AG 103 313

จดประสงคการเรยนรเมออานบทท 11 จบแลวนกศกษาสามารถ

1. สามารถอธบายประวตทางพนธวศวกรรมได 2. สามารถอธบายความส าคญของพนธวศวกรรมได 3. สามารถอธบายขนตอนการสงถายยนสพชได 4. สามารถอธบายประโยชนการสงถายยนสพชได 5. สามารถอธบายกลไกการสงถายยนสพชได 6. บอกผลกระทบทอาจเกดขนจากการสงถายยนสพชได 7. สามารถอธบายปญหาตอการปรบปรงพนธพชโดยวธพนธวศวกรรมได 8. สามารถเชอมโยงหลกการพนธวศวกรรมกบวทยาศาสตรสาขาอน ๆ ได

เนอหาในบทท 11 ประกอบดวย 1. บทน า 2. การสงถายยนสพช 3. พาหะทใชน าจนเขาสพช 4. การปรบปรงพนธพชโดยวธพนธวศวกรรม 5. ประโยชนการสงถายยนสพช 6. ขนตอนการน ายนทนาสนใจเขาสพช 7. ปญหาการสงถายยนเขาสพช 8. การสรางพชแปลงพนธ 9. การสงถายยนโดยวธตรง 10. บทสรปกลไกการสงถายยนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพช 11. แบบประเมนผลทายบทและเฉลย

บทท 11 การสงถายยนสพชกบการปรบปรงพนธพช

314 AG 103

11.1 บทน า นบตงแตมการคนพบสารพนธกรรมและการศกษาคนควาวจยอยางตอเนอง จนถงทศวรรษทผานมา นกวทยาศาสตรไดคนพบเทคโนโลยทสามารถควบคมและดดแปลงพนธกรรมในเซลล (genetic manipulation) ทรจกกนในนามของพนธวศวกรรม (genetic engineering หรอ recombinant DNA technology) ซงนบวาเปนความกาวหนาทางวทยาการอยางมาก และนบเปนกาวส าคญทมนษยจะสามารถวางแผน ออกแบบ ควบคม และสรางลกษณะพนธกรรมใหม ๆ เพอใหไดสงมชวตใหมทมคณสมบตตามตองการได ความสามารถเหลานเปดโอกาสใหนกวทยาศาสตรไดน าลกษณะส าคญ ๆ ทซอนเรนในธรรมชาตของสงมชวตมาใชศกษาวจยและพฒนา และน ามาประยกตใชใหเกดประโยชนทงในดานการแพทย เภสชกรรม และดานการเกษตร ในดานการเกษตร พนธวศวกรรมจะมบทบาทอกอยางหนง คอ การปรบปรงพนธพช วธการในการปรบปรงพนธพชทใชกนมานบศตวรรษนยมใชกนอย 2 วธ คอ การคดเลอกพนธ (selection) จากความแปรปรวนในลกษณะทางพนธกรรมของประชากร จนไดพชทมลกษณะตามตองการและผสมพนธพชทมลกษณะดเขาดวยกน (hybridization) เพอใหลกหลานทเกดขนเปนผลรวมของลกษณะดเดนจากพอและแม ตามหลกการทางพนธศาสตรของเมลเดล (Mendelian genetics) ในทางปฏบตการพฒนาพนธพชสวนใหญเกดจากการผสมพนธเพอเปดโอกาสใหสารพนธกรรมรวมตวกน ท าใหไดประชากรทมความแปรปรวนในลกษณะทางพนธกรรมทมลกษณะดตามตองการ วธการดงกลาวแมวาจะไดผลดและกอใหเกดจากการรวมตวกน ท าใหไดประชากรทมความแปรปรวนในลกษณะทางพนธกรรม จากนนจงท าการคดเลอกพนธเพอหาลกผสมทเกดจากการรวมตวกนของสารพนธกรรมทมลกษณะดตามตองการ วธการดงกลาวแมวาจะไดผลดและกอใหเกดพนธพชทดมากมาย และยงเปนวธการหลกทใชในการปรบปรงพนธพชในปจจบนกตาม แตกเปนวธทส นเปลองเวลา แรงงาน และเงนทนมาก และไมแนใจวาจะประสบผลส าเรจเสมอไป ขอความส าคญคอการผสมขาม จะท าไดตอเมอเปนพชพนธชนดเดยวกนหรอใกลเคยงกนมากเทานน ดงนนการน าพนธวศวกรรมมาประยกตใชกบการปรบปรงพนธพช จงกอประโยชนโดยไมเพยงแตจะชวยยนระยะเวลาในการพฒนาพชพนธใหมเทานน แตยงเปดโอกาสใหนกวจยไดถายทอดยนจากสงมชวต

AG 103 315

ตางชนดกน ซงไมอาจท าไดในธรรมชาต อนอาจจะน าไปสการปฏบตรปโฉมของการเกษตรในอนาคตได วธการอยางงายของพนธวศวกรรมท าไดโดย ข นแรกท าการตดทอนดเอนเอ หรอยนทใหลกษณะตามตองการจากดเอนเอผให (donor DNA) โดยใชเอนไซมจ าเพาะ (restrition enzyme) ซงเอนไซมนจะตดยนทล าดบเบสจ าเพาะดวย ขณะเดยวกนกเตรยมพาหะ (vector) โดยใชเอนไซมชนดเดยวกนตดเพอใหล าดบเบสภายหลงการตดในดเอนเอพาหะมความสอดคลอง (complementary) กบล าดบเบสตรงจดตดของยนทตองการ ขนตอมาจงท าการเชอมดเอนเอทตองการเขากบดเอนเอพาหะ โดยใชเอนไซมไลเกส (ligase enzyme) จะม าใหไดดเอนเอสายพนธผสม (recombinant DNA) ซงโมเลกลดงกลาวจะเปนตวกลางในการถายสารพนธกรรมทตองการเขาสยนในพชได ในทางปฏบตการน าพนธวศวกรรมมาใชปรบปรงลกษณะตาง ๆ ของพช สามารถท าไดตามขนตอนกวาง ๆ ดงน 1) แยกเซลลจากพชและเลยงใหอยในสภาพปลอดเชอ (ในรปคลลสหรอโปรโตพลาส) ขนตอนนเปนการเตรยมการกอนทจะคดแปลงหรอสอดแทรกยนทควบคมลกษณะทตองการ 2) สรางหรอชกน าใหเกดการเปลยนแปลงลกษณะทางพนธกรรมภายนอกหรอภายในโครโมโซมเพอแตงแตมหรอควบคมเปลยนแปลงโครงสรางของยน (manipulation) ใหไดลกษณะตามตองการแลวท าการคดเลอดเซลลทแสดงลกษณะทตองการไว ข นตอนในขอนใชเทคโนโลยพนธวศวกรรมและอณพนธศาสตร (molecular genetics) 3) ขยายจ านวนเซลลเหลานน แลวกระตนใหเจรญเปนตนทสมบรณจะเหนวา พนธวศวกรรมเออประโยชนใหนกปรบปรงพนธสามารถท าการสบเปลยนหรอโยกยายยนจากสงมชวตชนดตาง ๆ ซงไมอาจเกดขนไดในธรรมชาต จงเปนการขยายขอบเขตของความแปรปรวนทางพนธกรรมหรอยนพล (gene pool) ซงจะเปนประโยชนในการปรบปรงพนธ นอกจากนยงอาจจะกอใหเกดลกษณะใหม ๆ ของพช ซงการปรบปรงพนธทใชกนในปจจบนไมสามารถท าได

316 AG 103

การถายยนจากพชสองตนเขาดวยกนโดยใชเทคโนโลยนมขอดทไมตองท างานกบพชทงตน ท าใหลดภาระไดมาก และการดงยนจากตนทเปนแหลงยนแลวสอดแทรกเขาสตนผรบ (recipient plant) ในต าแหนงทเหมาะสมและไมรบกวนยนในต าแหนงอน ๆ แลวจะท าใหไมตองกงวลกบยนอนของตนผรบแตอยางใด ขณะทวธการปรบปรงพนธในปจจบน เมอนกปรบปรงพนธตองการปรบปรงลกษณะหนง ภายหลงจากการผสมขามจะพบวามยนทควบคมลกษณะอนเกดการรวมตวกนขนดวย ซงเปนภาระยงยากตอนกปรบปรงพนธเปนอยางมาก นอกจากนแลว การถายทอดยนโดยเทคโนโลยนยงสามารถปรบปรงพนธหรอสรางพชชนดใหมไดภายในการทดลองเดยวหรอเพยงชวรน (generation) หนง ขณะทวธการปรบปรงพนธในปจจบนตองและคดเลอกหลาย ๆ รน ซงใชเวลานานยงไปกวานน พนธวศวกรรมยงเอออ านวยใหนกปรบปรงพนธพชสามารถน ายนทส าคญ ๆ เชน ยนตานทานโรคและแมลง ยนตานทานตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสม ยนดานทานยาปราบวชพช ยนตรงไนโตรเจนและยนควบคมลกษณะส าคญอน ๆ จากสงมชวตทอยนอกเหนออาณาจกรพชมาใชไดอกดวย ในปจจบนมรายงานถงความส าเรจของการท าพนธวศวกรรมกบพชหลายชนด เชน การสรางยาสบตานทานไวรส TMV หรอตานทานสารปราบวชพชไบอลาฟอส (bbialaphos) การสรางมะเขอเทศ ตานทานยาปฏชวนะในขาว หนอไมฝรง ฯลฯ ขณะเดยวกนนกวทยาศาสตรทวโลกกก าลงทมเทศกษาวจยเพอสรางพชพนธใหม ๆ และแสดงหาความรเกยวของกบยนในพชเพมขนเรอย ๆ และเปนทคาดคะเนกนวา ในราวป ค.ศ. 2000 มนษยจะสามารถน าประโยชนจากเทคโนโลยนมาใชไดอยางเตมท ซงเมอถงเวลานนอาจมการเปลยนรปโฉมของการเกษตรไปจากปจจบนมาก อยางไรกตาม เทคโนโลยนตองใชความสามารถของการประยกตข นตอนการปฏบตตาง ๆ เพอใหบรรลผลส าเรจในงานทคอนขางยาก เชน งานปรบปรงพนธพช ในอนาคตเทคโนโลยนจะสามารถน ามาใชอยางมประสทธภาพ และมความส าคญมากขน อยางนอยจะมสวนชวยในการปรบปรงลกษณะเฉพาะบางลกษณะของพช ในสวนทยงเปนจดออนของวธการทใชกนอยในปจจบนใหบรรลผลมากขน นอกจากนยงชวยเสรมใหนกปรบปรงพนธไดเขาใจกลไกของยน เพมวธการทน าไปสการสรางพชพนธใหมทดกวา อนจะน าไปสการปญหา

AG 103 317

การขาดแคลนอาหารทมคณภาพ และปญหาความสมดลระหวางอาหารกบประชากรของโลก ในขณะทอตราการเกดและการตายของประชากรโลกยงไมสมดลกนเชนทกวนน ในบรรดาเทคโนโลยทกาวหนาในปจจบน พนธวศวกรรมจดไดวาเปนเทคโนโลยทมความส าคญตอการใชศกษาและเปลยนแปลงลกษณะทางพนธกรรมของสงมชวตเปนอยางยง ซงข นตอนการสรางหรอชดน าใหเกดการเปลยนแปลงลกษณะทางพนธกรรม ท าไดโดยภายหลงจาการแยกเซลลพชใหเปนเซลลเดยว ๆ และเลยงใหอยในสภาพปลอดเชอแลวจงน าทอนยนทควบคมลกษณะทตองการมาตอเขากบทอนยนในเซลลของพช จากนนจงช าน าใหยนเกดการแสดงออกในระดบตนพช เทคโนโลยนนอกจากจะใชเปนเครองมอในการศกษากลไกของยน ถายทอดยนซงไมอาจท าไดในธรรมชาต หรอโยกยายยนจากสงมชวตนอกอาณาจกรพชมาใช อนจะชวยแกปญหาและเสรมประสทธภาพของวธการปรบปรงพนธใหสงขน แลวยงเปนการเพมวธการใหนกปรบปรงพนธสามารถเลอกประสทธภาพของวธการปรบปรงพนธใหสงขน แลวยงเปนการเพมวธการใหนกปรบปรงพนธสามารถเลอกใชไดอกดวย อยางไรกดการน าเทคโนโลยนมาใชใหประสบผล ควรพจารณาถงกลไกรแสดงออกของยนทตองการปรบปรง การแยกยน การ clone ยน การเลอกใชพาหะ และการท าการถายทอดยน การตรวจสอบเซลลเจาบานทมยนทตองการ รวมถงการตรวจสอบความคงตวของยนดวย และการเพาะเลยงเซลลดดแปลงนนใหเจรญเปนตนพชทมการแสดงออกของยน และถายทอดไปสลกหลานได ซงถาท าไดจะสามารถสรางพชใหเหมาะสมกบการเพาะปลก มคณคาทางอาหารสงขน หรอสรางพชพนธตานทานโรคและแมลง ทนตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสม ฯลฯ อนจะน าไปสการปฏวตรปโฉมของการเกษตรไปอยางสนเชง 11.2 Transformation คอการใสดเอนเอเขาสเซลลโดยตรง โดยเวคเตอรนนตองเปนพลาสมด และท าเซลลผรบใหอยในสภาพทพรอมจะรบดเอนเอภายนอกกอน อาจท าไดหลายวธขนอยกบเซลลทเปนผรบ ถาเปนแบคทเรย เชน E. coli ตองท าใหเซลลอยในสภาพ competent cell โดยใชสารบางชนด เชน CaCl2 หรอไอออนบวกอน ๆ แลวน าไปผานกรรมวธ heat

318 AG 103

shock ในกรณทเซลลผรบเปนเซลลพชเทคนคการถายฝากจนมหลายวธ เชน การถายฝากจนโดยตรง การถายฝากจนโดยใชกระแสไฟฟา การถายฝากจนโดยใชเขมฉด การถายฝากจนโดยใชเครองยง และการถายฝากโดยใชแบคทเรย Agrobacterium เปนตน 11.3 การสงถายจนสพช

ความหมายคอ กระบวนการสงถายจนทเราสนใจเขาสพช ซงไมจ าเปนตองเปนจนจากพชเสมอไป อาจเปนจนจากสงมชวตอน ๆ กได เชนอาจเปนจนจากแบคทเรย หรอเชอรา เปนตน ผลลพธทไดท าใหมการสอดแทรกของจนเขาไปในจโนมของพช ซงการสอดแทรกนตองมความเสถยร โดยสามารถผานขนตอนของการแบงเซลลแบบไมโตซส และไมโอซส ซงพชทไดรบจนเขาไปเรยกวาพชแปลงพนธ 11.4 พาหะทใชน าจนเขาสพช พลาสมด ( plasmid ) พลาสมดเปน DNA ทอยนอกโครโมโซม พบในแบคทเรยหลายชนด โครงสรางเปนวงแหวนเกลยวค มกมจนซงก าหนดการสรางเอนไซม หรอสารทมประโยชนกบแบคทเรย ท าใหแบคทเรยมคณสมบตพเศษ เชน ท าใหมความตานทานตอ antibiotic พลาสมดทใชเปนพาหะอาจเปน Ti plasmid ซงพบใน Agrobacterium tuemefaciens หรอ Ri plasmid ซงพบใน A. rhizogenes ในการสงถายจนทสนใจเขาสพชนน สวนของจนทสงถายไปตองมสวนทเรยกวา โปรโมเตอร ( promotor ) อยในสวนของจนนน ๆ ดวย นอกจากนยงตองมจนเครองหมาย ( selectable marker ) และจนรายงานผล ( reporter gene หรอ screenable marker ) อยดวย เพอใหงายตอการตรวจสอบผลส าเรจของการสงถายจน 11.5 การปรบปรงพนธพชโดยวธพนธวศวกรรม

ในอดตมนษยไดท าการปรบปรงพนธพชแบบดงเดม โดยวธผสมระหวางเกสรเพศผและเกสรเพศเมยทเปนพนธดแลวสงเกตรนลกทเกดขนวามลกษณะดขนกวารนพอแมหรอไม หากแตการปรบปรงพนธพชวธดงกลาวนนตองใชเวลานานและในบางครงผลทไดกไมไดเปนตามทคาดหวงไวเสมอไป หรอบางครงอาจไดลกษณะทเราไมตองการเขาไป

AG 103 319

ดวย จงท าใหนกวทยาศาสตรคดคนวธทจะประหยดเวลา และใหผลทนาพอใจตามทเราคาดหวงไว แมในตางประเทศการปรบปรงพนธพชแบบดงเดมเรมตงแตกอน 700 BC ชาวแอสซเรยนและบาบโลเนยนส ใชเทคนคการผสมเทยม (Artificially pollination) โดยท าการทดลองกบตน date plam

ชวงในโลกก าลงขาดแคลนอาหารเนองจากประชากรเพมขนอยางรวดเรวซงอยในชวงปครสตศกราช 1960-1970 จงเปนชวงเวลาทท าใหมการปฏวตเขยว (green revolution) เพอปรบปรงคณภาพของพชใหเพยงพอกบความตองการตามจ านวนประชากรทเพมขน โดยเฉพาะอยางยงในประเทศทพฒนา เชน สหรฐอเมรกา ไดมการคนควาวจยทางดานวทยาศาสตรการเกษตร เพอเรงเพมผลผลตใหมากขน เชน การเพมผลผลตของขาวสาล ใหมผลผลตสงโดย นอรแมน อ โบรลาจ (Norman E. Borlaug) ผซงไดรบรางวลโนเบล ในป ครสตศกราช 1970 สาขาพนธวศวกรรม (Genetic engineering) เรมเขามามบทบาทในการพฒนาการเกษตรแผนใหม พนธวศวกรรมมขอไดเปรยบกวาการปรบปรงพนธพชแบบดงเดม มากเพราะวธทางพนธวศวกรรมท าใหเราสามารถเลอกพนธพชใหมลกษณะตามความตองการไดในระยะเวลาอนสน เมอเทยบกบวธผสมกลบ ในปจจบนนเทคนคการสงถายยนสพชมความกาวหนามาก สามารถถายทอดยนระหวางสงมชวตตางชนดกนได และสามารถสรางพชทมความตานทานตอโรคและแมลงตาง ๆ ไดซงเปนการลดปญหาการใชสารเคมจ าพวกยาฆาแมลง และชวยลดมลภาวะตอสงแวดลอมได 11.6 ประโยชนการสงถายยนสพช

1) สรางพชตานทานโรค เชน การสรางพชตานทานโรคไวรส โดยการสงถายยนทก าหนดการสรางโปรตนหอหม (coat protein : CP) ของไวรสเขาไปในพช เชน หารสงถายยนซพ (CP) ของเขาไปในยาสบ ซงพชทยนนจะตานทานการบกรกของไวรสชนดนน ๆ และชนดใกลเคยงได

2) สรางพชตานทานแมลง เชน การสงถายยนทก าหนดการสรางสารพษจากแบคทเรย บาซลลส ทรนจนซส

(Bacillus thuringinsis) (bt toxin) เขาสพชทตองการปรบปรงพนธ เมอแมลงมากนพชท

320 AG 103

ยนนแลวแมลงจะตาย ดงนนพชทมยนนจงมกไมถกแมลงกนเมอเทยบกบตนพชทไมไดรบยน หรออาจจะใชยนทก าหนดการสรางสารยบยงเอนไซมยอยโปรตน (proteinase inhibitor) หรอ protein trypsin inhibitor จาก cow pea โดยมการทดลองถายยนนเขาสยาสบพบวาไดตนยาสบแปลงพนธสามารถตานทานตอการเขาท าลายของแมลงได อนงประโยชนทไดจากการสรางพชทตานทานแมลงคอ ลดปญหาการน าเขาสารเคมทเปนยาฆาแมลงจากตางประเทศไดอกทางหนง

3) สรางพชตานทานตอสารก าจดวชพช เชน การสรางพชตานทานตอสารก าจดวชพช คอสารไกลโฟเสท (glyphosate) (สารไกลโฟเสท จะท างานยบยงการท างานของสาร อพเอสพ ซนเทส EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) ซงเปนเอนไซมตวหนงในกระบวนการสรางกรดอะมโนกลมอะโรมาตก) พชทไดรบสารไกลโฟเสทนจะเหยวตายเพราะไมสามารถสรางกรดอะมโนดงกลาวได กลไกการตานทานตอสาร ไกลโฟเสท (glyphosate) สามารถอธบายได 2 วธดงน

วธทหนง ใหพชสราง EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) ในปรมาณทมาก (over product) จงมเอนไซมเพยงพอทจะสามารถเรงปฏกรยาได ซงสามารถท าไดโดยใชยนควบคมการสราง EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) จากพทเนยตอเขากบโปรโมเตอรและถายฝากยนเขาสยาสบซงจะมการสรางเอนไซมในระดบสง ท าใหพชทไดรบยนนสามารถตานทานตอสารไกลโฟเสท ไดดกวาตนทไมไดรบยนน เนองจากสารไกลโฟเสทเปนสารเคมทไปยบยงการท างานของเอนไซม EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) พชทสามารถทนทานตอสารไกลโฟเสท เปนเพราะสามารถผลตเอนไซม EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) ไดในปรมาณทสงมาก

วธทสอง ท าใหพชสรางเอนไซมทตางจากปกต (mutant enzyme) จงไมไวตอสารก าจดไกลโฟเสท ท าไดโดยใชจน อาโร เอ (aro A) ควบคมการสรางเอนไซม EPSP synthase (enolpyruvate shikinase-3-phosphate synthase) จากแบคทเรย ซลโมเนลลา

AG 103 321

ไทพมเรยม (Salmonella typhimurium) ซงตานทานตอสารไกลโฟเสท น ามาถายฝากลงในยาสบเพอสรางตนยาสบทตานทานตอสารไกลโฟเสท

4) การสรางพชแปลงพนธชนดใหมทมลกษณะดกวาเดม การสรางพชแปลงพนธใหมลกษณะทดกวาเดมท าไดโดยใชเทคนคเพาะเลยงเนอเยอชวย เชนสรางพชททนตอดนเคม ทนตอสารพษ และสรางพชทใหคณคาทางอาหารเพมมากขน หรอการเพมผลผลตตอพนทใหสงขน เชนการถายฝากยนใหถวเหลองสรางกรดอะมโนทจ าเปนใหมากขน และการสงถายยนกบขาวโพดเพอไดใหขาวโพดทมโปรตนคณภาพดขน

5) การสรางพชพนธใหมทสามารถตรงไนโตรเจนได เชน ขาวและพชจ าพวกธญพชทเปนพชเศรษฐกจหลกของโลก หรอของประเทศ แตมขอดอยคอไมสามารถตรงไนโตรเจนได นกวทยาศาสตรจงไดมวธทจะยายยนจากพชใบเลยงคทมยนในการตรงไนโตรเจนไดตามธรรมชาต เชนในพชตระกลถวทงหลาย ไปใสในพชธญพช เชน ขาวหรอขาวสาลเพอใหสามารถทจะตรงไนโตรเจนไดเชนเดยวกบพชตระกลถว เพราะการตรงไนโตรเจนท าใหพชสามารถทจะสรางอาหารเพอการเจรญเตบโตไดดกวาเดม และจะสงผลใหพชทไดรบยนนนใหผลผลตทสงขน

6) สามารถเกบรกษาพชไวไดนานขน โดยไมมปญหาเกยวกบการขนสงหรอการเกบรกษากอนการจ าหนายหรอสงออก เชน การสรางมะเขอเทศทสกชาโดยการสงถายยนพวก แอนไทเซน เอซซ ซนเทส (antisense ACC synthase) และ เอซซออกซเดส (ACC oxidase) ท าใหมะเขอเทศนนสรางสารเอธลนชาลง สงผลใหมะเขอเทศสกชาลง จงท าใหสามารถเกบรกษาไดนาน กลไกการสรางสารเอธลน CH3-S-CH2-CH2-CH-COO- Methionine NH+3 ATP PPi + Pi CH3-S

+-CH2-CH2-CH-COO- adenosine NH+3

322 AG 103

S-adenosylmenthionine (SAM) promote ACC synthase ethylene biosynthesis 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid (ACC)

ACC oxidase CO2 + HCN 1/2O2 CH2=CH2 Ethylene

promote fruit ripening ACC synthase ethylene senescene biosynthesis auxin wounding elictors /pathogens stress - drougth

- heat - cold - UV light

AG 103 323

7) สามารถสงถายยนเดยวทควบคมลกษณะทตองการเขาไปในตนพชแทนทจะเขาไปเปนกลมเหมอนการผสมพนธพชตามธรรมชาตจงท าใหไดลกษณะพชตามทตองการโดยไมตองพวงลกษณะทไมตองการ

8) ชวยลดปญหารการเขาคกนไมไดของยน เนองจากเทคนคการผสมพนธพชแบบดงเดมสามารถท าไดกบพชทมสายพนธใกลชดกนเทานน สวนพชทมสายพนธไมใกลชดกนจะประสบปญหาน เนองจากยนเขากนไมได ดงนนการน าเทคนคนมาใชจงท าใหปญหาดงกลาวหมดไป 9) เปนเครองมอทางโมเลกลาเจนตกส (molecular genetics) ตวอยางเชน ในการวเคราะหหาล าดบของดเอนเอ (DNA sequence) หรอหาโปรตนหรอการแสดงออกของยน (gene expression) 11.7 ความหมายของการสงถายยนสพช การสงถายยนสพช (Plant gene transfer) คอกระบวนการสงถายยนทเราสนใจเขาสพช (gene of interest) ซงไมจ าเปนตองเปนยนทมาจากพชเสมอไป อาจเปนยนมาจากสงมชวตตางชนดกนกได เชน อาจเปนยนจากแบคทเรย หรอจากเชอรา จากสตว เปนตน ซงผลลพธคอมการแทรกสอดยนเขาไปในจโนมของพชได ซงการสอดแทรกนนนตองมความถาวรหรอเสถยร (stable) โดยสามารถผานขนตอนการแบงเซลลแบบไมโตซสและไมโอซส ซงพชทไดรบจนเขาไปเรยกพชนวาพชแปลงพนธ (transgenic plants) ตวอยางพชแปลงพนธชนดแรกนนคอพชทไดรบ storage protein phaseolin จากภายนอกเขาไป 11.8 ขนตอนการน ายนทนาสนใจเขาสพช ในการน ายนทเราสนใจเขาสพช แบงเปนขนตอนไดดงน

1. ตองมพาหะ (vector) น าพายนทเราสนใจเขาสพช 2. ตองมการรวมตวกน(incorporation) ระหวางยนภายนอกและโครโมโซมของพช 3. ตองมการรวมตวกน (incorporation) อยางคงท และผานขนตอนการทรานสครป

ชนและทรานสเลชน (transcription and translation)

324 AG 103

4. ตองมการถายทอดยนนนโดยผานขนตอนการแบงเซลลแบบไมโตซสและไมโอซส

พาหะทใชในการน ายนเขาสพช (Plant gene vectors) พาหะทใชน ายนเขาสพชสามารถแบงไดเปน

1. พลาสมด (plasmids) พลาสมดเปนดเอนเอทอยนอกโครโมโซม พบในแบคทเรยหลายชนด โครงสราง

เปนวงแหวนเกลยวค มกมยนทก าหนดการสรางเอนไซม หรอสารทเปนประโยชนกบแบคทเรยท าใหแบคทเรยมคณสมบตพเศษ เชน ท าใหมความตานทานตอสารปฏชวนะ พลาสมดทใชเปนพาหะอาจเปน Ti plasmid ซงพบใน Agrobacterium tumefaciens หรอ Ri plasmid ซงพบใน A. rhizogenes

2. Lambda phage Lambda phage มจโนมเปนดเอนเอ เกลยวคขนาดประมาณ 48,000 bp. เมออยใน

อนภาคของ Phage DNA จะเปนสายเดยว แตเมอเขาไปในเซลลของ E. coli แลวปลายทเปนสายเดยวจะวกกลบมาจบกนดวยพนธะไฮโดรเจนเปลยนเปนดเอนเอรปวงแหวน 3. Yaest Artificial Chromosome (YAC)

YAC เปนเวคเตอรทมลกษณะคลายโครโมโซมขนาดเลก Yaest Artificial Chromosome จะประกอบดวยเซนโทรเมยรและทโลเมยรเปนเวคเตอรทใชกบยนทมขนาดใหญ ซงมขนาดตงแต 400,000 bp. ซงไมสามารถใชกบเวคเตอรชนดอนได 4. Virus

ไวรสทใชเปนพาหะเชนพวก CaMV (Cauliflower mosaic virus) 5. Cosmid

คอพลาสมดทมสวนของคอสไซท ของแลมปดาฝาจ อยคอสมดมสวนของดเอนเอทเปนจดเรมตนของการจ าลองตวของแบคทเรย มยนเครองหมายใชเปนตวคดเลอกเซลลทไดรบคอสมด

11.9 ปญหาการสงถายยนสพช ปญหาการสงถายยนสพชมดงตอไปน คอ

AG 103 325

1. ในพชใบเลยงเดยวบางชนดไมเปนทอาศยของ Agrobacterium 2. สายพนธของ Agrobacterium คอนขางจ าเพาะตอพชมาก ท าใหการสงถายยนส

พชโดยใช Agrobacteriumv อาจมปญหาในพชใบเลยงเดยว 3. การสงถายยนโดยใช Agrobacterium จะตองมข นตอนของการก าจดแบคทเรยชอ

Agrobacterium เมอสงถายยนเรยบรอยแลว ถาไมก าจดอาจเปนอนตรายตอพชได 4. ในพชบางชนดการชกน าใหเกดเปนตนใหมยากมาก ตวอยางเชนพบในพชใบ

เลยงเดยว พชตระกลถว และพชมเนอไม (woody species) ดงนนแมจะมการ transformation ส าเรจแตไมสามารถชกน าใหเกดเปนตนไดกไมเกดประโยชนอะไร

5. ในการสงถายยนโดยวธตรง (direct transformation) นนไมอาจใช selectable marker เปนพวกสารปฏชวนะได (antibiotic) เพราะถาใชจะท าใหเอมบรโอทยงออนอย (immature embryo) ตายกอนทจะเจรญไปเปนตนได

6. การสงถายยนโดยวธตรงบางครงพชแปลงพนธ (transgenic plant) ทไดอาจไมคง ท (stable) เปนการแสดงออกเพยงชวคราวถอเปน transient expression

7. ปญหาการอกปญกาหนงคอ การแสดงออกของยนในเซลลทตองการ และในเวลาท ตองการ ซงตองเฉพาะเจาะจงมากทท าใหบางครงไมมการแสดงออกของยน ขอควรระวงเกยวกบเทคโนโลยการสงถายยนสพช ทกสงทกอยางเมอมประโยชนกยอมมโทษบาง ดงนนการสงถายยนนจงควรมขอควรระวงดงตอไปน

1. อาจเกดความเปนพษ หรอเกดเชอโรค เชน ไวรส ตวใหม ๆ ขนได 2. อาจเกดการทนทานตอยาก าจดวชพช จนกระทงไมสามารถควบคมวชพชนน

ๆ ได 3. อาจมความเสยงสง ถาเราไมทราบวายนทสอดแทรกเขาไปนนจะไปท าอะไรใน

พชบาง 4. ความเสยงอนเนองจากการผสมขามระหวาง สปชส เชน หญา กบขาว อาจจะ

ไดพชพนธใหมทไมตองการเกดขน 5. ยนทน ามาศกษานน อาจถกสงตอไปสพชชนดอน ๆ ทไมตองการได

326 AG 103

6. อนตรายตอสภาพแวดลอมทคาดไมถงเชน เกยวกบหวงโซอาหารในธรรมชาต อาจเปลยนแปลงไป

7. การทงสารเคม และเชอแบคทเรยโดยไมระมดระวงอาจท าใหแพรกระจายไปส สภาพแวดลอม ซงอาจเปนอนตรายทงตอสขภาพและสงแวดลอม ขอมลพนฐานทตองศกษากอนทจะสงถายยนสพช กอนเรมตนการสงถายยนสพชนนตองมการศกษาขอมลดงตอไปน 1.การศกษาวธการเพมประสทธภาพในการชกน าใหพชนนเกดตนใหมใหไดเปอรเซนตทสง 2. การหาชนดของ Agrobacterium ทเจาะจงตอพชทเราตองการสงถายยนเขาไป 3. คดเลอกสารปฏชวนะทเหมาะสมในการก าจดเชอ Agrobacterium 4.คดเลอก selecting agent ทเหมาะสมในการคดเลอกพชแปลงพนธ (transgenic plants) 11.10 การสรางพชแปลงพนธ การสรางพชแปลงพนธโดยใช Agrobacterium –mediated transformation ขนอยกบความสามารถในการสงถายยนเขาสพชและในชกน าใหเกดเปนตนใหมนน มวธ 2 วธดงนคอ

1. protoplast co-cultivation โดย incubate protoplast กบ Agrobacterium หลง จากนน centrifuge เอา Agrobacterium ออก แลวเพาะเลยงโพรโทพลาสตใหสรางแคลลส ซงตอมาจะใช antibiotic เปนตวคดเลอก (select) transgenic tissue และตองก าจด Agrobacterium ใหหมดไปจากนนจงชกน าแคลลสใหเกดเปนยอดและรากตอไป

2. tissueexplant inoculatioโดย incubate explants เชน leaf disc กบแบคทเรย Agrobacterium จากนนน า leaf disc ไปวางบนอาหารทชกน าใหเกดแคลลส และคดเลอกพชแปลงพนธ โดยใชสารปฏชวนะ (antibiotic) จากนนจงชกน าใหเกดเปนตนตอไป ขอดของการสงถายยนโดยใช Agrobacterium

1. สามารถสงถายดเอนเอจากภายนอกเขาสเนอเยอหรอโพรโทพลาสตได 2. เนองจาก ทดเอนเอ (T-DNA) ม border sequence เปนบรเวณทก าหนด

AG 103 327

ขอบเขตทแนนอนของชนดเอนเอ เมอสอดแทรกเขาไปในโครโมโซมของพชแลว จงไมพบวามการจดเรยงตวผดไป แตถาใชระบบสงถายดเอนเอโดยตรง พลาสมดทเขาไปในเซลลพชจะมการจดเรยงตวและเกดการตอกนหลายโมเลกลกอนทเกดการสอดแทรกเขาไปในโครโมโซมพช จงเปนเหตใหเกดการจดเรยงตวของโครโมโซมพชผดไป ขนตอนการสรางพชแปลงพนธโดยใช Agrobacterium การสรางพชแปลงพนธโดย Agrobacterium ใชประกอบดวย 4 ขนตอนดงน

1. การสงยนทตองการศกษาเขาส Agrobacterium 2. ให Agrobacterium น ายนทสนใจเขาสเซลลพช 3. การเพาะเลยงเนอเยอพชในสภาพปลอดเชอและคดเลอกตนทเจรญจากเซลลทได

รบยนนน 4. การตรวจสอบการแสดงออกของยนในตนพชทผานการคดเลอกแลว

กลไกการสงถายยนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพช ขนตอนการสงถายยนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพชมข นตอนดงน

1. พชทเกดบาดแผลสงเคราะหสาร acetosyringone (AS) ซงเปนสารพวกฟโนลค (phenolic compound) และปลดปลอยออกมาจากบรเวณทมบาดแผล

2. สาร phenolic compound ไปกระตนผลตผลของยน chv ซงอยบนโครโมโซมของ Agrobacterium ท าให Agrobacterium เขาไปเกาะกบเซลลพชตรงบรเวณทมบาดแผล

3. โปรตนจากยน Vir A ท าหนาทเปน chemoreceptor จดจ า AS และไปกระตนให Vir G ท างาน

4. โปรตนจากยน Vir G ไปกระตน Vir อน ๆ ใหท างานและในทสดกระตน Vir D ใหท างาน

5. โปรตนจากยน Vir D ซงเปนเอนไซม endonuclease ตดพนธะฟอสโฟไดเอส เทอรทต าแหนงของ RB และ LB

6. เกด T-DNA สายเดยว หรอ t- strand 7. Vir gene จะท าหนาทสง t-strand เขาสเซลลพชซงจะไปแทรกอยในโครโมโซม

ของพช 8. เกดการแสดงออกของยนทอยในสวนของ T-DNA ซงจะท าใหเนอเยอพชมการ

328 AG 103

แบงตวเพมจ านวนมากมายแลวกลายสภาพเปนเนอเยอ ทเปนปมปม (crown gall) และมการผลตสารออกโทปนออกมาก

9. สารออกโทปนจะไปเหนยวน าใหเกดการลอกรหสของยน ท าหนาทสรางเอนไซม เพอใชสารนเปนแหลงพลงงาน ตารางสรปขอดและขอเสยของการสงถายยนสพชโดยวธ Agrobacterium mediated transformation

ขอด ขอเสย 1. มประสทธภาพสงในการทจะสราง

พชแปลงพนธเมอเทยบกบวธสงถายยนโดยวธตรง

2. เปนวธการทงายเมอเทยบการสงถายยนโดยวธตรง ซงตองใชเครองมอทมราคาแพง

3. อาจใชสวนของพชสวนใดกไดไมจ าเปนตองใชโพรโทพลาสตหรอเซลลเหมอนวธตรง ซงการสงถายยนสพชโดยใช Agrobacterium สวนของพชทใชอาจเปน ใบ กานใบ ปลอง หรอใบเลยง

4. คาใชจายถก 5. พชแปลงพนธทไดจะทความคงท

ของยน ซงไมคอยเปลยนแปลง

1. มความยงยากในการก าจด Agrobacterium

2. Agrobacterium แตละสายพนธ

(strain) จะเจาะจงกบพชแตละชนด ซงเปนการยงยากในการหา Agrobacterium ทเหมาะสมกบพชแตละชนด

11.11 การสงถายยนโดยวธตรง (Direct gene transfer)

การสงถายยนโดยใช Agrobacterium มขอจ ากดหลายอยางไดแก มความยงยากในการก าจด Agrobacterium และ Agrobacterium แตละสายพนธ (strain) จะเจาะจงกบ

AG 103 329

พชแตละชนด ซงเปนการยงยากในการหา Agrobacterium ทเหมาะสมกบพชแตละชนด โดยเฉพาะในพชใบเลยงเดยวไดแก ขาว ขาวโพด ขาวสาลและขาวฟาง นกวทยาศาสตรจงหนมาสนใจแกไขปญหาดงกลาวโดยการสงถายยนโดยวธตรง ซงมหลายวธดงน

1. การสงถายยนโดยใชสาร Polyethylene glycol (PEG) สาร Polyethylene glycol (PEG) มประสทธภาพในการชกน าใหเกดการรวมตวกนของโพรโทพลาสต และจากคณสมบตนสาร Polyethylene glycol (PEG)จงถกน ามาใชในการกระตนใหเกดการชกน า ดเอนเอ เขาสเซลล 2. การสงถายยนโดยใชกระแสไฟฟา (Electroporation) 3. การสงถายยนโดยใช Microprojectile microprojectile bombardment particle gun

4. การสงถายยนโดยใช Microinjection 5. การสงถายยนโดยเขาส single cell หรอ Protoplast โดยใช microinjection 6. การสงถายยนโดยเขาส multicellular structure โดยใช microinjection 7. การสงถายยนโดยใช Electrophoretic 8. การสงถายยนโดยใช Ultrasonication

9. การสงถายยนโดยใชวธอน ๆ จนรายงานผล หรอ reporter gene หรอ screenable marker จนรายงานผลเปนจนทก าหนดลกษณะบางอยางทท าใหทราบวาสวนของโปรโมเตอรทตออยกบจนนน มการแสดงออกหรอไมและแสดงออกไดมากนอยเพยงใดในเซลลหรอในเนอเยอสวนใด ตวอยางเชน gus ( beta-glucuronidase ) beta-glucuronidase ( gus ) gene เปนจนจากแบคทเรย E. coli นยมใชกนอยางกวางขวางในการศกษาดานชวโมเลกล เอนไซม beta-glucuronidase ท าหนาทคะตะไลซปฏกรยาไฮโดรไลซส ของ glucuronidase เนองจากมการสนนษฐานวาไมพบกจกรรมของ intrinsic gus ในพชชนสงอนเปนเหตผลทส าคญทท าใหมการใชจน gus เปน reporter gene

330 AG 103

การตรวจสอบผลการแสดงออกของจน หลงจากทมการสงถายจนเขาไปในพชแลวตองมการตรวจสอบพชวามการแสดงออกของจนหรอไม อาจตรวจสอบไดโดยวธการดงน gus assay

การใชจน gus เปนจนรายงานผลนน gus gene จะเปนตวก าหนดการสรางเอนไซม -glucuronidase ซงจะเปลยน substrate ( X-gluc ) ทเตมลงไป หรอสาร 5-bromo-4-chloro-3-indole--D glucuronide ใหเปนสารอนโดลล ( indolyl derivatives ) ทมสฟาของ 5-bromo-4-chloro-indico ดงสมการ -glucuronidase X-gluc 5-bromo-4-chloro-indico (5-bromo-4-chloro-3-indole--D glucuronide) (ท าใหเนอเยอพชมสฟา) ดงนนถาเนอเยอพชไดรบ DNA สายผสมไป กจะท าใหเนอเยอของพชสวนทไดรบ gus gene มสฟา การสงถายจนโดยใช Agrobacterium

Agrobacterium เปนแบคทเรยแกรมลบชนด aerobic bacteria ทอาศยอยในดน เปนสงมชวตชนดแรกทกอใหเกดการสงถายจนตามธรรมชาตหรอกอใหเกดพนธวศวกรรมตามธรรมชาต จดอยใน Family Rhizobiaceae Agrobacterium ม 4 ชนด คอ 1. Agrobacterium tumefaciens 2. A. rubi 3. A. rhizogenes 4. A. radiobacter ซงเปน avirulent sp.

ชนดทส าคญ คอ Agrobacterium tumefaciens ซงกอใหเกดโรค crown gall และ A. rhizogenes ซงกอใหเกดโรค hairy root

AG 103 331

ภายในเซลล Agrobacterium ม extrachromosomal plasmid ขนาดใหญ มขนาดประมาณ 200 kb โดยพบวาม Ti ( turmor inducing ) plasmid ใน Agrobacterium tumefaciens และ Ri ( root inducing ) plasmid ใน A. rhizogenes

Ti plasmid ใน Agrobacterium tumefaciens เปน DNA รปวงแหวนอยนอก

โครโมโซม Ti plasmid ทพบมาก 2 ชนด คอ ชนดออกโทปน ( octopine ) และโนปาลน ( nopaline )

สารพวกออกโทปน และโนปาลนเปนสารโอปนทเซลลพชบรเวณทถกบกรกดวย Agrobacterium สรางขนไดตามชนดของพลาสมด Ti พชทเปนโรค crown-gall tumour จะผลตสารโอปนชนดใดชนดหนงเทานน

โอปน ( Opine )

โอปน เปนแหลงคารบอนและแหลงไนโตรเจนท Agrobacterium จะน าไปใช โอปน แบงเปน 4 กลม คอ

1. ออกโทปน ( octopine ) เปน carboxyethyl derivative ของ อารจนน ( arginine )

2. โนปาลน ( nopaline ) เปน dicarboxypropyl derivative ของ อารจนน ( arginine )

3. อะโกรปน ( agropine ) เปน bicyclic sugar derivative ของกรดกลตามค ( glutamic acid )

4. อะโกรซโนปน ( agrocinopine ) เปนสาร พวก phosphorylated sugar Ti plasmid Ti plasmid ทพบใน Agrobacterium tumefaciens เปนสาเหตทกอใหเกดโรค crown-gall diseases Ti plasmid จะม 2 บรเวณทมความส าคญตอการสงถายจนสพช คอ

1. T-DNA ( transfer DNA )

332 AG 103

2. Vir region ( virulence region ) T – DNA

T-DNA ประกอบดวย DNA ประมาณ 23 kb ขอบเขตของ DNA ก าหนดโดยล าดบเบสซ า ( terminal repeat ) ประมาณ 25 bp อยสองขางของ T-DNA ซงเรยกวา left border ( LB ) และ right border ( RB ) ดงแสดงในภาพ 11.1 ในพบวาบน T-DNA มรหสส าหรบการสรางเอนไซม ทจ าเปนส าหรบการสงเคราะหสารโอปน ฮอรโมนออกซนและไซโทไคนน ดงแสดงในภาพ 11.2

ภาพท 11.1 แสดง left border (LB) และ right border (RB) ทอยสองขางของ

T-DNA

AG 103 333

ภาพท 11.2 แสดงโครงสราง T-DNA ทก าหนดการสรางสารโนปาลน (บน) และออกโทปน (ลาง)

Vir region สวนส าคญอกสวนหนงทท าใหมการสง T-DNA จาก Agrobacterium ไปยงพช คอ

สวนของ Vir region ซงมขนาดประมาณ 35-40 Kbp กลมจนนประกอบดวย จน 6 ต าแหนงคอ Vir A, Vir B, Vir C, Vir D, Vir G และ Vir E การสงถาย T-DNA เขาสเซลลพช การสงถาย T-DNA เขาสเซลลพชเกดขนจากการท างานของ virulence gene และ chv gene คอจนทอยบนโครโมโซมของ Agrobacterium โดยสามารถกระตนการท างานของ Vir region บน Ti plasmid ไดดวย specific wound substance ซงเปนสารพวก phenolic compounds เชน acetosyringone และ alphahydroxy ดงแสดงในภาพท 11.3 ซงปลดปลอยออกจากบาดแผลของพช

334 AG 103

ภาพท 11.3 แสดงพลาสมด Ti ชนดออกโทปน (ซาย) และโนปาลน (ขวา) กลไกการสง T-DNA สเซลลพช กลไกการสง T-DNA เขาไปในเซลลพชควบคมโดยกลมจน Vir region ทอยใน Ti plasmid ขนตอนแรกสดท Agrobacterium จะบกรกเซลลพชได คอ Agrobacterium จะเขาเกาะทต าแหนงจ าเพาะบนเซลลพช สารทเปนตวรบร ( receptor ) ของเซลลพชอยทผนงเซลลซงคาดกนวาอาจจะเปนคารโบไฮเดรตและโปรตน จากการศกษาพบวา บนโครโมโซมของ Agrobacterium มจนทควบคมการเขาเกาะกบเซลลพช คอ จน chv เมอพชมบาดแผลจะหลงสารฟนอลลก เชน acetosyringone ( 4-acetyl 2, 6 dimethoxy phenol ) ซงจะไปกระตนให vir gene มการแสดงออก คอ มการลอกรหสและแปลรหสออกมา โดยมโปรตนของ Vir A ท าหนาทเปน chemoreceptor รบรสารประกอบของพช Vir A ม hydrophobic region 2 ต าแหนงอยทางดานปลายกรดอะมโนซงจะเกาะอยกบเยอหมออรกาเนลลภายในเซลล สวนปลายคารบอกซลอยในไซโทพลาซม และมความสามารถเตมหมฟอสเฟตเขาสโมเลกลเองได ( autophosphorylating activity ) ดงแสดงในภาพ จากนนโปรตนทสงเคราะห จาก Vir A จะกระตน Vir G ซงท าหนาทเปน

AG 103 335

regulator component สนนษฐานวาท าหนาทกระตนกระบวนการลอกรหส ในบรเวณ Vir region อน ๆ Vir D เกยงของกบขนตอนแรก ในกระบวนการขนสง T-DNA Vir D1 มคณสมบต topoisomerase activity Vir D2 มคณสมบตของ endonuclease activity ตดพนธะฟอสโฟไดเอสเตอร ทบรเวณ right border ( RB) และ left border ( LB) ของ T-DNA Vir C มสวนชวย Vir D1 และ Vir D2 ซงเทากบเปนการสงเสรมประสทธภาพในการสง T-strand ดงแสดงในภาพ Vir D2และ Vir E จะเขาเกาะทางดานปลาย 5 ของ T- strand ทถกตดแลว เพอปองกนไมใหเอนไซมในกลม exonuclease และ endonuclease มายอยสลาย T-strand ในระหวางทมการขนสงผานจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพช และท าให T-strand อยในรปเสนตรง มขอสนนษฐานวา Vir B ก าหนดการสรางโปรตนทท าใหผนงเซลลของ Agrobacterium ม ลกษณะคลายกบกระบวนการ conjugation ของแบคทเรย แตการขนสง T-strand ผานเซลลพชและเยอหมนวเคลยสของพชรวมไปถงการเขาแทรกของ T-strand ในโครโมโซมพช จะเหมอนกบการบกรกของไวรส ดงแสดงในภาพท 11.5 ภาพท 11.4 แสดง disarmed plasmid ทตด T-DNA ออก แลวใส antibiotic

resistance gene แทน

336 AG 103

ภาพท 11.5 แสดงกลไกการสงถายจนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพช วธการศกษา

ตวอยางพชทจะน ามาท าการสงถายจนนเปน callus ของตนถวสวนตาง ๆ คอ shoot, cotyledon, epicotyl, hypocotyl และ leaf และจากตนออนของตนถวสวนตาง ๆ คอ cotyledon, epicotyl, hypocotyl และ leaf โดยมข นตอนดงน

1. ตด callus จากสวนตาง ๆ ประมาณ 4-5 ชน และตดสวนตาง ๆ ของตนออน ใหเปนชนเลก ๆ ประมาณ 4-5 ชน และตดสวนตาง ๆ ใหเกดบาดแผล

2. เตรยม Agrobacterium โดยเลยงในอาหารเหลวสตร LB ทม antibiotic แลวใส ในเครองเขยาความเรว 150 รอบตอนาท ทอณหภม 25 C เปนเวลา 48 ชวโมง

3. น า Agrobacterium 1 ml ไปป นเหวยง ท 1,800 g เปนเวลา 1 นาท ดดเอา สวนของเหลวทง ละลานตะกอนแบคทเรยดวยอาหารเหลวสตร MS 1 ml

4. ผสมสารละลาย Agrobacterium กบอาหารเหลวทจะใชเลยงตนถวใหไดความ เขมขนประมาณ 2X107 – 3X107 เซลลตอมลลลตร

5. น าสวนของ callus และตนสดทตดไวจมลง ในสารละลายอาหารเหลวทมเชอ

AG 103 337

Agrobacterium เปนเวลา 10 นาท 6. ยายสวนของ callus และตนสด มาวางบนกระดาษทปลอดเชอ แลวจงน าไป

วางในอาหารสตร MS ทเตมน าตาลซโครส 3% วน 0.7% เพาะเลยงทความเขมแสง1,500 ลกซ เวลา 16 ชวโมง อณหภม 25C เปนเวลา 48 ชวโมง

7. ยายสวนใบมาเพาะเลยงในอาหารสตรชกน าใหเกดตน ทเตม antibiotic เพอ ก าจด Agrobacterium และ selecting agent เชน กานามยซน เพอคดเลอกพชทไดรบจนทสงถายเขาไป สงเกตการเจรญเตบโตของเนอเยอพชและเปลยนอาหารใหมทก ๆ 14 วน

8. น าสวนตาง ๆ ของตนถวมาตรวจสอบการแสดงออกของจนโดย GUS assay

การแยกโพรโทพลาสตจากโปรโตครอมของกลวยไม

โพรโทพลาสต คอ เซลลรางกาย (somatic cell) ทไมมผนงเซลล มเพยงเซลลเมมเบรนทหมนวเคลยสและไซโทพลาซมไว เนองจากโพรโตพลาสตไมมผนงเซลลดงนนจงท าใหสะดวกตอการใมยนหรอสารพนธกรรมทเราสนใจเพอปรบปรงพนธพชใหเกดพนธใหมตามทตองการ

ป 1982 เรมมการใชวธกลในการแยกโพรโทพลาสต โดย Klercher แตมประสบความส าเรจเพราะมโพรโทพลาสตออกมานอย Cocking (1960) ไดทดลองใชเอนไซม cellulase แยกโพรโทพลาสตจากสวนปลายรากพช

Takebe, Otsuki and Aoki (1986) ไดแยกโพรโตพลาสตแบบวธกลและใชเอนไซมรวมดวยท าใหสามารถแยกโพรโทพลาสตจากยาสบไดจ านวนมาก แตมปญหาคอไมสามารถเพาะเลยงโพรโทพลาสตใหเจรญเปนแคลลสได และในป 1986 Takebe, Labib and Melckers ไดเพาะเลยงโพรโทพลาสตจากใบยาสบจนสามารถ regenerate เปนตนไดเปนครงแรก วธการแยกโพรโตพลาสต ท าได 2 วธคอ 1. วธกล (mechanical method)

338 AG 103

เปนวธการแรกทมนษยใชในการแยกโพรโทพลาสตออกจากเนอเยอของพชโดยเอาเนอเยอพชมาแชในสารละลายทมความเขมขนสง (hypertonic solution) น าในเซลลพชจะถกดงออกมาภายนอกท าใหโพรโทพลาสตหดตวลงคอเซลลเกด plasmolysis สวนเยอหมเซลลจงแยกออกจากผนงเซลล แลวตดเนอเยอพชเปนชนบาง ๆแลวน าไปแชในสารละลายทมความเขมขนนอย (hypotonic solution) โพรโทพลาสต จะพองตวและหลดออกมา 2. วธใชเอนไซม (enzymatic method)

เปนวธทสามารถแยกโพรโทพลาสตไดสมบรณและมปรมาณมาก โดยใชเอนไซม เซลลเลส (cellulase) และเพคตเนส (pectinase) มายอยสลายผนงเซลลจะไดสวนทเหลอเปนโพรโทพลาสต ขนตอนการแยกโพรโทพลาสต

น าโปรโตครอมกลวยไมมายอยโดยใชเอนไซม pectinase ซงจะท าหนาทยอยสารประกอบเพคตนและสารประกอบทเชอมตดกนใหแยกออกมาเปนเซลลเดยว ๆ ยอยบนเครองเขยาเบา ๆ เมอเซลลหลดออกมาเปนเซลลเดยว ๆ แลวจงใชเอนไซม cellulase ซงท าหนาทยอยผนงเซลลออกจนได โพรโทพลาสต วธการเลยงโพรโทพลาสต 1. เลยงในอาหารกงแขงหรออาหารแขง 1.1 Plating method 1.2 Feeder layer 2. เลยงในอาหารเหลว 2.1 suspension or drop culture 2.2 micro-drop culture 2.3 microchamber techniqe

AG 103 339

ปจจยทมผลตอการเจรญและการแบงตวของโพรโทพลาสต 1. ความเขมขนของโพรโทพลาสต ควรมความเขมขน 5X104-105 โพรโทพลาสตตอ

มลลลตร 2. การทเซลลโพรโทพลาสตสรางผนงเซลลเรวท าใหเปนอปสรรคในการรวมกนของโพ

รโทพลาสต 3. การเกบโพรโทพลาสตทเลยงในอาหาร ควรเกบโพรโทพลาสตทแยกใหม ๆ ในท ๆ ม

แสงสลว เพราะถาไดรบแสงทนทโพรโทพลาสตอาจตายได 4. อณหภมทเหมาะสมกบการเลยงโพรโทพลาสตคอ 25-29 องศาเซลเซยส พนธวศวกรรมของเมลดพชทเกบสะสมโปรตน

ในชวงทมการพฒนาการของเมลดนน พชสวนใหญมการสะสมสารหรออาหารทจะเกยวของกบกระบวนการเมทาโบลซมเพอใชในการงอกในชวงแรกของตนออน ซงพลงงานเหลานจะอยในรปของสารประกอบจ าพวกคารโบไฮเดรต (แปง) และไขมน สวนในเมลดทมสารประกอบพวกโปรตนจะสะสมในรปของธาตไนโตรเจน (N) คารบอน (C) และซลเฟอร (S) ซงมนษยมการใชประโยชนจากเมลดโดยการหมกเพอใหได อลกอฮฮล เชนจากขาวโพด และโปรตนจากถวเหลอง เปนตน เมลดพนธพชไรไดแก ขาวโพด ขาวสาล ขาวโอต และถวเหลอง สวนใหญนยมปลกจากเมลด ในดานอตสาหกรรมการเกษตร ทตองการคณภาพเมลดเพมขน ระหวางศตวรรษทผานมา นกปรบปรงพนธพชไดปบปรงพนธพชใหม ๆ ทมสารสะสมในเมลดมากกวาแตกอน ซงไมเพยงแตเพมปรมาณของแปง ไขมน และโปรตนเทานน แตมการปรบปรงใหมกรดไลโนเลอก ในเมลดถวเหลองลดลง เพอใหมกลนทนาพอใจยงขน การสงเคราะหคารโบไฮเดรตและไขมน รวมทงสารประกอบอน ๆ โดยน าวธทางพนธวศวกรรมชวย ในการเพมประสทธภาพได เชนในกจกรรม หนงหรอสองเอนไซม แตขอจ ากดคอไมมความสมดลของธาตคารบอนในเมลด สวนการปรบปรงพนธตามธรรมชาตจะเหมาะสมกวาในดานการพฒนาใหเมลดสะสมคารโบไฮเดรตและไขมน การตดตอยนโดยตรงเพอตองการเพมคณภาพเมลด เปนสงทส าคญ ในเมลดทสะสมโปรตนนนมกจะมการขาดกรดอะมโนทจ าเปนตวใดตวหนงไป ในธญพชจะมกรดอะ

340 AG 103

มโน ชนด Lysine และ Tryptophan นอย สวนพชตระกลถว มกจะขาด ธาตซลเฟอร Methionine และ Cystein ในชวงทมกรพฒนาดานเศรษฐกจจะมความตองการเพมปรมาณสารอาหารในเมลดใหมากขน เชนในประเทศสหรฐอเมรกา มการผลตขาวโพดและถวเหลองถง 16 ลานตนตอป เพอปอนโรงงานอตสาหกรรม และเกบไวบรโภค นกปรบปรงพนธมขอจ ากดในดานการสงถายยนเพอเพมปรมาณโปรตนใหมระดบสงในเมลดพช แตพบวายนไมมการแสดงออกในพชเหลานนได แมจะเกดอปสรรคขน แตกประสบความส าเรจในการสกด DNA สายผสมได และสงถายเขาสเซลลพชในหลอดทดลองเพอใหเกดการกลายพนธซงมล าดบของกรดอะมโนแทรกอยดวย โดยมการทดลองในขาวโพดและถวเหลอง เมลดทสะสมโปรตนนมโครงสรางและต าแหนงทเฉพาะซงอยภายในเซลลเมลด ซงสามารถดดแปลงโดยไมท าใหโครงสรางเหลานนเปลยนแปลงไป การจดกลมเมลดทเกบสะสมโปรตน ซงโปรตนเหลานจะอยในรปเปนเยอบาง เรยกวา protein bodies เมอเมลดงอกปรมาณโปรตนจะลดลง โดยเมลดใชพลงงานจากธาต N, C และ S เพอการเจรญในระยะแรก ๆ โปรตนทละลายน าไดมชอเรยกวา albumins และสามารถละลายในสารละลายของเกลอได ถาไมละลายน าอยในรปของ glubulins ละลายในอลกอฮอลเรยกวา prolamins หรอละลายในสารละลายทเปนกรดหรอเบสไดเรยกวา glutelins

อธบายค าศพทบางค าทางชวโมเลกล

adapter โมเลกลดเอนเอสน ๆ ทสงเคราะหขน ประกอบดวยสวนปลายดานหนงเปนสายเดยวทเปนคสมกบปลายดเอนเอทตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะชนดใดชนดหนง agar

โพลแซคคาไรดทสกดจากสาหรายทะเลชนดหนงใชส าหรบท าใหอาหารแขงตว agarose

AG 103 341

โพลเมอรของดกาแลกโทสสลบกบ 3,6 แอนไฮโดรกาแลกโทส แยกมาจากอะการอกทหนงใชเปนตวกลางในการท าอเลกโทรโฟรซส Agrobacterium tumefaciens แบคทเรยทสามารถท าใหเกดปมปมขนในพชใบเลยงคหลายชนด โดยแบคทเรยจะบกรกเขาสเซลลทตายหรอมบาดแผลเทานน และแบคทเรยจะสงทเปน พลาสมดเขาไปในเซลลพช Angstrom unit หนวยความยาวมคาเทากบ 10–4 ไมครอน หรอ 10–10 เมตร ใชสญลกษณ A๐ ตงชอเพอเปนเกยรตแกนกฟสกสชาวสวเดน Anders Janas Anstrom antibody โปรตนทผลตขนโดยเซลลน าเหลอง เพอตอบสนองตอสารแปลกปลอมทเขาสเซลลทเรยกวาแอนตเจน และสามารถท าปฏกรยาจ าเพาะกบสารดงกลาวได anticoding strand สายหนงของดเอนเอเกลยวคทใชเปนตนแบบในการลอกรหสเปนอารเอนเอ มเบสเปนคสมกบอารเอนเอทได เรยกอกอยางหนงวา template strand antigen สารแปลกปลอม ซงเมอน าเขาสสตวมกระดกสนหลง จะกระตนใหมการสงเคราะหแอนตบอดทจ าเพาะตอกน antisense RNA โมเลกลของอารเอนเอทมล าดบเบสเปนคสมกบ mRNA ซงสงเคราะหขนในเซลลโดยทวไป antitermination factor โปรตนซงท าหนาทชวยใหเอนไซม RNA polymerase ละเลยสญญาณการหยดลอกรหส ทต าแหนงหนงบนโมเลกลของดเอนเอ autoradiography

342 AG 103

เทคนคการหาต าแหนงของโมเลกลทตดฉลากดวยสารกมมนตรงส โดยวางฟลมเอกซเรยบนตวอยางทเตรยมไวเปนเวลาหลายชวโมงจนถงหลายวน จะปรากฎเปนจดสด าบนฟลมตรงต าแหนงทสนใจ autotroph สงมชวตทสามารถสรางสารโมเลกลใหญจากสารอนนทรยงาย ๆ ใชส าหรบด ารงชวตได เชน แอมโมเนย คารบอนไดออกไซด ไดแก พช และแบคทเรยบางชนด auxotroph จลนทรยพนธกลายซงไมสามารถสรางสารบางชนดไดดวยตวเอง จะเจรญเตบโตไดในสารอาหารทเตมสารดงกลาวแลวเทานน bacteriophage ไวรสของแบคทเรยเรยกสน ๆ วาฝาจ ตวอยางเชน P1,P2 แลมบดา เปนไวรสของแบคทเรย E.coli biotin วตามนชนดหนงท าหนาทเปนแฟคเตอรรวมของเอนไซมบางชนด สามารถจบตวไดดกบสารปฏชวนะ streptavidin biotinylated DNA DNA probe ทตดฉลากดวยสารไบโอตน cDNA ดเอนเอคสมซงสงเคราะหขนโดยใชอารเอนเอเปนตนแบบ ใชเอนไซม reverse transcriptase cDNA library

AG 103 343

แหลงรวมของ cDNA ทเปนตวแทนของ mRNA ทกชนดทสรางขนจากเซลลหรออวยวะหนงของสงมชวต ทตอเชอมอยกบเวคเตอร เชน พลาสมด หรอ ฝาจแลมบดา เนองจากยนทกยนในสงมชวตไมไดมการแสดงออกในทก ๆ เซลล cDNA library จ งเปนแหลงรวมของยนทมการแสดงออกในสวนนนเทานน chromosome walking

วธแยกหาโคลนทมชนดเอนเอซอนตอเนองกนเปนล าดบ เพอจะหาชนสวนของดเอนเอบนโครโมโซมทยาวมากเกนกวาทจะบรรจไวในเวคเตอรเพยงโมเลกลเดยวได อาจใชเทคนคนในการหายนหรอชนดเอนเอทไมม probe ส าหรบตดตามได แตทราบวายนดงกลาวนแยกตวไปพรอมกบชนดเอนเอชนหนงทแยกไวแลว ใชดเอนเอทแยกไดนเปน probe เพอตรวจหาโคลนทมดเอนเอซอนกนกบสวนของ probe จากgeomic library แลวแยกดเอนเอจากโคลนทไดใหม ท าแผนทโดยการตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ เลอกใชสวนปลายทอยไกลจาก probe ชนแรกเปน probe ตอไป เพอตรวจหาโคลนทมสวนของดเอนเอซอนกนยาวออกไปเรอย ๆ ทง 2 ทศทาง จนกวาจะถงยนทสนใจ clone ถาเปนค านามหมายถงกลมเซลลทก าเนดมาจากเซลลเดยวกน ดงนนจงมยนทมคณสมบตเหมอนกน เมอเปนค ากรยาหมายถงการสรางกลมเซลลทมสารพนธกรรมหรอยนเหมอนกนหรอเปนการขยายเพมปรมาณเซลลทมยนทตองการใหมจ านวนมาก เพอเปนการเพมปรมาณยนนน ๆ ใหมากขนดวย coat protein โปรตนโครงสรางทหอหมอยนอกอนภาคของไวรส coding strand สายหนงของดเอนเอเกลยวค ซงมล าดบเบสเหมอนกบ mRNA ยกเวน T แทนทดวย U ในอารเอนเอ

344 AG 103

colony hybridization เทคนคทใชแยกแบคทเรยทมเวคเตอรทมชนดเอนเอทสนใจสอดแทรกอย วธท าคอถายโคโลนของแบคทเรยจากจานเลยงเชอไปสแผนเมมเบรนฟลเตอร แลวจงน าแผนฟลเตอรไป hybridize กบ probe ทตดฉลากไวแลวดวยสารกมมนตรงสหรอสารปลอดรงส เพอหาต าแหนงของโคโลนทมยนทสนใจตอไป competence สภาพของแบคทเรยชวงทเซลลสามารถจบกบดเอนเอภายนอก และดดเขาไปภายในเซลลได คอท าใหเกด transfromation นนเอง concatemer โครงสรางทเกดจากการเชอมตอโมเลกลของสารทมหลาย ๆ หนวย โดยตอไปในทศทางเดยวกนตลอด เชน ดเอนเอจากจโนมของฝาจแลมบดาทตอกนเปนสายยาวหลายหนวยในขณะทมการจ าลองโมเลกล concensus sequence ล าดบการเรยงตวของเบสภายในดเอนเอทพบบอยในบรเวณหนง ๆ เ มอเปรยบเทยบยนหลายยนหรอยนทมาจากสงมชวตหลายชนด cosmid พลาสมดทม cos site ของฝาจแลมบดาอยดวย เพอใหสามารถสอดใสชนดเอนเอทมขนาดใหญและบรรจลงในโปรตนหอหมของฝาจแลมบดาไดในหลอดทดลอง dalton หนวยของสารมคาเทากบมวลของอะตอมของไฮโดรเจน (1.67X10 -24 กรม) denaturation

AG 103 345

การสญเสยโครงสรางของธรรมชาตของสารโมเลกลใหญ โดยความรอน pH หรอสารเคมบางชนด มกจะท าใหสญเสยความสามารถในกจกรรมตาง ๆ ไปดวย เชน ดเอนเอเมอเกดเสยสภาพหมายถงการเปลยนจากเกลยวคเปนสายเดยว DNA cloning การเพมปรมาณชนดเอนเอจ าเพาะใหมปรมาณมากขน โดยการเพมปรมาณเซลลทมชนดเอนเอดงกลาวอย DNA library แหลงรวมของชนดเอนเอจากสงมชวตชนดหนงทตออยกบเวคเตอร และถายฝากลงในเซลลผรบทเหมาะสม และมขนาดเลกกวา genomic library DNA ligase เอนไซมทท าหนาทเชอมตอชนดเอนเอ โดยสรางพนธะฟอสโฟไดแอสเทอรระหวางดเอนเอทงสองชนนน electrophoresis วธแยกสารโดยอาศยการเคลอนทของโมเลกลทมประจในสารละลายในสนามไฟฟา โดยทวไปมกจะมตวกลางเพอเปนทยดเกาะของโมเลกลของสาร เชน กระดาษกรอง แผนเซลลโลสอะซเตท เจลทท าจากอะการ อะกาโรส หรอโพลอะครลาไมด เปนตน ซงเปนการแยกสารโดยอาศยความแตกตางของประจไฟฟา ขนาด และรปทรงของโมเลกล electroporation เทคนคการท าใหเยอหมเซลลเกดชอง เพอใหยอมรบชนดเอนเอจากภายนอกเขาไปไดดขน โดยใชกระแสไฟฟาเปนจงหวะทเหมาะสมใชไดกบเซลลสตว โพรโทพลาสตของพช หรอเซลลแบคทเรยกได

346 AG 103

enhancer ล าดบของนวคลโอไทด ซงสงเสรมกจกรรมการลอกรหสของยนทอยใกลกนนน enhancer จะท างานโดยเพม 11.11 บทสรปกลไกการสงถายยนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพช 1. ขนตอนการสงถายยนจาก Agrobacterium ไปยงเซลลพชมข นตอนดงนพชทเกดบาดแผลสงเคราะหสาร acetosyringone (AS) ซงเปนสารพวกฟโนลค (phenolic compound) และปลดปลอยออกมาจากบรเวณทมบาดแผล

2. สาร phenolic compound ไปกระตนผลตผลของยน chv ซงอยบนโครโมโซมของ Agrobacterium ท าให Agrobacterium เขาไปเกาะกบเซลลพชตรงบรเวณทมบาดแผล

3. โปรตนจากยน Vir A ท าหนาทเปน chemoreceptor จดจ า AS และไปกระตนให Vir G ท างาน

4. โปรตนจากยน Vir G ไปกระตน Vir อน ๆ ใหท างานและในทสดกระตน Vir D ใหท างาน

5.โปรตนจากยน Vir D ซงเปนเอนไซม endonuclease ตดพนธะฟอสโฟไดเอสเทอรทต าแหนงของ RB และ LB

6. เกด T-DNA สายเดยว หรอ t- strand 7. Vir gene จะท าหนาทสง t-strand เขาสเซลลพชซงจะไปแทรกอยในโครโมโซม

ของพช 8. เกดการแสดงออกของยนทอยในสวนของ T-DNA ซงจะท าใหเนอเยอพชมการ

แบงตวเพมจ านวนมากมายแลวกลายสภาพเปนเนอเยอทเปนปมปม (crown gall) และมการผลตสารออกโทปนออกมาก

9. สารออกโทปนจะไปเหนยวน าใหเกดการลอกรหสของยนท าหนาทสรางเอนไซมเพอใชสารนเปนแหลงพลงงาน

AG 103 347

ภาพท 11.6 แสดงขนตอนท Agrobacterium T-DNA เขาสเซลลพช

348 AG 103

(ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540)

ภาพท 11.7 แสดงการทดลองเลยงเนอเยอ Crow gall ในอาหารสงเคราะหซงไมม

AG 103 349

ฮอรโมนซงปรากฏวาเนอเยอ Crow gall นนสามารถเจรญเตบโตได

ภาพท 11.8 ขนตอนการถายยน EPSP สตนยาสบเพอใหตานทานตอยาก าจดวชพช

350 AG 103

(glyphosate) ภาพท 11.9 แสดงขนตอนการสรางเวคเตอรทมยนทสนใจใน Agrobacterium

AG 103 351

(ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540) ภาพท 11.10 สรปกระบวนการสงถายยนสพชโดย Agrobacterium

352 AG 103

(ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540)

AG 103 353

ภาพท 11.11 แสดงการสรางเวคเตอรทจะน ายน EPSP synthase เขาสพช (ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540) ภาพท 11.12 ขนตอนการสงถายยนสพชเพอใหเกดพชแปลงพนธ

354 AG 103

ภาพท 11.13 แสดงแผนท (A) Ti plasmid (B) Ri plasmid

AG 103 355

356 AG 103

ภาพท 11.14 แสดงการวธการท า southern bloting (ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540) ภาพท 11.15 การสงถายยนวธตรงโดยใช microprojectile bombartment

AG 103 357

(ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540) ภาพท 11.16 การสงถายยนวธตรงโดยใช microprojectile (ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540)

358 AG 103

ภาพท 11.17 การสงถายยนวธตรงโดยใช microinjection (ดดแปลงจาก สมนทพย บนนาค, 2540)

AG 103 359

แบบประเมนผลทายบท จงเลอกค าตอบทถกตองเพยงขอเดยว 1. พชหรอสตวทไดจากการดดแปลงหรอตดตอสารพนธกรรมเรยกวา ? 1) GMOs 2) DMOs

3) GMS 4) GTS 2.วธการปรบปรงพนธพชทนยมใชกนในปจจบนคอขอใด ?

1) selection 2) hybridization 3) combination 4) ขอ 1 และขอ 2 ถกตอง

3. พาหะทน ายนเขาสเซลลพชนนนยมใชสงมชวตชนดใด ? 1) แบคทเรย 2) พช 3) สตว 4) โปรโตซว

4. เอนไซมทใชในการตดล าดบเบสคอ ? 1) ligase enzyme 2) restriction enzyme 3) recombinant 4) complementary

5. ในปจจบนนพชชนดใดทไดท าการตดแตงสารพนธกรรมส าเรจแลว 1) ยาสบตานทานไวรส TMV 2) มะเขอเทศตานทานสาร glyphosate 3) พทเนย 4) ถกตองทกขอ

เฉลยแบบประเมนผล 1. 1) 2. 4) 3. 1) 4. 2) 5. 4)

360 AG 103

*****************************************