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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（９）：３８４４

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技术与方法

Ｅ．ｃｏｌｉＴ蛋白 ＣＭ的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

芮　斌　谢长林　江　娜　文　汉（安徽农业大学生命科学学院　合肥　２３００３６）

摘要　越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中的分支酸变位酶（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅｍｕｔａｓｅ，ＣＭ）有着密切的关系，因此ＣＭ成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶标酶。采用分子克隆的方法，在感受态细胞ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）中重组表达大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ蛋白的ＣＭ（ＣＭＴ）。通过ＮｉＮＴＡ亲和层析柱、ＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５凝胶过滤层析柱和 ＧＥＭｏｎｏＱ阳离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白，质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶

体试剂盒的初步筛选，在３０％ ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃｐＨ４．６，２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ条件中发现

ＣＭＴ晶体。利用核磁共振方法，分析ＣＭＴ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图信息，指导设计ＣＭＴ晶体的优化方

案，成功获得高衍射能力的ＣＭＴ晶体，为ＣＭＴ结构的解析奠定了坚实的基础。关键词　分支酸变位酶　ＣＭＴ　原核表达　ＨＳＱＣ　晶体优化

中图分类号　ＴＱ１３８

收稿日期：２０１３０４１７　　修回日期：２０１３０５０７通讯作者，电子信箱：ｌｉｆｗｅｎ１０００＠１６３．ｃｏｍ

　　莽草酸途径是生成芳香族氨基酸、泛醌、甲酸、维

生素Ｅ和维生素Ｋ等多种代谢产物的共同途径，在植

物和微生物的合成代谢中起着重要的作用。哺乳动物

的细胞中不存在莽草酸途径，其自身也无法合成芳香

族氨基酸［１］。分支酸变位酶（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅｍｕｔａｓｅ，ＣＭ）

是莽草酸途径中催化分支酸变构，使其走向苯丙氨酸

（Ｐｈｅ）和酪氨酸（Ｔｙｒ）合成途径的重要功能酶［２］。许多

致病菌的病原性与生物体内的ＣＭ的存在有关，这一特

点使ＣＭ成为了国内外研究人员设计抗生素、抗菌药物

和肺结核等传染性疾病的重要靶标酶［３］。

　　大肠杆菌Ｐ蛋白和Ｔ蛋白是分支酸途径中均含有

ＣＭ的双功能酶。前者具有分支酸变位酶（ＣＭＰ）和预

苯酸脱水酶（ＰＤＴ）活性，参与催化分支酸转化为预苯

酸，再进一步转化为苯丙酮酸，是合成苯丙氨酸的重要

步骤。后者具有分支酸变位酶（ＣＭＴ）和预苯酸脱氢酶

（ＰＤＨ）活性，能够转化分支酸为预苯酸，进而转化为

羟基苯丙酮酸，是合成酪氨酸的重要步骤［４］。尽管在

生物体内催化着同一反应，但 ＣＭＴ与 ＣＭＰ同源性只有

３０％左右。ＣＭＰ的结构已被Ｌｅｅ等［５］解析出来，包含３

个α螺旋，并且其酶活位点、催化机制和抑制分子都已

经被揭示。作为功能相似的 ＣＭＴ，其结构特点，酶活位

点以及催化机制如何，是否和ＣＭＰ的一致，都有待于进

一步的研究和探索。而ＣＭＴ的结构信息是解决这一问

题的重要基础。

　　要获得原子水平上的蛋白质结构，核磁共振波谱

法和Ｘ射线晶体衍射法是结构生物学中两种最主要的

技术。两种技术都有各自的优点和缺点，但又能够互

补。核磁共振波谱法可以在液体或固体的状态下解析

蛋白质的结构，但本身固有的技术缺陷却往往不能得

到高分辨率的蛋白质结构［６］。Ｘ射线晶体衍射法解析

蛋白质结构是建立在高质量蛋白质晶体的基础上，但

很多蛋白很难结晶、不结晶或其晶体无衍射能力［７］。

　　初次筛选得到的晶体往往不能满足衍射的需要，

晶体的后续优化是得到高质量晶体的重要工作。传统

２０１３，３３（９） 芮　斌 等：Ｅ．ｃｏｌｉＴ蛋白ＣＭ的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

的晶体优化主要针对的是晶体成核后的优化，而成核

前的蛋白聚集体的状态（分子的大小、构象等）往往直

接影响着晶体成核的情况［８］，从而对晶体的质量产生重

要的影响。

　　在现有的技术中，ＮＭＲ因其化学位移的超高分辨

率和灵敏性使得核磁共振波谱法在无需预知生物大分

子的任何结构信息情况下就能对其构象特征进行研

究［９］。最重要的是，这种构象特点直接反应了被研究

样品的构象特点，获取的信息对获得高质量晶体有着

非常重要的指导作用，核磁共振波谱法还可以被用于

监测样品的状态、追踪在加入添加剂后样品状态的改

变［１０１１］。这些特点很好的改善了晶体筛选和优化时出

现的“ａｌｌｏｒｎｏｔｈｉｎｇ”的情况［１２］，可以为晶体的优化方案

的选择和设计提供有效直观的信息支持。

　　为了更加深入地了解大肠杆菌 ＣＭＴ的结构信息，

将ＣＭＴ的基因亚克隆至 ｐ２８ａ载体中，转化至 ＢＬ２１

Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）中，经 ＩＰＴＧ诱导表达。ＮｉＮＴＡ亲和层析

柱、ＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５凝胶过滤层析柱和 ＧＥＭｏｎｏＱ阳离

子交换层析柱三步纯化后得到电泳纯的重组蛋白。利

用晶体试剂盒的筛选技术得到蛋白质的初晶，结合核

磁共振波谱法１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图信息，指导建立 ＣＭＴ晶体的优化方案，最终得到了高衍射能力的ＣＭＴ晶体，

为其结构的解析奠定了坚实的基础。

１　材料与方法

１．１　菌株、质粒与培养基

　　菌株与质粒：原核表达载体 ｐ２８ａ和感受态细胞

ＤＨ５α、ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）均由中国科技大学施蕴渝教授

实验室提供。

　　培养基：ＬＢ培养基：１０ｇ／Ｌ蛋白胨，５ｇ／Ｌ酵母提取

物，１０ｇ／Ｌ的ＮａＣｌ，ｐＨ调节至７．０。

　　ＬＲ１４培养基：２４ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４，５ｇ／ＬＮａＯＨ，０．５ｇ／Ｌ１４ＮＨ４Ｃｌ，ｐＨ调节至７．０。０．１ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，２．２ｍｍｏｌ／Ｌ

ＭｇＳＯ４，２．５ｇ／Ｌ葡萄糖 （１１５℃、１５ｍｉｎ），１４０ｍｇ／ｍｌ

ＦｅＳＯ４（０．２２μｍ抽滤灭菌）

　　ＬＲ１５培养基：用１５ＮＨ４Ｃｌ替代 ＬＲ１４中的１４ＮＨ４Ｃｌ，

其他成分同ＬＲ１４。

　　以上培养基未特别注明的均在１２１℃条件下湿热

灭菌２０ｍｉｎ。

１．２　主要试剂和仪器

　　试剂：ＰｒｉｍｅｒＳｔａｒ购自ＴａＫａＲａ公司，限制性内切酶

ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ和 Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，质

粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒是 ＯＭＥＧＡ公司产品，Ｃｈａｐｓ为ＢｉｏｂａｓｉｃＩｎｃ生物工程公司产品。　　仪器：ＰＣＲ仪为 ＢｉｏＲａｄＣ１０００，纯化系统为 ＧＥＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ，核磁谱仪为安捷伦科技公司产品。１．３　引物设计与合成　　结合前期研究的结果和Ｊｐｒｅｄ预测信息，确定 ＣＭＴ的边界为 Ｔｐｒｏｔｅｉｎ的残基 １８９ａａ。以大肠杆菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ１２）原始质粒为模版，设计引物，在上游引物中加入 ＮｄｅＩ酶切位点，下游引物中加入 ＸｈｏＩ

酶切位点，并在前段加入相应的保护碱基。

　　上游引物ＣＭａ：５′ＡＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＡＴ３′　　下游引物ＣＭｂ：５′ＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧ３′　　（下划线为酶切位点）。引物由上海华大基因有限

公司合成。

１．４　表达载体的构建与测序１．４．１　目的基因ＣＭＴ的扩增与双酶切　以Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２菌株原始质粒为模版，采用 ＣＭａ和 ＣＭｂ为引物，对ＣＭＴ目的基因进行扩增。　　ＰＣＲ体系（５０μｌ）：２５μｌ２×ＰｒｉｍｅＳｔａｒ、２μｌ上游引物、２μｌ下游引物、１μｌＥ．ｃｏｌｉ原始质粒和２０μｌｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ程序：９８℃ ５ｍｉｎ；９８℃ ３０ｓ，７２℃ ３０ｓ，共３０循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测，采

用ＯＭＥＧＡ胶回收试剂盒纯化后回收，在３７℃条件下经ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ双酶切处理，产物经１％（ｗ／ｖ）琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。

１．４．２　表达载体 ｐ２８ａ双酶切　抽提原始表达载体ｐ２８ａ，经ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ双酶切处理后，琼脂糖凝胶电泳分离纯化后胶回收目的条带。

１．４．３　连接反应与重组质粒测序　将双酶切后的目的片段和表达载体按８∶１的比例混合，在 Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下，１６℃水浴过夜连接。将连接产物转化至感受态细胞 ＤＨ５α中，并依据质粒所带的抗性（ＫａｎａＲ）进行转化子筛选。将筛选到的阳性菌落保种并送样测序。

１．５　重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定１．５．１　重组蛋白的诱导表达　抽提测序正确的阳性单克隆的质粒，转化至感受态 ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）细胞中，涂布于含５０μｇ／ｍｌＫａｎａ抗生素的 ＬＢ筛选平板上，

置于恒温箱３７℃过夜培养，挑取单克隆于５ｍｌＬＢ培养

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．９２０１３

基中（含５０μｇ／ｍｌＫａｎａ），过夜后扩大培养。诱导条件

经优化后，确定为３７℃、０．３ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ、５ｈ，在上清液

可获得大量的重组蛋白。

１．５．２　重组蛋白的纯化与鉴定　用 ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ

（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ８．０，５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）重悬收集到

的菌体，冰浴超声破碎１０ｍｉｎ后，１３０００ｒ／ｍｉｎ３０ｍｉｎ离

心收集上清液。将上清液载入用ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ预平衡

的ＮｉＮＴＡ亲和柱中，用 ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ和含３０ｍｍｏｌ／Ｌ

咪唑的缓冲液（ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ）依次洗涤杂蛋白，再用

３００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑缓冲液（ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）洗涤融合蛋白。

将 ３００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱液浓 缩 至 ５ｍｌ上 样 ＧＥ

Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５柱，收集目的峰蛋白质溶液，ＳＤＳＰＡＧＥ凝

胶电泳检测蛋白纯度与状态。再将融合蛋白溶液浓缩

至５ｍｌ并透析至低盐 Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ８．０，

１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）中，上样阳离子交换层析柱 ＭｏｎｏＱ

柱，高盐Ｂｕｆｆｅｒ与 ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ成分一致。收集各接

样管的蛋白溶液，电泳检测纯度，收集纯度达到电泳纯

标准的样品，同时送样质谱鉴定。

１．６　重组蛋白晶体试剂盒的初步筛选

１．６．１　结晶的蛋白样品准备　根据前期测定的 ＣＭＴ的溶解度特性，确定作为首批蛋白质晶体试剂盒筛选

的样品浓度为４０ｍｇ／ｍｌ和２０ｍｇ／ｍｌ，蛋白溶液的缓冲

液成分为：２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ８．０，２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ。

１．６．２　结晶条件的筛选　采用ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ公司

的 ＩｎｄｅｘＳｃｒｅｅｎ试剂盒；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓ公司的

ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｃｒｅｅｎ（１和２）试剂盒；ＥｍｅｒａｌｄＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ

公司的 Ｗｉｚａｒｄ（Ⅰ 和 Ⅱ）试剂盒；Ｓｉｇｍａ公 司 的

ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎＫｉｔｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＣｏｍｐｌｅｘｅｓ试剂盒，

共计３４０个条件。

　　结晶方法：坐滴结晶法；结晶体系：１μｌＣＭＴ溶液＋

１μｌ平衡液；结晶温度：１０℃，２０℃。

１．７　重组蛋白１５Ｎ标记样品的准备和１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱

图的收集

　　用ＬＲ１５培养基培养重组细菌，１５ＮＣＭＴ的诱导、表

达及纯化步骤与ＣＭＴ的操作一致。将经过阳离子交换

层析纯化后的电泳纯蛋白样品过夜透析至１５ＮＣＭＴ能

够稳定存在的的核磁缓冲液（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４ｐＨ６．８，

２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）中。将透析后的１５ＮＣＭＴ溶液分别浓

缩至１ｍｇ／ｍｌ，２ｍｇ／ｍｌ，４ｍｇ／ｍｌ，８ｍｇ／ｍｌ。向不同浓度的

４５０μｌ蛋白溶液中加入５０μｌ重水（Ｄ２Ｏ）锁场后记１Ｈ１５

ＮＨＳＱＣ谱，记谱的温度为２５℃、探头为５００ｍｏｌ／Ｌ。筛

选添加剂时，逐渐增加添加剂的浓度。

１．８　基于核磁方法指导下的晶体优化

　　根据１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图提供的信息，优化 ＣＭＴ晶

体时将样品浓度控制在４ｍｇ／ｍｌ以下，去垢剂 Ｃｈａｐｓ浓

度控制在０．５％（ｗ／ｖ）以下。结合原始出晶条件３０％

ＰＥＧ ４０００，１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ ｐＨ４．６，２００ｍｍｏｌ／Ｌ

ＮＨ４Ａｃ，运用“网络法”梯度优化蛋白质的出晶条件。

２　结　果

２．１　ＰＣＲ扩增ＣＭＴ的目的基因和重组质粒的测序结

果

　　扩增出的目的基因和预期结果相一致，约 ３００ｂｐ

处有目的条带（图１）。构建的重组质粒的测序结果表

明，目的基因正确连接到载体中，基因序列及读码框均

正确。

图１ＰＣＲ扩增目的基因

Ｆｉｇ．１　ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＣＭＴｂｙＰＣＲ

１：Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔ

ｏｆＣＭＴ；２：ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ

２．２　融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

　　扩大培养ｐ２８ａＣＭＴＧｏｌｄ重组菌至１００ｍｌＬＢ培养

基中，优化后确定的最佳表达条件为３７℃、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ

ＩＰＴＧ、５ｈ。诱导结束后，收集菌体，超声破碎离心取上

清液，经ＮｉＮＴＡ亲和层析纯化，１２％ ＳＤＳＰＡＧＥ电泳

检测后，结果如图２所示。ＣＭＴ在上清液中大量表达，

占总蛋白量的８５％以上。融合蛋白的挂柱效果非常

好，Ｅｌｕｔｉｏｎ洗脱液中的目的蛋白较为干净，但纯度还不

适用于晶体的筛选。

　　将 Ｅｌｕｔｉｏｎ洗脱液浓缩至５ｍｌ上样 ＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５

柱，Ｕ２８０吸收值曲线图如图３所示。从出峰的位置我们

可以计算出目的蛋白的分子量在２０ｋＤａ左右，与前期

实验结果：ＣＭＴ以二聚体的状态存在于缓冲液中相吻

合。峰型尖锐，说明状态较为优良，取峰尖处蛋白样

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２０１３，３３（９） 芮　斌 等：Ｅ．ｃｏｌｉＴ蛋白ＣＭ的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

图２　ＣＭＴ的ＮｉＮＴＡ柱纯化及

Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５柱纯化电泳结果

Ｆｉｇ．２　ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＭＴｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙ

ＮｉＮＴＡｃｏｌｕｍｎａｎｄＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｃｏｌｕｍｎ１：ＣＭＴｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ；２：ＣＭＴｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；３：ＣＭＴｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ；

４：Ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｅｌｕａｎｔ；５：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ；６：Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒｅｌｕａｎｔ；

７：Ｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｅｌｕａｎｔ；８：ＣＭＴｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＧＥｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｃｏｌｕｍｎ

品，１２％ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测后，结果如图２中８所示，

在目的条带相近处仍有一条较为明显的杂带。

　　将收集到的目的蛋白浓缩至 ５ｍｌ，透析至低盐

Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ８．０，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）中，上

样阳离子交换层析ＧＥＭｏｎｏＱ柱，高盐Ｂｕｆｆｅｒ与Ｂｉｎｄｉｎｇ

Ｂｕｆｆｅｒ成分一致。结果如图 ４所示，在 Ｃｏｎｄ％在 ０～

１８ｈ，能成功将目的蛋白和杂蛋白分离，当 Ｃｏｎｄ％处于

１９以上时杂蛋白的条带依然存在，质谱鉴定结果与原

始序列大致吻合。

图３　ＣＭＴＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５柱纯化情况

Ｆｉｇ．３　ＴｈｅＣＭＴｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｂｙ

ＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｃｏｌｕｍｎ

２．３　晶体试剂盒的初筛

　　将阳离子层析分离得到电泳纯的 ＣＭＴ持续浓缩，

发现其溶解度能达到４０ｍｇ／ｍｌ。根据传统晶体试剂盒

筛选工作的经验，选择用于晶体试剂盒筛选的 ＣＭＴ浓

度为４０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ。经过试剂盒的初次筛选，３０ｄ

图４　ＣＭＴ阳离子交换层析纯化及ＳＤＳ电泳检测情况

Ｆｉｇ．４ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＭＴｐｕｒｉｆｉｅｄａｆｔｅｒ

ｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

ａｎｄＳＤＳｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＭ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ

后在 ３０％ ＰＥＧ ４０００，１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ，ｐＨ４．６，

２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ条件中发现晶体如图 ５所示，经

１２％ＰＡＧＥ电泳检测后，确定此晶体为 ＣＭＴ的蛋白质

晶体。通过Ｘ射线衍射仪衍射发现晶体无衍射能力。

梯度优化ＰＥＧ、ｐＨ及 ＮＨ４Ａｃ的浓度，发现所有条件出

现的晶体与原始晶体的晶型相似，且衍射能力无法得

到提高。

图５　３０％ ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃ（ｐＨ４．６），

２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ条件中的ＣＭＴ晶体

Ｆｉｇ．５　ＴｈｅＣＭＴｃｒｙｓｔａｌｉｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ３０％

ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃｐＨ４．６，

２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ

２．４　目的蛋白ＣＭＴ的异核单量子关系（ＨＳＱＣ）

　　利用晶体下游的优化技术对晶体的晶型和衍射能

力没有明显的改善，考虑 ＣＭＴ在缓冲液中的状态是否

１４

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．９２０１３

会对晶体生长有影响。通过记录１５ＮＣＭＴ的１Ｈ１５Ｎ

ＨＳＱＣ谱图可动态的检测蛋白质在缓冲液中的状态。

根据１．７中所述方法获得１５ＮＣＭＴ蛋白相应浓度的样

品，在２５℃、５００ｍｏｌ／Ｌ探头下记录１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图。

从图 ６、７对比的结果可知：当 ＣＭＴ 浓度 ４ｍｇ／ｍｌ

时１Ｈ，１５ＮＨＳＱＣ谱图中谱峰分散均匀，信号较为均一，

说明蛋白质具有一定的二级结构且蛋白溶液均一性良

好。当浓度上升到８ｍｇ／ｍｌ时，ＣＭＴ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱

图中的谱峰明显聚集在中间，信号强弱十分不均。与

图６相比，图７中峰的数目也有所增加。这些都说明蛋

白质已经处于高聚状态，此时的 ＣＭＴ溶液状态非常地

不均一。于是选择性地向８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ中加入不同种

类和浓度的去垢剂，来寻找改善聚合的方法。经过筛

选，从图７与图８的对比结果，可以发现 Ｃｈａｐｓ对 ＣＭＴ的聚合情况有明显的改善，从图８与图９的对比结果，

可以看出Ｃｈａｐｓ浓度过高对蛋白状态有着负面的影响。

图６　４ｍｇ／ｍｌＣＭＴ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ结果

Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ１Ｈ１５ＮＨＳＱＣｒｅｓｕｌｔｏｆ４ｍｇ／ｍｌＣＭＴ

图７　８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ结果

Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅ１Ｈ１５ＮＨＳＱＣｒｅｓｕｌｔｏｆ８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ

２．５　核磁方法指导下的晶体生长及其衍射图谱

　　基于１Ｈ，１５ＮＨＳＱＣ的指导，采用晶体筛选的蛋白

图８　８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ＋０．５％Ｃｈａｐｓ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ结果

Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ１Ｈ１５ＮＨＳＱＣｒｅｓｕｌｔｏｆ

８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ＋０．５％Ｃｈａｐｓ

图９　８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ＋１．０％Ｃｈａｐｓ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ结果

Ｆｉｇ．９Ｔｈｅ１Ｈ１５ＮＨＳＱＣｒｅｓｕｌｔｏｆ

８ｍｇ／ｍｌＣＭＴ＋１．０％Ｃｈａｐｓ

质浓度为 ４ｍｇ／ｍｌ和 ２ｍｇ／ｍｌ，再进行 ＰＥＧ、ｐＨ及

ＮＨ４Ａｃ优化的，对添加到 ＣＭＴ溶液中的 Ｃｈａｐｓ进行了

梯度的优化。最终在２６％ ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃ

（ｐＨ５．０），１６０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ，０．３％Ｃｈａｐｓ条件下发现

衍射能力达２埃的晶体，晶体图片如图１０所示，Ｘ射线

衍射图谱如图１１所示。

３　讨　论

　　分支酸变位酶催化分支酸转化成预苯酸，为苯丙

氨酸与酪氨酸的合成提供前体。这种酶促反应十分特

殊，因 为 它 是 克 莱 森 重 排 （ｐｅｒｉｃｙｃｌｉｃ ｃｌａｉｓｅｎ

ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）代谢中的特例［１３］。不同种属的分支酸

变位酶成为国内外研究人员热门的研究对象，其中对

结核分支杆菌的ＣＭ研究最为深入，它的结构、酶活位

２４

２０１３，３３（９） 芮　斌 等：Ｅ．ｃｏｌｉＴ蛋白ＣＭ的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

图１０　优化后ＣＭＴ晶体

Ｆｉｇ．１０　ＴｈｅＣＭＴｃｒｙｓｔａｌａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

图１１　优化后ＣＭＴ晶体的衍射图谱

Ｆｉｇ．１１　ＴｈｅｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｔｈｅＣＭＴ

ｃｒｙｓｔａｌａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

点、催化机制以及抑制分子的筛选合成和衍化都已经

取得了初步的成果，对新型肺结核药物的开发有着重

要的意义［１４１５］。目前对于大肠杆菌 Ｔ蛋白中的 ＣＭ研

究还相对较少。

　　实验利用ＰＣＲ技术，构建了ｐ２８ａＣＭＴ原核表达载

体，转化进 ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）感受态细胞中，获得了高

效可溶性表达的 ＣＭＴ。经过 ＮｉＮＴＡ柱纯化后纯度较

高，但未达到电泳纯的标准。据 ＣＭＴ在 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５中

的出峰位置可确定重组表达的ＣＭＴ以二聚体的形式存

在于缓冲液中。但是，通过电泳检测发现，分子筛纯化

不能将ＣＭＴ与其分子量十分相近的杂蛋白进行有效的

分离。最后，通过阳离子交换层析的纯化方法获得电

泳纯的ＣＭＴ样品。

　　获得电泳纯的 ＣＭＴ样品后，经过初步的蛋白质晶

体试剂盒的筛选，３０ｄ后在３０％ ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／Ｌ

ＮａＡｃｐＨ４．６，２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ条件下发现晶体，通过

电泳检测确定为 ＣＭＴ的蛋白质晶体。随后，在进行传

统的蛋白质晶体的下游优化时，始终未能得到理想的

具有衍射能力的晶体。影响蛋白质晶体质量的因素有

很多，目前为止没有任何一套理论适用于每个晶体的

生长。对于蛋白质晶体的优化，大部分的工作都聚焦

在下游优化上。

　　除了结晶条件是影响蛋白质晶体质量的因素外，

ＣＭＴ溶液的均一性也是重要的影响因素。相比较传统

的检测蛋白质均一性技术，如在晶体优化中运用最多

的动态光散射技术，核磁共振技术可以在检测水平上

精确监测蛋白质分子的每一个氨基酸残基的化学位移

变化，从而反映蛋白质溶液的特性。特别在复合物晶

体的优化方面，核磁技术能够检测分子之间的作用界

面，可以通过修饰作用界面的氨基酸残基的方式，提高

亲和力，促进复合物晶体的生长。通过对 ＣＭＴ进行１５Ｎ

标记，记录其１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图，谱图中每一个交叉峰

代表重组蛋白的一个氨基酸，谱峰的变化可以直接说

明重组蛋白的构象和状态的变化［７］。通过对 ＣＭＴ的１Ｈ１５ＮＨＳＱＣ谱图的分析，发现当 ＣＭＴ的浓度在

４ｍｇ／ｍｌ时，谱峰分散均匀，信号较为均一，说明重组蛋

白折叠正确有着一定的二级结构。但当浓度上升到

８ｍｇ／ｍｌ时，谱峰堆积严重，谱峰数明显增多，说明蛋白

质存在严重的聚合。随后，向聚合的 ＣＭＴ样品中添加

了不同的去垢剂，发现 Ｃｈａｐｓ对 ＣＭＴ的聚合有较大的

改善。

　　研究最终确定将晶体优化时 ＣＭＴ的浓度控制在

４ｍｇ／ｍｌ以下，同时向溶液中加入不同浓度的 Ｃｈａｐｓ。

通过对结晶的溶液成分进行“网络法”筛选，在２０℃温

度下，２６％ ＰＥＧ ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃｐＨ ５．０，

１６０ｍｍｏｌ／ＬＮＨ４Ａｃ，０．３％Ｃｈａｐｓ条件里发现衍射能力

达２埃左右的蛋白质晶体。这为ＣＭＴ晶体结构的解析

奠定了坚实的基础，也为如何利用核磁共振波谱学指

导蛋白质晶体优化提供了新的思路。

致谢　感谢中国科技大学施蕴渝教授全体研究组、安

徽大学葛宏华副教授对本次实验的支持和指导。

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