139

Anderson JM, Osmond B (2001) Sun-shade responses: Compromises between acclimation and photoinhibition. In: Kyle DJ, Osmond B, Arntzen CJ eds. Photoinhibition. Elsevier, Amsterdam, pp 1-38

Arntzen CJ, Ditto CL, Brewer PE (1979) Chloroplast membrane alterations in triazine resistant Amaranthus retroflexus biotypes. Proc Natl Acad Sci USA 76: 278-282

Arntzen CJ, Pfister K, Steinback KE (1982) The mechanism of chloroplast triazine resistance: alterations in the site of herbicide action. In: LeBaron HM, Gressel J eds. Herbicide Resistance in Plants. John Wiley and Sons, New York, pp 185-214

Aro EM, Virgin I, Andersson B (1993) Photoinhibition of photosystem II: inactivation, protein damage and turnover. Biochim Biophys Acta 1143: 113-134

Asada K (1994) Mechanisms for scavenging reactive molecules generated in chloroplasts under light stress. In: Baker NR, Bowyer JR eds. Photoinhibition of Photosynthesis: From Molecular Mechanisms to the Field. BIOS Sci Publ, Oxford, pp 129-142

Asada K (1999) The water-water cycle in chloroplast: Scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 601-639

Assmann SM (1988) Enhancement of the stomatal response to blue light by red light, reduced intracellular concentrations of CO2, and low vapor pressure differences. Plant Physiol. 87: 226-237

Avenson TJ, Ahn TK, Zigmantas D, Niyogi KK, Li Z, Ballotarri M, Bassi R, Fleming GR (2008) Zeaxanthin radical cation formation in minor light harvesting complexes of higher plant antenna. J Biol Chem 283: 3550-3558

Avenson TJ, Ahn TK, Niyogi KK, Ballottari M, Bassi R, Fleming GR (2009) Lutein can act as a switchable charge-transfer quencher in the CP26 light-harvesting complex. J Biol Chem 284: 2830-2835

Bajkán Sz, Váradi Gy, Balogh M, Domonkos Á, Kiss GyB, Kovács L, Lehoczki E (2010) Conserved structure of the chloroplast-DNA encoded D1 protein is essential for effective photoprotection via non-photochemical thermal dissipation in higher plants. Mol Genet Genomics 284: 55-63

104

Bajkán Sz, Várkonyi Zs, Lehoczki E (2011) Comparative study on energy partitioning in photosystem II of two Arabidopsis thaliana mutants with reduced non-photochemical quenching capacity. Acta Physiol Plant (közlésre elfogadva)

Barber J, Andersson B (1992) Too much of a good thing: light can be bad for photosynthesis. Trends Biochem Sci 17: 61-66

Benhassaine-Kesri G, Aid F, Demandre C, Kader JC, Mazliak P (2002) Drought stress affects chloroplast lipid metabolism in rape (Brassica napus) leaves. Physiol Plant 115: 221-227

Bennett J (1977) Phosphorylation of chloroplast membrane proteins. Nature 269: 344-346 Bennett J (1979) Chloroplast phosphoproteins. The protein kinase of thylakoid membranes is light-

dependent. FEBS Lett 103: 342-344 Bergantino E, Segalla A, Brunetta A, Teardo E, Rigoni F, Giacometti GM, Szabo I (2003) Light- and pH-

dependent structural changes in the PsbS subunit of photosystem II. Proc Natl Acad Sci USA 100: 15265-15270

Bernacchia G, Furini A (2004) Biochemical and molecular responses to water stress in resurrection plants. Physiol Plant 121: 175-181

Betterle N, Ballottari M, Zorzan S, de Bianchi S, Cazzaniga S, Dall’Osto L, Morosinotto T, Bassi R (2009) Light induced dissociation of an antenna hetero-oligomer is needed for non-photochemical quenching induction. J Biol Chem 284: 15255-15266

Beversdorf WD, Hume DJ, Donnelly-Vanderloo MJ (1988) Agronomic performance of triazine-resistant and susceptible reciprocal spring canola hybrids. Crop Sci 28: 932-934

Bilger W, Björkman O (1990) Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in Hedera canariensis. Photosynth Res 25: 173-185

Bilger W, Björkman O (1994) Relationships among violaxanthin deepoxidation, thylakoid membrane conformation, and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching in leaves of cotton (Gossypium hirsutum L.). Planta 193: 238-246

Bilger W, Schreiber U, Bock M (1995) Determination of the quantum efficiency of PS II and of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in the field. Oecologia 102: 425-432

Björkman O, Demmig B (1987) Photon yield of O2 evolution and chlorophyll fluorescence characteristics at 77K among vascular plants of diverse origins. Planta 170: 489-504

Björkman O, Powles SB (1987) Leaf movement in the shade species Oxalis oregana L I. Response to light level and light quality. Carneg Inst Wash Yearb 80: 59-62

Bohnert HJ, Shen B (1999) Transformation and compatible solutes. Sci Hortic 78: 237-260 Bonaventura C, Mayers J (1969) Fluorescence and oxygen evolution from Chlorella pyrenoidosa. Biochim

Biophys Acta 189: 366-383 Bonente G, Howes BD, Caffarri S, Smulevich G, Bassi R (2008) Interactions between the photosystem II

subunit PsbS and xanthophylls studied in vivo and in vitro. J Biol Chem 283: 8434-8445 Bota J, Medrano H, Flexas J (2004) Is photosynthesis limited by decreased Rubisco activity and RuBP

content under progressive water stress? New Physiologist 162: 671-681 Bowes JM, Crofts AR, Arntzen CJ (1980) Redox reactions on the reducing side of photosystem II in

chloroplasts with altered herbicide biding properties. Arch Biochem Biophys 200: 303-308 Briantais JM, Vernotte C, Picaud M, Krause GH (1979) A quantitative study of the slow decline of

chlorophyll a fluorescence in isolated chloroplasts. Biochim Biophys Acta 548: 128-138 Briantais JM, Ducruet JM, Hodges M, Krause GH (1992) The effects of low temperature acclimation and

photoinhibitory treatments on photosystem-2 studied by thermoluminescence and fluorescence decay kinetics. Photosynth Res 31: 1-10

Briantais JM (1994) Light-harvesting chlorophyll a-b complex requirement for regulation of photosystem II photochemistry by non-photochemical quenching. Photosynth Res 40: 287-294

Brugnoli E, Björkman O (1992) Growth of cotton under continuous salinity stress-influence on allocation pattern, stomatal and nonstomatal components of photosynthesis and dissipation of excess light energy. Planta 187: 335-47

Bugos RC, Yamamoto HY (1996) Molecular cloning of violaxanthin de-epoxidase from romaine lettuce and expression in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 93: 6320-6325

105

Bunce JA (1981) Relationships between maximum photosynthetic rates and photosynthetic tolerance of low leaf water potentials. Can J Bot 59: 769-774

Burke JJ, Wilson RF, Swafford JR (1982) Characterization of chloroplasts isolated from triazine-susceptible and triazine-resistant biotypes of Brassica campestris L. Plant Physiol 70: 24-29

Caffarri S, Croce R, Breton J, Bassi R (2001) The major antenna complex of photosystem II has a xanthophyll binding site not involved in light harvesting. J Biol Chem 38: 35924-35933

Caldwell CR, Whitman CE (1987) Temperature-induced protein conformational changes in barley root plasma membrane-enriched microsomes. I. Effect of temperature on membrane protein and lipid mobility. Plant Physiol 84: 918-923

Cailly AL, Rizza F, Genty B, Harbinson J (1996) Fate of excitation at PS II in leaves. The non-photochemical side. Plant Physiol Biochemistry Special issue, pp 86

Castrillo M, Fernández D, Calcagno AM, Trujillo I, Guenni L (2001) Responses of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, protein content, and stomatal conductance to water deficit in maize, tomato, and bean. Photosynthetica 39: 221-226

Chaves MM (1991) Effects of water deficits on carbon assimilation. J Exp Bot 42: 1-16 Chaves MM, Maroco JP, Pereira JS (2003) Understanding plant responses to drought – from genes to the

whole plant. Funct Plant Biol 30: 239-264 Chaves MM, Oliveira MM (2004) Mechanisms underlying plant resilience to water deficits: prospects for

water-saving agriculture. J Exp Bot 55: 2365-2384 Chow WS, Anderson JM Hope AB (1988) Variable stoichiometries of photosystem-II to photosystem-I

reaction centers. Photosynth Res 17: 277-281 Chow WS (1994) Photoprotection and photoinhibitory damage. In: Bittar EE, Barber J eds. Advanves in

Molecular and Cell Biology, Vol 10. JAI Press, London, pp 151-196 Cornic G, Gouallec JL, Briantais JM, Hodges M (1989) Effect of dehydration and high light on

photosynthesis of two C3 plants (Phaseolus vulgaris L. and Elatostema repens (Lour.) Hall f.). Planta 177: 84-90

Cornic G, Briantais JM (1991) Partitioning of photosynthetic electron flow between CO2 and O2 reduction in a C3 leaf (Phaseolus vulgaris L.) at different CO2 concentrations and during drought stress. Planta 183: 178-184

Cornic G, Fresneau S (2002) Photosynthetic carbon reduction and carbon oxidation cycles are the main electron sinks for photosystem II activity during a mild drought. Ann Bot 89: 887-894

Crouchman S, Ruban AV, Horton P (2006) PsbS enhances nonphotochemical fluorescence quenching in the absence of zeaxanthin. FEBS Lett 580: 2053-2058

Curwiel VB, van Rensen JJS (1993) Influence of photoinhibition on electron transport and photophosphorylation of isolated chloroplasts. Physiol Plant 89: 97-102

da Silva JM, Arrabaça MC (2004) Contributions of soluble carbohydrates to the osmotic adjustment in the C4 grass Setaria sphacelata: a comparison between rapidly and slowly imposed water stress. J Plant Physiol 161: 551-555

Darkó É, Váradi Gy, Hargitai A, Nagy E, Lehoczki E (1995) Comparison of photosensitivity of the photosynthetic apparatus in different light adapted atrazine-resistant and susceptible biotypes from Conyza canadensis (L.) Cronq. In: Mathis P ed. Photosynthesis from light to Biosphere, Vol IV. Kluwer Academic Publ, Dordrecht/Boston/London, pp 191-194

Darkó É, Váradi Gy, Lehoczki E (1996) Atrazine-resistant biotypes of Conyza canadensis have altered fluorescence quenching and xanthophyll cycle pattern. Plant Physiol Biochem 34: 843-852

Darkó É, Váradi Gy, Lemoine Y, Lehoczki E (2000) Defensive strategies against high-light stress in wild and D1 protein mutant biotypes of Erigeron canadensis. Aust J Plant Physiol 27: 325-333

Darmency H, Pernes J (1989) Agronomic performance of a triazine-resistant foxtail millet (Setaria italica (L.) Beauv.). Weed Res 29: 147-150

Davies WJ, Zhang J (1991) Root sygnals and the regulation of growth and development of plant in drying soil. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42: 55-76

de Bianchi S, Dall’Osto L, Tognon G, Morosinotto T, Bassi R (2008) Minor antenna proteins CP24 and CP26 affect the interactions between photosystem II subunits and the electron transport rate in grana membranes of Arabidopsis. Plant Cell 20: 1012-1028

106

Demmig B, Winter K, Krüger A, Czygan FC (1987) Photoinhibition and zeaxanthin formation in intact leaves: a possible role of the xanthophyll cycle in the dissipation of excess light energy. Plant Physiol 84: 218-224

Demmig-Adams B (1990) Carotenoids and photoprotection in plants: a role for the xanthophyll zeaxanthin. Biochim Biophys Acta 1020: 1-24

Demmig-Adams B, Adams WWIII (1992) Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43: 599-626

Demmig-Adams B, Adams WWIII (1996) The role of xanthophyll cycle carotenoids in the protection of photosynthesis. Trends Plant Sci 1: 21-26

Demmig-Adams B, Adams WW, Barker DH, Logan BA, Bowling DR, Verhoeven AS (1996) Using chlorophyll fluorescence to assess the fraction of absorbed light allocated to thermal dissipation of excess excitation. Physiol Plant 98: 253-264

Dominici P, Caffarri S, Armenante F, Ceoldo S, Crimi M, Bassi R (2002) Biochemical properties of the PsbS subunit of photosystem II either purified from chloroplast or recombinant. J Biol Chem 277: 22750-22758

Dreuw A, Wormit M (2008) Simple replacement of violaxanthin by zeaxanthin in LHCII does not cause chlorophyll fluorescence quenching. J Inorg Biochem 102: 458-465

Ducruet J, Lemoine Y (1985) Increased heat sensitivity of the photosynthetic apparatus in triazine-resistant biotypes from different plant species. Plant Cell Physiol 26: 419-429

Ducruet JM, Roman M, Ortega JM, Janda T (2005) Role of the oxidized secondary acceptor QB of photosystem II in the delayed ‘afterglow’ chlorophyll luminescence. Photosynth Res 84: 161-166

El-Lithy ME, Rodrigues GC, van Rensen JJS, Snel JF, Dassen HJ, Koornneef M, Jansen MA, Aarts MG, Vreugdenhil D (2005) Altered photosynthetic performance of a natural Arabidopsis accession is associated with atrazine resistance. J Exp Bot 56: 1625-1634

Farquhar GD, Sharkey TD (1982) Stomatal conductance and photosynthesis. Annu Rev Plant Physiol 33: 317-345

Farquhar GD, von Caemmerer S, Berry JA (1990) A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta 149: 78-90

Färber A, Young AJ, Ruban AV, Horton P, Jahns P (1997) Dynamics of xanthophyll-cycle activity in different antenna subcomplexes in the photosynthetic membranes of higher plants. Plant Physiol 115: 1609-1618

Fedtke C (1979) Physiological responses of soybean (Glycine max) plants to metribuzin. Weed Sci 27: 192-195

Feild TS, Lee DW, Holbrook NM (2001) Why leaves turn red in autumn: the role of anthocyanins in senescing leaves of red-osier dogwood. Plant Physiol 127: 566-574

Finazzi G, Johnson GN, Dall’Osto L, Joliot P, Wollman FA, Bassi R (2004) A zeaxanthin-independent nonphotochemical quenching mechanism localized in the photosystem II core complex. Proc Natl Acad Sci USA 101: 12375-12380

Flexas J, Medrano H (2002) Drought inhibition of photosynthesis in C3 plants: stomatal and non-stomatal limitations revisited. Ann Bot 89: 183-189

Flexas J, Bota J, Loreto F, Cornic G, Sharkey TD (2004) Diffusive and metabolic limitations to photosynthesis under drought and salinity in C3 plants. Plant Biology 6: 269-279

Flexas J, Ribas-Carbó M, Bota J, Galmés J, Henkle M, Martínez-Cañellas S, Medrano H (2006) Decreased Rubisco activity during water stress is not induced by decreased relative water content but related to conditions of low stomatal conductance and chloroplast CO2 concentration. New Phytologist 172: 73-82

Flexas J, Diaz-Espejo A, Galmés J, Kaldenhoff R, Medrano H, Ribas-Carbo M (2007) Rapid variations of mesophyll conductance in response to changes in CO2 concentration around leaves. Plant Cell Environ 30: 1284-1298

Flexas J, Ribas-Carbó M, Diaz-Espejo A, Galmés J, Medrano H (2008) Mesophyll conductance to CO2: current knowledge and future prospects. Plant Cell Eviron 31: 602-612

Foyer CH, Descourvières P, Kunert KJ (1994) Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants. Plant Cell Environ 17: 507-523

107

Frank HA, Bautista JA, Josue JS, Young AJ (2000) Mechanism of nonphotochemical quenching in green plants: energies of the lowest excited singlet states of violaxanthin and zeaxanthin. Biochemistry 39: 2831-2837

Fuerst EP, Norman MA (1991) Interaction of herbicides with photosynthetic electron transport. Weed Sci 39: 458-464

Funk C, Schröder WP, Napiwotzki A, Tjus SE, Renger G, Andersson B (1995) The PSII-S protein of higher plants: a new type of pigmentbinding protein. Biochemistry 34: 11133-11141

Gal A, Shahak Y, Schuster G, Ohad I (1987) Specific loss of LHCII phosphorylation in the Lemna mutant-1073 lacking the cytochrome-b6/f complex. FEBS Lett 221: 205-210

Ganeteg U, Strand A, Gustafsson P, Jansson S (2001) The properties of the chlorophyll a/b binding proteins Lhca2 and Lhca3 studied in vivo using antisense inhibition. Plant Physiol 12: 150-158

Gawronski SW, Sugita M, Sugiura M (1992) Mutation of psbA gene in herbicide- resistant population of Erigeron canadensis. In: Murata N ed. Research in Photosynthesis,Vol III. Kluwer Academic Publi, Dordrecht, pp 405-407

Genty B, Briantais JM, Baker NR (1989) The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron-transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta 990: 87-92

Genty B, Goulas Y, Dimon B, Peltier G, Briantais JM, Moya I (1992) Modulation of efficiency of primary conversion in leaves. Photosynth Res 34: 106

Genty B, Harbinson J (1996) Regulation of light utilization for photosynthetic electron transport. In: Baker NR ed. Photosynthesis and the environment. Kluwer Academic Publ, Amsterdam, pp 67-99

Genty B, Meyer S, Piel C, Badeck F, Liozon R (1998) CO2 diffusion inside leaf mesophyll of ligneous plants. In: Garab G ed. Photosynthesis: mechanisms and effects. Kluwer Academic Publ, Dordrecht, pp 3961-3967

Girardi MT, Cona B, Geiken B, Kucera T, Masojidek J, Matoo A K (1996) Longterm drought stress induces structural and functional reorganization of photosystem II. Planta 199: 118-125

Gilmore AM, Yamamoto HY (1992) Dark induction of zeaxanthin dependent nonphotochemical fluorescence quenching mediated by ATP. Proc Natl Acad Sci USA 89: 1899-1903

Golding AJ, Johnson GN (2003) Down-regulation of linear and activation of cyclic electron transport during drought. Planta 218: 107-114

Gollan T, Passioura JB, Munns R (1986) Soil water status affects the stomatal conductance of fully turgid wheat and sunflower leaves. Aust J Plant Physiol 13: 459-464

Gonzales J, Pastenes C, Horton P (2001) Effect of temperature, water and light stresses on PS2 heterogeneity in four bean varieties (Phaseolus vulgaris, L.). Revista Chilena Historia Natural 74: 779-791

Goss R, Opitz C, Lepetit B, Wilhelm C (2008) The synthesis of NPQ-effective zeaxanthin depends on the presence of a transmembrane proton gradient and slightly basic stromal side of the thylakoid membrane. Planta 228: 999-1009

Graber P (1987) Primary charge separation and energy transduction in photosynthesis. In: Molazzo G, Blanks M eds. Bioelectrochemistry. Plenum, New York, pp 379-429

Gressel J (1985) Herbicide tolerance and resistance; alteration of site of activity. In: Duke SO ed. Weed Physiology, Vol II. CRC Press, Boca Raton, Florida, pp 159-189

Gressel J, Ben-Sinai G (1985) Low intraspecific competeitive fitness in a triazine-resistant, nearly nuclear-isogenic line of Brassica napus. Plant Sci 38: 29-32

Gronwald JW (1994) Resistance to photosystem II inhibiting herbicides. In: Powles SB, Holtum JAM eds. Herbicide Resistance in Plants: Biology and Biochemistry. Lewis Publ, Boca Raton, pp 299-316

Haehnel W (1984). Photosynthetic electron transport in higher plants. Annu Rev Plant Physiol 35: 659-693 Hart JJ, Stemler A (1990) High light-induced reduction and low light-enhanced recovery of photon yield in

triazine-resistant Brassica napus. Plant Physiol 94: 1301-1307 Härtel H, Lokstein H (1995) Relationship between quenching of maximum and dark-level chlorophyll

fluorescence in vivo: dependence on photosystem II antenna size. Biochim Biophys Acta 1228: 91-94 Härtel H, Lokstein H, Grimm B, Rank B (1996) Kinetic studies on the xanthophyll cycle in barley leaves.

Plant Physiol 110: 471-482

108

Haupt-Herting S, Fock HP (2002) Oxygen exchange in relation to carbon assimilation in water stressed leaves during photosynthesis. Ann Bot 89: 851-854

Havaux M (1989) Comparison of atrazine-resistant and -susceptible biotypes of Senecio vulgaris L: Effect of high and low temperatures on the in vivo photosynthetic electron transfer in intact leaves. J Exp Bot 40: 849-854

Havaux M, Dall’Osto L, Cuine S, Giuliano G, Bassi R (2004) The effect of zeaxanthin as the only xanthophyll on the structure and function of the photosynthetic apparatus in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 279: 13878-13888

He JX, Wang J, Liang HG (1995) Effects of water-stress on photochemical function and protein-metabolism of photosystem-II in wheat leaves. Physiol Plant 93: 771-777

Heber U, Walker D (1992) Concerning a dual function of coupled cyclic electron transport in leaves. Plant Physiol 100: 1621-1626

Hendrickson L, Furbank RT, Chow WS (2004) A simple alternative approach to assessing the fate of absorbed light energy using chlorophyll fluorescence. Photosynth Res 82: 73-81

Hirschberg J, Bleecker A, Kyle DJ, McIntosh L, Arntzen CJ (1984) The molecular basis of triazine-herbicide resistance in higher-plant chloroplasts. Z Naturforsch 39c: 412-420

Hirschberg J, McIntosh L (1983) The molecular basis of herbicide resistance in Amaranthus hybridus. Science 222: 1346-1349

Holt JS, Stemler AJ, Radosevic SR (1981) Differential light responses of photosynthesis by triazine-resistant and triazine-susceptible Senecio vulgaris biotypes. Plant Physiol 67: 744-748

Holt JS, Goffner DP (1985) Leaf structure and function in triazine-resistant common groundsel (Senecio vulgaris). Plant Physiol 79: 699-705

Holt NE, Zigmantas D, Valkunas L, Li XP, Niyogi KK, Fleming GR (2005) Carotenoid cation formation and the regulation of photosynthetic light harvesting. Science 307: 433-436

Horton P (1981) The effect of redox potential on the kinetics of fluorescence induction in peachloroplasts 2. sigmoidicity. Biochim Biophys Acta 637: 152-158

Horton P, Hague A (1988) Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of nonphotochemical quenching. Biochim Biophys Acta 932: 107-115

Horton P, Ruban AV, Rees D, Pascal AA, Noctor G, Young AJ (1991) Control of the light-harvesting function of chloroplast membranes by aggregation of the LHCII chlorophyll-protein complex. FEBS Lett 292: 1-4

Horton P, Ruban AV (1993) Delta-pH-dependent quenching of the Fo-level of chlorophyll fluorescence in spinach leaves. Biochim Biophys Acta 1142: 203-206

Horton P, Ruban AV, Walters RG (1994) Regulation of light harvesting in green plants: indication by nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence. Plant Physiol 106: 415-420

Horton P, Ruban AV, Walters RG (1996) Regulation of light harvesting in green plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47: 665-684

Horton P, Ruban AV, Wentworth M (2000) Allosteric regulation of the light harvesting system of photosystem II. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355: 1361-1370

Horton P, Wentworth M, Ruban A (2005) Control of the light harvesting function of chloroplast membranes: The LHCII-aggregation model for non-photochemical quenching. FEBS Lett 579: 4201-4206

Horton P, Johnson MP, Pérez-Bueno M, Kiss AZ, Ruban AV (2008) Does the structure and macro-organization of photosystem II in higher plant grana membranes regulate light harvesting states? FEBS J 275: 1069-1079

Hurry V, Anderson JM, Badger MR, Price GD (1996) Reduced levels of cytochrome b6/f in transgenic tobacco increases the excitation pressure on photosystem II without increasing the sensitivity to photoinhibition in vivo. Photosynth Res 50: 159-69

Ilioaia C, Johnson M, Horton P, Ruban AV (2008) Induction of efficient energy dissipation in the isolated light harvesting complex of photosystem II in the absence of protein aggregation. J Biol Chem 283: 29505-29512

Ireland CR, Telfer A, Covello PS, Baker NR, Barber J (1988) Studies on the limitations to photosynthesis in leaves of the herbicide-resistant mutant of Senecio vulgaris L. Planta 173: 459-467

109

Ivanov AG, Sane PV, Hurry V, Öquist G, Huner NPA (2008) Photosystem II reaction centre quenching: mechanisms and physiological role. Photosynth Res 98: 565-574

Jansson S (1999) A guide to the Lhc genes and their relatives in Arabidopsis. Trends Plant Sci 4: 236-240 Johnson MP, Pérez-Bueno ML, Zia A, Horton P, Ruban AV (2009) The zeaxanthin-independent and

zeaxanthin-dependent qE components of nonphotochemical quenching involve common conformational changes within the photosystem II antenna in Arabidopsis. Plant Physiol 149: 1061-1075

Johnson MP, Ruban AV (2010) Arabidopsis plants lacking PsbS protein possess photoprotective energy dissipation. Plant J 61: 283-289

Jung HS, Niyogi KK (2009) Quantitative genetic analysis of thermal dissipation in Arabidopsis. Plant Physiol 150: 997-986

Kalituho L, Grasses T, Graf M, Rech J, Jahns P (2006) Characterization of a nonphotochemical quenching-deficient Arabidopsis mutant possessing an intact PsbS protein, xanthophyll cycle and lumen acidification. Planta 223: 532-541

Kato MC, Hikosaka K, Hirotsu N, Makino A, Hirose T (2003) The excess light energy that is neither utilized in photosynthesis nor dissipated by photoprotective mechanisms determines the rate of photoinactivation in photosystem II. Plant Cell Physiol 44: 318-325

Kiss A, Ruban AV, Horton P (2008) The PsbS protein controls the organization of the photosystem II antenna in higher plant thylakoid membranes. J Biol Chem 283: 3972-3978

Kloppstech K (1997) Light regulation of photosynthetic genes. Physiol Plant 100: 739-747 Klughammer C, Schreiber U (2008) Complementary PS II quantum yields calculated from simple

fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the saturation pulse method. PAM Application Notes 1: 27-35

Kohno H, Ohki A, Ohki S, Koizumi K, Van den Noort ME, Rodrigues GC, van Rensen JJ, Wakabayashi K (2000) Low resistance against novel benzylamino-1,3,5-triazine herbicides in atrazine-resistant Chenopodium album plants. Photosynth Res 65: 115-120

Kovács L, Damkjær J, Kereïche S, Ilioaia C, Ruban AV, Boekema EJ, Jansson S, Horton P (2006) Lack of the light-harvesting complex CP24 affects the structure and function of the grana membranes of higher plant chloroplasts. Plant Cell 18: 3106-3120

Krause GH (1988) Photoinhibiton of photosynthesis: an evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiol Plant 74: 566-574

Krivosheeva A, Tao DL, Ottander C, Wingsle G, Dube SL, Öquist G (1996) Cold acclimation and photoinhibition of photosynthesis in Scots pine. Planta 200: 296-305

Kuiper PJC (1980) Lipid metabolism as a factor in environmental adaptation. In: Mazliak P, Benveniste P, Costes C, Douce R eds. Biogenesis and function of plant lipids. Elsevier, Amsterdam, pp 169-176

Külheim C, Ågren J, Jansson S (2002) Rapid regulation of light harvesting and plant fitness in the field. Science 297: 91-93

Kyle DJ (1987) The biochemical basis for photoinhibition of photosystem II. In: Kyle DJ, Osmond CB, Arntzen CJ eds. Photoinhibition. Elsevier, Amsterdam, pp 197-226

Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685

Lambrev PH, Nilkens M, Miloslavina Y, Jahns P, Holzwarth AR (2010) Kinetic and spectral resolution of multiple nonphotochemical quenching components in Arabidopsis leaves. Plant Physiol 152: 1611-1624

Lawlor DW (2002) Limitations to Photosynthesis in water-stressed leaves: stomatal vs. metabolism and the role of ATP. Ann Bot 89: 871-885

Lawlor DW, Cornic G (2002) Photosynthetic carbon assimilation and associated metabolism in relation to water deficits in higher plants. Plant Cell Environ 25: 275-294

Lehoczki E, Pölös E, Laskay G, Farkas T (1985) Chemical compositions and physical states of chloroplast lipids related to atrazine resistance in Conyza canadensis. Plant Sci 42: 19-24

Lemoine Y, Dubacq JP, Zabulon G, Ducruet JM (1986) Organization of the photosynthetic apparatus from triazine-resistant and -susceptible biotypes of several plant species. Can J Bot 64: 2999-3007

Li XP, Björkman O, Shih C, Grossman AR, Rosenquist M, Jansson S, Niyogi KK (2000) A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature 403: 391-395

110

Li XP, Phippard A, Pasari J, Niyogi KK (2002a) Structure-function analysis of photosystem II subunit S (PsbS) in vivo. Funct Plant Biol 29: 1131-1139

Li XP, Muller-Moule P, Gilmore AM, Niyogi KK (2002b) PsbS-dependent enhancement of feedback de-excitation protects photosystem II from photoinhibition. Proc Natl Acad Sci USA 99: 15222-15227

Li XP, Gilmore AM, Caffarri S, Bassi R, Golan T, Kramer D, Niyogi KK (2004) Regulation of photosynthetic light harvesting involves intrathylakoid lumen pH sensing by the PsbS protein. J Biol Chem 279: 22866-22874

Li Z, Ahn TK, Avenson TJ, Ballotari M, Cruz JA, Kramer DM, Bassi R, Fleming GR, Keasling JD, Niyogi KK (2009) Lutein accumulation in the absence of zeaxanthin restores nonphotochemical quenching in the Arabidopsis thaliana npq1 mutant. Plant Cell 21: 1798-1812

Lichtenthaler HK (1987) Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic Biomembranes. In: Packer L, Douce R eds. Methods in Enzymology. Academic Press, New York, 148: 350-382

Liu ZF, Yan HC, Wang KB, Kuang TY, Zhang JP, Gui LL, An XM, Chang WR (2004) Crystal structure of spinach major-light harvesting complex at 2.72Å resolution. Nature 428: 287-292

Lokstein H, Tian L, Polle JEW, DellaPenna D (2002) Xanthophyll biosynthetic mutants of Arabidopsis thaliana: altered nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence is due to changes in photosystem II antenna size and stability. Biochim Biophys Acta 1553: 309-319

Long SP, Humphries S, Falkowski PG (1994) Photoinhibition of photosynthesis in nature. Plant Physiol Plant Mol Biol 45: 633-662

Matsubara S, Gilmore AM, Osmond CB (2001) Diurnal and acclimatory responses of violaxanthin and lutein epoxide in the Australian mistletoe Amyema miquelii. Aust J Plant Physiol 28: 793-800

McCloskey WB, Holt JS (1990) Triazine resistance in Senecio vulgaris parental and nearly isonuclear backcrossed biotypes is correlated with reduced productivity. Plant Physiol 92: 954-962

Melis A (1985) Functional properties of PS IIβ in spinach chloroplasts. Biochim Biophys Acta 808: 334-342

Melis A (1991) Dynamics of photosynthetic membrane-composition and function. Biochim Biophys Acta 1058: 187-106

Meyer S, Genty B (1998) Mapping intercellular CO2 mole fraction (Ci) in Rosa rubiginosa leaves fed with abscisic acid by using chlorophyll fluorescence imaging: significance of Ci estimated from leaf gas exchange. Plant Physiol 116: 947-957

Miloslavina Y, Wehner A, Wientjes E, Reus M, Lambrev P, Garab G, Croce R, Holzwarth AR (2008) Far-red fluorescence: a direct spectroscopic marker for LHCII oligomers forming in non photochemical quenching. FEBS Lett 582: 3625-3631

Miyake C, Shinzaki Y, Miyata M, Tomizawa K (2004) Enhancement of cyclic electron flow around PSI at high light and its contribution to the induction of non-photochemical quenching of chl fluorescence in intact leaves of tobacco plants. 45 :1426-1433

Mozzo M, Passarini F, Bassi R, van Amerongen H, Croce R (2008) Photoprotection in higher plants: the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochim Biophys Acta 1777: 1263-1267

Mullet JE (1983) The amino-acid-sequence of the polypeptide segment which regulates membrane adhesion (grana stacking) in chloroplasts. J Biol Chem 258: 9941-9948

Mullineaux CW, Ruban AV, Horton P (1994) Prompt heat release associated with delta-pH dependent quenching in spinach thylakoid membranes. Biochim Biophys Acta 1185: 119-123

Munekage Y, Hashimoto M, Miyake C, Tomizawa K, Endo T, Tasaka M, Shikanai T (2004) Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis. 429: 579-582

Murata N, Takahashi S, Nishiyama Y, Allakhverdiev SI (2007) Photoinhibition of photosystem II under environmental stress. Biochim Biophys Acta 1767: 414-421

Niyogi KK, Björkman O, Grossman AR (1997) Chlamydomonas xanthophyll cycle mutants identified by video imaging of chlorophyll fluorescence quenching. Plant Cell 9: 1369-1380

Niyogi KK, Grossman AR, Björkman O (1998) Arabidopsis mutants define a central role for the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion. Plant Cell 10: 1121-1134

Niyogi KK (1999) Photoprotection revisited: Genetic and molecular approaches. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 333-359

111

Niyogi KK (2000) Safety valves for photosynthesis. Curr Opin Plant Biol 3: 455-460 Niyogi KK, Shih C, Chow SW, Pogson BJ, DellaPenna D, Börkman O (2001) Photoprotection in a

zeaxanthin- and lutein-deficient double mutant of Arabidopsis. Photosynth Res 67: 139-145 Niyogi KK, Li XP, Rosenberg V, Jung HS (2005) Is PsbS the site of nonphotochemical quenching in

photosynthesis? J Exp Bot 56: 375-382 Noctor G, Ruban AV, Horton P (1993) Modulation of delta-pH-dependent nonphotochemical quenching of

chlorophyll fluorescence in spinach-chloroplasts. Biochim Biophys Acta 1183: 339-344 Noctor G, Veljovic-Jovanovic S, Driscoll S, Novitskaya L, Foyer CH (2002) Drought and oxidative load in

the leaves of C-3 plants: a predominant role for photorespiration? Ann Bot 89: 841-850 Ort DR, Ahrens WH, Martin B, Stoller EW (1983) Comparison of photosynthetic performance in triazine-

resistant and susceptible biotypes of Amaranthus hybridus. Plant Physiol 72: 925-930 Ort DR (2001) When there is too much light. Plant Physiol 125: 29-32 Osmond CB, Grace SC (1995) Perspectives on photoinhibition and photorespiration in the field:

quintessential inefficiencies of the light and dark reactions of photosynthesis? J Exp Bot 46: 1351-1362 Oxborough K, Horton P (1988) A study of the regulation and function of energy-dependent quenching in

pea-chloroplasts. Biochim Biophys Acta 934: 135-143 Ögren E, Öquist G (1985) Effects of drought on photosynthesis, chlorophyll fluorescence and

photoinhibition susceptibility in intact willow leaves. Planta 166: 380-388 Ögren E, Sjöström M (1990) Estimation of the effect of photoinhibition on the carbon gain in leaves of a

willow canopy. Planta 181: 560-567 Ögren E, Rosenqvist E (1992) On the significance of photoinhibition of photosynthesis in the field and its

generality among species. Photosynth Res 33: 63-71 Parry MAJ, Andralojc PJ, Khan S, Lea PJ, Keys AJ (2002) Rubisco activity: effects of drought stress. Ann

Bot 89: 833-839 Peterson RB, Havir EA (2000) A nonphotochemical-quenching-deficient mutant of Arabidopsis thaliana

possessing normal pigment composition and xanthophyll-cycle activity. Planta 210: 205-214 Pfister K, Arntzen CJ (1979) The mode of action of photosystem II-specific inhibitors in herbicide-resistant

weed biotypes. Z Naturforsch 34c: 996-1009 Pfündel E, Renganathan M, Gilmore AM, Yamamoto HY, Dilley RA (1994) Intrathylakoid pH in isolated

pea chloroplasts as probed by violaxanthin de-epoxidation. Plant Physiol 106: 1647-1658 Polle A (1997) Defense against photooxidative damage in plants. In: Scandalios JG ed. Oxidative Stress and

the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY, pp 623-666

Pogson BJ, Niyogi KK, Björkman O, DellaPenna D (1998) Altered xanthophyll compositions adversely affect chlorophyll accumulation and non-photochemical quenching in Arabidopsis mutants. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13324-13329

Pogson BJ, Rissler HM (2000) Genetic manipulation of carotenoid biosynthesis and photoprotection. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355: 1395-1403

Powles SB, Björkman O (1982) Photoinhibition of photosynthesis: effect on chlorophyll fluorescence at 77K in intact leaves and in chloroplast membranes of Nerium oleander. Planta 156: 97-107

Quick WP, Stitt M (1989) An examination of factors contributing to nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochim Biophys Acta 977: 287-296

Renou JL, Gerbaud A, Just D, André M (1990) Differing substomatal and chloroplastic CO2 concentrations in water-stressed wheat. Planta 183: 415-419

Riera M, Valon C, Fenzi F, Giraduat J, Leung J (2005) The genetics of adaptive responses to drought stress: abscisic acid-dependent and abscisic acid-independent signalling comonents. Physiol Plant 123: 111-119

Ruban AV, Rees D, Noctor GD, Young A, Horton P (1991) Long-wavelength chlorophyll species are associated with amplification of high-energy-state excitation quenching in higher-plants. Biochim Biophys Acta 1059: 355-360

Ruban AV, Horton P, Young AJ (1993a) Aggregation of high plant xanthophylls: differences in absorption spectra and in the dependency on solvent polarity. J Photochem Photobiol B Biol 21: 229-234

112

Ruban AV, Young AJ, Horton P (1993b) Induction of non-photochemical quenching and absorbance changes in leaves. Plant Physiol 102: 741-750

Ruban AV, Young AJ, Horton P (1994) Modulation of chlorophyll fluorescence quenching in isolated light-harvesting complex of photosystem-II. Biochim Biophys Acta 1186: 123-127

Ruban AV, Horton P (1995) Regulation of nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence in plants. Aust J Plant Physiol 22: 221-230

Ruban AV, Young AJ, Horton P (1996) Dynamic properties of the minor chlorophyll a/b binding proteins of higher plants: an in vitro model for photoprotective nonphotochemical energy dissipation. Biochemistry 35: 674-678

Ruban AV, Horton P (1999) The xanthophyll cycle modulates the kinetics of non-photochemical energy dissipation in isolated light-harvesting complexes, intact chloroplasts and leaves of spinach. Plant Physiol 119: 531-542

Ruban AV, Lee PJ, Wentworth M, Young AJ, Horton P (1999) Determination of the stoichiometry and strength of binding of xanthophylls to the PSII light harvesting complexes. J Biol Chem 274: 10458-10465

Ruban AV, Pascal AA, Lee PJ, Robert B, Horton P (2002a) Molecular configuration of xanthophyll cycle carotenoids in photosystem II antenna complexes. J Biol Chem 277: 42937-42942

Ruban AV, Pascal AA, Robert B, Horton P (2002b) Activation of zeaxanthin is an obligatory event in the regulation of photosynthetic light harvesting. J Biol Chem 277: 7785-7789

Ruban AV, Wentworth M, Yakushevska AE, Andersson J, Lee PJ, Keegstra W, Dekkerk JP, Boekema EJ, Jansson S, Horton P (2003) Plants lacking the main light-harvesting complex retain photosystem II macro-organization. Nature 421: 648-653

Ruban AV, Berera R, Ilioaia C, van Stokkum IHM, Kennis JTM, Pascal AA, van Amerongen H, Robert B, Horton P, van Grondelle R (2007) Identification of a mechanism of photoprotective energy dissipation in higher plants. Nature 450: 575-578

Sahsah Y, Campos P, Gareil M, Zuily-Fodil A, Pham-Thi T (1998) Enzymatic degradation of polar lipids in Vigna unguiculata leaves and influence of drought stress. Physiol Plant 104: 577-586

Schansker G, van Rensen JJS (1999) Performance of active photosystem II centers in photoinhibited pea leaves. Photosynth Res 62: 175-184

Schansker G, Tóth SZ, Strasser RJ (2006) Dark recovery of the Chl a fluorescence transient (OJIP) after light adaptation: The qT-component of non-photochemical quenching is related to an activated photosystem I acceptor side. Biochim Biophys Acta 1757: 787-797

Schindler C, Lichtenthaler HK (1994) Is there a correlation between light-induced zeaxanthin accumulation and quenching of variable chlorophyll a fluorescence? Plant Physiol Biochem 32: 813-823

Schönfeld M, Yaacoby T, Michael O, Rubin B (1987) Triazine resistance without reduced vigor in Phalaris paradoxa. Plant Physiol 83: 329-333

Schreiber U (1986) Detection of rapid induction kinetics with a new type of high-frequency modulated chlorophyll fluorometer. Photosynth Res 9: 261-272

Schreiber U, Bilger W, Neubauer C (1994) Chlorophyll fluorescence as a non-intrusive indicator for rapid assessment of in vivo photosynthesis. In: Schulze ED, Caldwell MM eds. Ecophysiology of Photosynthesis. Springer-Verlag, Berlin, pp 49-70

Schulze ED (1986) Whole-plant responses to drought. Aust J Plant Physiol 13: 127-141 Somersalo S, Krause GH (1988) Changes in chlorophyll fluorescence related to photoinhibition of

photosynthesis and cold acclimation of green plants. In: Lichtenthaler HK ed. Applications of Chlorophyll Fluorescence. Kluwer Academic Publ, Dordrecht, pp 157-164

Souza Machado V, Bandeen JD, Stephenson GR, Lavigne P (1978) Uniparental inheritance of chloroplast atrazine tolerance in Brassica campestris. Can J Plant Sci 58: 977-981

Srivastava A, Strasser RJ, Govindjee (1995) Polyphasic rise of chlorophyll a fluorescence in herbicide-resistant D1 mutants of Chlamydomonas reinhardtii. Photosynth Res 43: 131-141

Stowe AE, Holt JS (1988) Comparison of triazine-resistant and -susceptible biotypes of Senecio vulgaris and their F1 hybrids. Plant Physiol 87: 183-189

113

Strasser RJ, Srivastava A, Tsimilli-Michael M (2000) The fluorescence transient as a tool to characterize and screen photosynthetic samples. In: Mohanty P, Yunus M, Pathre U eds. Probing Photosynthesis Mechanism, Regulation and Adaptation. Taylor and Francis, London, pp 445-480

Strasser RJ, Tsimilli-Michael M, Srivastava A (2004) Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient. In: Papageorgiou GC, Govindjee, eds. Chlorophyll fluorescence: a signature of photosynthesis. Advances in photosynthesis and respiration series, Vol 19. Kluwer Academic Publ, Rotterdam, pp 321-362

Sundblad LG, Schröder WP, Akerlung HE (1988) S-state distribution and redox state of QA in barley in relation to luminescence decay kinetics. Biochim Biophys Acta 973: 47-52

Sundby C, Chow WS, Anderson JM (1993a) Effects on photosystem II function, photoinhibition, and plant performance of the spontaneous mutation of Serine-264 in the photosystem II reaction center D1 protein in triazine-resistant Brassica napus L. Plant Physiol 103: 105-113

Sundby C, McCaffery S, Chow WS, Anderson JM (1993b) Photosystem II function, photoinhibition and turnover of the D1 protein at different irradiances in normal and atrazine-resistant plants with an altered QB-binding site In: Murata N ed. Research in photosynthesis, Vol IV. Kluwer Academic Publ, Dordrecht, pp 443-447

Suss KH, Yordanov I (1986) Biosynthetic cause of in vivo acquired thermotolerance of photosynthetic light reactions and metabolic responses of chloroplasts to heat stress. Plant Physiol 81: 192-199

Szigeti Z, Lehoczki E (2003) A review of physiological and biochemical aspects of resistance to atrazine and paraquat in Hungarian weeds. Pest Manag Sci 59: 451-458

Tambussi EA, Casadesus J, Munné-Bosch S, Araus JL (2002) Photoprotection in water-stressed plants of durum wheat (Triticum turgidum var. durum): Changes in chlorophyll fluorescence, spectral signature and photosynthetic pigments. Funct Plant Biol 29: 35-44

Teardo E, Polverino de Laureto P, Bergantino E, Dalla Vecchia F, Rigoni F, Szabó I, Giacometti GM (2007) Evidences for interaction of PsbS with photosynthetic complexes in maize thylakoids. Biochim Biophys Acta 1767: 703-711

Tenhunen JD, Lange OL, Gebel J, Beyschlag W, Weber JA (1984) Changes in photosynthetic capacity, carboxylation efficiency, and CO2 compensation point associated with midday stomatal closure and midday depression of net CO2 exchange of leaves of Quercus suber. Planta 162: 193-203

Tezara W, Mitchell VJ, Driscoll SD, Lawlor DW (1999) Water stress inhibits plant photosynthesis by decreasing coupling factor and ATP. Nature 401: 914-917

Tezara W, Mitchell VJ, Driscoll SD, Lawlor DW (2002) Effects of water deficit and its interactions with CO2 supply on the biochemistry and physiology of photosynthesis in sunflower. J Exp Bot 53: 1781-1791

Thiele A, Winter K, Krause GH (1997) Low inactivation of D1 protein of photosystem II in young canopy leaves of Anacardium excelsum under high-light. J Plant Physiol 151: 286-292

Thimmanaik S, Giridara Kumar S, Jyothsna Kumari G, Suryanarayana N, Sudhakar C (2002) Photosynthesis and the enzymes of photosynthetic carbon reduction cycle in mulberry during water stress and recovery. Photosynthetica 40: 233-236

Tian X, Darmency H (2006) Rapid bidirectional allele-specific PCR identification for triazine resistance in higher plants. Pest Manag Sci 62: 531-536

Tourneux C, Peltier G (1995) Effect of water deficit on photosynthetic oxygen exchange measured using 18O2 and mass spectrometry in Solanum tuberosum L. leaf discs. Planta 195: 570-577

Trebst A (1991) The molecular basis of resistance of photosystem II herbicides. In: Caseley JC, Cussans GW, Atkin RK eds. Herbicide Resistance in Weeds and Crops. Butterwort-Heinemann, Oxford, pp 145-164

Tsimilli-Michael M, Strasser RJ (2008) In vivo assessment of stress impact on plant’s vitality: applications in detecting and evaluating the beneficial role of mycorrhization on host plants. In: Varma A ed. Mycorrhiza: Genetics and Molecular Biology, Eco-function, Biotechnology, Eco-physiology, and Structure and Systematics. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, pp 679-703

van Kooten O, Snel JFH (1990) The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth Res 25: 147-150

114

van Oorschot JLP, Leeuwen PH (1989) Photosynthetic capacity of intact leaves of resistant and susceptible cultivars of Brassica napus L. to atrazine. Weed Res 29: 29-32

van Rensen JJS, Rodrigues GC, Vredenberg WJ (2001) Analysis of electron flow around photosystem II in atrazine-resistant plants applying the three-state trapping model on the fluorescence induction curve. In: Proceedings 12. International Congress on Photosynthesis, Brisbane, Australia, S14-007

Váradi Gy, Darkó É, Pölös E, Szigeti Z, Lehoczki E (1994) Xanthophyll cycle patterns and in vivo photoinhibition in herbicide-resistant biotypes of Conyza canadensis. J Plant Physiol 144: 669-674

Váradi Gy, Polyánka H, Darkó É, Lehoczki E (2003) Atrazine resistance entails a limited xanthophyll cycle activity, a lower PS II efficiency and an altered pattern of excess excitation dissipation. Physiol Plant 118: 47-56

Velthuys BR (1981) Electron dependent competition between plastoquinone and inhibitorsfor binding to photosystem II. FEBS Lett 126: 277-281

von Caemmerer S, Farquhar GD (1981) Some relationships between the biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta 153: 376-387

von Caemmerer S (2000) Techniques in Plant Sciences Vol 2: Biochemical Models of Leaf Photosynthesis. CSIRO Publishing, Collingwood

Walters RG, Horton P (1991) Resolution of components of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching in barley leaves. Photosynth Res 27: 121-133

Walters RG, Horton P (1993) Theroetical assesment of alternative mechanisms for non-photochemical chlorophyll quenching in barley leaves. Photosynth Res 36: 741-750

Walters RG, Ruban AV, Horton P (1994) Higher plant light-harvesting complexes LHCIIa and LHCIIc are bound by dicyclohexylcarbodiimide during inhibition of energy dissipation. Eur J Biochem 226: 1063-1069

Walters RG, Ruban AV, Horton P (1996) Identification of proton-active residues in a higher plant light-harvesting complex. Proc Natl Acad Sci USA 93: 14204-14209

Weiss E, Berry JA (1987) Quantum efficiency of pPhotosystem-II in relation to energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim Biophys Acta 894: 198-208

Vermaas WFJ, Arntzen CJ,. Gu LQ, Yu C-A (1983) Interactions of herbicides and azidoquinones at a photosystem II binding site in the thylakoid membrane. Biochim Biophys Acta 723: 266-275

Whitmarsh J, Samson G, Poulson M (1994) Photoprotection in photosystem II – the role of cytochrome b559. In: Baker NR, Bowyer JR eds. Photoinhibition of Photosynthesis: From Molecular Mechanisms to the Field. BIOS Sci Publ, Oxford, pp 75-93

Wraight CA, Crofts AR (1970) Energy-dependent quenching of chlorophyll a fluorescence in isolated chloroplasts. Eur J Biochem 17: 319-327

Yordanov I, Tsonev T, Goltsev V, Merakchiiska-Nikolova M, Georgieva K (1997) Gas exchange and chlorophyll fluorescence during water and high temperature stresses and recovery. Probable protective effect of carbamide cytokinin 4-PU30. Photosynthetica 33: 423-431

Zhang JX, Nguyen HT, Bluma A (1999) Genetic analysis of osmotic adjustment in crop plants. J Exp Bot 50: 291-302

115

10. FÜGGELÉK

1. ábra A vízdeficit hatása a kloroplasztiszok szerkezetére S. nigrum AS (a, c, e, g) és AR biotípusaiban (b, d, f, h). Jó vízellátottságú kontroll, a és b; közepes vízhiány (DH2), c és d; erős vízhiány (DH3), e és f; rehidratált a DH3 állapotból, g és h.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)1.1 μm

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g) (h)1.1 μm1.1 μm

116

2. ábra Trichómák vizsgálata AS (a) és AR (b) biotípusú S. nigrum növények abaxiális levélfelületein Scanning Elektron Mikroszkópiával (60 × nagyítás).

(a) (b)(a) (b)

117

11. PUBLIKÁCIÓS LISTA

Tari I, Csiszár J, Gallé Á, Bajkán Sz, Szepesi Á, Vashegyi Á (2004) Élettani megközelítések gazdasági növények szárazságtűrésének genetikai transzformációval történő javítására. Bot Közl 90: 139-158

*Bajkán Sz, Váradi Gy, Balogh M, Domonkos Á, Kiss GyB, Kovács L, Lehoczki E (2010) Conserved structure of the chloroplast-DNA encoded D1 protein is essential for effective photoprotection via non-photochemical thermal dissipation in higher plants. Mol Genet Genomics 284: 55-63

IF: 2,853

*Bajkán Sz, Várkonyi Zs, Lehoczki E (2011) Comparative study on energy partitioning in photosystem II of two Arabidopsis thaliana mutants with reduced non-photochemical quenching capacity. Acta Physiol Plant (közlésre elfogadva) IF: 1,232

Lehotai N, Pető A, Bajkán Sz, Erdei L, Tari I, Kolbert Zs (2011) In vivo and in situ visualization of early physiological events induced by heavy metals in pea root meristem. Acta Physiol Plant, DOI 10.1007/s11738-011-0759-z IF: 1,232

Konferencia közlemények:

Tari I, Simon LM, Deér KA, Csiszár J, Bajkán Sz, Kis Gy, Szepesi Á (2004) Influence of salicylic acid on salt stress acclimation of tomato plants: oxidative stress responses and osmotic adaptation. (poster) The 14th FESPB Congress, August 23-27, 2004, Cracow, Poland, Acta Physiol Plant, Book of Abstracts, pp. 237 IF: 0,433

Csiszár J, Tari I, Szepesi Á, Gallé Á, Bartha B, Bajkán Sz, Zeller D, Vashegyi Á, Pécsváradi A, Horváth F, Lazar A, Camen D, Staicu M, Petolescu (Dragoescu) C, Gabor L, Erdei L (2004) Oxidative stress and total antioxidants as estimated by using ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays in vegetable genotypes. (oral presentation) PHARE Conference, 3-5 September, 2004, Timisoara

Csiszár J, Tari I, Szepesi Á, Gallé Á, Bartha B, Bajkán Sz, Zeller D, Vashegyi Á, Pécsváradi A, Horváth F, Lazar A, Dorin C, Staicu M, Petolescu C, Gabor L, Erdei L (2004). Az antioxidáns védőmechanizmus egyes elemeinek vizsgálata zöldségfélékben szárazságstressz hatására. Zárójelentés, 37-43. old., Magyarország – Románia PHARE CBC Program (projekt szám: HU 2002/000, 627, 03-14), Román-magyar miniszimpózium

*Bajkán Sz, Váradi Gy, Lehoczki E (2005) The response of photosynthesis to water deficit in atrazine-susceptible and resistant biotypes of Solanum nigrum. (oral presentation) The 8th Hungarian Congress on Plant Physiology, The 6th Hungarian Conference on Photosynthesis, August 25-28, 2005, Szeged, Hungary, Acta Biol Szeged 49: 203-205

118

*Bajkán Sz, Váradi Gy, Lehoczki E (2005) Chlorophyll fluorescence quenching analysis of Solanum nigrum in relation to water deficit. (poster) The 8th Hungarian Congress on Plant Physiology, The 6th Hungarian Conference on Photosynthesis, August 25-28, 2005, Szeged, Hungary, Acta Biol Szeged 49: 207-209

*Várkonyi Zs, Bajkán Sz, Váradi Gy, Lehoczki E (2005) Light response of the chlorophyll fluorescence parameters and partitioning of absorbed light energy in wild type and npq4 mutant of Arabidopsis thaliana. (poster) The 8th Hungarian Congress on Plant Physiology, The 6th Hungarian Conference on Photosynthesis, August 25-28, 2005, Szeged, Hungary, Acta Biol Szeged 49: 229-232

Szepesi Á, Csiszár J, Bajkán Sz, Gémes K, Horváth F, Erdei L, Deér KA, Simon LM, Tari I (2005) (poster) Role of salicylic acid pre-treatment on the acclimation of tomato plants to salt and osmotic stress. The 8th Hungarian Congress on Plant Physiology, The 6th Hungarian Conference on Photosynthesis, August 25-28, 2005, Szeged, Hungary Acta Biol Szeged 49: 123-125

Tari I, Szepesi Á, Csiszár J, Bajkán Sz, Gémes K, Horváth F, Erdei L, Deér A, Simon LM (2005) Role of salicylic acid pre-treatment on the acclimation of tomato plants to salt stress. (oral presentation) The 8th Hungarian Congress on Plant Physiology, 6th Hungarian Conference on Photosynthesis, August 22-25, 2005, Szeged, Hungary

Bajkán Sz, Tóth T, Holzwarth AR, Garab Gy, Kovács L (2008) Light-induced conformational changes in the reaction center of photosystem II, revealed by fluorescence measurements. (poster) The 9th Congress of Hungarian Society on Plant Biology, June 7-9, 2008, Szeged, Hungary

Tóth T, Bajkán Sz, Garab Gy, Kovács L (2008) The role of LHCII in the macro-organization of thylakoid membranes. (poster) The 9th Congress of Hungarian Society on Plant Biology, June 7-9, 2008, Szeged, Hungary

* A dolgozatban felhasznált közlemények

119

12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretném megköszönni témavezetőmnek, Lehoczki Endre Tanár Úrnak mind

szakmai, mind emberi támogatását és az együtt töltött három évet.

Köszönettel tartozom az MTA SZBK Növénybiológiai Intézet munkatársainak, Kovács

Lászlónak, a dolgozatom elkészítésében nyújtott szakmai segítségéért és a Western blot

analízis kivitelezéséért; köszönettel tartozom Tóth Szilviának, a gyors klorofill fluoreszcencia

mérésekben nyújtott segítségéért, és a TEM vizsgálatok esetében Mustárdy Lászlónak;

megköszönöm Ughy Bettinának és Várkonyi Zsuzsannának a kísérleteim elvégzéséhez

nyújtott értékes segítségét és baráti támogatásukat. Köszönet illeti az MBK Genetikai

Intézetének munkatársait, Domonkos Ágotát, Balogh Mártát és Kiss György Botondot, a

szekvenálási munkáért. Köszönettel tartozom a Corvinus Egyetem Szőlészeti és Borászati

Kutatóintézet tagjainak, Váradi Gyulának, a pigmentösszetétel mérésekben nyújtott

segítségéért, műszerek használatának biztosításáért és a dolgozatom revíziójáért, és Szegedi

Ernőnek a PCR vizsgálatokban nyújtott segítségéért. Köszönöm az SZTE Növénybiológiai

Tanszék munkatársainak, Laskay Gábornak, az angol nyelvű közleményeim lektorálását,

külön szeretném megköszönni Kolbert Zsuzsannának baráti és technikai támogatását. Hálás

köszönettel tartozom Légrádi Máriának a reciprok keresztezések kivitelezésében nyújtott

kiváló asszisztenciáért. Szeretném megköszönni Mihalik Erzsébetnek a SEM vizsgálatokban

nyújtott segítségét.

Köszönetet szeretnék mondani Barátaimnak, akik fáradhatatlanul ösztönzöztek, támogattak és

kitartottak mellettem az évek során. Köszönöm Jávorfi Tamásnak a szeretetét, bíztatását, ezen

kívül a dolgozatom elkészítésében nyújtott technikai segítséget és az angol nyelvű

közlemények lektorálását. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm Édesanyámank hogy

éveken keresztül támogatott és segítette munkámat és doktori disszertációm elkészülését.