SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

E. coli: 4.6 X 106 bp genome size, in terreni ricchi.

G= 22’, aerobiosi, per produzione di proteine

ricombinanti.

Tempo di riproduzione

ALCUNI MICRORGANISMI UTILIZZATI PERI PROCESSI BIOTECNOLOGICI

• Aeremonium chrysogenum• Bacillus brevis• Bacillus subtilis• Bacillus thurigiensis• Corynebacterium glutamicum• Pseudomonas•Rhizobium•Streptomyces•Zymonas mobilis

SISTEMI BIOLOGICI IMPIEGATI NELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE

• S. cerevisiae: 14 x 106 bp genome size, ben nota la biologia molecolare e il metabolismo, genoma totalmente sequenziato nel 1996, impiegato per la produzione di proteine ricombinanti da eucarioti.

VETTORI VIRALI: PRODUZIONE IN SISTEMI CELLULARI DI PROTEINE RICOMBINANTI E

VACCINI.

PROCEDIMENTO DI CLONAZIONE DEL DNA RICOMBINANTE

DNAdi partenza

DNAbersaglio

Vettore diclonazione

Frammentazioneenzimatica

Linearizzazioneenzimatica

Unione DNA bersaglio-vettoreDi clonazione

Costrutto di DNAIntroduzione delDNA nella cellula ospite

Isolamento delle cellule con il gene clonato

Cellula ospite

Proteina codificatadal gene clonato

Produzione di proteinada gene clonato

1

2

3

4

Enzimi di restrizione Enzimi di restrizione

Le biotecnologie ricombinanti sono in grado di analizzare e manipolare il Le biotecnologie ricombinanti sono in grado di analizzare e manipolare il materiale genetico essenzialmente utilizzando una serie di specifiche attività materiale genetico essenzialmente utilizzando una serie di specifiche attività

enzimatiche con le quali possono “tagliare” e “cucire” il DNAenzimatiche con le quali possono “tagliare” e “cucire” il DNA

Tra gli strumenti più utili a nostra disposizione si annoverano Tra gli strumenti più utili a nostra disposizione si annoverano gli enzimi di gli enzimi di restrizionerestrizione, enzimi capaci di riconoscere sul DNA brevi sequenze bersaglio, di , enzimi capaci di riconoscere sul DNA brevi sequenze bersaglio, di solito palindromiche tagliandole in posizioni specifiche. solito palindromiche tagliandole in posizioni specifiche. Una palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da Una palindrome è una parola che si legge allo stesso modo sia da destra che da sinistra, per es. la parolasinistra, per es. la parola radar radar oppure oppure ala. ala. Un sito di riconoscimento Un sito di riconoscimento palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in palindromico è una sequenza in cui il filamento superiore e inferiore, letti in direzione 5’-3’, sono uguali. Per es. la sequenza: direzione 5’-3’, sono uguali. Per es. la sequenza:

’’’’’’’’

Gli enzimi di restrizione furono scoperti intorno agli anni ‘50 e devono il loro nome al fenomeno della restrizione-modificazione controllata dalla cellula ospite. Si notò che talvolta l’introduzione in E.coli di DNA esogeno, proveniente da un diverso ceppo di E.coli, risultava nella sua rapida frammentazione in piccoli frammenti (restrizione). L’analisi di un DNA virale rivelatosi capace di resistere alla degradazione, rivelò, una decina di anni più tardi, la presenza di alcune basi metilate. Si scoprì, quindi, l’esistenza in E.coli di sistemi di restrizione/modificazione capaci di metilare specifiche basi e, contemporaneamente, di tagliare le stesse basi quando non metilate. Con questo sistema E.coli è capace di degradare DNA esogeno tagliandolo in specifici siti di riconoscimento. Gli stessi siti presenti sul DNA endogeno, tuttavia, non sono tagliati perché preventivamente metilati dal sistema di restrizione-metilazione

ENZIMI DI RESTRIZIONE

ISOLATI DAI BATTERI RICONOSCONO BREVI SEQUENZE DI DNA E TAGLIANO MOLECOLE DI DNA IN SITI SPECIFICI

(SITI DI RICONOSCMENTO)

RICONOSCONO COME SITI “TARGET” ESANUCLEOTIDI MA ANCHE SEQUENZE DI DNA DI 4,5,8 NUCLEOTIDI

-N-N-GAATTC-N-N-N-N-CTTAAG-N-N

Specifica sequenza palindromica

EcoRI

TAGLIA TRA I RESIDUI DI GUANINA E DI ADENINA DI CIASCUN FILAMENTO

EcoRI:TAGLIO SIMMETRICO E SFALSATO

Scanner pag 43 fig 4.2

SI PRODUCONO DUE ESTREMITA’ COMPLEMENTARI AD UN SOLO FILAMENTO (ESTREMITA’ COESIVE).

EcoRI:TAGLIO SIMMETRICO E SFALSATO

SI PRODUCONO 2 ESTREMITA’ COMPLEMENTARI AD UN SOLO LATO (ESTREMITA’ COESIVE)

Legame internucleotidico

3’ 5’

HindIII:TAGLIO CON ESTREMITA’ NETTE

SI PRODUCONO MOLECOLE DI DNA TERMINANTI PARI (ESTREMITA’ NETTE)

SEQUENZE DI RICONOSCIMENTO DI ALCUNE ENDONULEASI DI RESTRIZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

3 CLASSI:• TIPO I E III:

ATTIVITA’ DI RESTRIZIONE E DI METILAZIONE NELLA STESSA MOLECOLA. ASPECIFICITA’ DI TAGLIO: NON USATI IN BIOLOGIA MOLECOLARE.

• TIPO II:

2 ATTIVITA’ SU MOLECOLE DISTINTE. ELEVATA SPECIFICITA’ DI TAGLIO.

NOMENCLATURA

GENERE E SPECIE DEL BATTERIO DA CUI E’ STATO ISOLATO.

ISOSCHIZOMERI

RICONOSCONO LA STESSA SEQUENZA DI TAGLIO.

SPECIFICITA’ SITO SPECIFICA E FREQUENZA DI TAGLIO

Specificità sito-specifica e frequenza di taglioSpecificità sito-specifica e frequenza di taglio

La straordinaria importanza degli enzimi restrizione risiede nella loro La straordinaria importanza degli enzimi restrizione risiede nella loro specificità. Ogni particolare enzima di restrizione, infatti, riconosce una specificità. Ogni particolare enzima di restrizione, infatti, riconosce una sequenza specifica di basi all’interno di una catena polinucleotidica. La sequenza specifica di basi all’interno di una catena polinucleotidica. La maggior parte degli enzimi più comuni riconoscono da 4 a 6 basi.maggior parte degli enzimi più comuni riconoscono da 4 a 6 basi.

Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la Il numero di basi riconosciute è di importanza pratica perché determina la frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati. frequenza media di taglio e la dimensione media dei frammenti generati.

E’ ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più E’ ovvio che un enzima che riconosce una sequenza di 4 basi taglierà più frequentemente di uno che ne riconosce 6.frequentemente di uno che ne riconosce 6.

ENZIMI DI RESTRIZIONE

• LA MAGGIOR PARTE FUNZIONA IN SEMPLICI TAMPONI TRA pH 7 E 8, DI SOLITO A 37°C. (SPECIFICHE DEL FORNITORE)

• UNITA’ DI ENZIMA

• “EFFETTO STAR”

ENZIMI DI RESTRIZIONE: MODALITA’ DI TAGLIO

•Generano estremità piatte (blunt)

Es. SmaI5'-CCC GGG-3'3'GGG CCC-5’

•Generano estremità coesive (sticky) sporgenti al 5' (5' protuding)

Es. EcoRI5'-G AATTC-3'

3'-CTTAA G-5’

•Generano estremità coesive (sticky) sporgenti al 3' (3' protuding)

Es. PstI5'-CTGCA G-3'

3'-G ACGTC-5'

ELETTROFORESI SU GEL

ESTRAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA DA GEL DI AGAROSIO (POLISACCARIDE RICAVATO DA ALGHE MARINE)

ESEMPI DI SISTEMI DI PURIFICAZIONE:

• elettroeluizione• colonne a scambio ionico• gel-filtration• ultrafiltrazioni• agarosio a basso punto di fusione• ecc. ecc.

VETTORI PLASMIDICI

MOLECOLE DI DNA CIRCOLARI, A DOPPIO FILAMENTO CAPACI DI AUTOREPLICAZIONE CHE SI MANTENGONO NEI BATTERI COME ENTITA’ EXTRACROMOSOMALI INDIPENDENTI

PLASMIDE

CARATTERISTICHE ESSENZIALI:

• ORIGINE DI REPLICAZIONE• MARCATORE SELEZIONABILE• SITI DI RESTRZIONE UNICI• GRANDEZZA 1-500 Kb• GRANDEZZA INSERTO 0.1-10-15 Kb• ELEVATO N° DI COPIE: 10-100 COPIE• BASSO N° DI COPIE: 1-4 COPIE

Replicazione plasmidica

• “repliconi”molecole capaci di replicazione autonoma. Presenza di una origine di replicazione, chiamata ori (Nel caso dei plasmidi oriV, per “ori vector”))

replicazione (uni o bi-direzionale) circolo rotante

Richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico

Funzioni dell’origine di replicazione

•Il numero di copie

•La specificità d’ospite

•I gruppi di incompatibilità  

NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONENUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE

Modalità di replicazione:Modalità di replicazione:• quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la quelli di grandi dimensioni, si replicano in maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico e si di dicono sottoposti a replicazione del cromosoma batterico e si di dicono sottoposti a controllo controllo stringentestringente. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.

• Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti replicazione batterica e si dicono sottoposti a controllo rilassatoa controllo rilassato. . Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio. Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.

  Plasmidi Plasmidi ori ori numero di copienumero di copie

PBR322 e derivatiPBR322 e derivati PMB1 PMB1 15-20 15-20

PUC e derivatiPUC e derivati ColE1ColE1 500-700 500-700

pACYC e derivati pACYC e derivati p15Ap15A 10-12 10-12

pSC101 e derivatipSC101 e derivati pSC10 pSC10 1 -5 1 -5

Controllo del numero di copieControllo del numero di copie

I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazioneI plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidicaplasmidica

L’inizio della replicazione può essere controllata regolando:L’inizio della replicazione può essere controllata regolando:

• La disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidicoLa disponibilità del primer necessario a innescare la replicazione del DNA plasmidico• La disponibilità di proteine essenziali alla replicazioneLa disponibilità di proteine essenziali alla replicazione• La funzionalità di proteine essenziali alla replicazioneLa funzionalità di proteine essenziali alla replicazione

SPECIFICITA' D'OSPITESPECIFICITA' D'OSPITE

• Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitataa specificità d'ospite limitata ( narrow host range). Per ( narrow host range). Per esempio PBR322 o PUC18 che si replicano solo in esempio PBR322 o PUC18 che si replicano solo in E.coli. E.coli.

• Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono dicono a largo spettro d'ospitea largo spettro d'ospite (Broad host range). Per es. RK2 , è capace di (Broad host range). Per es. RK2 , è capace di replicarsi in molti batteri gram-negativi.replicarsi in molti batteri gram-negativi.

I plasmidi a largo spettro d'ospite derivano questa loro proprietà dal possesso I plasmidi a largo spettro d'ospite derivano questa loro proprietà dal possesso di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell' origine di replicazione. di alcuni geni necessari per il riconoscimento dell' origine di replicazione. Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico.Dipendono meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico.

GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’

Plasmidi con la stessa origine di replicazione (Inc) sono incompatibili tra loro.Plasmidi con la stessa origine di replicazione (Inc) sono incompatibili tra loro.

I batteri dipendono per la loro replicazione da componenti genetiche I batteri dipendono per la loro replicazione da componenti genetiche dell'ospite batterico in grado di riconoscere l'origine di replicazione e iniziare dell'ospite batterico in grado di riconoscere l'origine di replicazione e iniziare la replicazione. Per esempio i geni che codificano la DNA polimerasi, RNA la replicazione. Per esempio i geni che codificano la DNA polimerasi, RNA polimerasi- DNA dipendente, RNasi H ecc. Se in uno stesso batterio entrano polimerasi- DNA dipendente, RNasi H ecc. Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per due plasmidi con la stessa origine di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno componenti proteici comuni. Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi verrà perso. Possono invecere coesistere plasmidi con origine dei due plasmidi verrà perso. Possono invecere coesistere plasmidi con origine di replicazione diverse che appartangono a diversi gruppi di incompatibilitàdi replicazione diverse che appartangono a diversi gruppi di incompatibilità

MARCATORI SELEZIONABILIMARCATORI SELEZIONABILI

I plasmidi naturali a volte codificano per uno o pochi geni non essenziali I plasmidi naturali a volte codificano per uno o pochi geni non essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in alcune situazioni. Per esempio possono codificare per la tossine batteriche o per geni di resistenza esempio possono codificare per la tossine batteriche o per geni di resistenza agli antibiotici. In alcuni casi, tuttavia, nessun vantaggio competitivo sembra agli antibiotici. In alcuni casi, tuttavia, nessun vantaggio competitivo sembra essere associato alla presenza di geni di resistenza.essere associato alla presenza di geni di resistenza.

Tutti i vettori di clonaggio includono almeno un marcatore selezionabile. Tutti i vettori di clonaggio includono almeno un marcatore selezionabile.

Hanno lo scopo essenziale di distinguere e selezionare le molecole Hanno lo scopo essenziale di distinguere e selezionare le molecole ricombinanti. Inoltre, sotto un'appropriata pressione selettiva, stabilizzano il ricombinanti. Inoltre, sotto un'appropriata pressione selettiva, stabilizzano il plasmide plasmide

I marcatori selezionabili più utilizzati nei batteri sono i geni di resistenza agli I marcatori selezionabili più utilizzati nei batteri sono i geni di resistenza agli antibiotici. Per esempio il gene per la Beta-lattamasi codifica per un enzima antibiotici. Per esempio il gene per la Beta-lattamasi codifica per un enzima capace di idrolizzare l'anello lattamico degli antibiotici di tipo penicillinico (es. capace di idrolizzare l'anello lattamico degli antibiotici di tipo penicillinico (es. l'ampicillina). I batteri che contengono un plasmide con questo gene quindi l'ampicillina). I batteri che contengono un plasmide con questo gene quindi ( simboleggiato con Amp o Ap) possono crescere in terreni di coltura che ( simboleggiato con Amp o Ap) possono crescere in terreni di coltura che contengono l'ampicillina.contengono l'ampicillina.

SITI DI RESTRIZIONE UNICISITI DI RESTRIZIONE UNICI

Per effettuare un clonaggio molecolare é necessario avere sempre Per effettuare un clonaggio molecolare é necessario avere sempre almeno un sito di riconoscimento per una endonucleasi di almeno un sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione. restrizione.

Il sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione deve Il sito di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione deve essere presente nel vettore una volta sola per non distruggere essere presente nel vettore una volta sola per non distruggere l'integrità fisica del plasmide e non deve essere presente in l'integrità fisica del plasmide e non deve essere presente in regioni cis essenziali (es. ori o promotori) o in geni che codificano regioni cis essenziali (es. ori o promotori) o in geni che codificano per funzioni essenziali (es. geni di resistenza).per funzioni essenziali (es. geni di resistenza).

TIPI DI PLASMIDITIPI DI PLASMIDI

• PLASMIDI FPLASMIDI F• PLASMIDI RPLASMIDI R• PLASMIDI DEGRADATIVIPLASMIDI DEGRADATIVI• PLASMIDI CRIPTICIPLASMIDI CRIPTICI• PLASMIDI DI GRUPPO DI INCOMPATIBILITA’PLASMIDI DI GRUPPO DI INCOMPATIBILITA’• PLASMIDI A CAMPO DI OSPITI RISTRETTO E PLASMIDI A CAMPO DI OSPITI RISTRETTO E

LARGOLARGO• PLASMIDI INGEGNERIZZATI PLASMIDI INGEGNERIZZATI

GENETICAMENTEGENETICAMENTE

Plasmide superavvolto (supercoiled)

Plasmide circolare rilassato

Plasmide linearizzato

nick

Nell'ospite batterico i plasmidi si presentano come molecole circolari superavvolte, che, durante le manipolazioni sperimentali, possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.

I plasmidi possono essere lineari o integrati nel cromosoma batterico (episomi) ma, nella maggior parte dei casi , sono molecole di DNA circolari

COME SI PRESENTANO I PLASMIDI?

Plasmide:forma rilassataforma lineareforma superavvolata

forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico)

GEL DI AGAROSIO E BROMURO DI ETIDIO:Le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte.

PLASMIDE pBR322PLASMIDE pBR322CONTIENE SEGMENTI DI DNA CHE DERIVANO DA TRE PLASMIDI PRESENTI INCONTIENE SEGMENTI DI DNA CHE DERIVANO DA TRE PLASMIDI PRESENTI INNATURA IN CEPPI DI NATURA IN CEPPI DI E. coliE. coli

• Amp Amp R R -------------------- PLASMIDE R1 -------------------- PLASMIDE R1• Tet Tet RR ----------------------- PLASMIDE R1 ----------------------- PLASMIDE R1• ORIORI ------------------------- pMB1 (Col E1) ------------------------- pMB1 (Col E1)

• SITI UNICI DI RESTRIZIONESITI UNICI DI RESTRIZIONE

• ELEVATO NUMERO DI COPIEELEVATO NUMERO DI COPIE

CLONAZIONE DI DNA ESTRANEO IN UN VETTORE PLASMIDICOCLONAZIONE DI DNA ESTRANEO IN UN VETTORE PLASMIDICO

FOSFATASI ALCALINAFOSFATASI ALCALINA• ENZIMA CHE RIMUOVE I GRUPPI FOSFATO ENZIMA CHE RIMUOVE I GRUPPI FOSFATO

5’ DAL DNA PLASMIDICO RESO LINEARE 5’ DAL DNA PLASMIDICO RESO LINEARE (DEFOSFORILAZIONE)(DEFOSFORILAZIONE)

DNA LIAGASI T4DNA LIAGASI T4• DNA-LIGASI DERIVATA DAL DNA-LIGASI DERIVATA DAL

BATTERIOFAGO T4. FORMA LEGAMI BATTERIOFAGO T4. FORMA LEGAMI FOSFODIESTERI CONGIUNGENDO I GRUPPI FOSFODIESTERI CONGIUNGENDO I GRUPPI FOSFATO 5’ E OSSIDRILE 3’ DI MOLECOLE FOSFATO 5’ E OSSIDRILE 3’ DI MOLECOLE

DI DNA ADIACENTI.DI DNA ADIACENTI.• RICHIEDE ATPRICHIEDE ATP

TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONE

PROCESSO CON IL QUALE SI INTRODUCE DNA PROCESSO CON IL QUALE SI INTRODUCE DNA PURIFICATO IN UNA CELLULA BATTERICAPURIFICATO IN UNA CELLULA BATTERICA

• TRATTAMENTO PRELIMINARE DI TRATTAMENTO PRELIMINARE DI E. coliE. coli CON CON CLORURO DI CALCIO (CaCL2)CLORURO DI CALCIO (CaCL2)

• CARATTERISTICHE DELLA CELLULA OSPITE:CARATTERISTICHE DELLA CELLULA OSPITE:A)A) PRIVE DI GENI PER GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (Per PRIVE DI GENI PER GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE (Per

evitare la degradazione del clone)evitare la degradazione del clone)B)B) NEGATIVE ALLA RICOMBINAZIONE (RecA-) (Per NEGATIVE ALLA RICOMBINAZIONE (RecA-) (Per

evitare che il DNA inserto venga alterato)evitare che il DNA inserto venga alterato)

SELEZIONE E SCREENING DI SELEZIONE E SCREENING DI MOLECOLE RICOMBINANTIMOLECOLE RICOMBINANTI

ES.ES. SISTEMA pBR322 RECANTE UN DNA BERSAGLIO INSERITO SISTEMA pBR322 RECANTE UN DNA BERSAGLIO INSERITO IN UN SITO IN UN SITO BamHI BamHI

(SISTEMA SENSIBILE ALLA TETRACICLINA)(SISTEMA SENSIBILE ALLA TETRACICLINA)

I TAPPAI TAPPAPIASTRATURA DELLE CELLULE CONTENENTI LA MISCELA DI PIASTRATURA DELLE CELLULE CONTENENTI LA MISCELA DI

TRASFORMAZIONE SU MEZZO CON TRASFORMAZIONE SU MEZZO CON AMPICILLINAAMPICILLINA

CRESCITACRESCITALB/AMPLB/AMP

• CELLULE + pBR322 INTATTO SI

• CELLULE + pBR322-DNA CLONATO SI

• CELLULE NON TRASFORMATE NO

SELEZIONE E SCREENING DI SELEZIONE E SCREENING DI MOLECOLE RICOMBINANTIMOLECOLE RICOMBINANTI

II TAPPAII TAPPACELLULE CHE CRESCONO NEL MEZZO CON AMPICILLINA CELLULE CHE CRESCONO NEL MEZZO CON AMPICILLINA VENGONO TRASFERITE IN UN MEZZO CON VENGONO TRASFERITE IN UN MEZZO CON TETRACICLINATETRACICLINA

CRESCITACRESCITALB/TETLB/TET

• CELLULE + pBR322 INTATTO CELLULE + pBR322 INTATTO SISI

• CELLULE + pBR322-DNA CLONATO CELLULE + pBR322-DNA CLONATO NONO

Make a replica plate of original Amp plate and transfer to Tet. • plasmids with insert will not grow on Tet (will be TetS)

Colonies of AmpR E.coli

Master PlateAmpicillin in media

Replica PlateTetracycline in media

Colonies missing on Tet plate

Go back to master plate and pick coloniesthat were missing on Tet plate. These willbe transformed E. coli with insert of interest.

ALTRO VETTORE DI CLONAZIONE PLASMIDICO: pUC19ALTRO VETTORE DI CLONAZIONE PLASMIDICO: pUC19

INCORPORATA NELINCORPORATA NELGENE lacZ’GENE lacZ’

• GENE GENE lacZ’:lacZ’: GENE PER LA GENE PER LA bb-GALATTOSIDASI -GALATTOSIDASI DELL’OPERONE PER IL LATTOSIO DI DELL’OPERONE PER IL LATTOSIO DI E. coliE. coli

• GENE GENE lacIlacI: PRODUCE UN REPRESSORE CHE REGOLA : PRODUCE UN REPRESSORE CHE REGOLA L’ESPRESSIONE DEL GENE lacZ’.L’ESPRESSIONE DEL GENE lacZ’.

PROCEDIMENTO DI SELEZIONE DI pUC19PROCEDIMENTO DI SELEZIONE DI pUC19

PIASTRATURA DELLE CELLULE OSPITI SU UN MEZZO PIASTRATURA DELLE CELLULE OSPITI SU UN MEZZO (LB) CONTENENTE (LB) CONTENENTE AMPICILLINA, IPTG E X-GalAMPICILLINA, IPTG E X-Gal

1.1. CRESCITA IN PRESENZA DI IPTG (ISOPROPIL-BETA-D-CRESCITA IN PRESENZA DI IPTG (ISOPROPIL-BETA-D-TIOGALATTOPIRANOSIDE)TIOGALATTOPIRANOSIDE)

INDUTTORE DELL’OPERONE lac------- IL REPRESSORE INDUTTORE DELL’OPERONE lac------- IL REPRESSORE PRODOTTO DA lacI NON SI LEGA ALL’OPERATORE DI lacZ’------ PRODOTTO DA lacI NON SI LEGA ALL’OPERATORE DI lacZ’------ TRASCRIZIONE DI lacZ’------TRASCRIZIONE DI lacZ’------BETA-GALATTOSIDASI ATTIVABETA-GALATTOSIDASI ATTIVA

2.2. PRESENZA DI X-Gal SUBSTRATO (5-BROMO-4-CLORO-3-PRESENZA DI X-Gal SUBSTRATO (5-BROMO-4-CLORO-3-INDOLIL-BETA.D-GALATTOPIRANOSIDE)INDOLIL-BETA.D-GALATTOPIRANOSIDE)

L’X-Gal VIENE IDROLIZZATO DALLA BETA-GALATTOSIDASI IN L’X-Gal VIENE IDROLIZZATO DALLA BETA-GALATTOSIDASI IN UN PRODOTTO DI COLORE BLU.UN PRODOTTO DI COLORE BLU.

SELEZIONESELEZIONE

1.1. CELLULE + pUC19 INTATTO:CELLULE + pUC19 INTATTO:

CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BLUCRESCONO IN AMP -------- COLONIE BLU

2. CELLULE + pUC19-DNA CLONATO:2. CELLULE + pUC19-DNA CLONATO:

CRESCONO IN AMP -------- COLONIE BIANCHECRESCONO IN AMP -------- COLONIE BIANCHE

3. CELLULE NON TRASFORMATE:3. CELLULE NON TRASFORMATE:

NON CRESCONO IN PRESENZA DI AMP.NON CRESCONO IN PRESENZA DI AMP.

Identifying TransformantsIdentifying Transformants

whitewhiteBlueBlue

pUC Vector

Ampicillin media

Ampicillin +IPTG+ X-Gal media

Allows for selection and screeningon one plate. No need for replica platingPick white colonies on Amp, IPTG and X-gal

Select for White colonies on Ampicillin (AmpSelect for White colonies on Ampicillin (AmpRR) ) and X-gal plates (LacZand X-gal plates (LacZ--))

EVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIOEVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIO

Da questi due vettori di clonaggio sono derivati decine di Da questi due vettori di clonaggio sono derivati decine di nuovi altri vettori. La tendenza é quella di creare vettori nuovi altri vettori. La tendenza é quella di creare vettori più piccoli e funzionali. più piccoli e funzionali.

VANTAGGIVANTAGGI

1) 1) E' più maneggevoleE' più maneggevole.. Per esempio é più difficile Per esempio é più difficile danneggiarlo o introdurvi interruzioni a singola elica danneggiarlo o introdurvi interruzioni a singola elica durante le manipolazioni sperimentali.durante le manipolazioni sperimentali.

2) 2) E' più facile estrarloE' più facile estrarlo.. I principali metodi di separazione I principali metodi di separazione dei plasmidi dal cromosoma batterico si basano sulla dei plasmidi dal cromosoma batterico si basano sulla denaturazione degli acidi nucleici ( per es. mediante denaturazione degli acidi nucleici ( per es. mediante calore o basi diluite) e sulla loro successiva rinaturazione. calore o basi diluite) e sulla loro successiva rinaturazione. Mentre i plasmidi, di piccole dimensioni, rinaturano Mentre i plasmidi, di piccole dimensioni, rinaturano rapidamente il grosso cromosoma batterico non riesce a rapidamente il grosso cromosoma batterico non riesce a rinaturare velocemente e viene selettivamente eliminato.rinaturare velocemente e viene selettivamente eliminato.La velocità di rinaturazione plasmidica é inversamente La velocità di rinaturazione plasmidica é inversamente proporzionale alla dimensione. Quanto più piccoli sono, proporzionale alla dimensione. Quanto più piccoli sono, quindi, tanto più facile é il loro isolamento.quindi, tanto più facile é il loro isolamento.

EVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIOEVOLUZIONE DEI VETTORI DI CLONAGGIO

VANTAGGIVANTAGGI

3) 3) E' più facile introdurlo dentro un batterioE' più facile introdurlo dentro un batterio.. I metodi di "trasformazione" sono I metodi di "trasformazione" sono essenziali nella tecnologia del DNA ricombinante. esistono varie tecniche, come la essenziali nella tecnologia del DNA ricombinante. esistono varie tecniche, come la trasformazione con CaCl2 o l'elettroporazione, ma in tutti i casi trasformazione con CaCl2 o l'elettroporazione, ma in tutti i casi l'efficenza di l'efficenza di trasformazione é inversamente proporzonale alla dimensione plasmidica.trasformazione é inversamente proporzonale alla dimensione plasmidica.Un'ulteriore tendenza é quella di sostituire i siti di restrizione unici con Un'ulteriore tendenza é quella di sostituire i siti di restrizione unici con Multi cloning Multi cloning sitessites sempre più completi. Questa caratteristica (in genere) facilita il lavoro di sempre più completi. Questa caratteristica (in genere) facilita il lavoro di clonaggio permettendo di utilizzare l'enzima di restrizione più conveniente. Questo clonaggio permettendo di utilizzare l'enzima di restrizione più conveniente. Questo problema é particolarmente sentito quando si devono clonare inserti di grosse problema é particolarmente sentito quando si devono clonare inserti di grosse dimensioni in cui possono essere presenti numerosi siti di restrizione. Numerosi altri dimensioni in cui possono essere presenti numerosi siti di restrizione. Numerosi altri vettori più o meno "specializzati" sono reperibili per gli utilizzi più disparati: vettori più o meno "specializzati" sono reperibili per gli utilizzi più disparati: trascrizione in vitro, inserzioni di trasposoni, selezione di mutazioni, clonaggio di trascrizione in vitro, inserzioni di trasposoni, selezione di mutazioni, clonaggio di frammenti amplificati con PCR, vettori "shuttle" che contengono più origini di frammenti amplificati con PCR, vettori "shuttle" che contengono più origini di replicazione ecc.replicazione ecc.

Vettori per la clonazione di frammenti di Vettori per la clonazione di frammenti di DNA di grandi dimensioniDNA di grandi dimensioni

• VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO Formazione di genoteche (DNA > 10kb)Formazione di genoteche (DNA > 10kb)

• COSMIDICOSMIDIDNA clonato di 40 kbDNA clonato di 40 kb

• SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO MOLTO GRANDEMOLTO GRANDE

DNA clonato > 100 kbDNA clonato > 100 kb

VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO

• CICLO LITICO E LISOGENOCICLO LITICO E LISOGENO

• LUNGHEZZA DNA DEL BATTERIOFAGO LUNGHEZZA DNA DEL BATTERIOFAGO 50 50 kb. 20 kb INDISPENSABILI PER EVENTI DI kb. 20 kb INDISPENSABILI PER EVENTI DI INTEGRAZIONE-ESCISSIONE (I/E)INTEGRAZIONE-ESCISSIONE (I/E)

• SOSTITUZIONE DI QUESTE 20 kb CON SOSTITUZIONE DI QUESTE 20 kb CON ALTRETTANTE DI DNA CLONATOALTRETTANTE DI DNA CLONATO

• BATTERIOFAGO LAMDA “RICOMBINANTE” BATTERIOFAGO LAMDA “RICOMBINANTE” (Cicli litici obbligatori)(Cicli litici obbligatori)

I Batteriofagi

A partire dalla scoperta iniziale (intorno alla secoda decade del 900’) sono stati isolati e caratterizzati numerosi batteriofagi, ciascuno con differenze genetiche e strutturali. fago fago capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi viralibatteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi. batteriofago batteriofago ,, il fago di maggior interesse in Biologia molecolare, può utilizzare due stili di vita all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogeno

• Ciclo liticoCiclo litico: il batteriofago replica il proprio corredo genetico, si assembla in virione maturo e lisa la cellula uccidendola.• Ciclo lisogeno:Ciclo lisogeno: il fago é capace di integrare il proprio DNA nel cromosoma batterico, mantenendolo in uno stato profagico inattivo e non dannoso per l'ospite batterico .

A livello molecolare il controllo della scelta del ciclo litico o di quello lisogeno dipende dall’espressione A livello molecolare il controllo della scelta del ciclo litico o di quello lisogeno dipende dall’espressione di una serie di repressori proteici. Il repressore essenziale nel mantenimento del ciclo lisogeno è di una serie di repressori proteici. Il repressore essenziale nel mantenimento del ciclo lisogeno è cIcI. La sua. La suapresenza reprime efficacentemente l’espressione dei geni del ciclo litico. La proteina più importante perpresenza reprime efficacentemente l’espressione dei geni del ciclo litico. La proteina più importante perlo stabilirsi del ciclo litico è il prodotto del gene lo stabilirsi del ciclo litico è il prodotto del gene SS..

Geni dellacoda

Geni della

testa

attintxis

cIII

N cI cro cII O PQ

S

R

cos

att intXis

ricombinazione

cIII N cI cro cII

lisogenia

O P Q S R

coscos

geni dellatesta

geni dellacoda

replicazione DNA

geni tardivi

lisi

Lisi o Lisogenia? Lamda è un fago temperato, che può infettare una cellula di E.coli e lisarla, producendo molte particelle fagiche, oppure integrarsi nel cromosoma batterico replicandosi come parte integrante di coli senza produrre danno alcuno. La scelta tra ciclo litico e ciclo lisogeno è influenzato da diversi fattori. Una volta che la sceltaè stata effettuata è, essenzialmente irreversibile, anche se una piccola percentuale di fagi possono revertire daun ciclo all’altro.

L’espressione dei geni di si divide in fasi che portano all’espressione dei geni molto precoci, precoci, intermedi e tardivi.L’espressione dei geni precoci utilizza essenzialmente le proteine di coli e porta alla trascrizione dei geni N e cIII, a partire da PL e d cro e cII, a partire da PR.

I prodotti di cIII e cII e sono necessari all’espressione di cI, che, a sua volta reprime l’espressione della maggior parte dei geni, incluso se stesso.

N e cro, d’altra parte codificano, rispettivamente per un fattore di antiterminazione e per un repressore di cI Il prevalere dell’azione di N e cro porta alla repressione di cI, alla trascrizione dei geni intermedi e allo Il prevalere dell’azione di N e cro porta alla repressione di cI, alla trascrizione dei geni intermedi e allo stabilirsi del ciclo litico, mentre il prevalere dell’azione di cIII, cII e, quindi, cI, porta al ciclo lisogeno.stabilirsi del ciclo litico, mentre il prevalere dell’azione di cIII, cII e, quindi, cI, porta al ciclo lisogeno.

cIcI

PPLL

PPRRcIIIcIII cIIcII

TTLL

TTLLNN crocro

Aspetti applicativiAspetti applicativi

Dal punto di vista pratico inizialmente i batteriofagici hanno suscitato molto interesse per un loro possibile utilizzo contro agenti patogeni batterici. Completamente superato dall'introduzione degli antibiotici, questo possibile utilizzo dei batteriofagi come "antibiotici naturali" sta nuovamente risquotendo qualche interesse, a causa della comparsa di ceppi batterici resistenti agli antibiotici. Il principale campo di applicazione dei batteriofagi, tuttavia, consiste nello sviluppo di diversi tipi di vettori per biologia molecolaresviluppo di diversi tipi di vettori per biologia molecolare. Fra i più comuni citiamo, ovviamente, il fago , ma anche M13, T3, T7 e f1.

Packaging Packaging in vitroin vitro

Sebbene il DNA possa essere inserito in un batterio per trasformazione, la dimensione del genoma di rende questa metodica poco efficiente. Si preferisce sfruttare, in alternativa, il sistema di packaging packaging in vitroin vitro di di . In una normale infezione litica, comincia a replicarsi con la modalità del circolo rotante, producendo lunghi concatenameri. Questi vengono successivamente ridotti in frammenti lineari, delimitati dalle estremità cosestremità cos, e impacchettati all’interno di un capside vuoto. In seguito all’assemblaggio con una coda, si ricostituisce un virione maturo e infettivo. Il risultato di un’ infezione fagica consiste nella formazione di placche di lisi traslucide su uno strato di batteri a confluenza.

Mescolando il DNA da inserire, con due colture di fagi difettivi, uno incapace di introdurre il DNA nei capsidi vuoti e l’altro incapace di produrre capsidi vuoti, si riesce a produrre un packaging efficiente

A causa delle caratteristiche biologiche di , la produzione di lunghi stampi concatenati, risulta in packaging più efficienti.

I vettori derivati dal fago l

I più importanti vettori fagici sono quelli derivati dal fago l. Il DNA di l è una molecola lineare a doppio filamento di 48,5 Kb, caratterizzata dalla presenza alle estremità 5’ di due terminali coesivi a singola elica di 12 bp. Queste code a singolo filamento sono chiamte siti cos ( per cohesive ends ) e permettono la circolarizzazione del DNA di l dopo l’infezione della cellula ospite.

La mappa genetica del fago l comprende circa 40 geni che possono essere suddivisi in tre gruppi funzionali:

La parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della testa e della coda.

La parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che porta all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori.

La parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico.

Struttura generale dei vettori

La regione tra i geni J e N del genoma di , come dicevamo, non è essenziale per la crescita litica. In linea di principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14500 bp di DNA estraneo, che ricostituirebbero la lunghezza originale del genoma di . Nella testa, del fago, però, può trovare posto fino al 105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di altre regioni non essenziali che possono essere rimosse. Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA estraneo inseribile. Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di , pari a circa 37 Kb, al di sotto il DNA non viene impaccato e il non è vitale.

Esistono due tipi di vettori * I vettori d'inserzione * I vettori di sostituzione

I vettori che contengono un sito di restrizione unico (x) per l'inserzione di DNA estraneo sono chiamati vettori d'inserzionevettori d'inserzione. Questi vettori sono più facili da utilizzare e possono accettare inserti di dimensioni da 8 fino a 10-12 Kb. Sono generalmente utilizzati per costruire librerie di cDNA.

I vettori con due siti di taglio, in cui la parte centrale del DNA (frammento stuffer) può essere rimossa e sostituita con un frammento di DNA estraneo, sono chiamati vettori di sostituzione. Possono accettare inserti da 10 a 22 Kb e sono in genere utilizzati per costruire librerie genomiche.

In linea generale tutti i utilizzati come vettori sono stati estesamente modificati. In particolare sono stati creati siti di restrizione unici nella regione centrale, eliminando eventuali siti di restizione multipli mediante mutazioni sito-specifiche. I vettori derivati da inoltre sono stati ridotti in dimensione rispetto al wild type, eliminando la maggior parte delle sequenze non necessarie al ciclo litico. gt10 è un esempio di vettore d'insezione, mentre EMBL3 rappresenta un esempio di vettore di sostituzione.

digestione parziale con Sau3A

Isolamento frammentida 15 Kb

BamHI

ligazione

Packaging in vitroinfezione di E.coliscreening

sito cos sito cos

I vettori di sostituzione permettono di clonare frammenti di 15-20 kb. Si effettua una digestione genomica parziale con Sau3A e si purifica una popolazione intorno a i 15 kb. Si digerisce quindi un vettore di sostituzione con BamHI, complementare a Sau3A, e si ligano insieme i bracci destro, sinistro e la popolazione di digesti parziali di circa 15 Kb.

Clonaggio in vettori di sostituzioneClonaggio in vettori di sostituzione

packaging in vitro

Infezione diE.coli

autoradiografia

I frammenti privi di inserto e di “stuffer” sono troppo piccoli per essere impacchettatie dare particelle virali

gt10 + EcoRI

ligasi

packaging in vitro

Infezione diE.coli

Clonaggio in vettori di insezione

IL PACKAGING DEL DNA DEL BATTERIOFAGO l NELLE TESTE IL PACKAGING DEL DNA DEL BATTERIOFAGO l NELLE TESTE DURANTE IL CICLO LITICODURANTE IL CICLO LITICO

50 kb

IL SISTEMA DI CLONAZIONE BASATO SUL BATTERIOFAGO IL SISTEMA DI CLONAZIONE BASATO SUL BATTERIOFAGO ll

La selezione nei vettori fagiciLa selezione nei vettori fagici

Il problema di selezionare i cloni ricombinanti è più complesso nei fagi a causa delle dimensioni e della Il problema di selezionare i cloni ricombinanti è più complesso nei fagi a causa delle dimensioni e della ridondanza delle genoteche da cui si parte ridondanza delle genoteche da cui si parte

Dal punto di vista pratico la manipolazione e selezione dei batteriofagi ricombinanti è simile a quella Dal punto di vista pratico la manipolazione e selezione dei batteriofagi ricombinanti è simile a quella dei plasmidi. In entrambi i casi si utilizzeranno le stesse tecniche, già studiate, per manipolare il DNA. dei plasmidi. In entrambi i casi si utilizzeranno le stesse tecniche, già studiate, per manipolare il DNA. Le principali differenze risiedono Le principali differenze risiedono nell’introduzione del DNA nella cellula e nel tipo di colonie.nell’introduzione del DNA nella cellula e nel tipo di colonie.

Ricordiamo che durante un’infezione litica il DNA virale è Ricordiamo che durante un’infezione litica il DNA virale è introdotto, sotto forma di DNA lineare di circa 48.5 Kb, introdotto, sotto forma di DNA lineare di circa 48.5 Kb, all’interno della cellula batterica. Una volta all’interno all’interno della cellula batterica. Una volta all’interno della cellula, il DNA fagico ricircolarizza, sfruttando le sue della cellula, il DNA fagico ricircolarizza, sfruttando le sue estremità coesive estremità coesive cos,cos, e si replica come molecola circolare e si replica come molecola circolare con una replicazione di tipo Teta, simile a quella batterica. con una replicazione di tipo Teta, simile a quella batterica. Da un certo momento in poi, lambda comincia a repilcarsi Da un certo momento in poi, lambda comincia a repilcarsi con una modalità di tipo “rolling circle, cominciando a con una modalità di tipo “rolling circle, cominciando a formare lunghi concatenameri di singoli genomi fagici. formare lunghi concatenameri di singoli genomi fagici. Contemporaneamente si esprimono i geni strutturali che Contemporaneamente si esprimono i geni strutturali che assemblano delle teste “vuote”, dove vengono inseriti assemblano delle teste “vuote”, dove vengono inseriti singolesingoleunità di lambda ( un DNA di 48.5 Kb definito da due siti unità di lambda ( un DNA di 48.5 Kb definito da due siti cos). Infine viene assemblata la coda e i fagi lisano Il cos). Infine viene assemblata la coda e i fagi lisano Il batterio e fuoriescono.batterio e fuoriescono.

Il packaging in vitro sfrutta l’esistenza di fagi mutanti, che producono teste fagiche vuote, in quanto mancanti di una proteina necessaria per il packaging, e di fagi capaci di effettuare il packaging ma incapaci di produrre le teste. Mescolando in provetta queste due popolazioni fagiche insieme al nostro DNA, avremo un’efficiente packaging in vitro. I fagi ricombinanti saranno quindi utilizzati perInfettare una popolazione di batteri sensibili ai fagi in soft agar. Il risultato sarà la produzione di placche di lisi, apparentemnte simili a colonie batteriche.

Anche nel caso dei vettori fagici il Anche nel caso dei vettori fagici il primo problemaprimo problema è quello di selezionare i fagi ricombinanti che è quello di selezionare i fagi ricombinanti che contengono un inserto clonato da quelli che contengono vettori senza inserto.contengono un inserto clonato da quelli che contengono vettori senza inserto.

** Nel caso dei Nel caso dei vettori di sostituzione,vettori di sostituzione, come ad esempio EMBL3, i fagi ricombinanti sono come ad esempio EMBL3, i fagi ricombinanti sono automaticamente selezionati. La ligazione dei bracci destro e sinistro, infatti, ricostituisce un DNA automaticamente selezionati. La ligazione dei bracci destro e sinistro, infatti, ricostituisce un DNA fagico le cui dimensioni sono inferiori al fatidico 75% del genoma virale necessario per fagico le cui dimensioni sono inferiori al fatidico 75% del genoma virale necessario per l'impacchettamento del DNA in un capside. Solamente i fagi ricombinanti contenenti un inserto di l'impacchettamento del DNA in un capside. Solamente i fagi ricombinanti contenenti un inserto di dimensioni adeguate, potranno quindi ricostituire la dimensione sufficiente per poter essere dimensioni adeguate, potranno quindi ricostituire la dimensione sufficiente per poter essere inpacchettati nel capside ed essere vitali.inpacchettati nel capside ed essere vitali. ** Nel caso dei Nel caso dei vettori di inserzionevettori di inserzione sono utilizzate diverse strategie. sono utilizzate diverse strategie.

In molti casi, ad esempio nei Lambda Zap, viene utilizzata la selezione bianco/blu già descritta per i In molti casi, ad esempio nei Lambda Zap, viene utilizzata la selezione bianco/blu già descritta per i vettori plasmidici, in cui l'inserto da clonare è posizionato all'interno del gene per la vettori plasmidici, in cui l'inserto da clonare è posizionato all'interno del gene per la -galattosidasi -galattosidasi interrompendone l'integrità strutturale. In presenza di un interrompendone l'integrità strutturale. In presenza di un -galattoside cromogenico, come l'X-gal, le -galattoside cromogenico, come l'X-gal, le placche ricombinanti appariranno bianche, quelle prodotte fagi conteneti da vettori senza inserto placche ricombinanti appariranno bianche, quelle prodotte fagi conteneti da vettori senza inserto appariranno blu. appariranno blu.

La selezione nei vettori fagiciLa selezione nei vettori fagici

Lambda gt10 è un altro esempio di inattivazione inserzionale. Il sito EcoRI è posizionato in mezzo al Lambda gt10 è un altro esempio di inattivazione inserzionale. Il sito EcoRI è posizionato in mezzo al gene cI. Un inserzione al suo interno, dunque distruggerà l’integrità strutturale del repressore e il fago gene cI. Un inserzione al suo interno, dunque distruggerà l’integrità strutturale del repressore e il fago non sarà più in grado di entrare nel ciclo lisogeno. Quindi i faghi senza inserzioni avranno colonie non sarà più in grado di entrare nel ciclo lisogeno. Quindi i faghi senza inserzioni avranno colonie torbide ( miscela di fagi lisogeni e litici) mentre i fagi con l’inserzione daranno placche chiare (placche torbide ( miscela di fagi lisogeni e litici) mentre i fagi con l’inserzione daranno placche chiare (placche litiche). La distinzione può essere resa ancora più evidente usando litiche). La distinzione può essere resa ancora più evidente usando E.coliE.coli recanti la mutazione recanti la mutazione hfl hfl ( high frequency of lisogeny), in cui tutti fagi conteneti il solo vettorie non produrranno affatto placche.( high frequency of lisogeny), in cui tutti fagi conteneti il solo vettorie non produrranno affatto placche.

I COSMIDII COSMIDI

• 40 kb DI DNA CLONATO40 kb DI DNA CLONATO

• MANTENUTI SOTTO FORMA DI MANTENUTI SOTTO FORMA DI PLASMIDI IN PLASMIDI IN E. coliE. coli

• PROPRIETA’ DEI PLASMIDI E DI PROPRIETA’ DEI PLASMIDI E DI VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO VETTORI BASATI SUL BATTERIOFAGO LAMBDALAMBDA

I COSMIDII COSMIDI

DUPLICE VANTAGGIODUPLICE VANTAGGIO

1.1. GRUPPI DI GENI E GENI GRANDI GRUPPI DI GENI E GENI GRANDI VENGONO CLONATI PIU’ VENGONO CLONATI PIU’ FACILMENTEFACILMENTE

2.2. SCREENING DI UN NUMERO MINORE SCREENING DI UN NUMERO MINORE DI CLONI AI FINI DELLA CREAZIONE DI CLONI AI FINI DELLA CREAZIONE DI UNA GENOTECADI UNA GENOTECA

CosmidiCosmidi

Permettono di inserire DNA fino a 45 Kb. Un cosmide è semplicemente un plasmide, di solito intorno alle 5 Kb, contenente, un sito cos. Come tutti i vettori plasmidici contiene una ori, un marcatore di resistenza e siti unici di restrizione e si utilizza nello stesso modo. Invece di trasformare la miscela di ligazione per trasformazione, processo che sarebbe piuttosto inefficiente, vista la dimensione media di un cosmide, si può utilizzare un packaging in vitro. Il cosmide infatti possiede un sito cos è può essere considerato un buon substrato per una reazione di packaging, purchè abbia dimensione comprese tra 37 e 51 Kb. Considerando la dimensione media di un vettore cosmidico, la dimensione di un inserto che può essere clonato in un cosmide varierà tra 32 e 45Kb.

UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICOUN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO

pLFR-5

UN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICOUN SISTEMA DI CLONAZIONE COSMIDICO

SELEZIONE INSELEZIONE INPRESENZA DIPRESENZA DI TETRACICLINATETRACICLINA

SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A SISTEMI DI VETTORI BATTERICI A INSERTO MOLTO GRANDE (>100kb)INSERTO MOLTO GRANDE (>100kb)

• FACILITANO L’ANALISI DEI GENOMI FACILITANO L’ANALISI DEI GENOMI EUCARIOTICI COMPLESSIEUCARIOTICI COMPLESSI

• INDISPENSABILI PER:INDISPENSABILI PER:- MAPPATURA GENOMA UMANOMAPPATURA GENOMA UMANO- SCOPERTA DI GENI UMANISCOPERTA DI GENI UMANIESEMPIO:ESEMPIO:CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI CROMOSOMI ARTIFICIALI BATTERICI

(BAC): COSTRUTTI VETTORE-(BAC): COSTRUTTI VETTORE-INSERTO BASATI SUL PLASMIDE FINSERTO BASATI SUL PLASMIDE F

Svariate strategie di trasferimento genico sono state evolute in diversi organismi e sono rimaste le tracce di antichi trasferimenti genici. I batteri, per esempio, sono in grado di trasferire materiale genetico da batterio a batterio, mediante coniugazione; i virus infettando cellule suscettibili di vari organismi; i batteri del suolo del genere Agrobacterium riescono a trasferire e integrare stabilmente in cellule vegetali porzioni del loro genoma.

Trasformazione di cellule procariotiche ed eucarioticheTrasformazione di cellule procariotiche ed eucariotiche

Un aspetto importante di tutte le tecniche di ingegneria genetica è rappresentato Dalla introduzione del DNA ricombinante in una cellula ospite capace di replicarlo.

La capacità di trasferire geni da un organismo ad un altro è alla base di tutte le tecni-che di ingegneria genetica. L’efficienza di questo passaggio è cruciale per garantire il successo di qualunque clonaggio

Recenti progressi nelle tecniche di trasferimento genico permettono oggi di trasferire ad alta efficenza, e in modo controllato materiale genico in altri organismi. L’introduzione di materiale genetico eterologo, cioè proveniente da un altro organismo, in una cellula viene generalmente definita trasformazione. Bisogna tener conto, tuttavia, che il termine “trasformazione” è piuttosto generico, indicando, per esempio anche la trasformazione di cellule normali in cellule tumorali.

Generalmente per “trasformazione” s’intende il trasferimento di DNA in cellule batteriche, mentre per “trasfezione” il trasferimento genico mediato da batteriofagi ovirus.

Per le cellule animali il termine “trasformazione” indica il passaggio da cellula normale a cellula tumorale, mentre l’introduzione di DNA eterologo nella cellula si definisce “ trasformazione mediata da DNA” o, più frequentemente “trasfezione”.

Tipi di trasferimento genico

DNAplasmidico

ElettroporazioneCaCl2

ConiugazioneTrasformazione

Cellula batterica

Cellula animale

DNA

PEGElettroporazione DEAE-destranoCaPO4

virus

Cellula vegetale

Elettroporazionecannoncino balisticoAgrobacterium

protoplasto

Elettroporazionefusione di protoplasti

Trasfezione

BatteriElettroporazionetrasformazione chimica con CaCl2

coniugazione batterica

Pianteelettroporazionetrasferimento mediato da Agrobacteriumcannoncino balisticofusione di protoplasti

LievitiPEGElettroporazione DEAE-destrano

Principali metodi di trasferimento genicoPrincipali metodi di trasferimento genico

ProtoplastiElettroporazionefusione di protoplasti

Cellule animaliPEGElettroporazione DEAE-destranoCaPO4

TRASFORMAZIONE GENETICA NEI PROCARIOTI

• TRASFERIMENTO DI DNA IN E. coli (TRASFORMAZIONE)– CaCl2 ICE-COLD– HEAT SHOCK 90S, 42 °C– EFFICIENZA: 107-108/g DNA

• PERMEABILIZZAZIONE DELLA MEMBRANA MEDIATA DA CAMPO ELETTRICO– E. coli: - 25 microfarad - 2,5 kilovolts - 200 ohm - 4,6 millisecondi Efficienza: 109/g DNA

• CONIUGAZIONE

A. CaCl2 method (fresh cells)

1. Dilute overnight LB culture 1:1000 into 100 ml of fresh LB broth at 37° C

2.Collect cells at O.D.A600=0.4-0.5 (It may vary depending on the strains) and

sediment at 4.000 x g (=5000 rpm with A4 rotor * ) for 5’ at 4°C

3. Wash cells in about half the volume ( 50 ml ) of cold 0.1 M CaCl2

4. . Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently in about 1/4 thevolume ( 25 ml ) of cold 0.1 M CaCl2

5. Sediment cells at 3.0000 xg for 5’ and resuspend very gently in 4 ml ) of cold 0.1 M CaCl2. Stand on ice for at least 30’.

6. Add DNA in a volume as little as possible (up to 0.1 ml) to a 200 µl aliquot ofcompetent cells and incubate on ice from 1 hour to all day

7. Heat shock for 90’’ at 42°C. (important!)

8. Add 0,8 ml of LB without drugs and incubate without shaking for 1 hour

9. Plate on selective media by spreading.

Protocollo di trasformazione con cellule calcio-competentiProtocollo di trasformazione con cellule calcio-competenti

Plasmidi coniugativi e non coniugativi

I plasmidi possono essere classificati in due gruppi; plasmidi coniugativi e non coniuga-tivi in relazione alla loro capacità di trasferire materiale genetico tra batteri mediante la coniugazione batterica. In generale, sono i plasmidi di grosse dimensione ad essereconiugativi, mentre la maggior parte dei piccoli vettori usati in ingegneria genetica, non lo sono. Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:

• Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)• I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus mob (mobilizzazione)

Plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili; tuttavia se un plasmidepossiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando appositi batterihelper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti.

CONIUGAZIONE BATTERICA

La coniugazione batterica è un processo di trasferimento genetico tramite il contatto tra due cellule. Il materiale trasferito può essere un plasmide o una porzione di cromosoma mobilizzato da un plasmide F.

CONIUGAZIONE BATTERICACONIUGAZIONE BATTERICA

La maggior parte dei plasmidi utilizzati nella La maggior parte dei plasmidi utilizzati nella ricerca è priva di funzioni coniugative, sicchè ricerca è priva di funzioni coniugative, sicchè il DNA di questi plasmidi non può essere il DNA di questi plasmidi non può essere trasmesso alle cellule riceventi per trasmesso alle cellule riceventi per coniugazione.coniugazione.

Introducendo un plasmide con funzioni Introducendo un plasmide con funzioni coniugative in una cellula batterica già in coniugative in una cellula batterica già in possesso di un vettore plasmidico possesso di un vettore plasmidico mobilizzabile, si può trasferire il suddetto mobilizzabile, si può trasferire il suddetto vettore a una cellula ricevente.vettore a una cellula ricevente.

MESCOLAMENTO DI 3 CEPPI

• A: plasmide mobilizzabile A: plasmide mobilizzabile coniugativoconiugativo

• B: vettore di clonazione B: vettore di clonazione mobilizzabile non mobilizzabile non coniugativo (di interesse)coniugativo (di interesse)

• C: cellula ricevente C: cellula ricevente bersagliobersaglio

A

B C

ESEMPIO DI SELEZIONEESEMPIO DI SELEZIONE

• Ceppo A:Ceppo A: non può crescere su mezzo non può crescere su mezzo minimo, AMP sensibileminimo, AMP sensibile

• Ceppo B:Ceppo B: non può crescere su mezzo non può crescere su mezzo minimo, AMP resistenteminimo, AMP resistente

• Ceppo C:Ceppo C: cresce su mezzo minimo, cresce su mezzo minimo, AMP sensibileAMP sensibile

Avvenute le coniugazioni….

Crescita delle cellule per breve tempo su mezzo ricco senza AMP

Trasferimento delle cellule su mezzo minimo con AMP

Quali cellule potranno crescere in tali

condizioni

……. CELLULE BERSAGLIO CHE HANNO . CELLULE BERSAGLIO CHE HANNO ACQUISTATO IL VETTORE DI ACQUISTATO IL VETTORE DI CLONAZIONE PLASMIDICO!CLONAZIONE PLASMIDICO!