cultius cel·lulars - uab barcelona...•cèl·lules solitàries de la línia cel·lular l mostren...

CULTIUS CEL·LULARS Apunts 3r Biotecnologia

2020 UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA

Consell d’Estudiants de Biociències

Cultius Cel·lulars 2020

CEBIO 1

Índex Capítol I – Introducció ........................................................................................................... 3

Tema 1 – Breu Història dels cultius cel·lulars .................................................................... 3

Com hem estudiat l’ésser humà. .................................................................................... 3

Models d’Estudi de la fisiologia ...................................................................................... 4

Aplicacions dels estudis amb cultius cel·lulars. .............................................................. 5

Capítol II – Organització d’un Laboratori de Cultius Cel·lulars ............................................... 6

Tema 2 – Distribució d’instal·lacions i equipament ............................................................ 6

Consideracions clau pel plantejament i el disseny d’un laboratori. ................................. 6

Estructura de la Sala de Cultius. .................................................................................... 6

Estructura de les Sales associades a la sala de cultius. ................................................. 8

Tema 3 - Nivells de contenció biològica i Bioseguretat. .................................................... 8

Agents Biològics. ........................................................................................................... 9

Nivells de contenció biològica. ....................................................................................... 9

Comitès de Bioseguretat. ............................................................................................. 11

Gestió de Residus. ....................................................................................................... 12

Capítol III – Principis bàsics dels Cultius Cel·lulars animals. ............................................... 13

Tema 4 – Cultius Cel·lulars: Condicions físico-químiques i biològiques. .......................... 13

Condicions físico-químiques dels cultius cel·lulars ....................................................... 13

Condicions Biològiques ................................................................................................ 15

Tema 5 - Cultius cel·lulars: producció i manteniment. ...................................................... 18

Autoritzacions. ............................................................................................................. 18

Treballar en una Cabina de Seguretat Biològica. ......................................................... 18

Tipus de cultius de cèl·lules ......................................................................................... 18

Establiment d’un cultiu primari ..................................................................................... 18

Subcultiu de cèl·lules adherents .................................................................................. 19

Selecció o separació de cèl·lules ................................................................................. 19

Cellular Lifespan .......................................................................................................... 20

Tema 6 - Cultius cel·lulars: quantificació de cèl·lules ....................................................... 21

Recompte de cèl·lules.................................................................................................. 21

Quantificació cèl·lules vives/mortes en cultiu ............................................................... 22

Mort cel·lular regulada ................................................................................................. 23

Tema 7 - Cultius cel·lulars: criopreservació de cèl·lules ................................................. 24

Avantatges la criopreservació ...................................................................................... 24

Principis de la congelació ............................................................................................. 25

Protocols de congelació i descongelació. ..................................................................... 25

Estocs de cèl·lules. ...................................................................................................... 26


CEBIO 2

Tema 8 – Cultius cel·lulars: contaminacions. ................................................................... 27

Fonts de contaminació. ................................................................................................ 27

Contaminació biològica visible. .................................................................................... 27

Contaminació biològica no visible. ............................................................................... 27

Contaminacions creuades. ........................................................................................... 29

Tema 9 - Cultius cel·lulars: caracterització i autentificació. ............................................. 29

Mètodes de caracterització. ......................................................................................... 29

Caracterització morfològica. ......................................................................................... 29

Caracterització immunològica. ..................................................................................... 30

Caracterització citogenètica. ........................................................................................ 30

Polimorfismes de DNA. ................................................................................................ 31

Cas exemple. ............................................................................................................... 31

Tema 10 - Tècniques especials: sincronització cel·lular. ................................................. 32

El cicle cel·lular. ........................................................................................................... 32

Mètodes físics de separació de cèl·lules. ..................................................................... 33

Mètodes químics de separació de cèl·lules. ................................................................. 34

Capítol IV - Biotecnologia en cèl·lules animals i teixits. ....................................................... 35

Tema 11 - Línies cel·lulars en recerca i producció biotecnològica. ................................. 35

Expression host Systems. ............................................................................................ 35

Cèl·lules de mamífer. ................................................................................................... 35

Cases comercials. ........................................................................................................ 36

Tema 12 - Escalat de cultius cel·lulars ............................................................................ 36

Biotecnologia vermella. ................................................................................................ 36

Consideracions per l’escalat. ....................................................................................... 37

Sistemes d’immobilització de cèl·lules. ........................................................................ 37

Producció de productes cel·lulars. ............................................................................... 37

Producció de cèl·lules. ................................................................................................. 38

Substitució de proves en organismes. .......................................................................... 39


CEBIO 3

Capítol I – Introducció

Tema 1 – Breu Història dels cultius cel·lulars

Com hem estudiat l’ésser humà.

L’ésser humà ha estat, des de fa molts i molts anys, interessat en el seu propi cos. N’ha estat

interessat tant a nivell de malalties que el poden afectar com a nivell del seu

desenvolupament. Per tant, l’ésser humà ha hagut de buscar diverses maneres d’investigar-

se a si mateix sol i en interacció amb altres espècies.

Però investigar els complexos mecanismes que regulen la malaltia i el desenvolupament

humans no és senzill. La nostre incapacitat d’observar i pertorbar, directament, els processos

biològics d’interès ens dificulta aquesta tasca. En conseqüència, la recerca s’ha de basar en

l’ús de models d’estudi i en sistemes in vitro.

El problema de cadascun d’aquests és la seva baixa rellevància fisiològica respecte l’ésser

humà, ja que n’és ben diferent. En el que superen a aquest és en la tractabilitat

experimental, és a dir, la facilitat amb la que es poden fer servir en els experiments.

La història dels cultius cel·lulars ha tingut les següents fites al llarg del temps:

1885

•S'aconsegueix mantenir cèl·lules vives en una solució salina i fora del cos de l'animal del ques'han extret.

1913

•Les cèl·lules poden crèixer per llargs períodes en cultius alimentats regularment sotacondicions asèptiques.

1948

•Cèl·lules solitàries de la línia cel·lular L mostren que poden fer clons de cèl·lules en cultius deteixits.

1952

•S'estableix una línia continua de cèl·lules humanes derivades d'un carcinoma cervical a les quemés tard s'anomenaran HeLa Cells.

Finals dels 1980s i principis dels 1990s

•Quasi totes les cèl·lules del medi estan envoltades per altres cèl·lules i per la matriuextracel·lular.

•Els cultius de cèl·lules en tres dimensions prenen en consideració tots els aspectes ambientalsde les mateixes.

2008 - 2009

•Orgànuls intestinals es poden derivar de cèl·lules mare adultes.

•Les cèl·lules mare pluripotents podrien refer in vitro el desenvolupament de teixits corticals.

2010

•Es crea el terme Organ-on-a-chip.


CEBIO 4

Models d’Estudi de la fisiologia

Cultius 2D

Els cultius en dues dimensions (cultius 2D) són el mètode d’estudi de l’ésser humà amb

menor rellevància fisiològica però amb major tractabilitat experimental. Consisteixen en un

conjunt de cèl·lules vives adherides a una superfície plana. Aquesta pot ser de plàstic o

d’algun element metàl·lic.

Cultius 3D

A la vida real, la cèl·lules d’un ésser humà no es troben soles i aïllades, sinó que tenen un

conjunt d’elements al voltant. A part de la resta de cèl·lules iguals que ella que formen un

òrgan o una estructura, les cèl·lules tenen una matriu i secreten un conjunt de factors de

creixement que els són essencials. Per tal de poder analitzar algunes d’aquestes estructures

que formen les cèl·lules d’un teixit o conjunt de teixits, es fa un cultiu de les mateixes en

immersió en una matriu proteica.

Si en aquest cultiu tan sols hi creixen densament cèl·lules d’una línia cel·lular i d’un sol tipus

cel·lular, se’ls sol permetre formar agregats 3D en la suspensió. En aquest cas s’anomena

cultiu histotòpic o monotípic.

En el cas que al cultiu hi hagués cèl·lules de diferents llinatges recombinades o mesclades,

se’n determinaria la ràtio i les relacions espacials per recrear un component de l’òrgan

d’estudi.

Organoides i Òrgan-on-a-chip.

Un organoide és una versió miniaturitzada i simplificada d'un òrgan produït in vitro en tres

dimensions que mostra una microanatomia realista. Es deriven d'una o poques cèl·lules d'un

teixit, cèl·lules mare embrionàries o cèl·lules mare pluripotents induïdes, que poden

autoorganitzar-se en un cultiu tridimensional a causa de les seves capacitats d'autorenovació

i diferenciació1.

El terme òrgan-on-a-chip, inventat per Donald Ingber, es basa en el nostre coneixement dels

òrgans humans per dissenyar-ne fragments en els quals les cèl·lules formants i el seu

microambient estan extremadament controlats. Aquesta tècnica no només incorpora múltiples

tipus de cèl·lules, sinó que també involucra aspectes d’enginyeria com el control de l’espai

final i la incorporació de sensors i canals microfluídics.

Avantatges i Desavantatges de l’ús de cèl·lules.

Els cultius en una matriu proteica tenen una sèrie d’avantatges respecte els altres tipus

d’investigacions. Per començar, els cultius en una matriu proteica fan servir una quantitat

relativament petita de cèl·lules, el que permet reduir el nombre d’animals amb els que es

treballa. Per un altre banda, cultivar algunes cèl·lules atorga un major control sobre

variables molt difícils de gestionar en obert, com les dosis que es subministren, en qui temps,

a quina concentració... i això sense ni tan sols mencionar el control de les condicions

fisiològiques! Finalment, donat que les cèl·lules inicials d’un cultiu de cèl·lules en una matriu

proteica són poques i que es coneixen en profunditat molts dels passos que s’hauran de

seguir durant el procés, és possible mecanitzar i obtenir gran quantitat de cèl·lules al final

del cultiu.

No per tenir unes tres avantatges, els cultius en matrius no tenen limitacions. En són

principalment dos: el requeriment d’experiència prèvia en el treball i la possibilitat d’haver-

1 Extret de la Viquipèdia.


CEBIO 5

hi inestabilitat plasmídica, ja sigui genotípica o fenotípica arran de la divisió i la reproducció

cel·lulars.

Aplicacions dels estudis amb cultius cel·lulars.

Els cultius cel·lulars tenen moltes aplicacions, des de l’estudi de l’activitat intracel·lular fins a

la producció de teixits tot passant per la proteòmica i la genòmica. En l’àmbit concret de la

biotecnologia en destaquen les aplicacions d’enginyeria de teixits i l’obtenció de productes

cel·lulars, d’entre els quals trobem molts medicaments.


CEBIO 6

Capítol II – Organització d’un Laboratori de Cultius Cel·lulars

Tema 2 – Distribució d’instal·lacions i equipament

Consideracions clau pel plantejament i el disseny d’un laboratori.

En el mateix moment què tenim clar que volem realitzar una investigació sobre la vida

(humana o bacteriana) cal que assumim que hi haurà un punt on caldrà treballar amb cèl·lules.

Això no es pot fer en un laboratori qualsevol ni de qualsevol manera. Per tant, en

dissenyar el nostre laboratori cal que ens plantegem quina estructura tindrà i quin nivell de

contenció biològica necessitarà.

L’estructura d’un laboratori ve definida per 3 factors: quantitat d’usuaris que el faran servir,

l’espai disponible que hi ha i les àrees de treball que caldrà fer servir. Segons aquests

criteris es prendran les decisions de la mida de la sala (gran o petita) i de si aquesta serà

única o en tindrà d’adjacents.

En el cas de contenció biològica, però, la intenció no és tant la comoditat i eficiència amb

què es treballa. Enlloc d’això, té a veure amb les mesures i controls que ha de tenir el

laboratori en qüestió. Principalment, des de l’aspecte de la contenció biològica, el més

important és saber el tipus de treball que es farà al laboratori, el nivell de bioseguretat que

aquest tipus de treball implica per la meva investigació i els mecanismes que cal seguir per

evitar la contaminació i mantenir així l’esterilitat.

Estructura de la Sala de Cultius.

En el disseny de l’estructura de la sala o sales de laboratori cal tenir molt clar que sempre que

es treballa amb cèl·lules es necessita, si ó sí, de cert equipament i seguretat bàsics.

Equipament inventariable bàsic.

L’element més important en el treball amb cèl·lules és el que s’anomena campana de cultiu

cel·lular. Aquesta estructura de vidre i filtres serveix per generar un espai aïllat de la resta

de laboratori. Una de les més utilitzades quan els riscos són baixos són les campanes de

flux laminar.

Una campana de flux laminar, el qual pot ser horitzontal o vertical, genera un espai on treballar

amb un producte o espècie on estarà protegida de la contaminació per partícules com els

microorganismes. Això s’aconsegueix gràcies al flux laminar d’aire net que ha sortit del filtre

HEPA, el qual es bufa a través de l’espai de treball en direcció a l’usuari i al laboratori.

Arran d’aquest flux cap a l’usuari, una campana de flux laminar normal i corrent no atorga

cap protecció a l’investigador enfront de materials infecciosos o químicament perillosos. El

que si que atorga aquest nivell de protecció son les cabines de seguretat.

Existeixen 3 tipus de cabines de seguretat biològiques, cadascuna més protectora de l’altre.

Les classificacions es fan en ordre ascendent de seguretat, obtenint les Classes I, II i III.

Consideracions clau pel plantejament i disseny d'un laboratori

EstructuraQuantitat d'usuaris

Espai disponible

Àrees de Treball

Contenció biològica

Tipus de treball

Bioseguretat

Mecanismes d'esterilitat


CEBIO 7

Les cabines de seguretat Biològica de classe I protegeixen l’usuari i el medi ambient però

no el producte. En aquestes cabines, l’aire és aspirat cap a la cabina i expulsat lluny de

l’investigador, normalment per la part superior.

Les cabines de Seguretat Biològica de classe II es separen en 4 subtipus (A1, A2, B1 i B2)

però totes elles protegeixen el producte o espècie, l’usuari i el medi ambient de

contaminar-se. Les cabines de Bioseguretat de tipus B atorguen protecció a l’usuari al

treballar amb vapors i gasos on es necessiten condicions asèptiques. En aquests casos el

flux d’aire és eliminat en un 70 o un 100% de la cabina. Aquestes cabines han d’estar

connectades al sistema d’expulsió de l’aire de l’edifici.

Les cabines de seguretat biològica de classe III són aquelles on es fan servir caixes vidriades

amb guants incorporats i garanteixen la màxima protecció per treballar en laboratoris de

contingència de bioseguretat de nivell 4. Aquest tipus de cabines són essencials per

treballar amb agents amb un nivell 4 de bioseguretat o altres materials perillosos com aerosols

de patògens o toxines. Aquestes caixes de guants segellades hermèticament amb un accés

a través d’un segon tanc o càmera de doble porta adjacent permeten aplicar una

descontaminació si fos necessari. Normalment, les cabines de seguretat biològica de classe

III tenen dos filtres HEPA en el sistema d’expulsió d’aire per afegir una protecció ambiental

superior.

Malgrat les campanes de cultiu cel·lular són l’element més important en el treball amb cultius

cel·lulars, no es poden obviar altres equipaments igualment essencials com un incubador

(preferiblement humit i de CO2), un microscopi de contrast de fase invertit, un comptador

de cèl·lules, un contenidor de nitrogen líquid, un bany d’aigua, una centrífuga, un

congelador o nevera i un contenidor d’emmagatzematge.

Seguretat Bàsica.

En el disseny de l’estructura de la sala o sales de laboratori cal tenir molt clar que sempre que

es treballa amb cèl·lules es necessita, si ó sí, de cert equipament i seguretat bàsics.

En referència a la seguretat, a tots els laboratoris hi ha d’haver uns contenidors de residus,

els quals es separen en diferents categories i en destaca els de residus bioperillosos, els

equipaments de protecció individual (o EPIs) i les alarmes. Els equipaments de protecció

individual difereixen una mica dels contenidors de residus i de les alarmes, ja que no són

material de seguretat per tot el laboratori sinó que són elements de seguretat que només

protegeixen a l’individu que els porta. Són EPIs les bates de laboratori, els guants, les

mascaretes, les ulleres...

En un laboratori hi ha d’haver, sempre, dos tipus d’alarmes. L’alarma d’oxigen és essencial

perquè l’absència o baixos nivells d’aquest gas poden produir pèrdua de consciència, danys

cerebrals greus i fins i tot la mort per asfíxia. Una alarma que indiqui que les seves

concentracions són baixes pot evitar que es produeixin aquests efectes prenent mesures

ràpides.

L’altre alarma important és la de diòxid de Carboni, conegut com “assassí silenciós” per la

seva manca d’olor característica (al contrari que al butà, per exemple). La seva inhalació en

altes concentracions és, òbviament, mortal i ningú és capaç d’adonar-se’n fins que ja és

massa tard.

Altre equipament inventariable.

En un laboratori les campanes, les centrífugues i les alarmes són elements essencials que

sempre hi ha d’haver, però existeixen una sèrie d’equipaments que, de ser-hi, agilitzen la

feina del laboratori i la fan molt més eficient que no pas si no hi fossin. Són d’aquest tipus


CEBIO 8

d’equipaments els sistemes d’aspiració, els vòrtex, els microscopis invertits de

fluorescència i les pipetes automàtiques i pipetejadors.

Estructura de les Sales associades a la sala de cultius.

Investigar no consisteix només en realitzar els experiments que creguem convenients, sinó

que té associats molts altres processos. Aquests, arran de les seves característiques, no es

poden dur a terme a la sala de cultius, que és l’espai del laboratori on es realitzen totes

les pràctiques relacionades amb la nostra investigació. Depenent de les seves

característiques, els processos associats s’hauran de dur a terme en sales també associades

a la principal. Aquestes sales, a més, han d’estar estructurades per no dificultar la recerca.

Les tres activitats principals que cal tenir en compte són: la neteja, l’esterilització i la

preparació de solucions. Aquestes tres es poden realitzar en la mateixa sala, a la qual es

sol anomenar “sala de preparació”. Quan es planifica l’existència d’aquesta sala també es

solen dissenyar les sales de quarantena i de microscòpia. La primera no té contacte directe

amb la sala d’experimentació principal i serveix per recollir les mostres i línies cel·lulars

comprades i mantenir-les a una temperatura còmode per comprovar si són pures o si estan

contaminades amb altres línies cel·lulars. La sala de microscòpia sí que sol estar connectada

amb la sala principal i és, tal i com el seu nom indica, on es fan les mesures amb els

microscopis.

Quan l’espai és més gran i es disposa de moltes més sales, es mira d’aïllar amb un passadís

les sales de neteja, esterilització, preparació de solucions i emmagatzematge perquè sigui

més difícil el contacte amb la sala d’experimentació i evitar així contaminacions. Les dues

sales adjacents anteriors continuen dissenyant-se adjacents per agilitzar el funcionament del

laboratori.

Equipament bàsic de les sales associades a la sala de treball

En els processos de neteja, esterilització i preparació de solucions és adient disposar d’una

sèrie d’equipaments per tal que siguin mínimament funcionals. Per tal de netejar són

clarament indispensables piques i aixetes que permetin eliminar el màxim de restes

possibles dels recursos que s’han fet servir. Per tal d’esterilitzar cal un mètode d’esterilització

per calor sec (que permeti fer pasteuritzacions) i un de calor humit (un autoclau). Aquests

mètodes, combinats amb alguns indicadors físics o biològics d’esterilització i amb la llum

ultraviolada, permeten aconseguir un material reutilitzable al laboratori. En la preparació de

solucions no es pot permetre la presència de substàncies no desitjades, per això és necessari

tenir un mecanisme de purificació d’aigua i, a més, una filtració de la mateixa.

Tema 3 - Nivells de contenció biològica i Bioseguretat. La bioseguretat, en el sentit més ampli, es pot definir com el conjunt de mesures dirigides

a prevenir i protegir les saluts humana, animal, vegetal i del medi ambient davant de

tots aquells agents, factors i riscos d’origen biològic. Les mesures es poden prendre en

el camp de l’organització, pràctiques de treball, disseny d’instal·lacions, equips de seguretat,

etc.

Per poder valorar si allò amb el què s’està treballant necessita d’algun tipus concret de

contenció biològica o alguna mesura de precaució addicional es consulten els comitès de

bioseguretat com el de la UAB. Els comitès de bioseguretat avaluen l’agent biològic amb

què es treballa i l’activitat que amb ell es realitza, el que dictaminarà el grau de bioseguretat

que cal aplicar. Si el laboratori compleix amb aquesta bioseguretat, el comitè generarà un

certificat per tal que el laboratori pugui realitzar el seu experiment. De vegades, però, cal


CEBIO 9

també un certificat del comitè de bioètica per poder realitzar l’experiment. La UAB disposa

d’un Comitè de Bioseguretat i un de Bioètica.

Agents Biològics.

Un agent biològic és un element viu que es fa servir en un laboratori. Per tal d’analitzar el

risc que suposa treballar amb algun d’ells, es classifiquen en 4 grups de risc segons el seu

risc infecciós, el seu risc de propagació a la col·lectivitat i l’existència de profilaxi o

tractaments eficaços.

Aparts d’aquests tres criteris (Capacitat de causar una malaltia, capacitat d’infectar i

disponibilitat de mesures terapèutiques) es solen prendre en consideració altres factors de

risc. Es té en compte el mode de transmissió, la dosi infectiva, l’estabilitat, el rang

d’hostes i vectors, la naturalesa endèmica, l’efecte sobre altres espècies i l’efecte sobre

l’economia i el medi ambient.

Dins del grup de risc 2 és on trobem els teixits, sang i fluids d’origen humà o d’altres

primats. També formen part del grup de risc 2 les línies cel·lulars establertes, els cultius

primaris d’origen humà i qualsevol tipus de mostra en què existeixi la incertesa sobre la

presència d’agents patògens humans.

Per obtenir més informació respecte els agents biològics es pot consultar la pàgina web

(www.insst.es/databio-fitchas-de-agentes-biologicos)

Nivells de contenció biològica.

Hi ha 4 Nivells de Contenció Biològica reconeguts universalment. Els BSL (BioSafety Levels)

estan ordenats de menor a major contenció. Aquests nivells, malgrat ser la mateixa quantitat

i ordre, NO són grups de risc (tot i que es correlacionen amb ells). Els Nivells de Contenció

venen determinats per una combinació específica de:

Agent Biològic del Grup de Risc 1

•Poc probable que causin malalties.

•No existeix un risc que es propagui a la col·lectivitat.

•El seu tractament, en cas d'infecció, és innecessari.


•Pot causar una malaltia i constituir un perill pels treballadors.

•Té poca probabilitat de propagar-se a la col·lectivitat

•En cas d'infecció, existeix un tractament eficaç de manera general


•Pot provocar una malaltia greu i constitueix un perill pels i les treballadores.

•És probable que aquest agent es propagui a la col·lectivitat.

•En cas d'infecció, existeix un tractament eficaç de manera general.


•Provoca una malaltia greu i constitueix un seriós perill pels i les treballadores.

•Hi ha una elevada probabilitat que es propagui a la col·lectivitat.

•No se'n coneix un tractament eficaç.

http://www.insst.es/databio-fitchas-de-agentes-biologicos


CEBIO 10

BioSafety Level 1.

El BSL-1 és el nivell bàsic de protecció comú a la majoria de laboratoris de recerca i

laboratoris clínics i és adequat per a agents dels que no es té constància que causin

malalties en humans normals i sans.

En aquest tipus de laboratoris el treball es pot realitzar en una poyata de laboratori o en una

taula, la instal·lació ha de disposar d’un lavabo per al rentat de mans i ha de tenir portes per

separar l’espai de treball amb la resta de la instal·lació.

Les pràctiques que es segueixen són les estàndards i calen equips de protecció individual

que es porten segons calgui. Entre aquests equips es troben la bata de laboratori, guants i

protecció pels ulls.

Biosafety Level 2.

El BSL-2 és adequat per agents de risc moderat que se sap que causen malalties humanes

de diversa gravetat per ingestió o mitjançant exposicions percutànies o a la mucosa. La

majoria de laboratoris de cultiu cel·lular han de ser com a mínim BSL-2 però els requisits

exactes depenen de la línia cel·lular utilitzada i de tipus de treball realitzat.

En aquests laboratoris es tenen totes les mesures de BSL-1 i, a més, hi ha d’haver un accés

controlat, un autoclau i una cabina de bioseguretat. Les cabines de seguretat són per fer-

hi tots els procediments que puguin generar aerosols o esquitxades. L’autoclau dels

laboratoris de BSL-2 és substituïble per un mètode alternatiu de descontaminació per a la

seva correcta eliminació. Els equips de protecció d’un BSL-2 són iguals que els d’un BSL-1

i un EPI adequat, incloent-hi bata i guants de laboratori. També es pot portar protecció per als

ulls i per a cara, segons sigui necessari.

Biosafety Level 3.

El BSL-3 està dissenyat i preparat per al treball amb microorganismes del grup de risc 3 i amb

grans volums o altes concentracions de microorganismes del grup de risc 2 que suposin un

augment de la possibilitat de propagació dels aerosols. La contenció del nivell 3 de

bioseguretat requereix l'enfortiment dels programes de seguretat operatius i superiors als dels

laboratoris bàsics. Són laboratoris adequats per a agents indígenes o exòtics amb un

potencial conegut de transmissió d’aerosol i per a agents que poden causar infeccions greus

i potencialment letals com el causant de la tuberculosi o la SIDA.

Biosafety Level 4.

El laboratori de contenció màxim, BSL-4, està dissenyat per a treballs amb microorganismes

del grup de risc 4. Abans que es construeixi i es posi en funcionament un laboratori d’aquestes

característiques, s'haurien de realitzar consultes intensives amb institucions que tinguin

experiència en operar una instal·lació similar. Els laboratoris operatius BSL-4 haurien d'estar

sota el control de les autoritats sanitàries nacionals o d'altres autoritats. Les entitats

Equips de protecció individual

Bones pràctiques microbiològiques

Equips de seguretat

Disseny i construcció d’instal·lacions


CEBIO 11

que treballin per desenvolupar un laboratori de nivell bioseguretat 4 s'han de posar en

contacte amb el programa de Bioseguretat de la OMS. El BSL-4 és adequat per a agents

exòtics que presenten un risc individual elevat de malalties que poden posar en perill i per

aerosols infecciosos i per als quals no hi ha tractament disponible. Aquests agents estan

restringits a laboratoris d’alta contenció.

Indicacions del Centro Nacional de Biotecnología.

Segons el CNB, en el seu manual de seguretat i higiene en els laboratoris de seguretat

biològica, als laboratoris BSL-1 només s’hi ha de dur a terme la manipulació de fluids, teixits

i òrgans d'origen animal o vegetal, tenint la certesa de la inexistència d'Agents Biològics

patògens humans contaminants; la manipulació de mostres constituïdes per fluids, teixits

i òrgans d'origen humà o d'altres primats inactivades prèviament mitjançant mètodes

verificats en laboratoris NCB2 o superiors; la manipulació d'Agents Biològics silvestres

purificats no patògens per a humans, animals o plantes ni possiblement nocius per al

medi ambient; i la manipulació, cultiu o producció d'OMG en Activitats d'utilització

confinada a laboratoris de Tipus 1.

En canvi, consideren que als laboratoris de BSL-2 el que s’hi ha de fer és la manipulació de

teixits i fluids d'origen humà o d'altres primats assimilables al grup de risc 2, sempre

que no se sospiti la presència d'Agents biològics dels Grups de risc 3 o 4, la manipulació

d'Agents Biològics silvestres purificats del GR 2 com a màxim o patògens per animals

o plantes assimilables al Grup de risc 2 com a màxim, el Cultiu de línies cel·lulars

establertes o de teixits primaris d'origen humà o d'altres primats sempre que no se sospiti

o no es conegui la presència d'Agents Biològics de l'GR3 o GR4, la manipulació, cultiu o

producció d'OMG en Activitats d'utilització confinada Tipus 2 (ACT2) com a màxim;

l'obtenció i manteniment de línies de ratolins transgènics i "Knockout" en ACT2 i la

Producció i cultiu de plantes transgèniques en ACT2.

Comitès de Bioseguretat.

Un comitè de bioseguretat és un organisme que determina el risc biològic sobre un

determinat agent o activitat per establir quines son les condicions d’infraestructura de

contenció o confinament necessàries i quines normes s’hi han de complir.

Els Comitès de Bioseguretat es recolzen en els paràmetres recollits en la legislació, com

en els que dictin les autoritats competents per a aquest tipus d'avaluacions. Poden sol·licitar

Aspectes a analitzar amb qualsevol tipus de material biològic

Possible patogenicitat.

Vies de transmissió i gamma d'hostes.

Tipus d'activitats i tècniques a realitzar.

Quantitat i concentració de l'agent a manipular.

Disponibilitat de mesures de contenció i protecció eficaços.

Disponibilitat de profilaxi i tractament sanitari eficaços.

Experiència prèvia i formació de personal que realitzarà les activitats

Aspectes a analitzar amb OMG

Característiques de l'organisme receptor o parental i del donant si existís.

Característiques de l'insert o inserits.

Característiques de el vector o vectors utilitzats.

Possible inducció de patogenicitat.

Canvis en la patogenicitat (tropisme, virulència, etc.).

Possible impacte en el medi ambient després una fuita accidental.


CEBIO 12

més informació si existissin dubtes sobre les característiques dels organismes a utilitzar o

produir o sobre les condicions d'execució.

Gestió de Residus.

Considerem residus biològics no bioperillosos els que són o contenen Agents Biològics de

grup 1 i que, per tant, tenen una capacitat molt reduïda d'induir o produir una infecció, una

al·lèrgia o toxicitat als éssers vius i que no suposen cap perill per al medi ambient.

Són residus biològics bioperillosos els residus que són o contenen Agents Biològics de grup

2 de perillositat o superior i, per tant, tenen capacitat de produir una infecció, una al·lèrgia o

toxicitat als éssers vius, o de ser perillosos per al medi ambient. També s'inclouen els

organismes genèticament modificats (OGM) de qualsevol grup. Els residus bioperillosos es

guarden en tancs que després s’incineren en una empresa especialitzada. Els materials

citotòxics són processats de manera específica.


CEBIO 13

Capítol III – Principis bàsics dels Cultius Cel·lulars animals.

Tema 4 – Cultius Cel·lulars: Condicions físico-químiques i biològiques.

Condicions físico-químiques dels cultius cel·lulars

Les cèl·lules, cultivades in vitro, necessiten trobar-se en unes condicions el més similars

possible a quan es troben in vivo. Això significa que els paràmetres de Temperatura, pH i

pressió osmòtica han d’estar controlats a la perfecció. Cal tenir en compte que les cèl·lules

es troben adaptades a la temperatura fisiològica de l’organisme del qual provenen, que la

majoria de cèl·lules de mamífer creixen correctament a un pH de 7.4 i que un excés de soluts

a l’exterior o l’interior de la membrana plasmàtica pot acabar produint una crenació o una lisi,

respectivament.

Un altre factor a tenir en compte però que no té la intenció d’imitar les condicions fisiològiques

és el suport i substrat dels cultius. Això és perquè els contenidors dels cultius atorguen una

barrera contra la contaminació per protegir els cultius de l’ambient exterior mentre mantenen

l’interior.

Temperatura.

Per poder fixar correctament el factor físic de la temperatura cal saber quines cèl·lules tenim

i de quin organisme provenen. Els principals tipus de cèl·lules i les seves temperatures de

creixement són les següents:

El control de la temperatura del cultiu és molt important, ja que les cèl·lules, en la seva gran

majoria, no toleren increments de més de 2ºC de la temperatura d’incubació i moren. Pel

contrari, solen sobreviure a una temperatura inferior malgrat això es tradueixi en una

proliferació reduïda. Aquesta reducció és arran d’un alentiment de tot el cicle cel·lular provocat

per un allargament de la fase G1, el que permet sincronitzar un cultiu de cèl·lules

asincròniques.

Composició de la fase gasosa i pH.

Malgrat semblin espais inconnexes, el control del pH es troba molt relacionat amb el de la

composició de la fase gasosa, sobretot en relació al diòxid de carboni, el qual es troba en

equilibri amb la concentració de protons del medi de cultiu.

Cèl·lules Humanes i de Mamífer

•La majoria de línies cel·lulars es mantenen entre 36ºC i 37ºC per un creixement òptim.

•En són una excepció les cèl·lules testiculars, per exemple, que creixen a 32ºC.

Cèl·lules d'Insectes

•Es cultiven a 27ºC per un creixement òptim.

•Per obtenir un creixement més lent es cultiven per sota de 27ºC o entre 27 i 30ºC.

Cèl·lules d'Aus

•Necessiten d'una temperatura de 38.5ºC per un creixement màxim.

•També es poden fer crèixer a 37ºC, tot i que ho faran més lent.

Cèl·lules d'Animals de Sang Freda

•Són les cèl·lules sortides d'amfibis o de peixos d'aigua freda.

•Toleren un rang de temperatura d'entre 15 i 28ºC.


CEBIO 14

Això és perquè el diòxid de carboni, en equilibri entre els seus estats gasós i soluble, pot

reaccionar amb l’aigua quan es troba en aquest segon. La reacció amb l’aigua produeix

àcid carbònic (H2CO3), un àcid feble que allibera protons al medi de cultiu.

𝐶𝑂2𝑔𝑎𝑠ó𝑠 ⇌ 𝐶𝑂2𝑙í𝑞𝑢𝑖𝑑 + 𝐻2𝑂 ⇌ 𝐻2𝐶𝑂3 ⇌ 𝐻+ + 𝐻𝐶𝑂3−

És important mantenir el pH a nivells òptims tant a cultius tancats, on la concentració de

diòxid de carboni va augmentant i per això es redueix el pH, com en sistemes de cultius

oberts, on es sol perdre tant de CO2 a l’atmosfera que el pH ha d’augmentar per compensar-

ho.

Per contrarestar aquests efectes hi ha diverses opcions. Per començar, en els cultius tancats

el tamponament es sol fer amb alts nivells d’aminoàcids, galactosa i piruvat i sense

bicarbonat. En sistemes de cultiu oberts, en canvi, cal mantenir constant la pressió de diòxid

de carboni alhora que es tampona el medi de cultiu mitjançant bicarbonat o HEPES.

L’HEPES és un bon tampó per pH entre 7.2 i 7.6. Tenint en compte que la majoria de cèl·lules

creixen a un pH que es troba entre 7.2 i 7.4, això està molt bé. A més, es pot fer servir HEPES

en incubacions amb i sense CO2. Així i tot, quan hi hagi diòxid de carboni l’efecte tamponant

del HEPES és òptim a concentracions com a mínim dobles de la del bicarbonat. Cal tenir en

compte, però, que l’HEPES és un producte tòxic si es troba en altes concentracions, com

també cal tenir en compte que genera peròxid d’hidrogen si entra en contacte amb la llum.

Per evitar haver de posar gaire tampó es fan servir taps de cultiu permeables al CO2.

S’utilitzen, sobretot, en cultius amb una pressió de diòxid de carboni d’entre el 2 i el 10% i

possibiliten l’intercanvi de gasos del cultiu amb l’exterior sense comprometre’n l’esterilitat. A

més, als medis s’hi afegeix roig de fenol com a indicador de pH. Aquest producte acoloreix

els cultius segons el seu valor d’acidesa: vermell a pH 7.4, rosat a més de 7.6, taronja a 7.0 i

groc a 6.5. En cas que es torni de color groc és esperable suposar una contaminació per

bacteris, ja que aquests produeixen més CO2 que les cèl·lules animals. Així i tot, el roig fenol

no s’ha de fer servir en cultius de cèl·lules sensibles a estrògens, com les cèl·lules mamàries,

ni tampoc quan es fan estudis de citometria de flux.

Pressió Osmòtica.

La pressió osmòtica és aquella que es dona en referència a la quantitat total de soluts en

una solució aquosa. Aquesta quantitat es calcula mitjançant l’osmolalitat i l’osmolaritat.

L’osmolalitat s’aconsegueix dividint la quantitat d’osmols del solut entre els quilograms del

solvent, mentre que l’osmolaritat s’obté del quocient dels osmols de solut entre els litres de

solvent. Un osmol és un mol de partícula de solut independentment de la composició exacte

de la molècula. Per entendre millor el concepte d’osmol farem servir 4 exemples:

És important controlar la pressió osmòtica per no tenir ni medis hipertònics, on l’osmolaritat

del medi és superior al de les cèl·lules i aquestes es turgeixen, ni tampoc medis hipotònics,

1 mol de Glucosa

1 Osmol Glucosa

1 mol NaCL

1 Osmol Na+

1 Osmol Cl-

1 mol NaHCO3

1 Osmol Na+

1 Osmol HCO3

-

1 mol Na2SO4

2 Osmols Na+

1 Osmol SO4

2-


CEBIO 15

on l’osmolaritat del medi és inferior al de les cèl·lules i aquestes es lisen. S’ha de buscar

l’osmolaritat del medi justa per tal que aquest sigui isotònic.

Tipus de contenidors i substrats.

Els cultius cel·lulars poden ser de cèl·lules adherents o de cèl·lules en suspensió. Els dos

tipus de cèl·lules es diferencien en el que el seu nom ja bé diu: s’adhereixen al contenidor i

allà creixen o creixen al medi sense unir-se al contenidor. Ambdós tipus de cèl·lules poden

ser estacionàries o mòbils.

La majoria de les cèl·lules són cèl·lules adherents. Aquestes, quan son estacionàries,

creixen en flascons, plats i en pouets que no es troben en moviment. Són els sistemes de

cultiu més fàcils de fer servir i són els que necessiten menys equipament. Així i tot, les cèl·lules

adherents estacionàries requereixen molta feina intensiva per produir-ne en grans quantitats.

Si són cèl·lules adherents mòbils es solen cultivar en ampolles rodants que giren a una

velocitat d’entre 0.5 i 1 rpm en tambors. Es fan servir per produir grans quantitats de cèl·lules.

Les cèl·lules en suspensió solen ser línies hematopoètiques2, alguns tipus de cèl·lules

transformades, gàmetes... En cas que siguin cèl·lules estacionàries, creixen sense agitació

en plats i flascons sense tractar. Són molt útils per fer créixer petits volums de cèl·lules

independents d’ancoratge que creixen malament en cultius en suspensió tradicionals. En cas

que siguin cèl·lules mòbils, les cèl·lules en suspensió creixen en bioreactors, fermentadors

o flascons giratoris. Les cèl·lules en suspensió mòbils solen ser el mètode per produir grans

volums de cèl·lules tant al laboratori com a la indústria.

Els substrats d’un cultiu cel·lular poden ser sòlids inorgànics com el vidre o el plàstic,

semisòlids orgànics com l’agar, la gelatina o el metocel, matrius com el col·lagen, la poli-

lisina o la fibronectina, o poden ser un co-cultiu amb altres tipus cel·lulars que subministrin

factors de creixement, nutrients... Cal anar amb compte en la preparació de les matrius, doncs

la presència de molècules lliures (no adherides al plàstic) pot ser tòxica per a les cèl·lules.

Les cèl·lules mare creixen entre fibroblasts. La capa d'alimentació ajuda a proporcionar

nutrició per a les cèl·lules mare a més de factors que les eviten diferenciar.

La matriu CELLvo™ és una matriu extracel·lular (ECM) de proteïnes sintetitzada in vitro per

cèl·lules estromals de la medul·la òssia. Aquest producte està compost per més de 150

proteïnes que van ser secretades i reunides per cèl·lules de medul·la òssia durant la

producció de la matriu CELLvo™. El producte final és lliure de cèl·lules, només amb l'ECM

unida a la superfície del recipient de cultiu. Aquest substrat de cultiu cel·lular proporciona un

microambient tridimensional natiu, que es pot utilitzar per a una expansió cel·lular ràpida i

fiable de cèl·lules mare mesènquimes de gran qualitat (MSCs).

Condicions Biològiques

Les condicions biològiques d’un cultiu venen donades per les solucions salines

equilibrades i pels medis de cultiu.

Les solucions salines equilibrades tenen una composició simple que només inclou sals

inorgàniques tot i que, de vegades, té glucosa afegida com a nutrient. Les solucions salines

serveixen per mantenir les condicions fisiològiques com el pH, la pressió osmòtica i les

concentracions de sals inorgàniques. Les solucions salines també són útils per mantenir els

teixits i les cèl·lules vives fora del cos per curts períodes de temps, generalment uns pocs

dies. És per això que es fan servir per transportar, ràpidament, les cèl·lules d’un lloc a un altre

o netejar-les.

2 El teixit hematopoètic és el responsable de la producció de cèl·lules sanguínies.


CEBIO 16

Els medis de cultiu es separen en medis naturals, els quals consisteixen en substàncies

biològiques naturals com el plasma, el sèrum i l’extracte d’embrions, i en medis sintètics,

compostos d’un medi basal i de suplements com sèrum, factors de creixement i hormones.

Solucions salines equilibrades.

Les solucions salines equilibrades tenen diverses aplicacions, com ser un irrigador o dilució

que manté el balanç osmòtic intracel·lular i extracel·lular, mantenir un aprovisionament d’ions

inorgànics essencials pel metabolisme normal de la cèl·lula, subministrar la principal font

d’energia a la cèl·lula (només si la solució està barrejada amb glucosa o algun altre

carbohidrat) i ser un sistema tamponant per mantenir el medi a un rang fisiològic de pH. Cada

tipus de sal atorga a la solució unes característiques diferents:

Medis de Cultiu.

Un medi base és aquell que és capaç d’oferir una certa regulació del pH i de la osmolaritat

alhora que proporciona nutrients i energia. Un medi de cultiu bàsic ha d’incloure tots els

aminoàcids essencials a més de la cisteïna, la tirosina i la glutamina. Amb aquest últim

cal anar amb compte, doncs la degradació de la L-glutamina genera amoníac que, per alguns

tipus cel·lulars, pot ser tòxic i més crític que la falta de L-glutamina. Aquest medi també ha

d’incloure vitamines del grup B perquè actuïn com a cofactors, sals i ions i carbohidrats.

Hi ha vegades que als medis de cultiu se’ls afegeixen antibiòtics, els quals eviten

contaminacions. Aquests afecten a la proliferació cel·lular i a la diferenciació, apart que poden

emmascarar infeccions o contaminacions. Per això s’hauria d’evitar fer-ne servir rutinàriament

excepte si són antibiòtics de selecció, quan no en sol durar gaire la seva aplicació.

Els medis de cultiu es suplementen amb més o menys complexitat. Segons com de ric

vulguem que sigui el nostre medi li hem d’afegir més o menys suplements, entre els que

trobem el sèrum o qualsevol component químic que li vulguem afegir. Si li afegim sèrum hem

de tenir en compte que el nostre medi passa a ser un no definit i que ja no el podem fer servir

en la producció de fàrmacs, per exemple.

El sèrum és el component sanguini que no és ni una cèl·lula sanguínia ni un factor de

coagulació. És el plasma sanguini amb els fibrinògens eliminats. Només n’hem retirat les

cèl·lules, pel que inclou totes les proteïnes que no es veuen involucrades en la coagulació i

tots els electròlits, anticossos, antígens i substàncies exògenes (com drogues i

oRegulen la permeabilitat.

Na+ i Ka+

oMantenen la integritat de les membranes cel·lulars i d’estructures internes.

Ca2+ i Mg2+

oControlen la concentració d’ions mitjançant el seu efecte tampó.

HPO4- i HCO3

-

oTambé inclou glucosa, el que suposa energia ja preparada per la cèl·lula.

BSS


CEBIO 17

microorganismes). Així i tot, es pot inactivar el sèrum si es manté a 56ºC durant 30 minuts.

El sèrum s’extreu de vedells, poltres, cavalls i humans.

Existeixen diversos medis de cultiu disponibles al mercat. Un d’ells s’anomena Medi mínim

essencial d’Eagle (EMEM) i permet el creixement d’un ampli espectre de cèl·lules, incloent

les cèl·lules del moll de l’os. És un medi simple de BSS amb aminoàcids no essencials,

piruvat sòdic i bicarbonat sòdic reduït. El medi EMEM es troba sovint reforçat amb suplements

o alts nivells de sèrum i n’existeixen nombroses variacions en la fórmula per diferents

aplicacions.

Un dels medis sorgits com a variació del EMEM és el DMEM, la modificació del medi

d’Eagle per Dulbecco. Aquest medi és EMEM enriquit amb el doble d’aminoàcids en

concentració i amb 4 vegades la quantitat de vitamines. A més a més, porta nitrat fèrric, piruvat

sòdic i alguns aminoàcids suplementaris. També porta una alta concentració de glucosa.

Les barreges de nutrients de Ham es van desenvolupar per donar suport al creixement

clonal de les cèl·lules d'ovari de hàmster xinès (CHO). Hi ha nombroses modificacions a la

formulació original, com el medi F-12 o el F-10, més complex i adequat per a la propagació

lliure de sèrum.

La barreja DMEM / F12 (en proporció 1:1) és un medi extremadament ric i complex que

s'utilitza per donar suport al creixement d'una àmplia gamma de tipus de cèl·lules tant en

formulacions sense sèrum com amb sèrum.

El 5A de McCoy es va utilitzar originalment per cultivar cèl·lules de l'hepatoma de Novikoff i

dona suport al creixement de cultius primaris.

El RPMI-1640 és una modificació del 5A de McCoy desenvolupat per al cultiu a llarg termini

dels limfòcits en sang perifèrica. Suporta el creixement d'una gran varietat de cèl·lules en

suspensió, així com d'un nombre de cèl·lules cultivades com a monocapa.

Al medi L-15 de Leibovitz, el sistema de tampó de bicarbonat de sodi estàndard / CO₂ està

substituït per una combinació de tampons fosfat, aminoàcids de base lliure, nivells més

elevats de piruvat sòdic i galactosa. Tot i que es va formular per al seu ús sense incubació de

CO₂, les cèl·lules es poden cultivar en incubadores de CO₂ sempre que no hi hagi intercanvi

entre l'aire del vas de cultiu i el de la incubadora.

Els medis de cultiu sense sèrum milloren la reproductibilitat dels cultius, disminueixen el

risc de contaminació, faciliten la purificació dels productes, prevenen el sobre-creixement dels

fibroblasts en cultius primaris i incrementen la productivitat del cultiu. Així i tot, fer servir

aquests medis provoca la necessitat de formulacions específiques per diferents tipus

cel·lulars i fa créixer més lent les cèl·lules. A més a més, necessita que els reactius tinguin

un elevat nivell de puresa, el que és molt car.

Estudis demostren que la composició del medi de cultiu i de l’alimentació pot influenciar

el creixement cel·lular, la productivitat proteica, l’expressió gènica, la qualitat del producte i el

metabolisme del lactat i de l’amoni. És per això que, quan es planteja un experiment i s’ha

d’escollir un medi de cultiu, cal tenir en consideració diversos aspectes:

Primer de tot, cal definir l’objectiu. Volem que les cèl·lules proliferin, es diferenciïn o que

únicament es mantinguin vives? Volem que produeixin? Què volem que facin les nostres

cèl·lules?

Segon, es pot optimitzar el medi de cultiu? Inicialment és millor que les línies cel·lulars les

cultivem en el medi original. Si volem modificar el medi, podem testar diferents medis i


CEBIO 18

comparar el creixement cel·lular al llarg de 5 passes (congelar cèl·lules a cada canvi per tenir

un estoc de reserva), modificar-los suplementant amb hormones, glucosa, glutamina,

vitamines, aminoàcids, insulina, transferrina, albúmina, lípids (colesterol, àcid linoleic,

fosfatidiletanolamina...)..., variar la osmolalitat amunt i avall, escollir el medi i barreja que

millors resultats hagin donat...

Si necessitem grans quantitats de medi cal tenir present que el medi en pols és més

econòmic. És preferible treballar sense antibiòtics, sempre que sigui possible. També és

convenient utilitzar material de vidre i plàstic exclusivament per cultius. Si cal rentar-lo, fer-ho

sense detergents. L’aigua és un factor crític, sobretot quan es treballa amb medis sense

sèrum.

Tema 5 - Cultius cel·lulars: producció i manteniment.

Autoritzacions.

El treball amb cèl·lules animals no es pot fer si abans no es compta amb el suport o

autorització del comitè de bioètica de la institució on es treballa, el qual està subjecte a

comitès de bioètica superiors a si mateix. En el cas de la UAB, qui fa aquesta feina és el

comitè de bioseguretat de la UAB en quant a la valoració del risc i la comissió d’ètica en

l’Experimentació animal i humana en quant a l’ètica.

Treballar en una Cabina de Seguretat Biològica.

Les cabines de seguretat biològica han de complir una sèrie de requisits per poder-se fer

servir. Per començar, cal que estiguin a una distància mínima de 500mm l’una de l’altre, que

es netegin amb etanol al 70% i que disposin del mínim material necessari dins d’elles.

En referència a com s’hi ha de treballar, cal fer moviments lents per no destorbar el flux

d’aire laminar alhora que no es bloquegen ni les reixes ni les ranures de corrent. Això

implica, per tant, mantenir un ordre i una neteja constants, distingir els articles nets dels que

estan contaminats i ser especialment curós amb el manteniment de l’asèpsia.

Tipus de cultius de cèl·lules

Els cultius primaris són aquells aïllats de teixits o de cèl·lules individuals. Aquests cultius

poden ser tant en suspensió com adherents i solen ser molt heterogenis en el seu inici de

cultiu. Per poder-los posar en una placa, el procediment consisteix en disgregar els teixits,

sembrar-ne una part o cèl·lules individualitzades i mantenir-ho en vida.

Els cultius secundaris són aquells derivats d’un cultiu primari i reben el nom de Subcultius.

El seu procediment és més senzill, doncs consisteix en seleccionar algunes cèl·lules i cultivar-

les en un medi diferent, el que dona una mostra de treball més homogènia.

Després del primer subcultiu, el cultiu primari rep el nom de línia cel·lular o subclon. Les

línies cel·lulars poden ser finites o contínues. Les línies cel·lulars finites són les cèl·lules

normals, que només es divideixen una quantitat concreta de vegades abans de perdre la seva

habilitat per proliferar, el qual és un esdeveniment determinat genèticament i anomenat

sensescència. Les línies cel·lulars contínues es tornen immortals a través d’un procés

anomenat immortalització induïda víricament o química o bé immortalització espontània.

Establiment d’un cultiu primari

Els cultius primaris són aquells aïllats d’un teixit animal, ja sigui embrionari, adult, normal o

neoplàstic. Pot ser un explant o cèl·lules individuals, que sigui de cèl·lules en suspensió o

adherents i sol ser inicialment heterogeni.


CEBIO 19

La disgregació d’un teixit es pot fer de forma fina, mecànica o enzimàtica, cadascuna amb els

seus procediments. La disgregació fina d’un teixit es dona tot tallant el teixit a trossos tan

petits com un explant. La disgregació mecànica és per mètodes més dràstics, com un

pipeteig o molt de moviment. La disgregació enzimàtica es sol fer amb tripsina freda o

temperada o amb col·lagenasa.

Per poder realitzar la digestió enzimàtica primer cal recollir una mostra del cultiu en DBSS

per després tallar-lo a trossos de 2 o 3mm i posteriorment resuspendre’l i afegir-hi l’enzim que

es consideri. És important saber, a l’hora d’escollir l’enzim, que n’hi ha de més digestius

com la tripsina i menys digestius com la col·lagenasa. Si es vol fer amb col·lagenasa, el

procediment consisteix en incubar les cèl·lules resuspeses en un medi complet amb

col·lagenasa per, posteriorment, dispersar les cèl·lules per pipeteig. Seguidament a aquest,

s’han de transferir les cèl·lules a un tub i permetre que s’hi dipositin al fons. D’aquest pot, cal

centrifugar el sobrenedant i resuspendre’n les cèl·lules en un medi de creixement. El mateix

s’ha de fer amb les cèl·lules que s’havien dipositat: resuspendre-les en un medi de

creixement. Això permetrà que hi hagi una proliferació cel·lular.

Subcultiu de cèl·lules adherents

Un subcultiu és un cultiu bastant homogeni de cèl·lules seleccionades d’un cultiu

primari. A mesura que les cèl·lules estan en cultiu, van proliferant. Així i tot, arriba un punt

on, independentment de les bones condicions del medi on estiguin, el cultiu deixa de

proliferar perquè les cèl·lules s’han fet velles.

Per poder fer un subcultiu d’una línia cel·lular cal primer tripsinitzar les cèl·lules. Això es fa

en una sèrie de passos. Primer cal eliminar el medi de cultiu i netejar el flascó amb

PBS/HBSS. Posteriorment s’hi afegeix tripsina que, deixant-la actuar 5 minuts a 37ºC,

trencarà les unions de les cèl·lules amb el flascó. Després de retirar la majoria de la tripsina i

deixant incubar uns 10 minuts més a 37ºC, les cèl·lules s’haurien de veure rodones i surant

pel flascó. Resuspenem aleshores amb molt més medi i canviem de flascó tant per les

cèl·lules originals com per les de subcultiu.

Cal tenir en compte que la tripsina i la solució PBS/HBSS és la que es fa servir amb la majoria

de cèl·lules contínues, però cada cèl·lula és diferent i n’hi ha que potser els va millor que

l’enzim utilitzat sigui TrypLE, Dispasa o col·lagenasa, que la solució de balanç que genera un

ambient que mantingui la integritat estructural i fisiològica de les cèl·lules in vitro sigui HBSS,

PBS o DPBS, o que necessitin un agent quelant que segresti alguns ions metàl·lics com fa

l’EDTA.

Selecció o separació de cèl·lules

Centrifugació

Un dels mètodes de separació de cèl·lules d’un cultiu primari és la centrifugació, la qual pot

ser diferencial o de gradient de densitat. En la centrifugació diferencial es van fent

successives centrifugacions, cadascuna a major velocitat i sobre el sobrenedant de l’anterior.

La centrifugació de gradient de densitat, en canvi, consisteix en fer servir de “medi” un

gradient d’algun material que augmenti la resistència i després perforar el contingent per anar

recollint les mostres en base a la seva fracció corresponent.

Una versió de la centrifugació és l’ultracentrifugació. En aquesta es combinen els mètodes

de la centrifugació diferencial i de la del gradient de densitat. Això ho fa després d’una segona

centrifugació, on es resuspèn el pellet en una columna de gradient per separar posteriorment,

aconseguint així una millor separació.


CEBIO 20

Afinitat per anticossos específics

Un altre mètode de separació és el de l’afinitat per anticossos específics mitjançant

immune panning, on es fan circular cèl·lules per plaques recobertes d’anticossos, o mitjançant

magnètic sorting, on s’uneixen cèl·lules i anticossos conjugats amb una partícula magnètica,

el que permet fer selecció en un camp magnètic. Aquesta última opció es pot modificar per

tal que es faci en continu mitjançant un MACS, on les cèl·lules d’interès es queden retingudes

a la columna que disposa d’un imant que l’envolta.

Els anticossos també permeten fer un FACS, una selecció de cèl·lules en base a la

fluorescència activada. Aquest procediment es fa mitjançant una citometria de flux, la qual

permet separar les gotes del medi on es troba cada cèl·lula en base a la fluorescència que

aquesta tingui.

Cellular Lifespan

Els Population Doubling Levels (PDL) calculen l’envelliment de la població de la línia cel·lular.

Aquesta xifra fa referència a la quantitat total de vegades que les cèl·lules de la població s’han

duplicat des de la seva primera isolació in vitro. Es calcula amb una fórmula en base a les

cèl·lules sembrades i tripsinitzades. L’entrada en senescència es sol donar al cap de 50 o 60

PDL. La fórmula per calcular els population doublings que ha tingut la línia cel·lular és la

següent:

𝑃𝐷𝐿 = 𝑋 + 3.322 ∗ (log 𝑌 − log 𝐼)

On X és el doubling level de la població inicial, I és la quantitat inicial de cèl·lules sembrades

al flascó i Y és la quantitat de cèl·lules al final del període de creixement.

A mesura que les cèl·lules es divideixen, els telòmers s’escurcen. És un paràmetre, la

llargada dels telòmers, bastant inversament proporcional o indicativa de la quantitat de PDL

que la línia cel·lular porta i que li queden. Això sol passar per la manca de telomerasa en les

cèl·lules velles. Quan els extrems cromosòmics són molt curts, no protegeixen els

cromosomes. Aquesta manca de protecció activa p53 i pRb que fan entrar la línia cel·lular en

senescència. El procés mitjançant el qual evitem aquesta arribada a la senescència és el

que anomenem “immortalització”. Això sí, les cèl·lules immortalitzades, a mesura que

passa el temps, perden rellevància biològica. Cal tenir molt clar perquè es faran servir.

Immortalització cel·lular.

Hi ha diferents maneres d’immortalitzar les cèl·lules, tot i que també es pot donar de manera

espontània. Els mètodes provocats solen ser mitjançant càncers, virus o l’activació de la

telomerasa. Cada tipus d’immortalització té un efecte diferent de la resta i també es diferent

segons el tipus cel·lular al que se li apliqui, ja que hi ha cèl·lules a les que no els agrada

alguna de les estratègies. Per aquest motiu es solen combinar els mètodes que explicarem

a continuació.

La immortalització, doncs, es pot induir. Una de les maneres més fàcils de fer-ho és mitjançant

l’expressió de la telomerasa, on podem afegir una GFP control per saber si s’està

expressant realment. Sempre cal fer un western per determinar-ho, ja que es podria donar

una expressió de la GFP i no de la telomerasa. L’activació de la telomerasa no implica un

gran problema a nivell gènic i d’expressió, pel que és una bona opció. Aquesta expressió de

la telomerasa es pot aconseguir per la introducció de hTERT.

Una altre manera de fer-ho és a través dels oncogens virals de les cèl·lules, una sèrie de

gens que codifiquen per maneres d’aturar la p53 o la pRb. Dins d’aquests hi ha el SV40 LT,


CEBIO 21

el HPV16 E6/E7 i l’Epstein Barr. Això provocarà una reorganització del genoma, que les fa

entrar en crisi. Algunes cèl·lules, i tan sols per acció de l’atzar, es tornen immortals.

Així i tot, per alguns tipus cel·lulars, la sobre expressió de SV40LT o hTERT no és suficient

per aconseguir la immortalització. En aquests casos es pot intentar la combinació de les dues

metodologies.

Un altre mètode d’aconseguir la immortalització induïda és la fusió cel·lular de línies finites

amb línies immortals, el que genera cèl·lules híbrides. La fusió es dona gràcies al virus

Sendai inactivat i a la presència de polietilenglicol. El resultat de la fusió pot ser triple:

homocarions mortals i immortals (mortals els que són unió de dos finits i immortals la unió

de dos infinits) i heterocarions immortals.

El mètode per seleccionar els heterocarions immortals és el de generar cèl·lules parentals

sense capacitat de generar nucleòtids mitjançant la via de la hipoxantina i cèl·lules parentals

sense capacitat de generar nucleòtids per la via de la timidina. Com que les cèl·lules de

mamífer necessiten de la dihidrofolat reductasa o d’aquestes dues vies per generar nous

nucleòtids, cultivem el resultat de la fusió de les dues cèl·lules parentals en medi HAT. El

medi HAT conté, apart de tots els components que necessita un medi, Aminopterina,

Hipoxantina i Timidina.

Com que l’aminopterina inhibeix la dihidrofolat reductasa i les cèl·lules heterocariones

podran fer servir les dues vies de síntesi de nucleòtids, seran les úniques que sobreviuran

en un medi HAT.

Una important utilitat de la immortalització és la producció d’anticossos. En aquest cas,

es comença subministrant a un animal l’antigen contra el qual volem els anticossos.

Seguidament li retirem unes quantes cèl·lules B i les fusionem amb cèl·lules canceroses

immortals i deficients en TK i HGPRT, els enzims de les vies de la timidina i de la hipoxantina,

respectivament. Cultivem les cèl·lules resultants en medi HAT per tal que només hi creixin les

cèl·lules B immortals, a les que anomenarem hibridomes. D’aquests, en fem un screening

amb l’antigen per seleccionar-ne només les que produeixen l’anticòs d’interès. Això permet la

generació d’anticossos monoclonals.

Una altre manera de aconseguir cèl·lules immortals és mitjançant la transformació cel·lular,

és a dir, la infecció vírica no productiva i que acaba generant cèl·lules mutants immortals.

El seu problema és que una cèl·lula transformada té inestabilitat genòmica. Això significa que

va patint i acumulant alteracions al llarg del temps. A més, la inestabilitat va lligat a un

creixement aberrant i a la malignitat. No sempre es compleixen tots els trets, però això no

implica que no siguin transformades. Les cèl·lules transformades, a més, poden créixer

independentment del substrat i tenen la capacitat de perdre l’ancoratge amb la superfície i

créixer en suspensió. Aquestes cèl·lules es saturen més tard i es dupliquen a una velocitat

més elevada.

Tema 6 - Cultius cel·lulars: quantificació de cèl·lules

Recompte de cèl·lules

Tenir unes cèl·lules en cultiu és com tenir un fill o una mascota: implica estar pendent d’elles

en tots els paràmetres possibles. Una cosa que cal fer per analitzar-les és tripsinitzar-les

setmanalment. Aquest recompte de cèl·lules que la tripsinització ens permet fer ens farà tenir

constància de l’avenç de la senescència.

Per fer el recompte de cèl·lules quan hi ha pocs flascons es fa servir l’hemocitòmetre o

cambra de Neubauer. El procediment d’aquest aparell és senzill: partint d’una suspensió de


CEBIO 22

cèl·lules ben homogeneïtzada, se n’afegeix un volum determinat a la graella. D’aquesta en

seleccionem les caselles més externes i en fem el recompte. Com que el volum que es

diposita en cadascuna de les cambres de Neubauer és de 10-4 ml, es pot saber amb

bastanta precisió quantes cèl·lules hi ha al cultiu. En funció de la cambra de Neubauer

que es tingui, es segueix un mecanisme de recompte diferent que depèn dels límits de la

quadrícula. En el recompte a la cambra de Neubauer es sol fer servir blau tripà, que permet

saber la quantitat de cèl·lules vives i la quantitat de cèl·lules mortes. Aquest tint funciona,

sobretot, en cèl·lules animals.

Sempre que sigui possible, interessa treballar amb sistemes electrònics de recompte de

cèl·lules. N’hi ha diferents tipus, ja que estan basats en diferents estratègies de recompte.

La majoria es poden separar en dues estratègies: canvi de resistència elèctrica a mesura

que la cèl·lula passa per un orifici o Anàlisi de fluorescència. També existeix la citometria

de flux com a mètode alternatiu. Els experiments ens demostren que la desviació en el

recompte de cèl·lules respecte diverses passades de l’aparell és minúscula comparada

amb la que hi pot haver entre diverses persones fent un recompte manual.

Els recomptes de cèl·lules són útils per vàries coses, però la més important de totes és el

recompte de PDL i el càlcul de PDT. Les PDL són els Population Doubling Levels, la quantitat

total de vegades que les cèl·lules de la població s’han duplicat des de la seva primera isolació

in vitro. És important saber calcular la quantitat de PDL que han passat en un cultiu, ja que

s’han d’anar sumant els PDL acumulats per saber quants en porta el cultiu primari. El PDT

és un element similar al PDL, sols que aquest paràmetre serveix per calcular el temps que

triga el cultiu cel·lular en duplicar-se. Els dos paràmetres es calculen tal que:

𝑃𝐷𝐿 =log 𝑁 − log 𝑁0

log 2 𝑃𝐷𝑇 =

𝑇 ∗ log 2

log 𝑁 − log 𝑁0

On T és el temps transcorregut en hores, N la quantitat de cèl·lules finals i N0 és la quantitat

de cèl·lules inicials.

És importar conèixer els PDL i els PDT de les nostres cèl·lules perquè permet detectar

qualsevol problema que aquestes tinguin. En cas que a les cèl·lules els passi alguna cosa,

es veurà reflectit a les corbes de creixement. També tenen corbes diferents els cultius

transformats.

Quantificació cèl·lules vives/mortes en cultiu

La quantificació de cèl·lules també permet avaluar la toxicitat, ja que podem separar

entre cèl·lules mortes i cèl·lules vives d’un mateix cultiu. Hi ha moltes tècniques per separar-

les, cadascuna amb diferents criteris de selecció: la presència d’enzims actius a les cèl·lules,

l’avaluació de la pèrdua de permeabilitat de la membrana, la capacitat d’incorporació de

nucleòtids...

Un mètode és el kit viu o mort. En aquest, afegim la molècula no fluorescent acetoximetil

calceina, la qual pot ser transportada dins de les cèl·lules vives a través de la membrana

cel·lular, i Iodur de Propidi, un agent intercalant que únicament entra a la cèl·lula si la

membrana plasmàtica està malmesa. Dins la cèl·lula viva, les enterases eliminen el grup

acetometoxi, la molècula es queda atrapada dins la cèl·lula i emet una forta fluorescència

verda. A través d’una posterior irradiació i anàlisi de la fluorescència, el recompte de cèl·lules

verdes indicarà la quantitat de cèl·lules vives i el recompte de cèl·lules vermelles indicarà

la quantitat de mortes.


CEBIO 23

L’assaig MTT és una altre manera de comptabilitzar cèl·lules vives o mortes. Es basa en la

capacitat de les deshidrogenases mitocondrials per convertir un substrat groc i soluble en

aigua (el MTT) en formazan, de color blau fosc i insoluble en aigua. La quantitat de formazan

és directament proporcional al número de cèl·lules vives d’un cultiu cel·lular. Per

comptabilitzar-les, cal solubilitzar els cristalls de formazan i estudiar-ne les absorbàncies, el

que mataria les cèl·lules que hi hagués. Hi ha diverses variants comercials derivades de

l’MTT: MTS, XTT, WST-8...

Una variant molt útil de l’assaig és aquesta última, la que fa servir WST-8. Aquesta substància

és incolora i, en reduir-se, pren un color taronja. Aquesta molècula no entra a les cèl·lules,

però cal que actuïn deshidrogenases internes per degradar-la. Per aconseguir-ho, es combina

amb una molècula reduïda per les deshidrogenases de dins les cèl·lules i que pot sortir i entrar

al citoplasma. Aquesta molècula reduïda s’oxida per contacte amb WST-8, el que permet

repetir el cicle una vegada i una altre sense matar les cèl·lules, no com passa amb MTT.

L’assaig AlamarBlue és una prova similar al MTT. En aquesta prova, enzims cel·lulars

redueixen el Resazurin, que pot entrar a la cèl·lula i no és tòxic, en Resorufin. Aquest últim

es valora de forma colorimètrica en el sobrenedant amb una placa d’ELISA. La quantitat de

fluorescència és proporcional al nombre de cèl·lules vives. Aquest assaig té un gran

avantatge: com que no és tòxic, les cèl·lules no s’han de fixar i com que s’utilitza el

sobrenedant, es pot fer servir diverses vegades en el mateix cultiu.

Mort cel·lular regulada

Quan es mesuren cèl·lules vives i mortes, es vol saber de què o com es moren. Això permet

parlar de dos conceptes. La mort cel·lular regulada resulta de l’activació d’una o més

cascades de senyalització amb efectors específics i conseqüències bioquímiques, funcionals

i immunològiques úniques.

La mort cel·lular programada, en canvi, és una particular forma de mort cel·lular regulada

que succeeix en escenaris estrictament fisiològics. No es relaciona amb pertorbacions amb

l’homeòstasi i, per tant, no es dona en el context d’una mala adaptació a l’estrès cel·lular. La

mort cel·lular regulada es pot donar de diverses maneres en els cultius cel·lulars:

Existeixen 3 modalitats de mort cel·lular regulada, classificades en base a les característiques

morfològiques i estructurals que es donen quan succeeixen.

L’apoptosi és una mort cel·lular neta. En aquest tipus de mort programada, la cèl·lula es va

destruint des de l’interior. Hi ha un arrodoniment de la cèl·lula, es fragmenta o s’acumula el

DNA a la perifèria del nucli, es fragmenta el nucli cel·lular i, finalment, es generen gemmes

cel·lulars o vesícules anomenades cossos apoptòtics. El més important d’aquest tipus de

mort cel·lular programada és que el contingut interior de la cèl·lula mai arriba a l’exterior.

Les cèl·lules fagocítiques de l’organisme les ingereixen arran dels flip-flops dels àcids grassos

de la membrana, el que senyalitza aquesta necessitat d’eliminació.

Eliminació de factors de creixement en línies cel·lulars que creixen a densitats elevades

Exposició a agents citotòxics

No adhesió al substrat

Diferenciació terminal de les cèl·lules in vitro

Nombre de divisions finit


CEBIO 24

En la necrosi, tot l’interior es veu alliberat a l’exterior. És pràcticament el procediment invers

que en l’apoptosi. Quan s’inicia el procés de necrosi, hi ha un inflament cel·lular seguit d’una

lisi de la cèl·lula, alliberant tot el contingut a l’exterior amb una moderada condensació de

la cromatina.

L’autofàgia és un procediment mitjançant el qual les cèl·lules desintegren totes les seves

membranes internes i les concentren a la membrana externa, quedant-se així buides de

contingut.

Quantificació apoptosi en cultiu.

Per comptabilitzar la quantitat de cèl·lules que en un cultiu han mort per apoptosi el primer

que cal fer és una Caracterització morfològica de la cèl·lula o del nucli. Això es pot

aconseguir per tinció Leishman, DAPI o Hoechst. En tots els casos, el que s’ha d’analitzar per

trobar cèl·lules apoptòtiques és la presència dels cossos apoptòtics, que són visibles com

petites esferes al voltant d’una cèl·lula més petita del normal. Quan hi ha una tinció amb DAPI

o Hoechst, es veuen els nuclis, els quals estan explotats si hi ha un tractament inductor de

l’apoptosi.

També es pot comptabilitzar la translocació de la fosfatidilserina, que de normal es troba

a la membrana interna de la bicapa i es transloca a la externa quan s’inicia l’apoptosi. A la

fosfatidilserina s’hi uneix nexina, que brilla amb un color verd. A mesura que va passant

l’apoptosi, la membrana es desestabilitza, cas en que podem afegir Iodur de Propidi, que

entrarà a la cèl·lula i ens mostrarà els nuclis. Hi ha un tipus de cèl·lules, les necròtiques, que

tenen la membrana solubilitzada però prou estable i que, per tant, es veurien alhora verdes

però amb un centre vermellós.

Una altre cosa que es pot mesurar és l’activitat de les caspases, unes proteïnes que

digereixen diferents components de la cèl·lula mitjançant una cascada enzimàtica. Aquesta

és una de les característiques que s’aprofiten amb la tinció per un tint de DNA amb alta afinitat.

Aquest substrat, el qual és alhora no fluorescent i no funcional com a tint de DNA, creua les

membranes cel·lulars a molt alta velocitat per entrar al citoplasma, on és tallat per la caspasa-

3 per formar un tint de DNA d’alta afinitat que marca el nucli amb un verd brillant, permetent

la detecció de l’activitat de la caspasa-3 i la visualització de canvis en la morfologia nuclear

durant l’apoptosi.

L’últim mètode de quantificació de l’apoptosi en un cultiu és el mètode TUNEL. El mètode

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling of

DNA fragments), utilitza l’activitat de la transferasa terminal de desoxinucleòtids (TdT) per

incorporar dNTP als extrems 3’ del DNA fragmentat que poden ser detectats mitjançant

diferents estratègies.

Tema 7 - Cultius cel·lulars: criopreservació de cèl·lules

Avantatges la criopreservació

La criopreservació de cèl·lules cultius cel·lulars és el procediment mitjançant el qual les

cèl·lules es mantenen a molt baixa temperatura, sovint en nitrogen líquid, per descongelar-

les quan se’n necessiti alguna mostra o calgui fer algun experiment. La criopreservació

presenta diversos avantatges, com estalviar temps i materials quan les cèl·lules no s’han

d’utilitzar immediatament, fer rèpliques d’experiments a PDL similars o distribuir cèl·lules a

altres laboratoris. Aquest últim avantatge es realitza sovint, ja que es solen produir moltes

cèl·lules i la solidaritat entre laboratoris és un element molt important en recerca.

L’ús de la criopreservació també és molt útil si es vol evitar certs problemes amb la utilització

d’una mateixa línia cel·lular. Això és perquè fer servir la criopreservació evita efectes


CEBIO 25

relacionats amb la vellesa del cultiu com la inestabilitat genètica i la deriva genotípica

associada, la selecció i diferenciació, l’increment de les possibilitats de transformació,

l’envelliment cel·lular en línies no immortalitzades, la contaminació per microorganismes

o altres línies cel·lulars i les pèrdues dels cultius per fallades dels aparells.

Principis de la congelació

Quan es comença a congelar unes cèl·lules, es treballa amb unes solucions isotòniques,

amb la mateixa osmolaritat que el citoplasma. Quan es congela aigua es formen cristalls de

gel. La presència de cristalls redueix la concentració d’aigua allà on es trobin. Si el

refredament és lent, el gel comença a formar-se a partir de nuclis concrets a l’exterior

cel·lular. Això provoca un increment en la concentració de soluts del líquid i la pèrdua d’aigua

de les cèl·lules per adaptar-s’hi. Si el refredament és ràpid, les cèl·lules no tenen temps de

deshidratar-se i formen cristalls de gel a l’interior.

Els crioprotectors són molècules solubles en aigua amb un pes molecular inferior a 100Da

que disminueixen el punt eutèctic, la temperatura on tot el material està congelat. La seva

aplicació és mitjançant solubilització al medi, on tindran una difusió simple a través de les

membranes cel·lulars fins arribar a l’equilibri osmòtic.

La disminució de la temperatura provoca la formació gel a l’exterior cel·lular. Per compensar

la diferència de soluts a l’exterior, la cèl·lula es deshidrata. Això provoca un increment en la

concentració de crioprotector a l’interior de la cèl·lula tot entrant-hi per difusió simple. Com

que el crioprotector és una substància viscosa, la seva presència disminueix la

probabilitat de formació de cristalls de gel a l’interior de la cèl·lula. Aquest últim fenomen,

la disminució de cristalls dins la cèl·lula, també es dona perquè més del 50% de l’aigua de

dins la cèl·lula és substituïda per molècules de crioprotector.

Quan s’ha subministrat crioprotector, el qual pot ser PVP, DMSO o glicerol; cal que el cultiu

es congeli poc a poc (-1ºC/min). No tots els crioprotectors són igual d’efectius. El

Polivinilpirrolidó (PVP) manté l’habilitat d’alguns tipus de cèl·lules mare per diferenciar-se un

cop es descongelen. La contrapartida és que té una viabilitat cel·lular inferior que altres

crioprotectors intracel·lulars i pot afectar a la integritat dels àcids nucleics. El Dimetil Sulfòxid

(DMSO) ofereix una protecció superior a la lisi osmòtica, però pot ser absorbit directament a

través de la pell i és citotòxic en alguns tipus cel·lulars. El glicerol, finalment, és molt menys

citotòxic que la resta de crioprotectors i és més segur per l’operari que el DMSO. El problema

del glicerol és que provoca més lisis cel·lulars que el DMSO i que s’ha de retirar abans de

cultivar les cèl·lules en plaques, igual que el DMSO, un procediment complex.

Per conservar les cèl·lules d’alt Valor afegit, s’ha de fer una vitrificació. Una vitrificació

consisteix en una congelació ultra ràpida per evitar la formació de cristalls de gel. Per realitzar-

la es requereix d’un refredament ràpid, una alta viscositat del medi, una alta concentració

de crioprotector i un volum de medi limitat. Per disposar de l’alta concentració de

crioprotector, aquest es va afegint gradualment a temperatura ambient. Un cop s’ha assolit la

concentració adequada, s’introdueixen els cultius en flascons prims i llargs directament a

196ºC sota 0 (nitrogen líquid). És important que quan es faci una congelació, aquesta sigui

amb un gran nombre de cèl·lules (unes 106). De la mateixa manera, és important marcar

els pots de conservació.

Protocols de congelació i descongelació.

Congelació de cèl·lules.

El procés per congelar unes cèl·lules consta de varis passos. Primer, tripsinitzar les cèl·lules

i fer-ne un recompte. Després s’ha de centrifugar i resuspendre en medi que contingui


CEBIO 26

crioprotector (glicerol o DMSO). Aquesta resuspensió s’ha de fer amb unes concentracions

entre 5 i 10 vegades superiors a les de sembra. Un cop resuspeses, cal disposar la solució

en criotubs. Aleshores es provoca una disminució gradual de la temperatura (-1ºC/minut)

utilitzant contenidors especials per aquesta tasca i es deixen dins d’un congelador de -80ºC

durant un mínim de 4 o 6 h. Passades aquestes, s’han de transferir els criotubs al nitrogen

líquid, tenint cura que la temperatura no pugi de –50ºC. Finalment, només queda mantenir

les cèl·lules congelades submergides en el líquid o en la fase gasosa de sobre el nitrogen

líquid.

Existeixen diferents tipus de contenidors per a la criopreservació. N’hi ha de coll prim, de coll

ample, de conservació en canyes i de conservació en calaixos.

Descongelació de cèl·lules.

El procés de descongelació cel·lular és més simple que el de congelació i consisteix en menys

passos. El procediment comença per retirar el criotub del N2 i immediatament “sucar-lo” en

un bany María a 37ºC sense submergir el tap del criotub. Un cop descongelada la mostra,

rentar el criotub per fora amb etanol al 70%. Aleshores transferir la suspensió, lentament,

a un flascó de cultiu que contingui el medi. Al dia següent, quan les cèl·lules ja estan

adherides, fer un canvi de medi per extreure les possibles restes de crioprotector.

Per alguns tipus cel·lulars sol anar bé no deixar restes de crioprotector. Llavors, es centrifuga,

s’elimina el medi de congelació i es resuspenen les cèl·lules en medi fresc.

Estocs de cèl·lules.

És important congelar les cèl·lules per tenir estocs. No val la pena fer un cultiu primari

per un sol experiment o per un sol criotub. No només per la quantitat de feina que comporta

Mantenir les cèl·lules congelades.

Transferir els criotubs al nitrogen líquid.

Deixar dins d’un congelador de 4 a 6h.

Disminuir gradualment la temperatura.

Disposar la solució en criotubs.

Centrifugar i resuspendre en medi que contingui crioprotector.

Tripsinitzar les cèl·lules i fer-ne un recompte.

Al dia següent fer un canvi de medi.

Transferir la suspensió a un flascó de cultiu que contingui el medi de cultiu.

Rentar el criotub per fora amb etanol al 70%.

Retirar el criotub del N2 i sucar-lo en un bany María a 37ºC sense submergir-ne el tap.


CEBIO 27

sinó per la importància de tenir expansions de cultius primaris. Es descongela un vial i es fa

una expansió del mateix per distribuir.

La primera expansió s’ha de fer a partir d’un cultiu primari. L’expansió implica diversos

subcultius per crear l’estoc de cèl·lules congelades, de les que alguns autors en recomanen

12 vials congelats. Un cop haguem generat l’expansió de l’estoc de sembra mitjançant

aquest procediment se l’ha de caracteritzar i testar per assegurar l’absència de contaminació,

moment a partir del qual serveix de reservori cel·lular.

En cas de voler fer un estoc de distribució, el procediment a seguir comença per

descongelar un vial de l’estoc de sembra, cultivar-lo i expandir-lo per crear un segon estoc

d’uns 50 vials. Aquest serà l’estoc de distribució. Aquest estoc és el que s’ha d’utilitzar per

repartir als peticionaris.

Finalment, cal que cada investigador/a o grup de recerca estableixi els seus estocs d’usuari,

els quals s’han de generar amb un màxim de 20 vials per 5 anys i que s’haurien d’eliminar un

cop acabada l’experimentació. Així i tot, es recomana no mantenir cultius de més de 3

mesos.

Tema 8 – Cultius cel·lulars: contaminacions.

Fonts de contaminació.

Quan es treballa amb cultius cel·lulars és essencial mantenir les condicions d’asèpsia.

Això significa que cal assegurar que la contaminació biològica, la que prové de llevats, fongs,

bacteris, micoplasma, virus i altres cèl·lules; no es doni si no és pròpia del cultiu. Per

aconseguir una bona asèpsia és important assegurar-se de treballar correctament i amb

esterilitat. Implica garantir una esterilització efectiva, tenir una manipulació correcte i eficient,

fer servir material de bona qualitat, tenir un bon emmagatzematge i que es mantingui

correctament l’equipament del laboratori. Aquest conjunt de factors també impliquen, en el

fons, disposar de cabines de la bioseguretat corresponent i que, amb el seu funcionament en

perfecte estat, s’hi treballi correctament.

Contaminació biològica visible.

La contaminació biològica visible és un tipus de contaminació provocada per bacteris,

fongs i llevats que podem detectar de diverses maneres. Una és mitjançant canvis en el pH

del medi de cultiu i en la seva transparència, la qual es redueix. Un altre manera és

mitjançant la microscòpia de contrast de fase, on es fa molt evident aquesta contaminació.

Algunes de les soques que provoquen contaminació biològica visible poden tenir un

creixement molt lent i necessiten de períodes de temps més llargs (de fins a sis setmanes)

per ser detectades. Per poder detectar la contaminació biològica visible es recomana

treballar en absència d’antibiòtics.

Un cop s’ha detectat, per qualsevol de les mesures anteriors, la presència de contaminació

al cultiu, aquesta s’ha d’eliminar. També cal autoclavar tot el material que s’ha fet servir i la

font de la que s’ha extret el cultiu. En cas que la contaminació provingui d’un cas extern, és a

dir, de cultius que provenen d’un altre laboratori per realitzar un experiment, es poden testar

combinacions d’antibiòtics o d’antifúngics. El problema amb aquests és que s’acaben creant

resistències que impedeixen fer net de la contaminació. A més, cal recordar que l'ús

d’antibiòtics pot afectar les cèl·lules en cultiu.

Contaminació biològica no visible.

Mycoplasma és un gènere de bacteris que no tenen paret cel·lular. Són petits, d’entre

0,2 i 0,8 µm, pel que poden travessar filtres. Al no tenir paret cel·lular, no estan afectats per

molts antibiòtics com la penicil·lina o d’altres que tenen l'objectiu d'atacar la paret cel·lular.


CEBIO 28

Són sensibles, en canvi, a les Tetraciclines, als Pleuromutilins i a les Quinolones. Existeixen

unes 190 espècies de Mycoplasma diferents, tot i que el 95% de les contaminacions estan

produïdes per 8 espècies.

La principal causa d’infecció per micoplasma és una contaminació creuada per part d’un

cultiu cel·lular prèviament infectat de micoplasma que es fa servir en el mateix laboratori. Si

a això li afegim que els micoplasmes contaminants normalment provenen de l’ésser

humà, la contaminació per micoplasma sol ser fruit de la mala manipulació al laboratori. Com

que és molt probable que es doni aquesta contaminació, la majoria de laboratoris solen

demanar proves de detecció de micoplasma abans d’acceptar unes cèl·lules d’un altre.

La presència de micoplasma en un cultiu pot generar varis problemes, ja que competeix

amb les cèl·lules cultivades per precursors bioquímics, s’adhereix a la superfície cel·lular

o s’hi fusiona. Això provoca alteracions en el metabolisme, creixement i genoma de la

cèl·lula; danys a la membrana que porten a una pèrdua de la integritat cel·lular, interferències

amb els receptors de membrana que alteren els mecanismes de transport, senyalització i

producció de citoquinines i tot junt pot acabar tenint efectes citopàtics. En definitiva, la

contaminació per micoplasma en un cultiu pot acabar generant la mort de moltes de les

cèl·lules que es tenen en aquest, el que deriva en una mala interpretació dels resultats i pot

posar en compromís la validesa de les dades generades per la recerca o projectes

d’investigació i desenvolupament.

Es poden fer dos tipus de test per detectar la presència de micoplasma en els diversos cultius

cel·lulars. Per començar està el test directe, consistent en realitzar un cultiu microbiològic en

agar. Per altra banda estan els tests indirectes, com la Tinció de DNA, la realització d’una

PCR sobre el 16s rRNA de micoplasma o fer servir mycoalert, el qual es basa en la

presència d’enzims d’aquest organisme per generar compostos luminescents. Per realitzar la

tinció del DNA es poden fer servir fluorocroms que s’enllacen al DNA com Hoechst o 33258 /

DAPI. Quan es fa, en els cultius infectats s’observen els nuclis cel·lulars fluorescents i DNA

extra-nuclear.

Si s’ha detectat una infecció per micoplasma, el que es pot fer és autoclavar els cultius

infectats i els reactius i desinfectar els equips utilitzats. També es poden combinar diferents

antibiòtics sempre i quan actuïn sobre el metabolisme bacterià i no sobre la formació de

paret.

Els micoplasma són uns organismes molt infecciosos i s’expandeixen molt ràpid. En un

experiment realitzat el 1976, un investigador va infectar, de manera voluntària, un cultiu amb

micoplasma. Tot fent diversos anàlisis, va voler comprovar l’estat del material del laboratori.

Va veure que, al cap de 6 setmanes, la major part de les línies cel·lulars, al igual que les

pipetes, poyates i resta de material estaven infectats per micoplasma.

Existeix un altre tipus de contaminació no visible: la de virus. Els virus que infecten de manera

no visible poden ser Virus endògens específics d’espècie o Virus contaminants com els

que s’utilitzen per immortalitzar cèl·lules. Els primers solen provenir del sèrum animal que es

fa servir com a suplement del medi de cultiu i els segons poden provenir de limfoblastoides

Epstein Barr, per exemple.

Per detectar la presència de virus cal comprovar si hi ha efecte citopatogènic (CPE) com

lisi cel·lular, vacúols o vesícules, multinucleació i transformació... L’absència d’efecte

citopatogènic no exclou la possibilitat de presència de virus. Per comprovar del cert si n’hi ha,

cal fer Tests immunològics (ELISA), citològics, bioquímics i/o ultraestructurals apropiats.


CEBIO 29

Contaminacions creuades.

Les contaminacions creuades són les contaminacions més importants i poden ser de 2 tipus.

Una opció és que la cèl·lula que contamina tingui més capacitat de proliferació en

aquelles condicions en les que estem cultivant. Si això passa, desplaçarà a les cèl·lules

originals. Una altra és que en un laboratori es treballi amb cèl·lules iguals però que

provinguin de diferents donants. No es pot considerar, doncs, que els resultats que

s’obtinguin siguin igualment vàlids. No totes les tècniques d’identificació cel·lular

serveixen ni tampoc sempre van bé.

Hi ha, al menys, 324 línies cel·lulars infectades per altres cèl·lules. D’aquestes, 106 línies

estan infectades per cèl·lules HeLa. Hi ha un registre de totes les línies contaminades per

altres o línies cel·lulars mal caracteritzades. Per tal d’evitar aquest tipus de contaminacions,

les creuades, és important que les cèl·lules s’obtinguin de fonts fiables, validar

periòdicament les característiques de les cèl·lules i controlar les pràctiques d’asèpsia.

Tema 9 - Cultius cel·lulars: caracterització i autentificació. Quan es realitza un cultiu cel·lular és molt important caracteritzar i autentificar les cèl·lules

que hi ha en ell. Això servirà per detectar contaminacions creuades amb altres línies

cel·lulars, el que podria haver dut a generar hipòtesis biològiques inapropiades o a resultats

irreproduïbles i enganyosos, validar línies per a l’obtenció de vacunes que validin les

vacunes obtingudes i per identificar canvis en la línia a mida que incrementem el nombre

de subcultius, com la inestabilitat genètica o les propietats associades a la transformació.

Sempre que existeixin marcadors específics, i si es tenen les eines adequades, la

caracterització també pot permetre identificar el teixit d’origen, el llinatge i la posició en

el llinatge.

Mètodes de caracterització.

Els mètodes de caracterització cel·lular es separen, la majoria, en 4 tipus segons en què es

basin o quines tècniques facin servir. Així i tot, també existeixen altres mètodes, com

l’enzimatologia, que no tractarem en aquest tema. La caracterització d’una línia cel·lular

es sol fer abans d’experimentar amb ella. Els 4 mètodes de caracterització són segons la

Morfologia, Mitjançant anticossos, per Citogenètica o per Polimorfismes del DNA.

Caracterització morfològica.

Hi ha diferents tipus de morfologia perquè hi ha diferents tipus de cèl·lules. Per començar,

poden ser cèl·lules en suspensió o cèl·lules adherents, i aquestes poden ser cèl·lules

endotelials, fibroblasts, epitelials, melanòcits, queratinòcits, cèl·lules del múscul llis...

Utilitat de la caracterització cel·lular

Detectar contaminacions

creuades.

Evita hipòtesis inadequades i

resultats enganyosos.

Validar línies per l'obtenció de

vacunes.

Valida vacunes obtingudes.

Identificar canvis en la línia cel·lular.

Detectem inestabilitat gènica.

Identificar el Teixit d'origen i el

llinatge cel·lular.

Permet ubicar en el llinatge.


CEBIO 30

La caracterització morfològica de les nostres cèl·lules ens permetrà veure canvis

morfològics deguts a la confluència o a la diferenciació. Aquestes característiques són

importants de saber perquè, quan les observem en diferents estadis de l’experiment i les

comparem amb les control, podrem saber si la morfologia ha canviat en funció de l’edat del

cultiu, els factors de maduració o la contaminació per altres organismes.

Caracterització immunològica.

A més de la caracterització morfològica, la qual estudia i anota les característiques que

presenten les cèl·lules a través de la seva visió general, n’hi d’immunològica , la qual aprofita

les característiques dels anticossos. Els anticossos poden ser monoclonals i que reaccionin

davant un sol epítop o poden ser policlonals i que reaccionin davant diferents epítops. Els

epítops són els fragments dels elements de la superfície on es pot adherir l’anticòs i que fan

que aquest s’hi uneixi. De normal, es pot interpretar que una proteïna i un epítop acaben

sent termes sinònims.

Quan es barregen anticossos per fer una caracterització immunològica, es fan servir tots els

que ataquen al mateix invasor o antigen. En aquestes caracteritzacions primer es posen

els anticossos monoclonals, que s’adhereixen a l’epítop i que s’hauran de detectar. Aquesta

detecció es pot fer mitjançant un fluorocrom que portin unit de bon principi o es pot fer afegint

un anticòs secundari policlonal contra l’organisme generador dels primers anticossos

marcat amb fluorescència. Com que els segons ataquen l’organisme del qual han sortit els

primers, és important saber d’on surten els anticossos amb els que treballem en un

experiment de caracterització immunològica.

Quan es realitza una caracterització immunològica es sol fer servir un marcatge amb l’anticòs

secundari perquè és més senzill i econòmic que unir l’anticòs primari amb un fluorocrom.

Això és perquè ja estan comercialitzades una bateria d’anticossos secundaris anti-rabbit de

colors i una bateria anti-mouse. Com que se’n fan servir molts, se’n produeixen molts i es

redueix el preu. Si es volguessin detectar dues proteïnes alhora s’haurien d’evitar

reaccions creuades i, per tant, fer servir diferents organismes generadors d’anticossos.

Els anticossos també es poden marcar amb altres molècules que no siguin

fluorescents, com metalls pesants o un substrat de la peroxidasa. El consum del substrat

per part de la peroxidasa genera un color i un precipitat vermell, indicant on hi ha l’anticòs.

Caracterització citogenètica.

Un altre tipus de caracterització de les cèl·lules és la Caracterització citogenètica.

Consisteix en identificar el cariotip que tenen o haurien de tenir les cèl·lules del cultiu. Si

després de realitzar aquesta caracterització s’identifiquen anomalies morfològiques en els

cromosomes, és molt probable que hi hagi hagut una contaminació.

La preparació dels cromosomes per fer una tinció uniforme requereix de l’addició de

colquicina o viniblastina per bloquejar les cèl·lules en les seves mitosis a l’alçada de les

metafases. Un cop fixades en metafase, cal tripsinitzar les cèl·lules o simplement sacsejar

fora del pot les cèl·lules metafàsiques poc adherides. Les cèl·lules extretes s’haurien de

resuspendre en una solució hipotònica de citrat. Les cèl·lules s’haurien aleshores de fixar

en suspensió amb metanol acètic fred i resuspendre en un fixant fresc.

Després d’una centrifugació i una nova resuspensió, es deixa caure una gota de la mescla en

un portaobjectes i es fixa amb Giemsa.

Un procediment paral·lel a la preparació de cromosomes per tinció uniforme és el Bandeig

cromosòmic o la Hibridació fluorescent in situ (FISH). Aquesta última consisteix en la


CEBIO 31

introducció de sondes fluorescents a la mostra en metafase i comprovar si hi ha una

il·luminació corresponent a l’esperada. D’aquestes sondes se’n fabriquen d’un sol gen, de

centròmer, de telòmer, de pintat, de genoma... La Hibridació in situ fluorescent de pintat

permet veure reorganitzacions quan no es fa un cariotip.

Polimorfismes de DNA.

La caracterització de les cèl·lules i les línies cel·lulars per mitjà dels polimorfismes de DNA

consisteix en detectar variacions en el DNA dels cultius en diferents moments, permetent-

nos veure si hi ha variacions esperades o inesperades. Hi ha 2 mètodes de caracterització

per polimorfismes de DNA: RFLP i STR.

Restriction Fragment Length Polymorphisms.

Dins del DNA hi ha regions altament polimòrfiques, és a dir, variables. La RFLP és la

primera tècnica que es va descriure per caracteritzar a nivell molecular les línies cel·lulars i

es basa, precisament, en aquestes regions variables. La tècnica consisteix en determinar

canvis en la longitud de zones d’entre 10 i 20 parells de bases en el genoma d’un individu o

línia cel·lular. Les mides del fragment de restricció, en tant que es veuen alterades pels canvis

en o entre els llocs de reconeixement d’enzims, permeten determinar les variacions entre

línies cel·lulars o en el temps.

Els canvis o mutacions en aquestes regions es poden detectar per Southern blots. Per fer-

ho, s’ha d’extreure tot el DNA i tallar-lo amb uns enzims de restricció determinats. A

continuació s’ha de córrer un gel d’agarosa o poliacrilamida, transferir-lo a una membrana

i hibridar-lo amb una sonda. Gràcies a aquesta hibridació es troba un patró de bandes que

permet comparar genomes.

Short Tandem Repeats.

Les STR són elements de seqüència d’entre 3 i 7 parells de bases que es repeteixen.

Poden ser pentanucleòtids, tetranucleòtids, trinucleòtids o dinucleòtids.

La quantitat de repeticions STR en uns loci pot ser altament variable entre individus, el que fa

que aquests marcadors genètics siguin efectius per la identificació humana o els

processos d’autentificació cel·lulars. Els STRs s’han tornat marcadors de repetició del

DNA perquè son fàcilment amplificables per la reacció en cadena de la polimerasa (PCR)

si es fan servir primers que s’uneixin a les regions circundants de la repetició STR. Es poden

examinar múltiples loci STR simultàniament per crear un perfil de DNA.

Estudis retrospectius de 500 línies cel·lulars humanes revelen que hi ha un mínim de 8

marcadors STR centrals: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, vWA, TH01, TPOX,

CSF1PO. Per buscar la relació entre diferents línies cel·lulars, es recomana fer-los servir tots

8. Permet identificar de manera única les diferents cèl·lules humanes i fer comparacions de

perfils. A més a més, s’utilitza la amelogenina, que determina si és XX o XY, el que permet

observar i comparar perfils amb prou certesa.

La identificació de contaminacions del nostre cultiu mitjançant les STRs consisteix en quins

fragments nous apareixen que abans no hi fossin. Aquests nous fragments correspondran

a altres línies cel·lulars responsables de la infecció.

Cas exemple.

Creixement normal i diferenciació en una línia cel·lular de queratinòcits humans immortalitzada

espontàniament.

En aquest experiment que ara posarem d’exemple per a comprendre la caracterització

cel·lular, es van aïllar queratinòcits normals del prepuci de nadons humans. Els


CEBIO 32

queratinòcits són les cèl·lules de la pell. Els cultius de queratinòcits es van establir tot

plaquejant alíquotes d’una suspensió cel·lular en presència d’una capa d’alimentadors

(feeders).

Les cèl·lules cultivades inicialment, al cap de 15 PDLs, van aparèixer planes i grans, indicant

senescència. Al PDL 16, malgrat tot, va aparèixer una nova població de cèl·lules amb una

morfologia empaquetada i petita. Al PDL 17, aquestes cèl·lules havien reemplaçat

completament tota la població anterior. Les mateixes cèl·lules es van anar subcultivant fins

arribar a un PDL 58 al cap de 372 dies.

Els investigadors postulaven que aquestes cèl·lules eren, tal i com diu el seu títol,

immortalitzades espontàniament. Per corroborar-ho, van realitzar un anàlisi cariogenètic on

van observar un canvi només a la fase 32 amb un iso-cromosoma 8 (s’havien reproduït els

braços llargs dues vegades en comptes de tenir dos llargs i dos curts). També van realitzar

un anàlisi dels polimorfismes de DNA mitjançant 4 loci de STRs en 5 línies cel·lulars diferents.

Les línies dels STR coincidien, indicant que, certament, eren la mateixa línia cel·lular.

Tema 10 - Tècniques especials: sincronització cel·lular.

El cicle cel·lular.

Les cèl·lules humanes que es divideixen de forma ràpida tenen un cicle cel·lular que dura

unes 24 hores. El cicle cel·lular està dividit en dues parts fonamentals: interfase, que ocupa

la majoria del cicle cel·lular, i mitosi, que dura uns 30 minuts. El cicle finalitza amb la divisió

de la cèl·lula. Durant la interfase, el DNA es troba distribuït de manera difusa pel nucli i els

cromosomes no es poden distingir individualment. Poca activitat és visible a través del

microscopi, però hi ha dos tipus de processos importants que estan succeint. Els processos

continus ocorren durant la interfase i són referits col·lectivament com a creixement.

Els processos esglaonats ocorren un cop per cicle. La replicació cromosòmica, per exemple,

està restringida a una part concreta de la interfase anomenada fase S. La fase S ocorre enmig

de la interfase, precedida per un interval anomenat G1 i seguida d’un altre anomenat G2.

Després que cada cromosoma s’hagi replicat, els dos cromosomes fills es mantenen

enganxats l’un amb l’altre en múltiples punts en la seva longitud i ens hi referim com a

cromàtides germanes. En un cicle cel·lular animal típic, G1 dura 12 hores, la fase S en dura

6, G2 en dura 6 més i la mitosi triga uns 30 minuts.

La supervivència de tots els organismes depèn de la transmissió precisa de la

informació genètica d’una cèl·lula a les seves filles. Aquesta transmissió fefaent reflecteix

la precisió de la replicació del DNA i l’assemblatge del fus mitòtic, així com dels mecanismes

que reparen el DNA danyat i que realineen cromosomes que s’han unit incorrectament al fus

mitòtic. Però aquests processos no poden garantir la transmissió de la informació genètica a

no ser que les cèl·lules puguin solucionar el problema de la fi, pel qual alguns processos han

d’haver acabat abans que altres comencin.

Per fer-ho, les cèl·lules han de garantir que no entren en la mitosi fins que la replicació

del DNA s’ha completat i que no comencen l’anafase fins que tots els cromosomes es

troben correctament alineats al fus. De forma similar, les cèl·lules que hagin patit danys en

el DNA durant la G1 haurien d’esperar fins a la seva reparació abans d’entrar a la replicació

del mateix, i les cèl·lules que han patit danys en el DNA durant la fase S o la fase G2 haurien

de reparar-lo abans d’entrar en mitosi.

El progrés del cicle cel·lular es troba regulat en checkpoints o controls que corresponen

a la transició en la maquinària del cicle cel·lular. El pas a cada fase està regulat per ciclines

CDK, responsables de fosforilar proteïnes diana i promoure el transcurs del cicle. Les CDK


CEBIO 33

són constants però les ciclines associades a elles varien segons quin pas regulin, ja

que fosforilen diferents proteïnes. El checkpoint del final de G1 controla les condicions

externes: que hi hagi factors de creixement, que la cèl·lula tingui la mida adequada, que no

hi hagi un DNA lesionat (si p53 estigués danyat, obtindríem poliploïdies). Si passa aquest

checkpoint, s'ha de replicar sí o sí. En cas que no repliqui, la cèl·lula es mor. Un altre

control és al final de la G2 i abans de la mitosi, el qual controla que el DNA estigui replicat i

no lesionat, a part de la mida cel·lular. Quan se supera, s'entra en mitosi. L'últim checkpoint

és el de Metafase-Anafase. Aquest punt de control assegura que tots els cromosomes

estiguin ben orientats i units al fus mitòtic.

Per citometria de flux es pot mesurar la quantitat de DNA en cada cèl·lula individual tot

detectant la fluorescència de tints d’unió al DNA. Un cop ha analitzat moltes cèl·lules, el

citòmetre retorna una lectura de la distribució de les cèl·lules amb diferents continguts de DNA

en la població. Les cèl·lules en G2 tenen el doble de DNA que les cèl·lules en G1 i les cèl·lules

en fase S tenen una quantitat intermèdia. L’alçada relativa dels diferents pics en la lectura

indicarà la fracció de la població cel·lular en cadascun del estadis del cicle. Un pic del

citòmetre abans del 100% són cèl·lules en apoptosi. Si hi ha pic de citòmetre més enllà del

200% de contingut de DNA és que hi ha cèl·lules poliploides. Existeixen colorants vitals que

permeten marcar el DNA de la cèl·lula sense matar-les i existeixen els colorants DAPI o el

Iodur de propidi que només funcionen sobre cèl·lules mortes.

En cas que al nostre cultiu hi tinguem cèl·lules polinucleades, els pics es desplaçarien per

indicar una quantitat doble de DNA. Fins i tot es podria arribar a tenir cèl·lules 4n, aconseguint

un perfil més estrany de citometria de flux.

Mètodes físics de separació de cèl·lules.

Fluorescence Activated Cell Sorter.

Un FACS consisteix en un citòmetre de flux que, en funció del valor de la fluorescència que

obtingui sobre el DNA, aprofitarà la càrrega elèctrica que pot provocar per traslladar les

cèl·lules a un col·lector de cèl·lules mitòtiques o a un d’interfàsiques. Depenent de la

precisió que es busqui es pot aconseguir separar les cèl·lules en funció de la fase del cicle

cel·lular en què es trobin.

Mitotic shakeoff.

El Mitotic Shakeoff és una tècnica de separació física que aprofita que les cèl·lules perden

adhesió amb el substrat quan estan en mitosi. El procediment del mitotic shakeoff consisteix

en fer 10 cultius de 75cm2 amb unes 106 cèl·lules en cadascun i incubar-los durant dos dies

en multilayer flasks. Passats els dos dies cal agitar i recuperar el medi amb les cèl·lules

mitòtiques, aproximadament entre un 2 i 5% de les que hi havia al flascó. Aquest medi que

hem recollit s’ha de centrifugar i recollir-ne les cèl·lules per després afegir-hi 5mL de medi

fresc, incubar durant dues hores més i repetir el procés.

La gran quantitat de mostra que requereix aquest procediment és perquè la mitosi té una

durada aproximada de 30 min. Si tenim en compte que el cicle cel·lular en mamífers dura

unes 24 hores, només una quantitat aproximada del 5% de les cèl·lules estaran en fase

M. Arran d’això, necessitarem un nombre considerable de flascons, així com algun treball en

equip per reduir al màxim el temps de processament.

Elutriació per centrifugació

En una elutriació, les cèl·lules carregades a la cambra de separació estan sotmeses a la

força centrífuga generada per la rotació d'un rotor en sentit exterior i a la força de fluid


CEBIO 34

bombada a la cambra de separació en sentit interior. En canviar gradualment l'equilibri

d'aquestes dues forces, les cèl·lules se separen segons la mida, la forma i / o la densitat.

A l'elutriador centrífug contraflux microfluídic, s'introdueix al microcanal un flux impulsat

per rotació que conté partícules o cèl·lules. A la cambra de separació, les partícules queden

en posicions específiques on s'equilibren les forces líquides i centrífugues. Finalment, la

recuperació de partícules s'aconsegueix augmentant gradualment la densitat de fluids.

Mètodes químics de separació de cèl·lules.

Els mètodes químics de separació cel·lular consisteixen en bloquejar algun fenomen

del cicle cel·lular. Així i tot, s’ha d’anar amb cura amb fer-los servir, ja que poden ser tòxics.

Bloqueig a G0.

La fase G0 és la més fàcil de sincronitzar. Per aconseguir-ho primer hem de tenir les

cèl·lules creixent en DMEM amb el 10% de FCS, un medi complet. Aleshores prenem les

nostres cèl·lules i les incubem entre 2 i 3 dies a 37ºC i reemplacem el medi per DMEM amb

el 0.5% de FCS. Deixem incubar entre 2 i 3 dies més i rentem amb una solució salina que no

contingui ni Ca2+ ni tampoc Mg2+. Un cop rentat, tripsinitzem. La suspensió cel·lular resultant

ha de ser dispersada amb la pipeta, transferida a un tub de centrífuga, diluïda en un volum

igual de medi de creixement i centrifugada. Finalment, només queda resuspendre les cèl·lules

en un medi complet (10% de FCS) i inocular a una densitat de 106 cèl·lules per placa.

Bloqueig a G1.

Per realitzar un Bloqueig a G1 disposem de 2 compostos químics diferents: la Lovastatina i

la mimosina.

La Lovastatina inhibeix la HMG-CoAreductasa, donant lloc a l'esgotament del mevalonat,

que és un precursor essencial de la síntesi de colesterol i un requisit per a la isoprenilació de

molècules de substrat, incloses les rases p21. La Lovastatina és un inhibidor còmode i ràpid

de les cèl·lules G1 primerenques. La Lovastatina no és eficaç amb tots els tipus cel·lulars, i

en alguns també indueix una aturada parcial de cèl·lules en G2 / M. La Lovastatina és

més cara que alguns altres mètodes.

La mimosina, un aminoàcid derivat de les plantes l'objectiu cel·lular del qual encara no està

clar, bloqueja les cèl·lules sigui en la fase G1 tardana sigui al límit G1 / S. La mimosina és

barata i relativament no tòxica en comparació amb altres inhibidors químics, com ara

l'afidicolina. A diferència d’aquesta, però, la mimosina requereix diverses hores per inhibir

la progressió del cicle cel·lular. Els estudis de seguiment de la progressió del cicle cel·lular

indiquen que la replicació s'inicia d'1 a 2 hores després de l'alliberament del bloqueig induït

per mimosina.

Bloqueig a G1/S.

La sincronització de cèl·lules a la frontera de la fase G1 / S s'aconsegueix generalment

mitjançant la inhibició de la síntesi d'ADN mitjançant inhibidors químics, incloent-hi

hidroxiaurea, excés de timidina o l’afidicolina. El primer destrueix una Tyr essencial de la

ribonucleòtid reductasa, el segon inhibeix el mateix enzim per acumulació de timidina trifosfat

i el tercer inhibeix directament la DNA polimerasa. Independentment de l’agent, calen dues

rondes de bloqueig per induir la sincronia.

Bloqueig a M.

El nocodazol és un agent antineoplàstic que exerceix el seu efecte en les cèl·lules interferint

en la polimerització de microtúbuls. Diversos fàrmacs, inclosa la vincristina i el colcemid, són

similars al nocodazol, ja que també interfereixen amb la polimerització de microtúbuls.


CEBIO 35

Capítol IV - Biotecnologia en cèl·lules animals i teixits.

Tema 11 - Línies cel·lulars en recerca i producció biotecnològica.

Expression host Systems.

En general, la majoria de les línies de cèl·lules animals secreten proteïnes. Això ens evita

la lisi cel·lular per a l'extracció i el posterior pas de replegament de proteïnes. La glicosilació

de proteïnes és una característica important i té un paper crucial en l'eficàcia, vida mitjana

sèrica i antigenicitat d'un biofàrmac recombinant. Cal tenir en compte, però, que les cèl·lules

de mamífer, de llevat i d’insecte difereixen en els patrons de glicosilació. El cultiu

cel·lular, els paràmetres bioquímics i els processos físics són, també, els responsables

d'aconseguir les glicoformes desitjades d'una proteïna terapèutica recombinant.

Cèl·lules de mamífer.

Les línies cel·lulars de mamífers no humanes també produeixen PTMs que s'expressen en

humans. A saber, la galactosa-α1,3-galactosa (α-gal) i l’àcid N-glicolilneuraminic (NGNA).

Com que els humans posseeixen anticossos circulants contra tots dos N-glicans, les línies de

cèl·lules no humanes se solen analitzar durant la seva producció per identificar clons amb un

perfil glicà acceptable. Per PTMs entenem la glicosilació, la formació de ponts disulfur, la

fosforilació o el processament proteolític.

Les cèl·lules de mamífer produeixen un bon plegament i secreció proteiques apart de l’alta

qualitat de les mateixes. Així i tot, tenen una baixa ràtio de creixement, un alt cost total, un alt

temps de producció, una difícil propagació i un alt risc de contaminació.

Línies cel·lulars de ratolí.

Les línies cel·lulars de ratolí que es fan servir són les Línies de Mieloma (NS0 i Sp2/0).

Aquestes cèl·lules són derivades de cèl·lules tumorigèniques (mieloma) productores

d’Immunoglobulines. ·Ja no produeixen les originals però que contenen la maquinària per

produir-les i secretar-les. Les cèl·lules NS0 han estat utilitzades en processos de fusió per

produir cèl·lules d’hibridoma que produeixen anticossos monoclonals. NS0 s’ha convertit en

una important cèl·lula hoste per a la producció de proteïnes recombinants, especialment en

combinació amb el sistema de selecció GS (Glutamine synthetase). Sp2/0-Ag14 cell line es

troba adaptada a créixer en medi químicament definit animal i sèrum-free.

Línies cel·lulars de hàmster.

Les cèl·lules CHO, cèl·lules d’ovari de hàmster xinès, són les cèl·lules més utilitzades (70%

proteïnes recombinants aprovades). Creixen tant adherides com en suspensió. Poden créixer

sense sèrum i en medis químicament definits. Tenen una baixa susceptibilitat a la infecció

vírica, són molt tolerants a canvis de pH, pressió, nivell d’oxigen i de temperatura. Hi ha

soques CHO deficients per la dihidrofolat reductasa (dhfr), útils per a la co-transfecció amb

un gen diana. Les FUT8-/-CHO cells, es fan servir per la producció de fucosylated anti-HER2

antibody.

Hi ha estudis que afirmen que una deficiència de fucosa de la cadena de carbohidrats

connectada a Asn297 a la regió Fc IgG1 humana podria millorar l'afinitat amb el receptor

FcγRIII sobre cèl·lules naturals assassines (NK) i millorar la bioactivitat de la citotoxicitat

cel·lular depenent dels anticossos (ADCC).

Línies cel·lulars de mico.

Les línies cel·lulars mico que més es fan servir són les cèl·lules Vero, les quals deriven de

ronyó normal de la mona verda africana. Tenen una morfologia de fibroblasts i un creixement

depenent d’ancoratge. S’adapta bé a sistemes de creixement amb perfusió contínua, i permet


CEBIO 36

obtenir elevades densitats. Hi ha variants adaptades al creixement sense sèrum. S’ha utilitzat

massivament en la producció de vacunes virals.

Línies cel·lulars humanes.

Existeixen vàries línies cel·lulars humanes que es poden cultivar i que es fan servir.

La WI-38 és una línia derivada de teixit pulmonar embrionari humà. Amb una morfologia de

fibroblast, són cèl·lules dependents d’ancoratge i que formen multicapes quan creixen durant

períodes llargs. Com que tenen un ampli ventall de susceptibilitat a virus, és una línia

cel·lular utilitzada en la producció de vacunes.

La MRC-5 és una línia cel·lular derivada de teixit pulmonar fetal humà normal. També té una

morfologia de Fibroblast, com la WI-38. A diferència d’ella, és destacable que duplica més

ràpidament i que és més resistent. Es duplica entre 60 i 80 vegades abans d’arribar a la

senescència, mantenint-se estables. En producció s’utilitzen PD28-30.

La línia cel·lular HEK293 (Human embryonic kidney) i els seus derivats creixen en suspensió

en absència de sèrum. Aquesta línia cel·lular es fa servir per produir anticossos recombinants,

proteïnes de fusió d’anticossos i proteïnes importants com ara receptors acoblats a proteïnes

G, canals iònics regulats per lligand o canals iònics sensibles a la tensió. Es va utilitzar per

produir Drotrecogin-α, i molècules anti-thrombotic, antiinflammatory, i profibrinolytic que

necessiten unes PTM que les CHO no poden fer. Les cèl·lules HEK293 són unes cèl·lules

fàcilment transfectables i de les que es poden produir virus lentivirus en la seva “soca”

HEK29T.

La línia cel·lular humana HeLa va ser la primera línia cel·lular humana establerta (1951).

Deriva d’un adenocarcinoma de cèrvix uterina humà. Amb una morfologia similar a les

cèl·lules epitelials, les cèl·lules HeLa són susceptibles al virus de la poliomielitis tipus 1 i a

l’adenovirus tipus 3. S’han utilitzat per la producció de proteïnes recombinants no

terapèutiques com la metallothioneina1 de ratolí, superòxid dismutasaCu/Zn humana i de

l'antigen de superfície de la hepatitis B. La seva amplia utilització ha portat a que hagi

contaminat moltes altres línies cel·lulars.

Cases comercials.

Existeixen vàries cases comercials que vénen línies cel·lulars, com ATCC, DSMZ, ECACC o

ICLC. Les empreses de venta de línies cel·lulars poden ser del tipus “Certified Cell Lines” si

les cèl·lules que vénen es troben caracteritzades i certificades que no tenen micoplasma,

bacteris, fongs, protozous i virus citopàtics; o poden ser del tipus “Cell Repository Lines”, on

les cèl·lules compleixen els requisits mínims de caracterització i on es certifica que no hi ha

contaminació microbiana.

Les CCL caracteritzen el creixement de les cèl·lules per fotografies i el cariotip. L’espècie

d'origen de la línia també s’ha testat per anàlisi immunològics i isoenzimàtics. En les CRL,

s’ha verificat l’espècie d’origen i la viabilitat desprès de la congelació.

Tema 12 - Escalat de cultius cel·lulars

Biotecnologia vermella.

La biotecnologia vermella és aquella dedicada a la salut. En aquesta, es poden

aconseguir productes a partir de les cèl·lules, cèl·lules com a producte o es pot intentar

substituir les proves en animals. És sol buscar obtenir glicoproteïnes i vacunes a partir de

cèl·lules; cèl·lules en suspensió per teràpies, teixits funcionals per transplantar i organoides

extracorporis com a producte i es mira de validar els agents i les seves dosis fora dels

animals.


CEBIO 37

Consideracions per l’escalat.

Quan volem fer un escalat d’un cultiu cel·lular hem de tenir en compte varis factors: la

quantitat de producte que es necessita, el tipus de cultiu cel·lular que serà, quina serà la

limitació d’oxigen i de gasos, quines limitacions de nutrients hi haurà, com eliminarem els

metabòlits tòxics i quines forces hidrodinàmiques estaran presentes en tot moment. També

és important saber que no sempre podrem fer servir un bioreactor de tanc agitat, sinó

que probablement haurem de fer servir Flascons T-175 o sistemes de cultius multitray.

Sistemes d’immobilització de cèl·lules.

Moltes cèl·lules les farem servir més per aconseguir productes cel·lulars que no pas per

obtenir-les a elles mateixes. En aquests casos és necessari mantenir les cèl·lules dins de

la nostra zona de cultiu per poder anar recollint el producte sense perdre el

biocatalitzador. Hi ha diverses opcions per aconseguir-ho. Les cèl·lules es poden trobar

unides a una superfície de forma natural o artificial, poden estar atrapades en una matriu

porosa o poden estar contingudes darrere una barrera. Hi ha un altre procediment que es pot

fer servir: l’autoagregació mitjançant la gota penjant o l’agitació constant, el que també ens

permetrà immobilitzar-les.

Els microcarriers s'utilitzen regularment per cultivar poblacions de cèl·lules adherents en

la producció comercial a gran escala de productes biològics i vacunes. El desenvolupament

dels microcarriers va començar el 1967, quan van Wezel va comprovar que aquests podien

donar suport al creixement de cèl·lules dependents d'ancoratge.

Els microcarriers solen ser esferes de 125 a 250 micròmetres de diàmetre i la seva densitat

permet mantenir-les en suspensió amb agitació suau. Es poden fabricar amb diversos

materials, incloent-hi DEAE-dextran, vidre, plàstic de poliestirè, acrilamida, col·lagen i alginat.

Aquests materials, juntament amb diferents components químics de superfície, poden influir

en el comportament cel·lular, inclosa la morfologia i la proliferació. Els components

químics de superfície poden incloure proteïnes de matriu extracel·lular, proteïnes

recombinants, pèptids i molècules de càrrega positiva o negativa.

El cultiu de cèl·lules en microcarriers se sol realitzar en matrassos de rotatoris, tot i que

altres contingents com ara bioreactors de microgravetat de paret giratòria o bioreactors de llit

fluïditzat també poden donar suport a cultius basats en microcarriers. Els avantatges de la

tecnologia de microcarriers en la indústria de les vacunes inclouen la facilitat d'escalat, la

capacitat de controlar amb precisió les condicions de creixement cel·lular en bioreactors

sofisticats i controlats per ordinador, una reducció global de l'espai i del volum dels

bioreactors necessaris per a una operació de fabricació i una reducció dràstica de la mà

d'obra.

Amb la immobilització cel·lular s’han aconseguit crear les Hollow Fibers, una classe de

membranes artificials que contenen una barrera semipermeable en forma de fibra buida.

Originalment desenvolupada a la dècada de 1960 per a aplicacions d'osmosi inversa, des de

llavors les membranes de fibra buida han prevalgut en el tractament de l'aigua, el cultiu

cel·lular, la medicina i l'enginyeria de teixits. La majoria de les membranes de fibra buida

comercials es troben envasades en cartutxos que es poden utilitzar per a una varietat de

separacions gasoses i líquides3.

Producció de productes cel·lulars.

La producció de productes cel·lulars permet produir proteïnes recombinants. En aquest cas,

el que es fa és cultivar les cèl·lules en hidrogel, un material que es pot polimeritzar de tal

3 Extret de la Viquipèdia tot els microcàrriers i les Hollow fibers. S’hauria de canviar si pots.


CEBIO 38

manera que situa a les cèl·lules en una estructura on no hi ha estrès hidrodinàmic causat pel

moviment. Sense les tensions hidrodinàmiques, les cèl·lules de mamífers podrien

créixer a alta densitat amb alta productivitat.

Entre els diversos productes cel·lulars que ens pot interessar obtenir hi trobem les vacunes.

Aquestes es solen generar amb virus lentivirus que es poden aconseguir, per exemple, fent

servir un bioreactor de llit empacat en el que hi tenim cèl·lules que infectem amb el virus en

qüestió.

Producció de cèl·lules.

Les cèl·lules que més ens pot interessar cultivar són les cèl·lules mare embrionàries.

Aquestes són cèl·lules totipotents i, de situar-ser en un punt on hi ha hagut una lesió tissular,

podrien diferenciar-se per completar aquell mateix teixit on es troben. Són, per tant, una

esperança en el desenvolupament de la medicina regenerativa.

Una altra possible funció de l’obtenció de cèl·lules seria el seu ús en la immunoteràpia.

Aquesta es sol fer amb limfòcits T adults. Per aconseguir-les, el primer que s’ha de fer és

separar els glòbuls blancs, incloent-hi les cèl·lules T, de la resta de la sang. La bossa de

cèl·lules resultant es transporta a una empresa perquè les reprogramin. En les teràpies CAR-

T aprovades, un vector víric transmet a les cèl·lules T un gen que codifica per un receptor

d’antigen quimèric anomenat CAR. Les cèl·lules transgèniques, ara conegudes com

cèl·lules CAR-T, es multipliquen en un bioreactor.

El pacient rep quimioteràpia per rebaixar la quantitat de glòbuls blancs que tenen disponibles

a la sang, deixant espai per les noves cèl·lules CAR-T. Finalment, les cèl·lules CAR-T

s’introdueixen a la sang del pacient, on proliferen i detecten i destrueixen cèl·lules canceroses.

Les cèl·lules produïdes també es poden fer servir per generar nous teixits. En un

experiment, per exemple, es va valorar la Viabilitat d'utilitzar aorta descel·lularitzada de porcs

fetals (DAFPs) per construir empelts vasculars de gran diàmetre enginyats amb teixits i provar

el rendiment i l'aplicació de DAFPs com a bastides enginyades per teixits vasculars al sistema

arterial caní.

En aquest estudi, es va utilitzar un sistema de bioreactor vascular dissenyat a mida i

produït per a sembres dinàmiques. Aquest sistema de bioreactor vascular pot simular

l'ambient mecànic vascular intern, afavorir l'adhesió i la proliferació de Cèl·lules Endotelials

(EC) i evitar que les EC sembrades es rentin després del trasplantament al sistema arterial.

Els resultats del present estudi van demostrar que la sembra dinàmica va fer que les EC

s'adherissin estrictament als DAFPs.

Els empelts vasculars de petit diàmetre dissenyats amb teixits amb una capa EC intacta es

poden construir amb èxit mitjançant DAFPs. Es poden trasplantar aquests vasos sanguinis

engendrats per teixits per substituir l'artèria caròtida comuna canina. A més, els empelts

s'assemblen estructuralment i funcionalment a l'artèria normal després de remodelar in vivo

en animals. Per tant, els DAFPs poden tenir un potencial d'ús en la construcció d'empelts

vasculars de petit diàmetre dissenyats per enginyeria de teixits.

Una altre aplicació és la generació d’organoides extracorporis. Un organoide és una versió

miniaturitzada i simplificada d'un òrgan produït in vitro en tres dimensions que mostra una

microanatomia realista. Es deriven d'una o poques cèl·lules d'un teixit, cèl·lules mare

embrionàries o cèl·lules mare pluripotents induïdes, que poden autoorganitzar-se en un cultiu

tridimensional a causa de les seves capacitats d'autorenovació i diferenciació.


CEBIO 39

La formació d'organoides requereix el cultiu de cèl·lules mare o progenitores en un medi 3D.

El medi 3D es pot fer mitjançant una matriu extracel·lular hidrogel Matrigel o Cultrex BME,

que és una matriu extracel·lular rica en laminines segregada per la línia de tumor Engelbreth-

Holm-Swarm. Els cossos organoides es poden fer mitjançant incrustacions de cèl·lules

mare en un medi 3D. Quan s'utilitzen cèl·lules mare pluripotents per a la creació

d’organoides, es sol deixar que les cèl·lules formin cossos embrionaris. Aquests cossos són

tractats farmacològicament amb factors de patró per impulsar la formació de la identitat

organoide desitjada. Els organoides també s'han creat utilitzant cèl·lules mare adultes

extretes de l'òrgan objectiu i cultivades en medis 3D4.

Substitució de proves en organismes.

Els organoides derivats del pacient també representen un recurs important per

desenvolupar règims de tractament personalitzats. L'amplificació in vitro d'organoides de

pacients procedents de biòpsies del lloc de la malaltia pot aportar material suficient per a la

seqüenciació profunda que reveli mutacions causals o per a un perfil fenotípic en profunditat

que faciliti els règims de tractament més adaptats.

La capacitat de fer créixer organoides saludables i malalts de pacients humans permet, a

més, pantalles clíniques per a combinacions de medicaments que dirigeixen selectivament el

teixit malalt, ajudant a identificar tractaments més efectius amb efectes secundaris

mínims. Molts efectes secundaris dels medicaments contra el càncer es poden atribuir a la

toxicitat aguda del fetge. Per tant, es podria preveure l'ús d'organoides hepàtics per predir la

toxicitat hepàtica de les combinacions experimentals de medicaments abans de començar

assajos clínics.

Altres aplicacions clíniques inclouen l'ús d'organoides de la malaltia per predir l'adquisició

de resistència als fàrmacs i per desenvolupar fàrmacs que s'orientin efectivament a les

cèl·lules mare potencialment canceroses. A més, en combinació amb la microscòpia 4D, es

poden fer un seguiment del temps amb els organoides per avaluar el comportament i la

viabilitat de les cèl·lules canceroses en resposta a un tractament.

Una estratègia per millorar la taxa d'èxit de nous fàrmacs contra el càncer en transició a la

fase clínica seria alinear els models cel·lulars utilitzats en el seu descobriment

primerenc amb models animals preclínics i tumors de pacients. Per als tumors sòlids,

això requeriria el desenvolupament i la implementació de models tridimensionals (3D) de

tumors in vitro que recollissin amb més precisió l'arquitectura i la biologia del tumor sòlid

humà. Destaquem dos mètodes que produeixen esferoides tumorals multicel·lulars 3D de

mida uniforme i controlada compatibles amb la investigació sobre fàrmacs contra el càncer i

el cribratge d'inhibició de creixement de gran rendiment (HTS): esferoides tumorals formats

en microplaques d'adhesió ultra baixa o en matrius de micropous d'hidrogel de polietilè glicol

dimetacrilat.

4 Això també ha sortit de la Viquipèdia.

cultius cel·lulars - uab barcelona...•cèl·lules solitàries de la línia cel·lular l mostren...

Documents