evaluación de nuevas aplicaciones de arribazones de...

Evaluación de nuevas aplicaciones de arribazones de Posidonia oceanica en la agricultura

Tania González Ruíz

https://www.ua.es/

http://www.eltallerdigital.com/es/index.html

EVALUACIÓN DE NUEVAS APLICACIONES

DE ARRIBAZONES DE Posidonia oceanica

EN LA AGRICULTURA

Tania González Ruiz

Tesis Doctoral

Alicante, Junio 2019

TESIS DOCTORAL:

EVALUACIÓN DE NUEVAS APLICACIONES DE ARRIBAZONES

DE Posidonia oceanica EN LA AGRICULTURA

Memoria presentada por Dña. TANIA GONZÁLEZ RUIZ para optar al grado de

Doctora en Ciencias Experimentales y Biosanitarias.

Dña. Tania González Ruiz

Alicante, 2019

Departament d’Agroquímica, Bioquímica

Departamento de Agroquímica, Bioquímica

Dr. D. Roque Bru Martínez, Director del Departamento de Agroquímica y Bioquímica

de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Alicante.

Certifica:

Que la memoria adjunta, titulada “Evaluación de nuevas aplicaciones de

arribazones de Posidonia oceanica en la agricultura” presentada por Dña. Tania

González Ruiz, para aspirar al grado de Doctora por la Universidad de Alicante, ha

sido realizada en este Departamento bajo la dirección de la Dra. Dña. Mª del Mar

Cerdán Sala y Dr. D. Antonio Sánchez Sánchez.

Y para que conste a los efectos oportunos expido el siguiente certificado en Alicante,

2019.

Dr. D. Roque Bru Martínez

Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular

Departament d’Agroquímica, Bioquímica

Departamento de Agroquímica, Bioquímica

Trabajo presentado para optar al Grado de Doctora en Ciencias Experimentales y

Biosanitarias, Línea de investigación Suelos y Nutrición Vegetal.

Fdo. Dña. Tania González Ruíz.

DIRECTORES:

Fdo. Dra. Mª del Mar Cerdán Sala Fdo. Dr. Antonio Sánchez Sánchez

Profesores Contratados Doctores de Edafología y Química Agrícola de la

Facultad de Ciencias de la Universidad de Alicante.

A mis abuelas,

A mis padres,

A Damián,

A Lucas,

Y a mi pequeño Le.

“Si crees que puedes, ya estás a medio camino” (T Roosevelt.)

AGRADECIMIENTOS

Porque ya se sabe que es de bien nacida ser agradecida,…quiero empezar

dando las gracias a mi directora y tutora Mar, ella fue en la primera persona en la que

pensé cuando me planteé el realizar la tesis, y es que las prácticas de edafología que

impartió en biología, me dejaron un regustillo muy bueno y lo que para mí en un

principio era tierra o arena lo convirtió en suelo, por lo que empecé a darle la

importancia que realmente se merecía.

También le agradezco a mi director a Antonio dicha oportunidad, ya que el

tándem formado por los dos ha hecho mucho más enriquecedora mi experiencia, mis

conocimientos y mi trabajo.

No menos importantes son Paco e Isabel porque sin la ayuda de ellos y los

chistes malos de Paco, todo me hubiese costado el doble de esfuerzo.

Gracias a Idoia, profesora mía de ecofisiología vegetal, por escucharme,

ayudarme y acordarse de mí para las cosas importantes (puestos de trabajo,

convocatorias de becas, etc…).

A mi Javi y mi Ana, compañero y monitora de piscina, porque entre largo y

largo y la “charraera for you” era la mejor forma de desconectar cuando me atascaba

en algún experimento y “todo lo malo” se quedaba en el agua.

A mis padres y Damián, por no dejar que tirase la toalla en ningún momento,

animarme, comprenderme y aguantar mis bajadas y mal humor, aunque he de decir

que cada vez que me preguntabais cómo iba la tesis me sentaba fatal.

Sin ninguna duda, a mi pequeño Le, por acompañarme en todas las caminatas

de una hora por el monte cuando estaba saturada de tanto ordenador.

Y por supuesto, a la última personita en incorporarse a mi familia, Lucas, que

me ha dado el último y más grande de los empujones para poder finalizar esta tesis,

hay bebés que nacen con un pan debajo del brazo y tú…pues con una tesis.

A mis profesoras de instituto, a Concha de biología, por confiar en mí y

animarme a ser bióloga y a Encarna de química, porque tus “suspendida,

suspendidísima” delante de toda la clase cada vez que me salía mal un examen, no

me hundieron en la miseria, al revés, me hizo más fuerte.

ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………... 3

I.1. POSIDONIA OCEANICA……………………………………………………………... 3

I.1.1. Características morfológicas de la Posidonia oceanica………………... 3

I.1.2. Ciclo vital de Posidonia oceanica…………………………………………. 4

I.1.3. Problemática de arribazones de Posidonia oceanica en playas……… 6

I.1.4. Actuales usos de los arribazones de Posidonia oceanica……………... 7

I.2. ENMIENDAS AGRÍCOLAS…………………………………………………………... 8

I.2.1. Tipos de enmiendas………………………………………………………... 8

I.2.2. Propiedades y funciones de las enmiendas…………………………….. 9

I.3. SUSTRATOS DE USO EN AGRICULTURA…………………………………......... 12

I.3.1. Tipos de sustratos………………………………………………………….. 13

I.3.2. Propiedades de los sustratos……………………………………………… 14

I.3.3. Tendencias en el uso de sustratos……………………………………….. 16

I.4. ELICITORES O INDUCTORES DE DEFENSA EN VEGETALES…………......... 16

I.4.1. Elicitores en condiciones de estrés abiótico…………………………….. 18

I.4.2. Extractos vegetales………………………………………………………… 19

I.5. EL CULTIVO DEL TOMATE…………………………………………………………. 22

II. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL……………………………... 27

II.1. OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 27

II.2. PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL……………………………………………… 28

III. EXPERIENCIA 1: EMPLEO DE ARRIBAZONES DE Posidonia oceanica

COMO ENMIENDA ORGÁNICA……………………………………………………....... 33

III.1. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….. 33

III.1.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de

Posidonia oceanica como enmienda orgánica…………………………………………. 33

III.1.1.1 Caracterización físico-química de Posidonia oceanica……... 33

III.1.2. ENSAYO 2: Evaluación de la composición de lixiviados procedentes

de suelos agrícolas enmendados con Posidonia oceanica…………………………… 37

III.1.2.1. Caracterización de los lixiviados……………………………… 39

III.1.3. ENSAYO 3: Evaluación del efecto de los lixiviados de suelos

enmendados con Posidonia oceanica en la germinación de Lycopersicum

esculentum Mill…………………………………………………………………………….. 40

III.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………... 43

III.2.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de

Posidonia oceanica como enmienda orgánica…………………………………………. 43

III.2.2. ENSAYO 2: Evaluación de la composición de lixiviados procedentes

de suelos agrícolas enmendados con Posidonia oceanica…………………………… 46

III.2.3. ENSAYO 3: Evaluación del efecto de los lixiviados obtenidos de

suelos enmendados con Posidonia oceanica en la germinación de Lycopersicum

esculentum Mill…………………………………………………………………………….. 57

III.3. CONCLUSIONES……………………………………………………………………. 61

IV. EXPERIENCIA II: EMPLEO DE ARRIBAZONES DE Posidonia Oceánica

COMO SUSTRATO DE CULTIVO………………………………………………………. 65

IV.1. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….. 65

IV.1.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de

Posidonia oceanica como sustrato de cultivo…………………………...……………… 65

IV.1.2. ENSAYO 2: Desarrollo de plantas de tomate empleando Posidonia

oceanica como sustrato de cultivo……………………………………………………..... 67

IV.1.2.1. Parámetros de crecimiento de cultivo……………………….. 71

IV.1.2.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales……………………… 71

IV.1.2.3. Parámetros de calidad del fruto………………………………. 73

IV.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………….. 79

IV.2.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de

Posidonia oceanica como sustrato de cultivo…………………………………………... 79


oceanica como sustrato de cultivo………………………………………………………. 80

IV.2.2.1. Parámetros de crecimiento de cultivo……………………….. 80

IV.2.2.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales……………………… 87

IV.2.2.3. Parámetros de calidad del fruto………………………………. 94

IV.3. CONCLUSIONES…………………………………………………..……………….. 109

V. EXPERIENCIA III: EFECTO DE LA APLICACIÓN DE EXTRACTOS

ACUOSOS DE Posidonia oceanica SOBRE EL DESARROLLO VEGETAL......... 113

V.1. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………... 113

V.1.1. ENSAYO 1: Obtención y caracterización de extractos de Posidonia

oceanica……………………………………………………………………………............. 113

V.1.2. ENSAYO 2: Efecto de la aplicación de extractos acuosos de

Posidonia oceanica sobre la germinación de semillas de tomate SENY F1………... 115

V.1.3. ENSAYO 3: Efecto de la aplicación foliar de extractos acuosos de

Posidonia oceanica a plantas de tomate sometidas a estrés salino…………………. 116

V.1.3.1. Parámetros morfológicos………………………………………. 119

V.1.3.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales………………………. 119

V.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………… 123

V.2.1. ENSAYO 1: Obtención de extractos acuosos de Posidonia

oceanica…………………………………………………………………………………….. 123

V.2.2. ENSAYO 2: Efecto de la aplicación de extractos acuosos de

Posidonia oceanica sobre la germinación de semillas de tomate SENY F1………... 124


Posidonia oceanica a plantas de tomate sometidas a estrés salino……………........ 125

V.2.3.1. Parámetros morfológicos………………………………………. 125

V.2.3.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales………………………. 129

V.3. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….. 143

VI. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………... 147

1

I. INTRODUCCIÓN

Introducción

3

I. INTRODUCCIÓN

I.1. POSIDONIA OCEÁNICA

I.1.1. Características morfológicas de la Posidonia oceanica

Posidonia oceanica es una especie endémica del mar Mediterráneo (Ruiz,

2000). Puede presentarse desde la superficie hasta los 30-40 m de profundidad, en

función de la transparencia de las aguas (Pérès y Picard, 1964). Como se muestra en

la Figura I.1, es una planta superior que dispone de hojas, tallo y raíces además de

desarrollar flores y frutos. Las hojas son alargadas en forma de cinta de

aproximadamente 1 cm de ancho y de longitud variable, siendo las hojas centrales

más jóvenes y cortas que las de los extremos (Díaz y Marbà, 2009).

Figura I.1. Morfología de Posidonia oceanica (Modificado de Mazzella et al., 1986).

Respecto a sus requerimientos ecológicos, se trata de una planta bastante

exigente, debido a que no tolera grandes variaciones de salinidad, como demostraron

Sandoval et al. (2012) en un estudio donde plantas de Posidonia oceanica fueron

sometidas a un estrés hipersalino. Este carácter estenohalino hace que no se

encuentre en lagunas salobres ni en zonas próximas a desembocaduras de ríos (De

Muro et al., 2015).

Evaluación de Nuevas Aplicaciones de Arribazones de Posidonia oceanica en la Agricultura

4

Se le podría considerar una planta bioindicadora de aguas limpias y bien

oxigenadas, ya que es muy sensible a la eutrofización, y tampoco tolera altas tasas de

sedimentación (Peirano y Bianchi, 1995).

Posidonia oceanica se encuentra formando extensas praderas en forma de

cinturones más o menos continuos a lo largo del litoral, o formando manchas de pocos

metros cuadrados (López-Rubio et al., 2010), y suele crecer sobre sustrato arenoso,

aunque también pueden hacerlo sobre un terreno rocoso (Green y Short, 2003).

Como se ha dicho anteriormente, las praderas de Posidonia oceanica son

endémicas del mar Mediterráneo, las más extensas y mejor conservadas se

encuentran en el archipiélago balear y frente a la costa levantina. Se calcula que

ocupan entre 2,5 y 4,5 millones de hectáreas sumergidas (Pasqualini et al., 1998); un

25% del fondo mediterráneo de profundidad somera (hasta los 45 m) (Procaccini et al.,

2003).

I.1.2. Ciclo vital de Posidonia oceanica

Esta fanerógama marina, presenta un ciclo anual de crecimiento, caracterizado

por el desarrollo, crecimiento y pérdida de las hojas. Dichos procesos no se realizan a

la vez en todas las praderas, ya que dependerá de las condiciones ambientales y

climáticas de cada zona (Sánchez et al., 1993). En primavera, al aumentar la

temperatura, las hojas crecen; en verano, las hojas alcanzan su longitud máxima, y

son colonizadas por organismos y algas epífitas. En otoño, la disminución de la

temperatura del agua y los temporales provocan que la planta pierda sus hojas. Es en

otoño cuando la planta dispone de pocas hojas (Medina et al., 2001), siendo el

crecimiento mínimo debido a las bajas temperaturas (MAGRAMA, 2016). Durante los

meses de invierno y principio de la primavera es cuando los arribazones de hojas

muertas y rizomas son fáciles de ver en la costa mediterránea.

Su reproducción puede ser sexual por disponer de flores hermafroditas (Luque y

Templado, 2004), aunque la floración en Posidonia no se realiza todos los años, esto

dependerá, como ya se apuntó anteriormente, de las condiciones ambientales y del

buen estado de la pradera (Mazzella et al., 1984). La aparición de las flores suele

darse en los meses de septiembre y noviembre, la cual, dará lugar a un fruto “la

aceituna de mar”, entre marzo y junio (Propuesta de WWF/Adena, 2000). La

reproducción también puede ser asexual, propagándose la pradera a través de

Introducción

5

estolones, siendo más común esta última (Celdrán, 2011). Como se puede observar

en la Figura I.2, las praderas de Posidonia oceanica del litoral mediterráneo juegan un

papel importante en la dinámica sedimentaria, ya que sus raíces mantienen el

sedimento inmóvil (Boudouresque et al. 2012), son importantes zonas de cría y refugio

de muchas especies animales (Batiato et al., 1982; Pérez-Llorens et al., 2014), y de

producción de oxígeno (Felisberto y Jesús, 2015).

Son numerosas las amenazas que afectan a las praderas de Posidonia

oceanica, por un lado, la turbidez que disminuye la transparencia del agua afectando

negativamente a la fotosíntesis de ésta (Ruiz y Romero, 2004), por otro, al crecer a

poca profundidad a menudo se ve afectada por el fondeo de embarcaciones y la pesca

ilegal de arrastre, desarraigando la planta (Marbà et al., 2007; Boudouresque et al.,

2009; Balaguer et al., 2011). La aparición de algas invasoras en aguas mediterráneas

como Caulerpa racemosa o Lophocladia lallemandii también ejercen un efecto

negativo sobre las praderas de Posidonia oceanica (Ballesteros et al., 2007; Sureda y

Box, 2008).

Figura I.2. Importancia ecológica de las praderas de Posidonia (Modificado de Espino

et al., 2008).

Suministra alimento

y refugio

Aumenta y

conserva

Lugar de puesta y

reclutamiento de

muchas especies

Alta productividad

Contribuye al reciclaje

de los nutrientes

Funciones

ecológicas de

Posidonia oceanica

Exportan materia

orgánica y enriquecen

otros ecosistemas

litorales

Conservación

geomorfológica

del litoral

Amortiguan el efecto del oleaje

y las corrientes, estabilizan los

sedimentos, evitan la erosión y

conservan las playas


6

Actualmente, las praderas de Posidonia oceanica están protegidas a nivel

europeo como hábitat prioritario (Directiva 92/42 CEE 21/05/92 y 97/62/CE

27/10/1997) y como especie (Convención de Berna, Anexo 1); a nivel nacional (Real

Decreto 1997/1995) y por la legislación de varias comunidades autónomas (DOGC

nº1479 del 12/08/91), así como la de distintos países del Mediterráneo. Su protección

se considera como prioritaria en el Convenido Internacional para la Diversidad

Biológica e incluso su valor se ha reconocido también en la Declaración de la Isla de

Ibiza como Patrimonio de la Humanidad.

Por último, el Reglamento de Pesca de la Unión Europea para el Mediterráneo

(Reglamento CE 1626/94), prohíbe expresamente la pesca de arrastre sobre praderas

de fanerógamas marinas.

I.1.3. Problemática de arribazones de Posidonia oceanica en playas

En el mar Mediterráneo la mayor cantidad de restos vegetales acumulados en

la arena pertenecen a Posidonia oceánica (rizomas, hojas,…), estos se depositan en

nuestras costas al disminuir el oleaje, formando estructuras de pocos centímetros de

espesor a varios metros. Estas estructuras, comúnmente denominadas arribazones,

protegen a la playa de la erosión, su retirada, puede tener un efecto negativo, tanto en

la morfología de la playa, como en los ecosistemas costeros (Rodríguez-Perea et al.,

2000; Mateo et al., 2002; Roig y Martí, 2005).

En el marco jurídico español no existe una normativa específica que verse

sobre la retirada de los arribazones en las costas, pero en algunas regiones, como en

la Región de Murcia, en las playas del Parque Regional de las Salinas y Arenales de

San Pedro del Pinatar, la administración regional solo retira los arribazones en zonas

puntuales, donde no se vea afectada la playa, durante la temporada de verano.

Además, dicha región recogió en la resolución de 24 de julio de 2006 de la Secretaría

General para la Prevención de la Contaminación y el Cambio Climático en la que "se

recomienda no retirar los restos vegetales (arribazones) que se acumulan,

cubriéndolos con arena en el caso de que la afluencia turística exigiera su limpieza"

(BOE-A-2006-14619).

Introducción

7

Se estima que la extracción de 1.000 m3 de arribazones implica la pérdida de

entre 19 y 44 m3 de sedimentos (Guillén et al., 2013). Dicha extracción se realiza

normalmente con máquinas sin sistema de rejilla siendo muy grande el volumen de

sedimentos que se pierde, desequilibrando de forma importante el balance entre la

entrada y salida de sedimentos, hecho importante en playas donde la entrada

sedimentaria es baja (Guillén et al., 2013).

I.1.4. Actuales usos de los arribazones de Posidonia oceanica

Existen numerosas iniciativas en los usos de Posidonia oceánica que es

retirada de la costa: En la costa alicantina, concretamente en la población de Santa

Pola se ha empleado en el sellado de vertederos y recuperación de zonas verdes

(Elmundo.es, 7 de Mayo de 2013). De la misma forma, se estudia para reforestar

especies autóctonas de ambientes salinos y especies forestales adaptadas a elevados

índices de salinidad, debido al alto contenido en silicio de esta planta (Guillén et al.,

2014). Estos arribazones también se utilizan como compost: pueden ser mezclados

con otros residuos orgánicos (Minini et al., 2009) o simplemente lavados con agua

dulce (Montesano et al., 2012).

Dentro de los usos de Posidonia oceánica también destaca su uso en la

construcción, debido a que almacena un 20% más de energía que la madera, también

se emplea como aislante por su capacidad ignífuga (Kost et al., 2013). En la actualidad

se están desarrollando plásticos reforzados con fibra natural (PRFN) basados en

polietileno de origen renovable y fibras de residuos de Posidonia oceanica (Ferrero et

al., 2015).

Muchos centros de investigación europeos estudian la aplicación de esta

fanerógama en farmacia, industria y medio ambiente. Estudios realizados por Gokce y

Heznedaroglu (2008), han demostrado que los extractos de Posidonia oceanica tienen

propiedades antioxidantes, antidiabéticas y vasoprotectoras en ratas. Otros estudios

muestran como los residuos de Posidonia oceanica pueden ser empleados como

materia prima para producir bioetanol, tras la hidrólisis ácida y enzimática de los

mismos (Pilavtepe et al., 2013).


8

Bonet et al. (2012) han realizado trabajos en los que emplean hojas frescas de

Posidonia oceanica como precursora de carbono activo con fines medio ambientales,

tras someterlas a pirólisis. Del mismo modo, se ha demostrado que Posidonia

oceanica presenta una gran capacidad de adsorción y eliminación de fósforo disuelto

en aguas residuales, por lo que podrían ser una alternativa en el tratamiento terciario

de este tipo de aguas y el producto resultante se podría utilizar como fertilizante en

agricultura o como base para la obtención de compost (Wahab et al., 2011).

Investigaciones llevadas a cabo por Carrillo et al. (2014) han puesto de

manifiesto el efecto beneficioso de la sustitución de la paja de cebada, por arribazones

de Posidonia oceanica en la comida de explotaciones de ganado caprino, sin que vaya

en detrimento del peso del animal ni de la calidad de la leche (Carrillo et al., 2002).

Por tanto, debido a la cantidad de usos que se le puede dar a los arribazones,

la acumulación de éstos en vertederos debería ser la última opción.

I.2. ENMIENDAS AGRÍCOLAS

El suelo agrícola es un recurso limitado, cuya degradación supone terminar con

el bien más preciado de los agricultores. Por este motivo, proteger el suelo con un

buen abonado, es de gran importancia para garantizar su fertilidad y su valor agrícola.

En agricultura se llama “enmienda” a las sustancias que se incorporan al suelo,

para cambiar su textura y actuar sobre las reacciones químicas y/o biológicas del

suelo, éstas pueden tener un impacto positivo, mejorando la estructura y el contenido

de materia orgánica del suelo (Wallace, 2008). El empleo de enmiendas ha sido una

práctica ancestral que ha ido evolucionando a la vez que la tecnología agrícola.

I.2.1. Tipos de enmiendas

Los tipos de enmienda vienen recogidos en el Real Decreto 506/2013, de 28 de

junio, sobre productos fertilizantes, donde se las divide en tres grupos:

“Enmienda caliza (cálcica o magnésica): enmienda que contiene calcio y/o

magnesio, esencialmente en forma de óxido, hidróxido, carbonato o silicato, utilizada

Introducción

9

principalmente para mantener o aumentar el pH del suelo o para modificar sus

propiedades físicas.

Enmienda orgánica: enmienda procedente de materiales carbonados de origen

vegetal o animal, utilizada fundamentalmente para mantener o aumentar el contenido

en materia orgánica del suelo, mejorar sus propiedades físicas y mejorar también sus

propiedades o actividad química o biológica.

Otras enmiendas: enmiendas no incluidas en los párrafos anteriores, utilizadas

fundamentalmente para mejorar las propiedades físicas, químicas o biológicas del

suelo.”

I.2.2. Propiedades y funciones de las enmiendas

Las funciones de cada enmienda vendrán dadas por la naturaleza de dicha

enmienda, por lo que el empleo de una enmienda u otra dependerá de la deficiencia

que tenga el suelo a tratar.

Enmiendas orgánicas

La normativa reguladora vigente, el Real Decreto 506/2013, divide las

enmiendas orgánicas en función de su composición, materia orgánica y extracto

húmico total y contenido de humedad. Las principales propiedades de las enmiendas

orgánicas más empleadas en agricultura:

Enmienda húmica: Este tipo de enmienda es interesante, puesto que se aporta

directamente compuestos húmicos al suelo, procedentes de restos animales o

vegetales. Las sustancias húmicas son compuestos de color amarillento a negro,

amorfos, de alto peso molecular y de naturaleza coloidal (MARM, 2010).

La adición de sustancias húmicas al suelo afecta positivamente al crecimiento de las

plantas por lo siguiente:

• Actúan en los procesos de movilización-liberación de micronutrientes (Abad et

al., 2002).

• Reduce la incompatibilidad del terreno (Busby et al, 2007).

• Incrementa la agregación de partículas (McDowell y Sharpley, 2003).


10

• Capacidad de amortiguación y/o fijación de compuestos contaminantes

(Ingelmo y Rubio, 2008).

Turbas: Proceden de las turberas, que son acumulaciones de materia vegetal

degradadas bioquímicamente en condiciones anaeróbicas. La normativa R.D.

506/2013, diferencia dos tipos de turba: 1) la turba herbácea (o negra), formada por

caña y carrizos, que se forma en zonas de llanura, con aguas estancadas y con un

gran contenido en materia orgánica, y 2) la turba de musgo (o rubia) en la que

predomina el género Sphagnum y se origina en zonas frías de gran altitud y elevadas

precipitaciones.

Por su alto contenido en materia orgánica suelen emplearse para recuperar suelos

muy degradados.

Compost: El compost es el resultado de la descomposición microbiológica aeróbica

controlada de residuos orgánicos (Gajalakshmi y Abbasi, 2008). A groso modo en el

compostaje se pueden diferenciar dos fases; una de intensa actividad microbiológica

(compostaje) y otra donde la actividad microbiana va ralentizándose por agotamiento

del residuo (estabilización) (MARM, 2010).

La función principal de las enmiendas orgánicas es aportar materia orgánica al suelo,

para generar humus y así mejorar la fertilidad del suelo. Entre otras funciones están:

• Retención de humedad y disminución de pérdida de agua por percolación tras

el riego. El aumento en la retención de humedad hace que no se den cambios

bruscos en la temperatura del suelo, por lo que directamente da una estabilidad

térmica (Hirzel y Walter, 2008; Pang y Letey, 2000).

• Aumento en la oxigenación del suelo. La adición de materia orgánica

aumentará el tamaño de poro del suelo y buena agregación entre partículas, lo

que permitirá una mejor oxigenación radicular, esencial para el crecimiento de

la planta (Karlen et al., 1997; Fronning et al., 2008).

• Aumenta la eficiencia de la maquinaria de laboreo, puesto que la materia

orgánica disminuye la compactación de las partículas del suelo (Sparling y

Schipper, 2004).

Introducción

11

Se ha demostrado como el uso de compost proveniente de residuos de flores

tiene gran potencialidad en el manejo de suelos ácidos al mejorar sus condiciones

químicas. La aplicación de este compost mejoró significativamente las propiedades del

suelo como el pH, acidez intercambiable, fósforo disponible, materia orgánica y las

relaciones C/N y C/P al inicio de su aplicación, así como la concentración de

micronutrientes en plantas de maíz (Daza, 2014).

Problemas del uso de enmiendas

Aunque las enmiendas son empleadas para mejorar las propiedades del

suelo, en ocasiones podemos encontrarnos con algunos problemas (MARM,

2010).

Las aplicaciones frecuentes de una enmienda pueden llevar a una considerable

adición de sales al suelo, con la consiguiente salinización del medio, lo que podría

generar problemas en la disponibilidad de agua para las plantas, dichas sales también

pueden afectar a algunos procesos microbianos, a la vegetación incipiente o a la

germinación. Aunque si las aplicaciones son esporádicas, dicho efecto no

tendría mucha importancia (Araujo y Monteiro, 2005).

Es importante destacar los problemas de fitotoxicidad asociados a algunos

tipos de enmiendas, estas sustancias presentes o producidas por la enmienda pueden

ser absorbidas y acumuladas en el tejido vegetal (Araujo y Monteiro, 2005), problemas

que en ocasiones han limitado el uso de materiales compostados en agricultura

(Mondini et al., 2003; Earth y Burian, 2013). Por eso es importante conocer el grado de

fitotoxicidad presente en las enmiendas para saber las dosis correctas de aplicación

(Aslam et al., 2008).

Si la materia orgánica que se aplica está poco estabilizada, puede originar

efectos negativos en la vegetación debido a la putrefacción de los residuos. La

utilización de algunas enmiendas, requieren un acondicionamiento previo al trasplante

del cultivo para prevenir efectos fitotóxicos (Campitelli et al, 2008). Además, la

importancia de saber las dosis a aplicar (como ya se ha dicho anteriormente) reside en

evitar problemas de contaminación de las aguas subterráneas por los lixiviados

generados durante la estabilización de la enmienda y problemas de salinidad en los

suelos. Ha de tenerse en cuenta que aparte de la putrefacción de residuos, éstos


12

pueden ir asociados a patógenos presentando un riesgo para la salud humana, así

como también presencia de semillas de malezas (Campitelli et al., 2008).

La aplicación directa de sustancias orgánicas frescas al suelo puede causar

problemas tales como la fermentación, la cual puede producir metabolitos fitotóxicos y

aumentar la temperatura del suelo, disminuir la concentración de N2 disponible y,

producir malos olores.

La estabilidad de algunas enmiendas podría venir dada por el compostaje,

proceso oxidativo controlado por microoganismos, en el cual se estabiliza la materia

orgánica transformándose en una sustancia similar al humus del suelo, libre de

compuestos fitotóxicos (Zucconi y de Bertoldi 1987; Cooperband 2002). Otro efecto no

deseable de la aplicación de residuos orgánicos (tratados o no) es que puede producir

cambios en el pH del suelo, introducir elementos nocivos y compuestos orgánicos

tóxicos en el suelo. Si la concentración de estas sustancias contaminantes es mayor

que la capacidad de detoxificación es cuando aparece el fenómeno de contaminación

(Tan, 1994).

Conocer la caracterización de los lixiviados proporciona al agricultor una

herramienta para potencializar, mejorar la productividad de los cultivos y disminuir los

problemas fitosanitarios y evitando la contaminación de los suelos (Granada y Prada,

2015).

I.3. SUSTRATOS DE USO EN AGRICULTURA

La normativa que regula el uso de sustratos se recoge en el Real Decreto

865/2010, de 2 de julio, sobre sustratos de cultivo y en su posterior modificación Real

Decreto 1039/2012, de 6 de julio, por el que se modifica el Real Decreto 865/2010, de

2 de julio, sobre sustratos de cultivo.

Un sustrato es todo material sólido distinto del suelo, natural o artificial, mineral u

orgánico, que colocado en un contenedor (maceta, bolsa u otro), solo o mezclado,

permite el anclaje del sistema radicular, favoreciendo el suministro de agua, nutrientes

y oxígeno (Calderón, 2006). García (2005) añade a la definición que dicho sustrato ha

de producir “una planta de alta calidad en un tiempo menor, a bajo coste”.

Introducción

13

I.3.1. Tipos de sustratos

Existen distintos criterios de clasificación de los sustratos, en este caso los

clasificaremos en función de la naturaleza de los materiales, así tenemos sustratos

orgánicos e inorgánicos (Abad et al., 2004); y dentro de estos en naturales y sintéticos

(R.D. 865/2010).

Sustratos orgánicos:

• Naturales: suelen ser subproductos de actividades industriales, agrícolas y

urbanas. En algunos se debe aplicar el compostaje para poder emplearlos.

Dentro de estos se incluyen: fibra de coco, corteza de árbol, serrín, cascarilla

de arroz, turba, etc. (Awang et al., 2010).

• Sintéticos: la mayoría son polímeros de síntesis química y no biodegradables.

Aquí se pueden incluir, derivados de plásticos, como las espumas de

poliuretano o el poliestireno expandido (MARM, 2010).

Sustratos inorgánicos:

• Naturales: este grupo engloba: grava, arena y rocas volcánicas, no

biodegradables (Terres et al., 1997).

• Sintéticos: mediante tratamientos físicos se obtienen: lana de roca, vermiculita,

perlita, arcilla expandida, etc... (García et al., 2005; Asaduzzaman, 2013; Salto

et al, 2013; Urrestarazu, 2015).

Una desventaja de los materiales orgánicos en relación a los inorgánicos es

que son susceptibles de continuar su descomposición en mayor o menor medida

(Mendoza et al., 2011).

En ocasiones un material orgánico no cumple o no mejora las condiciones de

crecimiento para un favorable desarrollo en la planta, por lo que se necesita realizar

mezclas con materiales inorgánicos (Cruz-Crespo, 2010), para obtener mejores

condiciones de crecimiento (Baumgarten, 2008).


14

Los sustratos inorgánicos tendrán que ser suplementados con alguna

disolución fertilizante, porque, aunque funcionen como soporte para la planta, no

intervienen en el proceso de absorción de nutrientes, mientras que los orgánicos sí

actúan como depósito de reserva de nutrientes aparte de servir como soporte (Abad et

al., 2004).

I.3.2. Propiedades de los sustratos

Son muchos los materiales que se pueden escoger como componentes de un

sustrato, lo importante es que dicha elección permita un desarrollo radicular óptimo,

por lo que a la hora de inclinarnos por un sustrato u otro es importante conocer la

relación entre la fracción de porosidad que proporciona el agua y la que proporciona la

aireación (Abad et al., 2004).

El comportamiento del sustrato depende de condiciones climáticas, tamaño y

forma de recipiente o contenedor del sustrato, cultivo, sistema de riego, fertilización,

etc. También es necesario que las propiedades físicas y químicas del sustrato se

combinen pero que no se alteren. Para que un sustrato se comporte de manera

adecuada y las propiedades físico-químicas sean las óptimas, es necesario que el

reparto y la composición de las fases sólidas, líquida y gaseosa sea correcta (Gallo y

Viana, 2005).

Propiedades físicas

Las propiedades físicas de un sustrato vienen determinadas por proveer a la

planta de agua, permitir su intercambio gaseoso desde y hacia las raíces, ser

reservorio de nutrientes y soporte físico (Handreck y Black, 2002).

Dentro de estas propiedades podemos destacar la densidad del sustrato, el

espacio de poro y su capacidad de retención de agua, el tamaño y la forma de las

partículas e intercambio gaseoso (Raviv, 2002). Muchos estudios han demostrado la

relación que existe entre tamaño de partícula y la capacidad de retener agua en

distintos sustratos (Marfá et al, 1993; Raviv et a.l, 2001; Fernández y Corá, 2004). Se

considera que un buen sustrato debe tener más del 85% de porosidad (Valenzuela y

Introducción

15

Gallardo 2002). Para cumplir con los requisitos de suministro de agua y aire, los

sustratos han de tener buena capacidad de retención de agua y una porosidad que

sea mayor al 85%, favoreciendo un drenaje relativamente rápido y una aireación entre

el 10 y 30% (Park et al., 2011).

Por otro lado, ensayos realizados por Noguera et al. (2004) en fibra de coco,

corteza de pino y arena, determinaron que un tamaño de partícula de 0,5 mm aporta

cambios importantes y significativos sobre la relación humedad/aire, este tamaño de

partícula hace que se creen poros con un tamaño tal que presentan una capacidad de

retención de humedad favorable, encontrándose el agua fácilmente disponible para las

raíces de las plantas y una capacidad de aireación entre 70-84%, lo que permite que la

compactación del suelo sea menor y como consecuencia no se provoquen daños

mecánicos en las raíces.

De los diferentes tipos de sustratos, los orgánicos naturales son los que se

enmarcan dentro de los objetivos de la presente tesis, de los cuales, la fibra de coco

podría ser uno de los más representativos, es por ello que haremos más hincapié en

dicho sustrato.

Se ha visto que la fibra de coco tiene una capacidad de retención hídrica

elevada, incluso podría llegar a retener 8 veces su peso en agua, aunque no toda el

agua retenida está disponible para la planta (Anicua, 2009), aun así, Zamora-Morales

et al. (2005) demostraron que la fibra de coco mejoraba a parte de la retención de

agua su tasa de infiltración en los cultivos donde se utiliza como sustrato. Su carácter

rígido y el que no se comprima con facilidad, hace que sea un material muy poroso, y

por ende provee de una mejor aireación al sustrato en comparación con la arena

(Ward et al., 1987 citados por Anicua, 2009).

Propiedades químicas

Las propiedades químicas de un sustrato determinan la transferencia recíproca

de elementos entre: sustrato, disolución nutritiva y la raíz de la planta, debida a las

distintas reacciones que se dan en la nutrición vegetal (disolución, hidrolisis,

intercambio de iones, metabolismo) (Nuez, 1995). Las propiedades químicas pueden

ser modificadas durante el ciclo productivo del cultivo, a diferencia de las propiedades

físicas (Cabrera, 1998).


16

La conductividad eléctrica (CE), el pH, la capacidad de intercambio catiónico

(CIC), la concentración de nutrientes disponibles, así como de metales pesados y

elementos tóxicos, son las propiedades químicas más importantes de un sustrato

(Trejo et al., 2007), pese a que en la práctica comercial, las dos propiedades que nos

indican la calidad de un sustrato son únicamente el pH y la CE (Burés, 1997).

Aunque la fibra de coco puede presentar unas propiedades físicas favorables,

no lo son tanto las químicas, ya que se han descrito algunos problemas de exceso de

potasio, sodio o cloro (Zamora-Morales et al., 2005). En general suele utilizarse fresca,

aunque algunos tipos de fibra de coco pueden presentar fitotoxicidad, por lo que es

mejor el compostaje antes de su uso y emplearla en una mezcla, añadiéndose

nitrógeno (Burés, 1997).

I.3.3. Tendencias en el uso de sustratos

El empleo de sustratos en Europa y en el mundo es cada vez mayor, la razón

de su popularidad es por la unión de varios factores, entre ellos está el aumento en el

rendimiento, el control del medio y la posibilidad de prevenir enfermedades (Blok y

Urrestarazu, 2010).

A día de hoy, tanto la flor cortada como los cultivos de hortalizas son cultivadas

mayoritariamente en turba, fibra de coco, lana de roca, perlita, espuma sintética y

minerales volcánicos (Domiño et al., 2009).

Debido al impacto ambiental que supone la extracción de turba, su empleo va

disminuyendo, mientras que el éxito en el uso de la perlita en Grecia y España va en

aumento, aunque aún existen inconvenientes en la fabricación relativos a su tamaño

(Blok y Urrestarazu, 2010).

I.4. ELICITORES O INDUCTORES DE DEFENSA EN VEGETALES

Cuando las plantas reciben cualquier estímulo exógeno, ponen en marcha una

cascada de interacciones donde están implicadas distintos tipos de fithormonas. Estas

hormonas producen una señal que es transportada hasta llegar al núcleo de la célula

Introducción

17

vegetal, allí es donde se producirá la represión o la activación de genes que

responderán a dicho estímulo (Azcon-Bieto et al., 2008).

Normalmente, la exposición de las plantas a condiciones adversas (bióticas y

abióticas), produce un estrés oxidativo, causado por el desequilibrio entre la

acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la lentitud de detoxificación de

dichas moléculas (Arbona et al., 2008). Las plantas para protegerse de estos daños

han desarrollado un mecanismo de defensa antioxidante en el que están implicados

sistemas de defensa enzimáticos (catalasa, ascorbato peroxidasa, superóxido

dismutasa, etc.) y no enzimáticos (compuestos fenólicos, ascorbato, glutatión, y α-

tocoferol) (Szalai et al., 2009).

El concepto clásico de elicitor se refiere a moléculas que inducen la síntesis de

fitoalexinas (metabolitos secundarios que sintetizan y acumulan algunas plantas en

altas concentraciones, después de infecciones de distinta índole ayudando a limitar la

dispersión del patógeno en la planta) sin necesidad de que exista un agente patógeno

(Hahn y Albersheim et al., 1978). Actualmente, esta definición se ha ampliado para

cualquier sustancia que pueda activar los mecanismos de defensa de la planta contra

patógenos (Dzhavakhiya et al, 2016). Estas moléculas pueden ser extractos vegetales

o sus equivalentes sintéticos, así como derivados a partir de hongos, plagas, etc. Por

lo tanto, el término elicitor incluye todo microorganismo o sustancia que, administrada

a la semilla, planta o raíz de forma exógena, es capaz de activar procesos metabólicos

en la planta que mejoren su eficacia nutricional, su calidad y/o su tolerancia a estreses

abióticos y bióticos (Le Mire, 2018).

Los elicitores suelen activar la expresión de genes que codifican el transporte

de nutrientes desde la raíz a los brotes, aumentan el crecimiento radicular (Billard et

al., 1988), estimulan algunos procesos biológicos en las plantas como la fotosíntesis y

la producción de masa foliar (Katiyar et al., 2015; Ghaderi et al., 2015), aumentando

así el rendimiento y la calidad de las cosechas (Ambuludi, 2015).

Es interesante hablar en este apartado del silicio, elemento que pese no a ser

esencial en la nutrición vegetal, diversos estudios han mostrado su capacidad como

elicitor en el crecimiento y desarrollo vegetal (Ma y Yamaji, 2006), o como cereales

sometidos a estrés biótico y abiótico han respondido positivamente tras la aplicación

exógena de silicio (Ma, 2004; Meharg y Meharg, 2015) y como en ausencia de estrés,

el cultivo no se beneficia de dicha aplicación (Van Bockhaven et al., 2013).


18

Ma et al. en 2003, realizó un estudio sobre los efectos de la aplicación de silicio

sobre la resistencia a la sequía en plantas de pepino. Los resultados de dicho estudio

mostraron que el silicio mejoró el rendimiento fotosintético neto y disminuyó la

conductancia estomática, aumentando la retención de agua. Respecto al estrés

oxidativo se mantuvieron los niveles normales de superóxido dismutasa (SOD) y

aumentó la actividad de la catalasa (CAT).Los efectos del elicitor pueden variar en

función de la fase de crecimiento en la que se realiza la aplicación, por lo que el

momento en el que se aplica el tratamiento, habrá que tenerlo en cuenta (Zhao et al.,

2005). También es importante estudiar el comportamiento del cultivo conforme pasa el

tiempo, ya que el aumento de la productividad se da bastante tiempo después de la

aplicación del inductor (Gala et al., 2005).

I.4.1. Elicitores en condiciones de estrés abiótico

Los elicitores en las plantas actúan como señales internas regulando la

respuesta de defensa frente al estrés; algunos de estos compuestos son enzimas

antioxidantes y otros metabolitos secundarios como el ácido salicílico, el metil

jasmonato, la vitamina E, el ácido ascórbico, el α-tocoferol, el glutatión y los

carotenoides (González et al., 2015). Por este motivo, los elicitores podrían convertirse

en una herramienta interesante para mejorar el valor nutricional y las propiedades

organolépticas de los frutos, al mismo tiempo que mejoran su productividad en

condiciones ambientales adversas (Yang et al., 2007, Karuppusamy, 2010;

Ramakrishna y Aswathanarayana, 2011). Se ha demostrado que la aplicación exógena

de elicitores, estimula las respuestas relacionadas con la producción y el desarrollo de

la planta, de la misma forma que cuando esta es sometida a distintos estreses

abióticos aumenta la tolerancia ante dichas condiciones adversas (Mejía-Teniente et

al., 2009).

Bajo diferentes tipos de estrés abiotico, que incluyen bajas temperaturas,

sequía, humedad o salinidad, la aplicación de elicitores puede mitigar los efectos de

dichos estreses mediante la estimulación de enzimas y compuestos que reducen los

niveles de las especies reactivas de oxígeno que se liberan durante el estrés y

amplifican, además, algunas señales que conllevan a la formación y activación de las

hormonas tradicionales que actúan en la célula vegetal (Salvador, P. y Lasserre, T.,

2010).

Introducción

19

Algunas de las ventajas del uso de los elicitores son:

Los elicitores son seguros, biodegradables e inocuos en personas y animales

(Cavalcanti et al., 2005), e incluso los introducimos en nuestra dieta habitualmente (El

Hadrami et al., 2010).

Son de amplio espectro, producen efecto ante condiciones adversas, virus,

bacterias, nematodos, insectos y hongos ya que no producen una resistencia

específica. Los elicitores ricos en polifenoles tienen diferentes funciones, tales como

defensa contra herbívoros y patógenos, soporte mecánico (lignina), atrayentes

polinizadores, mejoramiento del daño UV-B y efectos alelopáticos (Taiz y Zeiger, 1998;

Fumagalli et al., 2006; Iriti et al., 2008). Además, los daños provocados por factores

físicos como la radiación UV-B, el estrés hídrico (Castellarin et al., 2007), la elevada

intensidad luminosa (González et al., 2015), así como las altas temperaturas (Mori et

al., 2001), también podrían limitarse con la aplicación de elicitores a base de

polifenoles.

Otra de sus características es que estimulan la producción de especies

reactivas de oxígeno (ROS) lo que hace que la planta ponga en marcha una cascada

de reacciones enzimáticas con la finalidad de detoxificar a las ROS (Sudisha et al.,

2011).

I.4.2. Extractos vegetales

Los extractos vegetales son preparados líquidos o en polvo obtenidos de la

extracción de los principios activos de los vegetales por técnicas como la destilación y

la maceración entre otras, que tienen como finalidad concentrar sustancias tales como

ácidos grasos, alcaloides, aldehídos, aminoácidos no proteicos, azúcares,

cianohidrinas, esteroides, fenoles, flavonoides, glicósidos, glucosinolatos, furanos,

lignanos, quinonas, taninos, sesquiterpenos y terpenos. Las partes vegetales que se

suelen emplear son las raíces, hojas, flores y semillas (Do Nasciento et al., 2008).

Se ha visto como la aplicación de extractos vegetales aplicados a especies

vegetales mejoran la nutrición mineral en los tejidos de la planta, creando un equilibrio

nutricional, lo cual permite soportar las condiciones de estrés abiótico, como la

salinidad, el estrés hídrico o la sequía, al compensar los nutrientes deficientes en los

tejidos de la planta, alterando las vías de fijación de nitrógeno y carbono (Tighe et al.,

2014).


20

Además tienen efecto insecticida o insectistático con inhibición del desarrollo y

comportamiento de los insectos (Tabla I.1). Asimismo, tienen efecto protector que

incluye repelencia, disuasión de la alimentación u ovoposición, confusión o disrupción

(Silva et. al., 2012). La efectividad de los extractos vegetales está en función de su

composición y la dosis usada.

Tabla I.1. Metabolitos vegetales secundarios utilizados en la defensa de las plantas

Clase Tipo Funciones

Compuestos Nitrogenados

Alcaloides Glucósidos Aminoácidos no proteicos

Afectan al sistema nervioso de los herbívoros Liberan cianuro o compuestos de azufre Afectan a la estructura proteica del herbívoro

Compuestos Fenólicos

Flavonoides Quinonas Taninos

Fitoalexinas Inhiben las plantas competidoras Repelen herbívoros y micrbios

Terpenos

Monoterpenos Sesquiterpenos Esteroides

Insecticidas Fitoalexinas: repelen a los herbívoros Imitan hormonas de los insectos y afectan los ciclos de vida de los insectos

Estos extractos tienen entre sus componentes, elementos antioxidantes como

los polifenoles, fenoles y/o flavonoides, por este motivo son considerados como

inductores de resistencia, ya que dichas sustancias actúan eliminando radicales libres

(Rice-Evans et al., 1997). Algunos extractos como por ejemplo los de Larrea tridentata

contienen resinas y ácidos orgánicos tienen propiedades antioxidantes, citotóxica,

antimicrobianas e inhibidoras de enzimas de la pared de bacterias, micelio y cuerpos

fructíferos de hongos, bloqueando la síntesis de sustancias vitales en la pared, ruptura

y su plasmólisis; afectan el transporte mitocondrial de electrones (Lira, 2002).

Un extracto vegetal muy estudiado es el obtenido de la especie Equisetum

arvense (L.) caracterizado por su alto contenido en silicio y de metabolitos

secundarios, mayoritariamente compuestos antioxidantes (fenoles, flavonoides)

Introducción

21

(Milutinovic et al., 2014), esta propiedad ha hecho que se estudie su capacidad

antifúngica y antimicrobiana, funcionando muy bien (Mimica-Dukic et al., 2008),

aunque son pocos los trabajos en los que se emplea como elicitor frente a estrés

abiótico.

Existen otros extractos vegetales empleados en agricultura formados a partir de

mezclas de algas como: Ascophylum nodosum, Ecklonia maxima, Durvillea potatorum,

Durvillea antarctica, Fucus serratus, Himanthalia elongate, Laminaria digitata, L.

hyperborea, Macrocystis pyrifera y Sargassum spp (Boney 1965; Doty y Santos 1966).

La mayoría de los polisacáridos de las algas pardas estimulan la respuesta de defensa

en plantas y la protección contra determinados patógenos mediante la activación de

vías de señalización como la del ácido salícilico, jasmónico y/o etileno a nivel sistémico

(Vera et al. 2011).

Son numerosas las investigaciones que se han realizado y en las que se ha

demostrado que las plantas tratadas con este tipo de extractos son capaces de tolerar

mejor el estrés biótico y abiótico. Por ejemplo, se ha visto como una aplicación foliar

de este extracto disminuye el impacto del calor y la baja humedad del suelo (Zhang y

Schmidt 2000a); la salinidad (Nabati et al. 1994); el estrés por frío (Mancuso et al.,

2006); las enfermedades fúngicas (Jayaraj et al. 2008) y la alta intesidad de luz UV

(Schmidt y Zhang 1997).

Respecto a la Posidonia oceanica, no se ha aplicado como inductor de

resistencia en plantas hasta ahora, pero la caracterización de sus extractos vegetales,

indican que podría ser efectiva por su alto contenido en compuestos antioxidantes

(alcaloides, flavonoides, fenoles, taninos, saponinas, esteroles) (Cozza et al., 2004).

La importancia de los compuestos antioxidantes reside en que por su

estructura pueden eliminar especies reactivas de oxigeno (ROS), ya que actúan como

donadores de electrones para estabilizar dichas moléculas y quelar metales (Rice-

Evans et al., 1997). En diversos estudios se ha visto como los fenoles participan en la

eliminación del peróxido de hidrógeno (Rice-Evans et al., 1997) y como los flavonoides

pueden disminuir la fluidez de la membrana, impidiendo la peroxidación de lípidos.


22

I.5. EL CULTIVO DEL TOMATE

El tomate es una planta dicotiledónea que pertenece a la familia Solanaceae y

su nombre científico es Lycopersicum esculentum Mill. (Figura I.3). Es una planta

perenne de porte arbustivo que se cultiva como planta anual, aunque en condiciones

climáticas favorables puede prolongarse varios años (Maroto, 1994).

Las heladas y el calor excesivo pueden dificultar su buen desarrollo en esas

épocas, por ello se emplean nuevas tecnologías como el cultivo en invernadero, el uso

de mallas plásticas que intercepten más del 50 % la luz del sol, y la optimización del

sistema de riego (FAO, 2013). Puede desarrollarse de forma rastrera, semierecta o

erecta y existen variedades de crecimiento limitado (determinadas) y otras de

crecimiento ilimitado (indeterminadas).

Figura I.3. Frutos de Lycopersicum esculentum Mill. (Foto: Propia).

En cuanto a su sistema radicular consta de una raíz principal corta y débil,

numerosas y potentes raíces secundarias y raíces adventicias; y respecto al tallo, éste

tiene un grosor que oscila entre 2-4 cm en su base, es anguloso, pubescente y

presenta algunos pelos glandulares (Infoagro, 2016). El cultivo no necesita

condiciones especiales de suelo, aunque prefiere suelos sueltos, profundos, con un

Introducción

23

buen drenaje, y un buen contenido de nutrientes. Es resistente en condiciones de

acidez y basicidad, soportando niveles más altos de salinidad que otros cultivos

hortícolas.

La mayoría de las variedades de tomate toleran niveles de conductividad

eléctrica hasta 2,5 dS/m sin producirse una disminución del rendimiento, siendo

también los valores entre 2-2,5 dS/m ideales para evitar la necrosis apical. Si bien

establecer un valor óptimo de conductividad es difícil en muchas ocasiones debido a

las interacciones entre varios factores que podrían afectar al desarrollo del tomate.

(Iglesias et al., 2015). La temperatura óptima de desarrollo del tomate oscila entre 20 y

30ºC durante el día y 15 y 17ºC durante la noche. Tanto si las temperaturas son

superiores a los 30-35ºC como inferiores a los 12-15ºC afectan al desarrollo de la

planta y de su sistema radicular.

En cuanto a la humedad relativa óptima, ésta oscila entre un 60-80%.

Humedades relativas muy altas favorecen el desarrollo de enfermedades aéreas, el

agrietamiento del fruto y dificultad en la fecundación. Por último, respecto a la

iluminación el tomate necesita valores de luminosidad altos ya que por el contrario

tendría efectos negativos en la floración, fecundación y desarrollo vegetativo de la

planta. (Infoagro, 2016). Es una de las hortalizas más producidas en todo el mundo,

cultivándose 163 millones de toneladas/año (FAOSTAT, 2013).

La producción de tomates frescos se distribuye de forma desigual entre los

cinco continentes, siendo Asia el mayor productor, seguido de América, Europa, África

y por último Oceanía, según el promedio entre 2010-2013 proporcionado por La

Organización de Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAOSTAT,

2013). Respecto a la distribución por países, los datos recogidos en 2013 reflejan que

el país que produce una mayor cantidad de es China, siendo la producción alrededor

de 50 millones de toneladas; a continuación, se encuentra la India y Estados Unidos

(FAOSTAT, 2013).

En cuanto a España, se encuentra entre los 10 principales países de

producción de tomates, concretamente en noveno lugar, con una cosecha cercana a 4

millones de toneladas/año (FAOSTAT, 2013), lo que representa un 19% de la

producción de hortalizas en España. Las principales áreas de producción son


24

Andalucía, Extremadura y Murcia, seguidas de provincias como Navarra, Canarias,

Castilla la Mancha, Galicia, Aragón y Comunidad Valenciana, donde la producción es

mayor en Alicante (MAPA, 2017).

La gran importancia de la planta de tomate se debe, especialmente, a las

propiedades de su fruto. El tomate presenta un alto valor nutricional y efectos positivos

para el organismo debido a un bajo valor calórico, su alto contenido en agua y un

importante contenido en azúcares solubles y vitaminas, además de carotenoides y

elementos minerales. Un compuesto interesante del tomate es el licopeno, el cual se

encuentra en cantidades elevadas dentro de sus células, es el componente

responsable del color rojo del tomate y es objeto de numerosos estudios por su poder

antioxidante, en los que se le relaciona con la disminución del riesgo de cáncer de

próstata y del daño oxidativo. Además, incide sobre la actividad de ciertos enzimas

detoxificantes, estimula el sistema inmune, modula la síntesis de colesterol y el

metabolismo hormonal, e interviene en el control de la presión sanguínea (Greenwald

et al., 2001).

25

II. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO

EXPERIMENTAL

Objetivos y Planteamiento experimental

27

II. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

II.1. OBJETIVOS

Ante el problema medio ambiental que genera la retirada cada año de cientos

de toneladas de arribazones de Posidonia oceanica de las playas del mediterráneo y

su posterior acumulación en vertederos terrestres, surge la necesidad de buscar usos

alternativos a tales residuos. Hasta la fecha, las principales aplicaciones de los restos

de Posidonia oceanica han sido la construcción, la obtención de biofuel, la producción

de materiales plásticos reforzados con fibras naturales, la industria farmacéutica y

como alimento para el ganado, pero no hay evidencias de que se estén empleando en

el sector de la agricultura, a pesar de que por sus características físico-químicas esta

fanerógama marina podría tener múltiples beneficios. Es por ello que el objetivo

general de esta tesis fue estudiar la viabilidad del uso de los arribazones de Posidonia

oceanica en la agricultura, lo que les conferiría un valor añadido a los mismos.

El objetivo general se divide a su vez en los siguientes objetivos específicos:

1. En los últimos 50 años, la producción mundial agrícola ha aumentado

anualmente entre un 2 y un 4%, mientras que la extensión de área cultivada ha

ido descendiendo de 0,44 ha a 0,25 ha/persona. Estas circunstancias han

provocado una intensificación de la agricultura que ha llevado a un uso

desmesurado de los suelos. Por este motivo, la protección del suelo para

mantener su fertilidad y su valor agrícola evitando su degradación es una tarea

prioritaria. Es por este motivo que en uno de los objetivos de este trabajo de

investigación fue estudiar la viabilidad del empleo de los arribazones de

Posidonia oceanica como enmienda orgánica, mediante la evaluación de la

composición de los lixiviados recogidos de diferentes tipos de suelos

enmendados con Posidonia oceanica y del efecto de estos lixiviados en la

germinación de semillas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.).

2. El sector agrícola es un pilar fundamental en el crecimiento de la economía de

Alicante, Murcia y Almería, de hecho la producción hortofrutícola, supone

alrededor del 6% de las exportaciones, de las cuales un 42% provienen del

Levante español. De este sector agrícola, el cultivo sin suelo, necesita de gran

cantidad de materiales para que puedan servir de soporte al cultivo y que este

a su vez, permita el intercambio correcto de agua y aire, así como una buena


28

nutrición de las plantas. Actualmente, la fibra de coco es uno de los principales

sustratos no inertes empleados para cultivos en semillero o en contenedor

debido a sus propiedades. Evaluar el comportamiento de los arribazones de

Posidonia oceanica como sustrato cultivo, estableciendo su influencia en el

desarrollo y fisiología de plantas de tomate, así como sobre la producción y la

calidad organoléptica y nutricional de los frutos fue también objetivo de este

trabajo.

3. En la actualidad la aplicación exógena de sustancias inductoras de los

mecanismos de defensa de la planta (elicitores), está siendo considerado como

un método eficaz para mejorar la tolerancia de las plantas frente a diferentes

tipos de estrés abiótico, y entre ellos la salinidad. En este campo, los extractos

botánicos están cobrando importancia. Debido a la alta riqueza en metabolitos

secundarios con poder antioxidante de los extractos de Posidonia oceanica, se

plantea la posibilidad de aplicar dichos residuos como elicitores en la

agricultura. En base a esto, se planteó optimizar el proceso de obtención de

extractos vegetales de Posidonia oceanica ricos en compuestos con actividad

elicitora, así como estudiar el efecto de la aplicación de estos extractos en la

germinación de semillas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) y

demostrar su eficacia como elicitor en plantas de tomate sometidas a estrés

salino.

II.2. PLANTEMIENTO EXPERIMENTAL.

El apartado experimental de este trabajo de investigación se dividió en 3

experiencias:

1. Experiencia I: De acuerdo con lo propuesto en el Objetivo 1, la

finalidad de esta primera experiencia fue evaluar la viabilidad de los

arribazones de Posidonia oceanica como enmienda orgánica. Esta

experiencia se dividió a su vez en 3 ensayos. Un primer ensayo

(Ensayo 1) en el que se estableció si la Posidonia oceanica mostraba

unas características físico-químicas acordes a las exigencias de la

actual legislación referente al uso de materias como enmiendas

orgánicas en la agricultura. Un segundo ensayo (Ensayo 2) en el que se

determinó la composición de los lixiviados procedentes de distintos

Objetivos y Planteamiento experimental

29

suelos enmendados con diferentes dosis de Posidonia oceanica, lo que

permitiría hacer una primera aproximación de la composición de la

disolución del suelo enmendado en la zona de la rizosfera. Y un tercer y

último ensayo (Ensayo 3) en el que se determinó el efecto de los

lixiviados procedentes de suelos enmendados con Posidonia oceanica

sobre la germinación de semillas de tomate.

2. Experiencia II: Con la segunda experiencia se trató de dar respuesta a

las cuestiones planteadas en el Objetivo 2, es decir, establecer la

viabilidad de la Posidonia oceanica como sustrato de cultivo. Esta

experiencia se dividió en dos ensayos. Con el Ensayo 1 se determinó si

la Posidonia oceanica, por sus características físico-químicas cumplía

con las exigencias de la legislación vigente sobre sustratos de cultivo.

En el ensayo 2 se emplearon los arribazones de Posidonia oceanica

(lavados y sin lavar) como sustrato de cultivo en plantas de tomate

(Lycopersicum esculentum Mill.), y se realizó una comparativa con la

fibra de coco determinándose para ello: los parámetros de crecimiento,

fisiológicos y nutricionales de las plantas y los parámetros de calidad

del fruto.

3. Experiencia III: De acuerdo con lo propuesto en el Objetivo 3, la

finalidad de esta tercera y última experiencia fue evaluar el efecto de la

aplicación de extractos acuosos de Posidonia oceanica sobre el

desarrollo vegetal. Esta experiencia se dividió en 3 ensayos. Un primer

ensayo (Ensayo 1) en el que se realizó la obtención y la caracterización

de los extractos acuosos de Posidonia oceanica, para posteriormente

en un Ensayo 2, comprobar el efecto de la aplicación de dichos

extractos sobre la germinación de semillas de tomate y un Ensayo 3

donde se estudió la efectividad de la aplicación foliar de los extractos de

Posidonia oceanica en plantas sometidas a estrés salino.


30

Figura II.1. Planteamiento Experimental

PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Experiencia III Efecto de la aplicación de

extractos acuosos de Posidonia

oceanica sobre el desarrollo vegetal

Experiencia II Empleo de

arribazones de Posidonia oceanica como sustrato de

cultivo

Experiencia I Empleo de

arribazones de Posidonia oceanica

como enmienda orgánica

Ensayo 1 Evaluación de las

características físico-químicas de

Posidonia oceanica como enmienda

orgánica

Ensayo 2 Evaluación de la composición de

lixiviados procedentes de suelos agrícolas enmendados con

Posidonia oceanica

Ensayo 3 Evaluación del efecto

de los lixiviados obtenidos de suelos

enmendados con Posidonia oceanica

en la germinación de Lycopersicum

esculentum Mill.

Ensayo 1 Evaluación de las

características físico-químicas de

Posidonia oceanica como sustrato de

cultivo

Ensayo 2 Desarrollo de plantas de tomate empleando Posidonia oceanica como sustrato de

cultivo

Ensayo 1 Obtención y

caracterización de extractos acuosos de Posidonia oceanica

Ensayo 2 Efecto de la aplicación de

extractos acuosos de Posidonia oceanica

sobre la germinación de semillas de

tomate SENY F1

Ensayo 3 Efecto de la

aplicación foliar de extractos acuosos de Posidonia oceanica a

plantas de tomate sometidas a estrés

salino

31

III. EXPERIENCIA 1

Experiencia I

33

III. EXPERIENCIA I: EMPLEO DE ARRIBAZONES DE Posidonia Oceanica

COMO ENMIENDA ORGÁNICA.

III.1. Materiales y Métodos.

III.1.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de Posidonia

oceanica como enmienda orgánica.

La Posidonia oceánica empleada en este estudio fue muestreada en la playa

de la Marineta Casiana, en Denia, Alicante (38°50′27″N-0°06′21″E) (Figura III.1.).

Figura III. 1. Arribazones de Posidonia oceanica en la Playa de la Marineta Casiana (Foto Propia).

Una vez en el laboratorio, los residuos de Posidonia oceanica, fueron cribados,

primero por un tamiz de 2,0 mm y a continuación con un tamiz de 0,5 mm, con el

objetivo de retirar materiales no deseados tales como plásticos, vidrios, conchas,

arena, colillas, etc…, que podrían encontrarse en los arribazones de Posidonia

oceanica muestreados. Tras el cribado, la muestra fue molida con un molinillo eléctrico

hasta obtener un polvo fino y homogéneo que fue almacenado en un lugar seco y

oscuro hasta el momento de su análisis.

III.1.1.1. Caracterización físico-química de Posidonia oceanica.

Determinación del pH y de la conductividad eléctrica.

Ambos parámetros fueron medidos según la metodología descrita en la Norma

ISO 10390:1994(E) empleando el método de la relación 1:2,5 (p/v) para el pH y el de

la relación 1:5 (p/v) para la CE.


34

Para el pH se procedió como sigue, se tomaron 3g de posidonia seca y molida,

y se colocaron en un tubo de centrífuga al que se añadieron 7,5 mL de agua destilada.

A continuación, se agitó durante 10 minutos en un agitador de volteo. Tras la agitación

se mantuvo en reposo durante 30 minutos. Pasado este tiempo se agitó

vigorosamente la suspensión y se midió el pH con un pHmetro (Metler Toledo,

SevenEasy S20).

Para la conductividad eléctrica se mezcló 1g de posidonia seca y molida con 5

mL de agua destilada y se mantuvo en agitación durante 30 minutos. Pasado este

tiempo la suspensión se centrifugó y se filtró. En el filtrado se midió la conductividad

eléctrica con un conductímetro (Metler Toledo, SevenEasy S20), expresando el valor

en dS/m.

Determinación del contenido total en materia orgánica

Dicho parámetro se determinó de acuerdo con el método propuesto por Schulte

y Hopkins (1996). Para ello, se pesaron de 3g de muestra y se mezclaron con 50mL

de HCl 5% (v/v). La mezcla se mantuvo en agitación manual cada 5 minutos durante

un periodo de 15 minutos. Después la muestra se filtró, y el residuo que quedo en el

filtro se secó en estufa a 105ºC y una vez seco se pesó. A continuación, el residuo se

calcinó a 560ºC durante 5 horas y una vez frío se volvió a pesar.

El contenido de materia orgánica total (MOT) fue expresado como:

%MOT =B − CA × 100

Donde; A es el peso original de la muestra en gramos, B es el peso de la muestra

lavada y seca en gramos, y C hace referencia al peso de la muestra lavada, seca y

calcinada, en gramos.

Determinación del contenido en materia orgánica oxidable.

La determinación del contenido en materia orgánica fácilmente oxidable se

realizó según el procedimiento descrito por Walkley y Black (1934). Se pesó de 0,05g

de muestra a la que se le añadió 10mL de dicromato potásico 1N y 20mL de H2SO4

concentrado, tras 30 minutos de reposo, se adicionaron 200mL de agua destilada, 10

Experiencia I

35

mL de ácido fosfórico concentrado y 4 o 5 gotas del indicador difenilamina. A

continuación, se valoró con sal de Mohr 0,15M. El contenido de materia orgánica se

calculó como:

%M.O = �VB − VM� × 0,5 ×124000

×1p×1,7240,77

× 100

Dónde; VB es el volumen de sal de Mohr gastado en el ensayo del blanco en mL, VM el

de sal de Mohr gastado con la muestra y p es el peso de muestra en gramos.

Determinación del contenido en fósforo asimilable.

Para la determinación del contenido en fósforo asimilable, se empleó la

metodología propuesta por Kitson y Mellon (1944), esta técnica consiste en la

formación de un complejo de color amarillo, al reaccionar el fósforo presente en la

muestra con molibdato amónico y metavanadato en medio ácido, cuya intensidad de

color será proporcional al contenido en fósforo y la posterior cuantificación por

colorimetría, midiendo la absorbancia a 460nm con un espectrofotómetro UV-Vis

(JASCO V-630).

Previo a la cuantificación del fósforo fue necesario mineralizar la muestra de

Posidonia oceanica seca y molida, para ello 5g de muestra se calcinaron en un horno

hasta obtener cenizas blancas seguido de una digestión de las cenizas en medio

ácido.

Análisis elemental

La muestra fue analizada por un microanalizador CNS con un sistema de

microdetección TruSpec. La técnica consta de una oxidación completa por

combustión. Las diferentes combustiones producen gases, que son transportados por

helio, y selectivamente separados en columnas específicas, las cuales al pasar por el

detector producirán una señal proporcional a la concentración de cada componente.


36

Determinación del porcentaje de extracto húmico total y de ácidos húmicos

Para la determinación de estos parámetros, las muestras de Posidonia oceanica

cribada, seca y molida se sometieron, en primer lugar, a una extracción alcalina para

obtener el extracto húmico total, y posteriormente se precipitó en este extracto los

ácidos húmicos a pH 1 (Kononova, 1966). Para ello se pesaron 1,5 g de muestra y se

introdujeron en tubos de centrífuga, a los que posteriormente se añadieron 100mL de

solución extractante de pirofosfato 0,1M-NaOH 0,1M. Los tubos se agitaron durante 1

hora, en agitador de vaivén, a la máxima potencia y posteriormente se centrifugó a

4.500 r.p.m. durante 25 minutos. Esta operación se repitió hasta que el líquido de la

extracción fuese incoloro. Se reunieron todos los líquidos en un matraz enrasando con

agua destilada. A esta solución se le denominó “Extracto húmico total”.

Valoración del carbono orgánico del extracto húmico: Se tomaron 500mL del

extracto y se evaporó en el baño de agua hasta la sequedad. Se añadieron 10mL de

dicromático potásico 1N y a continuación 20mL de ácido sulfúrico concentrado,

agitando suavemente durante 1 minuto. Se dejó reposar durante 30minutos.

Transcurrido este tiempo, se añadieron 200mL de agua destilada y 10mL de ácido

fosfórico al 85% y se dejó enfriar. A continuación, se añadió 1mL de difenilamina y se

valoró con Sal de Mohr 0,15N.

Porcentaje de C=��·�·�· ,!"

#

Donde; Porcentaje de extracto húmico total=porcentaje de C·1,724, siendo V el

volumen, en mL, de Sal de Mohr consumidos por el blanco, V’ el volumen, en mL, de

Sal de Mohr consumidos por la muestra, N la normalidad de la Sal de Mohr, f el factor

de la Sal de Mohr, P el peso, en gramos, de la muestra y 0,39 el factor que resulta de

considerar que por este método sólo se oxida el 77% del carbono existente en la

muestra.

Precipitación de ácidos húmicos: Se tomaron 200mL de la solución “Extracto

húmico total” y se añadió ácido sulfúrico 1:1, agitando lentamente y sin turbulencias

hasta pH 1. La mezcla se dejó reposar 8 horas. Transcurrido dicho tiempo, se

centrifugó a 4.500 r.p.m. durante 25 minutos, para separar el precipitado de ácidos

húmicos. El precipitado se lavó con sosa 0,5M, y se llevó a un matraz aforado de

50mL y se enrasó con agua destilada, esta solución se denominó “Solución de ácidos

Experiencia I

37

húmicos”. La valoración de los ácidos húmicos se realizó de la misma forma que el

extracto húmico total, expresando el resultado como porcentaje de ácidos húmicos.

Determinación del contenido en macro, micronutrientes y metales pesados.

El análisis cuantitativo de macronutrientes (Ca, K y Mg), micronutrientes (Mn,

Cu, Fe, y Zn), Na y metales pesados (Cd, Cr, Ni, Pb y Hg), fue llevado a cabo por un

equipo de plasma de acoplamiento inductivo (ICP) acoplado a un espectrofotómetro de

emisión óptico (OES) (Perkin Elmer, Optima 4300 DV), previa digestión ácida

realizada por microondas de acuerdo con la metodología propuesta por Cozza et al.

(2011).

III.1.2. ENSAYO 2: Evaluación de la composición de lixiviados procedentes de

suelos agrícolas enmendados con Posidonia oceánica.

Con objeto de establecer la viabilidad de la Posidonia oceánica como enmienda

orgánica se seleccionaron tres suelos de distinta procedencia y características. Un

suelo agrícola ácido perteneciente a la provincia de Pontevedra (Concello As Neves) al

que se denominó suelo ácido (AC) y dos suelos agrícolas calizos de la provincia de

Alicante. La principal diferencia de estos dos últimos suelos es que uno de ellos

presentaba un contenido de sales solubles muy elevado (14,3 dS/m), suelo salino

(SAL), mientras que el otro era un suelo agrícola en barbecho (AG). La caracterización

físico-química de cada uno de los suelos se recoge en la Tabla III.1).

Una vez caracterizados los suelos se procedió a enmendar cada uno de ellos

con Posidonia oceánica, la cual únicamente había sido cribada tras el muestreo para

eliminar los restos de arena, plásticos, conchas y otros materiales ajenos a los

arribazones. La cantidad de Posidonia oceanica adicionada a cada suelo fue la

equivalente a las dosis habitualmente empleadas en campo (50-120t/ha·año),

incorporándola en los primeros 15 cm del suelo (Paul et al., 1993). Las dosis de

aplicación en estudio fueron: 25, 40, 50 y 60 g/kg de suelo, para controlar qué efecto

ejercía la Posidonia oceanica sobre los tres tipos de suelo. Como control se emplearon

los tres suelos en estudio previos a recibir la enmienda de Posidonia oceanica.


38

Tabla III.1. Características físico-químicas de los suelos empleados en el estudio.

Parámetro Método Unidad Suelo

Salino

Suelo

Ácido

Suelo

Agrícola

pH en aguaa Relación 1:2,5 Sin

unidad 7,7±0,1 5,7±0,3 7,3±0,1

CEa Relación 1:5 dS/m 14,3±0,9 0,087±0,001 0,290±0,002

MO oxidableb Walkley-Black % (p/p) 0,86±0,06 2,7±0,2 1,97±0,01

Texturac Bouyoucos

Sin

Unidad

Franco

arcilloso

Franco arcillo

limoso

Arcillo

limoso

Carbonatosd Calcímetro

Bernard % (p/p) 69±5 1,2±0,02 52±0,3

Capacidad de

campoe

Gandullo

(1985) % (p/p) 51±3 60±2 70±3

(a)pH y CE: Norma ISO 10390:1994(E); (b) MO oxidable: Walkley y Black, 1934; (c)Textura: Bouyoucos,

1962; (d) Carbonatos: Guitián y Carballas, 1976; (e)Capacidad de campo: Gandullo, 1985.

Una vez enmendados cada uno de los suelos a las distintas dosis en estudio,

se colocaron en recipientes de PVC (17x28x20cm), con 138 agujeros de 1 mm de

diámetro en la base, que se llenaron hasta los 15 cm de altura. A continuación, estos

recipientes se situaron en un simulador de lluvia (Figura III.2).

El simulador estaba compuesto de:

- Un bidón de 20 L de agua destilada cuyo caudal de grifo era de

aproximadamente 300 mL/min.

- Una bandeja con 46 puntas, que proporcionaban un caudal de riego/lluvia

aproximado de 260 mL/min.

- El recipiente que contenía las mezclas suelo-Posidonia situado a una distancia

de 1,35 cm de la bandeja anterior, provista de agujeros para que lixiviase al

recipiente recolector.

- Un recipiente de PVC en el que se recogieron los lixiviados obtenidos tras el

riego/lluvia.

Experiencia I

39

Figura III.2. Simulador de lluvia

Una vez situadas cada una de las mezclas suelo-posidonia en el simulador, se

agregó un volumen de agua correspondiente a la capacidad de campo de cada suelo

(Tabla III.1), más 2 L. Este volumen se estableció para asegurar que el volumen de

lixiviado recogido fuese suficiente para realizar los ensayos posteriores. Una vez

obtenidos los lixiviados fueron caracterizados para establecer la idoneidad de los

mismos para el desarrollo de un cultivo.

III.1.2.1. Caracterización de los lixiviados.

Una vez recogidos los lixiviados se filtraron y se determinaron los siguientes

parámetros.


El pH y la conductividad eléctrica se midieron directamente en el lixiviado con

un pHmetro y un conductímetro respectivamente (Mettler Toledo, SevenEasy).

Determinación de la demanda química de oxígeno (DQO).

La DQO se analizó mediante el método del dicromato propuesto por Crespi y

Huertas (1986), cuya medida se basa en una valoración del dicromato que queda en

exceso en la muestra tras la oxidación de la materia orgánica y de todas aquellas


40

sustancias inorgánicas susceptibles de ser oxidadas (sulfuros, sulfitos, yoduros, iones

metálicos…) presentes en el medio, con sulfato ferroso amónico (sal de Mohr),

utilizando ferroína como indicador. Cabe destacar que el valor de la DQO hace

referencia a la presencia de sustancias orgánicas e inorgánicas que pueden oxidarse

químicamente.

Determinación de la demanda biológica de oxígeno al quinto día (DBO5).

La DBO5 se determinó siguiendo el método descrito en la norma NTE ISO/IEC:

17025. A 244mL de lixiviado se le añadieron 4 gotas de reactivo A (KCl) y 3 gotas de

reactivo B (contra las bacterias nitrificantes). La demanda biológica de oxígeno (DBO5)

se define como la cantidad de materia orgánica susceptible de ser consumida u

oxidada por medios biológicos que contiene una muestra líquida, disuelta o en

suspensión tras 5 días de incubación con agitación y a 20ºC, en oscuridad (López,

2017).

Análisis estadístico

Con el fin de establecer las diferencias entre los distintos tratamientos y

condiciones desarrolladas sobre los distintos parámetros analizados, se realizó un

análisis de varianza de un factor (ANOVA), seguido del test post-hoc de Duncan para

comparar las medias, considerando que existen diferencias significativas cuando el p-

valor es 0,05 o menor (P≤0,05). Se realizó mediante el programa SPSS ® vs, 12.0.

III.1.3. ENSAYO 3: EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS LIXIVIADOS OBTENIDOS

DE SUELOS ENMENDADOS CON Posidonia oceanica EN LA GERMINACIÓN DE

Lycopersicum esculentum Mill.

El ensayo de germinación se realizó con semillas de Lycopersicum esculentum

Mill. cv. Seny F1. Se empleó esta especie porque son medianamente sensible a las

sales y pueden aguantar una conductividad eléctrica de 2,5 dS/m sin que haya una

disminución de crecimiento y/o rendimiento (Chinnusamy et al., 2005).

Experiencia I

41

Ensayos de germinación

El ensayo de germinación se llevó a cabo en placas Petri a las que se les

colocó en la base un disco de papel de filtro Whatmann Nº1 (Figura III.3) (Bowers et

al., 1997). En cada placa se pusieron a germinar 10 semillas durante 10 días,

añadiendo 3 réplicas por cada tipo de placa. Las placas denominadas Control fueron

regadas cada dos días con 5 mL de agua destilada y las placas problema fueron

regadas con 5 mL del lixiviado correspondiente (lixiviado a partir de suelo sin

enmendar y lixiviados obtenidos de los suelos enmendados a las distintas dosis de

enmienda: 25, 40, 50 y 60 g/kg de Posidonia oceanica). Esto se realizó para cada tipo

de suelo: salino, calizo y ácido. Seguidamente se metieron en la cámara de

germinación, Raypa I-280, en ausencia de luz, a 25ºC de temperatura y 44% de

humedad relativa.

Figura III.3. Placas con semillas regadas con lixiviado procedente de un suelo enmendado con Posidonia oceanica.

Cada día se contaron cuántas semillas habían germinado en cada placa y a los

10 días se les midió la raíz. A partir de estos datos se determinó de acuerdo con

Bagur-González et al. (2011) el porcentaje de germinación relativa (GRS), porcentaje

de crecimiento relativo radicular (CRR) e índice de germinación (IG).

GRS�%� =GmGc

× 100

Dónde; Gm es el número de semillas germinadas con el lixiviado problema y Gc es el

número de semillas germinadas con agua destilada.


42

CRR�%� =LmrGLcr

× 100

Dónde; Lmr es la longitud media de la radícula de las semillas germinadas con el

lixiviado problema y GLcr es la longitud media de la radícula de las semillas

germinadas con agua destilada.

El índice de germinación (IG) se calculó a partir de los parámetros GRS y CRR

de acuerdo con la siguiente expresión:

IG�%� =�GRS × CRR�

100

Análisis estadístico






Experiencia I

43

III.2. Resultados y discusión.

III.2.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de Posidonia

oceanica como enmienda orgánica.

Para evaluar el posible uso de Posidonia oceanica como enmienda orgánica en

primer lugar fue necesario comprobar sí cumplía los parámetros exigidos en el RD

506/2013 para que un material pueda ser empleado con tales fines. Además se

determinaron otros parámetros que, aunque no se incluyen en el Real Decreto,

podrían tener influencia desde el punto de vista agronómico.

El RD 506/2013 exige que para que una materia pueda ser usada como

enmienda orgánica tipo húmico debe tener un porcentaje de materia orgánica superior

al 25%. De acuerdo con la Tabla III.3, el contenido de materia orgánica total de la

Posidonia oceanica fue de un 30%, lo que supera en un 5% el mínimo exigido. Por

otro lado, el contenido en C orgánico oxidable, se situó en un 25% (Tabla III.3), siendo

dicha cantidad la mínima exigida para una enmienda orgánica de tipo húmico por la

legislación vigente. En relación con el porcentaje de extracto húmico total y de ácidos

húmicos, de acuerdo con el RD 506/2013, los valores de estos parámetros deben ser

superiores al 5% y al 3%, respectivamente. Si se observan los resultados recogidos en

la Tabla III.3, el valor de extracto húmico total de la Posidonia oceanica fue del 19,2%

y el de ácidos húmicos de un 15,3%, por lo que ambos parámetros cubrirían con

creces los mínimos exigidos. De estos resultados se deduce que la Posidonia

oceanica podría ser empleada como enmienda orgánica de tipo húmico de acuerdo

con los parámetros exigidos por el RD506/2013.

Por otro lado, en referencia al contenido en metales pesados en Posidonia

oceanica, las concentraciones encontradas para los elementos Cd, Cr, Ni, Pb, Cu, Zn,

Mn, Fe y Hg estuvieron por debajo de los límites máximos establecidos por el Real

Decreto 506/2013, para productos fertilizantes de clase A (0,4mg/Kg), concretamente

los contenidos de metales en la Posidonia oceanica se situaron a la mitad del valor

máximo. Lo mismo ocurre con el contenido de N total y con el de fósforo asimilable

(P2O5), ya que según este Real Decreto, el valor máximo permitido sería de 0,9% para

ambos elementos, y el valor de N total para la muestra de Posidonia oceanica fue de

0,5% y para el fósforo (P2O5) de 0,095% (Tabla III.3).


44

Respecto a la relación C/N, en el Real Decreto 506/2013 no existe margen de

tolerancia alguno para dicho parámetro. Tal y como se recoge en la Tabla III.3, la

relación C/N en Posidonia oceanica fue de 66,4, lo que significa que el ritmo de

nitrificación sería muy lento en este tipo de materia (Juárez et al., 2004). De acuerdo

con Hirzel y Salazar, (2011), la relación C/N de otras materias empleadas

habitualmente como enmienda orgánica, tales como el estiércol o el vermicompost, se

situarían entre 15 y 20, lo que es indicativo de que la liberación de N en el caso de la

Posidonia sería algo más escasa que en dichas enmiendas orgánicas.

Tabla III.3. Características físico-químicas de Posidonia oceanica

Parámetro Unidad Valor

pH UpH 8,40 ± 0,05 Conductividad Eléctrica dS/m 14,64 ± 0,07 Materia Orgánica Total % (p/p) 30 ± 2 C org oxidable % (p/p) 25±1 Fósforo asimilable (P2O5) %(p/p) 0,095 ± 0,007 Nitrógeno total %(p/p) 0,5 ± 0,01 Carbono total Relación C/N

%(p/p) %(p/p)

33,2 ± 0,9 66,4±0,2

Azufre total %(p/p) <0,01 Extracto Húmico Total %(p/p) 19,2±0,7 Ácidos Húmicos Calcio Magnesio Potasio Sodio Cobre Manganeso Zinc Hierro

%(p/p) %(p/p) %(p/p) ppm

%(p/p) %(p/p) %(p/p) %(p/p) ppm

15,3±0,3 11,6±1,0

0,57±0,00 824±103,9 0,59±0,04 7,4±0,5 63,8±5,2 25,5±2,3

0,27±0,01 * Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones.

En relación al resto de parámetros físico-químicos determinados, el valor de pH

de la Posidonia oceanica fue de 8,4 (Tabla III.3). Si se compara dicho parámetro con

otras enmiendas orgánicas utilizadas normalmente en la agricultura, se puede

observar que es del orden del pH de estiércol bovino (pH 8,0), el de la gallinaza de

pavo (pH 8,2) o incluso del de purín de cerdo, que tiene un pH de 8,6 (Hirzel y Salazar,

2011). El hecho de que Posidonia oceanica tenga un pH de 8,4, podría ser interesante

para enmendar suelos ácidos, ya que aumentaría el pH de dichos suelos, y esto

Experiencia I

45

podría dar lugar a un incremento en la disponibilidad de nutrientes para las plantas,

mejorando la nutrición vegetal y en consecuencia aumentando el rendimiento y la

productividad de éstas (Prasad & Power, 1997).

La conductividad eléctrica medida en Posidonia oceanica fue de 14,64 dS·m-1,

valor ligeramente inferior a la de la gallinaza de pavo (18,2 dS·m-1), y en torno al valor

de la del purín de cerdo (13,4 dS·m-1) (Hirzel y Salazar, 2011). Lo que es indicativo de

que su aplicación a suelos agrícolas no tendría por qué incrementar el aporte de sales

más de lo que los pueden hacer otras enmiendas orgánicas como las indicadas

anteriormente.

En relación al contenido en materia orgánica total, la muestra presentó un 30%,

resultado que concuerda con el encontrado por de Grassi et al. (2015) al caracterizar

muestras de esta fanerógama recogidas en las costas italianas. Si se compara el valor

de este parámetro (Tabla III.3) con el de otras enmiendas orgánicas, la Posidonia

oceanica presentaría un contenido en materia orgánica total similar al de la gallinaza

de pavo (31-41%C) o al del estiércol de bovino (34,4%C) (Hirzel y Salazar, 2011).

El porcentaje de fósforo asimilable, expresado como P2O5, en Posidonia

oceanica fue cercano al 0,1%, valor que estaría por debajo de la concentración que

tiene el purín (0,88%) o el estiércol bovino (0,63%) (Hirzel y Salazar, 2011).

Igualmente, el contenido de N en la Posidonia oceanica (Tabla III.3), fue 3 veces

menor al encontrado en otras enmiendas orgánicas como el purín de cerdo (1,5%)

(Hirzel y Salazar, 2011).

Respecto al contenido en macronutrientes (Ca, Mg, K) (Tabla III.3), el

porcentaje de calcio en Posidonia oceanica fue muy alto si se compara con la

concentración de calcio en el guano de pavo (7,5-7,9%), siendo esta enmienda la que

presenta una mayor concentración de este nutriente de entre las que habitualmente se

emplean en agricultura. Respecto al magnesio, la concentración en Posidonia estaría

cercana a la de un estiércol bovino (0,49%), en cambio la concentración de potasio

estaría muy por debajo de esta enmienda orgánica citada anteriormente, siendo el

purín de cerdo la enmienda orgánica con la concentración más baja de potasio (1%)

(Hirzel y Salazar, 2011).

En relación al Na, a pesar de no ser considerado como un macronutriente, es

habitual encontrarlo en la composición de las enmiendas orgánicas empleadas en

agricultura, por lo que también fue determinado (Tabla III.3). Tanto el guano de pavo


46

(0,18-0,78%) como el purín de cerdo (0,13-0,65%) son enmiendas orgánicas que

tienen una concentración de sodio similar a la de la Posidonia oceanica (Tabla III.3).

En conclusión, la Posidonia oceanica presenta unas características físico-

químicas bastante parecidas a la de otras enmiendas orgánicas que se están

aplicando actualmente en la agricultura, por lo que en base a estos datos, todo parece

indicar que podría utilizarse con tales fines.

III.2.2. ENSAYO 2: Evaluación de la composición de lixiviados procedentes de

suelos agrícolas enmendados con Posidonia oceánica.

En la Tabla III.4 se recogen la variación del pH y la CE de los lixiviados

procedentes de los tres suelos en estudios y a las distintas dosis de enmienda

empleadas. Como se puede observar en la Tabla III.4 conforme aumentó la cantidad

de Posidonia oceanica añadida como enmienda a los suelos ácido y agrícola, también

lo hizo la conductividad eléctrica del lixiviado obtenida de los suelos enmendados, este

incremento podría deberse a la solubilización de sales, principalmente de sodio,

procedente de la costra de sal superficial de la Posidonia oceánica (Tabla III.3).

Tabla III.4. pH y CE de los de lixiviados obtenidos de suelos enmendados con

Posidonia a las distintas dosis en estudio

Suelo Ácido Suelo Agrícola Suelo Salino

Dosis (g/Kg)

pH CE

(dS/cm) pH

CE (dS/cm)

pH CE

(dS/cm)

0 5,7±0,2b 0,087±0,002e 7,3±0,1b 0,29±0,01e 7,7±0,2b 15,3±0,6a

25 6,2±0,1a 0,41±0,01d 7,6±0,3ab 2,0±0,1d 7,9±0,3ab 12,29±0,02b

40 6,2±0,3a 0,99±0,06c 7,6±0,4ab 2,3±0,1c 7,9±0,1ab 10,07±0,01c

50 6,3±0,5ab 3,23±0,03b 7,9±0,6a 3,6±0,1b 8,0±0,3a 9,6±0,3d

60 6,5±0,2a 4,24±0,03a 8,1±0,5a 4,4±0,2a 8,2±0,3a 7,2±0,2e

Sig(1) * *** ** *** ** *** *Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

En relación al suelo salino, el comportamiento fue diferente (Tabla III.4), ya que

la CE del lixiviado disminuyó a medida que la dosis de enmienda aumentó. Este

Experiencia I

47

comportamiento podría ser debido a que conforme aumentó la dosis de Posidonia

oceanica, la proporción de suelo en la muestra disminuyó, provocando un efecto

dilución sobre la elevada concentración salina que mostraba este suelo previo a ser

enmendado.

Respecto al pH, el rango de los valores que se considera adecuado para que

haya una correcta disposición de nutrientes para las plantas es de 5,5 a 7,5 con un

valor óptimo de 6,5 (Brady y Weil, 1996). La enmienda de los tres suelos en estudio

con diferentes dosis de Posidonia oceanica se tradujo en aumento del pH del lixiviado,

de forma más acusada en el suelo ácido, y sólo ligeramente en los suelos calizos

(agrícola y salino) (Tabla III.4). Desde el punto de vista de la fertilidad del suelo, la

enmienda del suelo ácido con Posidonia tuvo un efecto beneficioso, ya que pasó de

unos valores de pH de 5,7 a 6,5, valor éste último considerado como óptimo para

alcanzar la máxima disponibilidad de nutrientes para los cultivos. Para los suelos

salino y agrícola, la variación de pH por adición de la enmienda fue pequeña y

únicamente significativa para dosis mayores a 50 g/kg (Tabla III.4), siendo el valor

promedio de pH de estos lixiviados, el característico para suelos minerales de regiones

áridas (Juárez et al., 2004).

Un parámetro agronómico a tener en cuenta en zonas áridas como la de la

provincia de Alicante, es la capacidad de retención de agua del suelo de cultivo, es por

ello que se incluyó en este estudio la variación este parámetro tras la enmienda de los

suelos con las diferentes dosis de Posidonia oceanica. Como se puede observar en la

Tabla III.5, para los 3 tipos de suelos, se encontró que había una relación directamente

proporcional entre la cantidad de Posidonia oceanica adicionada como enmienda y la

capacidad de retención de agua de los mismos. Así, la dosis que confirió mayor

capacidad de retención de agua a los tres suelos fue la de 60 g/kg (Tabla III.5),

pasando en el suelo ácido de un 71% de capacidad de campo a un 145%, es decir

duplicando la capacidad de retener agua de dicho suelo (Tabla III.5). Para los suelos

agrícola y salino, este incremento fue todavía mayor que para el suelo ácido, de forma

que la capacidad de retención de agua de dichos suelos enmendados con la dosis

más alta de Posidonia oceanica (60g/kg) aumentó un 24% y un 30% respecto a los

mismos suelos sin enmendar respectivamente (Tabla III.5). Este resultado concuerda

con el comportamiento observado para otras enmiendas orgánicas como el

vermicompost (Buckerfield y Webster ,1999), donde su adición al suelo de cultivo


48

aumentó la capacidad de retención de humedad en más de un 30%. En consecuencia,

el uso de los arribazones de Posidonia como enmienda orgánica podría tener grandes

beneficios en suelos de zonas áridas, incrementando sustancialmente el agua

disponible para los cultivos, y por tanto ayudando a hacer un uso más eficiente de la

escasa agua de riego existente en estas zonas.

Tabla III.5. Capacidad de retención de agua del suelo enmendados con Posidonia

oceanica.

Dosis (g/Kg) Suelo Ácido

CRA (%) Suelo Agrícola

CRA (%) Suelo Salino

CRA (%)

0 71±3d 60±2d 51±3e 25 82±4c 75±5c 69±3d 40 99±2b 88±13bc 104±5c 50 139±11a 101±4b 142±9b 60 145±12a 143±13a 157±2a

Sig(1) *** *** ***

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Demanda química de oxígeno (DQO) y demanda biológica de oxígeno (DBO5).

En los valores de DQO que se muestran en la Tabla III.7, se puede observar

como la adición de Posidonia oceanica como enmienda orgánica tuvo un

comportamiento diferente en función del tipo del suelo analizado. Respecto a los

suelos sin enmendar, se encontró que tanto el lixiviado obtenido del suelo ácido como

el del agrícola mostraron un valor de DQO diez veces mayor que el del suelo salino

(Tabla III.7). Este comportamiento podría relacionarse con el contenido en materia

orgánica de cada suelo, de forma que los suelos más ricos en materia orgánica (Tabla

III.1), fueron también los que mostraron mayores valores de DQO (Tabla III.7). Así, en

el suelo salino el valor de MO oxidable fue un 68% y un 56% menor que el de los

suelos ácido y agrícola respectivamente (Tabla III.1). Los bajos contenidos de materia

orgánica del suelo salino podrían ser atribuidos al menor aporte de restos biológicos

recibidos por este suelo, provocado por la imposibilidad de desarrollo de organismos,

tanto animales como vegetales, en el mismo, a no ser que se trate de especies

adaptadas a estos entornos altamente salinos (Gracia et al., 2012). Estos resultados

Experiencia I

49

sugieren que fue la materia orgánica soluble presente en el lixiviado la que contribuyó

principalmente a los valores de DQO obtenidos.

La tendencia mostrada para la DQO en los suelos ácido y agrícola fue la de

disminuir este valor a medida que aumentó la dosis de Posidonia aplicada como

enmienda, hasta la dosis de 50g/kg, a partir de la cual el valor de este parámetro se

mantuvo prácticamente constante (Tabla III.7). La justificación a este comportamiento

podría estar en el tiempo de obtención de los lixiviados para cada una de las dosis de

enmienda estudiadas. Así, a medida que aumentó la cantidad de enmienda adicionada

a los suelos, el tiempo el tiempo de lixiviación se redujo significativamente y por tanto,

la interacción entre el agua aplicada y la mezcla suelo-enmienda. Este hecho pudo dar

lugar a que la cantidad de materia orgánica solubilizada desde estas mezclas fuese

significativamente menor a la solubilizada desde los suelos no enmendados. El hecho

de que no haya diferencias estadísticamente significativas en el valor de DQO entre la

dosis de 50g/kg y 60g/kg (Tabla III.7), fue debido a que, entre estas dos muestras, el

tiempo de interacción fue muy parecido y por tanto la cantidad de materia orgánica

solubilizada también lo fue. Como se ha mencionado antes, la oxidación de materia

orgánica presente en los lixiviados fue el principal proceso que dio lugar a los valores

de DQO obtenidos, por lo que esas variaciones en la cantidad de materia orgánica

solubilizadas desde los suelos enmendados con distintas dosis, justificarían la

variabilidad de los valores de DQO en los lixiviados procedentes de los suelos agrícola

y ácido.

Tabla III.7. Demanda química de oxígeno (DQO).

Dosis (g/Kg) Ácido Agrícola Salino

0 312±16a 254±23a 41±3e 25 243,6±0,1b 195±9b 51±2c 40 176±8c 169±4c 79±5b 50 127±10d 120±11d 129±11a 60 129±5d 124±8d 144±10a

Sig(1) *** *** *** *Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).


50

Respecto al suelo salino, el valor de DQO aumentó a medida que lo hizo la

dosis de enmienda aplicada (Tabla III.7). Este comportamiento sugiere que el

incremento de la DQO fue debido a un aumento del contenido en materia orgánica

soluble en el lixiviado proveniente de la Posidonia. Es decir, la enmienda adicionada

contribuyó a aumentar la cantidad de materia orgánica soluble del lixiviado y por tanto

el valor de DQO (Tabla III.7)

En relación a la DBO5, el comportamiento fue similar al observado en la DQO

para los tres suelos en estudio (Tabla III.8). El hecho de que los valores de DQO sean

superiores a los de DBO5, es indicativo de que además de materia orgánica, en el

lixiviado había otras sustancias inorgánicas susceptibles de ser oxidadas (Tablas III.7

y III.8), si bien fue la materia orgánica la sustancia que principalmente contribuyó al

valor de DQO observado.

Tabla III.8. Demanda biológica de oxígeno en 5 días (DBO5).


0 98±1a 87±4a 30±1d 25 83±2b 76±4b 33±1d 40 76,1±0,5c 66±3c 49±1c 50 41,3±1d 38±1d 72±4b 60 39±3d 30±2e 80±2a


Relaciones entre DQO/DBO5 y DBO5/DQO.

A partir de los valores de DQO y DBO5 recogidos en las Tablas III.7 y III.8 se

calcularon las relaciones DQO/DBO5 y DBO5/DQO (Tablas III.9 y III.10). A la relación

DQO/DBO5 se le conoce como índice de biodegradabilidad e indica cómo de

biodegradable es la materia orgánica que poseen los lixiviados. En función del valor de

la relación DQO/DBO5 los lixiviados obtenidos para los tres suelos en estudio y para

las distintas dosis de enmienda aplicadas se podrían clasificar como (Kjeldsen et al.,

2002; Timur et al., 2004):

Experiencia I

51

DQO/DBO5 <1,5 ⇒ Lixiviados con materia orgánica muy degradable

DQO/DBO5 =1,5-10 ⇒ Lixiviados con materia orgánica moderadamente

degradable

DQO/DBO5 >10 ⇒ Lixiviados con materia orgánica poco degradable.

Tabla III.9. Relación entre DQO/DBO5.


0 2,6±0,1d 3,5±0,3b 1,36±0,07d

25 2,93±0,09b 2,5±0,1c 1,54±0,09c 40 2,31±0,05c 2,5±0,2c 1,6±0,1c 50 3,0±0,1b 3,1±0,1b 1,79±0,01b 60 3,30±0,07a 4,1±0,3a 1,8±0,1a


Los valores de la relación DQO/DBO5 mostrados en la Tabla III.9 son

indicativos de que la materia orgánica presente en todos los lixiviados era

moderadamente degradable, a excepción del obtenido para el suelo salino sin

enmendar cuya materia orgánica fue muy degradable (Tabla III.9). Este resultado

sugiere que la materia orgánica soluble presente en el suelo salino era muy lábil, muy

poco transformada, mientras que la de los otros dos suelos y de la Posidonia

oceanica, estaba más humificada, es decir era más estable.

Cuando se analizaron los valores de la relación DBO5/DQO recogidos en la

Tabla III.10, se observó que los suelos ácido y agrícola, tanto enmendados como sin

enmendar, mostraron un valor de este parámetro por debajo de 0,4, en concreto los

valores de esta relación se situaron, en todos los casos, entre 0,2 y 0,4, por lo que

estos lixiviados podrían ser catalogados como biodegradables (Mendoza y López,

2004). Por el contrario, para el suelo salino sin enmendar y enmendado a las

diferentes dosis en estudio, el valor de este parámetro siempre se mantuvo por encima

de 0,5 indicando que se trataba de unos lixiviados muy biodegradables (Kjeldsen et al.,

2002; Timur et al., 2004). El hecho de que la adición de Posidonia como enmienda al

suelo salino redujese el índice DBO5/DQO es indicativo de que la Posidonia oceanica

aportó al lixiviado materia orgánica soluble menos biodegradable que la que contenía


52

este suelo, es decir, redujo ligeramente la biodegradabilidad del lixiviado. Este

comportamiento implicaría la liberación en la zona radicular de compuestos

inorgánicos procedentes la biodegradación del lixiviado se reduciría, lo que limitaría el

valor fertilizante de los mismos.

Tabla III.10. Relación entre DBO5/DQO.


0 0,38±0,02b 0,28±0,02c 0,8±0,1a 25 0,34±0,01c 0,40±0,03a 0,650±0,005b 40 0,43±0,01a 0,39±0,02a 0,62±0,03c 50 0,32±0,02d 0,32±0,02b 0,55±0,005d 60 0,30±0,02d 0,24±0,02c 0,56±0,03d


Contenido en macronutrientes en los lixiviados.

En la Tabla III.11, se muestran la variación de la concentración de

macronutrientes en los lixiviados recogidos para los diferentes suelos enmendados a

las distintas dosis de Posidonia oceánica en estudio, así como el contenido de sodio

en dichos lixiviados.

Para el suelo ácido, todos los macronutrientes mostraron la misma tendencia

(Tabla III.11), de forma que a medida que aumentó la cantidad de enmienda

adicionada al suelo, también lo hizo la concentración de todos los macronutrientes.

Dado que la concentración de estos tres nutrientes no suele ser muy alta en el

complejo de cambio de los suelos ácidos (Andrades y Martínez, 2014), la enmienda de

este suelo con Posidonia oceanica supuso un enriquecimiento del mismo en dichos

nutrientes, de forma proporcional a la dosis de enmienda aplicada. Aspecto que

resultaría positivo ya que el lixiviado que llegaría a la zona radicular del cultivo tendría

un efecto fertilizante respecto a estos macronutrientes.

En relación al suelo agrícola, la variación del contenido en macronutrientes fue

diferente a la del suelo ácido (Tabla III.11). Respecto a la concentración de Ca2+, ésta

Experiencia I

53

disminuyó de forma proporcional a la dosis de enmienda aplicada, debido a que a

medida que aumentó la dosis de Posidonia, la proporción de suelo en la muestra se

redujo y también la elevada concentración de Ca característica de los suelos calizos

(Tabla III.11). Por el contrario, la concentración de Mg+2 y K+ aumentaron hasta

alcanzar un valor máximo para la dosis de 40g/kg de Posidonia oceanica, para luego

disminuir de forma significativa a las dos dosis más altas de enmienda (Tabla III.11).

De nuevo, el descenso de estos nutrientes observado en los lixividados obtenidos a

las dosis de 50 y 60 g/kg de enmienda podría relacionarse con el menor tiempo de

percolado de dichos tratamientos. De hecho, se pasó de un tiempo de percolación de

20 minutos para la dosis de 20g/kg a 8 y 7 minutos para las dosis de 50 y 60 g/kg

respectivamente. Estas diferencias tan marcadas en los tiempos de percolación

redujeron significativamente la interacción entre el agua y la mezcla suelo-Posidonia,

modificando los procesos de solubilización, y en consecuencia, disminuyendo la

cantidad de magnesio y potasio solubilizada.

Por último destacar que la tendencia mostrada por los macronutrientes en los

lixiviados obtenidos con el suelo salino fue similar a la observada para suelo agrícola,

ya que ambos suelos eran calizos, encontrándose únicamente diferencias en cuanto a

las concentraciones de los mismos en los lixiviados, las cuales fueron más elevadas

en el suelo salino, lo que sería consecuencia de la elevada cantidad de sales

presentes en el mismo.

En relación al sodio, cabe destacar aunque no se considera un macronutriente

para los cultivos, salvo para las plantas halófitas, también fue analizado debido a las

altas concentraciones que presenta la Posidonia oceanica en la costra salina que

recubre sus frondes. De los resultados mostrados en la Tabla III.11 se deduce que la

tendencia de este catión fue igual para los tres suelos en estudio (salino, agrícola y

ácido), lo que es indicativo que el proceso de solubilización de este elemento vino

controlado por la Posidonia oceanica. En los tres casos, la concentración de este

catión aumentó a medida que lo hizo la dosis de enmienda adicionada a los suelos,

hasta alcanzar un valor máximo para la dosis de 50g/kg de Posidonia oceanica, no

existiendo diferencias significativas entre ésta dosis y la de 60g/kg (Tabla III.11). El

hecho de que no existan diferencias significativas en el contenido en Na+ entre los

lixiviados obtenidos con las dos dosis más altas de enmienda podría ser debido a que

la velocidad de percolación del agua adicionada para obtener el lixiviado fue muy


54

similar en ambos tratamientos, lo que se tradujo en que el proceso de solubilización

del Na+ procedente de la superficie de la Posidonia fuese similar en ambos casos.

Tabla III.11. Concentración de macronutrientes en los lixiviados procedentes del suelo

ácido enmendado con Posidonia oceanica a las diferentes dosis en estudio.

Dosis (g/Kg) Na(mg/L lix) Ca(mg/L lix) Mg(mg/L lix) K(mg/L lix)

Suelo Acido

0 0,19±0,03d 46,6±0,8d 11,2±0,5e 1,3±0,4e 25 10±1c 77,4±0,8c 17±1b 22,2±0,8d 40 23,5±0,4b 103,4±0,5b 27,5±0,3d 26,5±0,4c 50 110±6a 135 ± 8a 42,6±0,2c 39,3±0,3b 60 95±10a 146 ±10a 89,0±0,6a 69±1a

Sig(1) *** *** *** ***

Suelo Agrícola

0 1,10±0,02d 249±13a 57±2e 24±1e 25 15±1c 153±9c 85±3c 27±1d 40 20±1b 179±8b 165±8a 71±2c 50 99±3a 124±9d 148±2b 56±2b 60 95±2a 82±5e 74±6d 42±1a

Sig(1) *** *** *** ***

Suelo Salino

0 15,1±0,2d 365±12a 164±2d 30±8e 25 36±8c 163±4b 178±5c 33±3d 40 59±1b 157±1c 234±2a 138,1±0,5a 50 95±5a 132±2d 195±5b 134±2b 60 93±1a 61±3e 86±2e 76±3c

Sig(1) *** *** *** *** *Los datos mostrados son la media ± SD de 3 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Concentración de micronutrientes en los lixiviados

En la Tabla III.12 se muestran las concentraciones de los micronutrientes en

los lixiviados recogidos de los distintos suelos enmendados con Posidonia oceanica a

las diferentes dosis en estudio.

Experiencia I

55

Tabla III.12. Concentración de micronutrientes en los lixiviados procedentes del suelo ácido enmendado con Posidonia oceanica a las diferentes dosis en estudio.

Dosis(g/Kg) Fe(mg/L lix) Cu(mg/L lix) Mn(mg/L lix) Zn(mg/L lix)

Suelo Ácido

0 0,211±0,003a 0,21±0,05a 0,53±0,02a 0,16±0,04a 25 0,092±0,007b 0,16±0,03a 0,50±0,03a 0,14±0,08a 40 <0,01c 0,17±0,04a 0,48±0,04ab 0,134±0,007a 50 <0,01c 0,0728±0,0008b 0,44±0,02b <0,01b 60 <0,01c 0,071±0,001b 0,42±0,03b <0,01b

Sig(1) *** *** * **

Suelo Agrícola

0 0,038±0,004a 0,1133±0,0004a <0,01 0,015±0,004a 25 <0,01b <0,01b <0,01 <0,01b 40 <0,01b <0,01b <0,01 <0,01b 50 <0,01b <0,01b <0,01 <0,01b 60 <0,01b <0,01b <0,01 <0,01b

Sig(1) *** *** ns *

Suelo Salino

0 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 25 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 40 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 50 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 60 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Sig(1) ns ns ns ns

*Los datos mostrados son la media ± SD de 3 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Como se observa en la Tabla III.12, la tendencia observada para cada uno de

estos elementos fue similar para los dos suelos calizos (agrícola y salino), en los

cuales la baja solubilidad de estos elementos a los valores de pH de los suelos con y

sin enmienda dieron lugar a que la contracción en los lixiviados fuese inferior a 0,01

mg/L.

En relación al suelo ácido, por su valor de pH (Tabla III.1), la solubilidad de Fe,

Cu, Mn y Zn fue más elevada que en la de los suelos calizos (agrícola y salino). Sin

embargo, al enmendar el suelo ácido con Posidonia oceanica, la solubilidad de los

micronutrientes disminuyó a medida que la dosis de enmienda aumentó (Tabla III.12).


56

Este comportamiento estaría asociado a los cambios de pH que experimentó el suelo

ácido al añadirle una enmienda alcalina, pasando de un valor de pH de 5,7 para el

suelo sin enmendar a 6,5 para el suelo enmendado a la dosis más alta de Posidonia

(Tabla III.4).

En el trabajo realizado por Brady y Weil (1996) se muestra como varía la

disponibilidad de los micronutrientes en un suelo en función del pH del mismo. De

acuerdo con este trabajo, el Fe presentaría una solubilidad máxima en el intervalo de

pH 4-6 (Brady y Weil, 1996), por lo que tiene sentido que al aumentar el pH del

lixiviado por encima de pH 6 (a partir de la dosis 20g/kg de Posidonia, Tabla III.4), su

concentración en el mismo se redujese (Tabla III.12). En relación al Mn, este elemento

presenta una disponibilidad máxima en el intervalo de pH de 5,0-7,5, es por ello que

cabría esperar que, como el máximo valor pH de los lixiviados se situó en 6,5 para la

dosis de 60 g/kg (Tabla III.4), la solubilidad de este nutriente no debería haberse visto

afectada. Sin embargo, se observó un ligero descenso para las dosis más altas de

enmienda (50 y 60 g/kg) (Tabla III.12). Este descenso podría ser debido a los menores

tiempos de percolación de estos tratamientos más que al incremento de pH del

lixiviado, ya que para todos los tratamientos el valor de este parámetro se situó en el

intervalo de máxima disponibilidad del Mn (Tablas III.4 y 12). En relación al Zn y al Cu,

la situación fue similar a la del Mn, de forma que en todos los tratamientos

independientemente de la cantidad de Posidonia adicionada al suelo, el valor de pH de

los lixiviados se situó dentro del intervalo de máxima solubilidad de estos elementos

(pH 5-7) (Brady y Weil, 1996). En consecuencia, el ligero descenso en la

concentración de Zn y de Cu de los lixiviados obtenidos para las dosis de enmienda de

50 y 60 g/kg, fue debido a los menores tiempos de percolación de estos tratamientos

que dieron lugar a que el tiempo de interacción entre el agua y la mezcla suelo-

enmienda fueran significativamente menores y por tanto que la solubilización de estos

nutrientes consecuentemente se redujera.

Experiencia I

57

III.2.3. ENSAYO 3: EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS LIXIVIADOS OBTENIDOS

DE SUELOS ENMENDADOS CON Posidonia oceanica EN LA GERMINACIÓN DE

Lycopersicum esculentum Mill.

En la Tabla III.13 se muestran los distintos parámetros de germinación

establecidos para Lycopersium esculentum Mill cuando las semillas fueron tratadas

con los lixiviados obtenidos de los tres suelos enmendados a las diferentes dosis con

Posidonia oceanica. En dicha Tabla se observa que, para el suelo ácido y el agrícola,

el porcentaje de germinación relativa (GRS) fue superior al 100%, tanto para los

suelos sin enmendar como para aquellos enmendados a las distintas dosis de

Posidonia oceanica (Tabla III.13). Estos resultados son indicativos de que el

porcentaje de germinación aumentó en todos los casos respecto a las semillas que

únicamente fueron regadas con agua destilada, lo que era de esperar teniendo en

cuenta la concentración de macro y micronutrientes en estos lixiviados (Tabla III.4). Al

comparar el valor de este parámetro entre los distintos tratamientos, no se encontraron

diferencias significativas entre las semillas tratadas con el lixiviado del suelo sin

enmendar y las tratadas con el lixiviado de los suelos enmendado a unas dosis de 25 y

40 g/kg (Tabla III.13). Sin embargo, el porcentaje de germinación se redujo

significativamente para las dos dosis de enmienda más altas (50 y 60 g/kg) (Tabla

III.13). Esta reducción podría ser consecuencia del incremento de CE en estos

lixiviados (Tabla III.4), lo que pudo generar un ligero estrés salino que inhibió la

germinación de las semillas tratadas con dichos lixiviados (Tabla III.13). Del mismo

modo, el crecimiento radicular (CRR) y el índice de germinación (IG), presentaron

valores superiores al 100% salvo para la dosis de 60g/kg, para la que el valor de estos

parámetros se situó un 89% y un 97% respectivamente para el suelo ácido y un 95% y

un 96 % respectivamente para el suelo agrícola (Tabla III.13). De nuevo el descenso

en el valor de estos parámetros para las semillas tratadas con el lixiviado del suelo

enmendado a una dosis de 60g/kg, pudo ser consecuencia del incremento de la

salinidad (Tablas III. 4 y 13). Cabe destacar que el tratamiento de las semillas con los

lixiviados procedentes del suelo enmendado a las dosis de 25 y 40 g/kg aumentó el

porcentaje de CRR e IG significativamente respecto a las semillas tratadas con el

lixiviado del suelo sin enmendar. Este comportamiento sugiere que la Posidonia

oceanica pudo liberar una serie de compuestos orgánicos al lixiviado, lo cuales

tuvieron un efecto bioestimulante del proceso del crecimiento de la raíz (Bagur et al.

2011).


58

Tabla III.13. Determinación de los parámetros de germinación en tomate.

*Los datos mostrados son la media ± SD de 30 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).GRS: Germinación relativa CRR: germinación relativa; IG: Índice de germinación.

El efecto de los lixiviados obtenidos a partir del suelo salino sobre el proceso de

germinación de las semillas de tomate fue diferente al encontrado para los suelos

agrícola y ácido (Tabla III.13). En este caso, el tratamiento de las semillas de tomate

con el lixiviado procedente del suelo sin enmendar, redujo el valor de GRS, CRR e IG

en un 52, 54 y 78% respectivamente respecto a las semillas regadas con agua

destilada (Tabla III.13). Esta reducción de la germinación podría atribuirse a la elevada

conductividad que presentó este lixiviado (15,3dS/m, Tabla III.4). De hecho, estudios

realizados por Chinnusamy et al. (2005) confirman que la tasa de germinación de las

Dosis (g/Kg) GRS (%) CRR (%) IG (%)

Suelo Ácido

0 119±8a 106±4b 126±6c 25 124±8a 132±1a 163±4a 40 112±6ab 129±7a 144±7b 50 108±6b 105±3b 113±3d 60 109±2b 89±1c 97±2e

Sig(1) *** *** ***

Suelo Agrícola

0 114±6a 117±2c 133±3c 25 112±3a 139±7a 156±3a 40 118±7a 122±1b 144±2b 50 102±7b 114±3c 116±4d 60 101±1b 95±5d 96±4e

Sig(1) *** *** ***

Suelo Salino

0 48±3d 46±1d 22±1d 25 50±2d 57±5c 29±1c 40 63±2c 52±5c 33±4c 50 82±5b 85±7b 70±2b 60 100±10a 94±3a 94±2a

Sig(1) *** *** ***

Experiencia I

59

semillas de tomate se inhibe considerablemente cuando se produce en un medio con

una CE superior a 2,5dS/m. Si se tiene en cuenta que en este estudio las semillas de

tomate germinaron en un medio con una conductividad 6 veces mayor a el valor límite

dado por Chinnusamy et al (2005), la importante reducción en los valores de GRS,

CRR e IG estaría más que justificada. Existen estudios en los que se trataron semillas

de diversos cultivares de tomate con concentraciones crecientes de una disolución de

NaCl, encontrando que el porcentaje de germinación disminuye progresivamente a

medida que aumenta la salinidad del medio, y a su vez el período de germinación se

vuelve más largo (Cuartero y Fernández-Muñoz, 1999; El-Habbasha et al., 1996),

aunque el efecto de la salinidad sobre el crecimiento radicular depende en gran

medida de la variedad, encontrándose una elevada variabilidad genotípica (Abrisqueta

et al., 1991; Fraschina y Chiesa, 1993, Pérez-Alfocea et al., 1993).

Por otro lado, el tratamiento de las semillas de tomate con los lixiviados

obtenidos de los suelos enmendados a las diferentes dosis de Posidonia,

incrementaron el valor de estos tres parámetros respecto al de las semillas tratadas

con el lixiviado del suelo sin enmendar (Tabla III.13), llegando a alcanzar valores

próximos al 100% para la dosis de 60g/kg. Este comportamiento podría ser atribuido a

que a medida que aumentó la cantidad de enmienda adicionada a la muestra, la

proporción de suelo se redujo, lo que se tradujo en una dilución del contenido de sales

en el medio, pasando de unos valores de CE de 15dS/cm para el suelo sin enmendar

a 7dS/cm para el suelo enmendado con la dosis de 60g/kg (Tabla III.4). Esta reducción

del estrés salino al que estaban sometidas las semillas permitió que la germinación

aumentase significativamente. Sin embargo, un lixiviado con una conductividad de

7dS/cm sigue presentado una salinidad elevada como para que el porcentaje de

germinación aumente hasta el 100%, lo que sugiere que la Posidonia puedo liberar

sustancias con efecto elicitor al lixiviado, tales como compuestos antioxidantes, que

redujesen el estrés oxidativo generado por la salinidad con el consiguiente incremento

de la germinación y del crecimiento radicular (Kruma, et. al. 2016).

Experiencia I

61

III.3. Conclusiones.

En base a los resultados expuestos hasta el momento, se llega a las siguientes

conclusiones:

• De acuerdo con la caracterización físico-química de la Posidonia oceanica, ésta

puede ser empleada como enmienda orgánica de acuerdo con la legislación,

presentando unas características similares a las de otras enmiendas utilizadas

habitualmente en la agricultura tales como los purines, las gallinazas o el

vermicompost.

• La capacidad de retención de agua de los suelos enmendados con Posidonia

oceanica aumentó entre un 200 y un 300% dependiendo de las características

físico-químicas de suelos, propiedad que sería de gran interés en zonas de cultivo

áridas, debido a las escasas precipitaciones y la baja disponibilidad de agua de

riego en estas zonas.

• La composición de los lixiviados obtenidos de los suelos enmendados con

Posidonia dependió fundamentalmente del tiempo de percolación, el cual se redujo

a medida que la dosis de enmienda aumentó.

• De las distintas dosis de enmienda estudiadas, la aplicación de entre 25 y 40 g de

Posidonia/kg de suelo sería la dosis más adecuada para enriquecer la disolución

del suelo en macro y micronutrientes, y en compuestos orgánicos liberados por

Posidonia oceanica, sin llegar a salinizar demasiado el medio.

• De los tres suelos empleados en este estudio, calizo, calizo-salino y ácido, éste

último es el que mostró mayores ventajas tras su enmienda con Posidonia

oceanica, ya que elevó el pH del medio hasta los valores de máxima disponibilidad

de los nutrientes del suelo y enriqueció la disolución del suelo en Ca, Mg, y K,

elementos que habitualmente no son abundantes en el complejo de cambio de los

suelos ácidos.

• La ventaja más importante de la enmienda con Posidonia oceanica de suelos

calizos muy salinos fue la reducción de la salinidad del medio.


62

• El tratamiento de semillas de tomate con los lixiviados procedentes de los suelos

ácidos y calizos enmendados con Posidonia tuvo un efecto bioestimulante de la

germinación y el crecimiento radicular a unas dosis de 25 y 40 g/kg, mientras que

para dosis de 60 g/kg, la elevada salinidad del medio inhibió la germinación.

• La elevada salinidad de los lixiviados procedentes del suelo salino inhibió la

germinación de la semillas de tomate, sin embargo la enmienda de este suelo con

Posidonia oceanica, la incrementó sustancialmente hasta valores similares a los

obtenidos tras regar las semillas con agua destilada, debido a que reducción de la

salinidad del medio, así como a la liberación de sustancias con actividad elicitora

procedentes de la Posidonia que redujeron el estrés oxidativo al que estaban

sometidas estas semillas.

63

IV. EXPERIENCIA 2

Experiencia II

65

IV. EXPERIENCIA II: EMPLEO DE ARRIBAZONES DE Posidonia Oceanica

COMO SUSTRATO DE CULTIVO.

En esta experiencia se propone estudiar si los restos de Posidonia oceanica que

son retirados de las playas cada temporada podrían emplearse como una alternativa más

a los distintos sustratos de cultivo no inertes que existen hoy en día en el mercado.

IV.1. Materiales y Métodos.

IV.1.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de Posidonia

oceanica como sustrato de cultivo.

Para la realización de este estudio se emplearon arribazones de Posidonia

oceanica, procedente de la Playa de La Marineta Casiana en Denia (Alicante), al igual que

en la Experiencia I. Una vez en el laboratorio, los residuos de Posidonia oceanica, fueron

cribados, primero por un tamiz de 2,0 mm y a continuación con un tamiz de 0,5 mm, con

el objetivo de retirar materiales no deseados tales como plásticos, vidrios, concha, arena,

colillas, etc…, que podrían encontrarse en los arribazones de Posidonia oceanica

muestreados. Tras el cribado, una fracción de Posidonia oceánica (PSL) fue caracterizada

para establecer su idoneidad como sustrato de cultivo no inerte, incluyendo aquellos

parámetros que exige la legislación, así como otros que resultaron de interés para poder

evaluar el efecto de la Posidonia oceanica en el desarrollo de un cultivo. Mientras que una

segunda fracción de Posidonia oceánica (PL) fue lavada repetidas veces tras el cribado,

primero con agua de red y finalmente con agua destilada, con el fin de eliminar los restos

de sal que pudiese tener en la superficie. Posteriormente fue secada en estufa a 40ºC y

caracterizada, determinando los mismos parámetros que en la Posidonia oceanica que

solo fue cribada (PSL).

El motivo de realizar dos tipos de acondicionamiento diferentes a los arribazones

de Posidonia oceanica recogidos en la playa es que fueron los que posteriormente se

emplearon en ensayos posteriores para el desarrollo de un cultivo.


66

Los parámetros determinados en PSL y PL fueron los que se describen a continuación:


Ambos parámetros fueron medidos según la metodología descrita en la Norma

ISO 10390:1994(E), tal y como se describe en el apartado “Materiales y Métodos” del

Ensayo 1 de la Experiencia 1.

Determinación del contenido fenólico total.

Para la determinación del contenido fenólico total se siguió el procedimiento

descrito por Oliveira et al. (2012). Se pesaron 0,5g de muestra seca y molida por triplicado

y a continuación, se extrajo secuencialmente con 20mL de metanol:agua (50:50, v:v) y

20mL de acetona:agua (70:30, v:v). Para cada extracción, la muestra se llevó a un

agitador de volteo durante un tiempo de 60 minutos, centrifugándose seguidamente a

4500rpm, durante 15 minutos y a temperatura ambiente. Los sobrenadantes de cada una

de las extracciones se reunieron en un matraz aforado de 50mL.

Para la determinación de los fenoles totales se pipetearon 10mL del sobrenadante,

a continuación, se adicionaron 3 gotas de reactivo Folin-Cicoalteu y 3 gotas de NaOH al

30% (p/v), se agitó, se dejó reposar 5 minutos y se filtró la muestra con un filtro de 45µm y

se pasó a medir la absorbancia a 700nm en un espectrofotómetro.

Los resultados se expresaron como mg de ácido gálico (GA)·Kg-1MF.

[Fenoles Totales] = (mg GA

Kg Fruto) = ppm ×

V(mL)

Peso Muestra(g)

Dónde;

ppm= Concentración de fenoles totales en el extracto en expresada en mg·L-1.

V (mL)= volumen de extracto.

Peso Muestra (g)= Peso seco en gramos de muestra empleada en la determinación.

Experiencia II

67

Determinación del contenido de macro y micronutrientes.

El análisis cuantitativo de Na, Ca, Mg, K, Fe, Cu, Mn y Zn, fue llevado ICP-OES

(Perkin Elmer, Optima 4300 DV), previa calcinación de 5g de muestra en horno mufla y

posterior digestión ácida de la misma (Cozza, et. al., 2011).

IV.1.2. ENSAYO 2: Desarrollo de plantas de tomate empleando Posidonia oceanica

como sustrato de cultivo.

En este ensayo se evaluó la efectividad de tres sustratos de cultivos diferentes:

Posidonia oceanica cribada y sin lavar (PSL), Posidonia oceanica cribada y lavada (PL) y

fibra de coco (FC) (Figura IV.1). La única diferencia entre los dos sustratos de Posidonia

oceanica fue el acondicionamiento al que fueron sometidos, el cual se describe en el

Ensayo 1 de esta misma experiencia. La fibra de coco fue empleada como sustrato

control, debido a su demostrada eficacia como sustrato de cultivo no inerte.

Figura IV.1. Sustratos de cultivos empleados en el estudio: 1- Fibra de coco (FC), 2-

Posidonia oceanica cribada y lavada (PL) y 3- Posidonia oceanica cribada y sin lavar

(PSL).

Para determinar la eficacia de la Posidonia oceanica como sustrato para el

desarrollo de un cultivo de tomate, en primer lugar, tiestos de 5L de capacidad fueron

rellenados con los tres sustratos de cultivo a evaluar (FC, PSL y PL) que fueron colocados

al módulo 2 del invernadero 2 (Figura IV.2A) de la Universidad de Alicante, localizado a


68

38º22’47.7” N y 0º 311’38.8”W durante 3 meses (abril-junio 2016). Este módulo estaba

dotado con 6 mesas móviles, con calefacción por disipación de calor, enfriador

evaporativo y luces de asimilación de 400 W y con diferentes sistemas de control climático

(apertura de puertas, ventilador, evaporador, sistema de niebla, calefacción, etc.). (Figura

IV.2B).

Figura IV.2. Módulo 2 del invernadero empleado para la realización de este estudio (A);

Invernadero 2 de la Universidad de Alicante (B).

En cada una de las mesas se colocaron 8 tiestos por cada uno de los sustratos de

cultivo a evaluar: fibra de coco (FC), Posidonia oceanica cribada y lavada (PL) y

Posidonia oceanica cribada (PSL).

La distribución de los tiestos se realizó tal y como se muestra en la Figura IV.3.

Experiencia II

69

Figura IV.3. Distribución de los tiestos con los tres sustratos de cultivo en estudio en el

módulo del invernadero.

Se realizó una instalación de riego por goteo con un caudal de 80 mL/min por

tiesto. En cada tiesto, a excepción de los tiestos 1, 9 y 17, se trasplantó una plántula de

tomate cv Seny F1 de unos 12 cm de altura. Los tiestos sin planta (1, 9, 17) se utilizaron

para determinar el volumen de disolución tomado por la planta y el lixiviado que se

generaba cada 24 horas, y poder de esta forma establecer un calendario de riego lo más

ajustado posible a las necesidades del vegetal. Para ello se midió diariamente el volumen

de los lixiviados, tanto de los tiestos con plantas como lo que no contenía planta, y el pH y

CE de los mismos.

El módulo de experimentación también estaba dotado de un tanque y una bomba

de riego. En dicho tanque se preparó la disolución nutritiva que se utilizó para fertirrigar

las plantas, cuya composición se fue modificando a lo largo del desarrollo del cultivo para

atender a las necesidades nutricionales en los diferentes momentos fenológicos de las

plantas de tomate. La disolución nutritiva de partida fue la propuesta por Martínez y

García (1993) para un cultivo de tomate (Tabla IV.4).


70

Tabla IV.4. Composición de la disolución nutritiva empleada para fertirrigar las plántulas

de tomate al inicio del ensayo (Martínez y García, 1993).

Nutriente Compuesto Concentración (mM)

N-NO3- Ca(NO3)2·4H2O, KNO3, NH4NO3 12

N-NH4+ NH4NO3 0,5

P-PO43- KH2PO4 1,5

K-K+ K2SO4, KNO3, KH2PO4 7,5

Ca-Ca2+ Ca(NO3)2·4H2O 3,5

Mg-Mg2+ MgSO4·7H2O 1,25

S-SO42- K2SO4, MgSO4·7H2O, MnSO4·H2O,

CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O

2

Fe-quelado Fe EDTA 3,6·10-2

Mn-Mn2+ MnSO4·H2O 1,3·10-2

Cu-Cu2+ CuSO4·5H2O 3,1·10-4

Zn-Zn2+ ZnSO4·7H2O 1,4·10-3

B-Borato H3BO3 4,6·10-2

Molibdato (NH4)6Mo7O24·4H2O 5,9·10-6

Las condiciones ambientales para el desarrollo del cultivo fueron: temperatura

entre 18º/25ºC (noche/día) y una HR del 60%. También se utilizaron las luces de

asimilación entre las 7:00 a 9:00 h y de 17:30 a 20:00h. Para llevar a cabo una correcta

polinización, a los 20 días de desarrollo de cultivo (primera floración) se instaló en el

invernadero una colmena de Bombus terrestris (Figura IV.4).

Figura IV.4. Ubicación de colmena de Bombus terrestris

Experiencia II

71

El cultivo se mantuvo hasta la aparición del segundo racimo floral, retirando las

plantas tras la maduración de los tomates de dicho racimo.

IV.1.2.1. Parámetros de crecimiento del cultivo.

Determinación del peso fresco y seco.

Una vez finalizada la experiencia de cada planta se separó la parte aérea de la

parte radicular, y se pesaron en fresco. A continuación, se secaron a 60ºC y hasta peso

constante, obteniendo el peso seco de cada una de las partes de la planta.

Determinación del número de racimos florales, flores y frutos.

Durante el periodo de desarrollo del cultivo se contaron el número de racimos

florales por planta y el número de flores y frutos cuajados por racimo.

IV.1.2.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales.

Determinación del contenido foliar de clorofilas.

La cuantificación de las clorofilas foliares se realizó siguiendo el método propuesto

por Abadía et al. (1984). Para ello se pesó 1 g de material fresco, que se troceó y se

introdujo en un vaso de precipitado con 25 mL de metanol y 0,1 g de CaCO3. Cuando el

material vegetal presentó un color blanco como consecuencia de la pérdida de los

pigmentos (aproximadamente 4 horas), se tomó 1 mL de la disolución y se llevó a 25 mL

con agua destilada. Finalmente se midieron las absorbancias a tres longitudes de onda:

663, 645 y 470 nm.


72

Empleando las siguientes ecuaciones (Lichtenthaler, 1987; Porra, 2002) se

determinó la concentración en mg/g de clorofila a, clorofila b y clorofilas (a+b):

Clorofila Total (mg/L extracto) = 8,02·A663 + 20,21· A645

Clorofila a (mg/L extracto) = 12,7·A663- 2,69·A645

Clorofila b (mg/L extracto) = 22,9·A645- 4,68·A663

Dónde;

A663, A645 y A470, es la absorbancia a las distintas longitudes de onda: 663, 645 y 470 nm

respectivamente.

Determinación del contenido foliar en malondialdehído (MDA).

La determinación se realizó de acuerdo al método propuesto por Restrepo-Díaz y

Garces-Varon (2013). Se pesaron 0,3 g de hojas que se homogenizaron en un mortero

añadiéndole 3 mL de ácido tricloroacético al 0,1%. Posteriormente se filtró la muestra

homogenizada con papel de filtro. Del filtrado se tomó 1mL que se depositó en un tubo de

ensayo al que se le agregó 3mL de una mezcla (1:1) de ácido tricloroacético 10% (p/v) y

ácido tiobarbitúrico 0,65 % (p/v). Seguidamente la muestra se mantuvo en un baño

termostatizado a 95ºC durante 25 min, tapando los tubos de ensayo con tapones durante

ese tiempo para evitar las pérdidas por evaporación. Tras ello, se trasvasaron las

muestras a tubos de centrífuga, y se introdujeron en un baño de hielo para detener la

reacción. Una vez alcanzada la temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron

durante 25 min a 12.000rpm. El sobrenadante de cada muestra se depositó en una cubeta

de cuarzo para medir la absorbancia a 532 nm y 600 nm, usando como blanco una

mezcla de 1,5mL de ácido tiobarbitúrico 0,65% y 1,5mL de ácido tricloroacético 10%

(Restrepo et al., 2013).

Experiencia II

73

El contenido en MDA en mmol/L para cada tratamiento se calculó de acuerdo con

la siguiente expresión:

MDA (mmol

mL) = [(

A532 − A600

155000)] × 106

Dónde;

155.000M-1 cm-1 es el coeficiente de extinción molar del MDA y A532 y A600 son las

absorbancias obtenidas a las longitudes de onda 532 y 600 nm respectivamente.

Determinación de la concentración foliar de peróxido de hidrógeno (H2O2).

La concentración de H2O2 se midió por colorimetría como describen Jana y

Choudhuri (1982). El H2O2 se extrajo homogeneizando 0,2 g de muestra foliar con 3 mL

de tampón fosfato (50 mM; pH 6,8). La muestra se centrifugó a 10.000 rpm durante 25

minutos. A continuación, se recogieron 3mL del sobrenadante a los que se les añadió

1mL de cloruro de titanio 0,1% en H2SO4 al 20% (p/v), para centrifugar de nuevo 15

minutos a 10.000 rpm. Para calcular su concentración se midió su absorbancia a 410nm,

teniendo en cuenta que el coeficiente de extinción molar del H2O2 es de 0,28 µm-1·cm-1.

[H2O2] (µmol/ g peso fresco) = A210/ (0,28µm-1·cm·g muestra foliar)

IV.1.2.3. Parámetros de calidad del fruto.

Los tomates se recolectaron cuando alcanzaron un estado de madurez de

consumo, presentando unas características homogéneas en cuanto a forma, tamaño y

color, y sin evidencias de daños físicos (golpes, magulladuras, etc…), ni signos de

infección. Una vez recolectados los tomates fueron lavados con agua destilada, con el fin

de eliminar polvo y posteriormente se secaron con papel de celulosa para eliminar los

restos de agua sobre su superficie. Tras el lavado en los frutos determinaron los

siguientes parámetros:


74

Determinación de la producción.

Se recolectaron los tomates una vez había alcanzado en un estado de madurez de

consumo entre la semana 6 y la 10 del desarrollo del cultivo, ambas inclusive.

Determinación del calibre del fruto.

La medida del calibre se llevó a cabo utilizando un pie de rey digital, de acuerdo

con el Reglamento 790/2000 de la Comisión Europea.

Determinación de la dureza del fruto.

La dureza del fruto fue medida utilizando un penetrómetro con un puntal de 10mm.

Este parámetro se determinó en dos secciones opuestas y sin piel de cada fruto. El valor

medio de las lecturas representó la dureza media del fruto y se expresó en kg-fuerza

(Cantwell, 2004).

Determinación de la jugosidad del fruto.

Se determinó de acuerdo con Von Mollendorf et al. (1992). Los tomates se

trituraron en batidora hasta obtener una pasta homogénea. A continuación, 100g de esta

pasta se centrifugaron durante 15 minutos a 10.000 rpm. El líquido sobrenadante fue

decantado y pesado. La jugosidad se expresó como porcentaje del peso fresco total.

Determinación de la conductividad eléctrica.

Se midió con un conductímetro (Metler Toledo, SevenEasy S20) a partir del zumo

obtenido en la determinación de la jugosidad.

Experiencia II

75

Determinación de la acidez valorable.

Se tomaron alícuotas de 10 mL de zumo de tomate, a las que se les añadió agua

destilada hasta alcanzar un volumen de 50 mL. A las muestras se les añadió 3-4 gotas de

fenolftaleína al 1% (en etanol al 50%) como indicador. Y se valoraron con NaOH 0,1M. El

resultado se expresó como % de ácido cítrico (AOAC, 2005).

% Acidez =VNaOH × N × 0,0064

Vzumo tomate× 100

Dónde;

VNaOH es el volumen (mL) de NaOH consumido en la valoración; N es la normalidad de la

NaOH; 0,0064 son los miliequivalentes de ácido cítrico y Vzumo tomate es el volumen de

zumo de tomate en mL.

Determinación de los sólidos solubles (ºBrix).

Se determinó con un refractómetro manual, cuya lectura aparece en ºBrix, a partir

de una alícuota del extracto obtenido en la determinación de la jugosidad.

Determinación de la materia seca.

Para la determinación del porcentaje de materia seca, se troceó y trituró varias

unidades de fruto, de esa pasta se pesaron 50g y se secó la estufa a 65ºC hasta peso

constante (Von Mollendorf et al., 1992).


76

Determinación del contenido en vitamina C en los frutos.

La determinación de vitamina C se realizó a través del método oficial que indica la

AOAC (1990), a partir de una valoración volumétrica del ácido ascórbico presente en el

zumo de tomate, con 2,6-diclorofenolindofenol (2,6-DF-IF).

Para ello se pesaron 50g de tomate a los que se adicionaron 50mL de una

disolución metafosfórico-acético. La mezcla se trituró durante 2-3 minutos hasta conseguir

una pasta homogénea. A continuación, se filtró y se anotó el volumen total obtenido del

extracto. De ese extracto se tomaron 2mL que se valoraron inmediatamente con una

disolución de 2,6-diclorofenolindofenol hasta la aparición de un color rosa débil

persistente. Los resultados se expresaron en mg de ácido ascórbico/kg tomate fresco.

Determinación del contenido fenólico total.

Para llevar a cabo dicho ensayo se siguió el procedimiento de Oliveira et al (2013).

Se pesaron 0,5g de pasta de tomate congelada, una vez homogenizada se realizó la

extracción y se procedió de la misma forma que se describe en el Ensayo 1 de esta

misma experiencia.

Determinación del contenido en licopeno.

Se determinó de acuerdo a Urfalino et al. (2011). Se pesaron 0,6 g de muestra de

tomate triturada y se colocaron en un tubo de centrífuga de 50mL cubierto con papel de

aluminio que contenía 5mL de hidroxibutiltolueno al 0,05% en acetona, 5mL de etanol y

10 mL de n-hexano. Las muestras se centrifugaron a 1.000 rpm durante 15 minutos a 0ºC.

A continuación, se adicionaron 3mL de agua desionizada y se centrifugaron 5 minutos

más. Se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la

separación de fases polares y apolares. Finalmente se midió la absorbancia de la capa

superior (capa de hexano) de 50nm. Como blanco se utilizó n-hexano

Experiencia II

77

Licopeno (mg/kg)= 𝐴503∗ 536,9𝑔 ∗ 1𝐿 ∗ 103 𝑚𝑔 ∗ 10𝑚𝐿

17,2∗104 𝑀−1∗ 𝑐𝑚−1 ∗ 𝑚𝑜𝑙 ∗ 103 𝑚𝐿 ∗ 1𝑔 ∗ 1𝑘𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑟𝑎=

A503∗31,2

g muestra

Donde;

A503 es el valor de absorbancia obtenida a 503nm; 17,2·104 M-1·cm-1 es el coeficiente de

extinción molar para el licopeno en hexano.

Determinación de la concentración de antocianos.

La determinación de antonicianos se llevó a cabo de acuerdo con la metodología

descrita por Francis (1982). Para ellos se pesaron 20 g de muestra que se trituraron y se

mezclaron con 20 mL de etanol al 95% y HCl 1,5M. El macerado, se cubrió con parafilm y

se almacenó durante una noche a 4ºC. Posteriormente la mezcla se centrifugó durante 15

minutos a 4.500 rpm y temperatura ambiente. El residuo que quedó en el tubo de

centrífuga se lavó con una disolución de etanol acidificado y se centrifugó nuevamente.

Todos los sobrenadantes se reunieron y se llevaron a 100 mL con la disolución

extractante. El contenido total en antocianos se midió a una longitud de onda de 535 nm y

su concentración se calculó de acuerdo con la siguiente expresión:

Antocianos Totales (mg

kg Fruto) =

A535 × 106

98,2 × peso Muestra(g)

Donde;

A535 es el valor de absorbancia obtenida a 535 nm; 98,2 es el coeficiente de extinción

molar; p es el peso de la muestra de tomate en g.

Análisis estadístico.


condiciones desarrolladas sobre los distintos parámetros analizados, se realizó un análisis

de varianza de un factor (ANOVA), seguido del test post-hoc de Duncan para comparar


78

las medias, considerando que existen diferencias significativas con el p-valor ≤0,05. Se

realizó mediante el programa SPSS ® vs, 12.0.

Experiencia II

79

IV.2. Resultados y discusión.

IV.2.1. ENSAYO 1: Evaluación de las características físico-químicas de Posidonia


En el Real Decreto 865/2010, de 2 de julio, sobre sustratos de cultivo, se

describen las características que debe tener un sustrato para poder emplearlo. El pH

para poder emplear un sustrato debe ser superior a 1, salvo en productos clasificados

como peligrosos, en los que no se admite tolerancia alguna, según esto Posidonia

oceanica podría emplearse como sustrato (Tabla IV.5).

Tabla IV.5. pH, salinidad (CE) y concentración de fenoles totales en Posidonia

oceánica cribada (PSL) y cribada y lavada (PL).

Tratamiento pH CE (mS/m) [Fenoles](mg GA/Kg sustrato)

PL 7,9±0,1a 150±20b 0,098±0,002a

PSL 8,1±0,1a 1450±50a 0,057±0,004b

Sig(1) *** *** ***

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. PL: Posidonia oceanica cribada y lavada;

PSL: Posidonia oceanica cribada. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0,05).

En el RD no se establece unos valores máximos y mínimos de CE para los

materiales empleados como sustrato de cultivo. Únicamente se clasifican en tres

grupos: sustratos con CE< 50 mS/m; sustratos con CE entre 50-200 mS/m y sustratos

con CE > 200 mS/m. Por lo tanto, Posidonia oceanica podría emplearse como sustrato

ya que no existe límite de tolerancia para la conductividad eléctrica. Al comparar el

valor de CE en PL y PSL con un sustrato de cultivo no inerte como la fibra de coco

(90mS/m) se observa que la conductividad eléctrica de los sustratos PL y PSL fue 1,7

y 16 veces mayor que la fibra de coco (90 mS/m). El alto valor de CE de PSL sugiere

que su empleo podría generar un estrés salino en el vegetal, pero al no encontrar una

limitación por parte del RD, fue comprobada su efectividad como sustrato de cultivo en

ensayos posteriores.

En referencia a la concentración de macro, micronutrientes y de fenoles el RD

865/2010 no aporta información, por lo que no existen limitación respecto a estos

parámetros en cuanto al uso de los sustratos PL y PSL.


80

A continuación, en las Tablas IV.6 y IV.7 se muestran los resultados obtenidos

para los diferentes nutrientes en los distintos sustratos. El Na+ no se considera un

macronutriente, excepto para las halófitas, pero al estar presente en grandes

cantidades en la costra salina superficial que cubre los frondes de la Posidonia

oceanica, este elemento fue incluido en el estudio.

Tabla IV.6. Concentración de macronutrientes en la Posidonia oceanica cribada (PSL) y cribada y lavada (PL)

Tratamiento Na(mg/kg ms) Ca(mg/kg ms) Mg(mg/kg ms) K(mg/kg ms)

PL 0,042±0,003b 65,3±0,6b 45±2a 28±1b PSL 0,58±0,05a 67±1ab 44±3a 30±1a Sig(1) *** * *** **

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. PL: Posidonia oceanica cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0,05).

Tabla IV.7. Concentración de micronutrientes en la Posidonia oceanica cribada (PSL) y cribada y lavada (PL)

Tratamiento Fe(mg/kg ms) Cu(mg/kg ms) Mn(mg/kg ms) Zn(mg/kg ms)

PL <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 PSL <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 Sig(1) ns ns ns ns

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones. PL: Posidonia oceanica cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada. (1)Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0,05).



IV.2.2.1.Parámetros de crecimiento del cultivo.

Peso fresco y seco.

La Tabla IV.8 muestra el peso fresco y seco de la parte aérea y radicular de las

plantas de tomate desarrolladas en cada uno de los sustratos en estudio al final del

ensayo (3 meses).

Experiencia II

81

Tabla IV.8.Peso fresco y seco de la parte aérea (PFA y PSA) y de la raíz (PFR y PSR) de plantas de tomate desarrolladas en los tres sustratos de cultivo en estudio.

Tratamientos PFA (g) PSA (g) PFR (g) PSR (g)

FC 646±45a 171±23a 250±16a 20±2b PL 527±25b 100±9b 100±8b 36±4a

PSL 416±41c 67±6c 75±5c 14±1c Sig (1) *** *** *** ***

*Los datos mostrados son la media ± SD de 6 repeticiones FC: fibra de coco; PL: Posidonia oceanica

cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. (1) Significación: ns (sig>0,05);

*(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna

indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

En relación al peso fresco de la parte aérea (PSA) se observa que el valor de

este parámetro en las plantas cultivadas en fibra de coco (FC) fue un 36% mayor que

el de las cultivadas en Posidonia oceanica sin lavar (PSL) y un 18% superior al de las

cultivadas en Posidonia oceanica lavada (PL) (Tabla IV.8). De los dos tratamientos en

los que se utilizó Posidonia oceanica como sustrato, PL presentó un desarrollo

significativamente mayor al PSL (Tabla IV.8). Tal y como se recoge en la Tabla IV.8, el

peso fresco de la parte aérea de las plantas PL fue un 21% mayor al de las plantas

PSL. Estos resultados sugieren que la mayor concentración de sodio (Tabla IV.6) y la

CE del sustrato PSL (Tabla IV.5) pudieron provocar una situación de estrés salino en

las plantas cultivadas en este sustrato, lo que se tradujo en una inhibición del

crecimiento de la parte aérea (Goykovik y Saavedra, 2007).

Por el contrario, el lavado del sustrato PL, redujo significativamente tanto la CE

(Tabla IV.5) como la concentración de sodio (Tabla IV.6).

El peso fresco de la parte radicular (PFR) mostró un comportamiento similar al

observado para la parte aérea (Tabla IV.6), siendo las raíces de las plantas cultivadas

en FC las que mostraron un mayor desarrollo, seguidas de las plantas cultivadas en

PL y por último las cultivadas en PSL (Tabla IV.8), si bien la reducción del peso fresco

de las raíces de las plantas cultivadas en Posidonia oceanica respecto a las

desarrolladas en FC fue muy superior al encontrado en la parte aérea (Tabla IV.8).

Como se muestra en la Tabla IV.8, el peso fresco de las raíces FC fue un 70% mayor

que las de PSL y un 60% superior al peso de las raíces de las plantas cultivadas en PL

(Tabla IV.8). Estos resultados son indicativos de que el exceso de NaCl afectó más al

desarrollo radicular que el de la parte aérea, comportamiento que coincide con los

recogidos en los trabajos realizados por Romero (2001) y Goykovic y Saavedra (2003).


82

En relación al peso seco de la parte aérea (PSA) se observa la misma

tendencia que para el peso fresco (Tabla IV.8), siendo de nuevo las plantas cultivadas

en fibra de coco (FC) las que mostraron un mayor peso seco, seguido de las plantas

desarrolladas en Posidonia lavada (PL) y por último las cultivadas en posidonia sin

lavar (PSL) (Tabla IV.8). Por el contrario, en el peso seco de la parte radicular (PSR)

se observan diferencias en el comportamiento respecto al encontrado en el peso

fresco de este órgano vegetal (Tabla IV.8). Como se muestra en la Tabla IV.6, las

plantas con un mayor peso seco radicular fueron las cultivadas en Posidonia oceanica

lavada (PL), seguidas de las plantas cultivadas en fibra de coco (FC) y de nuevo

siendo el menor valor el observado para las plantas desarrolladas en PSL (Tabla IV.8).

El hecho de que la materia seca de las plantas FC sea menor que las PL, pero que su

peso fresco sea muy superior es indicativo de que las raíces de las primeras

presentaban un mayor contenido de agua que las de las plantas PL. Este resultado

sugiere que las plantas PL, podrían haber limitado la toma de agua a través de las

raíces, lo que de nuevo vendría a confirmar que estas plantas estaban desarrollándose

en un medio salino, y en consecuencia activaron los mecanismos de adaptación, de

forma que habrían cerrado los estomas para tomar menos agua por tanto limitar

también la toma de NaCl y mitigar de esta manera los efectos fitotóxicos de las altas

concentraciones de estos iones en los tejidos vegetales (Romero-Aranda et al., 2001;

Flexas y Medrano, 2002).

El hecho de que con el sustrato PSL las plantas no hayan activado esos

mecanismos de respuesta podría deberse a que las plantas PL presentan un mayor

contenido en compuestos fenólicos (Tabla IV.5), los cuales pueden actuar como

inductores de los mecanismos de respuesta bajo condiciones de estrés abiótico como

es la salinidad (Imtiaz et al., 2016), por lo que harían que para las plantas PL se

activasen, mientras que en las plantas cultivadas en PSL, con menor concentración de

fenoles, unido al hecho de que el estrés salino al que están sometidas dichas plantas

es más acusado, no se hayan desarrollado dichas estrategias.

Los resultados de este ensayo coinciden con los obtenidos por Salas et al.

(2001) quienes estudiaron el comportamiento de plantas de tomate sometidas a estrés

salino (0,5; 2,3; 3,1; 5,0 dS/m) y vieron como la salinidad disminuyó el número de

estomas, lo que se tradujo una disminución de la biomasa aérea. Del mismo modo

Romero (2001), encontró que la presencia de altas concentraciones de sales (35 y 70

mM NaCl) en el medio de cultivo provocaron una disminución del área foliar y menor

Experiencia II

83

altura de plantas de tomate. Al-Karaki, (2000), también observó que las plantas

desarrolladas en un medio salino (1,8; 3,6; 5,2; 7,2 y 8,8 dS/m), mostraron un menor

número de hojas y una densidad estomática menor. Además de clorosis y necrosis

principalmente en los bordes foliares.

Número de racimos florales, flores y frutos.

La Tabla IV.9 muestra el número de racimos florales por planta para los tres

sustratos en estudio y durante las tres primeras floraciones.

Tabla IV.9. Número de racimos, número de flores por racimo y número de frutos cuajados por racimo.

Primera Floración

Tto Racimos/Planta Flores/Racimo Frutos cuajados/Racimo

FC 1±0,001 7,7±0,5 4,1±0,4a PL 1±0,001 6,9±0,5 4,1±0,4a

PSL 1±0,001 9±0,8 3,1±0,4b Sig. (1) ns ns ***

Segunda Floración

FC 2,0±0,1 11,0±0,6 4,3±0,5a PL 1,9±0,4 11,0±0,6 4,7±0,5a

PSL 2,2±0,4 10,2±0,9 3,1±0,4b Sig. (1) ns ns ***

Tercera Floración

FC 2,1±0,4 10±1 3,4±0,5a PL 1,6±0,4 10±1 2,7±0,5ab

PSL 1,4±0,4 9,1±0,4 1,9±0,4b

Sig. (1) ns ns ***


cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. (1) Significación: ns (sig>0,05);



Se puede ver como en las tres floraciones no se encontraron diferencias

significativas en relación al número de racimos florales entre las plantas desarrolladas

en los tres sustratos (FC, PL, PSL; Tabla IV.8), siendo estos valores, en los tres

tratamientos, más bajos que los encontrados por otros autores para plantas de tomate

(Lycopersicum esculentum Mill.) cultivados bajo invernadero en cultivo hidropónico

(Pérez et al., 2012). Así, Pérez et al. (2012), estudiaron el rendimiento en cuatro


84

cultivares de tomate, obteniendo desde 6,35 a 7,25 racimos por planta. Esta diferencia

podría atribuirse a que los cuatro cultivares que estudiaron fueron variedades de

híbridos del tipo “manzano” y es sabido que unas variedades de tomates son más

productivas que otras (FAO, 2014).

Para la variable número de flores/racimo, en la Tabla IV.8 no se encontraron

diferencias significativas entre los tres sustratos de cultivo y para las tres floraciones

analizadas. En la primera floración, fueron las plantas cultivadas en Posidonia

oceanica sin lavar (PSL) las que mayor número de flores por racimo produjeron, en

concreto un 23% y un 31% superior al de las plantas cultivadas en fibra de coco (FC)

y Posidonia oceanica lavada (PL), respectivamente (Tabla.IV.9). El hecho de que las

plantas que menos crecieron (Tabla IV.6), tuviesen en la primera floración un mayor

número de flores por racimo, podría ser debido a que estas plantas estuvieron

sometidas a estrés salino, lo que se pudo traducir en un efecto “fuente/sumidero” más

notable, para asegurarse su reproducción (Castilla, 2004; Ramírez y Niehuis, 2012).

En dicho efecto las plantas habrían producido una mayor traslocación de metabolitos

desde la parte vegetativa (fuente) hacia la fracción reproductiva (sumidero), y en

consecuencia, el desarrollo vegetativo se habría ralentizado o incluso podría haberse

inhibido totalmente (Castilla, 2004; Ramírez y Niehuis, 2012). Este comportamiento ha

sido previamente observado en estudios con plantas de ciclo anual como el tomate,

especies donde la cosecha coincide con final de su ciclo de vida (Castilla, 2004;

Ramírez y Niehuis, 2012). Estos resultados estarían en consonancia con los trabajos

realizados por Fornaris (2007), en los que se observaron que muchos cultivares de

tomate tendían a acelerar la floración y limitar el crecimiento vegetativo debido al

estrés por salinidad. Del mismo modo en un estudio realizado por Rojas et al. (2015),

donde sometieron a distintas variedades de tomate a estrés lumínico, se observó que

las plantas sometidas a un 35% de tasa de radiación óptima, fueron las que menos

biomasa desarrollaron pero las que más flores por racimo produjeron, resultados que

estarían en concordancia con los encontrados en este estudio.

A diferencia del comportamiento observado por las plantas PSL durante la

primera floración, en la segunda y la tercera estas plantas pasaron a ser las que

menos flores por racimo presentaron, pese a que no existen diferencias

estadisticamente significativas entre los tres sustratos (Tabla IV.9). Esto podría ser

debido a que, tras un primer estadio, el someter al cultivo de tomate a una situación de

estrés salino continuado, los recursos de la planta se agotaron, por lo que además de

Experiencia II

85

inhibir el crecimiento (Tabla IV.8), también se redujeron la producción flores por racimo

(Zoebl, 2002; Serio et al., 2004). Estudios llevado a cabo por Quintana et al. (2010)

vienen a confirmar estos resultados, ya que de acuerdo con estos autores, cuando el

cultivo de tomate es sometido condiciones de estrés salino continuado, la producción

de racimos florales no se ve prácticamente afectada, pero sí se reduce drásticamente

al número de flores producidas en cada racimo, siendo esta reducción mayor en los

racimos superiores de la planta que en los inferiores (Quintana et al., 2010).

Respecto al número de frutos cuajados por racimo, el comportamiento de las

plantas desarrolladas en los sustratos FC y PL fue estadísticamente igual durante las

tres primeras floraciones, mientras que el número de frutos cuajados en las plantas

desarrolladas en PSL fue menor al de los otros dos sustratos (Tabla IV.9). Como

puede observar en la Tabla IV.9, aunque el cuajado de las flores de la primera

floración de las plantas PSL fue significativamente menor al de las plantas FC y PL,

fueron estas las que mostraron un mayor número de flores/racimo durante este

periodo (Tabla IV.9). Esto podría atribuido a que la salinidad tiene un mayor efecto

nocivo sobre el cuajado de los frutos que sobre la floración (Magán, 2003). Por otro

lado, si se tiene en cuenta que las plantas cultivadas en Posidonia oceanica sin lavar

(PSL) eran las que presentaron un menor número de flores por racimo durante la

segunda y tercera floración, parece lógico que también sean las que tengan un menor

número de frutos cuajados/racimo.

El hecho de que las plantas cultivadas en FC y PL no presentasen diferencias

significativas para ninguno de los tres parámetros analizados en esta sección (número

de racimos por planta, número de flores por racimo y frutos cuajados por racimo)

(Tabla IV.9), viene a confirmar que el simple lavado de los arribazones de Posidonia

oceanica podría adecuar este material para que tuviese una respuesta tan positiva

como la fibra de coco, sustrato de cultivo no inerte cuya eficacia ha sido ampliamente

demostrada (Baquero et al., 2012).

En la Tabla IV.9 se muestra que el número de frutos cuajados en las plantas PL

en la tercera floración fue ligeramente inferior que en las plantas FC, aunque este

descenso no fue estadísticamente significativo. Este comportamiento podría ser

debido a que a medida que se va desarrollando el cultivo, la liberación por parte de la

Posidonia oceanica lavada (PL) de metabolitos secundarios presentes en su

composición, tales como los compuestos fenólicos (Tabla IV.5), podría haber


86

aumentado, y aunque a bajas concentraciones estos compuestos podrían tener un

efecto positivo como elicitores, a altas concentraciones podrían resultar fitotóxicos,

generando un estrés oxidativo en plantas de tomate (García-Sánchez et al., 2012).

Porcentaje de cuajado.

Para poder determinar el porcentaje de cuajado de las plantas desarrolladas en

los distintos sustratos en estudio se calculó la relación entre el número medio de flores

y de frutos cuajados. La Tabla IV.10, recoge estos porcentajes para las tres primeras

floraciones.

Tabla IV.10. Porcentaje de cuajado durante las tres primeras floraciones de las plantas de tomates cultivadas en los tres sustratos empleados en este estudio.

Tratamiento % Cuajado

1ª Floración % Cuajado

2ª Floración % Cuajado

3ª Floración

FC 53±2b 39±1b 34±1a PL 59±3a 43±1a 27±1b

PSL 31±2c 30±1c 20±1c Sig. (1) *** *** ***


cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. (1)Significación: ns (sig>0,05);



De acuerdo con Fornés et al. (2012), los distintos cultivares de tomate se

pueden clasificar según su porcentaje de cuajado en “muy productivas, productivas,

medias y de bajo cuajado”. Las que se consideran “muy productivas” tienen un

porcentaje de cuajado superior al 70%, las “productivas” cuando el cuajado está en

torno al 50%, las “medias” presentan un cuajado entre un 30 y un 40% y las de “bajo”

porcentaje de cuajado son las que presentan un cuajado inferior al 27%. Como se

puede observar en la Tabla V.9 el cuajado de frutos en las plantas desarrolladas en los

tres sustratos empleados en este ensayo disminuye a medida que aumenta el número

de floraciones. Las plantas cultivadas en fibra de coco y Posidonia oceanica lavada

pasaron de tener un cuajado productivo durante la primera floración a un cuajado

medio a partir de la segunda floración, mientras que las plantas PSL, pasaron de ser

de cuajado medio durante la primera floración a bajo para las dos siguientes. Esto es

debido a que a medida que el fruto va desarrollándose empiezan a aparecer

Experiencia II

87

fenómenos de competencia por los fotoasimilados entre los frutos tanto dentro del

mismo racimo como de racimos distintos y las partes vegetativas, lo cual puede inducir

a una caída de frutos o a una abscisión de las flores, efecto por el cual las plantas

seleccionan las mejores flores y posteriormente los mejores frutos, reduciendo el

riesgo de perder frutos por factores ambientales (Miranda, 2010).

Al comparar el porcentaje de cuajado de las plantas desarrolladas en los tres

sustratos durante las distintas floraciones (Tabla IV.10) se observa que para la primera

y segunda floración el valor de este parámetro para las plantas PL fue

estadísticamente superior al de las plantas PSL e incluso al de las plantas FC. Esto

podría ser atribuido a la liberación por parte de la Posidonia oceanica de metabolitos

secundarios y Si presente en su composición (Tabla IV.5), que podrían haber

estimulado este proceso. Sin embargo, en la tercera floración el porcentaje de cuajado

se redujo significativamente respecto a las plantas FC (Tabla IV.10), lo que hace

pensar que la acumulación de estos compuestos pudo resultar demasiado elevada

para las plantas, comenzando a presentar efectos fitotóxicos (García-Sánchez et al.,

2012).

Respecto a la plantas PSL, la salinidad del medio, generó un estrés salino en el

vegetal que se tradujo en unos bajos porcentajes de cuajado, mucho menores que el

de las plantas FC, las cuales fueron empleadas como tratamiento control (Tabla

IV.10). De acuerdo con Quintana et al. (2010), los menores porcentajes de cuajado

que presentan las plantas de tomate sometidas a estrés salino son provocados por

que el ápice de la planta actuaría al inicio de la floración como principal órgano

sumidero, por lo que los asimilados serán traslocados hacia las flores solo y cuando se

haya cubierto las necesidades del ápice, traduciéndose en un suministro de asimilados

inadecuado para el correcto desarrollo del fruto (Quintana et al., 2010).

IV.2.2.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales.

Contenido de clorofilas.

Los resultados de la concentración foliar de clorofila para los tres tratamientos

ensayados se muestran en la Figura IV.5. En dicha figura se puede observar como las

plantas cultivadas en fibra de coco no presentaron un contenido de clorofila


88

estadísticamente mayor a las plantas desarrolladas en Posidonia ocenica sin lavar, sin

embargo dicho contenido disminuye en plantas cultivadas en el sustrato PL (25%),

siendo las plantas cultivadas en PL las que mostraron el menor contenido en clorofila

de los tres (Figura IV.5). El hecho de que las plantas desarrolladas en Posidonia

oceanica sin lavar (PSL) tengan menos concentración de clorofilas que las plantas

desarrolladas en fibra de coco (FC) podría ser debido al exceso de sales que aporta la

Posidonia oceanica (Tabla IV.5). Este mismo resultado ya fue previamente observado

por Salas et al. (2015), al desarrollar plantas de tomate cv Rio Grande bajo

condiciones de estrés salino. Estos autores encontraron una reducción en el contenido

en clorofilas a medida que aumentaba la salinidad del medio de cultivo, cayendo

bruscamente cuando se superaban concentración de 20 mM de NaCl en el medio de

cultivo (Salas et al., 2015).

La explicación a la disminución de clorofilas en plantas sometidas a estrés

salino puede ser variada, principalmente se cree que podría deberse a una reducción

del área foliar, estrategia para reducir la transpiración y también para reducir la

acumulación de sodio en hojas (Amirjani, 2010), lo que evidentemente reduce el

crecimiento y productividad de la planta. Por otro lado, Turan y Tripathy (2015)

demostraron que la salinidad reducía la actividad de las enzimas que sintetizan la

clorofila, como la 5-aminolevulínico (ALA) dehidratasa, aunque también podría ser

debido a la alteración en la morfología de los cloroplastos y/o a la oxidación de los

mismos por radicales libres (Parida et al., 2002). Akça y Samsunlu (2012) investigaron

los efectos de la salinidad del agua de riego sobre el contenido de clorofila en nogal,

encontrando una disminución del contenido de las clorofilas a y b en condiciones de

salinidad. Si bien es cierto, que dichos cambios dependerán en mayor o menor medida

de la duración y severidad del estrés, así como la especie vegetal tratada.

Salas et al. (2015) estudiaron el efecto que tenía el estrés salino en tomate

sobre el contenido de clorofilas totales, a y b. Observaron que la clorofila total tuvo un

comportamiento similar al de la clorofila a, mientras que podía observarse como los

valores de clorofila b siguieron un comportamiento inverso; es decir, si el valor de

clorofila a disminuye, el de clorofila b aumenta (Salas et al., 2015). Respecto a los

valores de dichos parámetros, los que obtuvieron de clorofila a y b son similares a los

de este estudio y se comportaron del mismo modo, mientras que los valores de

clorofila total son menores que los obtenidos en este trabajo, ya que en las plantas

Experiencia II

89

control se obtuvo una concentración de clorofilas de 3mg/g Pf y en las plantas

sometidas a estrés salino (100mM de NaCl) la concentración fue de 2,3mg/g Pf.

Figura IV.5. Concentración foliar de clorofilas (mg/g pf) en plantas de tomate desarrolladas en diferentes sustratos de cultivo. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia

oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

Las plantas desarrolladas en Posidonia oceanica lavada (PL) fueron las que

presentaron una menor concentración de clorofila, sin embargo, la carga salina era

bastante menor que en la PSL. Este resultado sugiere que aunque las plantas

pudiesen estar sometidas a un ligero estrés salino, la inhibición en la síntesis de

clorofila podría estar relacionada con una mayor liberación por parte de este sustrato

de compuestos fenólicos al medio de cultivo (Tabla IV.5), que pudieron generar efecto

fitotóxico, que se tradujo en un descenso en la concentración de clorofila respecto a

las plantas desarrolladas en PSL. El que no se observara este comportamiento en

PSL, hace pensar que la capa de sales que presenta naturalmente la Posidonia

oceanica sobre la superficie de sus frondes, podría ejercer de recubrimiento que

limitaría la liberación de compuestos fenólicos al medio.

El hecho de que la aplicación de metabolitos secundarios únicamente tiene

un efecto elicitor positivo cuando se aplica a bajas dosis ya fue observado por Yang et

al. (2001) en plantas de arroz, dichas plantas fueron tratadas radicularmente con una

a

b

a

a

b

ca

b b

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

FC PL PSL

Co

ncen

tració

n d

e C

loro

fila

s

(mg

/g P

f)

Clrf Total (mg/g Pf)

Clrf a (mg/g Pf)

Clrf b (mg/g Pf)


90

mezcla de compuestos fenólicos (ácido o-hidroxifenil acético, ferúlico, y ácido p-

cumárico) a diferentes dosis. De acuerdo con este estudio, las concentraciones más

altas alteraron la síntesis de clorofilas, disminuyendo el porcentaje molar de la parte

“proto” y aumentando la “pchlide” de la molécula de la clorofila, lo que se tradujo una

inhibición en la síntesis de las clorofilas (Yang et al., 2001).

Figura IV.6. Detalle visual de los tratamientos. A: Fibra de coco, B: Posidonia oceanica cribada y lavada, C: Posidonia oceanica cribada y sin lavar.

Del mismo modo, Borowski y Nurzyński (2012), estudiaron el desarrollo de

plantas de tomate cv. “Admiro F1” en mezclas de distintos sustratos (paja de trigo, paja

de trigo con turba y corteza de pino, paja de colza, paja de colza con turba y corteza

de pino), las cuales diferían en su riqueza en compuestos fenólicos. Los resultaron de

este estudio mostraron que las plantas cultivadas con el sustrato más rico en

compuestos fenólicos (paja de colza mezclada con la corteza de pino), presentaron un

menor contenido en clorofilas que las plantas cultivadas en sustratos con un menor

contenido en compuestos fenólicos,. Zeng et al. (2001) atribuyen esta reducción en el

contenido en clorofilas al efecto negativo de las sustancias fenólicas sobre el aparato

fotosintético de las plantas, causando alteraciones en el transporte electrónico.

A pesar de los menores valores de clorofilas de las plantas cultivadas en

Posidonia oceanica lavada (PL) y sin lavar (PSL), estás plantas no manifestaron

síntomas de clorosis, tal y como se observa en la Figura IV.6, al comparar las hojas de

las plantas cultivadas en los tres sustratos en estudio.

Experiencia II

91

Contenido foliar en malondialdehído (MDA).

La actividad de algunos enzimas de defensa antioxidante (Superóxido

Dismutasa-SOD, Catalasa-CAT y Peróxido Dismutasa-POD), los cuales pueden

eliminar radicales libres de oxígeno tóxicos, se ve aumentada en las plantas expuestas

a estrés tanto biótico como abiótico (Romero-Aranda et al., 2001). Como resultado se

produce la peroxidación de los lípidos de la membrana acumulándose

malondialdehído, producto final de este proceso (Liang et al., 2015; Al-aghabary, 2004;

Liang et al., 2003). Por ello para conocer el grado de peroxidación de los lípidos de los

tejidos se determina la cantidad de equivalentes de MDA producidos (Hashemi et al.,

2010), utilizándose como un marcador que indica el daño oxidativo al que está

sometida la planta, el cual aumentará con el incremento del contenido de

malondialdehido.

La Figura IV.7 muestra la concentración foliar de malondialdehído en las

plantas cultivadas en los distintos sustratos. Se puede observar como en las hojas de

las plantas cultivadas en Posidonia oceanica lavada (PL) se produjo una mayor

acumulación de este metabolito (13,1 nmol/g PF, Figura IV.7), lo que indica que estas

plantas estaban sometidas a un mayor grado de daño oxidativo que las cultivadas en

los otros dos sustratos (Figura IV.7). Respecto a los sustratos fibra de coco y

Posidonia oceanica sin lavar, los datos muestran que, aunque las plantas cultivadas

en PSL presentaron un valor ligeramente superior al de las plantas FC (11±1 nmol/g

PF y 10,3±0,9 nmol /g PF respectivamente), estas diferencias no fueron significativas

(Figura IV.7) . El hecho de que las plantas PL fuesen las que presentaban un mayor

contenido de malondialdehído, mientras que las PSL mostraron un contenido

estadísticamente igual al de las plantas FC (Figura IV.7), sugiere que el estrés

oxidativo al que estuvieron sometidas las primeras pudo ser consecuencia de una

mayor liberación de compuestos fenólicos por parte del sustrato PL, la cual resultase

fitotóxica (Borowski y Nurzyński , 2012), ya que si este efecto hubiese sido producido

por la salinidad, el comportamiento de ambos sustratos de Posidonia oceanica hubiese

similar o incluso la plantas desarrolladas en PSL, hubiesen mostrado un mayor

contenido de MDA que las plantas PL, ya que la concentración de NaCl en el sustrato

PSL fue muy superior al PL (Tabla IV.5) . El hecho que las altas concentraciones de

compuestos fenólicos pueden traducirse en un mayor estrés oxidativo en el vegetal ya

había sido observado anteriormente por García-Sanchez et al. (2012). En este trabajo


92

se encontró que la aplicación de residuos secos procedentes de la obtención de aceite

de oliva a semillas de tomate, aumentaron los niveles de MDA en las mismas. Del

mismo modo, Lara-Núñez et al. (2009), aplicaron un extracto acuoso de la

Cucurbitacea Sicyos deppei “G. Don” con alta concentración en compuestos fenólicos

a semillas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.), observándose un aumento en la

degradación de las membranas plasmáticas de dichas semillas.

Figura IV.7. Concentración de Malondialdehído (MDA) (nmol/ g PF) en plantas de tomate desarrolladas en diferentes sustratos de cultivo. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Los valores medios de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintos estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

Por otro lado, el hecho de que no haya diferencias significativas en el contenido

foliar de MDA entre las plantas FC y PSL, hace pensar que la liberación en bajas

concentraciones de estos compuestos fenólicos en el sustrato PSL, pudiesen haber

minimizado los efectos nocivos de las altas concentraciones salinas. Esta hipótesis

podría ser confirmada con los estudios realizados por Martí et al. (2017) y Khan et al.

(2010), en los que la aplicación de mezclas de distintos compuestos fenólicos a dosis

bajas redujo los efectos negativos que el estrés por salinidad produjo en plantas de

tomate.

b

a

b

0

2

4

6

8

10

12

14

16

FC PL PSL

MD

A (

mm

ol/

g P

f)

Experiencia II

93

Concentración foliar de peróxido de hidrógeno (H2O2).

Cuando las plantas se ven sometidas a una situación de estrés, ya sea biótico

o abiótico, la actividad de ciertos enzimas, y en concreto la de la catalasa (CAT), se ve

fuertemente activada (Antonic et al., 2016). Esta enzima participa en el sistema de

defensa de las plantas frente el daño oxidativo, descomponiendo el peróxido de

hidrógeno, tóxico para las células, en H2O y O2. Como consecuencia de la reducción

de su actividad se produce, por tanto, un incremento del contenido de H2O2 en los

tejidos vegetales. Es por esto que la medida de este parámetro se suele emplear como

índice del grado de estrés al que está sometido el vegetal (Antonic et al., 2016; Rady y

Mohamed, 2015; Tari et al., 2010).

De acuerdo con los resultados recogidos en la Figura IV.8, las plantas

cultivadas en Posidonia oceanica lavada (PL) fueron las que presentaron una mayor

concentración de H2O2 (0,160/g Pf), en concreto un 19% superior a la de las plantas

desarrolladas en FC, sustrato empleado como control, y un 10% superior al de las

plantas cultivadas sobre PSL (Figura IV.8). De estos resultados se vuelve a confirmar

que las plantas PL estaban sometidas a un mayor estrés oxidativo, el cual como se ha

comentado anteriormente, podría ser provocado por la liberación de altas

concentraciones de compuestos fenólicos por este sustrato a lo largo del desarrollo del

cultivo. El incremento del contenido foliar en H2O2 debido a la aplicación de

compuestos fenólicos en altas concentraciones o incluso por el empleo de sustratos de

cultivo ricos en estos compuestos, ya ha sido descrito en estudios anteriores como los

realizados por García-Sánchez et al. (2012), Bais et al. 2003 y Cruz-Ortega et al. 2007.

De nuevo, los resultados muestran que el estrés oxidativo de las plantas

cultivadas en PL es mayor al del las plantas PSL, lo que vendría a confirmar que la

costra de sales presente en los frondes de PSL, actuaría como recubrimiento que

reduciría la concentración de compuestos fenólicos al medio a unas dosis que no

resultarían tan perjudiciales como las liberadas en PL donde el lavado con agua,

habría eliminado ese recubrimiento facilitando la liberación de los metabolitos

secundarios presentes en la Posidonia oceanica (Tabla IV.5).

Por otro lado, a diferencia de los resultados obtenidos para el MDA, el

contenido de H2O2 en las plantas PSL fue estadísticamente superior al de las plantas

FC, en concreto un 7% (Figura IV.8). Estos resultados son indicativos de que la


94

liberación en bajas dosis compuestos fenólicos desde la posidonia oceanica pudo

minimizar los efectos nocivos de las altas concentraciones de NaCl presentes en este

sustrato de cultivo, aunque no eliminarlos en su totalidad. Existen numerosos trabajos

en los que se ha demostrado que uno de los efectos del estrés por salinidad es el

desequilibrio entre la formación y eliminación de estas especies reactivas,

ocasionando un daño oxidativo. Este suceso conlleva un aumento en la cantidad de

ROS tales como el peróxido de hidrógeno (Gill y Tuteja, 2010).

Figura IV.8. Concentración foliar de peróxido de hidrógeno (H2O2) en plantas de tomate desarrolladas en diferentes sustratos de cultivo. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Los valores medios de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

IV.2.2.3. Parámetros de calidad del fruto.

Producción.

Los datos de producción se muestran en la Tabla IV.11. En ella se puede

observar que existen diferencias estadísticamente significativas en la cantidad de

tomates producidos entre las plantas cultivadas en FC y PL y las que crecieron en

PSL, siendo estas últimas las que mostraron una producción más baja (Tabla IV.11).

En concreto, las plantas que crecieron en PSL fueron un 35% menos productivas que

las que lo hicieron en FC o PL, no observándose diferencias estadísticamente

c

a

b

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

FC PL PSL

H2O

2(µ

mo

l/g

Pf)

Experiencia II

95

significativas entre las plantas cultivadas en estos dos últimos sustratos (Tabla IV.11).

Estos resultados podrían estar relacionados con la mayor salinidad del sustrato PSL,

frente a la fibra de coco (FC) y la Posidonia lavada (PL). De acuerdo con Cuartero et

al. (2006), este aumento del contenido en sales solubles en el medio de cultivo,

principalmente Na+ y Cl-, estaría relacionado con la disminución de la productividad en

plantas de tomate. Katerji et al. (2003) observaron que el aumento de la salinidad en el

medio de cultivo, se tradujo en una reducción del potencial osmótico y de la

disponibilidad de agua para las plantas de tomate, afectando a la conductancia

estomática, al crecimiento de las hojas y la fotosíntesis, lo que se tradujo en una

reducción de fotoasimilados, y en consecuencia, en una disminución del número y

peso de los frutos (Goykovic y Saavedra, 2007).

Tabla IV.11. Peso (g), diámetro ecuatorial (cm), y dureza de los frutos de tomate recogidos a lo largo del ensayo en las plantas desarrolladas en los tres sustratos de

cultivo en estudio.

Tto Producción (Kg/Planta) ØEc (mm) Dureza(Kg/cm2)

FC 0,57±0,05a 75±4 1,95±0,01c PL 0,56±0,04a 73±1 2,54±0,02b

PSL 0,37±0,02b 76±4 2,94±0,03a Sig. (1) ** ns **

*Los datos mostrados son la media ± SD de 10 repeticiones FC: fibra de coco; PL: Posidonia oceanica cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Calibre del fruto.

La Tabla IV.11 muestra la distribución de los tomates recolectados en función

de su calibre (diámetro ecuatorial en mm). La mayoría de los tomates, tanto para las

plantas FC como para las PL y PSL, presentaron calibres comprendidos entre los 73 y

los 76mm, no existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los tomates

desarrollados en los distintos sustratos (Tabla IV.11). La producción de tomates de

este estudio, tuvo diámetros comprendidos entre los 67 y 82mm, que según la

clasificación de Escobar y Lee (2001), estarían dentro de la “Categoría II. Primera”. El

hecho de que el calibre de los frutos no difiera estadísticamente entre los tres tipos de

sustrato, podría ser debido, a que tal y como se recoge en la Tabla IV.9, no se

encontraron diferencias significativas en el número de racimos por planta entre los tres


96

sustratos de cultivo en estudio, ya que en los trabajos realizados por Bangerth y Ho

(1988) se observó que un aumento en el número de racimos por planta es uno de los

parámetros que más pueden influir en el calibre de los frutos, provocando que a mayor

número de racimos, el calibre de los frutos disminuya, haciendo que bajen de

categoría (Bangerth y Ho, 1988).

Dureza del fruto.

En la mayor parte de los muestreos realizados a lo largo del desarrollo del

cultivo, tanto los tomates PL como los PSL presentaron unos valores de dureza entre

1,95 y 2,94Kg/cm2, que de acuerdo con Cantwell et al. (2004) se clasificarían como

tomates muy duros. Respecto a los tomates FC, presentaron una dureza inferior a la

de los tomates PL y PSL, situándose en este caso como tomates duros (Cantwell et

al., 2004) (Tabla IV.11).

La firmeza del tomate varía con el cultivar, y para un mismo cultivar las

variaciones en este parámetro estarían relacionadas con el índice de madurez del

fruto, de forma que a menor dureza mayor madurez del fruto. Esta disminución de la

dureza en los frutos sería producida por la existencia en la reducción del contenido de

sustancias pécticas de la pared celular (Gómez et al., 2001; Anza et al., 2005).

Por otro lado, el que los tomates producidos por las plantas PL y PLS

presenten mayor dureza que los de las plantas FC, y que de los dos sustratos a base

de Posidonia sea el PSL el que haya dado lugar a tomates más firmes, hace pensar

que ese incremento de la dureza también podría estar relacionado con el contenido en

sales solubles de los sustratos, de forma que la dureza de los tomates habría

aumentado a medida que lo hizo la salinidad del sustrato. Sin embargo, existen ciertas

discrepancias en relación a esta hipótesis. Passam et al. (2007) han observado como

la firmeza del tomate mejora con el aumento de la salinidad en la zona radicular,

mientras que Krauss et al. (2006) concluyeron que la firmeza del fruto se reducía por

efecto de la salinidad. Según Cuartero y Fernández-Muñoz (1999), la dureza del fruto

de tomate disminuye sólo cuando existen niveles altos de salinidad en la zona

radicular (más de 10 dS/m), condiciones que no se dieron en este estudio (Tabla

VI.11).

Experiencia II

97

Jugosidad del fruto.

En la Tabla IV.12 se encuentran los valores de jugosidad para los frutos de las

plantas desarrolladas en los distintos sustratos. Como se puede observar, la jugosidad

de los tomates osciló entre un 70,4% para los producidos para las plantas PL y un

42,6% para los tomates desarrollados en PSL (Tabla IV.12), no encontrándose

diferencias significativas entre los tomates producidos por las plantas FC y PSL, pero

habiéndolas con PL (Tabla IV.12).

Tabla IV.12. Porcentaje de jugosidad y CE de los frutos de tomate recogidos a lo largo del ensayo en las plantas desarrolladas en los tres sustratos de cultivo en estudio.

Tratamiento Jugosidad (%) CE (ms/cm)

FC 43,3±0,3b 6,82±0,05 PL 70,4±0,3a 6,92±0,1

PSL 42,6±0,4b 6,93±0,09 Sig(1) *** ns

*Los datos mostrados son la media ± SD de 16 repeticiones. FC: fibra de coco; PL: Posidonia oceanica cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Conductividad eléctrica.

Para dicho ensayo se empleó el zumo obtenido en la determinación de la

jugosidad.

En los valores de conductividad eléctrica no se observaron diferencias

estadísticamente significativas para los distintos tratamientos (Tabla IV.12). Dado que

todos los tomates son de la misma variedad se podría esperar que no existiesen

diferencias significativas en los valores de CE, pero en estudios realizados por Anza et

al. (2005), se concluyó que las condiciones medioambientales, como por ejemplo la

mayor salinidad de los sustratos a base de Posidonia oceanica (PL y PSL), tienen más

influencia sobre la CE que la propia genética (Anza et al., 2005). Resulta por tanto

lógico pensar que el ligero aumento de CE encontrada en los frutos de las plantas

cultivadas en los sustratos PL y PSL esté relacionado con las condiciones de salinidad

de estos sustratos.


98

Acidez valorable.

El contenido en acidez valorable (AV) en el fruto del tomate se debe a la

presencia de diversos ácidos orgánicos, siendo el más abundante el cítrico,

representando alrededor del 13% de la materia seca del fruto (Casierra-Posada et al.,

2010). La acidez es un parámetro que va a disminuir con el estado de maduración del

fruto (González-Céspedes et al., 2004), siendo los valores comprendidos entre 0,2 y

0,6% de ácido cítrico los adecuados para considerar que el tomate presenta una

madurez de consumo (Cantwell (2004). Como se recoge en la Tabla IV.13, la acidez

de los frutos de tomate de este estudio se situó, en los tres tratamientos, por encima

de ese valor máximo de acidez (0,6%). Estos resultados sugieren que los frutos fueron

cosechados antes de alcanzar la madurez óptima de consumo, lo que no es

importante ya que al tratarte de frutos climatéricos podrían alcanzar estos valores de

madurez lejos de la planta.

Por otro lado, se puede observar que los tomates producidos en Posidonia

oceanica lavada (PL) (0,764%) y sin lavar (PSL) (0,763%) mostraron unos valores de

acidez valorable significativamente mayores que a los de los tomates cultivados en FC

(0,653%), (Tabla IV.13), lo que sugiere que las características de la posidonia como

sustrato pudieron afectar al proceso de maduración del fruto, ya que como se ha

mencionado anteriormente, el valor de este parámetro irá disminuyendo a medida que

lo haga el proceso de maduración del fruto (Žnidarčič y Požrl, 2006).

Tabla IV.13. Porcentaje de acidez valorable, ºbrix e índice de madurez de los frutos de tomate recogidos a lo largo del ensayo en las plantas desarrolladas en los tres

sustratos de cultivo en estudio.

Tto Acidez Valorable (%) SST (ºBrix) Índice Madurez (SST/AV)

FC 0,65±0,01b 5,55±0,09a 8,5±0,5a PL 0,76±0,01a 5,05±0,02b 6,6±0,3c

PSL 0,77±0,01a 5,73±0,08a 7,3±0,4b Sig(1) *** *** ***

*Los datos mostrados son la media ± SD de 16 repeticiones. FC: fibra de coco; PL: Posidonia oceanica cribada y lavada; PSL: Posidonia oceanica cribada. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Experiencia II

99

Sólidos solubles (ºBrix).

El contenido en sólidos solubles para los tomates producidos en los tres tipos

de sustrato se muestra en la Tabla IV.13. En ella se puede observar que existen

diferencias estadísticamente significativas entre la fibra de coco (FC) y la Posidonia

oceanica sin lavar (PSL) y los tomates cultivados en Posidonia oceanica lavada (PL),

siendo el contenido en sacarosa de los primeros (5,55±0,09ºBrix para la FC y

5,73±0,02ºBrix para PSL), superior a los que presentaron los tomates cultivados en PL

(5,05±0,02 ºBrix) (Tabla IV.13).

En general se ha observado que el contenido en SST de los frutos aumenta

con la maduración, debido a procesos de biosíntesis de azúcares simples a partir de la

degradación de los polisacáridos de reservas y estructurales y de los ácidos orgánicos

(Carri et al., 2007). Por lo que sería de esperar que aquellos frutos que presentasen

una acidez más baja fuesen aquellos que mostraran un mayor contenido en SST y

viceversa. Al comparar el valor de estos dos parámetros para los tomates cultivados

en los tres sustratos en estudio (Tabla IV.13), se observa que esta correlación sólo se

encontró para los frutos producidos en FC y PL. Los frutos FC fueron los que

presentaron menor acidez y un mayor contenido en SST, lo que es indicativo de que

los frutos FC presentaban un estado madurativo más avanzado (Tabla IV.13). Por el

contrario, Los frutos PL serían los que mostraron mayor ácidez y menor contenido en

SST, es decir fueron los frutos menos maduros. Sin embargo, al comparar el valor de

estos parámetros para los frutos PSL se observa que no existe una buena correlación

SST y acidez valorable para los mismos (Tabla IV.13), ya que son los frutos que

presentaron valores de acidez y de SST más altos de los tres sustratos en estudio

(Tabla IV.13). De acuerdo con Grainferberg et al. (2000) existen claras evidencias de

que cuando los frutos de tomate se cultivan en un medio salino, el contenido en

sólidos solubles aumenta independientemente de su estado de madurez y lo hace

como mecanismo de adaptación a estas condiciones adversas, de forma que al

incrementar la síntesis de solutos compatibles en el interior de las células evitaría que

se llegaran a producir fenómenos de plasmólisis. Esto hace pensar que en el caso de

los tomates cultivado en PSL, los altos valores de ºBrix encontrados (Tabla IV.13)

pudieron ser consecuencia de la respuesta de la planta a la elevada salinidad del

medio.


100

Como se ha comentado anteriormente, la concentración en SST es un

parámetro de calidad del fruto que varía con la conductividad eléctrica de la solución

nutritiva y el estrés del fruto durante su desarrollo (Urrestarazu-Gavilán, 2004). Al

comparar los datos de SST con los valores de CE (Tablas IV.12 y 13), se observa que

los tomates PSL fueron los que mostraron una mayor conductividad y los valores más

altos en SST, lo que corroboraría de nuevo el hecho que ante un estrés salino, el

contenido en SST del fruto aumentaría independientemente de su estado de madurez

(Grainferberg et al., 2000).

Índice de madurez.

Existen investigaciones en las que se ha visto que el índice de madurez

(ºBrix/AT) es importante para determinar las diferencias entre cultivares, otras sugieren

que la calidad de los frutos podría ser mejorada aumentando el contenido total de

azúcares y ácidos. La estimación de la relación entre sólidos solubles y la acidez

valorable podría ser la mejor opción para determinar el índice de madurez en frutas, ya

que este parámetro indica el contenido de azúcares en relación con la menor cantidad

de acidez presente en la fruta (Kushman y Ballinger, 1967).

Teniendo en cuenta esto y según la Tabla IV.13, podemos observar que

existen diferencias estadísticamente significativas entre los tomates desarrollados en

los tres sustratos, siendo los cultivados en fibra de coco los más maduros (8,5) y los

menos maduros los cultivados en Posidonia oceanica lavada (6,6).

Una característica de la maduración es que cuanto mayor es esta, menos

acidez valorable, más vitamina C y materia seca (Elkner, 1994), por lo que si

observamos dichos parámetros para el sustrato fibra de coco, podemos ver como los

tomates recolectados de las plantas desarrolladas en este sustrato, tienen menos

acidez valorable (Tabla IV.13), más vitamina C (Figura IV.10) y más materia seca

(Figura IV.9).

Por otro lado, y siguiendo los aportes de Elkner (1994), los frutos recogidos de

las plantas desarrolladas en Posidonia oceanica lavada tienen menos materia seca

(Figura IV.9) y menos cantidad de vitamina C (Figura IV.10).

Este índice de madurez se podría calcular a partir del cociente entre los grados

ºBrix y la acidez valorable. De acuerdo con los datos recogidos en la Tabla IV.13, a

Experiencia II

101

pesar de que los tomates se recogieron a la vez, los desarrollados en fibra de coco

(FC), presentaban un índice de madurez más elevado frente a los desarrollados en los

sustratos de Posidonia oceanica (PL y PSL), resultados que podrían justificar las

diferencias en los valores de dureza encontrados en este estudio (Tabla IV.10).

Materia seca.

En la Figura IV.9 se muestra el porcentaje en materia seca de los tomates

cultivados en los distintos sustratos. En ella se muestra que el porcentaje en materia

seca de los tomates cultivados en fibra de coco fue estadísticamente mayor al de los

tomates producidos en Posidonia oceanica lavada (PL) (8,0% y 7,6% respectivamente)

(Figura IV.9). Por el contrario, los frutos cultivados en Posidonia oceanica sin lavar

(PSL) presentaron unos valores intermedios entre los frutos FC y PL, no encontrando

diferencias significativas entre el primero y los dos últimos (7,83%) (Figura IV.9).

Figura IV.9. Porcentaje de materia seca de los frutos de tomate desarrollados en los tres sustratos de cultivo en estudio. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

Estudios realizados por San Miguel et al. (2012) en diferentes cultivares de

tomate mostraron que los porcentajes de materia seca oscilaron entre 5,87 a 9,33% en

función del cultivar (San Miguel et al., 20012), por lo que nuestros datos estarían

a

b

a

7,2

7,3

7,4

7,5

7,6

7,7

7,8

7,9

8,0

8,1

8,2

FC PL PSL

Mate

ria S

eca (

%)


102

dentro de los resultados obtenidos por estos autores. El hecho que el contenido en

materia seca en los frutos PL y PSL sean menores que en los frutos FC (Figura IV.9)

podría estar relacionado con el efecto fitotóxico de los metabolitos bioactivos liberados

por el sustrato PL y por la salinidad del sustrato PSL como ya se ha mencionado

anteriormente, ya que de acuerdo con Pérez-Alfocea 1996 y Carvajal et al (2006),

estas condiciones de estrés afectarían negativamente al desarrollo del fruto y por tanto

a ciertos parámetros de calidad organoléptica como pueda ser el contenido en materia

seca. Tal y como se muestra en la Figura IV.9, este parámetro se vio más afectado por

las altas concentraciones de compuestos fenólicos liberados por el sustrato PL que las

altas concentraciones de Na y Cl del sustrato PSL.

Se ha observado como existe una relación inversamente proporcional entre el

porcentaje de materia seca y el de jugosidad (McGollum et al., 2006), por lo que de ser

así, nuestros resultados de jugosidad (Tabla IV.12) y materia seca (Figura IV.9)

estarían en concordancia con dicha aportación, ya que los tomates más jugosos y con

menor contenido en materia seca fueron los desarrollados en Posidonia oceanica

lavada (PL) y los menos jugosos y más contenido en materia seca fueron los

desarrollados en fibra de coco (FC).

Contenido en vitamina C en los frutos.

La Figura IV.10 muestra el contenido en vitamina C de los tomates cultivados

en los diferentes sustratos. De acuerdo con los resultados recogidos en dicha Figura,

se observa que existen diferencias estadísticamente significativas entre los tomates

cultivados en fibra de coco (FC, 38 mg/100g) y los que lo hicieron en Posidonia

oceanica lavada (PL 29 mg/100g) y sin lavar (PSL 28,7 mg/100g), no encontrándose

diferencias significativas en el contenido en vitamina C entre estos dos últimos

sustratos (Figura IV.10).

Los valores de vitamina C para los frutos de los tres sustratos ensayados

coinciden con los proporcionados por Tudor-Radu et al. (2016). Estos autores

estudiaron la variabilidad de distintos compuestos antioxidantes en 4 cultivares tomate

en el momento de la cosecha, y tras 7 y 14 días de almacenamiento, encontrando una

concentración promedio de vitamina C en torno a 32mg/100g de fruto, resultados que

serían del orden de los obtenidos en este estudio (Figura IV.10).

Experiencia II

103

Figura IV.10. Concentración de vitamina C. (mg/100g fruto) en tomates desarrollados en los tres sustratos de cultivo en estudio FC: Fibra de coco, PL: Posidonia oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

Por otro lado, el contenido de ácido ascórbico va aumentado con el proceso de

maduración, y sólo empieza a descender cuando se alcanza la sobremadurez, por lo

que es de esperar que en frutos que no han alcanzado la madurez de consumo

presenten unos contenidos en vitamina C menores que aquellos que ya está aptos

para ser consumidos (Abushita et al., 1997). Atendiendo a este hecho, los resultados

de este estudio estarían en concordancia, ya que los tomates menos maduros, los

cultivados en Posidonia oceanica lavada (PL) y sin lavar (PSL), también fueron los que

mostraron un contenido más bajo en vitamina C (Figura IV.10), mientras que los frutos

FC, mostraron un índice de madurez más alto (Tabla IV.13) y mayores contenidos de

vitamina C que los anteriores (Figura IV.10).

a

b b

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

FC PL PSL

Vit

am

ina C

(m

g/1

00g

Fru

to)


104

Contenido fenólico total y licopeno.

La Figura IV.11 muestra el contenido de compuestos fenólicos totales y de

licopeno en el fruto de tomate. En relación al contenido en compuestos fenólicos, los

tomates cultivados en PSL (28,4 mg GA/kg fruto) mostraron un contenido superior al

de los cultivados en PL y FC, no existiendo diferencias estadísticas entre estos dos

últimos tratamientos (Figura IV.11) (21,7 y 21 mg GA/kg de fruto, respectivamente).

En un estudio publicado por Serio et al., (2004), en el que se aplicó dos

disoluciones salinas (3 y 6 dSm-1) a plantas de tomate cherry (Lycopersicum

esculentum var cersaiforme Alef, cv Naomi) desarrolladas en Posidonia ocanica como

sustrato, se vio como el contenido de α-tocoferol (compuesto fenólico) aumentó en un

40% en los frutos sometidos a estrés salino, lo que podría ser debido a que las plantas

desarrolladas en Posidonia oceanica sin lavar (PSL) estuviesen más estresadas que el

resto (Fryer, 1992).

Figura IV.11. Concentración de fenoles totales y licopeno (mg/kg fruto) en frutos de tomate desarrollado en los tres sustratos de cultivo en estudio. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

b b

a

C

B

A

0

1

2

3

4

5

6

7

0

5

10

15

20

25

30

35

FC PL PSL

mg

/Kg

de F

ruto

Fenoles Totales (mgGA/Kg de Fruto)

Licopeno (mg/Kg de Fruto)

Experiencia II

105

Respecto a la concentración de licopeno, en la Figura IV.11 se muestra que

existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres tratamientos. La mayor

concentración de licopeno se encontró en los tomates cultivados con Posidonia

oceanica sin lavar (5,89 mg/Kg de fruto), seguida de los tomates cultivados en

Posidonia oceanica lavada (5,13 mg/Kg de fruto), mientras que la menor concentración

se obtuvo para aquellos obtenidos utilizando la la fibra de coco como sustrato (4,32

mg/Kg de fruto) (Figura IV.11). Estudios realizados por Liu et al 2011, mostraron que

aquellos tomates cultivados bajo condiciones de estrés oxidativo presentaron un

incremento en la concentración de licopeno, como respuesta del fruto a dicho estrés.

Este resultado justificaría el hecho de que en este estudio sean los tomates

producidos en Posidonia oceanica los más ricos en este compuesto, ya que de

acuerdo con las concentraciones de foliar H2O2 (Figura IV.8), fueron estas plantas las

que estaban sometidas a un mayor estrés oxidativo respecto a las desarrolladas en

fibra de coco. La justificación del mayor contenido de licopeno de los tomates PSL,

podría estar en que, como se ha comentado anteriormente, el lavado de la posidonia

eliminó la costra salina facilitando la solubilización de compuestos fenólicos, llegando a

ser fitotóxicos para las plantas, mientras que en los tomates PSL, la presencia de esta

costra salina, aunque pudo causar un estrés por salinidad, también limitó la liberación

de compuestos fenólicos. Es por ello que en los tomates PL, la presencia de

compuestos fenólico, lejos de tener un efecto beneficioso para el vegetal, provocó un

mayor estrés oxidativo que se tradujo en el incremento de licopeno en los frutos.

Estudios realizados por Al-Amri (2013) muestran que el tratamiento de semillas

de tomate a distintas concentraciones de ácido shikímico incrementó la concentración

de licopeno en el fruto, únicamente cuando se aplicó a las dosis altas (60 mg/L), ya

que éstas estaban produciendo un estrés oxidativo en el vegetal, resultados que

estarían de acuerdo con los obtenidos en este trabajo.

Concentración de antocianos.

La Figura IV.12 muestra los contenidos en antocianinas de los tomates

desarrollados en los tres sustratos de cultivo en estudio. Como se puede observar, no

se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los tomates cultivados

en fibra de coco (1,068 mg/100g de fruto) y los obtenidos en Posidonia oceanica sin

lavar (1,03 mg/100g de fruto) (Figura IV.12). Sin embargo, la concentración de dicho


106

antioxidante en los tomates cultivados en Posidonia lavada (0,68 mg/100g fruto) fue un

36% menor a la encontrada para los otros dos sustratos (Figura IV.12). Aun así, para

los tomates desarrollados en los distintos sustratos, la cantidad de antocianinas estaría

dentro del rango aportado por Khaldoun y Abd (2015), para frutos de tomate (0,6-

1,4mg/100 g de fruto).

Figura IV.12. Concentración de antocianos (mg/100g frutos) en frutos de tomate desarrollados en los distintos sustratos de cultivo. FC: Fibra de coco, PL: Posidonia

oceanica cribada y lavada, PSL: Posidonia oceanica cribada y sin lavar. Las barras de error representan la desviación estándar. Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

En una investigación realizada por Ozkan et al. (2002) sobre la degradación

cinética de antocianinas de frutas como fresa, granada y cereza, observaron cómo

empleando distintas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2) a distintas

temperaturas, éste puede descomponerse fácilmente en compuestos muy reactivos

como el anión perhidroxilo (OH-2) e hidroxilo (OH-), llegando a la conclusión de que el

radical OH es la especie más reactiva que ataca al anillo de benceno de los

compuestos fenólicos, degradando al sustrato en CO2 y H2O, lo que evidenció que las

quininas formadas por la oxidación de fenoles, pueden favorecer el deterioro de la

antocianina. Esto podría explicar que la concentración de antocianinas en los tomates

producidos en las plantas desarrolladas en Posidonia oceanica lavada (PL) fuese

a

b

a

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

FC PL PSL

An

tocia

no

s t

ota

les

(mg

/100g

fru

to)

Experiencia II

107

menor (Figura IV.12), debido a la mayor concentración foliar de H2O2 en las plantas

desarrolladas en dicho sustrato (Figura IV.8).


108

Experiencia II

109

IV.3. Conclusiones.

De los resultados expuestos a lo largo de la experiencia II, se concluye que:

• La caracterización físico-química de la Posidonia oceanica, permitió establecer la

idoneidad de estos residuos para ser empleados como sustrato de cultivo no inerte

de acuerdo con la actual legislación, tanto cuando la Posidonia oceanica

únicamente fue cribada tras su recogida en las playas, como cuando fue sometida

a un proceso de cribado y lavado para su acondicionamiento.

• Tras analizar el estado fisiológico de plantas de tomate cultivadas sobre los

sustratos de Posidonia oceanica cribada (PSL) y cribada y lavada (PL) se observó

que, en ambos casos, las plantas mostraron síntomas haber estado sometidas a

una situación de estrés, ya que además de presentar un menor desarrollo vegetal

y un menor cuajado de los frutos, sobre todo a partir de la tercera floración, sus

tejidos mostraban mayores contenidos de MDA y H2O2 que las plantas

desarrolladas sobre fibra de coco, sustrato de cultivo no inerte empleado como

control.

• De la caracterización físico-química de la Posidonia oceanica se deduce que en el

sustrato PSL, el estrés pudo ser generado por la elevada salinidad del medio, ya

que este sustrato presentaba unos valores de CE y Na mucho más altos que el de

la fibra de coco. Por el contrario, en el sustrato PL, el estrés pudo ser

consecuencia de la fitotoxicidad generada por una elevada liberación de

metabolitos secundarios con actividad elicitora por parte del sustrato.

• Las diferencias en el comportamiento de ambos sustratos de Posidonia oceanica

en los que únicamente varió el acondicionamiento realizado sugieren que la costra

de sales que presentaba inicialmente esta fanerógama sobre sus frondes actuó de

barrera limitando la solubilización de los compuestos fenólicos al medio

procedentes de sus tejidos, sin embargo, la eliminación de dicha costra de sales

tras el lavado, dio lugar a un incremento sustancial en la liberación de estos

compuestos con actividad elicitora al medio.

• En relación a la productividad, sólo las plantas PSL mostraron una menor cosecha

que las de las plantas desarrolladas en fibra de coco, mientras que en las PL los


110

kilos de tomate cosechados fueron del orden de los obtenidos para el sustrato

control.

• Cabe destacar que el emplear como sustrato de cultivo Posidonia oceanica

también afectó al proceso de maduración de los frutos, retrasándolo respecto a los

tomates obtenidos en fibra de coco.

• El hecho de que las plantas cultivadas sobre Posidonia oceanica estuviesen

sometidas a distintos tipos de estrés (salino y/o oxidativo), hizo que los frutos

presentasen mayores contenidos en compuestos fenólicos y licopeno, lo que

incrementó el valor nutricional de dichos frutos respecto a los cultivados sobre fibra

de coco.

111

V. EXPERIENCIA 3

Experiencia III

113

V. EXPERIENCIA III: EFECTO DE LA APLICACIÓN DE EXTRACTOS

ACUOSOS DE Posidonia oceanica SOBRE EL DESARROLLO VEGETAL

V.1. Materiales y Métodos.

V.1.1. ENSAYO 1: Obtención y caracterización de extractos vegetales de

Posidonia oceanica.

Para la realización de esta experiencia se necesitó, en primer lugar, la

obtención de los extractos vegetales de Posidonia oceanica que posteriormente se

aplicaron foliarmente a plántulas de tomate sometidas a estrés salino.

La Posidonia oceanica empleada fue la misma que en las experiencias

anteriores, proveniente de la Playa Marineta Casiana en Denia (Alicante). Antes del

proceso de obtención de los extractos vegetales, los arribazones de Posidonia

oceanica fueron tamizados secuencialmente a 2mm y a 1mm, para eliminar la arena y

los materiales no deseados (plásticos, vidrios, conchas,…). Tras el cribado se lavó con

agua de red y luego con agua destilada, repitiendo esta operación 2 veces en cada

caso, intentando eliminar las sales contenidas en la superficie foliar de esta

fanerógama. Las muestras húmedas se secaron en una estufa a 60ºC durante 2 días,

una vez transcurrido ese tiempo, se molieron con molinillo de aspas metálicas, hasta

obtener una textura homogénea. Y a continuación se procedió a preparar los extractos

vegetales de Posidonia oceanica.

Con el fin de evitar la aparición de fitotoxicidad en las plantas que fuesen

tratadas con estos extractos, se decidió emplear como extractante agua, obteniendo

así, extractos acuosos que fuesen lo más inocuos posibles para el vegetal (Derbalah,

2012). Respecto a las condiciones de extracción, se estudiaron distintas variaciones

en tiempo y temperatura (Conesa, 2016):

1) Temperatura: 35ºC y tiempo: 4 horas

2) Temperatura: 60ºC y tiempo: 2 horas

3) Temperatura: 100ºC y tiempo: 1 hora (Reflujo)

4) Temperatura: 100ºC y tiempo: 8 horas (Soxhlet)

Para las cuatro condiciones, se pesaron 4g de Posidonia oceanica, que se

introdujeron en un matraz esférico junto con 100mL de agua destilada, se realizaron 4

réplicas por proceso de extracción. La proporción empleada 4g/100mL fue


114

extrapolable a la que habitualmente se emplea para obtener otros extractos vegetales

a escala industrial (Frías, 2005).

En las condiciones 1 y 2, los matraces una vez tapados se introdujeron en un

baño termostatizado en las condiciones indicadas anteriormente (Figura V.1A). Una

vez pasado este tiempo las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente, a

continuación, se filtraron y guardaron a -20ºC hasta el momento de su caracterización.

Figura V.1: Montaje de los métodos empleados en la obtención de los extractos de Posidonia oceanica: A: Baño termostatizado con los matraces a las condiciones de extracción 1 y 2; B: Reflujo con tubo de destilación y manta calefactora a 100ºC y 1 hora de extracción; y C: Soxhlet.

En la condición 3, se introdujeron 4g de muestra en un matraz esférico con

100mL de agua destilada y se llevó a ebullición con reflujo durante 1 hora (Figura

V.1B). Finalmente, para la condición 4, se empleó un extractor Soxhlet siguiendo el

procedimiento de Barriada-Pereira et al. (2003) con alguna modificación, manteniendo

la misma relación soluto/disolvente que en las condiciones anteriores (Figura V.1C)..

Para cada extracto resultante se determinó:

− Contenido de macro (K, Ca, Mg) y micronutrientes (Fe, Mn, Cu, Zn), así como

de Si y de Na mediante un equipo ICP-OES (Perkin Elmer,Optima 4300 DV).

− Contenido de fenoles totales mediante el método de Folin-Ciocalteu

desarrollado por Larrauri et al (1997) y Oliveira et al (2012) y descrito en la

sección de materiales y métodos de la Experiencia IIV.1.

C

Experiencia III

115

V.1.2. ENSAYO 2: Efecto de la aplicación de extractos acuosos de Posidonia

oceanica sobre la germinación de semillas de tomate SENY F1.

En este ensayo fue evaluada la acción de extractos acuosos de Posidonia

oceanica sobre la germinación de semillas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.)

variedad SENY F1. Para ello se utilizó el extracto acuoso de Posidonia oceanica

resultante de la extracción a reflujo (100ºC y 1 hora) descrita en el Ensayo 1, a dos

dosis: una dosis del extracto sin diluir (EP1: 0,3 mM de Si y 0,35 mM de compuestos

fenólicos), y una segunda dosis del extracto acuoso diluido a la mitad (EP2: 0,15 mM

de Si y 0,18 mM de compuestos fenólicos).

Se realizó un ensayo de germinación in vitro, en el cual se usaron 270 semillas

distribuidas en 3 tratamientos: Control (semillas tratadas con agua destilada); EP1

(semillas tratadas con extracto Posidonia oceanica a la dosis 1 (0,3 mM de Si y 0,35

mM de compuesto fenólicos) y EP2 (semillas tratadas con extracto de Posidonia

ocenica a la dosis 2 (0,15 mM de Si y 0,18 mM de compuestos fenólicos)), con 9

repeticiones cada uno, usando 10 semillas por repetición. Cada repetición 10 semillas

de tomate fueron colocadas en una placa Petri con papel después de ser embebidas

en los respectivos tratamientos. Las placas de Petri se incubaron hasta la aparición de

la radícula, en una cámara de cultivo a 25ºC y un 44% de humedad relativa.

Cada dos días se adicionaron 5mL de agua destilada (control) o del extracto

correspondiente (EP1 o EP2) en cada placa Petri. 24, 48 y 72 horas después de haber

puesto las semillas a incubar, se calculó el porcentaje de germinación. Se consideró

que una semilla había germinado cuando la longitud de la raíz era de más de 1mm

(Rodríguez, 2013).

El efecto de los extractos acuosos empleados sobre la germinación se

determinó de la misma forma que en la Experiencia I, a partir de los siguientes

parámetros (Hoekstra, et al, 2002): germinación relativa (GRS), crecimiento relativo

radicular (CRR) e índice de germinación (IG).


116


Posidonia oceanica a plantas de tomate sometidas a estrés salino.

El desarrollo de esta experiencia se llevó a cabo en cámaras de cultivo SANYO

MLR-350 H del Departamento de Agroquímica y Bioquímica de la Universidad de

Alicante durante un período de 4 meses.

Semillas de tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) variedad SENY F1 sin

tratar, fueron germinadas en bandejas de plástico que contenían arena de sílice lavada

al ácido como sustrato. Estas semillas fueron regadas en días alternos con agua

destilada y con una disolución de sulfato cálcico 0,5 mM, ésta última para evitar la

aparición de hongos. Las bandejas con las semillas se mantuvieron bajo condiciones

controladas de temperatura, humedad relativa e intensidad lumínica (25ºC, 70% y 150

µE/m2·s).

Una vez germinadas las semillas (7 días), se modificaron las condiciones

ambientales de la cámara de cultivo (Tabla V.1), y se comenzó a regar todos los días

con una disolución nutritiva cuya composición se muestra en la Tabla V.5 (Martínez y

García, 1993), en este caso diluida a la mitad para los macronutrientes.

Tabla V.1: Condiciones ambientales de las cámaras de cultivo durante el desarrollo de las plántulas de tomate.

Temperatura (ºC)

Tiempo (horas)

Intensidad lumínica (µE/m2·s1)

Humedad Relativa (%)

21 2 150 70 25 12 >200 70 21 2 150 70 18 8 0 70

Cuando las plántulas alcanzaron un porte de aproximadamente 10cm (12 días

tras la germinación), se seleccionaron 45 plántulas que se trasplantaron a recipientes

de plástico opacos de 200mL de capacidad (una plántula por tarro), los recipientes se

rellenaron con 190mL de disolución nutritiva normal, idónea para el desarrollo del

cultivo de tomate y cuya composición se muestra en la Tabla V.2 (Martínez y García,

1993). Tres días después del trasplante, 36 de las 45 plántulas, se sometieron a estrés

salino, para ello la disolución nutritiva normal, se sustituyó por una disolución salina, la

Experiencia III

117

cual se preparó adicionando a la disolución nutritiva normal NaCl 50 mM alcanzando la

disolución final un valor de conductividad eléctrica (CE) próximo a 7 dS/m.

Tabla V.2: Composición disolución nutritiva (Martínez y García, 1993).

Compuesto Concentración (M) Compuesto Concentración (M)

FeEDDHA 3,58·10-5 Ca(NO3)2·4H2O 3,5·10-3 NH4NO3 5,0·10-4 MnSO4·5H2O 1,27·10-5

MgSO4·7H2O 1,25·10-3 CuSO4·H2O 3,14·10-7 KNO3 4,5·10-3 ZnSO4·7H2O 1,36·10-6 K2SO4 7,5·10-4 (NH4)6Mo7O24·4H2O 5,95·10-8

KH2PO4 1,5·10-3 H3BO3 4,63·10-5

Todas las plántulas se desarrollaron en cámara de cultivo, bajo condiciones

controladas durante 26 días (Tabla V.1 y Figura V.2). Cada dos días la disolución

nutritiva consumida por las plantas se repuso hasta los 190mL con agua destilada, y

en esa disolución se midió tanto el pH como la conductividad eléctrica. Tras esto, las

plántulas fueron pesadas para establecer la evolución del peso fresco a lo largo del

desarrollo del cultivo. Cuando el valor de la CE en la disolución nutritiva de las plantas

desarrolladas en condiciones normales era menor de 0,8dS/m, las disoluciones

nutritivas de todos los tratamientos se renovaron, o al cabo de una semana si no se

daba la primera condición.


118

Figura V.2: Cámara de cultivo utilizada en la experiencia, 17 días tras el trasplante.

Las plántulas se pulverizaron foliarmente un total de 6 veces a lo largo de los

26 días del desarrollo del cultivo, concretamente los días 7, 11, 14, 18, 21 y 25 tras el

trasplante. Los tratamientos fueron los siguientes: CN (control normal): plantas

desarrolladas en disolución nutritiva normal y pulverizadas con 5mL de agua destilada;

PN: plantas desarrolladas en disolución nutritiva normal y pulverizadas con el extracto

acuoso de Posidonia oceánica diluido a la mitad (0,15 mM de Si y 0,18 mM de

compuestos fenólicos). Esta dosis fue seleccionada porque fue con la que se

obtuvieron mejores resultados en el ensayo de germinación (Ensayo 2 de esta

Experiencia); CS (control salino): plantas desarrolladas en disolución salina (50mM de

NaCl) y pulverizadas con 5mL de agua destilada; P: plantas desarrolladas en

disolución nutritiva salina y pulverizadas con 5mL de extracto de acuoso de Posidonia

oceanica diluido a la mitad (0,15 mM de Si y 0,18 mM de compuestos fenólicos).

Previo al tratamiento foliar, las hojas fueron pulverizadas con 5mL de una

disolución de surfactante al 1% (v/v) (Mojante SpaChem S.L.), para mejorar la

penetrabilidad de las sustancias elicitoras a través de las hojas. El pH del extracto

acuodo de Posidonia oceanica empleado en este estudio fue ajustado a pH 5,5 con

ácido fosfórico previamente a ser aplicado al vegetal, con el fin de evitar el daño foliar.

Experiencia III

119

Una vez finalizado el periodo de desarrollo vegetal (26 días tras el trasplante),

las plantas se lavaron en primer lugar con jabón neutro sin fosfatos, con el fin de

eliminar polvo y posibles restos de los tratamientos efectuados. Después se lavaron

con agua ligeramente acidulada con HCl y por último, se enjuagaron varias veces con

agua destilada y se secaron con papel de filtro. Para cada determinación, de las 9

plantas de cada tratamiento, se escogieron 3 de ellas en las que se efectuaron los

análisis pertinentes.

V.1.3.1. Parámetros morfológicos.

Determinación del peso fresco y seco de las plántulas.

A lo largo de la experiencia se llevó a cabo la medida del peso fresco de las

plántulas, y al finalizar la misma se determinó el peso fresco y seco tanto de la parte

aérea como de la radicular. Para la determinación del peso seco las plántulas se

secaron en una estufa a 60ºC de temperatura hasta la pérdida total de agua.

V.1.3.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales.

Determinación de la concentración foliar de macro y micronutrientes.

La concentración de macro y micronutrientes se determinó a partir de la

calcinación seguida de una digestión ácida de las muestras de hoja seca y molida de

acuerdo con el método propuesto por Curdova et al. (1998) modificado. Una vez se

filtraron las muestras, se procedió a la cuantificación del contenido foliar de Na, K, Ca,

Mg, Mn, Zn, Cu y Fe por llevado a cabo por ICP-OES (Perkin Elmer Optima 4300 DV).

Determinación del contenido foliar de clorofilas.

El ensayo se realizó siguiendo el protocolo descrito en la Experiencia 2 por el

método de Abadía et al. (1984).


120

Determinación de la concentración foliar de peróxido de hidrógeno (H2O2).

La determinación se realizó siguiendo la metodología descrita por Jana y

Choudhuri (1982), descrita previamente en la Experiencia 2.

Determinación del contenido foliar en malondialdehído (MDA).

Dicha cuantificación se realizó del mismo modo que en la Experiencia 2,

mediante el procedimiento citado por Restrepo et al (2013).

Determinación del contenido foliar de prolina.

La determinación del contenido de prolina en hoja se realizó por colorimetría a

partir de la formación de un compuesto coloreado entre la ninhidrina ácida y la prolina

en medio tolueno, (Magné et al., 1992). Las muestras de material vegetal se

congelaron a -80ºC y se liofilizaron posteriormente en un equipo Ilshin TFD5503. Se

tomaron 100mg de hoja liofilizada a la que se le añadió 10mL de agua destilada a

60ºC. Se homogenizó y se centrifugó la muestra a 10.000 rpm durante 15 minutos en

una centrifuga refrigerada a 4ºC.

Posteriormente, a 0,5mL de sobrenadante se le añadieron 2mL de ninhidrina

ácida, preparada justo en el momento de su utilización (0,33g de ninhidrina en 20mL

de ácido acético glacial y 14mL de agua), y se agitó. Seguidamente se incubó durante

30minutos a 100ºC enfriando los tubos rápidamente en un baño con hielo una vez

finalizada la incubación. A continuación, se añadió 5mL de tolueno, se agitó y se

guardó en oscuridad a temperatura ambiente durante 3 horas. Finalmente se realizó

se midió la absorbancia de las muestras a 520nm.

Determinación del índice de transpiración.

La intensidad de transpiración (IT) se llevó a cabo midiendo la pérdida de peso

de un vástago de superficie conocida (Mangas, 2012). Para ello se tomó un vástago

de cada plántula y se midió su peso a distintos intervalos de tiempo.

Experiencia III

121

IT � gdm� × h =

PesoInicial − PesoFinalTiempo × Superficie

Determinación de la permeabilidad de membrana en raíz.

La permeabilidad de membrana se valoró a partir de la pérdida de electrolitos,

se midió a través de la conductividad eléctrica como cociente entre CE1/CE2

expresada en %, de manera que conforme aumenta este cociente mayor será la

permeabilidad de membrana (Kaya et al., 2002). Se lavaron y cortaron las raíces y se

pasaron a un tubo de centrífuga con agua destilada, manteniéndolos en agitación y

temperatura constante (100rpm y 25ºC, respectivamente) durante 24 horas, tras esto

se midió la conductividad eléctrica (CE1). La segunda medida de conductividad (CE2)

se realizó tras someter las muestras a 120ºC durante treinta minutos y dejarlas enfriar

a temperatura ambiente.

Análisis estadístico.






Experiencia III

123

V. 2. Resultados y discusión.

V.2.1. ENSAYO 1: Obtención de extractos acuosos de Posidonia oceanica.

Los resultados de la caracterización de los extractos de Posidonia oceanica

obtenidos con las distintas condiciones de extracción ensayadas, se muestran en las

Tablas V.1, V.2 y V.3. El criterio más importante para elegir el método de extracción

más adecuado fue la concentración de silicio y de compuestos fenólicos en cada uno

de los extractos vegetales, ya que existen evidencias de que estos principios activos

pueden actuar como inductores de la resistencia de las plantas desarrolladas bajo

condiciones de estrés abiótico (Rice-Evans et al., 1997; Romero-Aranda et al., 2001).

Tabla V.1: Concentración de silicio (mM) y de compuestos fenólicos totales (mM) en los extractos de Posidonia oceanica para cada método de extracción empleado.

Extracto Posidonia oceanica

Método Si (mM) Fenoles (mM)

35ºC-4h 0,040±0,002 0,070±0,003 60ºC-2h 0,11±0,01 0,18±0,01

100ºC-1h-reflujo 0,30±0,02 0,35±0,02 Soxhet 0,50±0,03 0,56±0,02

*Los datos mostrados son la media± SD de 4 repeticiones.

Tabla V.2: Concentración de macronutrientes en el extracto de Posidonia oceanica para cada método de extracción empleado.

Método Na (mM) K (mM) Ca (mM) Mg(mM)

35ºC-4h 1,8±0,1 0,13±0,01 1,1±0,1 1,3±0,1 60ºC-2h 4,8±0,2 0,34±0,02 2,5±0,1 3,4±0,2 100ºC-1h reflujo 1,8±0,1 0,22±0,01 1,2±0,1 1,6±0,1 Soxhlet 2,8±0,1 0,21±0,01 2,1±0,1 2,1±0,1

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones.

Tabla V.3: Concentración de micronutrientes en el extracto de Posidonia oceanica para cada método de extracción empleado.

Método Fe (µM) Zn(µM) Mn(µM) Cu(µM)

35ºC-4h 2,3±0,2 0,4±0,02 5,5±0,2 1,1±0,1 60ºC-2h 5,1±0,2 1,3±0,1 0,41±0,02 <0,08 100ºC-1h reflujo 4,5±0,3 0,34±0,02 0,24±0,01 <0,08 Soxhlet 2,6±0,1 0,5±0,02 0,081±0,001 <0,08

*Los datos mostrados son la media ± SD de 4 repeticiones.


124

Tras analizar los resultados de la composición de los extractos obtenidos a

partir de Posidonia oceanica, el extracto más rico en sustancias elicitoras fue el

obtenido con el Soxhlet (Tabla V.1), pero también su contenido en Na+ era alto, hecho

que podría aumentar el estrés salino al que estaban siendo sometidos las plantas, por

lo que se seleccionó como extracto a aplicar el obtenido con las condiciones de

extracción 3, es decir, el obtenido mediante reflujo de 1 hora, ya que aunque este

último presentaba una menor concentración de Si y de compuestos fenólicos que las

obtenidas con el Soxhlet, pero también su contenido en Na+ era mucho menor.

V.2.2. ENSAYO 2: Efecto de la aplicación de extractos acuosos de Posidonia

oceanica sobre la germinación de semillas de tomate SENY F1.

En la Tabla V.6, se muestran los resultados obtenidos para los distintos

parámetros de germinación medidos para evaluar el efecto del tratamiento de semillas

de tomate con el extracto de Posidonia oceanica a las dos dosis en estudio. Respecto

a la germinación relativa (GRS), no se observaron diferencias estadísticamente

significativas entre las dos dosis de extracto de Posidonia oceanica empleadas, con un

valor de 97% para ambos extractos (Tabla.V.6).

En relación al porcentaje de crecimiento de la raíz (CRR), el valor de este

parámetro fue superior al 100% para ambas dosis estudiadas, lo que demuestra el

efecto bioestimulante de este extracto, independientemente de la dosis aplicada (Tabla

V.6). Cabe destacar que el valor de CRR fue un 33% mayor para el extracto diluido

que para el concentrado (238% frente al 159%, respectivamente) (Tabla V.6), lo que

sugiere que las dosis más bajas de este producto podrían resultar más beneficiosas en

el proceso de germinación (García-Sánchez et al., 2012).

Como se puede observar en la Tabla V.6, el porcentaje de índice de

germinación (IG) en el extracto acuoso diluido fue mayor que en el extracto

concentrado, esto podría ser debido a que la mayor concentración de compuestos

fenólicos de este último pudiese resultar fitotóxica, ya que de acuerdo con García-

Sánchez et al. (2012) estos compuestos únicamente tiene un efecto positivo sobre la

germinación cuando se aplican a bajas dosis.

Experiencia III

125

Tabla V. 6. Ensayo de germinación en semillas de tomate.

Dosis del extracto de Posidonia

Tomate (96 horas)

GRS(%) CRR(%) IG(%)

Concentrada 97±3 159±5b 154±2b

Diluida 97±2 238±4a 229±3a

Sig(1) ns *** *** *Los datos mostrados son la media ± SD de 20 repeticiones. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).


Posidonia oceanica a plantas de tomate sometidas a estrés salino.

V.2.3.1. Parámetros morfológicos.

Peso fresco de las plántulas.

En la Figura V.4 se muestra el desarrollo del peso fresco de las plantas de

tomate para los distintos tratamientos estudiados a lo largo de esta experiencia. El

gráfico muestra cómo las plantas cultivadas en condiciones normales (CN)

presentaron un peso fresco significativamente mayor al de las plantas control salino

(CS) y al de las plantas desarrolladas en condiciones salinas y tratadas con el extracto

vegetal (P) a lo largo de los 26 días de desarrollo del cultivo. De forma que al final del

estudio, las plantas CS, habían disminuido su crecimiento en un 39 % respecto a las

CN, mientras que las plantas P lo hicieron en un 28% (Figura V.4). Estos resultados

apoyan los obtenidos por Zhu et al. (2004) y Soylemezoglu et al. (2009), en vid y

pepino, respectivamente. Estos autores observaron que el desarrollo de estas

especies bajo condiciones de estrés salino se tradujo en una importante inhibición en

su crecimiento. En general se puede decir que un incremento en la salinidad del medio

de cultivo normalmente suele ir acompañado de reducciones significativas en el peso

del tallo, altura de la planta, número de hojas por planta, longitud y área radicular en

los tomates, lo que se traduce en una reducción significativa del peso total de la planta

(Leidi y Pardo, 2000).


126

Figura V.4. Evolución peso fresco de las plantas. CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales).

Cuando se compara la evolución del peso fresco de las plantas control

desarrolladas en disolución nutritiva salina (CS) con la del peso de las plantas con

estrés salino que recibieron la aplicación foliar del extracto de Posidonia oceanica (P),

se observa que el desarrollo durante los primeros 10 días de tratamiento fue igual para

ambos (Figura V4). Sin embargo, a partir la segunda aplicación del extracto, las

plantas tratadas con P, mostraron un ligero incremento del peso fresco respecto a CS,

aunque en ningún caso estas plantas llegaron a alcanzar el peso de las plantas CN

(Figura V.4). Estas diferencias de comportamiento en el crecimiento vegetal entre las

plantas P y las CS, pueden ser atribuidas a la presencia de Si y compuestos fenólicos

en el extracto vegetal, los cuales podrían haber actuado como elicitores, reduciendo

los efectos nocivos que la salinidad tiene sobre el peso de las plantas. De acuerdo con

Berfad y Alnour, 2014; Pergent et al., 2008, los extractos de Posidonia oceanica son

ricos en compuestos fenólicos como el metil-12-acetoxiricinoleato, acetosiringona,

ácidos fenólicos como el ferúlico, vanílico, protocatéquico o hidroxibenzoico,

flavonoides o taninos, cuya composición podrá variar en función del el disolvente

usado para la obtención del extracto (Berfad y Alnour, 2014; Pergent et al., 2008).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20 25

Peso

fre

sco

pla

nta

(g

)

Días transcurridos desde la aplicación del tratamiento

CN

CS

P

Experiencia III

127

A

C

B

a

c b

0

5

10

15

20

25

30

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

CN CS P

Peso

Fre

sco

(g

)

Parte Aérea

Parte Radicular

Peso fresco de la parte aérea y radicular.

En la Figura V.5 se muestra el peso fresco de la parte aérea y radicular al final

de la experiencia, para los distintos tratamientos. Se puede observar como en el

control salino (CS), mostró una disminución del peso fresco de la parte aérea de un 43

% y de un 37 % de la parte radicular respecto a las plantas desarrolladas en

condiciones normales (CN) (Figura V.5). Estos porcentajes muestran como la parte

aérea se vio ligeramente más afectada por la salinidad que la parte radicular,

resultados que vendrían a confirmar los obtenidos por Shao et al. (2008).

Las aplicaciones foliares de los extractos vegetales de Posidonia oceanica

incrementaron significativamente tanto el peso fresco de la raíz como el de la parte

aérea de las plantas de tomate respecto a las plantas CS (Figura V.5.). En concreto el

peso fresco de la parte aérea de las plantas P fue un 17% mayor que el de las plantas

CS y mientras que en la parte radicular se encontró un incremento del 15 % (Figura

V.5).

Figura V.5: Peso fresco de la parte aérea y radicular de las plantas de tomate. CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.


128

a

bb

A

B B

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

CN CS P

Peso

Seco

(g

)

Parte Radicular

Parte Aérea

Peso seco de la parte aérea y radicular.

La Figura V.6 muestra los resultados del peso seco de la parte aérea y

radicular de las plantas de tomate desarrolladas en los distintos tratamientos.

En este caso, se puede observar como el peso seco de las plantas a las que se

les aplicó el extracto de Posidonia oceanica no mostraron diferencias estadísticamente

significativas con respecto al de las plantas CS (Figura V.6), ni de la parte área ni la

radicular. Resultados que serían esperables de acuerdo con Ayyub et al. 2015. Estos

autores, aplicaron foliarmente ácido salicílico y quitosano a plantas de lechuga y

espinaca sometidas a estrés salino y encontraron que el peso seco total de las mismas

no se incrementó tras el tratamiento con los elicitores, siendo el valor de este

parámetro del orden del que encontraron para las plantas desarrolladas en medio

salino sin tratamiento.

Figura V.6: Peso seco de la parte aérea y radicular de las plantas de tomate. CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

El hecho de que el peso fresco de las plantas P haya sido estadísticamente

mayor al de las plantas CS (Figura V.5), mientras que el peso seco de las primeras

estadísticamente igual al de las segundas sugiere que las plantas tratadas con el

Experiencia III

129

extracto vegetal mejoraron la eficiencia en el uso del agua respecto a las plantas no

tratadas, resultado que se podría interpretar como un indicio de que las plantas (P)

estaban sufriendo un menor daño por salinidad que las plantas control salino (CS) y

que vendrían a corroborar los obtenidos por Khan et al (2012) al aplicar foliarmente

compuestos fenólicos a plantas desarrolladas bajo un fuerte estrés salino,

V.2.3.2. Parámetros fisiológicos y nutricionales.

Concentración foliar de macro y micronutrientes.

Las Tablas V.7 y V.8 muestran las concentraciones de macro y micronutrientes

para las plantas analizadas en este estudio bajo las condiciones establecidas. De los

cuatro macronutrientes analizados hay que hacer más hincapié en el Na+, ya que

suele ser uno de los principales responsables del estrés salino en las plantas (Munns

et al., 2005; Chinnusamy et al., 2005).En la Tabla V.7 se puede observar como la

concentración de Na+ en las plantas sometidas a estrés salino (CS) fue 5 veces mayor

que a las plantas a las que no se les aplicó dicho estrés (CN). En el caso de las

plantas sometidas a estrés salino y tratadas con el extracto de Posidonia oceanica su

contenido foliar en Na+ fue estadísticamente igual al de las plantas CS, por lo que la

aplicación de este producto no parece que limitase la toma de Na+ a través de la

raíces, por lo que si ambas plantas mostraron el mismo contenido en Na+, el extracto

vegetal aplicado debió actuar sobre el daño que genera la presencia de un exceso de

este ion en los tejidos vegetales, más que en limitar su absorción a través de la raíces

para que no produzcan estos daños(Tabla V.7).

En relación a la concentración foliar de K+, tanto las plantas tratadas con el

extracto de Posidonia oceanica (P) como las plantas control salino (CS) mostraron un

contenido en potasio estadísticamente menor al delas plantas control normal (CN)

(Tabla V.7). Este comportamiento podría ser atribuido a que el flujo de K+ a través de

la membrana puede reducirse severamente en presencia de elevadas concentraciones

otros cationes como el NH4+, Na+, etc., debido a la competencia entre dichos cationes

y el K+ por los transportadores de la membrana (Nieves-Cordones et al., 2007). Por

tanto, los resultados de este trabajo sugieren que la presencia de altas

concentraciones de Na+ en el medio de cultivo hizo que la toma de potasio se redujese

en un 58% en relación con las plantas control normal (CN) y que la aplicación del


130

extracto de Posidonia oceanica no mejoró la toma de K+ por las plantas, lo que estaría

en concordancia con el hecho que tampoco redujo la concentración de Na+ acumulada

en los tejidos vegetales (Tabla V.7).Del mismo modo, Alemán et al. (2009) sostienen

que al incrementar la concentración de Na+ en la raíz de algunas especies, se limita

sustancialmente la absorción de otros cationes como el Ca2+ y el Mg2+ esto confirmaría

que las concentraciones de estos dos cationes en las plantas CS y P fueran

estadísticamente menores a las de las plantas CN (Tabla V.7). Al comparar la

concentración de estos elementos en las plantas control salino (CS) y en las plantas

tratadas con Posidonia oceanica (P) respecto a las plantas control normal (CN), se

puede observar que el contenido de ambos elementos se vio reducido un 43% para el

Ca2+ y un 41% para el Mg2+ (Tabla V.7). De estos resultados se deduce que la

aplicación foliar del extracto de Posidonia oceanica a la dosis empleada en este

estudio no incidió en la toma de Ca2+ y/o Mg2+ mostrando estas plantas el mismo

comportamiento que las del control salino (CS) (Tabla V.7).

Tabla V.7. Concentración de macronutrientes.

Tratamiento Ca % (p/p) Mg % (p/p) K % (p/p) Na % (p/p)

CN 3,3±0,3a 0,51±0,01a 4,4±0,2a 0,282±0,005b CS 1,98±0,03b 0,304±0,009b 3,2±0,2b 1,8±0,1a P 1,9±0,2b 0,31±0,01b 3,5±0,3b 2,0±0,3a

Sig(1) *** *** *** *** *Los datos mostrados son la media ± SD de 3 repeticiones. CN: Control Normal; CS: Control Salino; P: Tratamiento con Posidonia oceanica. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Respecto a las concentraciones de micronutrientes no existen diferencias

estadísticamente significativas entre los distintos tratamientos, por lo que se puede

decir que, tanto la concentración de sales establecidas en el ensayo como la

aplicación foliar del extracto de Posidonia oceanica no tuvieron ningún tipo de efecto

en la toma de Cu, Mn, Zn y Fe (Tabla V.8). Numerosos estudios han establecido que

la toma de micronutrientes por parte de las plantas se ve afectada cuando se da un

aumento de la salinidad del medio de cultivo, reduciendo la solubilidad de los

elementos (Page et al., 1990). debido a la competencia entre estos iones y el Na por

los sitios de absorción en las células radiculares (Grattan et al., 1992). Sin embargo,

en este estudio la toma de micronutrientes no se vio afectada.

Experiencia III

131

Tabla V.8. Concentración de micronutrientes.

Tratamiento Cu

(mg/Kg hoja) Mn

(mg/Kg hoja) Zn

(mg/Kg hoja) Fe

(mg/Kg hoja)

CN 37±2 112±8 62±5 121±5 CS 36±3 104±6 63±5 120±9 P 36±2 105±5 60±5 128±5

Sig(1) ns ns ns ns *Los datos mostrados son la media ± SD de 3 repeticiones CN: Control Normal; CS: Control Salino; P: Tratamiento con Posidonia oceanica. (1) Significación: ns (sig>0,05); *(0,05>sig>0,01); **(0,01>sig>0,001); ***(sig<0,001). Medias con letras distintas en una misma columna indican diferencias significativas según el test de Duncan (P<0.05).

Contenido foliar de clorofilas.

En la Figura V.7 se muestra los resultados de la concentración foliar de clorofila

en los diferentes tratamientos de este estudio. Como se puede observar, la salinidad

produjo un descenso significativo en el contenido foliar de este pigmento (Figura V.7).

Si se compara cómo varía la concentración foliar de clorofilas en las plantas

control normal (CN) respecto a las plantas control salino (CS), se observa que la

concentración de clorofilas se redujo en un 30% (Figura V.7).Son diversos los estudio

que demostrado que la salinidad disminuye la concentración foliar de pigmentos

fotosintéticos tales como las clorofilas y los carotenos independientemente del tipo de

cultivo (Siringam et al., 2011; Vazan y Torabi, 2013; Turan y Tripathy, 2015). Esta

disminución en la concentración foliar de clorofilas podría deberse en primer lugar, a la

degradación de las clorofilas por la acción de la clorofilasa, enzima que descompone la

clorofila en fitol y clorofilina (Santos, 2004; Sevengor et al., 2011), por otro lado, un

aumento de la salinidad disminuye la síntesis del ácido glutámico, precursor de los

tetrapirroles, por lo que tendría como consecuencia una disminución en la síntesis de

la clorofila (Santos, 2004), finalmente una disminución en la concentración de las

clorofilas podría darse por estrés oxidativo, ya que las especies reactivas de oxigeno

(ROS) producen una degradación directa de dicho pigmento (Jaleel et al., 2008).


132

b

c

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

CN CS PCo

ncen

tració

n d

e C

loro

fila

s

(mg

/g p

f)

Figura V.7: Concentración foliar de clorofilas total (mg/ g peso fresco). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia

oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

En relación al tratamiento P, en la Figura V.7 se observa que la aplicación foliar

del extracto de Posidonia oceanica incrementó el contenido en clorofilas respecto al de

las plantas control salino no tratadas (CS), llegando incluso a superar la concentración

de clorofilas del tratamiento control no salino (CN) (Figura V.7) El comportamiento

observado en las plantas a las que se les aplicó el extracto vegetal podría ser debido

tanto al aporte de Si y como de compuestos fenólicos presentes en el extracto de

Posidonia oceanica, ya que diversos estudios han demostrado que la aplicación de

estos compuestos mitiga el estrés oxidativo (Imtiaz et al., 2016) a la vez que dan

estabilidad a los cloroplastos (Nwugo y Huerta, 2008; Tripathi et al., 2015).

Experiencia III

133

Figura V.8: Concentración foliar de carotenoides (mg/ g peso fresco). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia


En un estudio de Al-aghabary et al., (2004) realizado en plantas de tomate

sometidas a estrés salino (100mM) observaron como la concentración foliar de

clorofilas disminuyó significativamente comparándolas con las plantas a las que no se

les aplicó dicho estrés. Sin embargo, la aplicación foliar de Si (2,5mM) a plantas

sometidas a dicho estrés mejoró la concentración foliar de las clorofilas. De acuerdo

con Lee et al., (2010), la adición de Si 2,5 mM a un cultivo hidropónico de plantas de

soja sometidas a estrés aumentó el contenido de clorofilas en comparación con las

que no se les realizó dicha aplicación. Son muchos los estudios que muestran que en

plantas sometidas a estrés salino, la adición de Si puede mejorar la eficiencia

fotoquímica del fotosistema II (PSII) debido al aumento en la concentración de

clorofila, limitando la tasa de transpiración y detoxificando a la planta de las sustancias

ROS debido a la acumulación de Si en las hojas (Mohsenzadeh, et al., 2011;

Alaghabary et al., 2004).

En lechuga, también se ha visto como la aplicación foliar de un extracto

obtenido del alga parda, Ascophyllum nodosum, mejoraba el desarrollo de plantas

sometidas a estrés salino (Neily et al., 2010; Guinan et al., 2013). Una de las

a

cb

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

CN CS P

Co

ncen

tració

n d

e

Caro

ten

oid

es (

mg

/g p

f)


134

respuestas características del tratamiento con extracto de algas marinas en plantas

sometidas a estrés salino es el aumento en el contenido de clorofila en las plantas

tratadas, este efecto se ha observado en distintos cultivos tales como la vid y/o la

fresa (Fan et al., 2013; Jannin et al., 2013; Sivasankari et al., 2006; Spinelli et al.,

2010).

Concentración foliar de peróxido de hidrógeno (H2O2).

Como ya se ha visto anteriormente, el estrés por salinidad produce distintos

efectos en el desarrollo de las plantas, entre ellos el desequilibrio que se da entre las

sustancias reactivas de oxigeno (ROS) y el sistema antioxidante de la planta, este

desequilibrio hace que se acumulen las sustancias reactivas de oxígeno, entre ellas, el

peróxido de hidrógeno (H2O2), produciendo un daño oxidativo (Schützendübel y Polle,

2002).

En la Figura V.8 se muestra la concentración foliar de peróxido de hidrogeno

para los distintos tratamientos en estudio. En ella se puede observar como las plantas

control normal (CN), tuvieron una concentración de H2O2 un 33% menor que el de las

sometidas a estrés salino (CS). A su vez, la aplicación foliar del extracto vegetal de

Posidonia oceanica hizo disminuir de forma significativa la concentración del peróxido

de hidrógeno en las plantas con estrés salino (P) respecto a las plantas control salino

(CS), situándose la concentración de H2O2 en valores estadísticamente iguales a los

del control normal (CN) (Figura V.8).

Estudios llevados a cabo por Al-aghabary et al., (2004), mostraron que cuando plantas

de tomate son sometidas a estrés salino, la actividad de la enzima superóxido

dismutasa (SOD), enzima encargada de la catálisis de las sustancias reactivas de

oxígeno (ROS), se vio significativamente reducida, lo que produjo una acumulación de

H2O2 en los tejidos, mientras que en las plantas estresadas por salinidad y tratadas

con silicio, el contenido en H2O2 se vio disminuido. El mecanismo por el que el silicio

puede reducir la concentración de H2O2 en los tejidos vegetales de plantas sometidas

a estrés oxidativa es por provoca incrementos de la actividad de la SOD, de la

peroxidasa (POD), la catalasa (CAT), así como las actividades de la glutatión

reductasa (GR) y la concentración de glutatión (GSH) en plantas de judía sometidas a

estrés salino, lo que contribuye a una eliminación de los ROS que se acumulan

durante estas condiciones de estrés (Liang et al., 2003; Al-Aghabary et al., 2004; Zhu

Experiencia III

135

et al., 2004; Shi et al., 2016). Por lo que los efectos observados al aplicar el extracto

de Posidonia oceanica podrían estar relacionados con las altas concentraciones de Si

que esta fanerógama presenta en su composición (Tabla V.1).

Figura V.8: Concentración foliar de peróxido de hidrógeno (µmol/ g peso fresco). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

Del mismo modo, Posidonia oceánica es rica en compuestos fenólicos, al

igual que las algas marinas, especialmente las algas pardas (Bhattacharyya y Jha,

2012). Hay evidencias de que este tipo de compuestos también intervienen activando

los sistemas enzimáticos encargado de la detoxificación de los tejidos vegetales y por

tanto de la disminución de las sustancias reactivas de oxigeno (ROS) tales como, el

oxígeno singlete, el ion superóxido, y los radicales hidroxilo, alcoxi y peroxilo, debido a

su gran capacidad de donar electrones o hidrógeno, así como de quelar metales (Rice-

Evans et al., 1996; Andjelković et al., 2006). Es por este motivo que tanto el Si como

los compuestos fenólicos presentes en la Posidonia e incluso la acción conjunta de

ambos podrían haber contribuido a reducir de forma significativa el contenido de H2O2

en las plantas P, y por tanto, disminuir el estrés oxidativo al que estaban sometidas.

b

a

b

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

CN CS P

H2O

2(µ

mo

l/g

Pf)


136

Contenido foliar en malondialdehído (MDA).

Uno de los efectos del estrés por salinidad es el estrés oxidativo, que produce

una acumulación de radicales libres o especies reactivas de oxigeno (ROS), dicha

acumulación entre otros efectos produce la peroxidación lipídica de los ácidos grasos

insaturados produciéndose la rotura de las membranas celulares. El malondialdehído

(MDA) es uno de los productos generado y es el marcador más empleado y estudiado

como indicador de estrés en las plantas (Del Rio et al., 2005).

En la Figura V.9 se recogen las concentraciones de MDA en los diferentes

tratamientos de este estudio. En ella se puede ver como la concentración foliar de

MDA en las plantas sometidas a estrés salino fue casi un 60% mayor que en las

plantas control normal (56 mmol/g peso fresco para plantas CS y 23 mmol/g peso

fresco para plantas CN). Estos resultados coincidirían con los obtenidos por Al-

aghabary et al. (2004) quienes observaron como la concentración foliar de MDA en

plantas de tomate sometidas a estrés salino aumentó en un 64% en relación a las

plantas no sometidas a dicho estrés.

Figura V.9: Concentración foliar de malondialdehído (mmol/ g peso fresco). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

c

a

b

0

10

20

30

40

50

60

70

CN CS P

MD

A (

mm

ol/

g P

f)

Experiencia III

137

Por otro lado, se puede ver como la aplicación del extracto de Posidonia

oceanica alivió en parte las consecuencias del estrés salino, ya que las plantas

tratadas con el extracto (P) mostraron unos contenidos significativamente menores de

MDA que las plantas control salino (CS), estando además estos valores muy próximos

a los obtenidos para las plantas control normal (CN), si bien no llegaron a ser iguales

estadísticamente hablando (Figura V.9).

Estudios realizado por Liang et al., (2003) y (2015), Moussa, (2006) y Gunes

et al. (2007) han demostrado que la aplicación de Si disminuye la concentración de

malondialdehído (MDA) en plantas de cebada y maíz sometidas a estrés salino ),

ayundando a mantener la integridad de la membrana y disminuyendo su

permeabilidad Los mecanismos moleculares inducidos por la aplicación de Si que

permiten a las plantas mejorar la resistencia frente al estrés salino, incluyen el

aumento de producción de compuestos de defensa como los fenoles o las fitoalexinas

(Rémus-Borel et al., 2005), y/o la activación de enzimas protectoras como las

peroxidasas, lipoxigenasas,…disminuyendo la concentración de MDA (Rahman et al.,

2016).

Se podría decir que la capacidad de mejora en plantas sometidas a estrés salino por la

aplicación del extracto de Posidonia oceanica, podría ser debido al aporte de silicio

que presenta el extracto en su composición, sin olvidar que dicha composición también

presenta compuestos fenólicos, que aplicados foliarmente disminuyen el estrés

oxidativo en plantas sometidas a estrés salino (Michalak, 2006; Khan et al., 2010).

Determinación de la permeabilidad de membrana en raíz.

En la Figura V.12 se muestran los resultados obtenidos respecto a la variación

de la permeabilidad de membrana a nivel radicular para los distintos tratamientos en

estudio. En general, uno de los efectos asociados con el estrés salino en el vegetales

la insaturación de los ácidos grasos de las membranas celulares debido a la

peroxidación lipídica producida por la acumulación de especies reactivas de oxígeno

en las células vegetales, lo que hace aumentar la permeabilidad de la membrana (Lian

et al., 2003). Es por ello que se espera que exista una cierta concordancia entre los

valores de permeabilidad de membrana y de MDA, si bien se debe que tener en

cuenta que en este estudio, la concentración de MDA se estableció en las hojas

mientras que la permeabilidad de membrana se determinó en la raíz, por lo que los

parámetros aunque sigan la misma tendencia no tienen por qué ser mismo orden.


138

De acuerdo con los datos recogidos en la Figura V.12, se encontraron

diferencias estadísticamente significativas entre los tres tratamientos en estudio (CN,

CS y P). Así, en las plantas control normal (CN) la pérdida de electrolitos fue de un

55% menor que para las plantas sometidas a estrés salino, cuyos valores de

permeabilidad son indicativos de que la integridad de la membrana se vio seriamente

afectada (91%) (Figura V.12). Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por

Yasar et al. (2008). Del mismo modo, Manaa et al. (2011) observaron una pérdida de

electrolitos a través de las células de la raíz de un 28-25% mayor en plantas de tomate

sometidas a estrés salino comparadas con plantas desarrolladas bajo condiciones

normales.

Figura V.12: Pérdida de electrolitos (%) como medida de la permeabilidad de membrana en raíces. CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica (Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

En relación a las plantas tratadas foliarmente con el extracto de Posidonia

oceanica (P) se puede observar que el valor de este parámetro se redujo de forma

significativa, pasando de unos porcentajes de permeabilidad de membrana del 91%

para las plantas CS a un 83% para las plantas P (Figura V.12). Estos resultados

sugieren que el menor estrés oxidativo al que estaban sometidas estas plantas, hizo

que la acumulación de ROS fuese menor y en concreto de H2O2 fuese menor (Figura

V.8), los contenidos MDA descendiesen (Figura V.9), y por tanto también hubiese una

c

ab

0

20

40

60

80

100

120

CN CS P

Pérd

ida d

e E

lectr

oli

tos (%

)

Experiencia III

139

menor pérdida de electrolitos a través de la membrana de las células radiculares

(Figura V.12). La justificación de este comportamiento podría estar en la presencia de

silicio y de compuestos fenólicos en el extracto de Posidonia oceanica, ya que

numerosos trabajos han demostrado que ambos compuestos son capaces de reducir

la peroxidación lípidica bajo condiciones tanto de estrés biótico como abiotico

disminuyendo a su vez el daño de la membrana de las células radiculares (Liang et al.,

2003; Blokhina et al., 2003; Zhu et al., 2004; Stevens et al., 2006; Gunes et al, 2007,

Gunes et al., 2008).

Contenido foliar de prolina.

Las plantas han desarrollado varios mecanismos protectores para contrarrestar

el estrés salino, uno de ellos es la acumulación de solutos compatibles como prolina y

glicina-betaína. Estos solutos participan en el ajuste osmótico y protegen las

estructuras celulares en plantas estresadas, estabilizando reacciones fotosintéticas, la

estructura de proteínas extrínsecas del fotosistema II, la síntesis de ATP y la

activación de enzimas (Watanabe et al., 2000; Chen et al., 2007; Chaman et al., 2014).

Figura V.11: Concentración foliar de prolina (µmol/g peso seco). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia


c

a

b

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

CN CS P

Pro

lin

a (µ

mo

l/g

Ps)


140

En la Figura V.10 se muestran los resultados para la concentración de prolina

para los distintos tratamientos ensayados. En ella se puede observar como existen

diferencias estadísticamente significativas para los distintos tratamientos (Figura V11).

Las plantas control salino (CS) mostraron una concentración de prolina 4 veces mayor

que las plantas control normal (CN) (155 µmol prolina/g peso seco y 35 µmol prolina/g

peso seco respectivamente), lo que confirmaría los resultados obtenidos por Chaman

et al. (2014), en los que al comparar la concentración de prolina de plantas tomate

tratadas con una disolución salina (200mM) con la de plantas no sometidas a estrés

salino, se observó que las últimas presentaban un contenido 74% menor de prolina

que las primeras. Este comportamiento era el esperado, es decir, que las plantas

sometidas a salinidad acumulasen prolina en el citoplasma de las células para evitar la

plasmólisis y que se produzca de forma adecuada el ajuste osmótico (Cheraghvareh y

Hajiboland, 2014). Díaz y Salas (2007) han comprobado que la acumulación celular de

prolina en plantas de tomate comercial y de Lycopersicon pimpinellifolium, permitió

que estas se pudiesen desarrollar en medio con una concentración de hasta 205 mM

de NaCl.

En relación a las plantas a las que se les aplicó foliarmente el extracto de

Posidonia oceanica (P), en la Figura V.10 se puede ver como siguieron una tendencia

similar a la observada anteriormente para el MDA (Figura V.9), para el H2O2 (Figura

V.8) y para las clorofilas (Figura V.7). Es decir, estas plantas presentaron unos

contenidos en prolina estadísticamente menores a los del control salino (CS), si bien

no llegaron a ser tan bajos como los que presentaban las plantas no sometidas a

estrés por salinidad (CN). Como se observa en la Figura V.10, se la concentración de

prolina en las plantas P fue un 62% menor que la de las plantas sometidas a estrés

salino (CS).

Índice de transpiración.

La transpiración es el transporte y evaporación de agua desde el suelo a la

atmósfera a través de las plantas, principalmente a través de las hojas (Azcón-Bieto y

Talón, 2008). Mientras los estomas están abiertos y el agua se evapora en las hojas,

las raíces incorporan agua desde el suelo y el transporte ascendente del agua en la

planta es continuo (Azcón-Bieto y Talón, 2008).

Experiencia III

141

Figura V.11: Índice de transpiración foliar (g/dm2·h). CN: plantas no tratadas, CS: plantas no tratadas y con disolución salina (50 mM NaCl), P: plantas con disolución salina (50 mM NaCl) tratadas con aplicación foliar de extracto de Posidonia oceanica

(Si de 0,15 mM y 0,18 mM de fenoles totales). Las medias de un mismo tratamiento con diferentes letras son distintas estadísticamente con una significación p≤0,05. ns: no significativo, p>0,05.

En condiciones de salinidad, uno de los principales mecanismos que se

inducen es el cierre de estomas para limitar la toma de agua y con ella la absorción

pasiva de Na+ que existe en el medio a altas concentraciones (Ben-Gal et al., 2008),

comportamiento que se confirma en los datos recogidos en la Figura V.11. Como se

puede observar, en las plantas sometidas a estrés por salinidad se vio reducida la

transpiración más del doble que en las plantas control normal (CN). Estos resultados

vendrían a confirmar los obtenidos por Morales et al. (1997) quienes estudiaron las

relaciones hídricas en dos cultivares de tomate (Lycopersicum esculentum y L.

pennelli) bajo condiciones de estrés salino (140mM de NaCl). Estos autores

establecieron que ante situaciones de elevada salinidad en el medio, las plantas

respondieron disminuyendo la transpiración y la conductancia estomática. Estos

mismos resultados también fueron confirmados por Tabatabaei (2006) en olivo.

En relación a las plantas a las que se les aplicó foliarmente el extracto de

Posidonia oceanica se puede ver un incremento estadísticamente significativo de la

tasa de transpiración respecto a las plantas sometidas al estrés salino (Figura V.11).

Este comportamiento podría ser de nuevo atribuido a la presencia de silicio en el

extracto, ya que varios estudios realizados en los últimos años, han observado que la

a

c

b

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

CN CS P

Índ

ice d

e T

ran

sp

iració

n

(g/d

m2·h

)


142

aplicación de Si a los cultivos se tradujo en un aumento de la transpiración en plantas

de arroz, de trigo y sorgo sometidas a estrés salino (Gong et al., 2005; Hattori et al.,

2005; Ahmed et al., 2011). Del mismo modo, Sonobe et al. (2009) concluyeron que la

aplicación de una disolución con 50ppm de Si aumentó la conductancia estomática, la

transpiración y mejoró la absorción de agua en cultivo hidropónico de sorgo. Aunque

también se ha encontrado que en situaciones de estrés abiótico, el Si puede

depositarse en las paredes celulares de la epidermis, evitando la perdida de agua por

transpiración, aumentando la elasticidad de la pared celular durante el crecimiento de

la planta al interactuar con pectinas y polifenoles (Marschner, 1995). Este resultado

justificaría el hecho de que las plantas P mostrasen un mayor peso fresco que las

plantas CS, a pesar de que el peso seco de ambas fuese igual (Figuras V.5 y V.6).

En relación con la aplicación de compuestos fenólicos como elicitores del

estrés salino en plantas, estudios realizados por Khan et al. (2015) mostraron que la

aplicación de este tipo de compuestos aumentó en un 20% la transpiración de plantas

sometidas a condiciones de estrés tratadas respecto a las no tratadas, lo que se

interpretó como que estas plantas habían experimentado una mejora sustancial en su

mejoraron su eficiencia en el uso del agua y mostrando menores daños ante la alta

concentración de sales del medio.

De nuevo, parece que el incremento en la tasa de transpiración observado en

las plantas P podría ser atribuido tanto a la presencia de Si como de compuestos

fenólicos en el extracto de Posidonia oceanica aplicado foliarmente, e incluso a un

efecto sinérgico entre ambos compuestos.

Experiencia III

143

V. 3.Conclusiones.

Tras analizar los resultados obtenidos en los ensayos que constituyen la

Experiencia III, se llega a las siguientes conclusiones:

• De las distintas condiciones de extracción ensayadas para la obtención de los

extractos acuosos de Posidonia oceanica, el reflujo a 100ºC durante 1h fue la que

permitió obtener un producto rico en Si y compuestos fenólicos pero con unas

bajas concentraciones en Na+.

• A pesar de que las dos dosis del extracto de Posidonia oceanica ensayadas

estimularon el proceso de germinación de las semillas de tomate, con un

incremento significativo de los parámetros CRR, IG, e GRS , fue la dosis más

diluida del extracto la que mostró un menor comportamiento, seguramente debido

a que a la dosis más alta, la concentración de compuestos fenólicos pudo resultar

algo elevada para plántulas tan pequeñas, ya que estos compuestos únicamente

tienen un efecto positivo cuando se aplican a bajas dosis.

• La aplicación foliar de los extractos de Posidonia oceanica fue efectiva para reducir

los efectos nocivos provocados por el estrés salino en plantas de tomate a la dosis

empleada en este estudio. El aumento de la actividad fotosintética de las plantas

tal y como se refleja en los mayores contenidos en clorofilas, el incremento de la

tasa de transpiración y el del peso fresco de las plantas salinas tratadas respecto a

las salinas no tratadas con el extracto vegetal son indicativos de la adaptación

alcanzada por las plantas de tomate a la salinidad del medio de cultivo.

• Al mismo tiempo, hay claras evidencias de que estos extractos vegetales también

redujeron el estrés oxidativo provocado por la alta concentración de NaCl, ya que

se mejoró la integridad de las membranas plasmáticas de las células radiculares, y

se redujo el contenido en prolina, MDA y H2O2 foliar.

• Los efectos beneficiosos frente al estrés salino confirman la actividad elicitora de

los extractos de Posidonia oceanica, debido a la presencia en su composición de

Si y compuestos fenólicos, si bien a partir de los resultados obtenidos no se puede

establecer si este efecto elicitor fue causado por el Si, por los compuestos

fenólicos o por un efecto sinérgico entre ambas sustancias.


144

• Aunque son necesarios más estudios que confirmen los resultados obtenidos en

este trabajo, los beneficios encontrados tras la aplicación vía foliar de los extractos

de Posidonia oceanica confirman la capacidad de las plantas de tomate para

absorber este tipo de compuestos a través de las hojas, lo que abre un nuevo

campo de aplicación en la agricultura sometida a estrés abiótico, permitiendo el

uso de productos respetuosos con el medio ambiente y la salud humana.

• El uso de extractos de Posidonia oceanica parece ser efectivo para combatir el

estrés salino, y por ello podría plantearse la posibilidad de usar los restos de esta

fanerógama marina como alternativa a su acumulación en vertederos tras su

retirada cada año de las playas.

145

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