Adresa společnosti: VŠCHT v Praze, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 220 443 151, fax: 233 334 769, e-mail:Danka.Pokorna@vscht.cz, IČO 00570397, číslo účtu: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52,

SWIFT CODE: COMBCZTPP

BIOP R S P E C T

Redakční rada

RNDr. Tomislav Barth, DrSc.ÚOCHB AVČR, Flemingovo n. 2, 166 10 Praha 6(Editor)

RNDr. Milan Fránek, DrSc.Výzkumný ústav veterinárního lékařstvíHudcova 70, 621 32 Brno

Ing. Petra Lipovová, Ph.D.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor)

Prof. Ing. Jan Káš, DrSc.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6

Prof. Ing. Ladislav Fukal, CSc.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor in Chief)

Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D.VŠCHT, Technická 3, 166 28 Praha 6(Editor)

RNDr. Vladimír ValaIvax, Ostravská 29, 747 70 Opava

BULLETIN

BIOTECHNOLOGICKÉ

SPOLEČNOSTI

zakládajícího člena Českého svazuvědeckotechnických společností

(ČSVTS) a

člena „European Federation of Biotechnology“ (EFB)

Sedmnáctý ročníkČíslo 2/2007

http://bts.vscht.cz

Society address: ICT, Technická 3, 166 28 Praha 6, tel.: 420-220 443 151, fax: 420-233 334 769, e-mail: danka.pokorna@vscht.cz, IČO 00570397, account No.: 19534-061/0100 Komerční banka Praha 6, Dejvická 52,

SWIFT CODE: COMBCZTPP

BIOP R S P E C T

research and practice in our biotechnology. The Bulletin should facilitate the exchange andtargeted delivery of information. In each issuethere will be advertisements of products suchas chemicals, diagnostics, equipment andapparatus, which have already appeared on theCzech and Slovak market, or are projectedenter it. Services, free R&D or productionfacilities can also be advertised. The editorialboard, together with the executive commiteeof the Biotechnology Society, hope that maybesome information published in the Bulletin, or some new contacts based on it, will givebirth to new cooperations with domestic or foreign research teams, to collaborations,joint ventures or strategic alliances providingaccess to expertise and financing in interna-tional markets.

The editorial board invites all of You, whoare involved in the field called biotechnology,and who are seeking contacts in Czech andSlovak Republic, to advertise in the BulletinBIOPROSPECT, which is mailed directly to more than one and a half thousand Czechand Slovak biotechnologists.

For more information contact the editorialboard or directly:Ladislav Fukal, Ph.D. (editor in chief)ICT, Technická 3166 10 Prague 6, Czech RepublicPhone +420 220 445 137e-mail: fukall@vscht.cz

BULLETIN OF CZECHBIOTECHNOLOGY

SOCIETY

member of European Federationof Biotechnology

SUMMARY

Bioprospect, the bulletin of the Biotechnolo-gy Society is a journal intended to inform thesociety members about the most recent deve-lopments in this field. The bulletin should sup-ply the vitaly important knowledge directly to those who need it and to those who are ableto use it properly. In accordance with the rulesof the Society, the Bulletin also deals with boththeoretical and practical questions of biotech-nology. Articles will be published informingabout the newest theoretical findings, but manyplanned papers are devoted to fully practicaltopics. In Czech and Slovak Republic there is a growing gap between basic research and pro-duction. It is extremely important to reverse as soon as possible the process of further open-ing of the scissors, and we hope the Bulletinwill help in this struggle by promoting both

17th VolumeNo. 2/2007

http://bts.vscht.cz

předpokládáme, že Vás druhé číslo našeho letošního„Bioprospectu“ zastihne právě před dovolenými, takžetentokrát budete mít čas si v klidu přečíst všechny člán-ky. Snažili jsme se Vám připravit pestrou paletu zajíma-vých témat, která se Vám budou určitě líbit a možnáVás budou inspirovat k napsání něčeho zajímavéhonebo alespoň nás vyzvete ke zpracování tématu, kteréby Vás zajímalo. V tomto čísle si všímáme biologic-kých palivových článků, nahlédneme do problematiky tvorby biofilmů a nezapomeneme ani na bioreme-diační tematiku, tentokráte na možnosti odstraňováníanilinu z odpadních vod. Již tradičně nesmí chyběttéma z oblasti mediciny, které věnujeme mozkovýmnádorům a možnosti jejich léčby.

Rád bych Vám připoměl, že důležité akce uvádímev rubrice „aktuálně“ na našich webových stránkáchhttp://bts.vscht.cz. Ze zahraničních akcí je stále aktuální 13. Evropský biotechnologický kongres,který organizuje EFB ve dnech 17. – 19.září 2007 v Bar-celoně. Bližší informace naleznete na webových stránkách http://www.ecb13.eu. Blíží se také 13. International Biotechnology Symposium – IBS2008, sponzorované IUPACem, které se bude konat ve dnech 12. – 17. října 2008 v Dalianu, Čínská lido-vá republika. Druhý cirkulář byl zveřejněn 1. června2007 a abstrakta mají být zaslána do 30. listopadu2007. Dále si Vás dovolujeme pozvat na již 4th Swiss-Czech Symposium, které se bude konat 22. – 23. 5.2008 ve Wadenswill (u Curychu). Hlavním tématemsymposia bude “ Biopharmaceuticals: why from yeast”,ale symposium je otevřeno i pro další témata. Zvemek účasti jak jednotlivce, tak především české biotech-nologické firmy. Po dalších dvou létech (2010) počítá-me s 5. česko-švýcarským symposiem v České repub-

lice. V příštím čísle Bioprospectu Vám přinesemepodrobnější informace.

16. 5. 2007 proběhl na VŠCHT, ve spolupráci s FPBTVŠCHT a Ministerstvem životního prostředí, seminářo geneticky modifikovaných organismech zaměře-ný především na nezemědělské aplikace. Součástísemináře byla i prezentace biotechnologického portá-lu www.gate2biotech.cz. Počítáme, že přibližně vestejnou dobu v příštím roce zoorganizujeme dalšíseminář týkající se GMO. Semináře o zemědělskétematice GMO bude nadále organizovat Ministerstvozemědělství ČR ve spolupráci s Českou zemědělskouuniverzitou a my Vás budeme i o těchto akcích včasinformovat.

S potěšením Vám oznamujeme, že Jihomoravskéinovační centrum (JIC) se sídlem v Brně vydalo začát-kem minulého měsíce Czech Biotech Report 2007, tentokrát jako CD-ROM. Toto CD se již nebude ko-merčně prodávat, ale bude volně šířeno tak, abyposloužilo k propagaci české biotechnologie. Na adre-se http://www.enviweb.cz/cbr2007.zip je možné sistáhnout první verzi CD. V současné době se pracujena získání feedbacku na tuto první verzi. Získané připo-mínky se po vyhodnocení zapracují do finální verzeCD. Pracovníci JIC mají zájem zejména o připomínkyke grafickému zpracování, přehlednosti a funkčnostizprávy.

Závěrem Vám všem přeji přijemné prožití letníchdnů, hezké dovolené a těším se na další spoluprácis Vámi,

VášJan Káš

ÚVODEM

17

Vážení přátelé,

18

BIOLOGICKÉ PALIVOVÉ ČLÁNKYŠimon BednářÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

ÚvodPalivový článek můžeme definovat jako elektroche-

mické zařízení uskutečňující přímou přeměnu chemic-ké energie na stejnosměrný elektrický proud. Tato pře-měna se děje katalytickými reakcemi na elektrodách.Svou činností se podobá galvanickým článkům, na roz-díl od nich však vyvíjí elektrickou energii nepřetržitědíky plynulému přísunu paliva k anodě a okysličovadlake katodě.

Oproti současným způsobům výroby elektrické ener-gie mají palivové články řadu výhod, zejména vyššíúčinnost a ekologičnost celého procesu. Při využívánífosilních paliv se zpravidla provádí jejich spalování,vzniklé teplo je potom konvertováno na mechanickounebo elektrickou energii. Tento nepřímý postup výrobyelektřiny je provázen řadou ztrát a má tedy nízkou účin-nost. Navíc značně zatěžuje životní prostředí tvorbouškodlivých emisí a skleníkových plynů.

Vodíkový palivový článekPalivem do nejběžnějších palivových článků může být

vodík v kapalném nebo plynném stavu, nebo mohoubýt používána nepřímá, vodík obsahující paliva, jakouhlovodíky (methan) nebo alkoholy (methanol, etha-nol), ze kterých se vodík uvolňuje reformovacím proce-sem. Finálním produktem palivového článku je voda,v případě využití uhlíkatých zdrojů vzniká navíc CO2.

Nejvíce využívané jsou palivové články na bázi mem-brány propouštějící pouze kladně nabité ionty tzv.PEMFC („Proton Exchange Membrane Fuel Cell“), kteráje schopna práce i za nízkých teplot (kolem 80 °C).V takovém článku je vodík plynule přiváděn na platino-vou elektrodu – anodu, která katalyzuje jeho rozklad naprotony a volné elektrony. Protony difundují membrá-nou ke katodě, zatímco elektrony přecházejí do elek-trického obvodu, kde konají práci. Na katodě (kladnéelektrodě) reagují kyslíkové molekuly s vodíkovýmiprotony za účasti elektronů z vnějšího elektrickéhoobvodu. Jako odpadní produkt celé reakce se tedyuvolňuje voda:

anodová reakce: 2H2 � 4H+ + 4e-

katodová reakce: O2 + 4H++ 4e- � 2H2O

sumární rovnice: O2 + 2H2 � 2H2O

Typický vodíkový palivový článek produkuje napětímenší než 1 volt, pro jejich účinné využití ve většiněelektrických spotřebičů je tedy nutné jejich sériovézapojení.

Jakkoli je ale produkce energie ve vodíkovém článkuekologická, vzhledem k tomu, že plynný vodík nemá nazemi své přirozené zásoby, může sloužit pouze jakopřenašeč energie, ne jako její zdroj. K výrobě velmičistého vodíků se používá elektrolýza, v některýchtypech článků ale může sloužit i vodík získaný rafinač-ními procesy ze zemního plynu, uhlí nebo biomasy.

Takový způsob výroby energie je nejen ekologičtější,ale také nesrovnatelně účinnější. V tepelných elektrár-nách se energie získává spalováním uhlí v kotli, vznikléteplo je poté využito k ohřevu vody. Horká pára roztáčíturbínu a ta zase generátor sloužící k výrobě elektrickéenergie. Když pára odevzdá využitelnou energii, kon-denzuje v kondenzátoru a vrací se zpět do kotle. Přivyužití tzv. „Clean Coal Technology“ se uhlí nejprvezplyní na syntetický plyn, jehož hlavními složkami jsouvodík a oxid uhelnatý. Vodík se z plynu oddělí a přivádído palivových článků, v nichž spalováním s kyslíkemvzniká elektrický proud a vodní pára.

Biologické palivové článkySpeciální typ palivových článků představují články,

které využívají enzymy nebo celé mikroorganismymísto anorganického katalyzátoru. Poskytovaný výkonje sice nižší, výzkum se ale v současnosti soustředíspíše na jejich využití pro některé speciální aplikacejako jsou biosenzory, medicínské implantáty, mikročipya další1. Můžeme si představit třeba kardiostimulátor,který by nepotřeboval žádný vnější zdroj energie, pro-tože by ho poháněl článek napájený glukosou přítom-nou v krevním řečišti.

Biokatalyzátory v takovém článku mohou mít dvojíúlohu. U primárních článků je enzym či mikroorganis-mus katalyzátorem redoxní reakce a podílí se tak přímona tvorbě elektřiny. V sekundárních článcích generujíbiokatalyzátory ze složitějších substrátů jednoduchésloučeniny jako je vodík či metan. Tyto molekuly jsoupotom oxidovány prostřednictvím anorganické katalýzyna povrchu elektrod.

Enzymatické článkyPalivové články oxidující vodík zpravidla využívají

vysoce účinné platinové elektrody. Tento kov je ale rela-tivně vzácný, a proto také velmi drahý. Navíc nečistoty,zejména oxid uhelnatý, které bývají běžně přítomny vevodíkovém palivu, mohou způsobit její ireversibilníinaktivaci. Snahou vědců proto bylo nahradit platino-vou elektrodu jiným katalyzátorem. Srovnatelnou účin-nost přitom poskytl enzym hydrogenasa, který máv katalytickém místě atomy niklu nebo železa. Bylyproto sestrojeny enzymatické články obsahující imobi-

lizovanou hydrogenasu na anodě a lakasu na katodě2.Přitom hydrogenasa katalyzovala oxidaci vodíku a ode-vzdávala elektrony přímo na elektrodu, zatímco lakasakatalyzovala čtyřelektronovou redukci kyslíku:

hydrogenasa: H2 � 2H+ + 2e-

lakasa: O2 + 4H+ + 4e- � 2H2O

Přímý přenos elektronů mezi enzymem a povrchemelektrody („Direct Electron Transfer“, DET) byl pozoro-ván pouze u nemnoha dalších proteinů (cytochrom c,některé peroxidasy). Často se proto při konstrukci enzy-matických článků používají různé mediátory, fungujícíjako elektronové transportéry mezi enzymem a elektro-dou. I když představují další krok v redoxním řetězcipřenášejícím elektrony z molekuly paliva na elektrodu,zpravidla značně zvyšují efektivitu celého procesu3. Většina používaných mediátorů je však dosti draháa toxická.

Například pro enzymatickou oxidaci glukosy byl pou-žit N-dimethyl-7-amino-1,2-benzophenoxaziniový kati-on (MB+)4. V takovém článku na anodě imobilizovanáglukosaoxidasa katalyzuje přeměnu glukosy na gluko-novou kyselinu za současné redukce své flavinové pro-sthetické skupiny (FAD). Ta je reoxidována elektrono-vým mediátorem a vzniklý MBH2 předává elektrony na

elektrodu za současného uvolnění vodíkových protonů.Jinou strategii při řešení stejného problému předsta-

vuje navázání glukosaoxidasy na pyrolochinolinchinon(PQQ, Obr.2) kovalentně vázaný na povrch zlaté elekt-rody modifikované cystaminem.5 Na druhé elektroděmůže být imobilizována lakasa přenášející elektrony nakyslík, mikroperoxidasa redukující peroxid vodíku nebocytochrom-c v kombinaci s cytochrom-c-oxidasou. Bylsestrojen i podobný článek využívající laktát jakoredukční činidlo. Na anodu modifikovanou PQQ-NAD+

byla přitom nejdříve pomocí bioafinitních interakcínavázána laktátdehydrogenasa (LDH), a potom prokří-žena pomocí glutaraldehydu6.

Životnost biologických palivových článků je limitová-na řadou faktorů. Asi nejdůležitějším z nich je stabilitavázaného enzymu. Většina zkonstruovaných enzymatic-kých článků totiž vydržela pracovat pouze několik dní.Významným faktorem, který může zvýšit celkovu stabi-litu enzymu, je způsob imobilizace. Nejjednoduššímzpůsobem je fyzikální adsorpce na vodivé částice jakoje grafitový prášek nebo uhlíková čerň. Další možnostíje zachycení biokatalyzátoru v polymerní matrici nebokovalentní vazba enzymu na modifikovanou elektrodu.Při pokusech se zachycením hydrogenasy do Nafiono-vé membrány modifikované tetrabutylammoniumbro-midem dosáhla životnost článku 45 dní. Přitom polo-čas inaktivace hydrogenasy ve vodném roztoku bylpouhých 7-8 hodin7.

Mikrobiální palivové článkyVyužití celých mikroorganismů v palivovém článku

má oproti samotným proteinům řadu výhod. Nemusíse izolovat potřebný enzym a odpadá i nutnost zacho-vávat prostředí, ve kterém má optimální aktivitu a sta-bilitu. Mikroorganismy se často využívají v sekundár-ních článcích, kde produkují sloučeniny, které jsounásledně oxidovány na anodě. Vzhledem k tomu jemožné fyzicky oddělit vlastní bioreaktor od elektrodo-vého prostoru a udržovat tak v každé části odlišné pod-mínky. Typickým příkladem takového článku je bioreak-tor produkující plynný vodík spojený s PEMFC.

Články, ve kterých není bioreaktor oddělený od elek-trodového prostoru, jsou limitovány podmínkami nut-nými pro život mikroorganismů. Zpravidla se využíváfermentačního metabolismu bakterií rodu Clostridium,které produkují velké množství plynného vodíku.V takovém článku byly bakterie zachyceny v polyakryla-midové matrici obalující elektrodu, takže generovanývodík mohl být ihned oxidován. Další výhodou takové-ho uspořádání je možnost využití i dalších produktůfermentačního metabolismu jako sekundárního paliva.Například pyruvát může být alternativně oxidován pyru-vát-formiátlyasou na formiát, který se dále rozkládá naanodě:

v bakterii: CH3-CO-COO- � HCOO-

na anodě: HCOO- � CO2+ H+ + 2e-

Kromě plynného vodíku je možné využít k elektrodo-vé reakci také redukované sirné sloučeniny jako je sul-

Obr. 1. Schéma enzymatického článku s přímým přenosemelektronů

Obr. 2. Chemický vzorec PQQ

19

20

fidový nebo siřičitanový anion. Tyto sloučeniny jsoucharakteristickým produktem anaerobního metabolis-mu bakterií rodu Desulfovibrio, které žijí v prostředíbohatém na organické sloučeniny a využívají síranyjako konečného akceptoru elektronů. V experimentál-ním článku byly použity bakterie rodu Desulfovibriodesulfuricans, které oxidovaly laktát a produkovaly při-tom sulfan pro oxidaci na anodě, zatímco na katodě seredukoval kyslík8.

Reakce katalyzovaná Desulfovibrio desulfuricans:

4CH3-CH(OH)-COO- + SO42- � S2- + 4H2O + 4CH3-CO-COO-

anodová reakce: S2- + 4H2O � SO42- + 8H+ + 8e- nebo

S2- + 3H2O � S2O32- + 6H+ + 6e-

katodová reakce: O2 + 4H+ + 4e- � 2H2O

Tyto bakterie jsou schopny využívat jako zdroj energiei jiné na sacharidy bohaté substráty. Ve článcích, kdezisk energie nebyl primárním cílem, sloužila jako sub-strát dokonce i odpadní voda.

Odlišným přístupem při konstrukci mikrobiálníhopalivového článku představuje použití elektronovýchmediátorů schopných přenášet elektrony z mikroorga-nismu na elektrodu. Bylo vyzkoušeno mnoho organic-kých i organokovových sloučenin, které by mohly slou-

žit jako elektronové přenašeče (Obr.3). Tyto látky bypřitom neměly být mikrobiálně odbouratelné, měly bysnadno pronikat buněčnou membránou a zároveň byneměly být pro buňku toxické.

Podstatou funkce elektronových mediátorů je schop-nost proniknout do plasmatické membrány a vázat zdeelektrony z dýchacího řetězce. V redukované formějsou poté uvolněny do média a reoxidovány na anodě.Současně se do prostředí uvolňují vodíkové protony,které difundují přes PEM do katodového prostoru, kdespolečně s elektrony a kyslíkem vytvářejí molekulyvody9. Jednou z podmínek úspěchu tohoto typu článkuje eliminace kyslíku v anodovém prostoru. Kyslík je totižzpravidla schopen reagovat s redukovanou formoumediátoru a snižovat tak účinnost procesu.

Novějším přístupem je využití bakterií z čeledi Geo-bacteraceae, které žijí v oblastech anoxických moř-ských sedimentů. Bylo prokázáno, že bakterie druhuGeobacter mohou oxidovat organické sloučeniny s vyu-žitím elektrody jako pevného akceptoru elektronů. Jsoutedy schopny realizovat přímý přenos elektronů naelektrodu bez použití často drahého a toxického medi-átoru. Kromě nižší ceny zefektivňuje tento přístup celýproces a zvyšuje životnost článku10,11.

ZávěrSouhrnem lze říci, že biologické palivové články před-

stavují perspektivní, životní prostředí nezatěžující bio-technologii. Jejich vysoká účinnost, ekologický provozi schopnost využívat odpadních produktů průmyslu jezvýhodňují oproti současným způsobům výroby elek-trické energie. I když mají oproti článkům založeným na anorganických katalyzátorech nižší výkon, pro řaduaplikacích bez vysokých energetických nároků budouideálním řešením.

thionin methylenová modř

Literatura1. Kim J., Hongfei J., Wang P.: Biotechnol. Adv. 24,

296, (2006).2. Varfolomeev S. D., Kurochkin I. N., Yaropolov A.I.:

Biosens. Bioelectron. 11, 863, (1996).3. Park D.H., Kim S.K., Shin I.H., Jeong Y.J.: Biotechnol.

Letters 22, 1301, (2000).4. Persson B., Gorton L., et al.: Enzyme Microbiol. Tech-

nol. 7, 549 (1985).5. Willner I., Katz E., Patolsky F., Bückmann A.F.: J.

Chem. Soc. 2, 1817 (1998).6. Katz E., Bardea A., Willner I., et al.: Biosens. Bioelec-

tron. 13, 741 (1998).

7. Akers N.L., Moore C.M., Minteer S.D.: Electrochim.Acta 50, 2521 (2005).

8. Habermann W., Pommer E.H.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 128 (1991).

9. Allen R.M., Bennetto H.P.: Appl. Microbiol. Biotech-nol. 39, 27 (1993).

10. Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R.:Science 295, 483 (2002).

11. Bond D.R. , Lovley D.R.: Appl. Microbiol. Biotech-nol. 69, 1548 (2003).

Obr. 3 Příklady elektronových mediátorů

21

METODY ODSTRAŇOVÁNÍ ANILINU Z ODPADNÍCH VODJitka HrdinováÚstav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha

Anilin je široce rozšířený polutant životního prostředí.Kvůli jeho toxicitě, persistenci a hojné aplikaci jako sou-části nejrůznějších materiálů a chemikálií je považovánza vzrůstající hrozbu jak pro životní prostředí tak prolidské zdraví. V ČR je vyráběn redukcí nitrobenzenuvodíkem (BorsodChem MCHZ s.r.o. Ostrava). Výrobníblok je tvořen technologicky navazujícími výrobamivodíku, koncentrované kyseliny dusičné, nitrobenzenua anilinu. Většina anilinu je exportována mimo ČR,na tuzemském trhu se spotřebovává pouze asi 1 %z celkové produkce1. Je používán v gumárenském prů-myslu při výrobě syntetického kaučuku a gumy a jakosoučást urychlovačů vulkanizace (difenylguanidinua cyklohexylaminu – LZ Draslovka a.s. Kolín), v che-mickém průmyslu k výrobě herbicidů, fungicidů, zvířecích repelentů, defoliantů, jako součást vývojek přivyvolávání černobílé fotografie2 a také ve farmaceutic-kém průmyslu k výrobě antipyrinu, antifebrinu a aceta-nilidu (antipyretikum, analgetikum)1. Je také vstupnísurovinou pro výrobu organických látek – barviv1,3

(4 typy barviv: azo-, trifenylmethanová, antrachinonováa safraniny) a polotovarů (Aliachem a.s. o.z. SynthesiaPardubice, Spolek pro chemickou a hutní výrobu, a.s.Ústí nad Labem)1. Kontaminace, zvláště vodních ekosystémů, je možná odpadními vodami právě z těch-to provozů.

V posledních letech se neustále zvyšuje zájem stát-ních orgánů o problematiku kontaminace anilinema jeho odstraňování ze životního prostředí, předevšímz vodních toků. Anilin však dosud není součástí sezna-mů nebezpečných nebo prioritních látek pro vodní pro-středí. Hlavním legislativním nástrojem v ČR upravují-cím zastoupení anilinu ve vodním prostředí je nařízenívlády č. 61/2003 Sb., o ukazatelích a hodnotách pří-pustného znečištění povrchových vod a odpadních vod,náležitostech povolení k vypouštění odpadních voddo vod povrchových a do kanalizací a o citlivých oblas-tech, které stanovuje imisní standardy pro obsah anili-nu v povrchových vodách3. Existuje mnoho programůa opatření týkajících se snížení množství anilinu a dal-ších polutantů ve vodách. Zde jsou uvedeny jen ně-které z nich: Legislativní opatření – Zákon č. 254/2001Sb., o vodách, v platném znění, Nařízení vládyč. 61/2003 Sb., o ukazatelích a hodnotách přípustnéhoznečištění vod4, Mezinárodní spolupráce v oblastiochrany vod – Mezinárodní komise pro ochranu Labe(MKOL), Národní program čistší produkce a ProgramResponsible Care3.

Metody odstranění anilinu z vodného prostředíRozpuštěný anilin se silně adsorbuje na organickou

hmotu, která modifikuje jeho rozpustnost a pohyblivostv podzemní vodě. Anilin adsorbovaný na huminové

materiály je náchylnější k oxidaci. Produkty jsou např.azobenzen, azoxybenzen, acetanilid a další. Na udrženíanilinu na půdních částicích se podílí kapilární tlak,Londonovy disperzní síly, výměna iontů atd. Anilinvázaný nekovalentními vazbami může prosakovat dopodzemní vody nebo tvořit kovalentní vazby mezisebou různými kondenzačními a oxidačními reakceminebo reakcemi s půdními částicemi. Další reakcemohou vést k tvorbě nehydrolyzovatelných vazeb5.Znalost mechanismů těchto interakcí je důležitá provývoj funkčních remediačních procesů.

Pro odstranění organických polutantů včetně anilinubyla vyvinuta celá řada fyzikálních, chemických a biolo-gických technologií. Avšak všechny tyto technologiejsou limitovány efektivitou, aplikovatelností, ale přede-vším náklady. Proto je snaha vyvíjet další nové a efek-tivnější postupy k odstranění těchto nežádoucíchlátek6.

a) fyzikální a chemické metodyAtraktivní způsob čištění odpadních vod, které obsa-

hují pevné nebo kapalné látky, nabízí elektrochemickémetody. Jednou z nich je destrukce anilinu elektroche-mickou oxidací na mediátoru z Ce4+ nebo Co3+, kde jeanilin přeměněn až na CO2. Tato metoda se nazývá

„zprostředkovaná elektrochemická oxidace“ (MED).Během tohoto procesu se organické látky oxidujía katalyzátor (mediátor) se redukuje. Jeho reoxidaceprobíhá na anodě. Při oxidaci anilinu může docházetk polymeračním reakcím, při nichž se tvoří velmi stabil-ní polymer polyanilin. Proto bývá kompletní přeměnaanilinu na CO2 složitější. K tomuto jevu může docházet

např. při oxidaci na PbO2 elektrodě, to se pak vnáší do

životního prostředí jiné polutanty. K efektivnější oxidaci anilinu se používají mediátory (redoxní páryCe4+/ Ce3+ nebo Co3+/ Co2+ s poměrně vysokým redox-ním potenciálem). Zprostředkovaná oxidace anilinuprobíhá ve více krocích v elektrodovém systému Pt a RuO2-Ti, všechny vznikající intermediáty musí mít

nižší oxidační potenciál než mediátorové redoxní páry7.Jako další metodu lze zmínit degradaci anilinu pomocíultrazvuku. Degradace probíhá v roztoku nasycenémkyslíkem. Ultrazvuk způsobuje velmi rychlou degradacichemických kontaminantů ve vodném prostředí. Che-mický efekt ultrazvuku je způsoben akustickou kavitací,tj. tvorba, růst a implozivní prasknutí bublin v kapalině.Praskání bublin vyvolá lokálně zvýšení teploty, tlakua elektrického náboje, při čemž se vytváří vysoké rych-losti zahřívaní a chlazení. Vodní pára a kyslík proděláva-jí termální disociaci na radikály H•, HO• a HOO•. Účin-nost degradace kontaminantů ve vodě je zvýšena přivyšších frekvencích. Rychlost degradace je spojenas fyzikálními a chemickými vlastnostmi cílové mole-

22

kuly. U látek s ionizovatelnou funkční skupinou hrajevelkou roli hodnota pH. Nejlepších výsledků při degra-daci anilinu je dosahováno v alkalické oblasti8. Při jehoodstraňování z odpadní vody je také možné použítfotokatalytických a fotochemických metod, kdy docházík rychlému odstranění anilinu, ale na jeho úplnoumineralizaci je třeba delší doba. Oxidace anilinu zdeprobíhá působením hydroxylových radikálů v přítom-nosti záření a vhodných chemických činidel (H2O2,

Fentonovo činidlo – FeSO4/H2O2, ozón). Rychlostní

konstanta oxidace hydroxylovými radikály je 109krátvyšší než u běžných oxidací. Fotokatalýza může být takéekonomický proces pro transformaci komplexníchorganických molekul na jednodušší, netoxické a proživotní prostřední neškodné látky, ideálně na CO2

a H2O, použitím vhodného záření. Tato metoda využívá

sluneční záření a je velmi slibná pro nejrůznější aplika-ce, kde je použití běžných metod obtížné nebo kde je nejdůležitější jednoduchost. Fotokatalytická reakce zde probíhá na povrchu TiO2, který má zde funkci kata-

lyzátoru, a působením slunečního záření. Fotochemic-ká reakce probíhala v přítomnosti H2O2 a slunečního

záření a byla o 50 % méně účinná než fotochemická9.

b) biologické metodyV poslední době jsou stále více uplatňovány biore-

mediační technologie, jelikož jsou levnější a šetrnějšík životnímu prostředí10. Kovalentně vázaný anilin namatrici je štěpen aerobně i anaerobně velmi pomalu,pokud je vůbec degradován. Nejslibnější při procesuremediace se zdá být také použití původních methano-genních mikroorganismů, které jsou schopny pomaluuvolňovat anilin vázaný na půdní částice. Degradacemůže být urychlena změnou pH půdy z kyseléhona neutrální. Při neutralizaci půdy byla pozorována zvýšená produkce volného anilinu a methanu5. Rovněžse zkoumá možnost fytoremediace anilinu11.

Mechanismus biodegradace anilinuRozklad organických látek může probíhat za nepří-

tomnosti nebo přítomnosti molekulárního kyslíku12.Biodegradace anilinu se účastní především bakteriálníkmeny díky jejich širokému metabolickému vybavení.Byly však nalezeny i některé druhy nižších hub. Zástup-ci anilin-degradujících mikroorganismů jsou uvedenyv Tab. 1.

Aerobní metabolismusAromatické substituované látky mají mírně zvýšenou

rezistenci k biodegradaci. To je způsobeno zavedenímskupiny (většinou elektronegativní) do aromatickéhojádra, která snižuje reaktivitu rezonančních strukturs kyslíkem a zabraňuje aktivaci nebo rozrušení uhlovo-díkového kruhu (tj. počátečních kroků biodegradacearomátů). Aerobní bakterie destabilizují tento systémpomocí reakce katalyzované dioxygenasou. Vznikají takkruhy se 2 hydroxylovými skupinami v poloze ortho-nebo para-. Metabolismus odbourávání aromatickýchlátek může dále probíhat dvěma cestami – podle vzni-kajících intermediátů hovoříme o katecholovém rozkla-du nebo rozkladu přes kyselinu gentisovou13.

Biodegradace anilinu probíhá převážně katecholovoudráhou, minoritně reversibilní acylací na acetanilida formanilid nebo oxidací dusíku vedoucí v menšímmnožství oligomerních kondenzačních produktů.Kromě biodegradace se na odstranění anilinu z vodné-ho prostředí podílejí fyzikální procesy jako autooxidace,fotooxidace a další chemické reakce13.

Tvorba katecholu probíhá přes cis-dihydrodiol, kterývzniká působením NADH-dioxygenasy (tento enzymbyl např. popsán u Pseudomonas putida)10,17. Ten jeokamžitě oxidován na katechol za současného vznikumolekuly NADH. Vznikající katecholy jsou štěpenyv poloze ortho-, meta- nebo para- na semialdehydkyseliny 2-hydroxymukonové nebo na kyselinu 2-hyd-roxymukonovou. Tato reakce je katalyzována dioxyge-

Mikroorganismus Buněčný typ Biodegradace

Pseudomonas sp AK2018 bakterie aerobní

Pseudomonas putida10,17 bakterie aerobní

Brevundimonas diminuta INMI KS-717 bakterie aerobní

Delftia acidovorans CA2810,17,19 bakterie aerobní

Comamonas testosteroni I217 bakterie aerobní

Aquaspirillum sp. 2C17 bakterie aerobní

Paracoccus denitrificans 3CA17 bakterie aerobní

Rhodococcus erythropolis20 bakterie aerobní

Acinetobacter sp. YAA21 bakterie aerobní

Moraxella sp. G22 bakterie aerobní

Thauera aromatica16 bakterie anaerobní

Desulfobacterium anilini23 bakterie anaerobní

Rhodopseudomonas palustris16 bakterie anaerobní

Phanerochaete chrysosporyum ATCC 2472524 plíseň aerobní

Fusarium sp.24 plíseň aerobní

Rhizopus sp.24 plíseň aerobní

Tab. 1 Přehled mikroorganismů degradujících anilin

23

nasou a dochází při ní k navázání jedné molekuly kys-líku. Štěpy vzniklé z aromatických kruhů jsou dálemetabolizovány až na intermediáty citrátovéhocyklu14,15. Na obr. 1 je znázorněna metabolická dráhabakterie Delftia sp.AN3, která je extrémně tolerantník vysokým koncentracím anilinu.

Anaerobní degradaceNěkteré mikroorganismy dokáží degradovat aroma-

tické látky až na oxid uhličitý bez přítomnosti kyslíku.Anaerobní štěpení kruhu poprvé popsal W. C. Evansv roce 1977 (cit.16). Zahrnuje reakční mechanismy karboxylace, reduktivní dehydroxylace, adice a další.Mnoho denitrifikačních druhů, které rostou anaerobněna aromatických látkách, jsou schopny je využít i aerob-ně. Klíčovým enzymem anaerobní degradace je benzo-yl-CoA reduktasa, o které se předpokládá, že je konsti-tutivním enzymem. Naopak enzymy periferních drah(např. dráhy pro degradaci anilinu, fenolů aj.) se synte-tizují, až po dodání konkrétní látky (indukovatelnéenzymy). Obvykle jsou aromatické sloučeniny utilizová-ny až tehdy, není-li přítomna už žádná utilizovatelnánearomatická látka (katabolická represe).

Byly popsány dvě dráhy k odbourávání aromatickéhojádra za anaerobních podmínek. Jedna vede přes resor-cinol nebo fluoroglucinol na AcCoA (aromatické slou-čeniny s více OH-skupinami) a druhá přes benzoyl-CoAna AcCoA (p-kresol, anilin, benzylalkohol aj.).

Biodegradace anilinu u denitrifikačních a sulfátredu-kujících bakterií začíná karboxylací (aktivace vznikemthioesteru AcCoA) aromatického jádra. Rozklad anilinuprobíhá dále přes 4-aminobenzoát až na benzoyl-CoA,který je klíčovým intermediátem této metabolickédráhy (obr. 2). Ten je redukován na cyklohex-1,5-dien-1-karboxyl-CoA, který podléhá oxidaci v dráze analogic-ké ß-oxidaci mastných kyselin. Konečnými produktyjsou 3 molekuly AcCoA a 1 molekula CO2 (obr. 3).

AcCoA je většinou oxidován v citrátovém cyklu. Někte-ré studované bakterie rostoucí anaerobně na aromatic-kých substrátech obsahují NADP-specifickou 2-oxoglu-tarát dehydrogenasu. U těchto bakterií probíhá asimila-ce AcCoA přes glyoxylátový cyklus. Ovšem existujíi výjimky (striktně anaerobní mikroorganismy), kterévyužívají jiné způsoby asimilace AcCoA, např. oxidaceAcCoA/uhlík monoxid-dehydrogenasovou cestou neboredukcí na pyruvát16.

Obr. 1. Předpokládaná degradační dráha anilinu pomocí Delftia sp.AN3 – meta-dráha10

Obr. 2. Přeměna anilinu na klíčový intermediát benzoyl-CoA16

Literatura1. IUPAC:http://hydro.chmi.cz/ojv2/htm/pasporty/

aniliny/anilin.htm., 20. ledna 2006.2. http://www.microbialcellfactories.com/content/

4/1/24. 15. dubna 2006.3. http://www.env.cz/AIS/web–pub.nsf/$pid/

MZPLSF4H1VU6/$FILE/oov_03_Anilin_20040414.pdf.20. ledna 2006.

4. http://www.env.cz/_C1256D3D006B1934.nsf/$pid/MZPLSF4H1VU6/$FILE/oov_Program_NL_uplny_text_20040414.pdf. 20. ledna 2006.

5. David S., Kosson D.S., Byrne S. V.: Environ. HealthPerspect. 103, 413 (1995).

6. Chemical Journal in Internet 4 (11), 56 (2002).http://www.chemistrymag.org//cji/2002/04b056pe.htm. 20. ledna 2006.

7. Chung Y.H., Park S.M.: J. Appl. Electrochem. 30, 685(2000).

8. Jiang Y., Petrier C., Waite T.D.: Ultrason. Sonochem.9, 163 (2002).

9. Kamble S.P., Sawant S.B. et al.: J. Chem. Technik.Biotechnol. 78, 865 (2003).

10. Liu Z., Yang H. et al.: Appl.Microbiol.Biotechnol. 58,679 (2002).

11. Alkorta I., Garbisu C.: 79, 273 (2001).12. Demnerová K., Pazlarová J., Pazlar M.: Biotechnolo-

gie životního prostředí. Vydavatelství VŠCHT, Praha2000.

13. Lyons C.D., Katz S., Bartha R.: Appl. Environ. Micro-biol. 48, 491 (1992).

14. Rauch P., Biochemie životního prostředí. Vydavatel-ství VŠCHT, Praha 2000.

15. Konopka A., Knight D., Turko R.F.: Appl. Environ.Microbiol. 55, 385 (1989).

16. Heider J., Fuchs G.: Eur. J. Biochem. 243, 577(1997).

17. Nikov V., Nikolov V., Dimitrov D.: Bioprocess Eng. 21,547 (1999).

18. Konopka A.: FEMS Microbiol. Lett. 111, 93 (1993).19. Peres C.M, Naveau H., Agathos S.N.: Appl. Micro-

biol. Biotechnol. 49, 343 (1998).20. Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.C.R.: Curr. Opin.

Biotech. 16, 282 (2005).21. Fujii T., Takeo M., Maeda Y.: Microbiology 143, 93

(1997).22. Zeyer J., Wasserfallen A., Timmis K.N.: Appl. Environ.

Microbiol. 50, 447 (1985).23. Schnell S., Schink B.: Arch. Microbiol. 155, 183

(1991).24. Emtiazi G., Satarii M., Mazaherion F.: Wat. Res. 35,

1219 (2001).

24

Obr. 3. Přeměna benzoyl-CoA na AcCoA16

25

ÚvodZástupci rodu Pseudomonas patří mezi všudypří-

tomné mikroorganismy, které můžeme v přírodě naléztve třech základních biotopech: planktonicky žijícíbuňky, buňky přichycené na biotický povrch a buňkypřichycené na abiotický povrch. Některé patogennízástupce tohoto rodu lze nalézt ve specifických lokali-tách s podmínkami, které jsou pro většinu mikroorga-nismů zcela nevyhovující. Rozšíření rodu Pseudomonasje pravděpodobně dáno jeho malými nutričními nároky, velkým množstvím uhlíkatých substrátů, kterémohou tyto mikroorganismy využívat a diverzitou jejichmetabolismu, danou šíří enzymového vybavení. Lze říci, že zástupci rodu Pseudomonas se převážněvyskytují v půdě a vodě, za aerobních, mezofilních pod-mínek v pH neutrálním prostředí. Zástupci rodu Pseu-domonas jsou také schopni tvořit konsorcia s rostlina-mi a zvířaty. Z výše uvedeného lze konstatovat, že sejednoznačně jedná o velmi vhodný mikroorganismuspro využití v bioremediačních technologiích1.

Základní charakteristiky a morfologie (vybrané buněčné struktury)

Jedná se o gramnegativní bakterie, nesporulující,rovné nebo mírně zakřivené tyčinky, převážně striktněaerobní, pohyblivé (monotrichní nebo lofotrichní), vyu-žívající oxidativní, chemoorganotrofní metabolismus,nevykazující kvasné ani fotosyntetické schopnosti. Někteří zástupci jsou schopni fixovat dusík (P. stutzeri,P. aeruginosai). Mezi vlastnosti pseudomonád, kteréjsou kódované na plasmidech, patří resistence na anti-biotika, chemická činidla, UV záření, bakteriofágy, bak-teriociny, geny degradace organických sloučenin,schopnost být donorem chromosomů, inhibice pro-dukce bakteriocinu, inhibice rozmnožování, nekompa-tibilita s ostatními plasmidy. Mezi významné vlastnostipatří také produkce sekundárních metabolitů, zejménapak sideroforů a antibiotik 2.

Epidemiologie a patogenitaNěkteří zástupci rodu Pseudomonas jsou patogenní

pro člověka, lidi a zvířata. Extracelulární enzymy sekre-tované psychrotrofními bakteriemi jsou známýmipůvodci kažení masa, mléka a mléčných výrobků 3. Pse-udomonádová infekce lidského organismu, způsobenánejčastěji kmenem Pseudomonas aeruginosa (10 % ze všech bakteriologických infekcí ročně), postihujenejrůznější části lidského těla. Infekce ovšem postihujevětšinou pouze závažně nemocné lidi. Vzhledem ke svým charakteristickým vlastnostem (např. schop-nost přichytit se na tkáňové buňky, minimální nutričnípožadavky, resistence k velkému počtu antibiotik,

produkce proteinů poškozujících tkáň, ochranná vrstva)bývá léčba těchto infekcí náročná 4.

Obecný metabolismusZástupci rodu Pseudomonas využívají klasický respi-

rační metabolismus s kyslíkem jako konečným akcep-torem elektronů, ale některé druhy jsou schopny rov-něž využívat nitrát jako alternativní akceptor elektronůa mohou využívat redukční disimilaci nitrátu (na N2O

nebo N2). Např. P. mendocina a P. fluorescens jsou

schopny anaerobní respirace s nitráty jako konečnýmiakceptory elektronů a aerobní přeměny argininu na ornitin. Rod Pseudomonas utilizuje cukry Entner-Doudoroffovou drahou. Některé druhy jsou schopnyvyužívat až 150 druhů organických sloučenin jako zdro-je uhlíku a energie 2,5. V komplexním prostředí obsahu-jícím několik vzájemně zastupitelných zdrojů živin semůže každý z přítomných mikrobiálních rodů spe-cializovat na utilizaci pouze jednoho nebo několikaz nich5.

BiofilmPovrchová adheze bakterií a jejich následné dceřinné

generace vzniklé binárním dělením a produkce exopo-lysacharidů vedou k tvorbě bakteriálního biofilmu. Biofilm je definován jako společenství mikroorganismůa jejich extracelulárních produktů vázaných k pevnémupovrchu6. Prokaryotický biofilm převládající v širokémrozmezí ekosystému je často vysoce organizovanáuspořádaná komunita složená z velkého počtu druhůmikroorganismů. Uvnitř této komunity jsou propojenémetabolické aktivity jednotlivých členů. Možnost uzpů-sobení struktury biofilmu a vztahů mezi jeho jednotli-vými členy je pravděpodobně dána možností expresesady genů, která ve výsledku vyústí ve fenotypový projev, který je naprosto odlišný od fenotypu jednotlivěrostoucích buněk stejného druhu6.

Struktura a diferenciace biofilmuPopulace vázaná na povrch (jednodruhová a vícedru-

hová) obvykle preferuje uspořádání do struktury biofil-mu. Mnoho bakteriálních rodů tvoří biofilm ve vývojo-vém sledu, který lze rozdělit do tří základních kroků:

1. počáteční vazba na povrch2. tvorba mikrokolonií3. dozrávání mikrokolonií ve vyvinutý biofilm uzavře-

ný ve vytvořených exopolysacharidech8.Vývoj biofilmu u gramnegativních mikroorganismů

(modelový mikroorganismus P. aeruginosa) bylpopsán například v práci Davey a kol. (2000) se zamě-řením na studium vývoje bičíků9. Přítomností bičíků bylv tomto případě zajištěn pohyb buňky do blízkosti

ROD PSEUDOMONAS: ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA,TVORBA BIOFILMUTereza HudcováÚstav kvasné chemie a bioinženýrství, VŠCHT Praha

26

povrchu, s pomocí lipopolysacharidů byly zprostředko-vány první interakce s povrchem pravděpodobně ve spolupráci s vnějšími membránovými proteinybuňky (OMPs). Jakmile bakterie vytvoří na povrchumonovrstvu pil typu IV, škubavými pohyby zajistí agre-gaci buněk v mikrokolonie. Produkce pil je regulovánanutričními signály (Crc). Doposud prokázané změnyv expresi genů v této první etapě tvorby biofilmu zahr-nují posílení exprese genů pro syntézu alginátu a sní-žení exprese genů pro syntézu bičíků. Pro zrání biofil-mu je rovněž důležitá produkce signálních molekulsloužících k mezibuněčné komunikaci (acyl-HSLs).Další sloučeninou, která hraje v tomto procesu důleži-tou roli je právě zmíněný alginát 9. O’Toole a kol. (1998)pomocí testů na iniciaci tvorby biofilmu (např. přichy-cení na biotický povrch) u P. fluorescens kmen WCS365prokázali, že tento kmen je schopen tvořit biofilm nabiotickém povrchu pokud má k dispozici dostatečněširoký zdroj nutrientů, z důvodu nutnosti proteosyntesykrátce po zahájení tvorby biofilmu8. Je patrné, že jeden(nebo více) exocytoplasmatických proteinů hraje rolipři kontaktu s biotickým povrchem. V této fázi hraje rolirovněž osmotický tlak v médiu, který ovlivňuje schop-nost buněk tvořit biofilm8.

Vliv okolního prostředí na strukturu biofilmuBakteriální biofilm se začíná tvořit v okamžiku, kdy

se individuálně rostoucí buňky začínají přichytávat napovrch. Schopnost buněk provést tento počáteční atakpovrchu je ovlivňována řadou environmentálních fakto-rů zahrnujících například koncentraci nutrietů, teplotu,pH a genetické faktory, včetně genů kódujících pohybo-vé funkce a environmentální senzory. Biofilmy vykazujíresistenci k široké škále antibiotik (např. ampicilin,streptomycin, tetracykliny, gentamycin a řadě dalších)a biocidním oxidačním činidlům jako jsou ozón, chlóra jód10. Chang a kol. (2003) například popsali změnubuněčné morfologie u P. putida kmen mt-2 při sníženédostupnosti vody, což mělo za následek ovlivnění veli-kosti mikrokolonií a ultrastrukturu biofilmu11.

Fenotypová diferenciace v průběhu vývoje biofilmuVýznamnou charakteristikou mikrobiální populace

tvořící biofilm je, jak již bylo řečeno, její odlišný fenoty-pový projev ve srovnání s populací žijící volně. Z feno-typových změn, které se zejména v posledních letechstávají předmětem intenzivního studia, je z hlediskavyužitelnosti biofilmu v biotechnologiích významnápředevším schopnost mikroorganismů lépe využívatživiny, následně tvořit větší množství metabolitů a mi-nimalizovat vznik dále nevyužitelných intermediátů(tzv. dead-metabolitů). Nespornou výhodou je mož-nost opakovaného použití biomasy bez nutnosti jejísložité separace, vysoká hustota buněk v reaktoru, jež zvyšuje rychlost a tím i produktivitu procesu nebo stabilita biofilmu. Proces tvorby biofilmu je v neposlední řadě využíván v moderních zařízeních pro biologickou degradaci toxických látek a čištěníodpadních vod12.

Klíčová sekvence genů u P. fluorescens WCS365pojmenovaná lap, jakožto místo bohaté na adhezivníproteiny („large adhesin protein“) nutné k přichyceníbuňky na biotický povrch, kóduje ~880 kDa proteina ABC transporter potřebný k sekreci lapA. Lap-systémje důležitý pro přechod z reversibilního na ireverzibilníkrok v procesu přichycení buňky na povrch v prvníchfázích vývoje biofilmu13. V případě, že je ABC transpor-ter mutován, LapA je možno nalézt pouze v cytoplazměbuněk, není tedy exkretován do supernatantu ani loka-lizován na buněčném povrchu14.

Široká škála mikroorganismů, zvláště pak bakterie,jsou schopné tvořit extracelulární polysacharidy (EPS)v rozličném prostředí. Bylo zjištěno, že produkce exo-polysacharidů je přímá a logická odpověď na selektivnítlak prostředí, ve kterém se daný mikroorganismusnachází, to znamená, že je možné připsat EPS funkcipřirozené ochrany svého producenta.

Životní podmínky v některých lokalitách doslova vyža-dují pro přežití mikroorganismů jejich adhezi na pevnýpovrch. Zdá se, že u kmenů produkujících EPS je adhe-ze na povrch a vytvoření biofilmu pravděpodobnějšínež u kmene, který expolysacharidy netvoří. Je tedypravděpodobné, že EPS mají důležitou roli při adhezibuňky na povrch. Oliveira a kol. (1993) studovali vlivpH a povrchu materiálů nosiče (polymerní látky) na produkci polysacharidů a tvorby biofilmu u P. fluo-rescens15. Z výsledků je patrné, že množství vyproduko-vaných exopolysacharidů je maximální v případě, kdy jako počáteční pH použijeme pH 7, to samé platípro množství narostlé biomasy. Již dříve bylo prokázá-no, že optimální pH pro produkci exopolysacharidů je zcela individuální pro každý kmen, pro většinu bak-terií je však toto optimum v blízkosti pH 7.

Mezi koncentrací EPS v médiu a tloušťkou vrstvy biofilmu, tvořící se na povrchovém materiálu nebyla prokázána přímá souvislost. Adheze mikroorganismů na povrch a produkce exopolysacharidů je pravděpodob-ně odpovědí na typ a vlastnosti povrchového materiálunosiče a je tedy možné, že povrchový materiál na základěsvých vlastností může produkci EPS navýšit nebo snížit16.

Charakterizace hlavních komponent exopolysacharidůmůže vést k odhalení potenciálních vazebných míst např.pro kovy nebo radionuklidy na tento exopolymerní bio-sorbent. Hung a kol. (2005) izolovali a charakterizovaliexopolysacharidy produkované Pseudomonas fluores-cens Biovar II (cit.5). Monosacharidy stanovené pomocíGS-MS byly složené z rhamnosy, fruktosy, arabinosy, xylo-sy, mannosy, galaktosy a glukosy. Kyselé skupiny v EPSbyly převážně zastoupeny karboxylovými kyselinamia v menší míře také polyaniontovými skupinami jako jenapř. sulfát a fosfát. Více než 70 % celkových uhlovodíkůbylo zastoupeno uronovými kyselinami. Kromě neutrál-ních a kyselých cukrů obsahovaly EPS i 2 % proteinů.

Mezibuněčná komunikace v průběhu tvorbybiofilmu, systém quorum-sensing

Jak již bylo řečeno v předchozím textu, bakterie tvoříbiofilmy multicelulárního charakteru. Genetická analý-

27

za buněk tvořících biofilm vedla ke vzniku myšlenky, že extracelulární signalizace a regulační systém quo-rum-sensing (QS) jsou nezbytné pro vznik diferencio-vaného biofilmu. Tato představa vystihuje pojem densi-tou řízené mezibuněčné komunikace a vede k popisuvývoje biofilmu u různých bakteriálních kmenů za růz-ných podmínek, je třeba však mít na paměti, že procestvorby biofilmu je proces multifaktoriální a komplexní.Fyzikální vlastnosti prostředí, dodávka živin a intracelu-lární tok zdroje uhlíku mají pravděpodobně hlavní vlivna měnící se buněčnou expresi nezbytnou pro adap-taci buněk v průběhu různých fází tvorby biofilmu.

Tvorba biofilmu může být rovněž výsledkem pro-pojení několika nezávislých interakcí určených speciál-ním komplexním systémem QS, který zprostředkovávámezibuněčnou komunikaci a umožní bakteriím koordi-novat komplexní buněčnou odpověď na danou situaci.Tato komunikace spočívá v syntéze a extracelulární pro-dukci chemických signálních molekul zvaných autoin-duktory. Lze tedy říci, že QS je druhem účelového cho-vání bakteriálních buněk, souvisejícího se změnoupopulační density. Zvyšování koncentrace autoinduk-torů přímo úměrně souvisí se vzrůstem populační den-sity. Dosažení prahové koncentrace signálních molekulvyvolá specifickou odpověď příslušného organismu,která vyústí v ovlivnění genové exprese. Jak grampozi-tivní, tak gramnegativní bakterie využívají QS jakokomunikační kaskádu vedoucí ke změně konkrétníchfyziologických projevů buněk. Zmíněné děje souvisejímimo tvorby biofilmu např. se symbiózou, virulencí,konjugací, produkcí antibiotik, pohybem a sporulací.Pro komunikaci využívají gramnegativní bakterie přede-vším acylovaných laktonů homoserinu (AHL), zatímcobakterie grampozitivní rozmanité oligopeptidy. Komu-nikaci QS jsou bakterie schopny využívat jak v rámcidruhu, tak mezidruhově. Jak charakter jednotlivých sig-nálních molekul, tak i mechanismus přenosu příslušnéinformace vnitrobuněčným prostředím se liší, a odlišnéjsou i geny, jejichž exprese je kontrolována systémy QS.Tento děj uděluje jednobuněčným organismům rysychování, jimiž se vyznačují vyšší organismy17.

P. aeruginosa je velmi variabilní organismus, který jeschopen se adaptovat na různá prostředí a který jevybaven rozsáhlým 6,3 MB genomem. Velikost genomunaznačuje existenci vysoce komplexní genové regulace,která umožňuje rychlou adaptaci na změny prostředí.Tento mikroorganismus produkuje širokou škálu extra-celulárních produktů. Produkce je v populaci regulová-na na densitě-závislém chování skrz mezibuněčnoukomunikaci nebo systém QS. U dvou propojených QSsystémů (las a rhl systém) bylo prokázáno jejich zapo-jení do systému virulence, vývoje biofilmu a dalšíchprocesů probíhajících v P. aeruginosa18.

Detekce AHL-molekul je v současné době usnadněnadíky vývoji sensitivních biodetektorů použitelných prorychlý screening mikroorganismů nebo difundovanýchsignálních molekul. AHL nebo jejich diketopiperazino-vé deriváty, jakožto nástroje mezibuněčné komunikace,hrají roli v regulaci rozličných bakteriálních funkcí,

jako je například syntéza antibiotik, produkce virulent-ních faktorů, biosyntéza exopolysacharidů, přenos plastidů konjugací a přechod kultury do stacionárníhostavu. Gramnegativní bakterie žijící na povrchu rostlin-ných kořenů produkují quorum-sensing signální mole-kuly, například u P. fluorescens byla prokázána produk-ce N-(3-hydroxy-butyryl)-L-homoserinového laktonu18.U Pseudomonas syringae vede zvýšení koncentraceAHL k expresi virulentních faktorů a sekundárníchmetabolitů, které zprostředkovávají úspěšnou koloni-zaci hostitele19,20.

Oddělování komponent v průběhu vývoje biofilmuOddělování komponent v průběhu vývoje biofilmu,

neboli tzv. „detachment“ (pohyb buněk z biofilmu dokapaliny), je proces, který umožňuje buněčné populaciodpoutání buněk z matrice biofilmu, čímž buňky získá-vají možnost osidlovat jiné povrchy. Tento proces jerealizován dvěma základními procesy, a to mechanic-kým oddělováním (proudem kapaliny) a spontánnímoddělováním. Tento proces je především důsledkemmortality buněk, která narušuje architekturu biofilmu.Allison a kol. (1998) prokázali vliv extracelulárních produktů P. fluorescens B52 na tvorbu biofilmua „detachment“ biofilmu21. Tento kmen tvoří biofilms maximálním nárůstem již po 20 – 50 hodinách od inokulace. Z výsledků jejich práce vyplývá, že mezibuněčná komunikace zprostředkovaná napříkladhomoserinovým laktonem je spojená s tvorbou biofilmu. Enzymatická degradace, ke které dochází, má specifickou roli při „detachmentu“ biofilmu za podmínek limitace substrátem a hladovění. Zatímco krátké uhlovodíkové řetězce (C6) exogenních

homoserinů mohou také spouštět buněčnou odpověďv P. fluorescens, vlastní podstata odpovědi je pravdě-podobně důsledkem přítomnosti dlouhých řetězcůmastných kyselin (>C8).

Tvorba biofilmu jako vývojový proces – dynamikabiofilmu

Moderní metody studia tvorby biofilmu jsou v sou-časné době založeny na konfokální mikroskopii a gene-tické analýze. Tolker-Nielsen a kol. (2000) použili prostudium dynamiky biofilmu geneticky značené zástup-ce následujících mikroorganismů: Pseudoudomonassp. kmen B13 a P. putida OUS82 (zelený fluorescenčníprotein) a Discosoma sp. (červený fluorescenční prote-in). Na začátku byla pozorována tvorba jednodruho-vých mikrokolonií, to značí, že tyto mikrokoloniev počátečních fázích tvorby biofilmu jsou snadněji tvo-řeny buňkami utilizujícími stejný substrát a nikolivbuněčnou agregací. Výskyt malého množství zelenýchbuněk v červených mikrokoloniích naopak prokazujemožnost přesunu buněk mezi mikrokoloniemi. Rychlýpřesun P. putida OUS82 do středu mikrokolonií bylpozorován před jejich přechodem na kompaktní mikro-kolonie. Tento přechod doprovází ztráta nepravidelněrostoucích povrchových struktur buněk. Pokusy prová-

28

ÚvodEnzymy jsou bílkoviny s biokatalytickou aktivitou,

přítomné ve všech živých buňkách, kde se podílejíprakticky na všech životních funkcích. Lze je rozdělit na endogenní, tj. produkované organismem, a exo-genní, přijímané potravou. Endogenní enzymy může-me dále rozlišit na metabolické, katalyzující různé che-mické reakce v buňkách, a trávicí, které jsou sekretová-ny v gastrointestinálním traktu, kde se podílí na rozkla-du přijaté potravy na menší látky, které mohou býtabsorbovány přes střevní stěnu do krve a transporto-vány k buňkám. Exogenní enzymy jsou přirozeně obsa-ženy ve všech syrových potravinách. Toto se týká přede-vším rostlinných produktů, které běžně konzumujemesyrové, platí to ale samozřejmě i pro masné nezpraco-vané výrobky. Zpracováním a vařením se enzymy obsa-žené v potravinách nevratně deaktivují, což je takécílem při konzervaci potravin, ale není výhodné projejich snadnější strávení.

Je tedy zřejmé, že velké množství problémů spoje-ných se špatným trávením spočívá v nadměrné konzu-maci zpracovaných jídel a nedostatku syrových potra-vin v moderním stravování. Předpokládá se, že našeorgány a žlázy mají naprogramovaný určitý „enzymový

potenciál“, tedy množství enzymů, které jsou schopnyběhem života vyprodukovat. Tento potenciál je genetic-ky určen, ale závisí také na různých faktorech životníhoprostředí. Během stárnutí organismu dochází k úbytkuprodukovaných enzymů a tím i ke zhoršení trávení –kromě klasických trávicích obtíží dochází i ke vznikuchronických obtíží jiného typu – oslabení imunity, cévníchoroby nebo různé metabolické poruchy. Příčinoutěchto obtíží jsou špatně nebo nedokonale strávenémetabolické produkty absorbované z GI traktu do krve,kde jsou metabolické enzymy nuceny je zpra-covat, a proto nemohou plnit svou primární funkci(např. obrana proti infekcím, opravné funkce). Dochází k porušení homeostázy a vzniku chronickýchobtíží (1). V takových případech je snadnou pomocípodávání potřebných enzymů ve formě potravinovýchdoplňků, které sice neléčí žádnou chorobu, ale odstra-ní nebo zmírní dlouhodobé obtíže spojené s nedostat-kem vlastních trávicích enzymů.

Enzymové deficiencePři nedostatku proteas je hlavním příznakem alkali-

zace krve, která může vést až k úzkostným stavůma často je řešena podáváním sedativ. Dále také dochá-

děné s bezbičíkovým mutantem P. putida potvrdily, že pohyb uvnitř a mezi mikrokoloniemi je řízen právěbičíky. Je tedy zřejmé, že volně žijící buňky se nachá-zejí v jiném fyziologickém stavu, než buňky vázanév biofilmu22.

Tato práce vznikla za podpory GAČR (projektč. 104/05/0194) a Ministerstva školství České re-publiky (projekt MSM 6046137305).

ENZYMY PRODÁVANÉ JAKO POTRAVNÍ DOPLŇKYKristýna SlámováÚstav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT Praha

Literatura1. http://textbookofbacteriology.net/Pseudomo-

nas.etc.html. Citováno 12.12.2006.2. Garrity G.M., Boone D.R.: Bergey’s Manual of Syste-

matic Bakteriology, Vydavatelství Springer, 2001.3. Rajmohan S., Dodd C.E.R., Waites W.M.: J. Appl. Mic-

robiol. 93, 205 (2002).4. www.healthatoz.com. Citováno dne 9.2.2007.5. Hung C., Santschi P.H., Gillow J.B.: Carbohydrate

Polymers 61, 141 (2005).6. Stolz, J.F. Microbial Sediments. Riding, R.E., Awra-

mik, M.S. eds. Springer – Verlag, Berlin Heidelberg.1-8 (2000).

7. Lazarova V., Manem J.: Wat. Res. 29, 2227 (1995).8. O’Toole G.A., Kolter R.: Mol. Microb. 28, 449 (1998).9. Davey M.E., O’Toole G.A.: Microbiol. Mol. Biol. Rev.

64, 847 (2000).10. Costerton J.W.: J. Ind. Microbiol. 15, 137 (1995).11. Chang W.S., Halverson L.J.: J. Bacter. 185, 6199

(2003).12. Stoodley P., Kauter K. et al.: Annu. Rev. Microbiol.

56, 187 (2002).

13. Wimpenny J., Manz W., Szewzyk U.: FEMS Microb.Rev. 24, 661 (2000).

14. Hinsa S.M., Ramos E.U. M. O’Toole G.A.: Mol. Micro-biol. 49, 905 (2003).

15. Olivieira R., Mělo L. et al.: Coll. Surf. – B Biointer. 2,41 (1993).

16. Wilkinson J.F.: Bacteriol. Rev. 22, 46 (1958).17. Kjelleberg S., Molin S.: Current Opin. Microb. 5, 254

(2002).18. Cámara M.: Quorum sensing: University of Notting-

ham, UK (2004).19. Loh J., Pierson E.A. et al.: Curr. Opin. Plant Biol. 5,

285 (2002).20. Quin∼∼ones B., Pujol C.J., Lindow S.E.: Mol. Plant-Mic-

robe Interact. 17, 521 (2004).21. Allison D.G., Ruiz B. et al.: FEMS Microb. Lett. 167,

179 (1998).22. Wolker-Nielsen T., Brinch U.C. et al.: J. Bacter. 182,

6482 (2000).

29

zí k otokům, protože nedostatek proteinů v krvi podpo-ruje přechod vody z krve do tkání. Špatné trávení vedek syndromu toxického tračníku, který může skončiti rakovinou tlustého střeva. Deficience proteas takézpůsobuje poruchy imunity, chronické a opakovanézáněty středního ucha u dětí a otoky končetin běhemPMS u žen.

Lidé s nedostatkem lipas jsou náchylní ke zvýšenýmhladinám cholesterolu a triacylglycerolů v krvi, obezitě,diabetu a glukosurii. Následkem je většinou závažnéonemocnění srdce a cév. Při nedostatku lipas docházíke snížení permeability cytoplazmatické membrány,což způsobí problémy s transportem živin do buňkya zplodin metabolismu ven z ní, souhrnně se projevyněkdy označují jako syndrom chronické únavy. Dalšímpříznakem deficience lipas mohou být svalové křečev oblasti ramen a krku, podobné křečím při tetanu.

Amylasy metabolizují kromě polysacharidů i mrtvélymfocyty (hnis), takže lidé trpící jejich nedostatkemjsou náchylní ke vzniku abscesů. Amylasy se také účast-ní protizánětlivé reakce vyvolané histaminem, jejichdeficience způsobuje kožní a plicní problémy jakoekzémy, opary, atopické dermatitidy nebo astma (1).

Systémová enzymoterapiePoměrně novou léčebnou metodou je tzv. systémo-

vá enzymoterapie (SET), která je založena na kom-plexním působení cíleně sestavených směsí hydroly-tických enzymů (především proteas) na klíčové fyziolo-gické a patofyziologické pochody. Zakladatelem systémové enzymoterapie byl prof. Max Wolf z USA,průmyslovou výrobu preparátů pro SET zavedl Dr. KarlRansberger. Díky prudkému rozvoji molekulární biolo-gie v posledních desetiletích se systémová enzymotera-pie z původně empirické léčebné metody stala vědec-ky podloženou součástí moderní medicíny. Můžemeříci, že jsme schopni popsat mechanismus působeníenzymatického přípravku na patologický proces, kon-krétně jsou známy zásahy proteas do cytokinové sítě,ovlivnění buněčného povrchu jak ve smyslu jeho adhe-zivity tak i modulace buněčných receptorů, a také ovliv-nění humorálních složek účastnících se řady fyziologic-kých i patologických procesů. V současné době existu-je dostatek experimentálních i klinických důkazů popí-rajících dogma o neresorbovatelnosti makromolekulstřevní stěnou.

Přípravky pro systémovou enzymoterapii mají proká-zaný vliv na imunitní systém a průběh zánětlivé reakcev organismu. Zánět je fylogeneticky nejstarším typemobranné reakce organismu na nejrůznější podněty,které mohou být povahy biologické (bakterie, plísně,viry, parazité), fyzikální (záření, trauma), chemickénebo metabolické (hypoxie, poruchy metabolismu).Cílem zánětu je odstranění jeho příčiny, lokalizacepoškození, odstranění poškozených tkání, jejich rege-nerace a obnovení jejich funkce. Při rozvoji zánětu spo-lupracují endotel, trombocyty, leukocyty, plazmatickýkoagulační systém a komplement. Je důležité, abyzánětlivá reakce probíhala v tempu a rozsahu odpoví-

dajícím intenzitě vyvolávajícího podnětu, pokud tomutak není, může dojít k rozvoji autoagresivního zánětu.

Proteasy obsažené v preparátech pro systémovouenzymoterapii jsou schopny zvýšit intenzitu akutníbuněčné odpovědi na podnět. Buňky účastnící sezánětlivé reakce po své aktivaci cytokiny mění spekt-rum adhezivních molekul v membráně, což jim umož-ňuje vzájemně interagovat a produkovat další cytokiny.Produkce cytokinů aktivovanými buňkami je žádoucípouze v první fázi zánětu, dále může přerůst v patolo-gický proces. Z tohoto důvodu je vhodné zvýšení clea-rance prozánětlivých cytokinů vlivem proteas. Proteasymají také schopnost regulovat přímo adhezivní mole-kuly na povrchu imunoaktivních buněk (CD44, CD45,CD4, CD80, CD62L), a tím zprostředkovaně ovlivňujíprodukci cytokinů. Proteasy se v krvi váží na přirozenéantiproteasy především α1-antitrypsin a α2-makroglo-bulin. V těchto komplexech jsou proteasy chráněnypřed rozeznáním imunitním systémem a směrovány do oblasti zánětu. α2-M je po navázání proteasy aktivován, mění se z pomalé formy na rychlou formu.Obě formy váží cytokiny, ale s různou specifičností:nativní volný α2-M váže především IL-6, PDGF a NGF,α2-M v rychlé formě váže hlavně TNF- α, IL-1, TGF- αa TGF-β.Tyto cytokiny po navázání ztrácí svoji aktivitua podněcují makrofágy k expresi receptorů pro α2-M,čímž jsou eliminovány z krevního oběhu. V časné fázizánětu se významně projevuje protiedémový účinekproteas (trypsinu, chymotrypsinu a bromelainu). Proteasy také významně ovlivňují reologické vlastnostikrve, protože zvyšují v krvi koncentraci plazminogenu,snižují tvorbu fibrinu a rozpouštějí již vzniklé tromby.Dochází i ke snížení agregace destiček, a tím pomáha-jí udržet průchodnost mikrocirkulace. Důležité je, že toto ovlivnění hemokoagulace nevede k výraznější-mu zhoršení hemostázy. Proteasy také mají schopnostaktivovat některé buňky podílející se na zánětlivé reakci. V pokusech in vitro došlo v přítomnosti proteasuž po 10 minutách k sedminásobnému zvýšení aktivitymakrofágů a aktivita NK-buněk se zvýšila dokonce třináctkrát. Proteolytické enzymy (především papaina bromelain) také tlumí vznik imunokomplexů a zvyšu-jí jejich clearance (2). Je tedy zřejmé, že proteasy majívelký pozitivní vliv v mnoha důležitých fyziologickýchprocesech v našem těle a mají široké možnosti použití.

Moderní medicína má pro preparáty systémové enzy-moterapie využití téměř v každém svém oboru, zmínímse jen o několika nejčastějších aplikacích. Jak už bylopopsáno výše, proteasy mají významný vliv na regulaciimunitní odpovědi organismu, čehož využívají imunolo-gové buď k posílení imunity u oslabených jedinců,nebo naopak k tlumení nadměrné reakce u pacientůs chronickými nebo autoimunními chorobami. Dalšívýznamnou oblastí pro aplikaci těchto léků je samo-zřejmě angiologie. Vzhledem k vlivu proteas na koagu-lační rovnováhu se používají jako prevence cévnícha srdečních onemocnění u rizikových osob. Enzymovépreparáty našly své použití i v oblasti chirurgie a trau-

Literatura1. http://www.enzymes.com2. http://www.wobenzym.cz

3. http://www.lekarna.cz

30

matologie, kde jsou podávány ke zmírnění zánětua otoku, což jsou hlavní pooperační komplikace. Výho-dou je možnost předoperační medikace, takže enzymymohou pracovat již během zákroku a urychlovat takúspěšné hojení.

Enzymy prodávané jako potravní doplňkyEnzymy v prodávaných enzymatických preparátech

jsou rostlinného i živočišného původu, ale většinoujsou produkovány v modifikovaných kmenech A. oryzae, A. niger nebo S. cerevisiae. Tyto kmeny jsouz potravinářského hlediska považovány za bezpečnéa jejich produkty jsou považovány za potraviny. Některé enzymy živočišného původu mohou také býtvyráběny z vnitřností zvířat (např. trypsin z pankreatuvepřů). Enzymové preparáty bývají ve formě tabletpotažených acidorezistentním obalem, tablety se roz-pouštějí až v tenkém střevě, kde se vstřebají. Enzymo-vé přípravky jsou směsi různých typů hydrolytickýchenzymů: proteas (trypsin, chymotrypsin, papain, bro-melain), lipas, amylas a dalších sacharolytických enzy-mů (cellulasy, pektinasy, invertasy, glukoamylasy aj.).

Snad nejznámějším enzymovým přípravkem nanašem trhu je Wobenzym, který vyrábí německá firmaMUCOS Pharma. Jedná se o jeden z prvních preparátůvyužívaných v medicíně pro systémovou enzymoterapii,jak již bylo uvedeno výše, ale je též možné si Woben-zym zakoupit v lékárně bez lékařského předpisu.Wobenzym je směs sedmi hydrolas s různou specifitouúčinku (papain, bromelain, pankreatin, trypsin, chy-motrypsin, lipasa, a amylasa). Tento enzymový preparátbyl vyvinut tak, že má velké množství různých indikací:poúrazové otoky, lymfedémy, fibrocystická mastopatie,pooperační stavy v chirurgii, záněty povrchových žil,revmatoidní artritida, artróza, chronické a recidivujícízáněty. MUCOS Pharma vyrábí ještě další přípravky SET,Phlogenzym a Prevenzym, které se liší složením enzy-mů a tím i specifitou účinku (2).

Velkým producentem enzymových preparátů naamerickém trhu je společnost Enzymes.com, kterávyrábí více než dvě desítky různých přípravků s obsa-hem enzymů a prodává je jako doplňky stravy. Z velkénabídky jsem vybrala tři reprezentanty, o kterých bychse chtěla zmínit. Zdá se, že velmi oblíbeným prepará-tem je směs trávicích enzymů příhodně nazvaná Diges-tive enzymes, která má za úkol pomáhat účinněa kompletně strávit potravu. Obsahuje velmi různoro-

dou směs enzymů (tři různé proteasy, peptidasa, amy-lasa, lipasa, laktasa, invertasa, cellulasa, alfa-galaktosi-dasa, a glukoamylasa). Je vhodný pro osoby s různýmiporuchami trávení, s nesnášenlivostí mléčných výrobkůnebo cukrů, alergií na potraviny nebo žlučníkovým stresem. Jiným produktem je Super CellZyme, kterýobsahuje směs enzymů (proteasu, amylasu, lipasu, cellulasu, glukoamylasu a pektinasu) a několik rostlin-ných extraktů. Tento přípravek působí proti únavě, stre-su, nedostatku energie, anemii a poruchám metabolis-mu. Dalším příkladem je LypoZyme, který obsahujezejména velké množství lipasy, která se postará o sní-žení hladiny cholesterolu a triacylglycerolů v krvi a zlep-ší trávení tuků. Tento preparát je doporučován prozdraví kardiovaskulárního systému, kontrolu nadváhya při diabetu (1).

Poslední dobou se v našich lékárnách objevuje velmiúspěšný produkt pro snižování nadváhy Lipoxal, kterývyrábí firma Garden State Nutritionals. Tento přípravekobsahuje enzymy papain a lipasu a velké množství přírodních výtažků z rostlin, hlavně ze zeleného čaje,šalvěje a zázvoru. Tato směs účinných látek podporujemetabolismus tukových buněk a spalování podkožníhotuku, snižuje potřebu příjmu potravy, posiluje imunitua čistí krev (3).

Jedním ze světově uznávaných enzymových přípravkůje Natto NKCP, nazývaný též „tajemství japonské dlou-hověkosti“, vyráběný Daiwa Pharmaceutical v Tokiu.Tento preparát obsahuje proteiny produkované Bacillus subtillis natto, což je speciální kmen pěstovanýna fermentované sóje. Účinnou složkou je fibrinolytic-ký enzym nattokinasa, který rozpouští krevní sraženinya udržuje rovnováhu mezi koagulací a fibrinolýzou.Tento přípravek je vhodný pro lidi s vyšším rizikeminfarktu nebo mozkové mrtvice nebo s bércovýmivředy, používá se též jako prevence proti vzniku trom-bóz (např. v těhotenství, při diabetu, během dlouhýchletů apod.) (3).

ZávěrZávěrem bych chtěla zdůraznit, že enzymové příprav-

ky mají své příznivce i odpůrce v řadách odborníků.S rozvojem molekulární biologie však lépe rozumímepůsobení enzymů na konkrétní procesy, a je zřejmé, žetento nový a moderní obor medicíny se bude rychlerozvíjet, a s tím zároveň poroste množství a objemyprodávaných enzymových preparátů.

Rakovina je zhoubné onemocnění, při kterém normální buňky uniknou běžným kontrolním mecha-nismům a nadměrně se začnou množit. Žádná z mi-liard buněk našeho těla není nesmrtelná. Naopak dobaživota buňky je pod přísnou kontrolou a po čase každábuňka umírá a je nahrazena buňkou novou. Během svéexistence buňky čelí mnoha nepříznivým vlivům, kteréje poškozují. Za normálních okolností zafungují kontrol-ní a opravné mechanismy a poškozená buňka je opra-vena a plní opět svoji funkci. V případě těžkého poško-zení je buňka trvale odstraněna z organismu. Nicméněza určitých okolností dojde k poškození vlastních kon-trolních mechanismů a pokud poškození buňky nenífatální, tak dochází k nadměrnému růstu a vznikunádorového onemocnění. Náš moderní způsob životas sebou přináší zvýšené riziko vystavení faktorůmpoškozujícím buňky (smog, kouření, potravinová aditi-va aj.), což spolu s prodlužováním lidského života(efektivita opravných mechanismů se stářím snižuje)vede k nárůstu počtu nádorových onemocnění v popu-laci. Rakovina se tak stává jednou z hlavních příčinumrtí v Evropě a ročně jí podlehne přes 1,7 milionů lidí.

Moderní medicína udělala značný pokrok v léčběněkterých druhů nádorů jako je nádor prostaty, prsunebo kůže s 5-ti letým indexem přežití přes 90 %. Nic-méně klasické léčebné postupy (chirurgie, radiothera-pie, chemotherapie) jsou zřetelně méně úspěšné v bojiproti rakovinám se špatnými prognózami jako je rako-vina plic a mozku.

Mozkové nádory jsou v několika aspektech zvláštnía odlišné od nádorů ostatních orgánů a tkání. Mozek jehlavním řídícím orgánem kontrolujícím vitální pochodynašeho těla, umožňuje nám vnímat okolní podněty,reagovat na ně, chodit, myslet, mluvit atd.. Proto každýzásah do tohoto komplikovaného orgánu je velmi deli-kátní a hrozí poškozením základních životních funkcí.Mozek je dobře chráněn jednak lebeční kostí i ochra-nou vrstvou buněk, tzv. hematoencefalickou bariérou.Tyto ochranné bariéry jsou pak přes svou původní pozi-tivní roli, při vývoji nádoru spíš faktorem negativním.I růst nezhoubného nádoru v uzavřeném prostoru(ohraničeného právě lebeční kostí) může mít velmivážné zdravotní následky dané tlakem nádoru na okol-ní zdravou tkáň. Navíc hematoencefalická bariéra, slou-žící primárně k bránění vstupu škodlivin do mozku,brání stejně i přísunu chemotherapeutik a ostaníchléků na místo účinku. Navíc mozkové nádory jsou veli-ce různorodé, což značně komplikuje jejich diagnózua léčbu.

Nádory mozku dělíme v zásadě na nádory primárnía sekundární. Nádory primární vznikají přímo z buněkmozkové tkáně nebo z buněk okolních podpůrnýchstruktur. Nádory sekundární mají svůj původ mimo

centrální nervovou soustavu a jsou způsobenymetastázami z jiných tkání. Primární mozkové nádorypředstavují asi 1 – 2 % všech zhoubných nádorů a jsoučastější pro muže než pro ženy. Každým rokem jev České republice diagnostikováno 700 nových pacien-tů s primárními mozkovými nádory. Celosvětově jetento počet odhadován na 176 000 případů, přičemžnejvíc do těchto statistik přispívají Spojené státy ame-rické (41 000 nových případů ročně). Incidence těchtonádorů kulminuje v dvou obdobích lidského života: (1)u dětí do 5 let, (2) u starších lidí nad 60 let. Primárnímozkové nádory jsou velice variabilní a jejich klasifika-ce není jednoduchá a stále se na ní pracuje. Podle typu buněk, ze kterých nádor vzniká rozlišujeme gliomy, meningeomy, neurinomy, adenomy hypofýzy,meduloblastomy, ependymomy a další. Nejčastějšímimezi nimi jsou gliomy, které vznikají z buněk podpůrnémozkové tkáně (neuroglie) a tvoří víc jak 50% všechprimárních mozkových nádorů. Klasifikace Světovézdravotnické organizace (WHO) dělí mozkové nádorypodle jejich histopatologie, zhoubnosti a mikroskopic-kého vzhledu do čtyř skupin : WHO grade I, WHO gradeII, WHO grade III a WHO grade IV. WHO grade I zahr-nuje nádory s nejlepšími a WHO grade IV naopak s nej-horšími prognózami na přežití pacienta. Do skupinyWHO grade IV patří např. vysoce zhoubné gliomy, glib-lastoma multiforme. Pacienti diagnostikovaní s tímtotypem nádorů mají velmi malou šanci na přežití a většina umíra do 8 měsíců po diagnóze nemoci.Léčba právě nádorů jako glioblastoma multiforme jenejvětší výzvou současné onkologie.

Současný léčebný standard pro pacienty s mozkový-mi nádory zahrnuje chirurgii, radioterapii a chemotera-pii. Nejdříve je však nutno typ nádoru co nejlépe a nej-přesněji diagnostikovat, neboť různým typům nádoruodpovídá i různý typ léčby. Obecně však platí, že prv-ním a základním léčebným postupem je chirurgickáoperace. Cílem neurochirurga je vždy odstranění maxi-mální části nádoru. To je však často limitováno jehovelikostí, ale především umístněním. Základním pro-blémem většiny zhoubných mozkových nádorů je jejichinfiltrativní charakter růstu, kdy nádorové buňky prorů-stají mezi zdravými a hranice nádoru tak nejsou ostré.Zřídkakdy se tak podaří odstranit nádor celý a zbývajícínádorová tkáň je pak léčena radioterapií, eventuelněchemoterapií v závislosti na histologickém typu nádo-ru. Ozařování (radioterapie) nastupuje většinou jakometoda doplňková k chirurgické resekci, nicméněv situacích, kdy operace není možná, se používá i jakometoda hlavní. Ozařování je metoda, která též poško-zuje zdravé buňky, ty jsou však více odolné než buňkynádorové. Délka ozařování se zpravidla pohybuje mezitřemi až šesti týdny. Během této doby pacient při stan-

MOZKOVÉ NÁDORY A JEJICH LÉČBAPetr BartíkKatedra biochemie, PřF UK Praha / Fakulta farmacie, Universita Louise Pasteura Strasbourg

31

Literatura:1. http://www.linkos.cz/pacienti/cns_clanek.php (MUDr.

Radek Lakomý: Zhoubné nádory mozku a míchy)2. www.lpr.cz/down/publikace/cns.doc (MUDr. Jan

Novotný: Nádory centrálního nervového systému)3. http://www.qmagazin.cz/index.php?option=com_

content&task=view&id=676&Itemid=61 (Tiskovákonference, Nemocnice Na Homolce, 9. 3. 2005,MUDr. Vladimír Dbalý)

4. Reardon D.A. et al.: J. Clin. Oncol. 24, 1253 (2006).5. Reardon D.A., Wen P.Y.: Oncologist 11, 152 (2006).6. Sathornsumetee S., Rich J.N.: Anticancer Drugs 17,

1003 (2006).

32

dardním ozařování dochází do ozařovny pětkrát zatýden. Chemotherapie je metodou z valné části doplň-kovou. Její účinnost je totiž často limitována sníženýmprůchodem cytostatika přes hematoencefalickou barié-ru. Nicméně v posledních několika letech se masivnějiprosadil temozolomide, derivát imidazotetrazinu mety-lující specifická místa DNA. Toto cytostatikum je velmivhodné jako doplňková léčba pro mozkové nádory,protože snadno prochází přes hematoencefalickoubariéru, dosahuje vysokých účinných koncentracív místě nádoru, nepotřebuje ke své aktivací jaternímetabolismus a je málo toxický. Používá se hlavněk léčbě recidivujících nádorů.

Tyto klasické léčebné postupy (chirurgie, radiotera-pie, chemoterapie) jsou velmi účinné pro některé typynádorů jako např. meningeomy, adenomy hypofýzy,germinativní nádory, které jsou pro moderní medicínuléčitelné a plně vyléčitelné. Bohužel vysoce zhoubnémozkové nádory (např. glioblastoma multiforme) jsoui přes moderní medicínské postupy neléčitelné a paci-enti mohou očekávat jen mírné prodloužení jejichpostdiagnostického života. To je základním důvodem,proč probíhá rozsáhlý výzkum nových možných cest,jak léčit tyto vysoce zhoubné mozkové nádory. Výcho-diskem je naše rostoucí poznání molekulárních změn,které prodělává normální buňka při transformaciv nádorovou. Výzkumníci se snaží najít takovou mole-kulu (enzym, receptor), která je ve zvýšené míře expri-

mována v nádorových buňkách a zároveň hraje důleži-tou roli v pochodech nutných pro rozvoj nádoru (proli-ferace, invasivita, migrace, neoangiogeneze). Cílem jepak zablokovat funkce zprostředkované touto moleku-lou, což postihne daleko více rychle se množící nádoro-vé buňky, než klidové normální buňky. Takovým léčeb-ným postupům se říká cílené terapie (targeted thera-pies). Mezi molekuly, na které se zaměřila pozornostvědců patří receptory pro růstové faktory (VEGFR,EGFR,PDGFR), kinasy (PKC, Raf kinase) a integriny. Přesdesítku let trvající výzkum na tomto poli s sebou přine-sl vývoj mnoha inhibitorů na bázi protilátek, malýchpeptidů nebo nepetidových mimetik, které v současnédobě vstupují do různých fází klinického testování. Zavšechny uveďme alespoň Bevacizumab (monoklonálníprotilátka proti VEGF), Cetuximab (monoklonální protilátka proti EGFR) a Cilengitide (inhibitor integrinuαVβ3 a αVβ5). Nejnovějším trendem je kombinovattyto nově objevené látky s již zavedenými terapiemi,což zvyšuje jejich účinek.

Nicméně i přes snahu výzkumných center a modernímedicíny jsou zhoubné mozkové nádory stále nemocísmrtelnou, prestože se daří prodlužovat a zkvalitňovatživot pacientů diagnostikovaných s touto chorobou.Věřím však, že s prohlubováním našich znalostí o mole-kulárních změnách doprovázejících nádorovou trans-formaci, se naučíme bojovat s touto nebezpečnou chorobou daleko účiněji.

POKYNY PRO AUTORYVážení přátelé, aby byla technická úprava našeho časopisu co nejlepší a s minimálním množstvím chyb, uvítali bychom dodržování některých dále uvedených zásad.

1. Texty zasílejte elektronickou formou jako “attachment” spolu s tištěnou verzí, aby bylomožno opravit chyby způsobené přenosem.

2. Texty pište v editoru WORD (formát .doc), písmo Arial, velikost 11. Nerozdělujte slova nakonci řádků. V textu lze používat zvýraznění některých termínů tučným písmem či kurzívou,a také horní a dolní index. Řádkování jednoduché. Odsazení odstavců a mezery mezi niminepoužívejte (nastavení = 0).

3. Nepoužívejte automatické číslování, tabulátory, ani „tvrdé“ definice stránek.4. Obrázky zasílejte zásadně zvlášť v některém z běžných formátů (.jpg, .tif).5. Připojte vždy svojí e-mailovou adresu či číslo telefonu, aby případné problémy bylo

možno rychle řešit.

Děkuji L. Fukal

Bednář Š.: Biological Fuel Cells 18

Hrdinová J.: Methods of the Anilin Removal from Waste-Water 21

Hudcová T.: Genus Pseudomonas: Basic Characteristics, Biofilm Forming 25

Slámová K.: Enzymes Marketed as Food Adjuncts 28

Bartík P.: Encephaloms and Their Therapy 31

C O N T E N T S

Š. Bednář: Biologické palivové články 18

J. Hrdinová: Metody odstraňování anilinu z odpadních vod 21

T. Hudcová: Rod Pseudomonas: Základní charakteristika, tvorba biofilmu 25

K. Slámová: Enzymy prodávané jako potravní doplňky 28

P. Bartík: Mozkové nádory a jejich léčba 31

V TOMTO ČÍSLE NAJDETE

BIOTECHNOLOGICKÁSPOLEČNOST

166 28 Praha 6, Technická 3

ISSN 1210-1737

Neprodejné – jen pro členy Biotechnologických společností

Podávání novinových zásilek povoleno Ředitelstvím pošt Praha, čl. NP 1177/1994 ze dne 13. 6. 1994