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발간등록번호11-1480523-001868-01 NIER-GP2014-017

생태독성 시험·운영 실무지침

2014. 3

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차 례

Ⅰ. 생태독성 시험·운영 실무지침 개요

1. 관련규정

2. 배경 및 목적

3. 생태독성관리제도 소개

4. 물벼룩에 대하여

Ⅱ. 물벼룩 배양

1. 필요장비 및 기구

2. 배양액 제조

3. 군집·계대 배양을 통한 연속배양 방법

4. 배양액 교체

Ⅲ. 물벼룩 먹이의 제조

1. 먹이 공급 방법

2. 물벼룩 먹이 종류

3. 녹조류 배양방법

4. YCT (Yeast, Chlorophyll, Trout chow) 제조 방법

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Ⅳ. 생태독성 시험과정

1. 생태독성 분석 흐름도

2. 시험방법

3. 생태독성에 영향을 미치는 요인

4. 실험시 주요 참고사항

Ⅴ. 결과의 통계처리

1. Probit Method

2. Trimmed Spearman Karber(TSK) Method

3. Graphical Method

4. 계산식에 의한 결과산출

Ⅵ. 내부정도관리

1. 표준독성시험

2. 생태독성 숙련도시험 세부지침

Ⅶ. 참고문헌

부 록

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Ⅰ. 생태독성 시험·운영 실무지침 개요

1. 관련규정

「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률」시행규칙 제26조 별표 10의

폐수종말처리시설 생태독성 방류수 수질기준 및 동법 제34조 별표

13 제2호 나목의 폐수배출시설 생태독성 배출허용기준

「하수도법」시행규칙 제3조 별표 1 제2호에 따른 공공하수처리시

설 생태독성 방류수 수질기준

2. 배경 및 목적

환경부는 생태적으로 건강한 하천과 유해물질로부터 안전한 물환경

조성을 목표로 2007년「수질환경보전법」을「수질 및 수생태계 보

전에 관한 법률」로 개정하고 유해물질로부터 안전한 물환경 조성

을 위한「생태독성 통합관리제도(Whole Effluent Toxicity:WET)」를

2011년 1월 1일부터 시행 중에 있다.

생물을 이용한 시험방법은 이화학분석과 달리 정량 분석이 불가능

하며, 시험생물의 건강성, 시험자의 숙련도에 따라 평가 결과가 달

라 질 수 있다. 더욱이 생태독성 배출허용기준이나 방류수 수질기준

초과 시 시설에 대한 개선명령 등 법적규제를 동반하고 있어, 시험

결과에 대한 신뢰성 확보가 매우 중요하다.

본 지침은 시험생물종의 배양, 먹이의 질(Quality), 생태독성에 영향

을 미치는 요인, 통계기법을 이용한 결과산출 등 생태독성 측정시

실무적으로 접할 수 있는 내용에 대하여 보다 구체적인 가이드라인

을 제시하여 실제 분석업무 담당자의 편의를 도모하고 궁극적으로

는 시험결과의 신뢰성을 향상시키는데 기여할 수 있도록 하기 위하

여 작성되었다.

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3. 생태독성관리제도 소개

유해화학물질은 매년 약 400여종이 신규 유통되고 있으며 국내에는

약 41,000여종, 전 세계적으로 보면 약 246,000여종의 유해화학물질

들이 현재 유통 중인 것으로 알려져 있다. 이러한 유해화학물질의

급격한 증가로 이들이 환경에 노출되는 것을 통제하기 위한 개별대

응은 매우 어렵고, 실제로 이화학 기준을 만족하는 방류수에서 생태

독성이 발생됨에 따라 수생태계에 대한 손상이 우려되어 왔다.

이에 따라 환경부에서는 수생태계 위해성 저감을 위한“생태독성

배출허용기준”을 도입하고, 2007년 12월「수질 및 수생태계 보전에

관한 법률」시행규칙을 개정하여 수질오염물질 및 방류수 수질기준

과 배출허용기준에 생태독성(TU)을 추가하였다. 또한, 2008년부터는

생태독성관리제도 정착을 위한 종합계획을 수립하고, 제도 정비, 조

사연구 및 기술지원, 그리고 교육, 홍보 및 관련 산업 육성에 대한

사업이 시행되고 있다.

생태독성 관리제도는 산업폐수 방류수에 생물체(물벼룩)를 넣고 생

태독성 여부를 측정하여 하∙폐수를 통해 배출되는 미지의 유해물질

을 통합관리하기 위한 제도이다. 물벼룩은 시험종으로 선택한 이유

는 물벼룩이 수생태계 1차 영양단계 대표 생물종으로, 크기 약 0.3

~ 3 mm 정도로 작은 소형 갑각류이고 다산 및 짧은 생활사를 갖는

특징이 있으며 무엇보다도 독성물질에 민감하고 독성시험의 재현

성이 높기 때문이다.

4. 물벼룩에 대하여

가. 물벼룩의 구조와 특징

물벼룩은 전 세계적으로 11과 52속 450여종이 그리고 이들 중 한국

산 물벼룩은 9과 29속 55종으로 알려져 있다. 대부분 담수종(약 95

%)이며 유속이 빠르지 않은 하천, 호수, 연못 등에 주로 서식하고,

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적정 서식온도는 평균 15 ~ 25 ℃정도의 범위를 갖는다. 먹이는 단

세포의 녹조류 및 남조류와 같은 식물성 플랑크톤 및 원생동물, 박

테리아 등의 미생물을 섭취하며 먹이 종류보다는 입자 크기에 민감

하고 가슴다리와 다리에 부착되어 있는 여과용 다리털을 이용하여

먹이를 섭취한다. 물벼룩 기관의 구조와 기능은 <그림 1>과 같다.

<그림 1> 물벼룩 기관의 구조와 기능.

나. 물벼룩의 생식방법

물벼룩의 생식은 크게 단위생식과 수정생식을 통해 이루어진다. 이

는 환경상태에 따라 좌우되는데, 환경이 좋으면 암컷에서 암컷이 생

산되는 단위생식을 하나 이상 환경(온도, 경도, pH, 조도, 독성물질

유입 등)에 접촉하게 되면 수정생식을 통해 암컷에서 수컷이 부화1)

하게 된다. 물벼룩 수정란의 명칭은 검은 알(black egg), 내구란

(ephippia), 휴면란(resting egg) 등으로 불린다.

1) 수컷이 생성되는 이유는 자연환경 중 극한 상태에서 개체 존속의 필요성을 느낄 때로서 온도가 적정온도 아래로 내려갈 경우(15℃ 이하), 주위환경이 건조하여 수체량이 감소하는 경우, 광량이 적어지는 경우, 그리고 섭취할 먹이량이 감소하고 물벼룩의 밀도가 증가하는 경우 등이다.

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영양 상태가 좋은 환경에서, 어린 개체(neonate)를 1주일 배양하면

암컷의 경우 알을 가지기 시작하며, 새끼를 낳는다. 그러나 활동 범

위가 크고, 크기도 작으며, 붉은 색을 띠는 경우 수컷일 확률이 높

다. 현미경으로 보았을 때 암컷은 배가 둥근 반면, 수컷은 배가 직

각 모양을 띠면서 가슴 갈퀴가 암컷에 비해 크며 가슴에 잔털을 가

지는 특징을 보인다.

<그림 2> 물벼룩의 단위생식 및 수정생식과정.

다. 물벼룩의 수명 및 생활사

물벼룩의 수명 및 생활사(life cycle)는 물벼룩의 종, 온도, 먹이량

등에 따라 달라진다. Daphnia magna의 경우, 평균 수명은 40일(25

℃에서) ~ 56일(20 ℃에서)이며, 형태적으로 egg, juvenile(알을 갖고

있지 않은 형태), adolescent(처음 알을 갖게 되는 형태), adult의 과

정을 거친다. 20 ℃조건에서 하루 보통 6 ~ 10개의 알을 가지며 50

일 동안 57개 정도의 알을 낳는다. 그러나 온도가 상승하게 되면 유

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충 부화량은 증가하며 성충의 생존 기간은 짧아진다. 반대로 온도가

낮아지면 유충 부화량은 감소하며 성충의 생존 기간은 길어진다.

<그림 3> Daphnia magna의 산란 및 형태적 분류.

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용 도 장비 및 기구 권장사항

물벼룩 배양 및 독성시험 시 노출

배양기 또는 항온수조

배양실 내에 별도의 온도조절장치를 구비할 것

배양기는 배양실과 시료 노출실의 구분이 가능한 제품을 권장(예 : 양문형)

배양공간의 공기질이 깨끗하지 않다면 이를 정화할 수 있는 여과설비를 갖출 것

배양액 및 희석수 제조

정제수 제조장치

증류수 생산 용량 10 L/hr 이상인 장비

(물벼룩 성체 약 700 마리 배양 시 가정)

물벼룩 먹이 제조 (녹조류 배양)

고압증기멸균기 -

독성시험 라이트(Light) 박스

물벼룩의 치사 및 유영저해는 육안으로 확인이 가능하나, 색도가 있는 시료 또는 미약한 유영저해 판정 시에는 라이트 박스를 이용하는 것이 효과적임

50 mL 유리비커 독성시험 시 시험용기로 사용

노출 Rack 시료 노출 시 사용

Ⅱ. 물벼룩 배양

1. 필요장비 및 기구

물벼룩 배양 및 급성독성시험을 위한 장비 및 기구 등은 <표 1>과

같다.

<표 1> 필요장비 및 기구

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용 도 장비 및 기구 권장사항

물벼룩 포집(grab)(배양액

교체 및 독성시험)

스포이드 또는 피펫

스포이드, 피펫 입구의 직경은 최소 5 mm가 되도록 절단하여 사용

배양용기 1 L 유리 비커 등

물벼룩 배양 시 악영향을 주지 않는 재질의 용기를 사용할 것

(PP, PE 재질도 배양용기로 사용 가능하나 물벼룩의 영향 여부를 확인 후 사용 할 것)

배양액 제조 및 저장

증류수 통 수량은 배양하고자 하는 물벼룩 개체수를 고려하여 여유롭게 준비할 것

교반기 및 마그네틱 바

황산칼슘 이수화물(CaSO4․2H2O) 용해 시 사용

배양액 폭기 에어펌프 펌프 내에 함유된 유분(그리스)으로 인해 발생된 증기(fume)가 배양액내로 유입될 경우, 물벼룩에게 악영향을 줄 수 있으므로 유분 등을 함유하지 않는 펌프(Oil free)를 사용하거나 활성탄필터를 이용하여 증기 유입을 방지할 것

에어스톤 증류수통 바닥으로 충분히 가라앉을 수 있는 중량을 가질 것

배양액 제조 및 표준독성시험

전자저울 소수점 이하 셋째자리를 정량할 수 있을 것

배양액 제조 배양액 제조 시약

물벼룩 배양액(표 2 참조)

조류 배양액(표 5 참조)

물벼룩 배양 환경 점검

조도측정기 및 온도계

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용 도 장비 및 기구 권장사항

배양액 및 시료 측정

잔류염소측정기 배양액 및 시료 내 잔류염소 존재여부

암모니아측정기 배양액 및 시료 내 NH3+ 농도 측정

경도측정기 -

pH meter -

DO meter -

온도계 -

염도 및 전기전도도 측정기

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물벼룩 먹이의 상태 확인(녹조류)

현미경 물벼룩의 먹이는 사용 전 현미경을 통해 조류세포밀도, 응집정도 등을 관찰하여 물벼룩 먹이로써 적합한지 확인해야 함

*YCT (물벼룩 먹이) 제조

믹서기 YCT 제조시 각 재료를 분쇄

2 L 분별깔때기

Trout chow나 Flake food의 발효액 제조 시 유분 배제

거름망 구명직경 110 ㎛가 되는 것을 사용

조류 및 YCT 보관

냉장고 -

* YCT : Yeast, Chlorophyll, Trout chow을 혼합하여 제조 (상용화된 제품

구매사용 가능)

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2. 배양액 제조

배양액은 증류수에 <표 2>에 제시된 시약을 첨가하여 제조하며, 배

양액 제조 순서는 아래와 같다(20 L 제조 기준).

(1) 증류수 18 L 준비

(2) 준비된 증류수에 염화칼륨 160 mg, 황산마그네슘 2,400 mg, 탄

산수소나트륨 3,840 mg 를 첨가하고 12시간 정도 폭기 한다.

ᄋ폭기는 관상어용(금붕어) 에어펌프를 사용하며, 호스 끝 부분에 에어스톤을 부착하여 증류수통 하단부터 폭기가 이루어질 수 있도록 한다(첨가된 시약을 충분히 용해시키고, 용존산소의 농도를 높이기 위함).

ᄋ펌프 내에 함유된 유분(그리스)으로 인해 발생된 증기(fume)가 배양액내로 유입될 경우, 물벼룩에게 악영향을 줄 수 있으므로 유분 등을 함유하지 않는 펌프(Oil free)를 사용하거나 활성탄 필터를 이용하여 증기 유입을 방지토록 한다.

(3) 별도로 2 L 증류수에 황산칼슘 이수화물 2,400 mg을 넣고 교반

기와 마그네틱 바를 이용하여 충분히 용해시킨다.

(4) 위 (2)항과 (3)항 용액을 혼합하고 배양액으로 사용한다(<그림 4>

참조).

ᄋ제조된 배양액의 조성은 용존산소 3.0 mg/L 이상, pH 7.6 ∼ 8.0 , 경도 160 ∼ 180 CaCO3 mg/L , 알칼리도 110 ∼ 120 CaCO3 mg/L을 나타내야 하며, 위 항목들을 최소 주 1회 이상 확인함.

ᄋ배양액은 배양 중인 물벼룩 개체수를 고려하여 배양액 교체에 소요되는 배양액량을 산출하고 사용 1일 전 미리 제조해 둘 것을 권고 (예 : 1 L 비커에 성체 10 마리씩 넣어 총 700 마리를 배양한다고 가정 할 때 배양액 교체일에 소요되는 배양액 량은 약 70 L)

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증류수 18 L에 황산마그네슘 2,400 mg, 염화칼륨 160 mg, 탄산수소나트륨 3,840 mg을 넣고 12시간 폭기

별도의 증류수 2 L에 황산칼슘 이수화물 2,400 mg을 넣고 교반기와 마그네틱로 충분히 용해

①+②를 혼합하여 배양액으로 사용

<그림 4> 배양액 제조 방법.

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<표 2> 배양액 제조에 첨가되는 시약 및 첨가량

시약명증류수량에 따른 시약첨가량(mg)

20 L 1 L 40 L

염화칼륨(KCl) 160 8 320

황산마그네슘(MgSO4) 2,400 120 4,800

황산칼슘 이수화물(CaSO4․2H2O) 2,400 120 4,800

탄산수소나트륨(NaHCO3) 3,840 192 7,680

3. 군집·계대 배양을 통한 연속배양 방법

(1) 국립환경과학원에서 새로 분양받은 어린 개체(neonate) 약 100마

리를 2 L 비커에 넣고 군집 배양한다.

(2) 군집 배양한 어린 개체가 성장하여 첫 알을 가지기 시작한 성체

(군집배양 시작일로부터 약 5∼7일 후, 육안으로 확인 가능)를 1 L

비커에 8 ~ 10 마리 정도 옮겨 계대 배양한다.

ᄋ성체를 1 L 비커에 10 마리 이상 배양 할 경우, 개체 과밀도로 성체의 생존율과 어린 개체 생산율의 저하, 내구란과 수컷 발생 유발

ᄋ특히, 성체는 연령이 2 ~ 4 주차 동안 어린 개체를 가장 많이 생산하므로, 성체 수를 조절하여 생산된 어린 개체로 인한 개체 과밀도가 발생하기 않도록 주의해야 함

(3) 계대 배양 중인 성체에서 생산된 어린 개체를 골라내어 2 L 비

커에 약 100마리씩 넣고 군집 배양한다.

어린 개체 골라낼 때에는 몸체의 윤곽이 뚜렷하고, 개체 크기가 크며 활동성이 좋은 개체 위주로 선별해야 함

(4) 위 (1)항∼(3)항 까지의 과정을 반복하여 물벼룩을 연속 배양 할

수 있다(<그림 5> 참조).

(5) 물벼룩 몸체 색깔이 흰색일 경우에는 곰팡이, 검은색일 경우에

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는 박테리아에 의한 영향일 수 있으며, 이 경우 성체의 생존율, 어

린 개체 생산율을 크게 저하 시키고 다른 개체로의 전염을 발생할

수 있으므로, 배양용기 내의 모든 개체는 폐기한다.

또한, 붉은색일 경우에는 배양액 내 산소 부족을 의심할 수 있으므

로, 배양액 내 용존산소 농도를 확인한다(<그림 6> 참조).

(6) 새로 분양받은 어린 개체는 최소 2세대 이상 순화과정2)을 거친

후, 이들 어린 개체가 2주 이상 성장하여 생산한 어린 개체를 급성

독성시험에 사용한다.

배양환경3)이 불량할 경우, <그림 7> 및 <그림 8>과 같은 수컷 또는 내구란이 발생될 수 있음. 이 경우, 수컷4), 내구란(Ephippia)5)

이 발생된 배양 용기 내의 물벼룩은 전량 폐기해야 함

그러나 이상 환경(온도, 경도, pH, 조도, 독성물질 유입 등)에 접촉

하게 되면 수컷이 부화하게 되고 수컷의 수가 크게 증가 된다. 물벼

룩의 생식은 크게 단위생식과 수정생식을 통해 이뤄지며 이는 환경

상태에 따라 좌우된다. 환경이 좋으면 암컷에서 암컷이 생산되는 단

위생식이 이뤄진다.

<표 3> 물벼룩 배양조건

항 목 조 건

온 도 20 ± 2 ℃

광 도 500 ∼ 1,000 Lux

광주기(명 : 암) 16 : 8

2) <그림 5>의 ①∼③ 과정을 두 번 이상 거친 성체에서 생산되는 어린 개체3) 배양환경이란 시험자 숙련도, 먹이질 및 공급량, 배양온도, 배양액 성상, 배양

실 공기질 등 물벼룩에 배양에 영향을 줄 수 있는 모든 인자4) 수컷은 암컷에 비해 활동성이 크고, 몸 크기가 작으며, 붉은 색을 나타낸다.

또한, 현미경 관찰시 암컷은 배가 둥근 반면, 수컷은 배가 직각 모양을 하고 있다

5) 수컷과의 교미를 통해 수정이 이뤄진 암컷은 검정색의 알(내구란)을 형성하게 된다. 이 알(내구란)은 탈피를 통해 수체 밑바닥으로 가라앉게 되며, 환경이 좋아지면 부화되어 암컷이 증가하고, 단위생식을 하게 된다(<그림 7> 참조).

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<그림 5> 군집배양 및 계대배양 방법.

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곰팡이에 의한 영향(Metschnikowia bicuspidata,

Metxchnikowiella bicuspidata 등)

박테리아에 의한 영향(Pasteuria ramosa)

산소 부족에 의한 영향(헤모글로빈 상승)

<그림 6> 곰팡이, 박테리아, 산소 부족에 따른 물벼룩 성체의 색깔6).

<내구란> <정상란>

<그림 7> 내구란과 정상란의 구분7).

6) Source : National Center for Biotechnology Information(US), 20057) Source : http://mblaqua.culture.com

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<암컷> <수컷>

<그림 8> 물벼룩 암컷과 수컷의 차이8).

4. 배양액 교체

배양액 교체 주기는 1주일에 3회(예: 월, 수, 금) 정도가 적당하며,

물벼룩은 스포이드나 피펫 등을 이용하여 포집(Grab)하고 조심스럽

게 새로운 배양액으로 옮긴다.

물벼룩 포집 시 사용하는 스포이드, 피펫의 입구 직경은 최소 5

mm 이상이 되어야 한다(스포이드, 피펫 입구에 물벼룩이 달라 붙는

등과 같은 물리적 스트레스 최소화).

물벼룩을 새로운 배양액을 옮길 때에는 <그림 9>와 같이 스포이드

나 피펫이 배양액에 충분히 잠기게 한 후 물벼룩을 내보내야 물벼

룩의 껍질(carapace) 사이에 공기가 부착되어 수면위로 떠오르는 것

을 방지할 수 있다.

8) Source : http://mblaqua.culture.com

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<올바르지 않은 이동 방법> <올바른 이동 방법>

<그림 9> 물벼룩 이동방법.

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Ⅲ. 물벼룩 먹이의 제조

1. 먹이 공급 방법

먹이는 배양액 교체일(월, 수, 금)에는 조류+YCT를 공급하며 배양액

미 교체일(화, 목)에는 조류만을 공급한다. 특히, 금요일에는 물벼룩

이 주말(토, 일)에 섭식하는 량을 고려하여 조류를 추가적으로 더

공급한다.

먹이 공급량은 <표 4>를 참고하여 공급하되, 먹이 공급하고 약 12시

간 후 확인하여 물벼룩 몸체에 조류가 붙어 있거나 바닥에 가라 앉

아 있으면 조류 공급량을 줄인다. 조류가 물벼룩 몸체에 달라붙는

경우, 유영을 방해하여 치사 및 유영저해를 유발할 수 있다.

<표 4> 먹이공급량 (1 L 비커에 성체 8~10마리 배양 시 기준)9)

구 분배양액 교체일(월,수,금)

배양액 미 교체일(화, 목)

비고

조 류(3.0∼3.5 ×106∼8 cells/mL)

약 1 mL 약 1 mL이내

금요일에 약 1 mL 추가

YCT (Yeast, Chlorophyll, Trout chow)

약 1 mL -

2. 물벼룩 먹이 종류

물벼룩 먹이는 <그림 10>과 같이 Chlorella vugaris, Raphidocelis subcapitata (이전 학명 : Pseudokirchneriella subcapitata) 등과 같

은 녹조류와 Yeast, Chlorophyll, Trout chow를 혼합한 YCT를 사용

9) Source : Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms Fifth Edition October 2002

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한다.

YCT는 보조 먹이로 줄 수 있으며, 2010년 국립환경과학원 자체 실

험 결과 YCT의 공급이 없을 경우, 성체의 생존율과 어린 개체 생산

율이 저하될 수 있는 것으로 나타난 바 있다.

<Chlorella vulgaris> <Raphidocelis subcapitata>

<그림 10> 물벼룩 먹이로 사용되는 녹조류 종류10).

3. 녹조류 배양방법

(1) 각각의 Stock solution은 <표 5>에 제시된 방법에 따라 제조한

후 고압증기멸균기를 이용하여 121 ℃, 15분간 멸균한다.

(2) 조류 배양액은 <표 5>에 제시된 제조 방법에 따라 부피플라스크

(1 L 용량)에 각각의 Stock solution 첨가량을 넣고 증류수로 전량이

1 L 가 되도록 하여 사용한다(Stock solution은 밀봉 후 4 ℃에서 한

달간 보관 가능).

(3) FeSO4·7H2O 경우 침전물이 생기므로 사용 전 흔들어 사용하며,

각각의 Stock solution은 섞이지 않도록 주의해야 한다.

10) Source : National Bioresource Project, Algae Resource Database, http://www.shige.nig.ac.jp/algae

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(4) 제조된 배양액은 삼각 플라스크에 옮긴 후 121 ℃, 15 분간 멸

균한다. 이 때 배양액을 삼각플라스크 목 부분까지 너무 과하게 채

우면 멸균 시 호일이 벗겨질 수 있으므로 삼각플라스크의 2/3 ~ 1/2

만 채우도록 한다. 조제한 배양액은 하루 냉장 또는 상온에서 완전

히 식힌 후 조류를 적당량 접종한다.

최초 배양에 사용되는 녹조류는 한국생명공학연구원에서 분양(유상) 받거나 상용화된 물벼룩 먹이용 녹조류를 구매하여 사용할 수 있음

(5) 조류는 25 ℃ 명 조건 인큐베이터(8,000 Lux 이상)에서 필터 처

리한 공기로 폭기하면서 5∼6일 정도 배양한다.

(6) 배양된 조류를 현미경으로 검경하여 과다 응집된 경우 폭기를

강하게 하거나 교반강도를 130∼150 rpm 정도로 한다. 이 때 증발

로 인한 배양액 손실이 발생 할 수 있으므로, 수시로 확인하여 손실

량 만큼 배양액을 보충하여야 한다.

(7) 배양이 종료된 조류는 4 ℃에서 3∼4일간 침전시킨 후 상층액은

2/3 정도 버린 후 현미경으로 조류세포농도와 배양상태(응집 여부)

를 확인 후 사용한다(먹이로 사용되는 조류세포농도는 3.0∼3.5

×106∼8 cells/mL 가 적당함).

조류 배양시 외부공기를 통한 오염(곰팡이, 박테리아 등)이 빈번하기 때문에 오염여부를 확인하여야 한다.

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<표 5> 조류배양액 제조방법

구분

시약명

Stock solution11) 제조 조류 배양액 제조

첨가량(g)증류수 (mL)

증류수 1 L 당 첨가되는 Stock solution 량(mL)

1 NaNO3 25 500 5

2 CaCl2⁃2H2O 2.5 500 5

3 MgSO4⁃7H2O 7.5 500 5

4 K2HPO4 7.5 500 5

5 KH2PO4 17.5 500 5

6 NaCl 2.5 500 5

7 Na2EDTA+KOH 5+3.1 100 1

8 FeSO4⁃7H2O 0.5 100 1

9 H3BO3 1.14 100 1

10

ZnSO4⁃7H2O 0.88

100 1

MnCl2⁃4H2O 0.144

MoO3 0.072

CuSO4⁃5H2O 0.158

Co(NO3)2⁃6H2O 0.078

4. YCT (Yeast, Chlorophyll, Trout chow) 제조 방법

YCT는 Yeast, Chlorophyll, Trout chow를 아래의 (1)~(3)까지의 과정

을 통해 제조 후 혼합하여 사용한다. 필요 시 바로 제조하여 사용하

며, 제조된 YCT는 1달간 냉동보관 가능하다. 냉동된 YCT는 사용 1

시간 전에 해동하고, 해동된 시점부터 일주일간만 사용한다.

(1) Trout chow나 Flake food의 발효액 제조

Trout chow나 Flake food 5 g을 초순수 1 L에 넣어 분쇄기로 잘 섞

는다. 잘 섞어진 혼합액은 2 L 분별깔때기에 부어 통과시킨 후(상등

11) Stock solution은 밀봉 후 4 ℃에서 한달간 보관 가능

- 25 -

액 배제) 혼합액을 실온에서 일주일간 폭기(용기 바닥에서) 한다. 발

효 과정에서 증발로 인해 생길 수 있는 초순수의 손실은 발효가 완

료될 때까지 계속하여 채워줘야 한다. 이 과정은 일주일이 소요되

며, 악취를 발생시킬 수 있으므로, 흄(Fume) 후드, 환기 가능한 곳,

격리 등이 필요할 수 있다. 발효가 완료되면, 냉장 보관하여 최소 1

시간 침전시키고, 상등액을 여과(구멍 직경이 110 ㎛ 정도인 거름망

을 이용) 하여 최종 액량을 100 mL로 하고 사용 전까지 냉동한다.

(2) Yeast 혼합액 제조

활성 건조 효모 5 g을 초순수 1 L에 넣는다. 활성 건조 효모가 잘

풀어지도록 교반기에서 마그네틱 바를 이용하여 교반하거나, 손으로

세차게 흔들거나, 믹서기로 약하게 혼합하여 100 mL로 만든다. (1)

과정을 통해 제조된 Trout chow 나 Flake food의 발효액 100 mL

와 혼합한다(혼합 후 남는 여액은 폐기한다).

(3) Chlorophyll 혼합액 제조(건조, 입상, 곡물 잎)

건조하여, 입상으로 만든 알파파 잎 5 g을 초순수 1 L에 넣는다. 분

쇄기로 5분간 강하게 섞거나, 교반기에서 마그네틱 바로 24시간 교

반(중간속도)하여 준다. 분쇄기를 이용하여 교반 후 부유물질이 생

겼을 경우, 냉장고에서 2 ~ 4시간 정치하여 침전시키고, 침전이 완

료된 액의 상등액을 취하여 100 mL로 한다.

YCT ((1) + (2) + (3) 혼합) 은 약 300 mL가 되도록 하고, 50 mL ~ 100 mL의 밀봉이 가능한 (예:screw-cap) 플라스틱 용기에 나누어 담아 냉동한다. 제조된 YCT의 고형물 함량은 약 1.7 ~ 1.9 solids/L가 적당하다.

- 26 -

Ⅳ. 생태독성 시험과정

1. 생태독성 분석 흐름도

<그림 11> 생태독성 분석 흐름도.

2. 시험방법

(1) 시료 원수를 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %로 단계적으로

희석하고 각 농도군 당 4개의 반복구를 둔다.

(2) 각 농도군 및 반복구별로 시험용 물벼룩을 5마리씩 투입 하고

온도 20 ± 2 ℃, 명암 주기는 16 : 8로 하여 24시간 동안 노출시킨

다.

- 27 -

물벼룩

5마리

씩

투입

è

(1) (2)

<그림 12> 시료의 희석 및 반복구.

(3) 24시간 후 각 농도군 당 물벼룩의 치사 및 유영저해 개체수를

확인한다. <그림 13>에서 보면, 각 농도군 당 물벼룩의 치사 및 유

영저해 개체수는 100 %에서 20마리, 50 %에서 17마리, 25 %에서

10마리, 12.5 %에서 5마리, 6.25 %에서 2 마리, 대조군에서 0마리가

된다.

(4) 각 농도군 당 물벼룩의 치사 및 유영저해 개체수를 바탕으로

Probit, TSK(Trimmed Spearman Karber) 등 통계프로그램이나 산출

식을 이용하여 EC50(%)를 산출한다. 위 그림에서 EC50(%)는 25가 되

며, 생태독성값(TU : Toxic Unit)은 4가 된다. (TU = 100/EC50)

- 28 -

è

(3) (4)

<그림 13> 분석 결과 및 EC50 산정방법 (예시).

(5) 사용된 물벼룩은 망으로 걸러서 살아있는 상태로 하수구에 유입

되지 않도록 주의해야 한다.

3. 생태독성에 영향을 미치는 요인

(1) 부유물질

부유물질은 입경 2 mm 이하의 물에 용해되지 않는 물질로 시료 내

에 다량의 부유물질이 포함되어 있는 경우 생태독성실험 시 물벼룩

(Daphnia magna) 유영저해 및 치사여부에 대한 관찰이 어려울 수

있다.

(2) 시료 보관방법

시료의 보관 및 취급하는 방법에 따라 생태독성 분석결과는 큰 영

향을 미치는데 일반적으로 시료 내 함유되어 있는 독성은 생분해,

가수분해, 흡착 등과 같은 방법으로 저장기간이 길어질수록 감소한

다. 이를 최소화하기 위해 US EPA Guideline에서는 실험 시작 뿐

아니라 보관과 수송 시 냉장보관토록 하고 있다.

- 29 -

(3) 시험생물종의 먹이

시험생물종이 영양소 품질과 먹이 크기(조류 등)가 일정하지 않은

조건에서 배양되어 왔다면 시료를 동일한 조건에서 분석한다 하더

라도 생태독성 분석결과가 달리 나올 수 있다. EPA Guideline에서는

부화 24 시간 미만의 바다 새우 유충을 대상으로 실험을 수행 하는

경우 먹이의 품질과 먹이 크기를 유지하여 유충에게 공급하도록 제

시하고 있다.

먹이의 제조, 구입 등으로 기존 공급하던 먹이와 다른 먹이를 공급

할 때는 먹이의 불량 및 오염 등으로 물벼룩이 영향을 받지 않도록

일부 물벼룩으로 사전 점검(약 2일간 사전 먹이 주입)을 한 이후 전

체 물벼룩에 먹이를 공급하도록 한다. 이는 먹이의 불량 등으로 인

한 물벼룩의 영향을 미리 방지하기 위함이다.

(4) 희석수의 조성

희석수의 조성(경도, 염도, 전도도, 탁도, DO, pH 등)이 부적절한 경

우 방류수에 포함되어 있는 독성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 희

석수 조제 시 주기적인 성분 분석을 통해 일정한 희석수 조성을 유

지 하여야 한다.

(5) 시험생물종의 이력

시험생물종의 건강성을 평가하기 위해 시험생물종의 수집, 배양, 환

경순화, 실험실에서의 취급 등에 대한 숙지가 필요하다. 실험에 사

용되는 물벼룩은「국립환경과학원」에서 분양받은 생물종으로만 분

석을 실시하여야 하며, 분양 후 순화과정으로 2세대 이후의 물벼

룩12)으로 분석을 실시하여야 한다.

4. 실험시 주요 참고사항

아래 내용은 물벼룩 독성실험 시 일어날 수 있는 상황에 대한 대처

방안 혹은 기본 지식에 대하여 서술한 것이다.

12) 분양받은 물벼룩이 새끼를 낳고, 그 새끼가 어미가 되어 다시 새끼를 낳은 물벼룩

- 30 -

(1) 실험전 먹이(조류 및 YCT)를 충분히 준 후 실험을 수행한다.

(2) 기생충이 발생하였을 때, 이 경우 성체의 생존율, 어린 개체 생

산율을 크게 저하 시키고 다른 개체로의 전염을 발생할 수 있으므

로, 배양용기 내의 모든 개체는 폐기한다.

(3) 계대 및 군집배양에서 물벼룩 이송에 사용되는 스포이드는 정해

진 그룹별로 다른 것을 사용하여야 교차 오염을 방지 할 수 있다.

(4) 방류수에는 물벼룩의 영양공급원인 미네랄과 입자들이 존재하기

때문에 방류수에서 대조군보다 성장이 좋은 경우가 발생할 수 있다.

(5) 방류수와 희석수의 경도 차이 및 부유/용존입자 차이에 의해 독

성물질의 존재 형태 및 분포가 변화하여 독성이 50%에서 높게 나타

나는 경우도 있다.

(6) 태어난 지 7일 이내의 물벼룩은 군집 배양이 성장에 효과적이

나, 성체들을 높은 밀도로 군집 배양하는 경우 스트레스에 의해 성

장 둔화 및 새끼의 수가 감소한다.

(7) Yeast는 건조 효모(dried yeast), 활성 건조 효모(active dried

yeast), 추출 효모(yeast extracted)가 있는데 이들 중 활성 건조 효

모(active dried yeast)를 사용해야 한다.

(8) 초순수 제조기의 염소 소독 후에는 초순수 제조기 내의 잔류염

소가 모두 제거된 이후 배양액 제조에 사용한다(증류수내 잔류염소

측정).

(9) 시료는 시험 전 실험온도(20 ± 2 ℃)에 맞춰줘야 한다.

(10) 배양액을 폭기 후 물벼룩 배양에 바로 사용할 경우 과포화된

용존산소로 인하여 물벼룩의 몸에 미세기포가 부착되어 물벼룩의

활동성에 영향을 줄 수 있으므로 배양액은 제조 후 24 시간이 지난

이후에 사용한다.

- 31 -

Ⅴ. 결과의 통계처리

물벼룩을 이용한 독성시험 결과는 통계학적 분석방법을 이용하여

EC50 를 구하고 이를 다시 독성값(TU)로 나타낸다. 따라서 EC50값을

산출하는데 사용된 통계 프로그램도 최종결과와 함께 표기한다. US

EPA에서는 이러한 통계학적 분석방법으로 Probit method, Trimmed

Spearman Karber(TSK) Method, Graphical Method 등을 제시하고 있

다. 아래 표는 각각의 통계 기법에 대한 특징을 나타낸 것이다.

<표 6> US EPA 통계분석방법

방 법 특 징

Probit Method- LC50에 대한 95% 신뢰도 구간을 한정하여 준다.

- 통계학적 추정 방법을 통해 LC50을 산정한다.

Trimmed Spearman Karber (TSK) Method

- LC50에 대한 95% 신뢰도 구간을 한정하여 준다.

- Probit Method를 적용할 수 없는 결과에도 이용할 수 있다.

Graphical Method

- 치사농도 대 방류수 농도(%)를 그림으로 확인한다.

- LC50에 대한 신뢰도 한계를 알 수 없다.

- 0% 와 100% 치사 및 유영저해 데이터만 존재할 경우 적용한다.

1. Probit Method

Probit method는 0 %, 100 % 치사 및 유영저해 데이터와 1 % ~ 99 %

치사 및 유영저해 데이터가 2개 이상 존재할 경우 적용한다. 단,

Probit을 이용한 결과 산출 시 <그림 14>와 같이 Chi-square test를

만족하지 못할 경우, 경고 문구가 나오게 되고 95 % 신뢰구간이 산

정되지 않는다. 따라서 이 경우에는 Trimmed Spearman- Karber(TSK)

Method를 이용하여 결과를 산출한다.

- 32 -

<그림 14> Chi-square test 불만족 시 경고 문구.

<표 7> Probit 적용 가능 사례

시료농도(%)

노출 개체수

치사 및 유영저해 개체수

치사율(%)

비 고

6.25 20 0 0 0 % 치사 및 유영저해 데이타

12.5 20 0 0 0 % 치사율 데이타

25 20 2 10 1 ~ 99 % 치사 및 유영저해 데이터

50 20 7 35 1 ~ 99 % 치사 및 유영저해 데이터

100 20 20 100 100 % 치사율 데이타

2. Trimmed Spearman Karber(TSK) Method

TSK는 0 % 과 100 % 치사율 자료를 제외한 1 ~ 99 % 치사율 데이

터가 1개 이하일 때 사용한다. 즉, 100 % 치사율 데이터, 0 % 치사

- 33 -

율 데이터와 부분치사율 데이터가 1개 이상 있을 때 사용한다.

<표 8> TSK 적용 가능 사례

시료농도(%)

노출 개체수

유영저해 및 치사 개체수

치사율(%)

비 고

6.25 20 0 0 0 % 치사율 데이타

12.5 20 0 0 0 % 치사율 데이타

25 20 0 0 0 % 치사율 데이타

50 20 7 35 1~99 % 부분치사율 데이터

100 20 20 100 100 % 치사율 데이타

3. Graphical Method

Graphical method는 시험결과가 0 %, 100 % 치사 및 유영저해 데이

터만 존재할 경우 적용하며, 이 방법은 95% 신뢰구간이 산정되지

않는다. Graphical method는 <그림 15>과 같이 X축을 치사 및 유영

저해율(%) Y축을 Log10(시료희석율)으로 하여 시험 결과를 plotting

하고 50% 치사 및 유영저해율에 대응하는 Y값을 구한다. 최종적인

EC50은 Y값의 Log10을 소거하여 산출하며 <그림 15>에서 산출된

EC50값은 70.79%가 된다.

<표 9> Graphical method 적용 가능 사례

시료농도(%)

노출 개체수

유영저해 및 치사 개체수

치사율(%)

비 고

6.25 20 0 0 0 % 치사율 데이타

12.5 20 0 0 0 % 치사율 데이타

25 20 0 0 0 % 치사율 데이타

50 20 0 0 0 % 치사율 데이타

100 20 20 100 100 % 치사율 데이타

- 34 -

<그림 15> Graphical method를 이용한 결과산출 예시.

4. 계산식에 의한 결과산출

(1) 원수 100 %에서 노출시킨 물벼룩의 치사 및 유영저해율이 11 %

~ 49 % 이며, 그 외 농도군에서는 치사 및 유영저해율이 나타나지

않았을 경우, 아래의 수식을 이용하여 생태독성값(TU : Toxic Unit)

을 산출한다.

계산식 : 0.02 × (치사 및 유영저해율)

(예시) 원수 100 % 에 노출 시킨 물벼룩 20 마리 중 5 마리가 치

사 및 유영저해를 나타냈으며, 그 외 농도군에서는 치사 및 유영

저해가 나타나지 않았을 경우; → 0.02 × 25 = TU 0.5

(2) 원수 100 %에서 노출 시킨 물벼룩의 치사 및 유영 저해율이 0

- 35 -

% ~ 10 % 이며, 그 외 농도군에서는 치사 및 유영 저해율이 나타나

지 않았을 경우, TU = 0 으로 표기한다.

(예시) 원수 100 % 에서만 노출 시킨 물벼룩 20마리 중 0 ~ 2마

리가 치사 및 유영저해를 나타냈으며, 그 외 농도군에서는 치사

및 유영저해가 나타나지 않았을 경우; → TU 0

(3) 원수 100% 에서 노출시킨 물벼룩의 치사 및 유영 저해율이 50

% 이며, 그 외 농도군에서 치사 및 유영 저해율이 나타나지 않았을

경우, TU = 1로 표기한다.

(예시) 원수 100 % 에 노출 시킨 물벼룩 20마리 중 10마리가 치

사 및 유영저해를 나타냈으며, 그 외 농도군에서는 치사 및 유영

저해가 나타나지 않았을 경우; → TU 1

※ EC50(Effective Concentration of 50 %)의 정의는 시료에 노출시

킨 시험생물종의 반수가 영향을 받는 농도이며, 생태독성값은

100에서 EC50을 나눈 값을 말한다. 따라서 이와 같은 경우

EC50(%)은 100 % 가 되며, TU = 100/100으로 1이 된다.

※ 비슷한 경우로 원수 100 %에 노출시킨 물벼룩이 모두 치사 및

유영저해를 나타내고, 원수 50 %에 노출시킨 물벼룩의 치사 및

유영저해율이 50 % 인 경우에는 EC50(%)은 50 %가 되며 TU는 2

가 된다.

(4) 원수 100 % ~ 12.5 % 에 노출 시킨 물벼룩의 치사 및 유영저해

율이 100 % 이며, 6.25 % 에서 물벼룩의 51% 이상이 치사 및 유영

저해를 나타낼 경우에는 TU > 16 으로 표기한다.

(예시) 원수 100 % ~ 12.5 % 에 노출 시킨 물벼룩 각 20마리가

모두 치사 및 유영저해를 나타냈으며, 6.25 % 에서는 물벼룩 20

마리 중 11마리 이상이 치사 및 유영저해를 나타낸 경우 ;

→ TU > 16

- 36 -

※ 위 예시에서 정확한 생태독성값을 산출을 원할 경우, 원수를 적

당량 희석하여 재시험하고 이를 통해 산출된 생태독성값에 희석

률을 곱하여 최종적인 생태독성값을 산출한다.

※ 수질오염공정시험기준에서 생태독성 시료의 최대보관시간은 시료

성상의 변화를 고려하여 36 시간 이내로 규정하고 있으므로, 재

시험 시 시료의 최대보관시간을 고려해야 한다.

(5) 원수 100 %에서 노출시킨 물벼룩의 치사 및 유영저해율이 51 ~

99 % 이며, 그 외 농도군에서는 치사 및 유영저해가 나타나지 않은

경우 1 < TU < 2 로 표기한다.

(예시) 원수 100 % ~ 12.5 % 에 노출 시킨 물벼룩 각 20마리 중

11마리 ~ 19마리 치사 및 유영저해를 나타냈으며, 그 외 농도군

에서는 치사 및 유영저해를 나타내지 않았을 경우 ;

→ 1 > TU > 2

※ 위 예시에서 정확한 생태독성값 산출을 원할 경우, 원수 100 %와

원수 50 % 사이에 농도군을 추가하여(예: 75 %) 재시험하면 된다.

이 경우에도 재시험 시 시료의 최대보관시간을 고려해야 한다.

- 37 -

Ⅵ. 내부정도관리

1. 표준독성시험

표준독성시험은 독성물질에 대한 물벼룩의 민감도와 시험결과의 신

뢰성을 확인하기 위해 월 1회 시행한다. 표준독성시험에 사용되는

표준독성물질은 다이크롬산포타슘(K2Cr2O7, 분자량 : 294.18)으로 하

며, 표준독성시험은 아래와 같은 절차로 수행한다.

(1) 표준독성물질 조제

다이크롬산포타슘 4 g을 정확히 달아 1 L 부피플라스크에 넣고 증

류수로 표선까지 정확히 채운 후 Stock solution으로 사용한다.

(2) 표준시료 조제

Stock solution 4 mL를 정확히 취하여 1 L 부피플라스크에 넣고 배

양액으로 표선까지 정확히 채워 원수 100 % 시료(다이크롬산포타슘

농도 4 mg/L)로 한다.

표준독성시험 시 원수 100 % 시료의 제조 농도는 내부정도관리를 만족하기 위한 다이크롬산포타슘 EC50 정상범위인 0.9 mg/L ~ 2.1 mg/L 와 실험자의 편의를 고려하여 원수 100 % 시료의 농도를 2 mg/L ~ 5 mg/L가 되도록 제조하고 사용한다.

(3) 생태독성 실험

원수 100 % 시료를 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %로 단계적으로 희석

하고 각 농도군 당 4개의 반복구를 두고 물벼룩 5마리씩을 넣어 노

출시킨다.

(4) 결과 확인

24시간 경과 후 물벼룩 치사 및 유영저해를 확인하여 EC50 (mg/L)을

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산출하며, 내부정도관리 만족을 위한 EC50 정상범위는 0.9 mg/L ~

2.1 mg/L 이다.

<그림 16>와 같이 내부정도관리 차트를 작성하여 월별 내부정도관

리 만족여부를 확인한다.

최종 결과에서 EC50 이 정상범위를 벗어나는 경우, 배양액 조성, 배양온도, 먹이 상태, 먹이공급량, 외부 오염원의 유입 여부, 시험자의 숙련도 등을 점검해야 한다.

<그림 16> 내부정도관리 차트(Control chart) 작성 예시.

2. 생태독성 숙련도시험 세부지침13)

2014년도 생태독성분야 숙련도 시험은 미지시료 4개 항목을 대상으

13) 매년 변동될 수 있으며 본 지침은 2014년 기준임

- 39 -

로 하며, 평가방법 및 기준은「환경시험·검사기관 정도관리 운영

등에 관한 규정」(별표 11의 2)를 참조한다.

가. 시료의 수령 확인

(1) 미지시료는 수령 즉시 내용물의 수량, 종류와 파손 여부를 확인

한다.

(2) 환경시험검사 종합운영시스템(http://qaqc.nier.go.kr)에 접속하여

배포된 시료의 바코드 번호와 수령한 바코드 번호가 일치하는지 확

인한 후 [수령확인]을 클릭한다.

(3) 수령한 시료에 이상(파손, 이물질 혼입 등)이 있을 경우 즉시 국

립환경과학원에 연락하여 조치를 받도록 한다.

나. 시료의 보관

미지시료는 가능한 한 신속히 실험하여야 하며, 즉시 실험하지 못할

경우에는 4 ℃ 이하의 어두운 곳에 보관하여야 한다. 단, 시료를 개

봉한 상태에서는 변질의 우려가 있으니 즉시 분석하여야 한다.

다. 분석항목

분석항목14) 시료 조제 비 고

미지시료 A 배양액으로 200배 희석 후 실험

갈색 앰플 22 mL미지시료 B

미지시료 C 미지시료 전량을 배양액에 녹여 500 mL로 만들어 사용

스크루 캡 갈색 바이알 5 mL 미지시료 D

14) 4개 항목을 예비항목으로 실시함(기관평가에 반영되지 않음)

- 40 -

라. 시료 앰플 개봉 방법

(1) 시료 앰플 개봉 시 손이 다칠 우려가 있으니 주의 한다.

(2) 장갑을 끼고 가능하면 유리 자르는 도구(예:GC 컬럼커터)를 사

용하여 앰플 목 부분에 흠집을 낸 다음 흠집의 반대방향으로 가볍

게 힘을 주어 자른다.

마. 분석용 시료의 조제

(1) 미지시료 A 및 B 조제

1 L 부피 플라스크(volumetric flask)에 배양액 약 500 mL을 채운다.

미지시료 A 앰플을‘라’방법에 따라 개봉한다. 앰플 내 미지시료

를 정확히 5 mL 취하여 1 L 부피 플라스크(volumetric flask)에 가

한 다음 배양액으로 표선까지 채운 다음 잘 흔들어 완전히 혼합한

용액이 원수(100%)가 된다.

(2) 미지시료 C 및 D 조제

500 mL 부피 플라스크(volumetric flask)에 배양액 약 250 mL를 채

운다. 미지시료 C가 들어 있는 스크루 캡 바이알의 마개를 열고 깔

때기를 사용하여 조심스럽게 미지시료 C 전량을 500 mL 부피 플라

스크에 옮긴다. 스크루 캡 바이알에 남아 있는 시료를 배양액으로

2～3번 씻어 그 액을 500 mL 부피 플라스크에 가한다. 500 mL 부

피 플라스크에 배양액을 표선 까지 채운 다음 완전히 녹을 때까지

충분히 혼합한 용액이 원수(100%)가 된다. 미지시료 D의 조제는 미

지시료 C 조제와 동일한 방법을 따른다.

(3) 주요 숙지사항

미지시료 조제는 반드시 수질오염공정시험기준 ES 04704.1 “물벼

룩을 이용한 급성 독성 시험법”에 제시된 배양액을 사용하며, 녹인

즉시 실험을 수행하도록 한다. 단, 즉시 실험 하지 못하고 냉장보관

을 하게 될 경우, 제조된 미지시료의 온도를 20±2℃로 맞춘 후 실

험을 수행하며, 36시간을 초과해서는 안된다.

- 41 -

바. 분석 방법

모든 시료는 수질오염공정시험기준 ES 04704.1 “물벼룩을 이용한

급성 독성 시험법”에 따라 실험한다.

사. 분석결과 판정(치사 및 유영저해)

(1) 치사

물벼룩을 현미경으로 관찰 시 촉각, 복부다리, 심장의 활동이나 움

직임이 명백하게 없는 상태를 말한다.

(2) 유영저해

시험용기를 살며시 움직여주고, 물벼룩을 15초 동안 관찰했을 때 어

떠한 움직임도 없을 경우를‘유영저해’로 판정한다. 이때, 촉수를

움직인다하더라도 유영을 하지 못한다면‘유영저해’로 판정한다.

아. 분석결과 산출 방법(“Ⅴ. 결과의 통계처리” 참조)

(1) Probit Method

Probit 은 0% 과 100% 치사율 데이타를 제외한 1 ~ 99% 치사율 데

이터가 2개 이상 존재해야 한다. 즉, 100% 치사율 데이터, 0% 치사

율 데이터와 부분적으로 치사한 데이터가 2개 이상 있을 때 Probit

을 사용가능한다.

(2) Trimmed Spearman Karber(TSK) Method

TSK는 0% 과 100% 치사율 자료를 제외한 1 ~ 99% 치사율 데이터

가 1개 이하일 때 사용한다. 즉, 100% 치사율 데이터, 0% 치사율

데이터와 부분적으로 치사한 데이터가 1개 이하 있을 때 TSK 방법

을 사용한다.

(3) Graphical Method

Graphical method는 시험결과가 0%와 100% 치사율 데이터만 존재

할 경우 적용하며 95% 신뢰구간은 산정되지 않는다.

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자. 분석결과의 입력

(1) 시료의 분석결과는 환경측정분석 종합운영시스템(http://qaqc.nie

r.go.kr)에 접속하여 정확히 계산된 생태독성값(TU)을 입력한다.

(2) 생태독성값(TU)은 소수점 첫째자리(표시자리의 그 아래 자리에

서 반올림)까지 입력한다.

(3) 숙련도시험 분석결과는 반드시 근거가 되는 분석 원자료(결과기

록부)를 3년간 보관하여야 한다. 현장평가시 원자료가 보관되어 있지

않거나, 제출한 분석결과와 원자료가 일치하지 않을 경우 숙련도 시

험의 부정행위로 간주되니 주의하여야 한다.

차. 분석결과의 제출

(1) 정도관리 대상기관은 정해진 기간 내에 인력․장비 정보 및 측정

결과를 환경측정분석 종합운영시스템(http://qaqc.nier.go.kr)에 입력

하여야 결과가 접수된다. 미지시료 A, B, C, D의 결과값(TU)은 기일

내에 반드시 시스템에 입력해야 한다.

(2) 생태독성 시험결과에 대한 근거자료는 기일 내에 (붙임 양식)에

따라 작성하여 숙련도시험 담당자 이메일로 제출하여야 한다.

※ 정도관리 현장평가시 점검표 및 평가하는 내용은 부록 참고

- 43 -

시험일자

시험시작 시각

시험종료 시각

시험자 성명

결과(TU)

반복구

시험농도

치사 및 유영저해 개체수

특이사항

1 2 3 4

Control

6.25%

12.5%

25%

50%

100%

붙임 생태독성 시험결과 근거자료

○ 미지시료 ( ... )

- 44 -

Ⅶ. 참고문헌

1. 국립환경과학원. 2012, 산업폐수 “염” 독성관리방안 및 공공처리

시설 “염” 고시 적용방안 연구

2. 국립환경과학원. 2011, 생태독성 통합관리제도 조기 정착을 위한 과

학적 기반 구축(IV)

3. 국립환경과학원. 2010, 산업폐수 방류수 평가를 위한 물벼룩을 이용

한 급성독성 시험에 관한 실험서

4. 국립환경과학원. 2013. 생태독성 분석기관 기술교육 자료집.

5. 국립환경과학원. 2014. 정도관리 현장평가내용 해설. p174-181

6. Canada. EC, 2000, Biological Test Method : Reference Method for

Determining Acute Lethality of Effluents to Daphnia magna

7. National Center for Biotechnology Information(US). 2005, Some

Parasites of Daphnia

8. OECD. 2004, Daphnia sp., Acute Immobilisation Test

9. US. EPA, 2002, Methods for Measuring the Acute Toxicity of

Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine

Organisms Fifth Edition

10. UK. EA, 2007, The Direct Toxicity Assessment of Aqueous

Environmental Samples Using the Juvenile Daphnia magna

Immobilisation Test

11. National Bioresource Project, Algae Resource Database,

http://www.shige.nig.ac.jp/algae

12. Marinco Bioassay Laboratory website, http://mblaquaculture.com

부 록

A. 생태독성 측정결과 통계프로그램 이용방법 해설

B. 생태독성분야 정도관리 현장평가 관련

- 환경시험·검사기관 정도관리 운영 등에 관한 규정

(별지 제8호) 서식

- 정도관리 현장평가내용 해설

C. 관련 서식

- 생태독성 실험일지(예시)

- 물벼룩 분양신청서

D. 폐수종말처리시설의 방류수 수질기준 (수질 및 수생태

보전에 관한 법률 시행규칙 제26조 [별표 10] )

E. 수질오염물질의 배출허용기준 (수질 및 수생태 보전에

관한 법률 시행규칙 제34조 [별표 13] )

F. 공공하수처리시설의 방류수 수질기준 (하수도법 시행규

칙 제3조 제1항 제1호 [별표 1] )

- 46 -

A. 생태독성 측정결과 통계프로그램 이용방법 해설

1. Probit Method

①

②

- 47 -

③

④

- 48 -

⑤

⑥

- 49 -

⑦

⑧

- 50 -

⑨

⑩

- 51 -

2. Trimmed Spearman Karber(TSK) Method

①

②

- 52 -

③

④

- 53 -

3. Graphical Method를 이용한 EC50 산출방법 (Excel 이용)

①

②

- 54 -

③

④

- 55 -

□ 점검표 번호 : 수질-8(생태독성 : 급성 독성)

평 가 내 용

평가기준 평가결과

적합

부적합

해당사항없음※

평점

1. 시료채취

1-1. 시료채취 장비 및 물품 보유여부

1-1-1. 시료채취 장비 및 물품 보유(관리대장 또는 구매대장 확인)

1 0

1-1-2. 시료채취 용기의 적합성 (수질오염공정시험기준 ES04130.1 참고)

1 0

1-2. 조사 목적에 적합한 지점 및 위치 선정의 정확성

1-2-1. 산업폐수, 하수, 하천수 등 수질공정시험기준에 안내된 용수로 Grab 채수 여부

1 0

1-2-2. 하수 및 폐수의 시료 채취 지점의 적합성 1 0

1-3. 시료 운송방법과 보관의 적절성

1-3-1. 시료 운송의 적절성 (4 ℃이하에서 냉장 보관하여 운송)

1 0

1-3-2. 시료별 운반 시간 준수 (24시간 이내 도착) 1 0

1-3-3. 저온 냉장 보관 1 0

1-4. 시료채취와 함께 측정하여야 하는 항목의 측정 (채취시간, 수온, pH, DO, 전기전도도, 염분, 잔류염소, 암모니아, 경도 등의 기록 여부)

2 0

2. 물벼룩 배양

2-1. 국립환경과학원에서 분양 받은 물벼룩을 배양하고 있는지에 대한 여부 (분양확인증, 분양 요청 공문 등 확인)

2 0

2-2. 배양액의 적절성

B. 생태독성분야 정도관리 현장평가 관련 내용 (「환경시험·검사기관 정도관리 운영 등에 관한 규정」 별지 제8호 서식 및 현장평가내용 해설)

1. 정도관리 현장평가시 점검표

- 56 -

□ 점검표 번호 : 수질-8(생태독성 : 급성 독성)

평 가 내 용

평가기준 평가결과

적합

부적합

해당사항없음※

평점

2-2-1. 정제수 제조장치 관리의 적절성 (정제수 관리를 위한 필터의 주기적 교체에 대한 기록 등)

1 0

2-2-2. 배양액 제조에 필요한 시약 보유 및 보관의 적절성 1 0

2-2-3. 수질오염공정시험기준에 따른 제조 방법 적용 여부 1 0

2-2-4. 제조된 배양액 조성의 적절성 (제조된 배양액 조성(pH 7.6 ~ 8.0, 경도 160 ~ 180 mg CaCO3/L, 알카리도 110 ~ 120 mg CaCO3/L, 용존산소 3.0 mg/L 이상)에 대한 주기적인 확인 여부)

1 0

2-3. 먹이 공급의 적합성 (Chlorella sp., Pseudochirknella subcapitata 등과 같은 단세포 녹조류(3.0 ~ 3.5 × 107 cells/ml) 및 YCT(yeast, chlorophyll, trout chow) 사용 여부)

2 0

2-4. 배양하고 있는 물벼룩의 건강상태 (내구란, 수컷, 유영저해, 치사 발생 여부)

2 0

2-5. 실험실 청결 상태 및 오염 예방에 대한 적절한 대처 1 0

3. 장비 및 물품의 관리

3-1. 정제수 제조장치 보유여부 1 0

3-2. 항온장치(인큐베이터, 항온수조 등) 보유여부 1 0

3-3. 항온장치의 올바른 작동 여부 (온도(20±2℃), 조도(500~1,000 Lux), 조명(명:암=16:8))

1 0

3-4. 시험 및 배양에 사용되는 기기 및 기구 보유여부 (배양용기, 시험용기, 스포이드 등의 보유)

1 0

3-5. 저울의 안정성 확인

3-5-1. 저울의 수평 여부 1 0

3-5-2. 저울 내부의 흡습제 비치 여부 1 0

3-5-3. 저울 설치장소의 적절성 (평편하고 흔들림이 없는 곳) 1 0

3-5-4. 저울 내․외부의 청결 상태 유지 1 0

- 57 -

□ 점검표 번호 : 수질-8(생태독성 : 급성 독성)

평 가 내 용

평가기준 평가결과

적합

부적합

해당사항없음※

평점

4. 시험방법

4-1. 시료 보존 기간 내 시험 실시 여부 (시료 채취 후 36시간 내 시험 실시 여부)

2 0

4-2. 시험에 사용되는 물벼룩의 적절성 (2회 이상 계대배양이 이뤄진 어미개체에서 생산된 24시간 미만의 어린 물벼룩을 시험에 사용하고 있는지에 대한 여부)

2 0

4-3. 적합한 희석수 사용 및 적절한 희석 배율 적용 여부 확인 (수질오염공정시험기준에 따른 희석수, 희석배율 적용 여부 확인)

2 0

4-4. 노출시간의 준수 (시료에 물벼룩을 노출하고 24시간 후 결과를 산출하고 있는가?)

2 0

4-5. 유영저해 및 치사 판단 숙지 정도 2 0

4-6. 시험방법에 따른 계산과정의 정확성 (수질오염공정시험기준에 따른 생태독성값 산출 여부)

2 0

4-7. 결과표현의 적절성 (적절한 단위 여부 등) 2 0

5. 정도관리(QA/QC)

5-1. 표준물질용액 제조방법 숙지 정도 (다이크롬산포타슘 을 이용하여 24시간-EC50값이 0.9~2.1 mg/L 범위가 되도록 제조하였는지에 대한 여부)

2 0

5-2. 내부정도관리의 적절성

5-2-1. 내부정도관리차트 작성 여부 (다이크롬산포타슘을 이용한 표준독성시험 월 1회 이상 실시 여부)

2 0

5-2-2. 24시간-EC50값 범위의 적절성(EC50 : 0.9 ~ 2.1 mg/L) 2 0

5-2-3. 24시간-EC50값이 정상범위를 벗어났을 경우 대처방법 숙지 정도

2 0

6. 기록 및 관리

6-1. 시료채취에 대한 기록 및 관리의 적절성 1 0

- 58 -

□ 점검표 번호 : 수질-8(생태독성 : 급성 독성)

평 가 내 용

평가기준 평가결과

적합

부적합

해당사항없음※

평점

6-2. 측정결과에 대한 원자료의 기록 및 관리의 적절성 1 0

6-3. 성적서의 기록 및 관리의 적절성 (담당자, 확인자의 서명 등)

1 0

6-4. 모든 기록에 대한 접근의 용이성 (과거 기록을 쉽게 찾아볼 수 있어야 함)

1 0

6-5. 모든 기록의 수정․변경에 대한 적절한 보안 조치 1 0

7. 실험실 폐액 처리

7-1. 실험실 폐액 처리의 적절성 1 0

7-2. 물벼룩의 적절한 폐기 조치 (시험에 사용된 물벼룩을 망 등을 이용하여 살아있는 상태로 하수구에 유입되지 않도록 하고 있는지에 대한 여부 )

1 0

<환산점수 계산>

- 평점총점 : 평점기준의 적합 점수 합계

- 평점제외 점수 : 해당사항 없는 항에 대한 평가기준의 적합 점수 합계

※ 해당사항이 없는 항은 그 항의 평가기준이 적합인 점수를 기록

- 평점 합 : 평가결과의 평점 합계

환산점수 평점합평점총점 평점제외 점수 ×

- 59 -

2. 생태독성분야 정도관리 현장평가 해설

< 시료채취 >

1-1. 시료채취 장비 및 물품 보유여부

1-1-1. 시료채취 장비 및 물품 보유

1-1-2. 시료채취 용기의 적합성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘1-1. 시료채취 장비 및 물품 보유여부’를 참조하라.

참고로, 물벼룩 급성독성시험을 위한 시료채취 용기는 물벼룩에 영향을 주지 않는 유리제품을 사용하도록 규정되어 있으나 외국에서는 플라스틱 제품의 사용도 가능한 것으로 규정되어 있다. 다만, 일부 폴리에틸렌 제품은 독성이 강하므로 주의를 요한다.

1-2. 조사 목적에 적합한 지점 및 위치 선정의 정확성

1-2-1. 산업폐수, 하수, 하천수 등 수질공정시험기준에 안내된 용수로

Grab 채수 여부

1-2-2. 하수 및 폐수의 시료 채취 지점의 적합성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘1-2. 조사목적에 적합한 지점 및 위치 선정의 정확성’을 참조하라

1-3. 시료 운송방법과 보관의 적절성

1-3-1. 시료 운송의 적절성

1-3-2. 시료별 운반 시간 준수

1-3-3. 저온 냉장 보관

- 60 -

해설

ES 04130.1에 따라 시료는 시험실에 도착할 때까지 조성의 변화가 일어나지 않도록 하여야 한다. 시료를 채취 후 즉시 시험할 수 없을 때는 따로 규정이 없는 한 4 ℃에서 운송 및 보존하되 최대 36시간을 초과하지 않아야 한다.

1-4. 시료채취와 함께 측정하여야 하는 항목의 측정

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘1-4. 시료채취와 함께 측정하여야 하는 항목의 측정’을 참조하라.

특히 시료채취 지점이 염소소독 이전인지 또는 이후인지를 명확히 기록하며, 현장 또는 시험실에서 염분 농도, 암모니아 농도 및 경도를 측정하여 기록한다.

< 물벼룩 배양 >

2-1. 국립환경과학원에서 분양 받은 물벼룩을 배양하고 있는지에 대한 여부

해설

물벼룩을 이용한 급성독성 시험에 사용되는 시험생물은 Daphnia magna이다.

생태독성시험에 주로 사용되는 시험용 물벼룩은 Daphnia magna와 Daphnia pulex로서, Daphnia pulex는 우리나라에서 서식하는 것으로 보고되고 있으며 크기는 약 3.5 mm정도 되며, Daphnia magna는 우리나라에 서식하지 않으며 보다 더 커서 5.6 mm ~ 6 mm에 달한다.

물벼룩은 국립환경과학원 등 시험생물을 제공하는 기관에서 제공받은 것이나 생물학적으로 Daphnia magna임이 확인된 것이면 문제되지 않는다.

2-2. 배양액의 적절성

2-2-1. 정제수 제조장치 관리의 적절성

2-2-2. 배양액 제조에 필요한 시약 보유 및 보관의 적절성

- 61 -

2-2-3. 수질오염공정시험기준에 따른 제조 방법 적용 여부

2-2-4. 제조된 배양액 조성의 적절성

해설

배양액 또는 희석수의 pH는 7.6 ∼ 8.0, 경도는 160 mg CaCO3/L∼180 mg CaCO3/L, 알카리도는 110 mg CaCO3/L∼120 mg CaCO3/L, 용존산소는 3.0 mg/L 이상 유지되도록 하며, 사용하기 전 24시간 정도 포기(aeration)시킨다.

해설물벼룩을 배양하기 위한 물은 오염되지 않은 것이면 어느 것이나 가능하나 시험에서는 동질의 시험생물을 계대 배양하여야 하므로 증류수에 필요한 시약을 첨가하여 배양액으로 사용한다.

ES 04704.1(물벼룩을 이용한 급성 독성 시험법)에 규정된 배양액은 EPA배양액(reconstituted hard water)과 동일한 조성을 하고 있다.

시약 첨가량(mg/L)염화칼륨(KCl) 8

황산마그네슘(MgSO4) 120황산칼슘 이수화물(CaSO4․2H2O) 120

탄산수소나트륨(NaHCO3) 192

2-3. 먹이 공급의 적합성

해설

ES 04704.1에 따르면 물벼룩의 먹이는 Chlorella sp., Pseudochirknella subcapitata 등과 같은 단세포 녹조류를 사용하고 보조먹이로 YCT(yeast, chlorophyll, trout chow)를 첨가하여 사용할 수 있다.

참고로, 보조먹이를 사용하는 것은 ES 04751.1에 따른 배양액에는 장기간 배양에서 부족할 수 있는 양이온, 음이온 등의 미량성분이 부족하기 때문이다.

그러므로 단일 먹이를 사용하는 경우는 장기간 배양에 문제가 발생할 수 있으나 배양액을 M4 배양액으로 대체하거나 단세포 녹조류를 배양할 때 비타민을 투입하면 장기간 배양에 문제가 거의 발생하지 않는다.

- 62 -

2-4. 배양하고 있는 물벼룩의 건강상태

해설

물벼룩의 건강을 온전히 확인하기는 어렵다. 다만, 배양용기 내에서 배양하고 있는 물벼룩의 10 % 이상이 죽는다면 어떤 문제가 있는 것으로 보며, 그 배양용기 내의 물벼룩은 일체 시험에 사용하지 않는다.

일반적으로 동일한 수온, 조도 및 동일한 배양액에 충분한 양의 먹이를 공급한다면 건강한 상태를 유지할 수 있다.

그러나 배양 중에 내구란(black egg)이 발생하거나 수컷이 보이면 배양용기 내에 너무 많은 물벼룩을 배양하고 있거나 먹이가 부족하거나 또는 배양온도가 저하된 것으로 판단할 수 있다.

2-5. 시험실 청결 상태 및 오염 예방에 대한 적절한 대처

해설물벼룩 급성 독성을 시험하기 위한 시료용기와 배양용기는 자주 사용하는 경우 내벽에 석회성분이 침적되므로 주기적으로 묽은 염산 용액에 담가 제거한 후 세척하여 사용하고,

농약, 휘발성 유기화합물, 기름 성분이 시험수에 포함된 경우에는 시험 후 시험용기 세척 시 ‘뜨거운 비눗물 세척-헹굼-아세톤 세척-헹굼’ 과정을 추가한다.

시험수의 유해성이 금속성분에 기인한다고 판단되는 경우, 시험 후 시험용기 세척 시 ‘묽은 염산(10 %) 세척 혹은 질산용액 세척-헹굼’ 과정을 추가한다.

< 장비 및 물품의 관리 >

3-1. 정제수 제조장치 보유여부

해설

물벼룩 배양액의 제조 및 시험용기의 세척을 위한 정제수 제조장치가 있어야 한다.

- 63 -

3-2. 항온장치(인큐베이터, 항온수조 등) 보유여부

해설

물벼룩의 배양 및 시험을 위하여 일정 온도로 유지할 수 있는 인큐베이터 또는 항온수조가 있어야 한다.

물벼룩 배양과 시험을 별도의 독립된 공간에서 항온항습기 등을 통하여 일정온도를 유지한 상태에서 진행한다면 인큐베이터나 항온수조가 없어도 된다.

3-3. 항온장치의 올바른 작동 여부

해설

물벼룩의 배양 및 시험을 인큐베이터에서 수행한다면 온도(20 ℃±2 ℃)와 조도(500 Lux ~ 1000 Lux) 및 조명을 규정된 바에 따라 조절할 수 있으나

항온수조와 항온항습기를 이용하는 경우는 조도와 조명이 규정된 바를 준수할 수 있는 지를 확인하여야 한다.

3-4. 시험 및 배양에 사용되는 기기 및 기구 보유여부

해설물벼룩을 얼마나 많이 배양하느냐에 따라 수량은 달라질 수 있지만 일반적으로 시험과 배양에 필요한 기본적인 기구는 배양용기(1 L 또는 2 L 비커), 시험용기(20 mL 또는 25 mL 비커), 스포이드 또는 홀피펫(25 mL 또는 50 mL) 등이 필요하다.

3-5. 저울의 안정성 확인

3-5-1. 저울의 수평 여부

3-5-2. 저울 내부의 흡습제 비치 여부

3-5-3. 저울 설치장소의 적절성

3-5-4. 저울 내․외부의 청결 상태 유지

- 64 -

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘5-6. 저울의 안정성 확인’을 참조하라

< 시험방법 >

4-1. 시료 보존 기간 내 시험 실시 여부

해설

ES 04130.1에 따라 시료채취 후 즉시 시험할 수 없을 때는 따로 규정이 없는 한 4 ℃에서 운송 및 보존하되 최대 36시간을 초과하지 않아야 한다.

4-2. 시험에 사용되는 물벼룩의 적절성

해설

ES 04704.1에 따라 시험을 실시할 때는 계대배양(여러 세대를 거쳐 배양)한 생후 2주 이상의 물벼룩 암컷 성체를 시험 전날에 새롭게 준비한 용기에 옮기고, 그 다음날까지 생산된 생후 24시간 미만의 어린 개체를 사용한다.

물벼룩은 배양 상태가 좋을 때 7일 ∼ 10일 사이에 첫 새끼를 부화하게 되는데 이때 부화된 새끼는 시험에 사용하지 않고 같은 어미가 약 네 번째 부화한 새끼부터 시험에 사용하여야 한다.

군집배양의 경우, 부화 횟수를 정확히 아는 것이 어렵기 때문에 생후 약 2주 이상의 어미에서 생산된 새끼를 시험에 사용하면 된다.

4-3. 적합한 희석수 사용 및 적절한 희석배율 적용 여부 확인

해설

독성값이 높을 것으로 예상되는 시료는 시험하기 전에 미리 배양액을 사용하여 희석을 한다. 또한 희석된 시료를 사용하여 산출된 독성값에 희석배수를 곱하여 실제 시료의 독성값으로 환산한다.

4-4. 노출시간의 준수

- 65 -

해설

ES 04704.1에 따라 시험시간은 24시간을 준수하여야 한다. 참고로, 국가(또는 시험방법)에 따라서는 48시간 후에 결과를 산출하기도 한다.

4-5. 유영저해 및 치사 판단 숙지 정도

해설

시험 시간(24시간)이 경과한 후 시험용기를 살며시 움직여주고, 15초 후 관찰했을 때 아무 반응이 없는 경우를 ‘치사(death)’라 판정하며, 거의 치사상태에서 촉수 정도만 움직인다면 이를 '유영저해(immobilization)'라 한다.

4-6. 시험방법에 따른 계산과정의 정확성

해설ES 04704.1 ‘8.0 결과보고’에 따라 독성값을 산출한다.

- 통계적 방법으로 EC50을 구할 수 있는 경우 : 생태독성값(TU) = 100/EC50

- 통계적 방법을 통한 EC50을 구할 수 없는 경우 :

100 % 시료에서 투입 물벼룩의 0 %∼10 %에 영향이 있는 경우(예: 원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 0 마리 ∼ 2 마리가 유영저해 및 치사를 보일 때)에는 TU를 0으로 한다.

원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 10 %∼49 %에 영향이 있는 경우에는 0.02 × (유영저해율 또는 치사율)로 TU를 계산한다.

[주] 원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 5마리가 유영저해 및 치사가 관찰되었을 때, 0.02 × 25 = 0.5 TU가 된다

원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 51 % ∼ 99 %에 영향이 있는 경우, 1 < TU < 2로 표시하거나, 필요에 따라 100 %, 75 %, 35 %, 12.5 %로 시험수의 농도를 조절하여 다시 시험한다.

4-7. 결과표현의 적절성

해설

ES 04704.1 ‘8.0 결과보고’를 참조하라. 즉, 결과는 독성값 TU로 표현하며 정수단위로 표기한다.

- 66 -

< 정도관리(QA/QC) >

5-1. 표준물질용액 제조방법 숙지 정도

해설물벼룩을 이용한 급성 독성 시험에서 표준물질은 다이크롬산포타슘이다.

ES 04704.1 ‘6.0 정도보증/정도관리’에 따라 표준독성물질 시험은 배양액에 24시간 - EC50값이 0.9 mg/L ∼2.1 mg/L 범위가 되도록 다이크롬산포타슘을 제조하여야 한다.

다이크롬산포타슘을 첨가한 표준독성물질 용액을 이용하여 ‘7.0 분석절차’와 동일하게 시험하여 24시간 - EC50값이 0.9 mg/L∼2.1 mg/L 범위 를 벗어났다면 재시험하고,

재시험 결과에서도 24시간 - EC50값이 0.9 mg/L∼2.1 mg/L 범위를 벗어났다면 시험을 중지하고 물벼룩을 전량 폐기 후 새로운 개체를 재분양 받아야 한다.

5-2. 내부정도관리의 적절성

5-2-1. 내부정도관리차트 작성 여부

5-2-2. 24시간-EC50값 범위의 적절성

5-2-3. 24시간-EC50값이 정상범위를 벗어났을 경우 대처방법 숙지 정도

해설

'5-1. 표준물질용액 제조방법 숙지 정도'를 참조하라.

표준독성물질 시험은 월 1회 이상 수행하여야 하며, 이를 내부 정도관리차트(control chart)로써 작성하여야 한다.

< 기록 및 관리 >

6-1. 시료채취에 대한 기록 및 관리의 적절성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘5-1. 기록 및 관리’를 참조하라.

- 67 -

6-2. 측정결과에 대한 원자료의 기록 및 관리의 적절성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘5-1. 기록 및 관리’를 참조하라.

참고로, ES 04704.1 ‘8.0 결과보고’에 의하면 방류수를 시험수로 사용한 시험결과는 아래 서식에 따라 그 결과를 기록한다. 그러나 일반적인 품질시스템에 따르면 기술책임자의 확인 서명도 필요하다.

방류수 시료 결과 기록부

배출시설 : 시료채취장소 : 시료 번호 :

채취일자 :

채취방법 : □ Grab □ Composite

채취시간

시작 : 일 시 분 종료 : 일 시 분

시료채취 1일전의 폐수 특성 : □ 정상 □ 비정상(내용 : )

시료 운반 조건 : □ 냉장 □ 실온

시료채취량(L) : 시료유효기간 :

현장 측정항목

온도(℃) : pH : 시료색깔 : □ 유 □ 무( )

용존산소(mg/L) : 방류수량(m3/일) :

전기전도도(uS/cm) : 염분(‰) :

독성시험항목

물벼룩 : 24시간 급성독성 EC50 : TU(100/EC50):

사용한 통계분석법 :

수질 측정항목

잔류염소(mg/L) : 암모니아(NH3, mg/L) : 경도(mg/L) :

최종 작성일 : 년 월 일

기입자 성명 : (인)

- 68 -

6-3. 성적서의 기록 및 관리의 적절성

해설

‘6-2. 측정결과에 대한 원자료의 기록 및 관리의 적절성’을 참조하라.

6-4. 모든 기록에 대한 접근의 용이성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘5-1. 기록 및 관리’를 참조하라

6-5. 모든 기록의 수정․변경에 대한 적절한 보안 조치

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의 ‘5-1. 기록 및 관리’를 참조하라

< 시험실 폐액 처리 >

7-1. 시험실 폐액 처리의 적절성

해설

3. 수질분야 - BOD, COD의‘5-8. 시험실 폐액처리의 적절성’을 참조하라

7-2. 물벼룩의 적절한 폐기 조치

해설

물벼룩을 폐기할 경우에는 망으로 걸러서 건조시키거나 물고기의 먹이로 제공하여 살아있는 상태로 하수구에 유입되지 않도록 주의해야 한다.

- 69 -

C. 관련 서식

1. 생태독성 실험일지 등 예시

생태독성 실험일지 담당 기술책임자1. 시험조건

시료명 접수번호 기준 TU시험종 Daphinia magna 연령(hr) 24시간 이내

시험용기 유형 □ P.P □ 유리 □ 사각 □ 원형시험용기 크기 50mL 광주기(명:암) 16:8시험용기 당 마리수 5마리 조도 Lux반복구 4 반복 먹이종류 Chlorella vulgaris, YCT시료 유형 □산업폐수 □하수 □하천수 □호소수 □해수 □기타( )

2. 수질측정농도 0%(대조군) 6.25%(저농도) 100%(고농도)

시험전 시험후 시험전 시험후 시험전 시험후수온pH용존산소경도(CaCO3)잔류염소(mg/L)

암모니아(NH3, mg/L)

전기전도도(mS/cm)

염분(%)

3. 관찰기록실험날짜 실험자 및 측정자실험시작시간 실험종료시간

반복횟수농도(%)

유영저해 마리수 유영저해율(%)1 2 3 4Control

6.2512.52550100

4. 실험결과사용통계프로그램 □ Probit Method , □ Trimmed Spearman – Karber (TSK) Method □ Graphic Method

EC50① 중크롬산칼륨 ( %)② 시료 (TU = 100/EC50 = )

최종 작성일 : 년 월 일

- 70 -

결과보고서

1. 시험조건

시료명 　 시험부피 50ml

시험방법 수질오염공정시험법 시험용기 75ml 유리비커

시험기간 최종측정치 유영저해율

온도 20±1℃ 반복수 4반복

광주기 　 컵당 생물수 5마리

2. 결과

구분 Rep. Ind.Mobil Immobile Mobil Immobile

Control 1 5

Control 2 5

Control 3 5

Control 4 5

6.25

1 5

2 5

3 5

4 5

12.5

1 5

2 5

3 5

4 5

25

1 5

2 5

3 5

4 5

50

1 5

2 5

3 5

4 5

100

1 5

2 5

3 5

4 5

- 71 -

2. 물벼룩 분양신청서

분 양 신 청 서접수번호

신청인

소 속

성 명

주 소

연락처 Fax.

분양신청 목적

생물종 Daphnia magna 수량

국립환경과학원 시험생물종 분양지침에 의거 위와 같이

무상 분양을 신청합니다.

위 본인은 국립환경과학원으로부터 분양받은 시험생물종

을 상기 목적 이외의 목적으로 부당하게 활용하지 않을 것

을 서약합니다.

년 월 일

신청자 (서명)

국립환경과학원장 귀하

- 72 -

D. 폐수종말처리시설의 방류수 수질기준(수질 및 수생태 보전에 관한 법률 시행규칙 제26조 [별표 10] <개정 2013. 9. 5>)

1. 방류수 수질기준

구 분

적용기간 및 수질기준

2010.12.31.까지

2011.1.1.부터

2011.12.31.까지

2012.1.1.부터 2012.12.31.까지

2013.1.1. 이후

Ⅰ지역 Ⅱ지역 Ⅲ지역 Ⅳ지역 Ⅰ지역 Ⅱ지역 Ⅲ지역 Ⅳ지역

생물화학적 산소요구량

(BOD)(mg/L)

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

10(10)이하

10(10)이하

10(10)이하

10(10)이하

화학적 산소요구량

(COD)(mg/L)

40(40)이하

40(40)이하

40(40)이하

40(40)이하

40(40)이하

40(40)이하

20(40)이하

20(40)이하

40(40)이하

40(40)이하

부유물질(SS)

(mg/L)

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

20(30)이하

10(10)이하

10(10)이하

10(10)이하

10(10)이하

총질소(T-N)(mg/L)

40(60)이하

40(60)이하

40(60)이하

40(60)이하

40(60)이하

40(60)이하

20(20)이하

20(20)이하

20(20)이하

20(20)이하

총인(T-P)(mg/L)

4(8)이하

4(8)이하

0.2(0.2)이하

0.3(0.3)이하

0.5(0.5)이하

4(8)이하

0.2(0.2)이하

0.3(0.3)이하

0.5(0.5)이하

2(2)이하

총대장균군 수(개/mL)

3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,0003,000(3,000)

3,000(3,000)

3,000(3,000)

3,000(3,000)

생태독성(TU)

-1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

1(1)이하

(비고)1. 산업단지 및 농공단지 폐수종말처리시설의 페놀류 등 수질오염물질의

방류수 수질기준은 위 표에도 불구하고 해당 처리시설에서 처리할 수 있는 수질오염물질 항목으로 한정하여 (별표 13) 제2호 나목의 표 중

- 73 -

구 분 범 위

Ⅰ지역 가.「수도법」제7조에 따라 지정ㆍ공고된 상수원보호구역

나.「환경정책기본법」제22조제1항에 따라 지정ㆍ고시된 특별대책지역 중 수질보전 특별대책지역으로 지정ㆍ고시된 지역

다.「한강수계 상수원수질개선 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항,「낙동강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항, 「금강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항 및 「영산강ㆍ섬진강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항에 따라 각각 지정ㆍ고시된 수변구역

라.「새만금사업 촉진을 위한 특별법」제2조제1호에 따른 새만금사업지역으로 유입되는 하천이 있는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

특례지역에 적용되는 배출허용기준의 범위에서 해당 처리시설 설치사업시행자의 요청에 따라 환경부장관이 정하여 고시한다.

2. 적용기간에 따른 수질기준란의 ( )는 농공단지 폐수종말처리시설의 방류수 수질기준을 말한다.

3. 생태독성 항목의 방류수 수질기준은 물벼룩에 대한 급성독성시험기준을 말한다.

4. 생태독성 방류수 수질기준 초과의 경우 그 원인이 오직 염(산의 음이온과 염기의 양이온에 의해 만들어지는 화합물을 말한다. 이하 같다) 성분 때문이라고 증명된 때에는 그 방류수를 법 제2조제9호의 공공수역 중 항만 또는 연안해역에 방류하는 경우에 한정하여 생태독성 방류수 수질기준을 초과하지 아니하는 것으로 본다.

5. 제4호에 따른 생태독성 방류수 수질기준 초과원인이 오직 염 성분 때문이라는 증명에 필요한 구비서류, 절차ㆍ방법 등에 관하여 필요한 사항은 국립환경과학원장이 정하여 고시한다.

2. 적용대상 지역

- 74 -

구 분 범 위

Ⅱ지역 법 제22조제2항에 따라 고시된 중권역 중 화학적 산소요구량(COD) 또는 총인(T-P)의 수치가 법 제24조제2항제1호에 따른 목표기준을 초과하였거나 초과할 우려가 현저한 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

Ⅲ지역 법 제22조제2항에 따라 고시된 중권역 중 한강ㆍ금강ㆍ낙동강ㆍ영산강ㆍ섬진강 수계에 포함되는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역(Ⅰ지역 및 Ⅱ지역을 제외한다)

Ⅳ지역 Ⅰ지역, Ⅱ지역 및 Ⅲ지역을 제외한 지역

- 75 -

E. 수질오염물질의 배출허용기준 (수질 및 수생태 보전에 관한 법률 시행규칙 제34조 [별표 13] )

1. 지역구분 적용에 대한 공통기준

가. 제2호 각 목 및 비고의 지역구분란의 청정지역, 가 지역, 나 지역

및 특례지역은 다음과 같다.

1) 청정지역 :「환경정책기본법 시행령」(별표 1) 제3호에 따른 수질

및 수생태계 환경기준(이하 "수질 및 수생태계 환경기준"이라 한다)

매우 좋음(Ⅰa)등급 정도의 수질을 보전하여야 한다고 인정되는 수

역의 수질에 영향을 미치는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시

하는 지역

2) 가 지역 : 수질 및 수생태계 환경기준 좋음(Ⅰb), 약간 좋음(Ⅱ)등급

정도의 수질을 보전하여야 한다고 인정되는 수역의 수질에 영향을

미치는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

3) 나 지역 : 수질 및 수생태계 환경기준 보통(Ⅲ), 약간 나쁨(Ⅳ), 나쁨

(Ⅴ) 등급 정도의 수질을 보전하여야 한다고 인정되는 수역의 수질

에 영향을 미치는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

4) 특례지역 : 환경부장관이 법 제49조제3항에 따른 공동처리구역으로

지정하는 지역 및 시장·군수가「산업입지 및 개발에 관한 법률」

제8조에 따라 지정하는 농공단지

나.「자연공원법」 제2조 제1호에 따른 자연공원의 공원구역 및 「수

도법」 제7조에 따라 지정·공고된 상수원보호구역은 제2호에 따른 항

목별 배출허용기준을 적용할 때에는 청정지역으로 본다.

다. 정상가동 중인 공공하수처리시설에 배수설비를 연결하여 처리하고

있는 폐수배출시설에 제2호에 따른 항목별 배출허용기준(같은 호 나목

의 항목은 해당 공공하수처리시설에서 처리하는 수질오염물질 항목만

해당한다)을 적용할 때에는 나지역의 기준을 적용한다.

- 76 -

2. 항목별 배출허용기준

가. 생물화학적산소요구량·화학적산소요구량·부유물질량

대상규모

항목

지역구분

1일 폐수배출량 2천 세제곱미터 이상

1일 폐수배출량 2 천세제곱미터 미만

생물화학적산소요구량

(㎎/L)

화학적산소요구량

(㎎/L)

부유물질량(㎎/L)

생물화학적산소요구량

(㎎/L)

화학적산소요구량

(㎎/L)

부유물질량(㎎/L)

청정지역 30 이하 40 이하 30 이하 40 이하 50 이하 40 이하

가 지역 60 이하 70 이하 60 이하 80 이하 90 이하 80 이하

나 지역 80 이하 90 이하 80 이하 120 이하 130 이하 120 이하

특례지역 30 이하 40 이하 30 이하 30 이하 40 이하 30 이하

(비고)1. 하수처리구역에서「하수도법」제28조에 따라 공공하수도관리청의 허

가를 받아 폐수를 공공하수도에 유입시키지 아니하고 공공수역으로 배출하는 폐수배출시설 및「하수도법」제27조제1항을 위반하여 배수설비를 설치하지 아니하고 폐수를 공공수역으로 배출하는 사업장에 대한 배출허용기준은 공공하수처리시설의 방류수 수질기준을 적용한다.

2.「국토의 계획 및 이용에 관한 법률」제6조제2호에 따른 관리지역에서의 같은 법 시행령 (별표 20) 제1호 차목 및 (별표 27) 제2호 타목((별표 20) 제1호 차목에 따른 공장만 해당한다)에 따른 공장에 대한 배출허용기준은 특례지역의 기준을 적용한다.

나. 페놀류 등 수질오염물질

1) 삭제 <2010.4.2.>,

2)~4), 6): 생략

- 77 -

지역 구분 항 목

청정지역

가 지역

나 지역

특례지역

수온이온농도 5.8~8.6 5.8~8.6 5.8~8.6 5.8~8.6

노말헥산추출물질함유량

광유류(㎎/L) 1 이하 5 이하 5 이하 5 이하

동식물유지류(㎎/L) 5 이하 30 이하 30 이하 30 이하

페놀류함유량(㎎/L) 1 이하 3 이하 3 이하 5 이하

시안함유량(㎎/L) 0.2 이하 1 이하 1 이하 1 이하

크롬함유량(㎎/L) 0.5 이하 2 이하 2 이하 2 이하

용해성철함유량(㎎/L) 2 이하 10 이하 10 이하 10 이하

아연함유량(㎎/L) 1 이하 5 이하 5 이하 5 이하

구리(동)함유량(㎎/L) 1 이하 3 이하 3 이하 3 이하

카드뮴함유량(㎎/L) 0.02 이하 0.1 이하 0.1 이하 0.1 이하

수은함유량(㎎/L) 0.001이하 0.005이하 0.005이하 0.005이하

유기인함유량(㎎/L) 0.2 이하 1 이하 1 이하 1 이하

비소함유량(㎎/L) 0.05 이하 0.25 이하 0.25 이하 0.25 이하

납함유량(㎎/L) 0.1 이하 0.5 이하 0.5 이하 0.5 이하

6가크롬함유량(㎎/L) 0.1 이하 0.5 이하 0.5 이하 0.5 이하

용해성망간함유량(㎎/L) 2 이하 10 이하 10 이하 10 이하

플로오르(불소)함유량(㎎/L) 3 이하 15 이하 15 이하 15 이하

PCB함유량(㎎/L) 불검출 0.003이하 0.003이하 0.003이하

총대장균군(群)(총대장균군수)(㎖) 100 이하 3,000이하 3,000이하 3,000이하

색도(도) 200 이하 300 이하 400 이하 400 이하

온도(℃) 40 이하 40 이하 40 이하 40 이하

총질소(㎎/L) 30 이하 60 이하 60 이하 60 이하

총인(㎎/L) 4 이하 8 이하 8 이하 8 이하

트리클로로에틸렌(㎎/L) 0.06 이하 0.3 이하 0.3 이하 0.3 이하

테트라클로로에틸렌(㎎/L) 0.02 이하 0.1 이하 0.1 이하 0.1 이하

음이온계면활성제(㎎/L) 3 이하 5 이하 5 이하 5 이하

벤젠(㎎/L) 0.01 이하 0.1 이하 0.1 이하 0.1 이하

디클로로메탄(㎎/L) 0.02 이하 0.2 이하 0.2 이하 0.2 이하

생태독성(TU) 1 이하 2 이하 2 이하 2 이하

셀레늄함유량(㎎/L) 0.1 이하 1 이하 1 이하 1 이하

사염화탄소(㎎/L) 0.004이하 0.04 이하 0.04 이하 0.08 이하

1,1-디클로로에틸렌(㎎/L) 0.03 이하 0.3 이하 0.3 이하 0.6 이하

5) 2014년 1월 1일부터 2015년 12월 31일까지 적용되는 기준

- 78 -

지역 구분 항 목

청정지역

가 지역

나 지역

특례지역

1,2-디클로로에탄(㎎/L) 0.03 이하 0.3 이하 0.3 이하 0.3 이하

클로로포름(㎎/L) 0.08 이하 0.8 이하 0.8 이하 0.8 이하

니켈(㎎/L) 0.1 이하 3.0 이하 3.0 이하 3.0 이하

바륨(㎎/L) 1.0 이하 10.0이하 10.0 이하 10.0 이하

1,4-다이옥산(㎎/L) 0.05 이하 4.0 이하 4.0 이하 4.0 이하

디에틸헥실프탈레이트(DEHP)(㎎/L) 0.02 이하 0.2 이하 0.2 이하 0.8 이하

염화비닐(㎎/L) 0.01 이하 0.5 이하 0.5 이하 1.0 이하

아크릴로니트릴(㎎/L) 0.01 이하 0.2 이하 0.2 이하 1.0 이하

브로모포름(㎎/L) 0.03 이하 0.3 이하 0.3 이하 0.3 이하

(비고)1. 색도항목의 배출허용기준은 (별표 4) 제2호 18)의 섬유염색 및 가공

시설, 같은 호 19)의 기타 섬유제품 제조시설 및 같은 호 23)의 펄프ㆍ종이 및 종이제품(색소첨가 제품만 해당한다) 제조시설에만 적용한다.

2. 생태독성 배출허용기준은 물벼룩에 대한 급성독성시험을 기준으로 하며, (별표 4) 제2호의 3), 12), 14), 17)부터 20)까지, 23), 26), 27), 30), 31), 33)부터 40)까지, 46), 48)부터 50)까지, 54), 55), 57)부터 60)까지, 63), 67), 74), 75) 및 80)에 해당되는 폐수배출시설에만 적용한다. 다만, 해당 사업장에서 배출되는 폐수를 모두 폐수종말처리시설 또는「하수도법」제2조제9호에 따른 공공하수처리시설에 유입시키는 폐수배출시설에는 적용하지 아니한다.

3. 청정지역에 설치된 영 (별표 13)에 따른 제3종부터 제5종까지의 사업장에 적용하는 생태독성 배출허용기준은 TU 2를 적용하되, 2016년 1월 1일부터는 TU 1을 적용한다.

4. 가 지역, 나 지역, 특례 지역에 적용하는 생태독성 배출허용기준의 경우 별표 4 제2호의 18), 48) 및 80)에 해당하는 폐수배출시설은 TU 4를 적용하고, 같은 호의 31) 및 33)에 해당하는 폐수배출시설은 TU 8을 적용하되, 2016년 1월 1일부터는 모두 TU 2를 적용한다.

5. 삭제 <2013.9.5>6. 생태독성(TU) 배출허용기준 초과원인이 염(산의 음이온과 염기의 양

- 79 -

이온에 의해 만들어지는 화합물을 말한다. 이하 같다)으로 증명된 경우로서 다음 각 목의 어느 하나에 해당하는 경우에는 생태독성(TU) 배출허용기준을 초과하지 아니한 것으로 본다.

가. 법 제2조제9호의 공공수역 중 항만ㆍ연안해역에 방류하는 경우 나. 법 제2조제9호의 공공수역 중 항만ㆍ연안해역을 제외한 곳으로 방

류하는 경우(2010년 12월 31일까지 설치허가 또는 변경허가를 받거나 설치신고 또는 변경신고를 한 폐수배출시설로 한정한다).

이 경우 시ㆍ도지사는 「환경기술개발 및 지원에 관한 법률」 제12조에 따른 환경기술지원을 받게 하고, 그 결과를 제출하게 할 수 있다.

7. 제6호에 따른 생태독성(TU) 배출허용기준 초과원인이 염이라는 증명에 필요한 구비서류, 절차ㆍ방법 등에 관하여 필요한 사항은 국립환경과학원장이 정하여 고시한다.

8. 특례지역 내 폐수배출시설에서 발생한 폐수를 폐수종말처리시설에 유입하지 아니하고 직접 방류할 경우에는 해당지역 구분에 따른 배출허용기준을 적용한다.

- 80 -

F. 공공하수처리시설의 방류수수질기준

(하수도법 시행규칙 제3조 제1항 제1호 [별표 1] )

1. 2010년 12월 31일까지 적용되는 기준

구분

생물화학적 산소요구량(BOD)(㎎/L)

화학적 산소요구량(COD)(㎎/L)

부유물질(SS)(㎎/L)

총질소(T-N)(㎎/L)

총인(T-P)(㎎/L)

총대장균군수(개/㎖)

1일 하수처리용량 50㎥ 이상

10 이하 40 이하 10 이하 20 이하 2 이하3,000이하

1일 하수처리용량 50㎥ 미만

10 이하 40 이하 10 이하 40 이하 4 이하

(비고)1. 공공하수처리시설의 페놀류 등 오염물질의 방류수수질기준은 해당 시

설에서 처리할 수 있는 오염물질항목에 한하여「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙」(별표 13) 제2호 나목 페놀류 등 수질오염물질 표 중 특례지역에 적용되는 배출허용기준 이내에서 그 처리시설의 설치사업 시행자의 요청에 따라 환경부장관이 정하여 고시한다.

2. 겨울철(12월 1일부터 3월 31일까지)의 총질소와 총인의 방류수수질기준은 60 ㎎/L 이하와 8 ㎎/L 이하를 각각 적용한다.

3. 다음 각 지역에 설치된 공공하수처리시설의 방류수수질기준은 총대장균군수를 1,000 개/㎖ 이하로 적용한다.

가.「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙」(별표 13)에 따른 청정지역

나.「수도법」 제7조에 따른 상수원보호구역 및 상수원보호구역의 경계로부터 상류로 유하거리(流下距離) 10 ㎞ 이내의 지역

다.「수도법」 제3조 제17호에 따른 취수(取水)시설로부터 상류로 유하거리 15 ㎞ 이내의 지역

4. 영 제4조제3호에 따른 수변구역에 설치된 공공하수처리시설에 대하여

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는 1일 하수처리용량 50㎥ 이상인 방류수수질기준을 적용한다. 2. 생략

3. 2012년 1월 1일부터 적용되는 기준

가. 방류수 수질기준

구 분생물화학적 산소요구량(BOD)(㎎/L)

화학적 산소요구량 (COD)(㎎/L)

부유물질(SS)(㎎/L)

총질소(T-N)(㎎/L)

총인(T-P)(㎎/L)

총대장균군수(개/㎖)

생태독성(TU)

1일 하수처리용량 500㎥ 이상

Ⅰ지역 5 이하 20 이하 10 이하 20 이하 0.2 이하 1,000 이하 1 이하

Ⅱ지역 5 이하 20 이하 10 이하 20 이하 0.3 이하 3,000 이하

Ⅲ지역 10 이하 40 이하 10 이하 20 이하 0.5 이하

Ⅳ지역 10 이하 40 이하 10 이하 20 이하 2 이하

1일 하수처리용량 500㎥ 미만 50㎥ 이상

10 이하 40 이하 10 이하 20 이하 2 이하

1일 하수처리용량 50㎥ 미만

10 이하 40 이하 10 이하 40 이하 4 이하

(비고)1. 공공하수처리시설의 페놀류 등 오염물질의 방류수수질기준은 해당 시

설에서 처리할 수 있는 오염물질항목에 한하여「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙」(별표 13) 제2호 나목 페놀류 등 수질오염물질 표 중 특례지역에 적용되는 배출허용기준 이내에서 그 처리시설의 설치사업 시행자의 요청에 따라 환경부장관이 정하여 고시한다.

2. 1일 하수처리용량이 500 ㎥ 미만인 공공하수처리시설의 겨울철(12월 1일부터 3월 31일까지)의 총질소와 총인의 방류수수질기준은 2014년 12월 31일까지 60 ㎎/L 이하와 8 ㎎/L 이하를 각각 적용한다.

3. 다음 각 지역에 설치된 공공하수처리시설의 방류수수질기준은 총대장

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구분 범 위

Ⅰ지역

가.「수도법」제7조에 따라 지정·공고된 상수원보호구역

나.「환경정책기본법」제22조제1항에 따라 지정·고시된 특별대책지역 중 수질보전 특별대책지역으로 지정·고시된 지역

다.「한강수계 상수원 수질개선 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항, 「낙동강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항, 「금강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항 및 「영산강·섬진강수계 물관리 및 주민지원 등에 관한 법률」 제4조제1항에 따라 각각 지

균군수를 1,000 개/㎖ 이하로 적용한다. 가.「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙」(별표 13)에 따른

청정지역 나.「수도법」제7조에 따른 상수원보호구역 및 상수원보호구역의 경계

로부터 상류로 유하거리(流下距離) 10 ㎞ 이내의 지역 다.「수도법」제3조 제17호에 따른 취수(取水)시설로부터 상류로 유

하거리 15 ㎞ 이내의 지역 4. 영 제4조 제3호에 따른 수변구역에 설치된 공공하수처리시설에 대하

여는 1일 하수처리용량 50 ㎥ 이상인 방류수수질기준을 적용한다. 5. 생태독성의 방류수 수질기준은 물벼룩에 대한 급성독성시험을 기준으

로 하며, 다음의 요건 모두에 해당하는 공공하수처리시설에만 적용한다.

가.「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 시행규칙」(별표 4) 제2호의 3), 12), 14), 17)부터 20)까지, 23), 26), 27), 30), 31), 33)부터 40)까지, 46), 48)부터 50)까지, 54), 55), 57)부터 60)까지, 63), 67), 74), 75) 및 80)에 해당하는 폐수배출시설에서 배출되는 폐수가 유입될 것

나. 1일 하수처리용량이 500 ㎥ 이상일 것

나. 지역 구분

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구분 범 위

정·고시된 수변구역

라.「새만금사업 촉진을 위한 특별법」제2조제1호에 따른 새만금사업지역으로 유입되는 하천이 있는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

Ⅱ지역 「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률」 제22조제2항에 따라 고시된 중권역 중 화학적 산소요구량(COD) 또는 총인(T-P)의 수치가 같은 법 제24조제2항제1호에 따른 목표기준을 초과하였거나 초과할 우려가 현저한 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역

Ⅲ지역 「수질 및 수생태계 보전에 관한 법률」 제22조제2항에 따라 고시된 중권역 중 한강·금강·낙동강·영산강·섬진강 수계에 포함되는 지역으로서 환경부장관이 정하여 고시하는 지역(Ⅰ지역 및 Ⅱ지역을 제외한다)

Ⅳ지역 Ⅰ지역, Ⅱ지역 및 Ⅲ지역을 제외한 지역

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생태독성 시험·운영 실무지침

발 행 일 : 2014. 3

발행기관 : 국립환경과학원 물환경연구부 물환경공학연구과

작 성 자 : 김종민 연구관, 신기식 연구사, 허인애 연구관,

박창희 연구관, 김재훈 연구관, 박태진 연구사,

임종권 연구사, 유순주 과장, 박우상 연구원,

이정서 연구원

전화번호 : 032-560-7427

팩스번호 : 032-568-2046