嘉南藥理科技大學 化妝品科技研究所...
TRANSCRIPT
嘉南藥理科技大學
化妝品科技研究所
碩士論文
以離子對層析法測定化粧品中七種美白劑成分
Determination of Seven Whitening Agents in Cosmetics
by Ion-pair Liquid Chromatographic Method
指 導 教 授 : 林 維 炤 博士
研 究 生 : 何 妍 慧
中華民國 一百零二年 七月 三十一日
嘉南藥理科技大學化妝品科技研究所
Department of Cosmetic Science
Chia-Nan University of Pharmacy and Science
碩士論文
Thesis for the Degree of Master
以離子對層析法測定化粧品中七種美白劑成分
Determination of Seven Whitening Agents in Cosmetics by
Ion-pair Liquid Chromatographic Method
指 導 教 授 : 林 維 炤 博士 ( Dr. Wei-Chao Lin )
研 究 生 : 何 妍 慧 ( Yan-Hui He )
中華民國 一百零二年 七月 三十一日
31, July 2013
1
摘要
本研究主要目的同時且快速分離七種美白劑，以離子對層析法
(IPC)層析方式進行測定，探討維生素 C 及其三種衍生物、熊果素、
對苯二酚、麴酸在不同 pH 值緩衝溶液、有機溶媒修飾劑的體積、離
子對試劑等影響分離參數，以找出最佳分離條件，選擇最適合的層析
方法進行實驗。以 C18 管柱做為靜相，線性方程式相關系數(R2)均在
0.999 以上。樣品回收率 97.61-104.78％。並評估七種美白劑溶解在不
同 pH 值溶劑下的安定性。
關鍵字:離子對高效液相層析法、維生素 C 及其三種衍生物、熊果素、
對苯二酚、麴酸
2
Abstract
The purpose of this study is to separate simultaneously seven water
soluble whiten agents by ion pair chromatographic method. These
components include ascorbic acid and its three derivative; arbutin,
hydroquinone and kojic acid. The parameters of IPC for separation, such
as pH value of buffer, organic modifier composition and ion pair reagent
concentration, were studied in this research. The results showed these
seven compounds could be well separated under optimum condition by
using C18 column as stationary phase. The regression coefficient of all
compounds calibration curve are larger than 0.999.
The stability of these components in water of different pH values
were also investigated. This method is applied for determination of these
compounds in lotions by simple dilution. Recoveries of the six analytes
were between 97.61-104.78%.
Key words: Ion-pair Liquid chromatographic method, ascorbic acid and its three derivative, arbutin, hydroquinone , kojic acid.
3
致謝
而今論文完成，首先要感謝我的恩師林維炤 教授在四年前給了
我進 C229 實驗室學習機會，且耐心帶領與指導，不論是在課業上或
是做人處事上，都讓我受益非淺。對於老師的感謝，永銘於心。
感謝口試委員成功大學化學系桂椿雄 教授及嘉南藥理科大藥學
系 劉國盛 教授在百忙之中詳加批閱並提供寶貴意見，始論文內容更
加充實完善由衷致上謝意。
在學習期間感謝詩欣、玳汝、虹潔學姐在我遇到困難的時候鼓勵
我，讓我更有勇氣去克服難題。謝謝實驗室同學怡霈、懿君及學弟妹
培鎂、宗儒、宛琪、雅琳、睿智、匯穎、芷溎、余柔、昆謙、妍玲，
總是給我莫大的協助。也讓我的研究生生活多采多姿，有你們真好。
最後，感謝我最愛的家人，謝謝你們從小到大無微不至的照顧，
無條件付出，因為有你們的關心與支持，讓我不斷有動力前進並能專
心於課業上。再一次，對這一路陪伴我的人、幫助過我的人，致上最
深的謝意。
4
目錄
摘要 ......................................................................................................... 1
Abstract ................................................................................................... 2
致謝 ......................................................................................................... 3
目錄 ......................................................................................................... 4
表目錄 ..................................................................................................... 7
圖目錄 ..................................................................................................... 7
第一章 緒論 ........................................................................................... 9
1-1 前言 ................................................................................................... 9
1-2 研究動機與目的 ............................................................................. 10
1-3 研究架構 ......................................................................................... 11
第二章 文獻回顧 ................................................................................. 13
2-1 皮膚構造 ......................................................................................... 13
2-1.1 黑色素細胞 .................................................................................. 14
2-1.2 黑色素生成機轉 .......................................................................... 14
2-2 美白劑在化妝品中使用限量 .......................................................... 18
2-3 美白劑介紹 ..................................................................................... 19
2-4 美白劑相關之研究 ......................................................................... 24
5
第三章 實驗材料與方法 ...................................................................... 33
3-1 實驗材料 ......................................................................................... 33
3-2 儀器設備 ......................................................................................... 35
3-3 研究方法 ......................................................................................... 36
3-3.1 波長選擇 ...................................................................................... 36
3-3.2 離子對試劑濃度的選擇 ............................................................... 36
3-3.3 探討不同有機修飾劑比例 ........................................................... 37
3-3.4 探討不同緩衝溶液 pH 值 ............................................................ 37
3-4 標準品溶液及檢量線配製 .............................................................. 38
3-5 自製、市售樣品前處理及添加方法 .............................................. 38
3-6 安定性評估 ..................................................................................... 41
3-7 精密度與準確度 ............................................................................. 43
3-8 偵測極限(LOD)及定量極限(LOQ) ................................................ 43
第四章 結果與討論 ............................................................................. 44
4-1 七種美白劑紫外線吸收波長探討 .................................................. 44
4-2 七種美白劑穩定性評估 ................................................................. 46
4-3 不同濃度 TBAH 離子對試劑影響各美白劑層析結果之探討 ...... 48
4-4 不同比例有機修溶劑影響各美白劑層析結果之探討 ................... 51
6
4-5 不同 pH 值緩衝溶液影響七種美白劑層析結果之探討 ................ 55
4-6 檢量線建立 ..................................................................................... 58
4-7 偵測極限(LOD) 及定量極限(LOQ) .............................................. 60
4-8 精密度與準確度 ............................................................................. 61
4-8.1 自製樣品含量測試及添加回收率 ............................................... 61
4-8.2 自製樣品安定性評估 .................................................................. 61
4-8.3 異日間分析(Inter-day)、同日間分析 (Intra-day) ....................... 63
4-8.4 市售樣品測定 .............................................................................. 63
第五章 結論 ......................................................................................... 69
參考文獻 ............................................................................................... 70
7
表目錄
表 2-1 衛生福利部公告美白劑 ............................................................. 18
表 2-2 七種美白劑之理化性質 ............................................................. 22
表 2-3HPLC 美白劑分析方法文獻整理 ............................................... 29
表 3-1 實驗使用藥品及溶劑................................................................. 33
表 3-2 實驗使用儀器及管柱................................................................. 35
表 3-3 市售樣品 .................................................................................... 40
表 3-4 自製乳液配方 ............................................................................ 41
表 3-5 自製精華液配方 ........................................................................ 42
表 4-1 七種美白劑，最大吸收波峰 ..................................................... 44
表 4-2 七種美白劑之檢量線參數 ......................................................... 59
表 4-3 偵測極限、定量極限................................................................. 60
表 4-4 自製精華液、乳液含量測試及添加回收率.............................. 65
表 4-5 自製精華液、乳液安定性 ......................................................... 66
表 4-6 同日分析及異日分析 CV％值 .................................................. 67
表 4-7 市售樣品含量測定 .................................................................... 68
8
圖目錄
圖 1-1 研究架構流程圖 ........................................................................ 12
圖 2-1 皮膚表皮構造圖 ........................................................................ 13
圖 4-1(a)維生素 C(b)維生素 C 磷酸鎂鹽(c)維生素 C 醣苷(d)3-氧-乙基
維生素 C(e)熊果素(f)對苯二酚(g)麴酸 (20μg/ml) 溶於二次水之 UV
吸收圖譜。 ........................................................................................... 45
圖 4-2 七種美白劑在移動相溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性 .................. 46
圖 4-3 七種美白劑在 pH2.5 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性 ......... 47
圖 4-4 七種美白劑在 pH5 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性 ............ 47
圖 4-5 七種美白劑在 pH7 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性 ............ 47
圖 4-6 添加不同離子對試劑濃度(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 ..... 49
圖 4-7 添加不同離子對試劑濃度之層析圖譜 ..................................... 50
圖 4-8 添加不同比例有機修飾劑(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 ..... 52
圖 4-9 添加不同有機修飾劑(Methanol)比例層析圖 ............................ 54
圖 4-10 不同 pH 值緩衝溶液(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 ............ 56
圖 4-11 不同 pH 值緩衝溶液層析圖 .................................................... 57
圖 4-12 七種美白劑標準溶液(均為 100 μg/mL)之層析圖 .................. 59
圖 4-13 自製精華液層析圖 .................................................................. 62
圖 4-14 自製乳液層析圖 ...................................................................... 62
9
第一章 緒論
1-1 前言
現代生活環境汙染物劇增，導致臭氧層遭到嚴重破壞，日曬後加
速皮膚氧化表皮層下黑色素沉澱。因此美白的課題格外引人注意，相
對美白化妝品也成為化妝保養品的主力。
市面上美白保養品玲瑯滿目，可添加美白劑非常多種不管是油溶
性或水溶性。而這些產品有時不只添加一種美白劑，為了增加美白效
果會同時添加兩三種美白劑甚至更多。
但各種美白劑皆有負面效果，如熊果素為對苯二酚之醣化衍生物，
使用濃度太高容易游離出對苯二酚，但對黑色素形成並無抑制作用且
會導致皮膚免疫力下降，或者直接添加禁用美白成分-對苯二酚破壞
黑色素細胞達到快速美白效果，長期使用下對人體健康都有所影響。
本研究所挑選的美白劑是現今最常添加於美白化粧品中六種水
溶性美白劑-維生素 C 及其衍生物、熊果素、麴酸及一種法規禁用美
白劑-對苯二酚，針對以上七種化合物進行分析方法建立。
10
1-2 研究動機與目的
近幾年來因應國際管理之潮流趨勢，美白化粧品原本列為含藥化
粧品管理，添加量只要未超過法規限量就可歸於一般化粧品無須申請，
但是消費者安全還是需要把關。
現今有不少分析方法運用在美白劑定量及定性，以薄層層析[1,2]、
高效能液相層析、氣相層析[3]、分光光度法[4,5]、微胞電動層析[6,7]
等。其中以高效能液相層析法為最主要檢測方法，但有些方法須要使
用到非常大量的有機修飾劑、分析時間慢長、樣品前處理繁瑣，所以
對於如何改善這些方法缺點是很值得探討。
因此本研究開發一個較低汙染、簡便、準確且能同時分離維生素
C、維生素 C 醣苷、維他命 C 磷酸鎂鹽、3-氧-乙基維生素 C、麴酸、
熊果素及對苯二酚提高效率的分析方法，並能加以定量市售製品中的
美白劑含量，讓消費者能夠更安心使用含有美白劑的產品。
11
1-3 研究架構
本研究架構流程如圖 1-1，研究先選定分析的七種美白劑為維他
命 C、維他命 C 醣苷、維他命 C 磷酸鎂鹽、3-氧-乙基維生素 C、麴
酸、熊果素及對苯二酚，接著建立離子對高效液相層析方法(IPC)。
實驗方法中使用 Tetrabutylammonium hydroxide (TBAH)離子對試劑，
探討其參數有穩定行評估、緩衝溶液 pH 值、離子對試劑濃度、有機
修飾劑比例，選擇最佳化條件運用在市售樣品含量檢測。
12
圖 1-1 研究架構流程圖
AA、MAP、AA2G、HQ、3OEAA、KA、AR
穩定性試驗
HPLC 分析條件建立
選擇 IPC 最佳化條件
有機修飾劑比例 緩衝溶液 pH 值 離子對試劑濃度
樣品檢測
七種美白成分分析
安定性評估
13
第二章 文獻回顧
2-1 皮膚構造
皮膚為人體的最大器官，表面積大約有 1.6~2.0 平方公尺，包覆
著我們身體，具有保護、感覺、調節體溫等功能，防止外來的各種刺
激傷害。皮膚結構由上而下大致可分為表皮 (Epidermis)、真皮
(Dermis)、皮下組織(Hypodermis)三層表皮層。表皮層有(a)角質細胞
(Keratinocytes) 、(b)郎格罕氏細胞(Langerhans)、(c)黑色素母細胞
(Melanosome)，圖 2-1。其中黑色素母細胞內有黑色體(Melanosome)
分泌黑色素(Melanin)，可吸收可見光及紫外光，做為保護的色素。
圖 2-1 皮膚表皮構造圖
(a)
(b)
(c)
角質層
透明層
顆粒層
有棘層
基底層
14
2-1.1 黑色素細胞
黑色素細胞為單細胞的分泌器官，佔表皮約5~10 %，位於基底層
及毛根部及毛跟外鞘層，其功能是形成黑色素。這種色素是在黑色素
細胞內的小胞器-黑色素顆粒體(Melanosome)合成後，會經由黑色素細
胞的樹枝狀突起而向周圍相鄰角質細胞移動。
人體皮膚內所含黑色素細胞在不同人種間其分部密度大至是相
同，人種間膚色差異主要是由各個黑色素細胞形成黑色素顆粒體能力
與黑色素顆粒體往表皮移動的數目，成熟度及存在形式所造成的。
每人平均約有20億個黑色素細胞，大約以7~8個基底細胞比1個黑
色素細胞比例存在。黑色素細胞在人體中除了存在於皮膚基底層及頭
髮毛囊外，於軟腦膜和眼睛脈絡膜中也都有黑色素細胞[8,9]。
2-1.2 黑色素生成機轉
黑色素生成與體內酪胺酸酶(Tyrosinase)之活性有關。黑色素
生成過程首先被 Raper 提出，再經由 Mason 的證實與補充而確定，
因此可將黑色素之形成過程稱為 Raper-Mason pathway。黑色素生成
機轉(圖 2-2)，由體內有一種胺基酸稱為酪胺酸(tyrosine)，在酪胺酸酶
(tyrosinase)氧化變成多巴(L-Dopa)，再變成多巴醌(L-Dopaquinone)，
15
開始合成與黑色素合成有關酵素，另外還有兩種與酪胺酸酶有關的蛋
白質，如 TRP-1 與 TRP-2 經由這種路逕形成可分為真黑色素
(Eumelanin)和嗜黑色素(Pheomelanin)，最後形成混合型黑色素(mixed
type melanins)。
Eumelanin 為黑色或茶色的色素蛋白質在人體內是由皮膚、
黏膜、毛髮黑色素細胞所合成。由酪胺酸經多巴醌產生 DHI，再經氧
化聚合作用產生。Pheomelanin 為黃紅色的含硫色素蛋白質在人體毛
髮中形成。由酪胺酸衍生而來，經由多巴醌在與 Glutathione 或
Cysteine 結合，形成 Cysteinyldopa 產生 Benzothiazine。
了解黑色素形成機轉再藉由美白劑來抑制、還原或破壞黑色素，
減少黑色素形成，而達成皮膚美白效果，大致可分為這四個作用點。
(1)減少黑色素的形成
黑色素形成過程中，抑制酪胺酸脢活性的作用機制最為常見。
如植酸(Phytic acid)、麴酸(Kojic acid)的美白原理是利用螯合銅離子的
機制，使酪胺酸脢失去活性，阻斷黑色素生成。
(2)還原已生成的黑色素
典型的成分如維他命 C (L-ascorbic acid)及其衍生物，可於酪胺
酸轉變為黑色素的反應中，將黑色素的中間體 Dopaquinone 還原成
Dopa，抑制黑色素形成。此種還原作用具有可逆性。
16
(3)防止黑色素形成
酪胺酸酶抑制劑對酪胺酸酶活性的影響為凝結作用，酪胺酸酶
為黑色素形成所需的基本物質，抑制劑存在使之酪胺酸酶無法與酪胺
酸無法進行一連串連鎖反應生成黑色素。文獻上有抑制酪胺酸酶活性
成分:杜鵑花酸(Azelaic acid)、熊果素(Arbutin)作為酪胺酸酶反應介質，
競爭酪胺酸導致酪胺酸酶作用之介質減少，抑制黑色素形成。
(4)黑色素細胞破壞作用
破壞黑色素母細胞，造成結構改變，而此類最典型成分:汞化合
物(Mercurous Compound) 塗抹後滲入皮膚與表皮層蛋白質結合，破
壞酵素，始酪胺酸酵素活動力受阻，減少黑色素生成效果十分明顯；
對苯二酚(Hydroquinone)可以產生 Semiquinone 的自由基。此作用方
式的缺點後遺症多且不會產生黑色素而導致皮膚癌或病變。
17
圖 2-2 黑色素(Melanin)合成路徑圖[8]
18
2-2 美白劑在化粧品中使用限量
衛生福利部自民國八十九年陸續公告可使用於化粧品的美白
劑，而這些美白劑在我國衛生署是以含藥化粧品來管理，目前現階段
經衛生福利部公告的美白劑共有十三種(表2-1)，因應國際管理之潮流
趨勢，美白劑添加量在符合原基準再一定限量範圍內由含藥化粧品改
以一般化粧品管理。
表 2-1 衛生福利部公告美白劑
編號 英文名稱 中文名稱 限量(使用濃度)%
1 Magnesium Ascorbyl Phosphate 維生素 C 磷酸鎂鹽 3%
2 Ascorbyl Glucoside 維生素 C 醣苷 2%
3 Kojic Acid 麴酸 2%
4 Arbutin 熊果素 7%
5 Chamomile ET 洋甘菊萃取物 0.5%
6 Sodium Ascorbyl Phosphate 維生素 C 磷酸鈉鹽 3.0%
7 Ellagic Acid 鞣花酸 0.5%
8 Tranexamic acid 傳明酸 2.0%~3.0%
9 Potassium Methoxysalicylate 甲氧基水楊酸鉀鹽 1.0%~3.0 %
10 3-O-Ethyl Ascorbic Acid 3-氧-乙基維生素 C 1.0%~2.0 %
11 5,5’-Dipropyl-biphenyl-2, 2’ -diol 5, 5-二丙基二苯基-2, 2-二醇
0.5%
12 Cetyl Tranexamate HCI 傳明酸十六烷基酯 3.0％
13 Ascorbyl Tetraisopalmitate 維他命 C 四異棕櫚酸
脂 3.0％
19
2-3 美白劑介紹
本研究所要分析的美白劑是現今最常添加於美白化粧品，表 2-2
為本研究所選用七種美白劑的理化特性，其介紹如下:
2-3.1 維生素 C 及其衍生物
維生素 C 學名為抗壞血酸(Ascorbic acid)結構中含有烯二醇基
(Enediol group)，其酸性較羧基(Carboxyl group)酸性大，可與鹼作用
形成鹽類，其對光、熱都相當敏感在鹼性之下完全被破壞。因此有許
多維生素 C 相關衍生物被開發並運用在化妝品上[8]，像是維生素 C
醣苷、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 磷酸鈉鹽、3-氧-乙基維生素 C
等。
維生素 C 及其衍生物其美白作用機制:酪胺酸轉換成黑色素的酪
胺酸反應中經由還原作用將黑色素中間體多巴醌(Dopaquinone)加以
還原，發揮其抑制黑色素形成作用；可將深色氧化型黑色素加以還原
而形成淡色還原型黑色素，進而達到美白作用。
2-3.2 麴酸
麴酸近幾年被大量使用在化粧品中，其美白作用機制:酪胺酸酵
素的抑制劑，藉由結構上第四位置 Carbonyl group 及第五位置的
Hydroxy group 螯合作用將酪胺酸酵素的銅離子移除，達到抑制酵素
20
的活性，影響酪胺酸酵素將 N-acetyl tyrosine 氫氧化為 N-acetyl dopa
和 N-acetyl dopaquinone 的過程，進而阻斷黑色素生成。
研究指出麴酸使用含量過高皮膚會產生過敏現象，在日本衛生最
高機關-厚生省被列為禁藥，根據厚生省研究發現，長期餵食麴酸老
鼠容易罹患癌症[12]，但若不經食用僅在皮膚上使用不經肝臟代謝是
無害的。
2-3.3 熊果素
熊果素為一分子的 Hydroquinone 與一分子 Glucose 所結合，在
弱酸下易水解得 Hydroquinone。其美白作用機轉就是透過與酪胺酸
競爭酪胺酸脢的活性位置而使酪胺酸酶失去活性，阻礙黑色素的形成
[13]。衛生福利部 89 年公告熊果素 (Arbutin)可使用於化粧品美白劑，
熊果素使用限量 7％，且不可摻入對苯二酚，同時製品中所含不純物
對苯二酚須低於 20ppm 。如長期使用高濃度，可能會使皮膚免疫力
下降。
2-3.4 對苯二酚
對苯二酚可產生 Semiquinone 自由基，破壞細胞膜，造成黑色素
結構改變，進而達到美白效果。醫學上藥用標準約 2~5％ ，超過 5
％可能會引起皮膚吸收的全身性副作用[14]而目前衛生福利部並未
21
核准使用在化粧品上。行政院衛生署於七十九年二月二十八日，衛生
藥字第 8549964 號函明示“市售化粧品經檢驗含有對苯二酚成份者，
不論其含量均列為藥品管理化粧品不得添加”。
22
表 2-2 七種美白劑之理化性質
分析物 維生素 C 維生素 C 醣苷 維生素 C 磷酸鎂鹽
化學名 L-Ascorbic acid Ascorbic acid 2-glucoside L-Ascorbic acid phosphate magnesium salt
結構式
IUPAC
name
(5R)-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]- 3,4-dihydroxyfuran-2(5H)-one
2-O-a-D-Glucopyranosyl- L-ascorbic Acid
Magnesium di-L-ascorbate ismagnesium (5R)-5-[(IS)-1,2dihydroxyl]-3-hydroxy
CAS No. 50-81-7 29499-78-1 108910-78-7
化學式 C6H8O6 C12H18O11 C6H7MgO9P
分子量 176.12g mol-1 338.26g mol-1 278.39g mol-1
使用限量 --- 2％ 3％
縮寫 AA AA2G MAP
23
表 2-2 七種美白劑之理化性質(續)
分析物 3-氧-乙基維生素 C 麴酸 熊果素 對苯二酚
化學名 3-O-Ethyl Ascorbic Acid Kojic acid Arbutin Hydroquinone
結構式
IUPAC
name
(2R)-2-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]- 3-ethoxy-4-hydroxy-2H-furan-5-one
5-Hydroxy-2-(hydroxymethyl) -4H-pyran-4-one
(2R,3S,4S,5R,6S)-2-Hydroxymethyl- 6-(4-hydroxyphenoxy)oxane-3,4,5
-triol Benzene-1,4-diol
CAS No. 86404-04-8 501-30-4 497-76-7 123-31-9
化學式 C8H12O6 C6H6O4 C17H16O7 C6H6O2
分子量 204.18g mol-1 142.11g mol-1 272.25g mol-1 110.11 g mol-1
使用限量 1~2％ 2％ 7％ ---
縮寫 3OEAA KA AR HQ
24
2-4 美白劑相關之研究
美白劑分析檢驗方法，以薄層層析(TLC)[1,2]、高效能液相層析
(HPLC)、氣相層析(GC)[3]、分光光度法(Spectrophotometry)[4,5、微
胞電動層析(MEKC)[6,7]，但以 HPLC 分析方法為主。針對上述分析
方法，高效能液相層析法在分析化粧品中美白劑，有比其他分析方法
簡便極高選擇性的優勢。以下就針對 HPLC 及 GC 分析方法做介紹。
表 2-3 為統整美白劑分析方法及詳細內容。
2-4.1 高效能液相層析(high performance liquid chromatography；HPLC)
HPLC 常被使用於化粧品分析美白劑中，靈敏度、精確度高，能
夠因應分析物需求改變靜相類型、移動相組成及偵測器種類、適用於
高沸點不易揮發、分子量大、不同極性有機化合物。下列幾種由 HPLC
以不同移動相及固定相組成分析美白劑的方法:
(1)逆相層析法 (Reverse-phase Liquid Chromatography ;RPLC)
2007 年衛生福利部食品藥物管理署建議化粧品中美白劑檢測方
法[15]，同時測定維他命 C 磷酸鎂鹽、維他命 C 葡萄醣苷、對苯二酚、
熊果素、麴酸，以 COSMOSIL 5C18-AR-II 250×4.6mm 為固定相，
0.05M 磷酸二氫鉀溶液(pH 2.5) :甲醇( 99:1v/v )混液再以濾膜過濾為
移動相，等度沖提。光二極體烈陣檢出器，波長 280nm。樣品前處理
25
取檢體約 0.1g 以 0.05M 磷酸二氫鉀溶液溶解定量至 20ml，超音波震
盪約 30 分鐘，冷卻至室溫，以濾膜過濾即可上機。檢出限量分別為
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.08μg/ml、維生素 C 葡萄糖苷 0.04μg/ml、麴酸
0.008μg/ml、熊果素 0.04μg/ml、對苯二酚 0.02μg/ml。
2008 年 A. Balaguer 等人[16]，使用環保的方法同時測定化妝品
中為生 C 及其衍生物，維他命 C、維生素 C 棕梠酸脂、維生素 C 醣
苷、維生素 C 鹽類(鎂鹽或鈉鹽)以 Octadecylsilica (C18)做為固定相，
50mM 磷酸緩衝溶液(不同的 pH 值)加入 0.1M 氯化鈉:乙醇，梯度沖
提。偵測極限在 2 至 6μg/ml 之間。
(2)離子對層析法 (Ion-pair Chromatography ;IPC)
離子對層析法是逆相分配層析法的一種，以離子對試劑在固定相
上生成暫時之離子交換基位，或與分析物生成離子配對而改變分析
物在移動相與固定相間之平衡關係，而達到分離的目的，用來分離離
子化合物。
離子對層析技術分離機制常以下列三種作用模式來解釋：
(1)離子交換模式，此種模式認為離子對試劑先於固定相表面生成離
子交換基，再與分析物作用，如同離子交換層析的反應。
(2)離子配對模式，此種模式認為分析物先與離子對試劑生成離子配
對後，於系統中與固定相及移動相進行平衡作用。
26
(3)離子作用力模式，認為分析物之滯留行為乃與固定相表層離子對
試劑在移動相沖提液作用力平衡關係而生成。
2011 年由 A. C. Wang 等人[17]，使用離子對液相層析法同時分離
維他命 C、麴酸、熊果素、對苯二酚、維他命 C 磷酸鎂鹽，以 Inertsil
ODS-3V 250×4.6mm 5μm 為固定相，緩衝液為 50mM 磷酸二氫鈉再
加入 2mM 溴化十六烷三甲基銨(pH 值 4.5)，移動相為梯度沖提，第
一階段為 0 至 20 分鐘乙腈與緩衝溶液( 1 : 99 )混合，第二階段 21 至
41 分鐘乙腈與與緩衝溶液( 70 : 30 )混合，第 41 分鐘回復以乙腈與緩
衝溶液( 1 : 99 )混合，平衡時間 10 分鐘，總分析時間為 51 分鐘。流
速 1ml/min，樣品注射量 10μl，檢測波長 270nm。線性相關系數值( r2 )
0.9968~0.9997，回收率介於 96.97％至 100.80％。
2003 年由 C. M. Chang 和 M. L. Chang 的研究[18]以離子對層析
法來測定化粧品中親水性美白劑維生素 C、熊果素、維他命 C 磷酸鎂
鹽、甘醇酸，作者所使用離子對試劑為 Butylammanium hydroxide
(TBAH)再搭配 0.05M 磷酸二氫鉀水溶液(pH 值 2.5)做為移動相，以
Stainless-steel Mightysil RP-18GP 為固定相，維他命 C 磷酸鎂鹽滯留
時間不但延長，且得到良好的分離效果。樣品注射量 25μl，流速
1ml/min，紫外光/可見光偵測器 ，檢測波長 220nm。線性相關系數
值( r2 ) 0.9974~0.9997，回收率介於 94.8％至 100.1％。
27
(3)微胞液體層析法 (Micellar liquid chromatography; MLC)
2013 年 W. Thogchai 等人[19]，以微胞液體層析法同時測定熊果
素及對苯二酚以 Nova-Pak C-18 150×3.9 mm 為固定相，1％(v/v) 乙
腈和 0.006mM Brij 35 (pH6.0)混和做為移動相，流速 1ml/min。紫外
光/可見光偵測器，檢測波長 280nm。線性相關系數值( r2 )
0.9923~0.9930，回收率介於 95.5％至 99.0％，偵測極限熊果素對苯二
酚分別為 0.51μg/ml、0.37μg/ml。
(4) 親水作用層析法 (Hydrophilic interaction chromatography ;HILIC)
2007年A. Tai等人，親水作用層析法檢測食品及飲品中維他命C
及其衍生物[20]。以Inertsil Diol 250×4.6mm 5μm為固定相，66.7mM
醋酸銨水溶液:乙腈( 85:15v/v )等度沖提，流速 0.7ml/min。紫外光/
可見光偵測器，檢測波長260nm。線性相關系數值( r2 ) 0.9996~1。
2-4.2 氣相層析(gas chromatography ；GC)
氣相層析法較適用於分析高溫易揮發而不易產生熱分解、變質、
疏水性高分析物。大多數化妝品成分都是屬於高沸點不易揮發，所以
必須衍生化程序或者是複雜樣品前處理才進行實驗。
(1) GC/MS
2010 年 C. Alberto 等人，使用氣相層析法連接質譜儀測定化粧品
28
美白劑麴酸、杜鵑花酸、熊果素、對苯二酚、間苯二酚 [3]。由於這
些化合物低揮發性必須先經過衍生化再進行實驗，研究中作者使用衍
生化試劑為 N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA)。GC 設
定條件為分流(1:10)，固定相為 TR-5MS (95% dimethyl–5%
phenylpolysiloxane)。載流氣體:氦氣、注射口 280℃。MS 使用電子游
離法。
29
表 2-3 HPLC 美白劑分析方法文獻整理
Analytesa Reap-sample Extraction solvent Instrum. Analytical technique LOD(μg/ml) references
HQ Cosmetic cream Water: Methanol (45:55) LC-UV
TLC
C18 column Mobile phase: water and ethanol (45:55)
--- [1]
AR HQ
Plant Water: Methanol(50:50) LC-UV
C18 column Mobile phase: 0.5% ortophosphoric acid water solution: methanol.
0.49-1.01 [21]
AA Pharmaceutical Acetic acid+1-hexanesulfonic acid sodium salt water solution LC-UV
C18 column Mobile phase: Aceticacid+1-hexanesulfonic acid sodium salt water solution
1.95 [22]
3-O-EAA Cosmetic Water: Methanol LC-UV C18 column Mobile phase: KH2PO4 solution: Methanol
--- [23]
AA AG AP APH
Cosmetic Ethanol: phosphate buffer pH 3 LC-UV
C18 column Mobile phase: ethanol: 50 mM phosphate buffer
2-6 [16]
30
表 2-3 HPLC 美白劑分析方法文獻整理
Analytesa Reap-sample Extraction solvent Instrum. Analytical technique LOD(μg/ml) references
MAP KA AR HQ AA2G
Cosmetic KH2PO4 buffer solution(pH 2.5) LC-DAD
C18 column Mobile phase: 0.05 M KH2PO4 buffer solution(pH 2.5) :methanol
0.008-0.04 [15]
AA AA2G EA AA-2βG
Food Acetonitrile :ammonium acetate solution LC-UV
Di ol column Mobile phase: acetonitrile: ammonium acetate
0.03-0.3 [20]
AR Cosmetic Methanol LC-UV
C18 column Mobile phase: water: methanol: hydrochloric acid
0.02 [24]
AA AR Cosmetic Methanol LC-UV
C18 column Mobile phase: phosphate buffer : methanol
0.2-0.3 [25]
31
表 2-3 HPLC 美白劑分析方法文獻整理
Analytesa Reap-sample Extraction solvent Instrum. Analytical technique LOD(μg/ml) references
AA Iso-AA Food TCEP+ HCl solution LC-UV
C18 column Mobile phase: Acetonitrile: sodium acetate solution pH 5.4
0.01 [26]
AA human lymphocytes
Metaphosphoric acid that contained EDTA LC-UV
C18 column Mobile phase: KH2PO4/H3PO4 (pH 3.0) containing EDTA
--- [27]
KA AR Cosmetic Acetonitrile LC-UV
TLC
Diol column Mobile phase: acetonitrile: KH2PO4
--- [28]
HQ Cosmetic Deionized water LC-UV
C18 column Mobile phase: dihydrogenphosphate buffer (pH 5.50): methanol
0.02 [29]
32
表 2-3 HPLC 美白劑分析方法文獻整理
Analytesa Reap-sample Extraction solvent Instrum. Analytical technique LOD(μg/ml) references
AP MPA Cosmetic Thtrahydrofurane-phosphate
buffer(pH3.5) LC-UV
Cyano-propyl column Mobile phase: methanol: monobasic sodium phosphate
--- [30]
MPA Cosmetic Trahydrofuran- phosphate buffer (pH 4) LC-UV
NH2 column Mobile phase: Acetonitrile: phosphate buffer(pH 4)
--- [31]
a Key abbreviation: AR, Arbutin KA, Kojic acid AA, Ascorbic acid HQ, Hydroquinone 3-O-EAA,3-O- Ethyl Ascorbic Acid AA2G, Ascorbic acid 2-glucoside
EA, erythorbic acid Iso AA, isoascorbic acid MAP, magnesium ascorbyl phosphate AP, ascorbyl palmitate APH,ascorbyl phosphate
AA-2βG,2-O-β-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid
33
第三章 實驗材料與方法
3-1 實驗材料
實驗中所使用的藥品及溶劑名稱、化學式、廠牌、等級均列於表
3-1。實驗過程中所使用的二次水，其電阻值均大於 17M-cm 歐姆以
上。
表 3-1 實驗使用藥品及溶劑
名稱 化學式 廠牌 等級
L-Ascorbic acid C6H8O6 SIGMA 99％
L-Ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate C6H7MgO9P Wako 99％
Ascorbic acid 2-glucoside C12H18O11 Hatashibara 99％
3-O Ethyl ascorbic acid C8H12O6 Spec-Chem Ind 99％
Kojic acid C6H6O4 Alfa Aesar 99％
Arbutin C17H16O7 TCI 97％
Hydroquinone C6H6O2 SIGMA 99％
Sodium Hydroxide NaOH 聯合化工試藥 95％
Potassium Phosphate monobasic KH2PO4 KOJIMA 試藥級
Potassium hydrogen phosphate K2HPO4 Merck 試藥級
34
表 3-1 實驗使用藥品及溶劑(續)
名稱 化學式 廠牌 等級
Phosphoric acid H3PO4 J.T. Baker 85-87％
Citric acid monohydrate HOC(COOH)(CH2COOH)2
H2O SIGMA ≥98％
Butylammanium hydroxide
40％ w/w aq.(TBAH) C16H37NO Alfa Aesar
Methanol CH3OH J.T. Baker HPLC 級
35
3-2 儀器設備
實驗中所使用儀器及管柱名稱、廠牌、型號均列於表 3-2。
表 3-2 實驗使用儀器及管柱
名稱 廠牌 型號
高效能液相層析幫浦 HITACHI L-7100
高效能液相層析儀管柱 Agilent HC-C18
紫外線-可見光偵測器 UV-Vis HITACHI L-7420
紫外光-可見光分光光譜儀 HITACHI U-2900
pH 計 EUTECH pH510
超音波震盪器 BRANSON3210 Spire Mixer5100
四位數精密分析天秤 Precisa XS225A
36
3-3 研究方法
3-3.1 波長選擇
分別取適量維生素 C、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣苷、
3-氧-乙基維生素 C、熊果素、對苯二酚、麴酸標準品，分別以二次去
離子水配製成 1000μg/ml 的儲備溶液再稀釋成 20μg/ml 溶液，置於兩
面透光石英槽中利用紫外光/可見光光譜儀進行掃描。波長掃描設定
範圍為 200~400nm 之間。
3-3.2 離子對試劑濃度的選擇
HPLC 條件為移動相 A 相:0.05MKH2PO4 (pH2.5)緩衝溶液；B 相:
甲醇，靜相為 Agilent HC-C18 , 250×4.6mm,5μm。偵測波長為 264nm，
移動相流速 1ml/min，樣品注射量 20μl。
配製七種美白劑 1000μg/ml 的儲備溶液，分別取等量各儲備溶液
以二次去離子水稀釋成 50μg/ml 測試溶液。實驗中使用離子對試劑為
Tetrabutylamonium hydroxide (TBAH)，將 TBAH 配製於 A 相緩衝溶
液中，其濃度各分別為 2、5、10、15mM，經由上述 HPLC 條件測試，
觀察滯留時間變化及解析度，並選擇最適當離子對試劑濃度來進行實
驗。
37
3-3.3 探討不同有機修飾劑比例
配製七種美白劑 1000μg/ml 的儲備溶液，分別取等量各儲備溶液
以二次去離子水稀釋成 50μg/ml 溶液，由 3.3-2 中所述 HPLC 條件進
行實驗，將移動相 B 相中有機修飾劑-甲醇調整不同比例 2、3、4、5、
6％，觀察滯留時間變化及解析度，並選擇最佳有機修飾劑比例來進
行實驗。
3-3.4 探討不同緩衝溶液 pH 值
取七種美白劑 1000μg/ml 的儲備溶液，分別取等量各儲備溶
液以二次去離子水稀釋成 100μg/ml 溶液，由 3.3-2 中所述 HPLC 條件
進行實驗，將移動相 A 相調整不同 pH 值，緩衝溶液配製如下:
(1) pH 2.5
取 1.7g 的磷酸氫二鉀用二次去離子水溶解，使用磷酸將 pH 值調
整至 2.5 再加入二次去離子定量至 250ml。
(2) pH 5
取 5.25g 的檸檬酸用二次去離子水溶解，使用 0.1M 氫氧化鈉將
pH 值調整至 5 再加入二次去離子定量至 250ml。
(3) pH 7
秤取 0.218g 的磷酸氫二鉀與 0.170g 的磷酸二氫鉀，加入二次去
38
離子水溶解，使用 0.1M 氫氧化鈉將 pH 值調整至 7 再加入二次去離
子水定量至 250ml。
分別利用上述緩衝溶液添配製移動相中，觀察滯留時間變化，並
選擇最適當 pH 值緩衝溶液來進行實驗。
3-4 標準品溶液及檢量線配製
精秤維生素 C、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣苷、3-氧-
乙基維生素 C 、熊果素、對苯二酚、麴酸，分別以二次去離子水配
製成 10000μg/ml 最高儲備溶液，再以二次去離子水稀釋配製成不同
濃度點 5、10、20、50、100μg/ml 做為檢量線。
3-5 自製、市售樣品前處理及添加方法
(a)自製、市售樣品前處理
取 0.1 克自製樣品放入 50ml 定量瓶，市售樣品 1 放入 25ml 定量
瓶，樣品 2 放入 5ml 定量瓶中，樣品 3 放入 50ml 定量瓶中，樣品 4
放入 100ml 定量瓶中，加入二次去離子水定量至刻度線，超音波震盪
後再使用 0.45μl Nylon 濾膜過濾即可測定。表 3-3 為本次實驗所檢測
市售樣品。
39
(b)樣品添加方法
分別各取 0.1 克自製樣品及市售樣品，放入不同體積定量瓶中，
添加已測得濃度溶液，此溶液從各美白劑最高儲備溶液取得，加入二
次去離子水定量至刻度線，超音波震盪後再使用 0.45μl Nylon 濾膜過
濾即可上機。回收率 100±10％為可接受範圍。
40
表 3-3 市售樣品
樣品編號 產品成分表中標示美白劑 標示含量(％) 劑型
01 熊果素 (AR) ---
乳液 維生素 C 磷酸鎂鹽 (MAP) ---
02 維生素 C 醣苷(AA2G) --- 面膜液
03 熊果素 (AR) 6％
精華液 3-氧-乙基維生素 C (3-O-EAA) ---
04 維生素 C (AA) 5％ 精華乳
樣品來源:開架式產品
41
3-6 安定性評估
表 3-4、3-5 為自製樣品配方，主要用於自行配製樣品測試維生
素 C 、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣苷、3-氧-乙基維生素 C、熊
果素、對苯二酚、麴酸穩定性測試。下列為本實驗自製乳液及精華液
配方表及配置步驟。將自製精華液及乳液放至室溫中評估第一天、第
二天、第三天、第五天經樣品前處理再由 HPLC/UV 分析(n=3)，觀察
美白劑含量變化。
表 3-4 自製乳液配方
成分 美白乳液
A 相 克數(％) Tween 20 3.0 Span 80 3.0
Caprylic/Capric Triglyceride 1.0 Squlane 1.0
Minernal oil 1.0 Dimethicone 1.0 GermabenⅡ 0.6
BHT 0.3 B 相
Vitamin C 0.5 Ascorbyl Glucoside 0.5
Magnesium ascorbyl phosphate 0.5 3-O-Ethyl Ascorbic Acid 0.5
kojic acid 0.1 Arbutin 0.5
Hydroquinone 0.5 Xanthan Gum 0.3
Distilled Water to 100
42
配製步驟:分別稱取 A％及 B％成分(B 相需先預溶至透明)，用攪
拌器攪拌，同時將 A％相逐滴滴入 B％相中，形成乳化後，再攪拌 20
分鐘，即可完成。
表 3-5 自製精華液配方
配製步驟: (1)配方中 pH 3 緩衝溶液配製:取 1.5 克檸檬酸用二次
去離子水溶解，用氫氧化鈉調整 pH 值至 3，在加入 1％ Sodium
metahisulfite 至完全溶解。(2)分別稱取 A％及 B％成分(A 相需先預溶
至透明) ，用攪拌器攪拌，再把 B％成分加入 A％中，攪拌數分鐘，
即可完成。
成分 美白精華液
A 相 克數(％) Xanthan Gum 0.2
Buffer 0.6 EDTA-2Na 0.1
pH 3 Buffer to 100 B 相
Vitamin C 1 Ascorbyl Glucoside 1
Magnesium ascorbyl phosphate 1 3-O-Ethyl Ascorbic Acid 1
kojic acid 1 Arbutin 1
Hydroquinone 1
43
3-7 精密度與準確度
為評估建立分析方法同日分析、異日分析之精密度與準確度，取
適量維生素 C、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣苷、3-氧-乙基維生
素 C、熊果素、對苯二酚、麴酸，分別以二次去離子水配製成 1000μg/ml
最高儲備溶液，再以二次去離子水稀釋配製成不同濃度點 5、10、20、
50、100μg/ml。在將上述所配置不同濃度之標準品，各取 20μl 的標
準溶液，由 HPLC/UV 分析 ( n = 3 )。
3-8 偵測極限(LOD)及定量極限(LOQ)
秤取維生素 C、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣苷、3-氧-乙基
維生素 C 、熊果素、對苯二酚、麴酸，分別以二次去離子水配製成
1000μg/ml 最高儲備溶液，再以二次去離子水稀釋配製成 100μg/ml
中間儲備溶液，配製成 0.5、1、2、5、10、20μg/ml 濃度範圍建立檢
量線，在取 0.5μg/ml、1μg/ml 及 2μg/ml 濃度點各測定七次，求出各
美白劑面積平均標準偏差值(SD)帶回檢量線方程式。得知一個濃度自
行配製由 HPLC 測定為偵測極限(LOD)；定量極限(LOQ)約為偵測極
限 3.3 倍。
44
第四章 結果與討論
4-1 七種美白劑紫外線吸收波長探討
以紫外光-可見光分光光譜儀進行測試，波長掃描範 200~400nm
之間。測試結果七種美白劑之特定吸收波峰波長(圖 4-1)，表一為各
美白劑最大吸收波峰。維生素 C 、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣
苷及麴酸最大吸收波再 260nm，熊果素、對苯二酚最大吸收波為 280nm，
3-氧-乙基維生素 C 最大吸收值較低則在 240nm。而本實驗 HPLC 系
統所使用紫外光可見光 UV/Vis 偵測器為 HITACHI L-7420，經評估後
選擇 264nm 做為偵測波長。
表 4-1 七種美白劑，最大吸收波峰
化合物名稱 最大吸收波
維生素 C (AA) 260nm
維生素 C 磷酸鎂鹽 (MAP) 260nm
維生素 C 糖苷 (AA2G) 260nm
3-氧-乙基維生素 C (3OEAA) 244nm
熊果素 (AR) 220、282nm
對苯二酚 (HQ) 221、288nm
麴酸 (KA ) 216、268nm
45
圖 4-1(a)維生素 C(b)維生素 C 磷酸鎂鹽(c)維生素 C 醣苷(d)3-氧-乙基
維生素 C(e)熊果素(f)對苯二酚(g)麴酸(20μg/ml) 溶於二次水之 UV 吸
收圖譜。
(g)
(a) (a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
46
4-2 七種美白劑穩定性評估
配製七種美白劑濃度為 100μg/ml 分別用 pH 2.5、pH 5、pH 7 緩
衝溶液及移動相定量，再分別放置 4℃和室溫下評估第一天、第三天、
第五天。評估結果顯示從圖 4-2 至 4-5，七種美白劑不管配製在任何
一種緩衝溶液下放置 4℃都比在室溫下的穩定。在以 4℃環境下不同
pH 緩衝溶液比較以 pH 2.5 最為穩定但隨著 pH 增加維生素 C 穩定性
越差，其他六種美白劑面積值也都有稍稍下降。從此結果可以判定美
白劑大多屬酸性，pH 值越高相對就會較不安定，也容易受到光、熱
導致降解相對的放置 4℃比室溫來的穩定。
圖 4-2 七種美白劑在移動相溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性
01000000200000030000004000000500000060000007000000
Are
a
Mobile pase (室溫) 第一天
第三天
第五天
01000000200000030000004000000500000060000007000000
Are
a
Mobile phase (4℃) 第一天
第三天
第五天
(b) (a)
47
圖 4-3 七種美白劑在 pH2.5 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性
圖 4-4 七種美白劑在 pH5 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性
圖 4-5 七種美白劑在 pH7 緩衝溶液 (a)室溫 (b) 4℃穩定性
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
Are
a
pH2.5 (4℃) 第一天
第三天
第五天
01000000
20000003000000
40000005000000
60000007000000
Are
a
pH2.5 (室溫) 第一天
第三天
第五天
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Are
a
pH5 (室溫) 第一天
第三天
第五天
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Are
apH5 (4℃) 第一天
第三天
第五天
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Are
a
pH7 (室溫)第一天
第三天
第五天
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Are
a
pH7 (4℃)第一天
第三天
第五天
(a) (b)
(a) (b)
(a) (b)
48
4-3 不同濃度 TBAH 離子對試劑影響各美白劑層析結果之探討
本實驗使用七種美白劑標準溶液 50μg/ml 溶液，再以溴化四丁
基銨(TBAH)配製 2、5、10、15mM 四種不同濃度進行實驗，結果顯
示圖 4-6，添加 15mM (TBAH)離子對試劑時，維他命 C 磷酸鎂鹽滯
留時間延長至 30 分鐘；添加 2mM (TBAH)維他命 C 磷酸鎂鹽滯留時
間大幅減短。維生素 C 及維生素醣苷相鄰波峰與麴酸及熊果素兩相
鄰波峰解析度是此七種美白劑中要有良好的解析度是較困難，添加
2mM (TBAH)維生素 C 及維生素醣苷之間解析度為 2.71 與其他離子
對試劑濃度相比雖然分離度不是最大，但值大於 1.5 以上為完全分離，
層析時間也只需要 20 分鐘就能達到所有化合物完全分離，本實驗考
慮到分析實驗中都盡可能將分析時間縮短，提高效率，減少有機廢液
產量，故本實驗選擇添加2mM TBAH離子對試劑作為移動相的組成。
圖 4-7 添加不同離子對試劑濃度之層析圖譜。
解析度計算公式: R=
∆ Wave =
t 2-t 1
∆Wave
49
(a) (b)
圖 4-6 添加不同離子對試劑濃度(a)滯留時間(b)解析度之相較圖
(層析條件如 3.3-2 中所述)
50
圖 4-7 添加不同離子對試劑濃度之層析圖譜，(a)2mM (b) 5mM (c)10mM
(d) 15mM.Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4 for AR,peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
(a)
(b)
(c)
(d)
7
6 5 4
3
2
1
7
6 5 4
3
2
1
7
6 5 4
1
2, 3
7
6 5
4
3
2
1
51
4-4 不同比例有機修溶劑影響各美白劑層析結果之探討
本實驗使用七種美白劑標準溶液 50μg/ml 以添加不同比例的有
機修飾劑-甲醇，觀察各美白劑滯留時間。其結果顯示圖 4-8，有機修
飾劑甲醇添加量到 6%，沖提強度變強，也會使美白劑在移動相中極
性大小改變，使得滯留時間縮短無法得到好的分離；添加 4%甲醇時，
七種美白劑都有達到分離，維生素 C 與維生素 C 醣苷滯留時間很接
近但是兩個波峰之間解析度也有達到(2.83)，移動相中添加 4%甲醇最
為適當。圖 4-9 添加不同有機修飾劑(Methanol)比例層析圖譜。
52
(a)
(b)
圖 4-8 添加不同比例有機修飾劑(a)滯留時間(b)解析度之相較圖
(層析條件如 3.3-2 中所述)
53
(c)
(b)
(a)
6
7 5
4
3
2 1
7
6 5 4
3
2
1
7
6 5 4
3
2
1
7
6 5 4
3
2
1
(d)
54
圖 4-9 添加不同有機修飾劑(Methanol)比例層析圖，(a)2％(b)3％(c)4
％(d) 5％(e) 6％. Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4for AR, peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
(e)1
2
3
4 5 6
7
55
4-5 不同 pH 值緩衝溶液影響七種美白劑層析結果之探討
移動相中緩衝液 pH 值會影響離子性分析物的解離相對的也會
影響層析結果。本實驗使用七種美白劑標準溶液 100μg/ml 以 pH 2.5、
pH 5、pH 7 緩衝溶液進行實驗，結果顯示圖 4-10，隨著 pH 值增加維
生素 C 磷酸鎂鹽滯留時間也延後最為明顯。針對維生素 C 與維生素 C
醣苷解析度在pH 2.5 解析度為2.83 與pH 5、pH 7 相較之下是最好的，
而在 pH 2.5 維生素 C 磷酸鎂鹽在此條件下滯留時間也是最短，所有
分析物都可以達到好的分離。因此本實驗移動相緩衝溶液 pH 值調整
至 pH 2.5。圖 4-11 不同 pH 值緩衝溶液層析圖。
56
(a)
(b)
圖 4-10 不同 pH 值緩衝溶液(a)滯留時間(b)解析度之相較圖
(層析條件如 3.3-2 中所述)
57
圖 4-11 不同 pH 值緩衝溶液層析圖，(a) pH 2.5 (b) pH 5(c) pH 7
Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4 for AR, peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
(a)
(b)
(c)
1、2
3
4 5 6
7
7
6 5 4
3
1
2
6
7
54
3
2
1
58
選擇以上各參數最佳條件，靜相為 Agilent HC-C18 , 250×4.6mm,
5μm，移動相 0.05M KH2PO4 (pH2.5)、0.2mM TBAH : Methanol 96:4(v/v)
偵測波長為 264nm 流速 1ml/min，樣品注射量 20μl，進行以下實驗。
4-6 檢量線建立
七種美白劑不同濃度混合標準溶液，以 HPLC 的最佳沖提條件
進行分析，結果如表4-2，七種分析物在5μg/ml-100μg/ml濃度範圍內，
線性方程式相關系數(R2)均在 0.9993 以上。圖 4-12 為對七支美白劑
標準品層析圖譜，由圖可見層析順序及個別化合物滯留時間為: (1)維
生素 C 4.24 分鐘 (2)維生素 C 醣苷 4.94 分鐘 (3)麴酸 6.70 分鐘 (4)
熊果素 7.46 分鐘 (5)對苯二酚 12.41 分鐘 (6)維生素 C 磷酸鎂鹽 16.89
分鐘 (7)3-氧-乙基維生素 C 19.68 分鐘。
59
表 4-2 七種美白劑之檢量線參數
a 檢量線濃度範圍 5μg/ml-100μg/ml
圖 4-12 七種美白劑標準溶液(均為 100 μg/mL)之層析圖
層析條件: Agilent HC-C18 , 250×4.6mm, 5μm，0.05M KH2PO4 (pH2.5)、
0.2mM TBAH : Methanol 96:4(v/v)波長:264nm，流速 1ml/min，樣品
注射量20μl。Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4 for AR,
peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
線性方程式 a 相關系數(R2)
維生素 C y= 2352.4x＋28832 0.9996
維生素 C 醣苷 y=15464x＋69022 0.9993
麴酸 y =2591.4x＋1628.8 0.9995
熊果素 y=8448.5x＋68507 0.9998
對苯二酚 y=2291.4x－4817.6 0.9997
維生素 C 磷酸鎂鹽 y=2591.4 x＋1628.8 0.9995
3-氧-乙基維生素 C y=27925x＋95503 0.9993
7
1
6 5
3
2
4
60
4-7 偵測極限(LOD) 及定量極限(LOQ)
取 0.5μg/ml、1μg/ml 及 2μg/ml 濃度點各測定七次，求出各美白
劑面積平均標準偏差值(SD)檢量線方程式。由 HPLC 測定為偵測極限
(LOD)；定量極限(LOQ)約為偵測極限 3.3 倍。
偵測極限表 4-3，分別為維生素 C 0.03μg/ml、維生素 C 醣
0.05μg/ml、麴酸 0.02μg/ml、熊果素 0.16μg/ml、對苯二酚 0.19μg/ml、
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.4μg/ml、3-氧-乙基維生素 C 0.07μg/ml。
表 4-3 偵測極限、定量極限
美白劑 LOD( μg/ml) LOQ( μg/ml)
維生素 C 0.03 0.09
維生素 C 醣苷 0.05 0.16
麴酸 0.02 0.06
熊果素 0.16 0.52
對苯二酚 0.19 0.62
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.4 1.32
3-氧-乙基維生素 C 0.07 0.23
61
4-8 精密度與準確度
4-8.1 自製樣品含量測試及添加回收率
利用本研究所建立離子對層析分析條件，應用於自製樣品以
評估再現性，圖 4-13、4-14 為自製樣品的層析圖，表 4-4 為自製樣品
含量及添加回收率測試結果。結果顯示用此方法對於同時含有維生素
C、維生素 C 醣苷、維生素 C 磷酸鎂鹽、3-氧-乙基維生素 C、麴酸、
熊果素及對苯二酚樣品，均可得良好的回收率，精華液及乳液回收率
在 94.73-112.56％，所以本實驗中所提出樣品含量測定方法，皆可確
實萃取出不同劑型配方中美白劑含量。
回收率計算公式:
4-8.2 自製樣品安定性評估
本實驗評估自製樣品中含有七種美白劑在不同劑型－精華液、
乳液產品的安定性評估，評估第一天、二天、三天、五天。（樣品製
造日期為：2012 年 7 月 22 日）結果顯示表 4-5，精華液中七種美白
成分前三天含量沒有太大變化到第五天含量就有稍稍下降。配製在乳
液七種美白劑在第三天含量就明顯下降，到第五天其中維生素 C、維
生素 C 糖苷、麴酸、對苯二酚及 3-氧-乙基維生素 C 含量減少更為明
添加樣品含量 － 未添加樣品含量平均
添加量×100％
62
顯，濃度分別為 0.45、0.48、0.08、0.48、0.43μg/ml。
從數據上得知精華液與乳液比較起來精華液較為安定，這可能
是有關精華液配方中所使用的 pH 3 緩衝溶液，這些美白劑大多屬於
弱酸性相對的在酸性環境下較為安定。
圖 4-13 自製精華液層析圖
圖 4-14 自製乳液層析圖
63
4-8.3 異日間分析(Inter-day)、同日間分析 (Intra-day)
次與次之間(Intra-day)重複性和日與日間(Inter-day)再現性評
估重複注射精密度，重複性試驗一日內連續重複進行三次，再現性實
驗為連續三日。以七種美白劑 5、10、20、50、100μg/ml 標準溶液進
行實驗。重複性、再現性的變異系數(CV)％是以同日、非同日連續注
射三次所得積分面積平均標準偏差(SD)除以積分面積平均值乘以 100。
結果顯示表 4-6，同日分析七種美白劑 CV％值分別在 0.16％~3.04％
之間，無明顯差異(CV＜5％)，所以在同日分析上精密度準確度接有
良好的可信度；而異日分析 CV％值則分別在 0.04％~10.32％之間與
同日分析相較之下 CV％值較大，精確度及準確度就相對來的較差。
變異係數計算公式:
4-8.4 市售樣品測定
將以確立的分析方法運用在市售美白產品，本實驗選用樣品
劑型分別有面膜、精華液、精華乳及乳液。購買產品時選擇在包裝上
特別強調美白、淡斑並含有本實驗七種美白劑為主，檢測含量及添加
回收率測試，實驗皆為三重複。結果顯示表 4-7，樣品 1 標示含有熊
果素及維生素 C 磷酸鎂鹽，實驗結果只測得熊果素 3.3％但未測得維
C.V. = ×100％
64
生素 C 磷酸鎂鹽，也許有可能未添加此種成分或者添加量太少在製
造過程中導致成分降解。樣品 3 (熊果素 6％)、樣品 4 (維生素 C 5％)
包裝上皆有顯示添加美白劑含量，檢測結果與標示含量相符。回收率
分別為 97.67±1.8％至 104.78±5.74％。此次購買的產品內含有熊果素
成份皆未測得對苯二酚，其檢測結果都在法規標示含量之內。
65
表 4-4 自製精華液、乳液含量測試及添加回收率
( n=3 )
樣品 美白劑 配製量(％) 平均測得濃度(％) 添加量(％) 添加回收率(％)
自製
精華液
維生素 C 1 1.01±0.05 1 94.73 維生素 C 醣苷 1 1.01±0.006 1 94.78
麴酸 1 1.08±0.01 1 101.94 熊果素 1 1.01±0.007 1 100.58
對苯二酚 1 1.02±0.002 1 106.60 維生素 C 磷酸鎂鹽 1 0.99±0.05 1 93.03
3-氧-乙基維生素 C 1 1.03±0.01 1 108.90
樣品 美白劑 配製量％ 平均測得濃度(％) 添加量(％) 添加回收率(％)
自製
乳液
維生素 C 0.5 0.52±0.07 0.5 101.08 維生素 C 醣苷 0.5 0.53±0.08 0.5 102.09
麴酸 0.1 0.13±0.005 0.1 112.15 熊果素 0.5 0.49±0.01 0.5 100.73
對苯二酚 0.5 0.52±0.03 0.5 112.56 維生素 C 磷酸鎂鹽 0.5 0.47±0.03 0.5 97.49 3-氧-乙基維生素 C 0.5 0.53±0.007 0.5 104.72
66
表 4-5 自製精華液、乳液安定性
Mean ±SD ( n=3 )
精華液(%) 乳液(%)
美白劑 第一天 第二天 第三天 第五天 第一天 第二天 第三天 第五天
維生素 C 1.01±0.05 0.97±0.04 0.98±0.01 0.96±0.02 0.52±0.07 0.49±0.07 0.46±0.01 0.45±0.01
維生素 C 醣苷 1.01±0.006 1.06±0.001 1.01±0.01 0.98±0.03 0.53±0.08 0.50±0.009 0.50±0.01 0.48±0.003
麴酸 1.08±0.01 1.03±0.03 1.02±0.006 1.0±0.003 0.13±0.005 0.13±0.001 0.097±0.004 0.08±0.0002
熊果素 1.01±0.007 1.09±0.07 0.99±0.06 0.94±0.01 0.49±0.01 048±0.006 0.50±0.02 0.48±0.07
對苯二酚 1.02±0.002 1.07±0.05 1.0±0.004 1.0±0.01 0.52±0.03 0.50±0.008 0.48±0.007 0.48±0.004
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.99±0.05 1.09±0.06 0.98±0.05 0.95±0.02 0.47±0.03 0.48±0.02 0.43±0.06 0.46±0.005
3-氧-乙基維生素 C 1.03±0.01 1.10±0.008 0.99±0.03 0.98±0.05 0.53±0.007 0.53±0.004 0.49±0.04 0.43±0.03
67
表 4-6 同日分析及異日分析 CV％值
CV％：SD / Mean ( n=3 )
同日 Intra-day CV(％)
異日 Inter-day CV(％)
美白劑 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 50μg/ml 100μg/ml 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 50μg/ml 100μg/ml
維生素 C 2.69 3.04 0.23 1.13 0.43 10.32 1.08 0.75 0.77 1.11
維生素 C 醣苷 1.12 1.91 0.59 1.82 0.70 6.97 2.68 1.87 0.005 0.96
麴酸 0.75 1.68 0.76 0.34 0.10 0.41 1.48 2.15 0.65 1.14
熊果素 0.30 2.59 1.30 3.19 1.51 3.59 2.51 7.63 0.53 0.04
對苯二酚 1.88 1.28 0.31 0.27 0.11 1.20 1.43 1.39 1.15 1.29
維生素 C 磷酸鎂鹽 2.25 0.80 1.64 0.52 0.71 2.66 4.29 2.60 4.42 1.87
3-氧-乙基維生素 C 0.50 0.53 0.16 1.16 0.19 2.48 2.70 2.68 1.15 0.78
68
表 4-7 市售樣品含量測定
( n=3 )
樣品編號 產品成分表中標示美白劑 標示含量(％) 平均測得濃度(％) 添加量(％) 添加回收率(％)
01 熊果素 --- 3.33±0.04 3.5 97.67±1.8
維生素 C 磷酸鎂鹽 --- 未測得 1 104.45±4.1
02 維生素 C 醣苷 --- 0.01±0.001 0.05 103.08±5.0
03 熊果素 6％ 6.05±0.04 6 98.24±1.09
3-氧-乙基維生素 C --- 0.53±0.004 0.5 104.78±5.7
04 維生素 C 5％ 5.08±0.13 5 99.20±2.9
69
第五章 結論
本研究主要是同時且快速分離七種美白劑-維生素 C、維生素 C
醣苷、維生素 C 磷酸鎂鹽、三氧乙基維生素 C、麴酸、熊果素、對苯
二酚，經過參數探討，建立了離子對高相液相層析條件，以 Agilent
HC-C18 4.6×250mm，5μm 為靜相，0.05M KH2PO4、0.2mM TBAH :
Methanol 96:4(v/v)作為移動相，偵測波長為 264nm，注射量 20μl，流
速 1ml/min，在 21 分鐘內所有分析物都達到有效的分離。線性方程式
相關係數(R2)均在 0.9993 以上。在樣品前處理上只需使用去離子水
(Deionized water)做為溶劑操作上更為安全且較低汙染。
將此研究結果運用在市售美白產品檢測，維他命 C、熊果素檢出
含量與包裝上所標示含量相符，其他未標示含量美白劑其檢測結果也
都在法規標示含量之內。樣品回收率 97.61-104.78％。
本研究所建立七種美白劑分析方法與 2011 年由 A. C. Wang 等人
所建立五種美白劑分析結果相較，雖然都是採用離子對層析法本實驗
只需等度沖提，移動相溶劑以甲醇取代乙腈，層析時間在 22 分鐘內
七種美白劑都能達到有效分離，與後者相較之下節省 30 分鐘。
70
參考文獻
[1] S. Saima, P. Zahida, and A. Zeeshan, et al. Qualitative and Quantitative Estimation of Hydroquinone in Skin Whitening Cosmetics. Journal of Cosmetics,Dermatological Sciences and Applications, 2012;2: 224-228.
[2] X. G. Zhou, W. S. Chen, Y. Y. Cai. This research probes by added
of Hydroquinone and Mercury salts compounds in a commercial whitening cosmetic. Ann.Rept NLFD,Taiwan R.O.C.1995;336-342.
[3] C. Alberto, S. Judit , and B. Ángel, et al. A gas chromatography–
mass spectrometric method to determine skin-whitening agents in cosmetic products. Contents lists available at Science Direct.2010;81:530-536.
[4] S. Rauf, A. Kazi, and T. G. Afridi, et al. Highly sensitive
spectrometric method for determination of hydroquinone in skin lightening creams: application in cosmetics International Journal of Cosmetic Science.2011;33:132-137.
[5] B. N. Barsoom, A. M. Abdelsamad, N. M. Adib. Indirect
spectrophotometric determination of arbutin, whitening agent through oxidation by periodate and complexation with ferric chloride. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy .2006;64(4):844-852.
[6] C. C. Wang, S. M. Wu. Simultaneous determination of l-ascorbic
acid, ascorbic acid-2-phosphate magnesium salt, and ascorbic acid-6-palmitate in commercial cosmetics by micellar electrokinetic capillary electrophoresis. Analytica Chimica Acta.2006;576:124-129.
71
[7] S. Jang, Y. Kim. Analysis of hydroquinone and its ether derivatives by using micellar electrokinetic chromatography (MEKC). Bulletin of the Korean Chemical Society. 2005; 26: 819-882
[8] 光景武夫，新化妝品化學，合記圖書出版，2006。
[9] 許元昱，李旺祚，郭文勵譯，組織學合，合記圖書出版，1992。
[10] J. M. Pawelek , A.M. Korner. The biosynthesis of mammalian melanin. American Scientist.1982;70:136-145.
[11] F.A. Sanchez, L. J. Rodriguez, and F. C. Garcia, et al. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. Biochimica et Biophysica Acta.1995; 22;1247(1):1-11.
[12] G.A. Burdock, M.G. Soni, and I.G .Carabin, et al. Evaluation of
Health Aspects of Kojic Acid in Food. Regulatory Toxicology and Pharmacology.2001;33:80-101.
[13] L.C. Chang, Application of cosmetic inspectino. Fay far
Publishing Co. Ltd. 1998. [14] A. L. Lorincz, S. Rothman. Annual Review of Medicine.1958;9:
380-420
[15] 衛生福利部食品藥物管理署，化妝品中美白成分鑑別及含量
測定方法，2007。
72
[16] A. Balaguer, A. Chisvert, and A.Salvador, et al. Environmentally friendly LC for the simultaneous determination of ascorbic acid and its derivatives in skin-whitening cosmetics.Journal of Separation Science.2008; 31: 229 - 236.
[17] A.C. Wang ,S. H. Cheng,and C. Sheu, et al. Simultaneous
Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography.
Applied Science and Engineering.2011; 9, 4: 287-299. [18] M. L. Chang, C. M. Chang. Simultaneous HPLC determination of
hydrophilic whitening agents in cosmetic products.
Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2003;33:617-626. [19] W. Thogchai, B. Liawruangrath. Micellar liquid chromatographic
determination of arbutin and hydroquinone in medicinal plant extracts and commercial cosmetic products. International Journal of Cosmetic Science.2013; 1–7.
[20] A.Tai, E. Gohda. Determination of ascorbic acid and its related
compounds in foods and beverages by hydrophilic interaction liquid chromatograph. Journal of Chromatography B. 2007;853:214–220.
[21] I. Rychlińska, S. Nowak.Quantitative Determination of Arbutin
and Hydroquinone in Different Plant Materials by HPLC. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca.2012; 40(2):109-113
[22] D. A. Kostic1, D. C. N.Dokic, and M. N. Mitic. et al. Rapid and
Reliable HPLC Method for the Determination of Vitamin C in Pharmaceutical Samples. Tropical Journal of Pharmaceutical Research.2011; 10 (1): 105-111.
73
[23] M. Xiao, Q. J. Shu. Determination of 3-O-ethyl-ascorbic acid by reversed phase high performance liquid chromatography Samples.
China Surfactant Detergent & Cosmetics.2008;4. [24] W. THONGCHAI, B. LIAWRUANGRATH,and S.
LIAWRUANGRATH. High- performance liquid chromatographic termination of arbutin in skin-whitening creams and medicinal plant extracts. International Journal of Cosmetic Science.2007; 58: 35-44.
[25] Y. Wei, Z. Zhang, Y.Zhang. Simple LC Method with
Chemiluminescence Detection for Simultaneous Determination of Arbutin and L-Ascorbic Acid in Whitening Cosmetics.
Chromatographia.2007; 65: 443–446. [26] P. Fontannaz, T. Kilinc, O. Heudi. HPLC-UV determination of
total vitamin C in a wide range of fortified food products. Food Chemistry .2006; 94: 626–631.
[27] P. E. Konjin, Z. Verjee , and A. V. Levin ,et al. Measurement of
intracellular vitamin C levels in human lymphocytes by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC). Clinical Biochemistry. 2005; 38; 450– 456.
[28] M. O. Masse ,V. Duvallet , and M. Borremans , et al.
Identification and quantitative analysis of kojic acid and arbutine in skin-whitening cosmetics.International Journal of Cosmetic Science, 2001; 23: 219-232.
74
[29] H. L. Cheng, J. Y. Sheu , H.L.Wu. Determination of hydroquinone in cosmetic emulsion using microdialysis sampling coupled with high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2005;38:414–419.
[30] E.Sottofattori, M. Anzaldi, and A. Balbi, et al. Simultaneous
HPLC determination of multiple components in a commercial cosmetic cream. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.1998;18:213-217.
[31] A. Semenzato, R. Austria, and C. Dall'Aglio, et al.
High-performance liquid chromatographic determination of ionic compounds in cosmetic emulsions: application to magnesium ascorbyl phosphate. Journal of Chromatography A.1995; 705:385-389.