Identification of Novel Genes Involved in Long-Chain n-Alkane Degradation by Acinetobacter sp. Strain D

SM 17874

APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY May 2007

• 长链烷烃 , 主链长度大于 20 个碳原子，是在原油的处理，运输等过程中主要的环境污染物。

• 已经鉴定出一些细菌产生的酶能在有氧条件下降解烷烃，如：细胞色素 P450 ，单氧化酶，双氧化酶等等。

• 在烷烃的降解过程中最为突出的是 Pseudomonas putida GPo1 (ATCC2934 ）中的 Alk 系统。该系统能将烷烃经 β- 氧化途径降解为相对应的醇、醛、羧酸和乙酰辅酶 A 。

• 多数已知的降解烷烃的系统主要以降解短链烷烃为主。仅一少部分已知的酶与降解长链烷烃相关。

• 不动杆菌属（ Acinetobacter ）的细菌 , 能利用主链长度从 10 到 44 个碳原子的烷烃。其中 A.sp. strain DSM 17874 能以 C10 到 C40 的长链烷烃为唯一碳原生长。

• 从 Acinetobacter 中鉴定了两个与 alkB 旁系同源的基因， alkMa 和 alkMb, 这两个基因均表现为涉及降解主链碳原子数为 20的长链烷烃。

• almA, 与降解 32 碳甚至更长的长链烷烃相关。

实验中所用到的菌株、质粒、启动子

构建 A.sp.DSM 17874 转座突变文库

• pLOFKm 质粒：带有 min-Tn10 转位子、卡那霉素抗性标记 , 结合载体的起始区 oriT ， Tn10 转位子带有 IPTG 诱导的启动子。该质粒在 A.sp.DSM 17874 中不能复制，主要用于构建转座突变文库。

• 将带有 pLOFKm 质粒的 Escherichia coli S17-1 (pir)/pLOFKm 和 A.sp.DSM 17874 在抗性选择压力下共同培养并用 IPTG 诱导转座酶的产生，使 pLOFKm 质粒转入 A.sp.DSM 17874 中。

• 构建的 A.sp. DSM 17874 转座突变文库包含有近 6,800 种 A.sp. DSM 17874 转座突变子。

高通量筛选 A.sp. DSM 17874 转座突变文库中不能降解长链烷烃的突变子

• 在各突变株中加入 C32 烷烃，以碘硝基四唑紫 (INT) 侦测各突变株的生长情况（ INT 的减少与细胞呼吸强度成正比）。筛选突变株中不能利用 C3

2 烷烃的突变子。

• 为了进一步确认筛选的结果，当将筛选到的突变子加入到以醋酸钠或 C16 烷烃为唯一碳原的培养基中，各突变子均表现为野生型水平的生长速率。

• 经筛选得到 34 个突变子，并鉴定了 16 个假定与降解长链烷烃相关的基因。

almA 基因在其它能降解长链烷烃的Acinetobacter 属的菌中的定位

• 根据在 A.sp. DSM 17874 突变菌基因组中与转座子相接的区域，以 almA1 和 almA2为引物进行反向 PCR 扩增得到 Acinetobacter 属中 A.sp. strain M-1 和 A.sp. strain RAG-1 的 almA 同源基因。

• 而 Acinetobacter baylyi ADP1 ACIAD3192 的基因序列直接从 GenBank 中获得。

• A.sp DSM 17874 almA 编码区与 A. baylyi ADP1 的 ACIAD3192 表现出 74.8% 的序列同源性。而在基因产物 AlmA和 ACIAD3192 中，同源性为 76.7% 。

• 在 A.sp. strain DSM 17874 和 A.sp. strain RAG-1 中的 almA 和 orf1 核算序列完全相同。

• A.sp. strain DSM 17874 和 A.sp. strain M-1 在核算序列上 almA 有 85.7% 的同源性， orf1 则有 75.5% 。

almA 在 Acinetobacter 属的不同菌中的区域

构建 A.sp.DSM 17874 的 almA 和 orf1 的缺失突变菌株 MAV1 和 BKO2

• 构建自杀性质粒 pLAL50 和 pBKO2

• 以 A.sp. DSM 17874 的 DNA 为模版， almA3 和 almA4 为引物扩增 almA ； orf1:1 和 orf1:2 为引物扩增orf1 ，将 almA 扩增产物酶切，取约 3kb 的片断连接到 pSOK804 上；将 orf1 扩增产物酶切，将酶切的约3kb 的片断连接到 pSOK201 上。

• 自杀性质粒 pLAL50 和 pBKO2 先以热转型法转入 E. coli S17-1 (pir) 中，随后通过菌体间的接合作用转入A.sp DSM 17874 中。以 Southern 印记法检测 almA 和 orf1 被消除的情况。

almA 基因在降解长链烷烃中的效应 A.sp. DSM 17874 ( 野生型 ; ○) A.sp. strain MAV1 (almA消除突变 ; ▽)

C20 C24

C36C32

orf1 基因的效应• 在突变株 BKO2 中研究 orf1 是否在长链烷

烃代谢中起作用的过程中，发现在以 C20 、C24 、 C32 、和 C36 为唯一碳原的条件下生长情况与野生型相似。

• 这一结果表明， orf1 与长链烷烃的代谢并没有多大关系。

构建 pALMA1 和 pACIAD1 质粒，用作回复突变的研究

• 以 A.sp. DSM 17874 的 DNA 为模版， almA5 和 almA6 为引物扩增 almA ，将 almA扩增产物酶切并连接到 pDLM02.1 载体上，构建 pALMA1 质粒。

• 以 A. baylyi ADP1 的 ACIAD3192 为模版，ACIAD1 和 ACIAD2 为引物扩增，扩增产物酶切并连接到 pDLM02.1 载体上，构建pACIAD1 质粒。

almA 回复突变的活力测定

A.sp. strain DSM 17874/pDLM02.1 (○) A.sp. strain MAV1/pDLM02.1 (□),A.sp. strain MAV1/pALMA1 (▽) A.sp. strain MAV1/pACIAD1 (△)

C32 C36