fÁjdalomban szerepet jÁtszÓ mechanizmusok...

FÁJDALOMBAN SZEREPET JÁTSZÓ MECHANIZMUSOK

KOMPLEX ÁLLATKÍSÉRLETES VIZSGÁLATA

EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

TÉKUS VALÉRIA

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Neurofarmakológiai Program

Doktori iskolavezető: Dr. Pintér Erika

Programvezető: Dr. Pintér Erika

Témavezetők: Dr. Helyes Zsuzsanna, Dr. Pethő Gábor

2014.

2

TARTALOMJEGYZÉK

oldalszám

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS 6

Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia 6

Kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések 7

Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankirin (TRPA1)

receptorok felépítése és funkciója 8

Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága 11

In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága 12

ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK 13

AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA 13

Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek 13

A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével 15

Egyéb in vivo vizsgálati módszerek 16

Lábtérfogati változások mérése 16

A spontán súlyeloszlás vizsgálata 16

A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata 17

A motoros koordináció vizsgálata 17

In vitro vizsgálati módszerek 17

Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet

homogenizátumokból

Etikai vonatkozások 18

1.FEJEZET: TRPV1 RECEPTOR AGONISTÁK DESZENZIBILIZÁLÓ ANTINOCICEPTÍV

HATÁSAINAK VIZSGÁLATA FÁJDALMAS HŐ- ÉS HIDEGKÜSZÖB MÉRÉSÉVEL

PATKÁNYBAN

IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK 19

A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció 19

N-oleoildopamin 20

CÉLKITŰZÉS 21

KÍSÉRLETI MODELLEK 21

Kísérleti állatok 21

A termonociceptív küszöbök meghatározása 21

Az érzőideg végződés deszenzibilizációjának vizsgálata 21

TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata 22

Felhasznált anyagok 23

Statisztikai analízis 23

EREDMÉNYEK 24

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 28

2. FEJEZET: TRPV1 ANTAGONISTÁK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA PATKÁNYMODELLBEN


CÉLKITŰZÉS 33



RTX által kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés 33

Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés 34

Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés 34

RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés) 35



EREDMÉNYEK 36

TRPV1 antagonisták hatásai a termonocicepciós küszöbök vizsgálatakor 36

RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 36

Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 37

A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása 39

TRPV1 receptor antagonisták hatása az alap hőküszöbre 40

3

TRPV1 antagonisták hatásai RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre 40


3. FEJEZET: A TRPV1 ÉS TRPA1 RECEPTOROK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AZ ALAP

HŐÉRZÉKELÉSBEN ÉS MUSTÁROLAJ ÁLTAL KIVÁLTOTT HIPERALGÉZIA MODELLBEN

RECEPTOR GÉNHIÁNYOS EGEREK FELHASZNÁLÁSÁVAL

BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR 46

CÉLKITŰZÉS 47




Előkísérletek és módszertani fejlesztések 48

Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása 49

Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata 49

Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata 49

Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció 49


EREDMÉNYEK 50

Előkísérletek 50

Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása 51

Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia meghatározása 52

Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása 53

Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció meghatározása 54


4. FEJEZET: A KOMPLEX REGIONÁLIS FÁJDALOM SZINDRÓMA (CRPS)

PASSZÍV TRANSZFER-TRAUMA EGÉRMODELLJE


Neuro-immun interakciók 59

A CRPS klinikai jellemzői 59

CÉLKITŰZÉS 62

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 62

Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés 62


Kísérleti protokoll 63

Plantáris bőr-izom incízió 64

Vizsgálati módszerek 64

EREDMÉNYEK 66

Mechanikai hiperalgézia 67

Lábduzzadás 68

Hő- és hideghiperalgézia 69

Spontán súlyeloszlás 69

Spontán lokomotoros aktivitás és motoros kordináció 69

Talphőmérséklet és testsúlyváltozás 70

Lábhomogenizátumokban mért gyulladásos neuropeptidek és citokinek

koncentrációja 71

Potenciálisan befolyásoló tényezők 71


ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 76

IRODALOMJEGYZÉK 78

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 93

PUBLIKÁCIÓS LISTA 94

4

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

ATP: adenozin-trifoszfát

AITC: allyl-isothiocyanate / allil-izotiocianát

ANOVA: analysis of variance / variancia-analízis

BK: bradikinin

B2: bradikinin receptor 2

CGRP: Calcitonin- gene-related-peptide / calcitonin gén-rokon peptid

CKK: kolecisztokinin

COX-2: ciklooxigenáz

CRPS: Complex Regional Pain Syndrome / Komplex Regionális Fájdalom Szindróma

CZP: kapszazepin

DMSO: dimetil-szulfoxid

H2S: hidrogén-szulfid

IASP: International Association for the Study of Pain / Fájdalomkutatás Nemzetközi

Szervezete

IC: intracelluláris

IgG: immunglobulin G

i.p.: intraperitoneális

i.pl.: intraplantáris

LCS: latenciaidő-csökkenés

MO: mustárolaj

MED: minimális effektív dózis

NSAID: non-steroidal anti inflammatory drug / nem szteroid gyulladáscsökkentő szer

NKA: neurokinin A

NGF: nerve growth factor / idegi eredetű növekedési faktor

NMR: nucleus raphe magnus

OLDA: N-oleoildopamin

PACAP: pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide / hipofízis-adenilát-cikláz-

aktiváló polipeptid

PAG: periaquaeductal grey matter/ periaquaduktális szürkeállomány

PAR: proteáz aktiváló receptor

PG: prosztaglandin

5

PGE2: prosztaglandin-E2

PKA: protein-kináz-A

PKC: protein-kináz-C

PLC: foszfolipáz-C

PIP2: foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát

RIA: radioimmunassay

RTX: reziniferatoxin

SEM: standard hiba

SP: substance P / P-anyag

TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa

TRP: tranziens receptor potenciál

TRPV1: tranziens receptor potenciál vanilloid 1

TRPA1: tranziens receptor potenciál ankirin 1

VR1: vanilloid receptor 1

6

Általános bevezetés

Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia

A fájdalomkutatás nemzetközi szervezete (International Association for the Study of Pain,

IASP) az alábbiak szerint definiálja a fájdalom fogalmát: egy kellemetlen szubjektív

érzéskvalitás, mely tényleges vagy potenciális szövetkárosodást jelez. Neurobiológiai

komponensével, a nocicepcióval, (a fájdalmas stimulus percepciója) illetve affektív

komponensével (fájdalom emociója) jellemezhető, ez utóbbi azonban csak emberekben

vizsgálható. Állatkísérletek során a nociceptorok aktiválódását, illetve a fájdalmas

stimulusra adott elhárító (nocifenzív) magatartást tudjuk vizsgálni. A nociceptorok, melyek

szövetkárosító ingerekre specifikusan reagáló szenzoros idegvégződések, többféle

szempontból csoportosíthatók. Érzékenység alapján megkülönböztethetünk unimodális

(csak termális vagy mechanikai ingerekkel stimulálható) illetve polimodális (hő-,

mechanikai és kémiai ingerekkel egyaránt aktiválható) receptorokat. Axonjaik

mielinizáltsága alapján vékonyan mielinizált, gyorsan vezető (12–30 m/s) Aδ

nociceptorokra, és mielinhüvely nélküli, lassan vezető (0,5–2 m/s) rostokkal rendelkező C

nociceptorokra oszthatjuk őket. A perifériás nociceptorok olyan primer afferens neuronok

végződései, melyek sejttestjei a gerincvelő hátsógyöki illetve trigeminus ganglionokban

találhatók. Ezek perifériás nyúlványai alkotják a fájdalomérző idegrostokat, míg centrális

nyúlványaik a központ felé a gerincvelő hátsó szarvába vagy a nucleus tractus spinalis

nervi trigeminibe továbbítják az ingerületet.

A fájdalom időtartama alapján lehet akut, illetve krónikus. Az akut fájdalom a szervezet

legfontosabb védekező mechanizmusa, mely a szövetek valamilyen károsodására hívja fel

a figyelmet, csillapítása az egyik legfontosabb tüneti kezelés. Krónikus fájdalomról

beszélünk, ha az több mint három hónapig fennáll. Ez a fájdalomállapot lehet konstans (pl.

malignus tumor esetében), illetve intermittáló (pl. migrén).

Az enyhe fájdalmas ingerek által kiváltott fokozott fájdalomérzetet hiperalgéziának

nevezzük, míg a nem fájdalmas stimulusokkal kiváltott patológiás fájdalomérzet az

allodínia (Merskey és Bogduk 1994). Mind a mechanikai, mind pedig a termális allodínia

és hiperalgézia kialakulhat gyulladás illetve eltérő eredetű (traumás, toxikus) centrális vagy

perifériás idegsérülés hatására, melyek a szomato-szenzoros vagy a spino-talamo-kortikális

pályarendszer bármely szintjén létrejöhetnek (Tajti és Vécsei 2006).

7

Kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések

A perifériás nociceptorok egy nagy csoportját, kb. 50-70%-át alkotják a kapszaicin-

érzékeny érzőideg-végződések (Holtzer és mtsai. 1991). Nevüket a csípős paprika

alkaloidjáról, a kapszaicinről kapták, mivel ezen idegvégződések membránjában

lokalizálódik receptora, a Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) ioncsatorna

(lásd később). Ezek az érzőideg-végződések egyedülálló módon ún. hármas funkcióval

rendelkeznek: egyrészt a klasszikus afferens funkcióval, mely során az ingerületbe került

szenzoros idegvégződés a központi idegrendszer felé közvetíti az idegaktivitást, ennek

következtében kialakul a fájdalomérzet, vagyis a nocicepció. Szolcsányi János és Gábor

Aranka korai kísérleteik során patkányok n. saphenusának és n. trigeminusának elektromos

izgatása következtében létrejövő arteriolás vazodilatációt, vaszkuláris permeabilitás-

növekedést és plazmaproteinek extravazációjátt figyelte meg a beidegzési területeken.

Ezen idegeken nagy dózisú kapszaicinnel történő előkezelés után sem ortodrómos kémiai,

sem antidrómos elektromos ingerlés hatására nem alakult ki a gyulladásos reakció. Ennek

alapján azt feltételezték, hogy a gyulladáskeltő mediátorok a kapszaicin-érzékeny

fájdalomérző-idegvégződésekből, a nociceptorokból szabadulnak fel (Jancsó és mtsai.

1967). Későbbi kísérleteik során igazolták, hogy az aktivált érzőideg-végződésekből

gyulladáskeltő szenzoros neuropeptidek (kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP),

tachikininek (substance P (SP) és neurokinin A (NKA)) szabadulnak fel, melyek

értágulatot, plazmafehérje kiáramlást okoznak, továbbá a gyulladásos sejtek aktivációjával

hozzák létre a neurogén gyulladást (Szolcsányi 1984 a, b, 1988). Ezt a folyamatot

nevezzük lokális efferens funkciónak. A neurogén gyulladás számos betegség

patomechanizmusában meghatározó szerepet játszik, jelenleg azonban egyetlen

gyógyszercsoport sem képes hatékonyan gátolni a betegség neurogén komponensét

(Helyes és mtsai. 2003).

A gyulladáskeltő neuropeptidek mellett, gyulladásgátló és fájdalomcsillapító mediátorok

(pl. szomatosztatin, hipofízis-adenilát-cikláz-aktiváló polipeptid (PACAP)) is

felszabadulnak, melyek a keringésbe jutva a test távolabbi pontjaira eljutva akadályozzák a

neurogén és nem neurogén gyulladás kialakulását, illetve analgetikus hatást váltanak ki. Ez

az érzőideg-végződések harmadik, ún. szisztémás efferens funkciója (Szolcsányi és mtsai.

1998 a, b).

8

1. ábra: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója (Rövidítéseket lásd a szövegben)

A Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankyrin 1 (TRPA1)

receptorok felépítése és funkciója

A hátsó gyöki és trigeminus ganglionokban a polimodális nociceptív primer szenzoros

neuronokon expresszálódnak, Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid családba tartozó

Vanilloid 1 és Ankirin 1 receptorok. Jelenlétüket újabban nem neuronális struktúrákon is

kimutatták (Inoue és mtsai. 2002, Fernandes és mtsai 2012). Mindkét receptor jelentős

szerepet játszik az érzőidegek aktivációján keresztül a fájdalom (Fernandes és mtsai. 2011)

és a neurogén gyulladás (Geppetti és mtsai. 2008) mechanizmusaiban. A TRPA1-et

expresszáló szenzoros neuronok 97%-ának membránjában megtalálható a TRPV1 receptor

is, míg a TRPV1-et expresszáló neuronok 30%-ában koexpresszálódik a TRPA1 is (Story

és mtsai. 2003). Mindkét receptor ioncsatornához kötött receptor, melyek Ca2+

és Na+

ionok számára permeabilisek, számos kémiai irritáns, endogén mediátor és fizikai inger

9

képes őket stimulálni. Szerkezetüket tekintve hasonlók: mindkét receptort 6 β-redő

szerkezetű transzmembrán domén építi fel. Az 5. és 6. alegység között intracelluláris,

hidrofób hurok található, ez alkotja csatornarégiót. Ezen struktúrák négy egységből álló

tetramerré alakulva alkotják a nem szelektív kationcsatornát (2. ábra). Legszembetűnőbb

különbség köztük a TRPA1 receptor N-terminális régiójában található 14 ankirin

ismétlődés, mely hosszúságával egyedülálló az élővilágban. A receptor elnevezését is erről

kapta, ezen ismétlődésnek feltetételezhetően a mechanikai érzékelésben jut fontos szerep

(Kwan és mtsai. 2006).

2. ábra: TRPV1 és TRPA1 receptor felépítése (Forrás: Bessac és Jordt 2008a.)

A TRPV1 egy olyan receptor, mely fizikai és kémiai ingerek számára molekuláris

integrátor funkciót lát el (Tominaga és mtsai. 1998). A receptor létezését, Szolcsányi már

1975-ben valószínűsítette (Szolcsányi 1975). Számos exogén növényi eredetű irritáló

vanilloid vegyület (reziniferatoxin (RTX), piperin, gingerol) (Pingle és mtsai. 2007,

Szállási 2007) képes aktiválni, ezért a receptor eredeti elnevezése vanilloid receptor 1

(VR1) lett, melyet azonban az egyéb tranziens receptorpotenciált közvetítő ioncsatornákkal

mutatott szerkezeti hasonlóságai miatt később TRPV1-re változtattak (Gunthorpe és mtsai.

2002). Kapszaicin melletti másik fontos stimulátora a fájdalmas intenzitású hő (43°C

felett), míg a pH változása (acidózis), „endovanilloidok” (pl. anandamid), arachidonsav-

metabolitok, oxidált linolsav metabolitok, és esszenciális olajok is képesek még a receptort

aktiválni (Pingle és mtsai. 2007, Szállási 2007). Gyulladáskeltő mediátorok, mint

bradikinin, prosztaglandinok, adenozin-trifoszfát (ATP), proteáz aktiváló receptorok (PAR

10

1, 2 ,4), tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-alfa), idegnövekedési faktor (nerve growth factor,

NGF) is érzékenyítik a receptort foszforiláció révén. Ezen mediátorok hatására a

csatornaproteinek allosztérikusan modifikálódnak, ezáltal növelik a hő, a protonok és/vagy

a kapszaicin által kiváltott receptor aktiváció mértékét (Moriyama és mtsai. 2005, Szállási

és mtsai. 2007). A receptor szenzibilizációjának mértékét számos mechanizmus

befolyásolja, köztük a TRPV1 foszforilációjának mértéke, melyben a protein kináz A

(PKA), protein kináz C (PKC) és egyéb kinázok játszanak kulcsfontosságú szerepet

(Premkumar és Ahern 2000, Jung és mtsai. 2003).

A TRPA1 receptor hidegérzékelésben betöltött szerepéről rendelkezésre álló adatok

egymásnak ellentmondóak. Számos különböző eredmény született e téren, vannak, akik

mellette (Story és mtsai. 2003, Obata és mtsai. 2005, Kwan és mtsai. 2006, Sawada és

mtsai. 2008), vannak, akik ellene érvelnek (Jordt és mtsai. 2004, Nagata és mtsai. 2005,

Bautista és mtsai. 2006). Feltételezhetően más mechanizmusok mellett a TRPA1 is

hozzájárul a 17°C alatti hőmérséklet érzékeléséhez.

A TRPA1 receptor exogén agonistái közül jelentősek a növényi eredetű vegyületek, a

mustárolajban található allil-izotiocianát (AITC) (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai

2004, Bautista és mtsai. 2006), a fokhagymában levő allicin (Macpherson és mtsai. 2005),

fahéjaldehid (Macpherson és mtsai. 2006), továbbá toxikus kipufogó gázokban és

dohányfüstben található vegyületek (pl. acrolein) (Bautista és mtsai. 2006). Endogén

agonistái között tartják számon az oxidatív stressz során felszabaduló reaktív gyököket

(Bessac és mtsai. 2008b), köztük a 4-hidroxinonenalt (Trevisani és mtsai. 2007), lipid

peroxidáz termékeket (Taylor-Clark és mtsai. 2008), továbbá cink, réz és kadmium ionokat

(Hu és mtsai. 2009, Gu és Lin 2010). Endogén modulátorai között szerepelnek a

gyulladásos folyamatok során felszabaduló ágensek, pl. bradikinin (Bandell és mtsai.

2004), PAR-2 agonisták (Dai és mtsai. 2007), továbbá a hidrogén-szulfid (H2S) (Miyamoto

és mtsai. 2011).

A receptor aktiválása többféleképpen történhet, fahéjaldehid, acrolein, AITC és a legtöbb

növényi eredetű terpén a csatorna intracelluláris N-terminális részén található specifikus

cisztein oldallánchoz kötődik reverzibilis kovalens kötéssel, így idézve elő a konformáció

változást és a csatorna nyitását (Hinman és mtsai. 2006). A TRPA1 receptor sajátossága,

hogy a Ca2+

ionokra nézve nem szelektív, az intracelluláris Ca2+

-szint-növekedés direkt

módon képes aktiválni a receptort. A bradikinin indirekt módon stimulálja a TRPA1

receptort, mégpedig úgy, hogy a primer szenzoros neuronon megtalálható G proteinhez

11

kötött receptorához kötődik, aktiválja a foszfolipáz C-t (PLC), amely a sejtmembránban

lévő foszfatidilinozitol biszfoszfát (PIP2) hidrolíziséhez vezet. E folyamat eredményeként a

keletkező inozitol-triszfoszfát (IP3) az intracelluláris Ca2+

raktárakból szabadít fel Ca2+

-

ionokat, míg a diacilglicerol (DAG) aktiválja a protein-kináz C-t (PKC), ami a TRPV1

szenzitizációjához vezet, így még több Ca2+

-ion áramlik be az extracelluláris térből a sejt

belsejébe. A kétféle úton zajló események az intracelluláris Ca2+

koncentráció emelkedése

révén a TRPA1 ioncsatorna nyitását okozzák (Bautista és mtsai. 2006).

3. ábra: A TRPV1 és TRPA1 receptor közötti interakcó (Forrás: Bautista és mtsai. 2006).

Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága

A fájdalomcsillapítás területén új támadáspontú szerek fejlesztésében az elmúlt 100 évben

nem történt lényegi áttörés. Évtizedek óta ugyanazon hatásmechanizmusú gyógyszereket

használják, melyek két nagy csoportra oszthatók, a nem-szteroid gyulladáscsökkentőkre

(NSAID) illetve az opioidokra.

Az NSAID-ok akut, elsősorban gyulladással és szövetkárosodással járó fájdalomra hatnak

(pl. traumás vagy posztoperatív fájdalom). Hatásmechanizmusuk alapja, hogy képesek

gátolni a gyulladás vagy szöveti trauma következtében indukálódó ciklooxigenáz 2 (COX-

2) enzimet, melynek hatására csökken a szintetizálódott prosztaglandinok (PG)

mennyisége a perifériás szövetekben, így csökken a nociceptor szenzibilizáló

(hiperalgéziát okozó) hatásuk. A COX-2 enzim gátlásával, akadályozzák a gerincvelő

hátsó szarvában a PGE2 nociceptív, spinális neuronokon kifejtett szenzibilizáló hatását.

12

Gyulladásgátló hatásuk mellett láz és fájdalomcsillapító hatással is rendelkeznek.

Mellékhatásaik többsége az élettanilag fontos COX-1 enzim gátlása révén alakul ki.

Ismerünk COX izoenzimekre nem-szelektív, COX-2-preferenciális és COX-2-specifikus

szereket. Az áttörést jelentő COX-2-specifikus szerek sem váltották be a hozzájuk fűződő

reményeket. Ugyan a szelektivitás miatt a kialakuló gasztrointesztinális mellékhatásaik

minimálisak, azonban a kardiovaszkuláris rizikót jelentősen megnövelik.

Az opioidok hatékonysága nagy, ezért nagy intenzitású fájdalommal járó megbetegedések

(pl. malignus tumor) kezelésében alkalmazzák őket. Az opioidok mind a fájdalom

percepciójára, mind pedig a fájdalom affektív komponensére hatással vannak, csökkentik a

szorongást, emelik a fájdalomküszöböt. Hatásmechanizmusuk főként centrális

támadáspontú, melynek magyarázata a gerincvelő opioid receptor (μ, δ, κ) gazdagsága,

azonban perifériás támadásponttal is jellemezhetők, mivel µ-receptorok az érzőideg

végződéseken is megtalálhatók (Stein és mtsai. 1990, Mousa és mtsai. 2001, Atkinson

2013).

Bár a korábban felsorolt két csoportba tartozó vegyületek a legtöbb esetben hatékony

fájdalomcsillapítók, mégis egyes fájdalom állapotokban (pl. neuropátiás fájdalomban)

hatástalannak bizonyulnak. Ezen esetekben adjuváns analgetikumok alkalmazására van

szükség. Ebbe a típusba tartoznak triciklikus antidepresszánsok (pl. amitriptilin,

nortriptilin), egyes antiepileptikumok (gabapentin, pregabalin), illetve a helyi

érzéstelenítők (pl. lidocain). Azonban gyakran e szerek alkalmazása mellett sem kielégítő a

hatás, melynek eredményességét tovább csökkentik az esetenként súlyos mértékben

jelentkező mellékhatások, pl. a COX izoenzimre nem szelektív NSAID-ok alkalmazásakor

fellépő gasztrointesztinális és renális mellékhatások, vagy a hosszantartó opioid-kezelés

következtében jelentkező fizikai és pszichés dependencia, tolerancia, eufória,

légzésdepresszió, obstipáció vagy vizeletretenció.

Mindezek alapján sürgető olyan új típusú célmolekulák azonosítása, melyek a perifériás

nociceptorokon szeletíven ható fájdalomcsillapítók támadáspontjai lehetnek.

In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága

A rendelkezésre álló in vitro elektrofiziológiai (pl. 1 idegrost akciós potenciálját elvezető

technika, „patch-clamp”, Ca2+

-imaging technika) és különböző molekuláris biológiai

technikák alkalmazásával lehetőség nyílik a különböző receptorok aktivációs

mechanizmusainak, jelátviteli útvonalainak felderítésére, illetve a receptorokon ható

13

agonisták-antagonisták azonosítására. Azonban az egyes szerek szervezetben kiváltott

hatásainak komplex vizsgálatához nélkülözhetetlenek az élő állatokon (egereken,

patkányokon) elvégzett tesztek.

Az in vivo élő szervezetekben elvégzett kísérletek kifejezetten jelentős szerepet játszottak

olyan akut és krónikus fájdalomállapotok eseteiben is, ahol a perifériás input válaszok

tanulmányozása humán alanyokon nem vagy alig kivitelezhető (Staud 2013). Krónikus

fájdalom modellekben vizsgált fájdalmas stimulusok jelátviteli útvonalainak azonosítása,

feldolgozása és percepciójának feltérképezése is állatkísérletek bevonásával valósult meg

(Kuner 2007). Mivel a legtöbb humán betegség nem pontosan modellezhető

állatkísérletesen, a megfelelő preklinikai módszerek kidolgozása ezek miatt nagy

fontossággal bír.

ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK

1. In vivo fájdalomtesztek során alkalmazott készülékek módszertani fejlesztése,

komplex betegség modellek validálása és kidolgozása

2. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések komplex vizsgálata, az ezeken

található receptorok aktivációjának serkentése illetve gátlása különböző

farmakológiai vegyületekkel, továbbá szerepük meghatározása különböző fájdalom

és gyulladás-modellekben

AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA

Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek

A nocicepció vizsgálatára számos módszer áll a rendelkezésre, az értekezés alapjául

szolgáló kísérletek során főként a termonocicepció vizsgálata került fókuszpontba. Az

általam alkalmazott módszerek alapelveit és fontosabb jellemzőit az alábbiakban foglalom

össze, míg a részletes kísérleti protokollokat az egyes fejezetekben ismertetem.

A klasszikus, latenciaidő-mérésen alapuló termonocicepciós tesztekben küszöb feletti

állandó intenzitású ingereket alkalmaznak, és az elhárító reakció megjelenéséig eltelt időt

mérik. Ilyen módszer például az állandó hőmérsékletű (50-55°C) forró lap, mely esetben a

vizsgált állat ráhelyezésekor az összes végtag érintkezik az ingerforrással (Eddy &

Leimbach 1953).

14

5. ábra: Egyenletesen emelkedő

hőmérsékletű forró lap

4. ábra: Plantar teszt

6. ábra: Egyenletesen emelkedő

hőmérsékletű vízfürdő

Másik módszer a plantar teszt (Hargraeves és mtsai. 1988) (4. ábra), ahol állatokat egy

alulról üveg felületű műanyag dobozba

helyezik, majd egyik talpukat állandó

intenzitású fókuszált fénysugár

segítségével ingerlik. Abban a pillanatban,

amikor az állat elhúzta a lábát, a fókuszált

fény kialszik, és a kijelzőről az eltelt idő -

mely az elhárító reakció latenciaideje-

leolvasható.

Ezzel szemben az általunk bevezetett új

mérési módszerekben a kezdeti, viszonylag alacsony kiindulási hőmérséklet fokozatos

emelésével – melyet az elhárító reakció megjelenésekor azonnal leállítunk – pontosan

meghatározható a termonocicepciós küszöb. E módszerek igazi előnye megbízhatóságában

és jó reprodukálhatóságában rejlik, így kiváló alternatívájává vált a tradicionális

latenciaidő- meghatározáson alapuló teszteknek. Az a hőmérsékleti érték, melynél az állat

elhárító reakciót mutat, – megnyalja, megrázza vagy megemeli valamelyik hátsó végtagját

– a fájdalmas hőküszöb. Az egerek és patkányok lábon mért termális küszöbének

meghatározásához az IITC Life Science által gyártott emelkedő/csökkenő hőmérsékletű

forró/hideg lapot használtuk (Almási és mtsai. 2003) (5. ábra). Az állatok szabadon

mozogtak egy alulról fűthető/hűthető fém aljú plexidobozban. A fémlap fűtése

szobahőmérsékletről indult, sebessége kétféle lehet, egyrészt 6 °C / perc illetve 12 °C /

perc. A nocifenzív reakciót kiváltó hőmérsékleti érték elérésekor a lap fűtését/hűtést

azonnal leállítottuk, és az állatot eltávolítottuk.

15

7. ábra: Dinamikus plantáris eszteziométer

Elhárító reakció hiányában a melegítés minden esetben az 50 °C elérése után leállt,

tekintve, hogy e hőmérséklet felett jelentős szövetkárosodás jöhet létre. A készülék a lábon

mért fájdalmas hidegküszöbök vizsgálatára is alkalmasnak bizonyult hasonló elvek

alapján. A fájdalmas hideg küszöbök meghatározásakor a legkisebb beállítható érték a 0 °C

volt. A termonocicepció mérésére egy másik módszert is alkalmaztunk, az Experimetria

Kft.-vel közösen kifejlesztett és intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű

vízfürdőt (6. ábra) (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009).

Patkányok lábán mért fájdalmas hőküszöbök vizsgálatához az állatokat gyengéden tartva,

egyik hátsó végtagjukat egy vízzel teli tartályba merítettük, majd a tartály vizét 30°C-ról

indulva egyenletesen melegíteni kezdtük. A mérést egy pedál segítségével a nocifenzív

reakció megjelenésekor azonnal leállítottuk, és a kijelzőről leolvasott hőmérsékleti értéket

tekintettük a láb termális fájdalomküszöbének.

A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével

A talp érintési érzékenységét dinamikus

plantáris eszteziométerrel (Ugo Basile, Comerio,

Olaszország) vizsgáltuk (7. ábra). A készülék

lényegében egy módosított von Frey berendezés.

Az állatok szabadon mozogtak egy alul rácsos

ketrecben. Egy tükrös stimulátor segítségével

egy tompa végű tűt irányítottunk pontosan az

állat talpának közepére, mely emelkedésével

fokozatosan növekvő erőhatást fejt ki az adott

területre. A maximális erőhatást 10g-ban

határoztuk meg, míg a tűemelés sebességét 2,5 g/s-ra állítottuk. A mechanonociceptív

küszöb elérésekor,- vagyis annál az értéknél, amelynél az állat elhárító reakciót mutat,

tehát elhúzza a lábát-, a digitális számláló megáll, és az érték a kijelzőről grammban

leolvasható.

16

9. ábra: Incapacitance teszter

8. ábra: Pletizmométer

Egyéb in vivo vizsgálati módszerek:

Lábtérfogati változások mérése

A láb térfogatának változásait pletizmométerrel (Ugo

Basile, 7140, Comerio, Olaszország) (8. ábra) vizsgáltuk.

A készülék a közlekedőedények elve alapján működik. Két

folyadékkal jelig töltött edény csatlakozik egy

transzducerhez, mely detektálja az állat lábának

bemerítésekor kiszorított folyadék térfogatát. A digitális

kijelzőről leolvasható a láb térfogata cm3-ben. A kapott

adatokat a kezdeti kontroll értékekhez viszonyítva

százalékosan ábrázoltuk.

A spontán súlyeloszlás vizsgálata

A hátsó végtagok spontán

súlyeloszlását Incapacitance Tester

(Linton Instrumentation, Norfolk,

Egyesült Királyság) készülékkel

vizsgáltuk (9. ábra), mellyel a hátsó

végtagok nehézkedését lehet

detektálni. Alkalmazásával a

hiperalgézia mértéke meghatározható

a spontán súlyterhelés változásával. A

mérés egy plexiketrecben történik,

melynek aljába két digitális mérleget építettek. Az állatok hátsó végtagjaikkal ezekre a

mérlegekre állnak, míg mellső lábaikat egy ezzel 45°-os szöget bezáró plexilapra

támasztják. A mért értékeket a digitális kijelzőről grammban olvastuk le. Kontroll

körülmények között az állatok a két hátsó végtagjukat szinte azonos mértékben terhelik,

tehát a spontán súlyeloszlás 50-50%, mely fájdalom hatására eltolódik. A spontán

súlyeloszlás változását a végtagok értékeinek összehasonlításával százalékban fejeztük ki.

17

10. ábra: Open field teszt

11. ábra: Rotarod kerék

A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata

A spontán lokomotoros aktivitás mérésére

open field tesztet alkalmaztunk (10. ábra).

Az állatokat egy 16 egyenlő részre osztott,

felülről nyitott dobozba helyeztük, majd a

kísérlet 5 perce alatt videokamerával

detektáltuk a következő paramétereket:

mozgással vagy mosakodással eltöltött időt,

érintett mezők és ágaskodások számát,

illetve a doboz közepén töltött időt. Krónikus

fájdalom jelenlétében fokozódik a szorongás,

mellyel fordítottan arányos a mozgással és a doboz középén töltött idő, továbbá az

időegység alatt érintett mezők száma, míg a mosakodás, ágaskodás, és a sarokban töltött

idő azzal egyenesen arányos (Gaszner és mtsai. 2012).

A motoros koordináció vizsgálata

A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát

RotaRod (Ugo Basile, 37400, Comerio,

Olaszország) készülékkel vizsgáltuk (11. ábra).

Az egyensúlyozó képesség és az izomerő

vizsgálatához az állatokat egy egyenletesen

gyorsuló forgó hengerre helyeztük, majd a

leesésig eltelt időt detektáltuk. A forgó henger

fordulatszáma (rpm) az első 10 másodpercben

konstans 4 rpm volt, majd 5 perc alatt 40 rpm-re

gyorsult fel.

In vitro vizsgálati módszerek:

Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet homogenizátumokból

A gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározásához a kivett szövetmintákat apró

darabokra vágtuk, majd 2 ml jéghideg kétszer desztillált vízben homogenizáltuk 0 °C

fokon 2 percen keresztül 21.000 rpm-en, Miccra D-9 homogenizátorral (Art-moderne

18

Labortechnik, Németország). Ezután a mintákat lecentrifugáltuk (4 °C, 10000 rpm 10

percig), majd a felülúszókat összegyűjtöttük és további mérésig -20 °C-on tároltuk. A

szöveti homogenizátumokból meghatározható CGRP- és SP-szerű immunreaktivitás

mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk a korábban leírtak szerint

(Németh és mtsai. 1998, 1999). A vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex®

100™ x MAP módszerrel (Invitrogen gyulladásos panel egerekhez, AtheNA Multi-Lyte)

határoztuk meg a gyártó cég ajánlása szerint.

Etikai vonatkozások

A kísérleteink során alkalmazott vizsgálatok minden esetben megfeleltek az állatkísérletek

végzéséről szóló 243/1998. számú kormányrendelet előírásainak. A kísérleti eljárásokat a

Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottság javaslatára a

Baranya Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer-ellenőrzési Főosztály engedélyezte

(szám: BA 02/2000-9-2011). Kísérleteink során minden esetben eleget tettünk az IASP

által lefektetett állatkísérletekre vonatkozó etikai alapelveknek (Zimmermann 1983).

Minden esetben igyekeztünk a kísérlet elvégzéséhez szükséges legkisebb állatszámmal

dolgozni, és a kísérletbe bevont állatok szenvedését minimálisra csökkenteni.

19

12. ábra: A kapszaicin és reziniferatoxin

kémiai struktúrája

1. fejezet: TRPV1 receptor agonisták deszenzibilizáló

antinociceptív hatásainak vizsgálata fájdalmas hő- és

hidegküszöb mérésével patkányban

Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing

actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as

measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Eur. J. Pain

14 (5), 2010, 480-486. (megosztott első szerzős publikáció)

IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK

A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció

A kapszaicin-kutatás első adatai az 1870-es évekre

mutatnak vissza, Hőgyes Endre vizsgálta először a

csípős paprika anyagát, megállapítva, hogy az az

érzőidegekre hat (Hőgyes 1878). A hő, mechanikai

és kémiai ingerekkel is aktiválható polimodális

nociceptorok szerepének ˗ melyek a TRPV1

receptorokat is expresszálják ˗ vizsgálata a

kapszaicin szelektív aktiváló és az azt követő gátló

hatásának felismerésével kezdődött. A kapszaicin

kémiai struktúrája (12. ábra) 8-metil-N-vanillil-6-

nonénamid, mely hasonlít a vanillin szerkezetéhez.

A természetes körülmények között a marokkói

Euphorbia resinifera növényben előforduló

reziniferatoxin (RTX) (12. ábra) is képes a

TRPV1 receptort aktiválni. Kapszaicinnél százszor potensebb, vagyis meghatározott

koncentrációjú kapszaicin által kiváltott hatás eléréséhez az RTX százszor kisebb

koncentrációja is elegendő (Szolcsányi 1990, Szállási 1999).

Ha a receptor aktiválódik, Na+ és Ca

2+ ionok áramlanak be a sejtbe, melyet K

+ ion

kiáramlás követ. A beáramló Na+ ionok hatására a membrán depolarizálódik és kialakul az

akciós potenciál, ezáltal a fájdalomérzet (nocicepció), míg a sejtbe kerülő Ca 2+

ionok

hatására az idegvégződésből szenzoros neuropeptidek szabadulnak fel. Ha a TRPV1

20

tartósan vagy gyakran kerül aktivált állapotba, a sejten belüli kation koncentráció

megnövekszik, melynek következtében a citoplazma és a mitokondriumok megduzzadnak,

ezáltal a sejtek energiaforgalma csökken, majd idővel az idegvégződés működésképtelenné

válik. Ezt a folyamatot deszenzibilizációnak nevezzük, melynek két formája ismert.

Előkezelésként kis dózisban vagy rövidebb ideig alkalmazva adott kapszaicin és más

TRPV1 receptor agonisták hatására csak ezen anyagokra nézve szűnik meg a

válaszkészség, feltételezhetően ekkor csak a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik.

Magasabb koncentrációban és hosszabb ideig alkalmazva a kapszaicin-érzékeny érzőideg-

végződés válaszkészsége az összes ingerre nézve csökken vagy megszűnik, tehát mind a

hő, mechanikai és kémiai ingerekre egyaránt érzéketlen lesz. Ez esetben a TRPV1

receptort expresszáló nociceptív idegvégződés egészének funkciócsökkenéséről van szó,

melynek hátterében dózistól függően ultrastruktúrális vagy markánsabb morfológiai

eltérések állnak (Szolcsányi és mtsai. 1975, 1987, Szállási és mtsai. 1989, Bevan és

Szolcsányi 1990, Szolcsányi 1993).

N-oleoildopamin

Az N-oleoildopamin (OLDA) a TRPV1 receptor aktivátora, bár affinitása kisebb, mint a

kapszaicinnek (Chu és mtsai 2003, Szolcsányi és mtsai 2004). Az OLDA az N- acil

dopaminszármazékok családjába tartozik, melyek egy új csoportot alkotnak a biológiailag

aktív lipidek között. Mivel hosszú szénláncú telítetlen zsírsavak és a terminális részen

amino-csoportot tartalmazó dopamin kondenzációs termékei, ezért a dopamid elnevezést

kapták. Az OLDA-t eredetileg a központi idegrendszer striátum régiójában azonosították.

A perifériás szövetekben eddig még nem sikerült igazolni a jelenlétét, azonban a nem

neuronális eredetű dopamin fő forrása a mesenteriális szövetekben van. Ez felveti annak a

lehetőségét, hogy az OLDA a bélben is szintetizálódhat, azonban ennek mechanizmusai és

központi idegrendszeri jelentősége nem ismert (Chu és mtsai 2003).

21

CÉLKITŰZÉS

Célunk a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződés és a TRPV1 receptor

deszenzibilizációjának vizsgálata volt patkányok fájdalmas hő- illetve hidegküszöb

meghatározásán alapuló módszerekkel. Az idegvégződés deszenzibilizációjának

analíziséhez az állatok mindkét talpába beadott különböző koncentrációjú kapszaicin, RTX

vagy OLDA fájdalmas hideg- illetve hőküszöb befolyásoló hatásait monitoroztuk naponta.

Az agonisták TRPV1 receptor deszenzibilizáló tulajdonságainak vizsgálatához azok akut

TRPV1 receptor izgató (nocifenzív és hőköszöb-csökkentő) hatását elemeztük.

KÍSÉRLETI MODELLEK

Kísérleti állatok

Kísérleteinkhez 150-250 g közötti nőstény Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat

egy folyamatosan kontrollált, állandó hőmérsékletű és páratartalmú elkülönített

állatszobában tartottuk 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel és vízzel ad libitum ellátva.

A termonociceptív küszöbök meghatározása

Patkányok lábán mért fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök meghatározásához a már

ismertetett készüléket az emelkedő/csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lapot alkalmaztuk

(lásd 14. oldal). A fémlap fűtését/hűtését szobahőmérsékletről indítottuk, a hőmérséklet-

változás sebessége 6 °C/perc volt. A készüléken beállítható hűtési minimum érték 0 °C,

azonban a legkisebb detektálható hőmérséklet -1 °C volt, mivel a lap a minimum elérése

után passzívan tovább hűlt.

Az érzőideg-végződés deszenzibilizációjának vizsgálata

A TRPV1 receptort expresszáló szenzoros idegvégződések deszenzibilizációjának

vizsgálatához az állatok mindkét talpába egyszeri dózisban 100 µl–t injektáltunk

kapszaicin (3,3 nmol – 1 µmol) vagy RTX (0,016 – 0,5 nmol) illetve OLDA (5nmol - 1,25

µmol) különböző oldataiból. Mindkét talp kezelésére azért volt szükség, hogy az intakt

lábon esetlegesen korábban megjelenő elhárító reakciót kivédhessük. A fájdalmas hő-

illetve hidegküszöb meghatározását ezután naponta ismételtük addig, míg a kiindulási

kontroll értékekhez viszonyított szignifikáns különbség el nem tűnt, de maximum 14

napig. Kísérleteink egy részében a fájdalmas hő- és hidegküszöbök parallel vizsgálatait is

22

elvégeztük. Ugyanazon patkányok csoportjában meghatároztuk a fájdalmas hő és

hidegküszöb értékeket a kezelések előtt, a bilaterálisan beadott kapszaicin (0,1 és 1 µmol

i.pl.) vagy RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) kezelés után, majd 1 héten keresztül naponta

detektáltuk a termonociceptív küszöbök változásait (mivel a hidegküszöb értékek kevesebb

mint 7 nap alatt visszatértek a kontroll szintre, ezért a méréseket nem folytattuk tovább).

A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata

A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálatához az állatok egyik talpát RTX vagy

OLDA injekcióval kezeltük, majd a kezelés hatására kialakuló akut válaszokat – a

nocifenzív viselkedés és a fájdalmas hőküszöb csökkenés – detektáltuk. (Almási és mtsai.

2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Az akut nocifenzív viselkedés kvantifikálásához a láb

nyalásával, rázásával és emelésével töltött időt mértük, míg a hőküszöbcsökkenést 5

perccel az RTX és 10 perccel az OLDA injekció után határoztuk meg az emelkedő

hőmérsékletű forró lappal. Kapszaicint kísérleteink e részében azért nem alkalmaztunk,

mert korábbi kísérleteinkben nem találtunk olyan dózist, amely reprodukálható

hőküszöbcsökkenést indukált volna.

Az állatok egyik talpába 50 µl RTX-et (0,016 nmol) vagy annak vehikulumát injektáltuk és

a küszöbcsökkenést detektáltuk. 3 órával később újra meghatároztuk a hőküszöböt és

ismételten 0,016 nmol RTX-et injektáltunk a korábban kezelt talpba (1. táblázat). Ezt

követően ismét elvégeztük a nocifenzív viselkedés időtartamának mérését és a

termonociceptív küszöb vizsgálatát. Az állatok további két csoportját OLDA-val (250

nmol, 50 µl i.pl.) vagy annak vehikulumával (50 µl i.pl.) kezeltük és a kialakuló nocifenzív

viselkedés időtartamát és a hőküszöbcsökkenést detektáltuk. 3 óra elteltével megmértük a

termonociceptív hőküszöböket, majd ismételten mindkét csoport állatainak korábban

kezelt talpába 50µl kisebb koncentrációjú OLDA oldatot (5 nmol i.pl.) injektáltunk. Ezt

követően az OLDA által kiváltott elhárító reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést

ismét detektáltuk. A kialakuló deszenzibilizáció specifitásának vizsgálatához azonos

koncentrációjú RTX (0,016 nmol), vagy vehikulum előkezelés (3 órával korábban) után az

állatok két csoportjának talpába 1% formalint injektáltunk, majd vizsgáltuk a nocifenzív

reakciókra gyakorolt hatást. Az OLDA és RTX között lehetséges kereszt-deszenzibilizáció

megfigyeléséhez az állatokat intraplantárisan 50µl OLDA-val (250 nmol) vagy annak

vehikulumával előkezeltük, 3 óra elteltével az azonos talpat RTX-szel (0,016 nmol)

23

kezeltük, majd a hatására létrejövő nocifenzív reakció időtartamát és a termonociceptív

küszöbváltozását mértük.

1. stimulus 2. stimulus vizsgálatok célja

RTX RTX homológ deszenzibilizáció

OLDA OLDA homológ deszenzibilizáció

RTX formalin deszenzibilizáció specifitása

OLDA RTX kereszt-deszenzibilizáció

1. táblázat: A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata során alkalmazott kezelés-kombinációk.

Felhasznált anyagok

A kapszaicint, a Sigma (St. Louis, USA), az N-oleolil-dopamint a Tocris Cookson

(London, Egyesült Királyság) cégektől szereztük be. Mindkét anyagból törzsoldatot

készítettünk (10 mg/ml illetve 5 mg/ml), 10% etanol, 10% Tween 80 és fiziológiás sóoldat

felhasználásával. A kísérlet elején reziniferatoxinból (Sigma St. Louis, USA) 1 mg/ml-es

törzsoldatot készítettünk 96%-os etanol felhasználásával, majd azt fiziológiás sóoldattal

hígítottuk tovább a megfelelő koncentrációkra.

Statisztikai analízis

A kapott eredmények átlagait és azok standard hibái (SEM) feltüntetésével ábrázoltuk.

Ugyanazon állatok különböző időpontokban vizsgált fájdalmas hő- illetve hidegküszöb

analízisére egyutas ANOVA-t, majd ezt követően Neumann-Keuls post hoc tesztet

alkalmaztunk. Az önkontrollos kísérletekben, az RTX ismételt adása által kiváltott

nocifenzív reakciók és a küszöbcsökkenések összehasonlítására Student-féle egymintás t-

tesztet használtunk. A nem önkontrollos kísérletekben a küszöbcsökkenések, illetve a

nocifenzív viselkedések összehasonlító vizsgálatához Student-féle kétmintás t-tesztet

alkalmaztunk. Az eredmények összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001

értékeket fogadtuk el szignifikánsnak.

24

EREDMÉNYEK

Az intraplantárisan adott kapszaicin, illetve RTX dózisfüggő módon megemelte az

egymást követő napokon vizsgált nociceptív hőküszöb értékeket (13. ábra). A minimális

effektív dózis (az a legkisebb dózis, mely a kísérlet bármely mérési időpontjában

szignifikáns hőküszöbemelő hatással bír), kapszaicin esetében 10 nmol, míg RTX esetében

0,05 nmol volt. A maximális küszöbemelkedés 2,3 + 0,5 °C volt az általunk alkalmazott

kapszaicin dózisoknál, míg ez az RTX esetében 2,8 + 0,5 °C volt. Mindkét vizsgált

agonista által kiváltott hatás időtartama dózis-függő volt: a kapszaicin 10-33 nmol és RTX

0,05 nmol koncentrációja reverzibilis hőküszöbemelő hatással bírt, mely 2-5 napnál tovább

nem állt fenn. A kapszaicin nagyobb koncentrációban 11 napig, az RTX pedig 9 napig

fennmaradó hőküszöbemelő hatást váltott ki. A legnagyobb alkalmazott RTX dózis által

kiváltott hőküszübemelő hatás monitorozását a 9. napon abbahagytuk, mivel az 5. és 9. nap

között mért értékek 2 °C-kal voltak magasabbak a kiindulási kontrollhoz képest, és

semmilyen csökkenő tendenciát nem mutatta. A tesztelt szerek oldószerei és az OLDA

egyik vizsgált koncentrációja sem rendelkezett szignifikáns hőküszöbemelő hatással (nem

ábrázolt adat).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1442

43

44

45

46

47

48

49

50

3,33

10

33

100

330

nmol kapszaicin i. pl.

Kontroll

**** *

**

*

**

* ** ***

*

** *

* ***

**

A

napok

No

cic

ep

tív

hő

kü

szö

b (

°C)

25

1 2 3 4 5 6 7 8 942

43

44

45

46

47

48

49

500,016

0,05

0,16

Kontroll

nmol RTX i.pl.

* * ** *

* * *

** *

* **

B

napok

No

cic

ep

tív

hő

kü

szö

b (

°C)

13. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A) vagy RTX (B) hatására kialakult hőküszöb változások,

melyeket naponta, emelkedő hőmérsékletű forró lappal mértünk. A csillagok a kiindulási kontroll

hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8-12, * p <0,05; egyutas ANOVA,

Neumann-Keuls post hoc teszt).

Az egyenletesen csökkenő hőmérsékletű hideg lapon mért fájdalmas hidegküszöbök átlaga

kezeletlen patkányokban 1,3 + 0,2°C volt, mely 5 napon keresztül a naponta ismételt

mérések során jól reprodukálhatónak bizonyult (nem ábrázolt adat). A hideg által kiváltott

nocifenzív reakciók lényegében megegyeztek a hőküszöb vizsgálatok során leírtakkal (láb

nyalása, emelése). A fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök párhuzamos vizsgálata során

csak a kapszaicin (0,1 és 1 µmol i.pl.) és RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) nagyobb dózisai

okoztak szignifikáns csökkenést a hidegküszöb értékekben (14. ábra B és C). Fontos

megemlíteni, hogy a kapszaicin bár mindkét vizsgált dózisban hasonló mértékű csökkenést

okozott a hidegküszöb értékekben, addig hőküszöb emelő hatása dózisfüggő volt (14. ábra

A és D). A hideggel szembeni deszenzibilizáció dózis-függőségének látszólagos hiányát

feltehetően az a tény okozta, hogy a készülékkel -1 °C-nál alacsonyabb hőmérsékletet nem

tudtunk mérni. Mindkét vizsgált anyag esetében, ugyanazon állatok hidegküszöb értékei 2-

4 nap alatt visszaálltak a kiindulási kontroll állapotba, még mielőtt a fájdalmas hőküszöb

értékek normalizálódtak volna.

26

1 2 3 442

43

44

45

46

47

48

49

50 Kapszaicin 0,1 mol i.pl.Kapszaicin 1 mol i.pl.

Kontroll

*

** **

***

*

7

napok

No

cic

ep

tív

h

ők

üs

zö

b (°C

)

1 2 3 442

43

44

45

46

47

48

49

50RTX 0,16 nmol i.pl.RTX 0,5 nmol i.pl.

Kontroll 7

**

**

*

* **

*

napok

No

cic

ep

tív

h

ők

üs

zö

b (°C

)

1 2 3 4

0

2

4

Kapszaicin 0,1 mol i.pl.Kapszaicin 1 mol i.pl.

Kontroll

*

*

*

*

*

*

*

7

napok

No

cic

ep

tív

h

ide

gk

üs

zö

b (°C

)

1 2 3 4-1

0

1

2

3

4RTX 0,16 nmol i.pl.RTX 0,5 nmol i.pl.

Kontroll 7

*

*

*

*

napok

No

cic

ep

tív

h

ide

gk

üs

zö

b (°C

)

A

B

C

D

14. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A-B) és reziniferatoxin (C-D) hő-és hidegküszöb befolyásoló

hatásainak párhuzamos vizsgálata emelkedő illetve csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lappal. A csillagok a

kiindulási kontroll hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8, p <0,05; egyutas

ANOVA, Neumann-Keuls post hoc teszt).

Korábbi eredményekkel összhangban (Almási és mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004,)

az intraplantárisan beadott 0,016 nmol RTX illetve 5 nmol OLDA akut elhárító reakciót

(érintett végtag rázása, nyalása) váltott ki, mely 5 illetve 10 percen belül megszűnt (15.

ábra felső rész). Mindkét agonista hatására egy jól kifejezett, 8-10 °C-os

hőküszöbcsökkenés jött létre, (15. ábra alsó rész) mely 30 perc elteltével megszűnt. A

kezeléseket követő 3. órában mért fájdalmas hőküszöb értékek statisztikailag nem

különböztek a kiindulási kontroll értékektől (nem ábrázolt adat). A TRPV1 receptor kémiai

ingerekkel szemben mutatott deszenzibilizációjának mértékének meghatározásához, a

patkányok előzőleg kezelt talpába a korábbival megegyező dózisú RTX-et (0,016 nmol)

illetve OLDA-t (5 nmol) injektáltunk. A 3 óra elteltével adott második RTX injekció

hatására mind a nocifenzív reakció időtartama, mind pedig a hőküszöbcsökkenés mértéke

27

szignifikánsan kisebb volt az első RTX injekció által kiváltott válaszoknál (15. A). 250

nmol OLDA előkezelés után 3 órával a kezelt talpba beadott kisebb dózisú (5 nmol)

OLDA szignifikánsan csökkentette mind a nocifenzív reakció időtartamát, mind pedig a

hőküszöb csökkenést az előkezelés után vehikulumot kapott csoporthoz képest (15. B).

Ugyanakkor az azonos dózisú RTX nem okozott szignifikáns változást a 3 órával később

beadott TRPA1 agonista formalin (McNamara, 2007) 1%-os oldatával kiváltott a

nocifenzív reakció időtartamában (15. A). Az OLDA előkezelés (250 nmol i.pl.)

ugyancsak csökkentette 3 óra múlva a kezelt talpba beadott RTX (0,016 nmol) akut

hatásait a vehikulumos előkezelést kapott állatokkal összehasonlítva. Tehát az elhárító

reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést is mérsékelte (15. C), mely a két TRPV1

agonista között létrejövő kereszt-deszenzibilizációra utal.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

i.pl. RTX utánkontroll/szolvens i.pl.

RTX i.pl. FORMALIN i.pl.

*

No

cifen

zív

reakció

id

őta

rtam

a (

s)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200szolvens + OLDA i.pl.

*

OLDA + OLDA i.pl.

No

cif

en

zív

reakció

idő

tart

am

a (

s)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

szolvens + RTX i.pl.

*

OLDA + RTX i.pl.

No

cif

en

zív

re

ak

ció

id

őta

rta

ma

(s)

0

2

4

6

8

10

12

Hő

kü

szö

b c

sö

kk

en

és

(°C

)

*

0

2

4

6

8

10

12

14

16Hő

kü

szö

b c

sö

kken

és (

°C)

*

A B C

0

2

4

6

8

10

12Hő

kü

szö

b c

sö

kken

és (

°C)

*

15. ábra: Előkezelésben (3 órával a kezelés előtt) alkalmazott intraplantáris RTX (0,016 nmol, A) vagy

OLDA (250 nmol, B-C) elhárító reakciót kiváltó és hőküszöb-csökkentő hatásai ugyanazon talpba adott

ismételt kezelést (0,016 nmol RTX vagy 5 nmol OLDA) követően. Az ábra A része az ismételt RTX kezelés

hatásait, illetve az RTX előkezelés utáni 1 %-os formalin által kiváltott nocicepciót szemlélteti. A B rész a

kétszeri OLDA injekció hatásait, míg a C rész az OLDA előkezelés utáni RTX által kiváltott válaszokat

szemlélteti. A csillagok a statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik a kétszeri RTX adás által kiváltott

küszöb-csökkenések között (A, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt), illetve az agonista- és szolvens-

kezelt csoportok között (B és C, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt).

28

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Munkacsoportunk korábbi közölt kísérleteiben sikeresen validálta az emelkedő

hőmérsékletű „forró lap” (hot plate) módszerét, mellyel megbízható módon ismételhető

mérésekkel naponta meghatározhatók a patkányok fájdalmas hőküszöb értékei (Almási és

mtsai. 2003). A patkányokon végzett szisztémás kapszaicin kezelés hosszantartó termális

antinociceptív hatása a tradícionális, állandó hőmérsékletű forró lap és „tail flick”

módszerekkel vizsgálva ellentmondásos (Szolcsányi 1976, Obál és mtsai. 1979, Hayes és

Tyers 1980, Gamse 1982, Bittner és Lahann, 1984), ugyanakkor elektrofiziológiai

kísérletekben teljes egészében deszenzibilizálja a kapszaicin-érzékeny polimodális

nociceptorokat (Szolcsányi 1987, Szolcsányi és mtsai. 1988). A kapszaicin hosszantartó

dózisfüggő termális antinociceptív hatását patkányokban korábban már leírták (Szolcsányi

1985), de a mérésére alkalmazott technika nem volt megfelelő a fájdalmas hőküszöb

pontos meghatározására. Jelen kísérleteinkben a lokálisan (talpba adott) alkalmazott

kapszaicin és RTX tartós hőküszöb emelkedést okozott, ezáltal jelezve a termális

antinocicepciót. Az általunk megállapított minimális effektív dózisok összehasonlításakor

az RTX a kapszaicinnél kb. kétszázszor potensebbnek bizonyult, tehát ugyanazon hatás

kiváltásához kétszázszor kisebb koncentrációja is elegendő volt. Ez megegyezik azon

korábbi irodalmi adatokkal, melyek szerint az RTX jellemzően a deszenzibilizációban

nagy hatáserősséggel rendelkezik (Szállási és Blumberg, 1999). Mindkét hatóanyag

maximális küszöbemelő hatása közel azonos volt, alátámasztva teljes TRPV1 receptor

agonista hatásukat (Ralevic és mtsai. 2003).

Mind a kapszaicin, mind az RTX hőküszöbemelő hatásának időtartama dózisfüggő volt: az

alacsonyabb dózisok hatásai 2-5 napig tartottak, míg nagyobb dózisok esetében a hatás

több mint egy hétig, de legfeljebb 11 napig volt megfigyelhető. Korábbi tanulmányokban

is hasonló eredményeket kaptak klasszikus, latenciaidő mérésen alapuló termonocicepciós

módszerekkel (Xu és mtsai. 1997, Neubert és mtsai. 2003, Pan és mtsai. 2003, Karai és

mtsai. 2004). Ezzel szemben kapszaicin perineurális alkalmazásakor már a küszöbdózis is

sokáig fennmaradó termális válaszkészség csökkenést idézett elő, mely a kísérlet 120 napja

alatt sem normalizálódott (Szolcsányi 1993).

Érdemes megemlíteni, hogy a hot plate módszerrel a lábon mért hőküszöb értékek nem

változtak sem TRPV1 génhiányos egerekben, sem pedig patkányokban előkezelésként

helyileg talpba adott TRPV1 antagonista, a jód-reziniferatoxin után (Almási és mtsai.

29

2003). Hasonlóan, a TRPV1 receptor szerepe nem volt igazolható termonocicepcióban a

klasszikus latenciaidő mérésen alapuló módszerekkel sem TRPV1 génhiányos egerek in

vitro kísérleteiben, sem pedig in vivo viselkedés vizsgálatokban (Caterina és mtsai. 2000,

Davis és mtsai. 2000, Woodbury és mtsai. 2004, Zimmermann és mtsai. 2005). Mindezek

alapján a kapszaicin és RTX kísérleteinkben tapasztalt hőküszöbemelő hatása sem tudható

be kizárólag a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésen található TRPV1 receptor

deszenzibilizációjának. Az általunk kiváltott hosszantartó hőküszöb emelő hatás hátterében

a funkcionális deszenzibilizáció vagyis a TRPV1 receptort expresszáló polimodális

idegvégződések károsodása állhat, melynek következtében minden őket ért ingerre kevésbé

reagálnak. Kapszaicin és RTX in vivo nagyobb dózisú alkalmazása során az

ultrastrukturális változásokon kívül (Szolcsányi és mtsai. 1975), a sejten belüli Ca2+

szint

hosszantartó és nagymértékű emelkedése az idegvégződés degenerálódásához vezet

(Simone és mtsai. 1998, Dux és mtsai. 1999, Nolano és mtsai. 1999). In vitro kísérletekben

kapszaicin és RTX kisebb, deszenzibilizáló dózisainak alkalmazásakor csak funkcionális

elváltozások jelentek meg, többek közt gátlódtak a feszültségfüggő Na+ és Ca

2+ csatornák

(Liu és mtsai. 2001, Wu és mtsai. 2005). A jelentős neurotoxikus hatást cáfolják a

reverzibilis elváltozások. A csak pár napig fennálló, alacsonyabb dózisú RTX vagy

kapszaicin által kiváltott hőküszöb emelkedés legvalószínűbb magyarázata a

kapszaicin˗érzékeny érzőideg˗végződések funkcióinak reverzibilis károdása, nem pedig a

neurotoxikus hatás. Ez pedig teoretikusan új támadáspontot jelenthet új típusú, perifériás

fájdalomcsillapítás területén.

A nemrég azonosított TRPV1 receptor agonista OLDA 50-szer gyengébb

hatáserősségűnek és körülbelül 40%-kal kisebb hatékonyságúnak bizonyult a

kapszaicinhez viszonyítva, in vitro patkányok heterológ módon expreszált TRPV1

receptorainak Ca2+

beáramlás vizsgálataiban (Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezzel ellentétben

a kapszaicin minimális effektív dózisánál 125- ször nagyobb dózisban beadott OLDA sem

okozott hosszantartó hőküszöbemelkedést. Ezért feltételezhetjük, hogy ennél az OLDA

dózisnál a receptor okkupancia már 100 %-os volt, tehát az OLDA kezelés következtében

elmaradó hőküszöbemelkedés az OLDA korlátozott hatékonyságával magyarázható. Ezt

alátámasztja egy másik tanulmány is, melyben az OLDA parciális agonistának bizonyult

patkányokban, viszont humán vizsgálatokban nem (Chu és mtsai. 2003). Az OLDA által

kiváltott TRPV1 receptor aktivációja következtében beáramló Ca2+

ionok megelőzik a

30

polimodális nociceptív idegvégződések károsodásához vezető folyamatokat, azáltal, hogy

deszenzibilizálják a receptort.

A hidegérzékenységet párhuzamosan vizsgáltuk a forró ingerek által kiváltott

hőérzékenységgel patkányok ugyanazon csoportján csökkenő/emelkedő hőmérsékletű

hideg/forró lappal. Érdekes, hogy míg az emberben mért fájdalmas hidegküszöb értékek

15°C körül vannak (Davis és Pope 2002), addig méréseink alapján patkányok ezen értékei

sokkal alacsonyabbak, 2°C körüliek. A hidegérzékenység nem tipikusan a polimodális

nociceptorok által mediált folyamat, azonban egy kisebb részük szerepet játszhat a nagy

intenzitású hideg ingerek detektálásában (Leem és mtsai. 1993). A fájdalmas intenzitású

hideg ingerek érzékeléséért leginkább a C és Aδ mechano-hideg érzékeny nociceptorok a

felelősek (Simone és Cajander, 1996). A jelenleg ismert hideg által stimulálható ion

csatornák a TRP család tagjai, a TRPM8 (McKemy és mtsai. 2002, Peier és mtsai. 2002) és

a TRPA1 (Story és mtsai. 2003), melyek in vitro körülmények között 25°C, illetve 17°C

körüli küszöbhőmérsékletnél kerülnek aktivált állapotba. Tudomásunk szerint elsőként

szolgáltattunk adatokat a TRPV1 agonisták hosszantartó hatásainak szerepéről a hideg

nocicepcióban. A kapszaicin és RTX hatására létrejövő hidegküszöbcsökkenés

legvalószínűbb magyarázata a TRPV1 receptort is expresszálni képes hidegérzékeny

nociceptorok károsodása lehet. Ezt a magyarázatot támasztja alá Story és mtsai 2003-ban

megjelent publikációja, mely szerint a TRPA1 és TRPV1 receptorok az esetek nagy

részében koexpresszálódnak a hátsó gyöki ganglionok neuronjaiban. A TRPV1 receptor

agonisták által a hideg-érzékeny nociceptorok végződésein kiváltott deszenzibilizáció

molekuláris mechanizmusa mindezidáig ismeretlen, de hasonló funkcionális eltéréseket

tapasztaltunk, mint a hőérzékeny polimodális nociceptorok esetében. Azon megfigyelés,

mely szerint a hidegküszöb értékek hamarabb térnek vissza a kontroll, kiindulási szintre,

mint ahogy a hőküszöb értékek normalizálódnának, arra enged következtetni, hogy a

fájdalmas intenzitású hő- illetve hideg-válaszkészség ˗ legalább részben ˗ különböző

rostokon közvetítődik.

Kutatócsoportunk korábbi eredménye, hogy a talpba adott RTX vagy OLDA az állatokban

akut nocifenzív reakciót vált ki, és jelentős hőküszöbcsökkentő hatással bír (Almási és

mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezen akut hatások kísérleteinkben szinte teljesen

kivédhetők voltak, ha az állatokat intraplantárisan hosszantartó hőküszöbemelő hatással

nem rendelkező dózisú ugyanazon TRPV1 agonista előkezelésben részesítettük. A kapott

eredményekből kitűnik, hogy ez esetben maga a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik, nem

31

pedig az egész érzőideg˗végződés. Kísérleteinkben a kis dózisú RTX ismételt adása gátolta

a hatására kialakuló akut elhárító reakciók megjelenését. Ugyanakkor nem befolyásolta a

formalin okozta akut nocifenzív reakciókat, tehát ez azt bizonyítja, hogy a receptor

deszenzibilizációja az érzőideg-végződés funkciójának károsodása nélkül valósult meg. A

TRPV1 receptor deszenzibilizációja következtében nem változik meg azon ágensek hatása,

melyek a receptort nem, de az őt expresszáló afferenseket aktiválni képesek. Ilyen ágens

például a TRPA1 ioncsatorna egyik aktivátora, a formalin (McNamara és mtsai. 2007). Az

általa kiváltott nocifenzív reakciók nagy dózisú kapszaicin előkezeléssel meggátolhatók

(Chen és mtsai. 2007), következésképp a formalin képes aktiválni a kapszaicin-érzékeny

afferenseket. Az OLDA előkezelés hatására megszűnő akut RTX hatások alátámasztják az

OLDA és RTX között kialakuló kereszt-deszenzibilizáció lehetőségét. A TRPV1 receptor

deszenzibilizációja jellegében hasonlít a TRPV1 génhiányos egereknél tapasztaltakhoz,

ahol elmarad a hőküszöbemelő hatás, mivel a termonociceptív csatornák elvesztik

válaszkészségüket.

Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris adása

után erőteljes hiperalgézia alakult ki, melynek mértékét több napon keresztül mindkét

hőmérsékleti tartományban meghatároztuk. A hidegtartományban a kezelés hatására

lecsökkent fájdalomküszöb értékek gyorsabban normalizálódtak a meleg tartományban

mért fájdalmas hőküszöb értékeknél. Ezen változások a TRPV1 receptort expresszáló

szenzoros neuronok perifériás végződéseinek funkcionális deszenzibilizációját jelzik.

Továbbá felelőssé tehetők a fájdalmas hő illetve hideg által kiváltott válaszok

elmaradásáért, azonban feltételezhetően különböznek a kis dózisú RTX illetve OLDA által

kiváltott TRPV1 receptor deszenzibilizációtól. A deszenzibilizáció mindkét típusa nagy

jelentőséggel bír a periférián ható új tipusú analgetikumok kifejlesztésének szempontjából

(Immke és Gavva, 2006). A TRPV1 receptor deszenzibilizáció során funkcionálisan

hasonló állapot jön létre, mint amilyen az újonnan kifejlesztett periférián ható TRPV1

receptor antagonisták alkalmazása során várható. Az idegvégződés deszenzibilizációja

azonban a fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, TRPV1 agonisták (pl.

kapszaicin˗Qutenza tapasz vagy RTX-klinikai vizsgálat alatt) helyileg alkalmazva

neuropátiás vagy más fájdalom állapotok kezelésére alkalmas (lásd 2. fejezet). Ezért az

általunk alkalmazott fájdalmas küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika, a későbbiek

során új típusú in vivo preklinikai szűrő módszerként szolgálhat.

32

2. fejezet: TRPV1 antagonisták hatásainak vizsgálata különböző

termális hiperalgézia modellekben

Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C.,

Szolcsányi J., Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor

antagonist compounds SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal

hyperalgesia measured with an increasing-temperature water bath.

Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141.


A preklinikai kutatások során számos olyan molekuláris mechanizmust azonosítottak,

melyek szerepet játszanak a fájdalom kialakulásában és fenntartásában, ezáltal kiváló

célpontok lehetnek a gyógyszerfejlesztés során. A tény, hogy a TRPV1 receptor a

fájdalmas ingerek molekuláris integrátora, világszerte elfogadottá vált (Tominaga és mtsai.

1998). Központi szerepet játszik a perifériás szenzitizáció folyamatában (Immke és Gavva

2006), továbbá a gyulladás vagy sérülés hatására kialakuló upregulációs és szenzitizációs

folyamatokban (Bishnoi és Premkumar 2011). Tekintve, hogy nagyszámú endogén

fájdalomkeltő (nociceptív) / szenzitizáló ágens hat ezen az ioncsatornán, ezért a receptor

ígéretes célpontja lehet olyan új típusú analgetikus vegyületek fejlesztésének, melyek

direkt módon blokkolják a perifériás nociceptorokat (Brederson és Szállási 2013).

Az egyik elsőként kifejlesztett TRPV1 receptor blokkoló a kapszazepin (CZP) volt, melyet

a farmakológiai kutatásokban mind in vivo, mind pedig in vitro intenzíven használtak

klasszikus kompetitív antagonistaként (Maggi és mtsai. 1993, Walpole és mtsai. 1994).

Hátránya, hogy a TRPV1 receptorra nézve nem szelektív, gátolja a nikotin receptorokat, a

feszültségfüggő Ca2+

csatornákat (Szállási és mtsai. 2007), illetve a TRPM8 ioncsatornát

(Weil és mtsai. 2005) is. Ezért számos gyógyszercég invesztált nagy összegeket olyan új,

szelektív TRPV1 antagonisták fejlesztésébe, melyek kiváló alapjai lehetnek új, hatékony

fájdalomcsillapító gyógyszereknek. Az újonnan fejlesztett szintetikus vegyületek (lásd 3.

táblázat), hasonlóak a CZP-hez, mely a csatorna pórus régiójába kötődik és a tetramer

ioncsatorna összes monomerjének oldalláncával kapcsolatot (Messeguer és mtsai. 2006).

Kísérleteink során az intézetünkben korábban beállított három eltérő kinetikájú termális

hiperalgézia modellt alkalmaztunk. A termális küszöbcsökkenést egyrészt a TRPV1

receptor direkt aktivációja révén váltottuk ki potens receptor agonista RTX-szel.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014488613003130#bb0070

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014488613003130#bb0160

33

Vizsgáltuk továbbá a termonociceptív küszöbcsökkenést enyhe hőtraumával illetve

plantáris talpbőr incízióval kiváltott hiperalgézia modellekben, mivel ezekben az

állaptokban a TRPV1 receptor feltehetően fontos szerepet játszik a hőhiperalgézia/

szenzibilizáció közvetítésében (Bölcskei és mtsai. 2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és

Brennan 2009), így várhatóan alkalmasak TRPV1 antagonisták tesztelésére.

A megbízhatóan működő preklinikai fájdalomtesztelő módszerek fejlesztése nagy

fontossággal bír, hiszen alkalmazásukkal csak az igazán hatékony gyógyszerjelölt

molekulák válhatnak a rendkívül költséges klinikai tanulmányok főszereplőivé.

CÉLKITŰZÉSEK

PhD munkám e részének vizsgálata során a következő célokat tűztük ki:

1.) Három különböző gyógyszercég által kifejlesztett TRPV1 receptor antagonista vegyület

(SB705498, BCTC és AMG9810) hatásának összehasonlítása RTX által kiváltott, plantáris

bőr-izom incíziót követő, illetve enyhe hőtrauma következtében kialakuló

hőhiperalgéziában, melyet a fájdalmas hőküszöbök mérésével határoztunk meg az

intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével.

2.) Ezen antagonisták hatásainak vizsgálata az RTX által indukált hőhiperalgézia

modellben az elhárító reakció latenciaidejének mérésével plantár-teszt módszerrel. A

klasszikus latenciaidő mérésen alapuló és az általunk korábban kifejlesztett

fájdalomküszöb-mérő módszer érzékenységének összehasonlítása.


Kísérleti állatok:

Kísérleteinkhez 140-200 g közötti nőstény Sprague-Dawley patkányokat használtunk,

melyeket a Harlan cégtől vásároltunk. Az állatokat egy állandó hőmérsékletű és

páratartalmú elkülönített állatszobában tartottuk, 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel

és vízzel ad libitum ellátva.

RTX-szel kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés

A fájdalmas hőküszöbcsökkenést a potens TRPV1 agonista RTX-szel váltottuk ki (Almási

és mtsai. 2003). A kontroll mérések elvégzése után előkezelésként TRPV1 antagonista

vegyületeket vagy azok vehikulumát adtunk szájon át (0,5 ml / 100 g per os), majd 1 óra

34

elteltével 0,01 µg RTX-et injektáltunk a patkányok egyik hátsó lábának talpába. Az

előkezelésre azért volt szükség, mert irodalmi adatokból ismert (Almási és mtsai. 2003),

hogy az RTX küszöbcsökkentő hatása 25 percnél rövidebb ideig tart, azonban ez az

időtartam vélhetően nem elegendő az orálisan adott antagonisták teljes felszívódásához. Az

RTX kezelést követő 5., 10., 15., 20. percben meghatároztuk a fájdalmas hőküszöb

értékeket emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (lásd 15. oldal).

Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés

Patkányok hátsó lábán mért hőküszöb csökkenést enyhe hőtraumával váltottunk ki.

Korábbi eredményeink alapján ismert, hogy az enyhe hőtrauma alkalmazása minimum 1

óráig fennmaradó hőhiperalgéziát eredményez (Bölcskei és mtsai. 2007). A kontroll

mérések elvégzése után az állatokat halotánnal altattuk, majd az egyik hátsó lábukat 20 s-ig

51°C -os forró vízbe merítettük. A pár perces altatást követő ébredés után a hőtrauma

alkalmazását követő 10. és 20. percekben poszttraumás kontroll hőküszöb méréseket

végeztünk, hogy megállapítsuk a hiperalgézia tényleges kialakulását. Azon állatokat,

amelyeknél a minimális 3°C-os hőküszöbcsökkenés nem jött létre, nem vizsgáltuk tovább.

A hőtraumát követő 20. percben az antagonistákat illetve azok vehikulumát

intraperitoneálisan (i.p. 0.5 ml / 100 g) adtuk, majd 40, 50, és 60 percnél ismételten

meghatároztuk az állatok fájdalmas hőküszöbét. Az antagonisták orális adása ez esetben

nem volt célszerű, mivel viszonylag rövid idő (20 perc) telt el a kezelés és az első mérés

között. Ezen időtartam pedig nem elegendő a maximális orális hasznosulás eléréséhez.

Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés

A hőküszöbcsökkenést az állatok egyik hátsó lábán elvégzett talpi incíziós műtéti eljárással

váltottuk ki (Füredi és mtsai. 2009). A kontroll hőküszöb mérések után, a patkányokat

pentobarbitállal (50 mg / kg i.p.) elaltattuk, majd fél cm-re a saroktól 1 cm hosszan a talp

középvonala mentén bemetszettük a bőrt, az izmot és az inakat is (16. ábra). A sebet 4.0

fonallal zártuk, majd Betadine-nal ecseteltük be. 24 órával a műtét után újabb kontroll

hőküszöb mérést végeztünk a hiperalgézia kialakulásának megállapításához, melyet 30

perc múlva ismételtünk. Az antagonisták illetve a vehikulum orális adása (p. o. 0,5 ml /

100 g) után 1, 2, 3, 4 óra múlva a termonocicepciós küszöbök ismételt mérésével

vizsgáltuk a hiperalgéziát.

35

16. ábra: Plantáris bőr-izom incízió

RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés)

Az általunk fejlesztett hőküszöb-mérő módszer érzékenységének vizsgálatához az állatok

egy külön csoportjában RTX-szel hőhiperalgéziát hoztunk létre. Majd összehasonlítottuk a

három antagonista hatását állandó intenzitású küszöb feletti hőinger által indukált elhárító

reakció latenciaidejének mérésével. Ehhez az értekezés elején bemutatott Plantar testet

használtuk (lásd 14. oldal), és a lábon mért elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk. A

kontroll mérések elvégzése után 0,06 µg RTX-et injektáltuk a patkányok egyik talpába,

majd 10 perc elteltével újból megmértük a latenciaidőt. Az állatok egyik csoportja

előkezelésként TRPV1 antagonistát (0,5 ml / 100 g p. o.), míg a másik csoport, azonos

térfogatú vehikulumot kapott 1 órával az RTX kezelés előtt.


A reziniferatoxint a Sigma (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) cégtől szereztük be.

Etanolban oldottuk, majd 1 mg/ml-es törzsoldatát fiziológiás sóoldattal hígítottuk a

megfelelő koncentrációkra. Az SB705498 (N-(2-bromofenil)-N′-[((R)-1-(5-trifluorometil-2

piridil) pirrolidin-3-il)] urea), a BCTC (N-(4-tertiaributilfenil)-4-(3-kolorfiridin-2-il)

tetrahidropriazin-1(2H)-karbox-amid) és az AMG9810 ((E)-3-(4-tbutilfenil)- N-(2,3-

dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-acrilamid) 99%-os tisztaságú vegyületeit a Richter

Gedeon Gyógyszergyárban szintetizálták. Az antagonistákat minden koncentráció esetén

5% Tween 80 és fiziológiás sóoldat keverékében oldottuk, melyből 0,5 ml-t adtunk 100 g

testtömegre. Vehikulumként is ebben a volumenben alkalmaztuk, ez esetben antagonista

nélkül.

36


Az egyes antagonisa dózisok hatását mindig az aktuális, azonos térfogatú vehikulumot

kapott kontroll csoportokhoz viszonyítottuk. A vizsgálatot végző személy nem ismerte a

kezelési elrendezést.

A vehikulummal vagy antagonistával kezelt állatokon mért termonociceptív küszöb-

csökkenések egyes időpontokban történő összehasonlító analízisére Student-féle kétmintás

t-próbát alkalmaztunk. A vehikulummal kezelt és a különböző koncentrációjú antagonista

csoportok összehasonlítására egyutas variancia analízist (ANOVA) használtunk, Tukey-

Kramer post hoc teszttel kiegészítve. A különböző csoportok közötti eredmények

összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001 értékeket fogadtuk el

szignifikánsnak. Az antagonisták hatását a hiperalgézia százalékos gátlásának

ábrázolásával fejeztük ki. A fájdalmas hőküszöbök vizsgálata során egy integratív

paraméterrel, a küszöbcsökkenések összegével számoltunk a következő képlet szerint:

(csökkenésvehikulum ˗ csökkenésantagonista) / csökkenésvehikulum x 100, ahol csökkenésvehikulum és

csökkenésantagonista a különböző időpontokban a vehikulummal illetve antagonistával kezelt

csoportokban mért hőküszöbcsökkenések összegét jelölik. A lábon mért latenciaidő

vizsgálatoknál a következő képlet szerint számoltunk: (LCSvehikulum ˗ LCSantagonista) /

LCSvehikulum x 100, ahol az LCSvehikulum illetve LCSantagonista a vehikulummal vagy

antagonistával kezelt csoportokban mért latenciaidő-csökkenések átlagát jelöli.

A dózis-hatás görbén minden esetben a kialakult hőhiperalgézia százalékos gátlását

ábrázoltuk úgy, hogy az egyes időpontokban mért hőküszöb értékeket csoportonként

átlagoltuk, majd ezeket viszonyítottuk a traumát követően mért kontrollok átlagához. Az

antihiperalgetikus hatás jellemzésére a legkisebb alkalmazott hatékony dózist, azaz a

minimális effektív dózist (MED) használtuk.

EREDMÉNYEK

TRPV1 receptor antagonisták hatásai a nociceptív hőküszöbök vizsgálatakor

RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása

A patkányok kontroll termonocicepciós küszöbe 43,2 + 0,4°C volt (n=36). Az

intraplantárisan adott RTX injekció azonnali, de legkésőbb 5 perc alatt lezajló nocifenzív

reakciót váltott ki, mely a láb rázásával, nyalásával járt. Ezután az emelkedő hőmérsékletű

vízfürdővel mérve nagymértékű (8-10 °C) küszöbcsökkenést detektáltunk, mely a vizsgálat

37

20 perce alatt végig fennmaradt. Az előkezelésben alkalmazott antagonisták mindegyike

dózisfüggően gátolta az RTX által indukált küszöbcsökkenést mindegyik mérési

időpontban 1-30 mg/kg p.o. dózisban (17. ábra). A minimális hatékony dózis 1 mg/kg volt

mindhárom antagonista esetében (2. táblázat). Az SB705498 legnagyobb koncentrációban

adva (10 mg/kg) teljesen megszüntette a kialakult hőküszöbcsökkenést, míg a BCTC (30

mg/kg) 74,5% és az AMG9810 (10 mg/kg) 66,2% maximális gátlást okozott.

32

34

36

38

40

42

44

46

48

vehikulum p.o.

1 mg/kg p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

SB705498

RTX 0,01g i.pl.

Kontroll 5 10 15 20

* * * *

****

* *

perc

Fájd

alm

as

hő

kü

szö

b (

°C)

32

34

36

38

40

42

44

46

48vehikulum p.o.

1 mg/kg p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

BCTC

RTX 0,01g i.pl.

Kontroll 5 10 15 20

*

**

* **

**

*

**

*

*

**

*

perc

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (

°C)

32

34

36

38

40

42

44

46

48

vehikulum p.o.

1 mg/kg p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

Kontroll 5 10 15 20

AMG9810

RTX 0,01g i.pl.

*

*

**

*** *

**

*

*

perc

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°C

)

0

20

40

60

80

100

BCTC

AMG9810

SB705498

1 3 10 30

dózis (mg/kg)

Hő

hip

era

lgézia

gátl

ás

a (

%)

A B

C D

17. ábra: Előkezelésben (1 óra) adott TRPV1 antagonisták hatásai az RTX-szel kiváltott

hőküszöbcsökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonként 6-12 állat eredményeinek

átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt

csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt).

Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása

A hőtrauma kiváltásához szükséges altatásból a patkányok egy percen belül felébredtek.

Ébredés után egyik állatnál sem tapasztaltunk semmilyen nocifenzív reakciót, nem rázták

és nem is nyalták a lábaikat. A hőtraumát követő 10. és 20. percben emelkedő

38

hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékekben 7-8 °C csökkenést tapasztaltunk a

kontrollhoz képest (18. ábra). Azon állatokat, melyeknél a hiperalgézia nem alakult ki,

vagyis a csökkenés mértéke nem volt legalább 3 °C, kizártuk a további kísérletekből (120

patkányból összesen 5-öt). A termális hiperalgézia kialakulása utáni 20. percben i.p.

beadott antagonisták mindegyike szignifikánsan mérsékelte a küszöbcsökkenést. A

minimális effektív dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, BCTC adásakor 3 mg/kg, míg az

AMG9810 vegyületnél 1 mg/kg volt (2. táblázat). Az SB705498 és BCTC dózis-hatás

görbéi a maximális beadott dózisnál (30 mg/kg) már enyhe csökkenést mutattak és

maximális gátló hatásukat a 10 mg/kg-os koncentrációnál érték el (54,1% és 74,2%). Ezzel

szemben az AMG9810 maximális gátló hatását a 30 mg/kg dózisban fejtette ki, amely

60,3% volt.

32

34

36

38

40

42

44

46 vehikulum i.p.

3 mg/kg i. p.

10 mg/kg i. p.

30 mg/kg i.p.

SB705498

hőtrauma (51°C, 20s)

kezelés

*

*

*

*

*

Kontroll 10 20 30 40 50 60

perc

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°C

)

32

34

36

38

40

42

44

46

vehikulum i.p.

1 mg/kg i. p.

3 mg/kg i. p.

10 mg/kg i. p.

30 mg/kg i.p.

BCTC


kezelés

Kontroll 10 20 30 40 50 60

****

*

**

**

perc

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (

°C)

32

34

36

38

40

42

44

46vehikulum i.p.

1 mg/kg i. p.

3 mg/kg i. p.

10 mg/kg i. p.

30 mg/kg i.p.

AMG9810


Kontroll 10 20 30 40 50 60

kezelés*** *

*

**

**

***

perc

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (

°C)

0

20

40

60

80

100

BCTC

AMG9810

SB705498

1 3 10 30

dózis (mg/kg)

Hő

hip

era

lgé

zia

gá

tlá

sa

(%

)

A B

C D

18. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai enyhe hőtraumával kiváltott termális nociceptív küszöb-

csökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-11 állat eredményeinek átlagát a

standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok

közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt). Az ábra D

része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

39

A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása

Az állatok a pentobarbitál altatás után 2-4 óra múlva felébredtek, a méréseket másnap

reggel végeztük. Semmilyen elhárító viselkedést sem tapasztaltunk a gyógyulási idő alatt,

habár a patkányok óvatosabban terhelték a műtött lábukat. A műtét után 24 órával az

emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékek 7-8 °C-ot csökkentek. A 18-20

állatot tartalmazó kísérleti csoportokból maximum 1-2 állatot zártunk ki a további

kísérletből (ezen állatoknál a küszöbcsökkenés mértéke nem érte el a 3°C-ot). Az

alkalmazott antagonisták mindegyike dózisfüggően gátolta a sebészi incízió következtében

kialakult küszöbcsökkenést 3-30 mg/kg p.o. dózisban (19. ábra). A minimális hatékony

dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, míg a BCTC és az AMG9810 egyaránt 3 mg/kg volt

(2. táblázat). A maximális gátló hatás SB705498-nál 40,5%, BCTC esetében 52,9%, és

84,4% volt az AMG9810 antagonistánál.

32

34

36

38

40

42

44

46

SB705498

íncizió

op. előtti op. utáni 1 2 3 4

kezelés

***

**

*

** *

kontroll (24 ó)

vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

óra

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°C

)

32

34

36

38

40

42

44

46vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

BCTC

íncizió


kezelés

*

*

*

*

**

*

* *

*

*

kontroll (24 ó)

*

óra

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°C

)

32

34

36

38

40

42

44

46

AMG9810

íncizió


kezelés **

** *

**

* **

*

kontroll (24 ó)

*

vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

óra

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°C

)

0

20

40

60

80

100 BCTC

AMG9810SB705498

3 10 30

dózis (mg/kg)

Hő

hip

era

lgé

zia

gá

tlá

sa

(%

)

A B

C D

19. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai plantáris bőr-izom incízióval kiváltott termális nociceptív

küszöb-csökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-8 állat eredményeinek

átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt

csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt).

Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlásából számolt dózis-hatás görbéket mutatja.

40

TRPV1 receptor antagonisták hatásai az alap hőküszöbre

A kontroll mérések elvégzése után mindhárom antagonistát vagy a vehikulumot is beadtuk

i. p. (n=9, 30 mg/kg dózisban), majd 30 illetve 60 perc elteltével emelkedő hőmérsékletű

vízfürdővel megmértük a termonocicepciós küszöböket. A tesztelt antagonisták egyike sem

változtatta meg szignifikánsan az alap (nem szenzitizált) nociceptív hőküszöböket (nem

ábrázolt adat).

TRPV1 antagonisták hatásai az RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre

A lábon mért alap elhárító reakció latenciaideje 11,03 + 0,3 s volt, amely az i.pl. adott

RTX injekció (0,06 µg) hatására 4,38 + 0,3 s-ra csökkent. Az 1 órával az RTX kezelés

előtt p. o. beadott antagonista vegyületek mindegyike antihiperalgéziás hatással

rendelkezett. Bár meghosszabították az elhárító reakció latenciaidejét, szignifikáns

különséget csak a legnagyobb alkalmazott dózis beadásakor detektáltunk, ekkor a gátlás

SB705498, BCTC és AMG9810 esetében 43%, 38% és 37% volt (20. ábra).

0

2

4

6

8

10

12

14

vehikulum p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

*

SB705498

Kontroll 10 perccel az RTX kezelés után

No

cif

en

zív

re

ak

ció

lé

ate

nc

iaid

eje

(s

)

0

2

4

6

8

10

12

14

vehikulum p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

*

BCTC


No

cif

en

zív

re

ak

ció

lé

ate

nc

iaid

eje

(s

)

0

2

4

6

8

10

12

14

vehikulum p.o.

3 mg/kg p.o.

10 mg/kg p.o.

30 mg/kg p.o.

*

AMG9810


No

cif

en

zív

re

ak

ció

lé

ate

nc

iaid

eje

(s

)

A B

C

20. ábra Az előkezelésben (1 óra) alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták (A, SB-705498; B, AMG9810,

C: BCTC) hatása RTX (0,06 µg, i. pl.) által kiváltott hőhiperalgéziában plantar teszttel vizsgálva a nocifenzív

reakció megjelenéséig eltelt időt. A csoportonkénti 6-7 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt

ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag

szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (egyutas ANOVA és Tukey-Kramer multifaktor variancia teszt).

41


Elsőként szolgáltattunk összehasonlító adatokat különböző gyógyszercégek által

kifejlesztett három TRPV1 antagonista hatásairól, új fájdalmas hőküszöbmérő és a

tradicionális elhárító reakciók latenciaidejének mérésén alapuló módszerekkel.

Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöb csökkenés megvalósulhat

direkt TRPV1 receptor aktiváción keresztül, enyhe hőtrauma alkalmazásával vagy sebészi

incíziót követően, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1

antagonisták mindegyikével szemben.

Munkám e részében bemutatott mindhárom antagonista orális előkezelésben alkalmazva

dózisfüggő módon gátolta a TRPV1 agonista RTX fájdalmas hőküszöb csökkentő hatását.

Az RTX intraplantáris adása rövid ideig tartó, de enyhe nocifenzív reakciót vált ki a

patkányokból, majd 20 percig fennmaradó küszöbcsökkenést eredményez (Almási és

mtsai. 2003). Az SB705498 maximálisan beadott dózisa teljesen, míg a BCTC és

AMG9810 75% illetve 66% védte ki a kialakult hiperalgéziát. Mivel az érintett végtagon

viszonylag nagy koncentrációban volt jelen a TRPV1 agonista RTX, ez a nagyfokú gátlás

igen figyelemre-méltó hatás.

A TRPV1 antagonisták igen alacsony dózisban alkalmazva antihiperalgéziás hatással

rendelkeztek, így minimális effektív dózisuk mindhárom esetben 1 mg/kg volt. Korábbi

publikációkben ezen TRPV1 antagonisták termális vagy mechanikai hiperalgéziát

csökkentő minimális effektív dózisai 3-10-szer nagyobbak voltak, (Rami és mtsai. 2006,

Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, lásd 2. táblázat), amely módszerünk

érzékenységét bizonyítja.

Az általunk kidolgozott hőküszöbmérő módszerrel mindhárom tesztelt antagonista

esetében 30-szor kisebb volt a minimális effektív dózis, összehasonlítva a tradicionális

latenciaidő mérő teszttel (Hargreaves és mtsai. 1988) kapott eredményekkel, melyek

további bizonyítékot szolgáltatnak módszerünk érzékenységére.

42

Modell SB705498 BCTC AMG9810

RTX- indukált hőküszöb

csökkenés 1 mg/kg p.o. 1 mg/kg p.o. 1 mg/kg p.o.

RTX által kiváltott lábon

mért elhárító reakció-

latenciaidő csökkenés

30 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.

Enyhe hőtrauma okozta

hőküszöb csökkenés 10 mg/kg i.p 3 mg/kg i.p. 1 mg/kg i.p.

Sebészi incízió okozta

hőküszöb csökkenés 10 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o.

Kapszaicin által kiváltott

másodlagos mechanikai

hiperalgézia

10 mg/kg p.o.a

Kapszaicin-indukált

szemtörlések száma 3 mg/kg i.p.

c

CFA- indukált termális

hiperalgézia 3 mg/kg p.o.

b 30 mg/kg i.p.

c

CFA-indukált mechanikai


b 100 mg/kg i.p.

c

Részleges ideglekötés

okozta mechanikai


b

Részleges ideglekötés

okozta mechanikai

allodínia 10 mg/kg p.o.

b

2. táblázat: TRPV1 receptor antagonisták (SB705498, BCTC és AMG9810) minimális hatékony dózisai

patkányokban különböző in vivo nociceptív tesztekben vizsgálva, a jelen tanulmány és korábbi irodalmi

adatok alapján. a Rami és mtsai. (2006.);

b Pomonis és mtsai. (2003.);

c Gavva és mtsai. (2005.)

Vizsgálataink során még két, intézetünkben korábban validált modellben (Bölcskei és

mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009) − egy akut / szubakut (enyhe hőtrauma), illetve egy

krónikus (sebészi incízió) − határoztuk meg a vizsgált antagonisták antihiperalgetikus

hatásait. Mindkét alkalmazott modell szerepét igazolták TRPV1 receptor aktivációs illetve

szenzitizációs folyamatokban mind TRPV1 génhiányos egerek, illetve patkányokon

TRPV1 antagonisták alkalmazásával (Bölcskei és mtsai. 2005, Pogatzki-Zahn és mtsai.

2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és Brennan 2009). Az enyhe hőtrauma és a sebészi incízió

módszerek jobban modellezik a valóságot, a humán klinikai kórképekhez közelebb állnak,

mind a tünetek hasonlóságát, mind pedig a sérülés bekövetkezése után elkezdett kezelési

protokollokat tekintve. Mindkét hiperalgézia modell rendkívül érzékenyen reagált a

vizsgált antagonistákra, az SB705498 illetve a BCTC MED értéke 1 mg/kg volt, míg az

AMG9810 vegyületé 3 mg/kg. A korábbi publikációkban megjelent adatokkal

összehasonlítva elmondható, hogy módszerünk legalább annyira, vagy még érzékenyebb a

fenti kísérletes paradigmák vizsgálatára (Rami és mtsai. 2006, Pomonis és mtsai. 2003,

Gavva és mtsai. 2005, 2. táblázat).

43

Az enyhe hőtrauma okozta hőhiperalgéziát mindhárom vegyület gátolta, mégis a

leghatékonyabb vegyületnek az AMG9810 bizonyult, mivel a legkisebb MED értékkel a

legnagyobb gátlást érte el, míg a legkevésbé hatékony ez esetben az SB705498 volt.

Érdekes módon mind az SB705498, mind pedig a BCTC hatása a legnagyobb alkalmazott

dózisban csökkenést mutatott, melynek oka ismeretlen. A sebészi incíziót követő hőküszöb

csökkenés gátlása dózis-hatás összefüggéseket mutatott mindhárom vizsgált antagonista

esetében. Meglepő módon, habár mindhárom anyag hatékonysága hasonló, az AMG9810

mégis határozottan nagyobb mértékű gátlást ért el a másik két antagonistához viszonyítva.

E modellben mind a BCTC, mind pedig az AMG9810 minimális effektív dózisa azonos, de

kisebb volt, mint az SB705498-é.

Említésre méltó, hogy ugyanazon TRPV1 antagonisták esetében az egyes modellekben

eltérő hatékonyságot tapasztaltunk. Például az SB705498 esetében, ahol maximális gátlást

értünk el az RTX-indukálta hőhiperalgézia modellben, míg ez a gátlás az enyhe hőtrauma

modellben 50%, illetve a sebészi incízió okozta hiperalgézia modellben pedig 40% volt.

Hasonló, de kevésbé kifejezett mintázat figyelhető meg a BCTC esetében is. Ennek egyik

magyarázata lehet, hogy a TRPV1 receptor korlátozott szerepet játszik a hőtrauma, illetve

a sebészi incíziót követő hőhiperalgézia fenntartásában. Korábbi publikációkban

patkányokon vizsgálva, az incízió következtében létrejövő hőhiperalgéziát más TRPV1

antagonisták is csak részben gátolták (A-425619, ABT-102 és AMG0347, Honoré és

mtsai. 2005, 2008, Wu és mtsai. 2008). Másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy a

TRPV1 antagonisták hatékonysága csökken, ha a TRPV1 receptor szenzitizálódik.

A legnagyobb dózisban alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták egyike sem változtatta

meg az alap kontroll hőküszöb értékeket. Ez az eredmény megegyezik a korábban, más

kutatócsoportok által közöltekkel, melyeknél nem volt kimutatható változás a patkányok

alap (kontroll, nem érzékenyített), lábon mért elhárító reakció latenciaidejében TRPV1

receptor antagonisták (BCTC, A-425619 és ABT-102) adása után (Pomonis és mtsai. 2003,

Honoré és mtsai. 2005, 2008).

A TRPV1 receptor szenzitizációjának valószínűsített mechanizmusa, számos intracelluláris

protein-kináz foszforilációja révén valósul meg, főként a protein-kináz C (Premkumar és

mtsai. 2000, Vellani és mtsai. 2001) vagy protein-kináz A (Bhave és mtsai. 2002, Varga és

mtsai. 2006) játszik fontos szerepet a folyamatban. Bizonyos gyulladásos mediátorok, mint

pl. bradikinin és prosztaglandinok is közreműködnek a TRPV1 receptorok

aktívációjában/szenzitizációjában a protein-kináz A és C útvonalon keresztül (Sugiura és

44

mtsai. 2002, Moriyama és mtsai. 2005). Mind az intraplantárisan adott ciklooxigenáz-

gátlók (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009), mind pedig a B2 bradikinin

receptor antagonista HOE 140 gátolta az enyhe hőtrauma- illetve a sebészi incízió-okozta

hőküszöb csökkenést (Füredi és mtsai. 2010).

A TRPV1 receptor nélkülözhetetlen más típusú hiperalgéziás illetve szenzitizációs

mechanizmusokban is (Caterina és mtsai. 2000, Davis és mtsai. 2000, Walker és mtsai.

2003, Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, Honoré és mtsai. 2005, Zimmermann

és mtsai. 2005). A gyógyszerfejlesztésben a TRPV1 antagonisták jövője továbbra is

problémás, köszönhetően potenciális, súlyos hipertermiát okozó hatásuknak (Gavva és

mtsai. 2007, Holzer és mtsai. 2008, Szolcsányi 2008). Azonban irodalmi adatok szerint

hipertermizáló hatásuk szétválasztható a TRPV1 receptor antagonizáló hatástól, ahogy ez

néhány újonnan kifejlesztett TRPV1 ligand esetében is tapasztalható (Letho és mtsai.

2008). A klinikai fázisig eljutó első szerek, melyek 3 aktivátor (kapszaicin, hő és protonok)

hatását képesek blokkolni, vagy erős hipertermiát okozó mellékhatásaik vagy

hatástalanságuk miatt pedig nem kerültek forgalomba.

Antagonista neve Terápiás indikáció Fejlesztési stádium

DWP-05195 neuropátiás fájdalom

post herpeszes neuralgia Fázis I./II.

PHE377

PHE 575 neuropátiás fájdalom

Fázis I. (folyamatban)

Preklinikai fejlesztés

MR-1817 per os fájdalomcsillapító Fázis I.

ABT-102

ABT-116

ABT-443

gyulladás, szöveti sérülés vagy

iszkémia következtében

kialakuló fájdalom

Fázis I.

Fejlesztés alatt

Fejlesztés alatt

AMG-517

AMG-628 fájdalom

Fázis I.B (leállított)

Fejlesztés alatt

AZD-1386 krónikus fájdalom /özofágeális

reflux Fázis II. (leállított)

GRC-6211

fájdalom, migrén és

oszteoartritisz, fájdalmas

hólyag szindróma

Fázis II. oszteoartritisz vizsgálat

(felfüggesztve)

JTS-653 fájdalom Fázis II. (felfüggesztve)

MK-2295 fájdalom Fázis II. (teljesített)

SB-705498 rinitisz, krónikus köhögés,

Fázis II. migrén és rektális fájdalom

(befejezett),

Fázis II. nem allergiás rinitisz

(intranazális adás-folyamatban),

JNJ-39729209 cisztitis, köhögés, és pruritusz fejlesztés alatt

AS(P)-1928370

AS-1725195 fájdalom fejlesztés alatt

3. táblázat: Klinikai vizsgálatokba bevont TRPV1 antagonisták státuszai (Forrás: Trevisani és Gatti 2013,

módosított).

45

Az újabb antagonisták, melyek blokkolják a kapszaicin TRPV1 receptor aktiváló hatását,

de nem befolyásolják sem az alacsony pH, sem pedig a hő által kiváltott stimulációt,

feltehetően nem változtatják meg a maghőmérsékletet. Ezen szerek klinikai fázisvizsgálati

eredményei ezidáig nem ismertek. Mindezek alapján reménykeltő annak a lehetősége,

hogy sikerül TRPV1-antagonizmuson alapuló perifériás támadáspontú analgetikumokat

kifejleszteni.

46

3. fejezet: A TRPV1 és TRPA1 receptorok szerepének

vizsgálata az alap hőérzékelésben és mustárolaj által kiváltott

hiperalgézia modellben receptor génhiányos egerek

felhasználásával

Absztrakt: Tékus V, Hajna Z, Horváth A, Kun J, Bölcskei K, Szolcsányi J, Helyes Z: Role

of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion

channels in thermonociception in mice. CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012)

(eredeti közlemény elküldése folyamatban)

BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR

A homeosztázis fenntartásában nélkülözhetetlen a környezeti hőmérséklet érzékelése, a

szövetek károsodásával is járó extrém hideg, illetve forró ingerek elkerülése alapvető

fontosságú az élővilágban. A hőérzékelésben szerepet játszó pontos mechanizmusok

mindezidáig nem tisztázottak. Kutatásaink során a forró ingerek detektálására alkalmas

TRPV1 receptor és a hidegérzékelésben máig vitatott jelentőséggel bíró TRPA1 receptor

funkciójára (lásd 10. oldal) fókuszáltunk. A TRPV1 receptor szerkezetének pontosabb

megismerésére a receptor klónozása adott lehetőséget, melynek segítségével derült fény

arra, hogy a receptort a fájdalmas hőingerek és az alacsony pH közvetlenül képes aktiválni,

valamint, hogy központi szerepet játszik a nociceptort érő fájdalmas stimulusok

integrálásában is (Caterina és mtsai. 1997; Tominaga és mtsai. 1998). A gyulladásos illetve

fájdalommal járó folyamatokban betöltött szerepének részletesebb tanulmányozása akkor

vált lehetővé, amikor 2000-ben két kutatócsoport egymástól függetlenül TRPV1 receptor

génhiányos egereket állított elő (Caterina és mtsai. 2000; Davis és mtsai. 2000).

A TRPA1 receptort már 1999-ben klónozták (Jaquemar és mtsai. 1999), ennek ellenére

neuronokon való expresszálódását csak 2003-ban közölték (Story és mtsai. 2003), akik a

receptort, a fájdalmas intenzitású hideg ingerek szenzoraként azonosították. Mivel

korábban e két receptor szerepének feltérképezése főként akut modellekben volt lehetséges

antagonisták adása révén, génhiányos egerek alkalmazásával a receptorok működése és

jelentősége vizsgálhatóvá vált krónikus kísérletekben is. Az eltelt évtizedben a TRPV1

génhiányos egerek intenzív kutatása zajlott, hogy pontosabban meghatározzák a receptorok

szerepét normál fiziológiai és patológiás körülmények között.

47

Az egyik elsőként TRPV1 génhiányos egereken elvégzett kísérletben megállapították,

hogy a receptor esszenciális termális hiperalgéziában (Davis és mtsai. 2000), azonban

szerepe az alap

hőérzékelésben nem tisztázott (Caterina és mtsai. 2000). Ezt erősítik kutatócsoportunk

korábbi eredményei is, melyekben a TRPV1 génkiütött egerek nociceptív hőküszöbe nem

különbözött a vad típusúakétól (Almási és mtsai. 2003), azonban TRPV1-/-

állatokban

szignifikánsan kisebb mértékű volt a hőtraumával kiváltott termális és mechanikai

hiperalgézia mértéke (Bölcskei és mtsai. 2005).

A mustárolaj a természetben is megtalálható növényi eredetű irritáns, melyet hosszú ideje

alkalmaznak a népi gyógyászatban. Korábban a TRPA1 receptor szelektív exogén

agonistájaként tartották számon (Jorgt és mtsai. 2004), azonban szelektivitása

megkérdőjelezhető, mivel feltehetően szerepet játszik a TRPV1 receptor aktivációjában is

(Gees és mtsai. 2013, Everaerts és mtsai. 2011). A benne található allil-izotiocianátot

(AITC) ˗ a kapszaicinhez hasonlóan ˗ kémiai fájdalomkeltő hatása miatt régóta használják

a gyulladás mechanizmusainak vizsgálatához. Az RTX-szel deszenzibilizált egerek

elvesztették válaszkészségüket kapszaicinnel szemben ugyanakkor csökkent érzékenységet

mutattak mustárolajjal szemben is, melynek egyik lehetséges magyarázata a két receptorra

jellemző nagyfokú koexpresszió (Pecze és mtsai. 2009).

Egereken egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel végzett lábon mért nociceptív

hőküszöb-vizsgálatok nem ismertek az irodalomban. Mivel az egerek rosszul tűrik a

kézben tartást, továbbá a relatív kisméretű lábon a mérés nehézkes, ezért figyelmünk

központjába az egérfarok vizsgálata került. Kísérleteink során az intézetünkben fejlesztett

emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt egy egérkaloda alkalmazásával alkalmassá tettük az

egerek farkán mért nociceptív hőküszöb vizsgálatokra.

CÉLKITŰZÉS

PhD munkám e részének célja volt a korábban intézetünkben patkány lábon mért hőküszöb

meghatározására kidolgozott emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztése,

mely lehetőséget teremt az egerek farkán mért hőküszöb értékek meghatározására is.

Mivel az irodalomban ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre mind a TRPV1, mind

pedig a TRPA1 receptor hő- és mechanikai-érzékelésben betöltött szerepével kapcsolatban

(lásd. 10. oldal), munkám további célja volt génhiányos egerek felhasználásával tisztázni

és vizsgálni e receptorok funkcióit fájdalmas küszöbmérésre alkalmas módszerekkel.

48

21. ábra: Emelkedő hőmérsékletű

vízfürdő, egerek részére kifejlesztett

kalodával

Mivel a receptorok szerepe feltehetően függ az érzőideg-végződések aktivációs

mechanizmusától, a választott kísérleti modellektől, illetve az alkalmazott vizsgálati

módszerektől, kidolgoztunk és validáltunk egy megbízhatóan működő, mustárolaj által

kiváltott hiperalgézia modellt, melyben az eltérő testtájak tanulmányozása vált lehetővé.



Az előkísérleteket hím CD1 állattörzsbe tartozó egereken (25-35g), míg további

vizsgálatainkat hím TRPV1 és TRPA1 génhiányos egereken és ezek vad típusú

megfelelőin végeztük. Mindkét génhiányos állattörzs genetikai alapját a C57Bl/6 törzs

képezi. A TRPV1 génkiütött egerek (TRPV1-/-

) eredeti szülőpárjait a Jackson Laboratories

(USA) cégen keresztül vásároltuk, míg a TRPA1 génhiányos állatok eredeti szülőpárjait

(TRPA1-/-

) Dr. Pierangelo Geppetti a firenzei Egyetem professzora bocsátotta

rendelkezésünkre. A kísérletekhez felhasznált állatokat a Pécsi Tudományegyetem

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének állatházában tenyésztettük, standard 25 °C-

on vízzel és élelemmel ad libitum ellátva.


A mustárolajat (allil-izotiocianát, AITC) a Sigma-Aldrich Kft.-től (Magyarország), míg a

96% etanolt, a paraffin olajat és a dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Reanal

Finomvegyszergyár Zrt.-től vásároltuk.

Előkísérletek és módszertani fejlesztések

Előkísérleteink során az egyenletesen emelkedő

hőmérsékletű vízfürdőt adaptáltuk egerekre. Az

egerek többnyire rosszul tűrik a kézbevételt, ezért a

mérések standardizálásához egy egérkalodát

fejlesztettünk ki, melyeket szellőzőlyukakkal ellátott

műanyag csövekből alakítottunk ki. Az állatok

behelyezése után a kalodákat egy állványon

rögzítettük, úgy hogy a farkuk pont a megfelelő

mélységben érjen bele a víztartályba (21. ábra). Pár

perc habituáció után megmértük az állatok fájdalmas

49

hőküszöbét, majd a mérést 10 percenként 1 órán keresztül ismételtük két egymást követő

napon. Összehasonlításképpen a vizsgált állatok alomtestvéreinek hőküszöb értékeit

detektáltuk, úgy, hogy az egereket a vizsgálatot végző személy a kezében tartotta.

Mustárolaj hatására létrejövő hiperalgézia modell kidolgozásakor a legalkalmasabb

oldószer kiválasztásához a mustárolajat 96% etanolban, paraffin olajban, illetve 30%

dimetil - szulfoxidban (DMSO) oldottuk, majd a hőküszöb-csökkentő hatást detektáltuk.

Ezután további kísérleteket végeztünk 0, 5, 1, 2, 5% mustárolaj alkalmazásával a megfelelő

mustárolaj koncentráció kiválasztásához.

Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása

Az egerek fájdalmas hőküszöbét a bevezetőben (lásd 14. oldal) bemutatott egyenletesen

emelkedő hőmérsékletű forró lap alkalmazásával detektáltuk a hátsó lábon, míg a farkon,

az előző pontban bemutatott módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel vizsgáltuk az

újonnan kifejlesztett csövek segítségével.

Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata

A mustárolaj hatására kialakuló hőküszöbcsökkenést a hátsó lábon vagy farkon az

emelkedő hőmérsékletű forró lappal vagy vízfürdővel határoztuk meg. A kontroll mérések

elvégzése után az állatok lábát 60 s-ig, míg farkát 30 s-ig 1%-os, 30% DMSO-t tartalmazó

mustárolajba merítettük, majd a hőküszöb-változást 1 órán keresztül 10 percenként

detektáltuk.

Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata

Az egerek lábán mért érintési érzékenységet dinamikus plantáris észteziométerrel

vizsgáltuk. A szoktató és kontroll mérések elvégzése után az egerek egyik hátsó lábát 60

másodpercre 1%-os mustárolajba merítettük, majd 30, 60, 120, 180 perccel később

megmértük az állatok mechanonociceptív küszöbét.

Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata

Az állatok farkát, illetve lábát 1%-os mustárolajba merítettük és az elhárító reakció

megjelenéséig eltelt időt detektáltuk. Elhárító reakciónak a farok illetve láb erőteljes

megrázását tekintettük. A latenciaidő maximális értékét 3 percben határoztuk meg.

50


A kapott eredmények statisztikai értékelését kétutas ANOVA utáni Bonferroni módosított

post hoc teszttel végeztük. Minden esetben a * p <0,05 értéket tekintettük szignifikáns

eltérésnek.

EREDMÉNYEK

Előkísérletek

Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztésekor egyik mérési pontban sem

tapasztaltunk szignifikáns eltérést az állatok kézben tartása, illetve csőbe zárása között.

Ugyanakkor, a kaloda alkalmazásával jelentősen csökkent a vizsgálati állatok

előkészítésének ideje, ezáltal időegység alatt több állat mérésére nyílt lehetőség (22. ábra).

0 10 20 30 40 50 6042

43

44

45

46

47

48

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (

°C) kézben tartott

csőbe zárt

idő (perc)

22. ábra: Farkon mért fájdalmas hőküszöb meghatározása csőbe zárva illetve kézben tartva egyenletesen

emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével. Fűtési sebesség: 12°C/perc. A csoportonkénti 8 állat

eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. Egyik vizsgálati időpontban sem tapasztaltunk

statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket.

Előkísérleteteink következő részében a mustárolaj megfelelőnek oldószerének

kiválasztásához, 5% MO-t oldottunk 96% -os etanolban vagy paraffin olajban, illetve 30%

DMSO-ban. Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel detektálható hőküszöb csökkenés az

első két esetben csak 1-2 °C fok volt, míg 30% DMSO-ban oldva jóval nagyobb,

szignifikáns küszöbcsökkenést mértünk. A 30%-os DMSO oldat önmagában nem okozott

változást a termonociceptív küszöbben, így a későbbi kísérleteink során kontrollként

alkalmaztuk (23. A ábra).

51

A 2, illetve 5% százalék mustárolajat tartalmazó oldatok alkalmazása során jelentős

küszöbcsökkenést és esetenként szobahőmérsékleten jelentkező spontán fájdalmat

detektáltunk. Mivel az 1%-nál kisebb MO tartalmú oldatok esetében nem találtunk

szignifikáns küszöbcsökkentő hatást, ezért kísérleteink további részében a 10-12°C

csökkenést eredményező, szobahőmérsékleten spontán fájdalmat nem indukáló 1 %-os

mustárolaj-oldatot használtuk (23. B).

0 10 20 30 40 50 60

34

36

38

40

42

44

46

48

50

5% MO paraffinban oldva

5% MO 30% DMSO-ban oldva

30% DMSO

5% MO 96%-os etanolban oldva

***

Kezelés után eltelt idő (perc)

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b

(°C

)

0 10 20 30 40 50 60-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

200% MO 0,5% MO1% MO 2% MO 5% MO

***

*****

Kezelés után eltelt idő (perc)

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b v

álto

zá

sa

(°C

)

A B

23. ábra: A termális hiperalgézia kiváltásához szükséges megfelelő vivőanyag és mustárolaj koncentráció

meghatározása egyenletesen emelkedő vízfürdő módszerrel vizsgálva. Az ábra A része a fájdalmas hőküszöb

értékeket mutatja 5%-os mustárolaj (MO) kezelés (farok oldatba merítése) előtt és 10-60 perccel később,

paraffinban, 96%-os etanolban és 30% DMSO-ban oldva. Az ábra B része különböző koncentrációjú MO

(30% DMSO-ban oldott) oldatok hőküszöb csökkentő hatását szemlélteti. A csoportonkénti 6-9 állat

eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok az oldószerrel kezelt (0% MO-

tartalmazó) illetve a különböző koncentrációjú MOcsoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p<0,05)

különbségeket jelölik (Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása

Meglepő módon a TRPV1 génhiányos egerek a farkán szignifikánsan magasabb hőküszöb

értéket detektáltunk (TRPV1-/-

: 45,42 + 0,34°C), mint vad típusú megfelelőiknél

(TRPV1+/+

: 42,98 + 0,4°C). A láb vizsgálatakor azonban nem találtunk statisztikai

különbséget (TRPV1-/-

: 46,04 + 0,4°C illetve TRPV1+/+

: 45,52 + 0,4 °C) (24. A ábra).

TRPA1 génhiányos egerekben sem a farkon (TRPA1-/-

: 43,57 + 0,7 °C, TRPA1+/+

: 43,07 +

0,4 °C), sem a lábon (TRPA1-/-

: 44, 87 + 0,5 °C, TRPA1+/+

: 45,22 + 0,6 °C) nem volt

szignifikáns különbség (24. B ábra). A különböző testtájak vizsgálatakor csak az alap

hőküszöb értékek meghatározásához használtuk fel ugyanazon állatokat, tekintve, hogy

52

ezen mérések nem voltak invazívak. Az eltérő testtájon történő mustárolaj kezelések során,

kezelésenként egymás alomtestvéreit használtuk.

40

42

44

46

48

TRPV1-/-TRPV1+/+

FAROK LÁB

**

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°

C)

40

42

44

46

48

TRPA1-/-TRPA1+/+

FAROK LÁB

Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (°

C)

A B

24. ábra: A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek farkon

(emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel) illetve lábon (hot plate készülékkel) mért alap fájdalmas hőküszöb

értékei. A csoportonkénti 6-9 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a

génhiányos és vad típusú egerek közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-

féle t-próba).

Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata

TRPV1+/+

állatok farkon mért fájdalmas hőküszöb értékei 10 perccel a mustárolaj kezelést

követően a kiindulási kontroll szintről (43,53 + 0,33 °C) 35,96 + 1,23 °C-ra csökkent.

Ezzel szemben a TRPV1 génhiányos egerekben ez a csökkenés szignifikánsan kisebb volt

(46,05 + 0,35°C-ról 40,6 + 0,6 °C-ra). A két csoport közti küszöbcsökkenés különbsége

(átlagosan 4-6 °C) a kísérlet folyamán végig fennmaradt (25. A ábra). TRPA1 receptor

hiánya illetve megléte esetében közel azonos mértékű hőküszöbcsökkenést detektáltunk az

egerek farkán (25. B ábra). TRPV1+/+

és TRPA1+/+

állatok lábon mért kontroll

fájdalomküszöbeinek átlaga (44,8 + 0,4°C és 45,0 + 0,2 °C), 20 perccel a mustárolaj

kezelést követően átlagosan 12-14°C–kal csökkent. A kísérlet végéig fennmaradó

csökkenés a TRPA1-/-

állatok esetében nem (25. D ábra), míg a TRPV1 génhiányos

egereknél szignifikánsan kisebb volt vad típusú megfelelőikhez képest (25. C ábra).

53

0 10 20 30 40 50 6032

34

36

38

40

42

44

46

48

50

TRPV1-/-

TRPV1+/+

*

*

*

**

* *

1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

Fájd

alm

as

hő

kü

szö

b (

°C)

0 10 20 30 40 50 6032

34

36

38

40

42

44

46

48

50

TRPA1-/-TRPA1+/+


Fájd

alm

as

hő

kü

szö

b (

°C)

0 10 20 30 40 50 6030

32

34

36

38

40

42

44

46

48

TRPV1-/-TRPV1+/+

Fá

jdalm

as

hők

üsz

öb

(°C

)

*** **

**

*****


0 10 20 30 40 50 6030

32

34

36

38

40

42

44

46

48

Fá

jdalm

as

hők

üsz

öb

(°C

)

TRPA1-/-TRPA1+/+


A B

C D

FAROK

LÁB

25. ábra: 1% mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata TRPV1 és TRPA1 génhiányos állatok

farkán emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (30 s; A-B), illetve lábán (60 s; C-D) emelkedő hőmérsékletű

forró lappal. A csoportonkénti 6 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok

a génhiányos egerek és azok vad tipusú megfelelőik közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05)

különbségeket jelölik (kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása

A mustárolaj kezelés után 30 perccel a vad típusú állatoknál 45-55%-os

mechanonociceptív küszöbcsökkenést detektáltunk. Ez a csökkenés a TRPV1 génhiányos

egereknél szignifikánsan kisebb mértékű, 25% körüli volt, mely különbség a kísérlet

végéig fennmaradt (26. A ábra). Érdekes módon a mustárolaj-kezelés mind a TRPA1

receptorral rendelkező, illetve nem rendelkező állatokban hasonló hatást ért el, vagyis a

kialakult mechanikai hiperalgézia közel azonos mértékű volt (26. B ábra).

54

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

TRPV1 -/-TRPV1 +/+

***

***

*** ***

1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

Mech

an

on

ocic

ep

tív k

üsz

öb

vá

lto

zása

(%

)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

TRPA1 -/-TRPA1 +/+

1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)

Mech

an

on

ocic

ep

tív

kü

szö

b v

ált

ozá

sa (

%)

A B

26. ábra: 1%-os (60s) mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia lábon dinamikus plantáris

észteziométerrel mérve. A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek

mechanonociceptív küszöbváltozásainak átlagát azok standard hibáival együtt ábrázoltuk (*** p <0,001; n=

7-11, kétutas ANOVA Bonferroni post hoc-teszt).

Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció

A TRPV1+/+

állatok farkán mért elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő 103 + 14 s volt a

mustárolajat nem tartalmazó oldatban, mely szignifikánsan nagyobb volt, mint a

mustárolajat tartalmazó oldatban töltött idő (48 + 5 s). Ezzel szemben a TRPV1-/-

állatok a

nocifenzív reakció megjelenéséig mustárolajban töltött ideje szignifikánsan nagyobb volt

(89 + 13 s) (27. A ábra). Hasonló eredményt kaptunk a TRPA1+/+

állatok vizsgálata során,

mustárolaj nélküli oldatban 63 + 8 s töltöttek a nocifenzív reakció megjelenéséig, míg 1%-

os mustárolaj oldatban ez az idő szignifikánsan kisebb volt (26 + 4 s). A TRPA1-/-

állatok

farkán mustárolajban detektált elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő szignifikánsan

magasabb volt vad típusú társaikhoz képest (82 + 13 s) (27. B ábra).

55

0

20

40

60

80

100

120

140

TRPV1+/+

szolvens TRPV1+/+

1% MOTRPV1 -/-

1% MO

#

*

Mu

stá

rola

jban

tö

ltö

tt i

dő (

s)

0

20

40

60

80

100

120

140

#

***

TRPA1 +/+

szolvensTRPA1 -/-

1% MOTRPA1+/+

1% MO

Mu

stá

rola

jban

tö

ltö

tt i

dő (

s)

A B

27. ábra: Mustárolajjal kiváltott akut nocifenzív reakció latenciaideje génhiányos (TRPV1 (A), TRPA1 (B))

és vad típusú egerek farkán. A csoportonkénti 8-16 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt

ábrázoltuk. A * p <0,05, *** p <0,001 a vad tipusú egerekhez viszonyított, míg a # p <0,05 statisztikailag

szignifikáns különbségeket jelölik. (egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).

3.5. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő készülék metodikai továbbfejlesztésével lehetőségünk

nyílt az egérfarok vizsgálatára, melyre a korábban alkalmazott módszerek nem voltak

alkalmasak. Alkalmazásával a mérési folyamat illetve az állatok előkészítése gyorsabbá

vált, standardizálva ezzel az emberi jelenlétből adódó különbségeket és az állatokat érő

stressz mértékét. A kidolgozott új metodika megbízható, gyors, preklinikai szűrőmódszerré

válhat.

A fájdalmas hőinger aktiválja a TRPV1 receptort (Caterina és mtsai. 1997), azonban

szerepét az irodalomi adatok szerint eddig kizárólag lábon vizsgálták, amely végtagon az

alap-hőérzékelésben betöltött funkciójának jelentőségét nem tudták igazolni (Caterina és

mtsai. 2000; Almási és mtsai. 2003; Bölcskei és mtsai. 2005), kivéve egy publikációt

(Hoffmann és mtsai. 2013). A TRPV1 receptor eltérő módon vesz részt a hő által kiváltott

nocifenzív viselkedés indukálásában (Caterina és mtsai. 2000). Vizsgálataik során a

TRPV1 génhiányos egerek kevésbé voltak érzékenyek egyes hővel kiváltott ingerekre,

(például a farok 48°C fokos vízbe merítésére), míg másokra fokozottabban reagáltak

(lábon vizsgált fókuszált sugárzó hő). Hasonló ellentmondásos eredményről számolt be

Davis és mtsai., akik TRPV1 receptorokat nem expresszáló DRG neuronokat vizsgáltak

elektrofiziológiai módszerekkel. A vizsgált sejtek fájdalmas intenzitású hőingerekkel nem

56

voltak aktiválhatók, azonban a TRPV1 génhiányos egerek normál módon reagáltak a forró

ingerekre (Davis és mtsai. 2000). Hoffmann és munkatársai TRPV1 és TRPA1 génhiányos,

illetve egyik gént sem tartalmazó TRPV1-/-

/TRPA1-/-

állatok latenciaidejét detektálták

plantar teszt segítségével. Kísérleteik során elsőként tapasztaltak normál körülmények

között mindhárom génhiányos törzsben megnyúlt latenciaidőt vad típusú megfelelőikhez

képest. Feltételezéseik szerint a TRPA1 receptor is részt vesz a hő által kiváltott

nocicepció detektálásában, azonban a TRPV1 receptortól eltérő módon (Hoffmann és

mtsai. 2013).

A módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdő és forró lap módszerek alkalmazásával

lehetőség nyílik a láb és a farok hőérzékelésének egyidejű összehasonlítására. E módszerek

segítségével elsőként szolgáltattunk adatokat arra nézve, hogy TRPV1 génhiányos egerek

farkán mérve szignifikánsan magasabb hőküszöbértékek detektálhatók, mint vad típusú

társaiknál, míg a lábon hot plate-tel mérve nem tapasztaltunk különbséget.

Az általuk tapasztalt eltérő testtájakon vizsgált adatok alátámaszthatják az általunk közölt

és tapasztalt szignifikáns különbségeket, melyeket a TRPV1 génhiányos egerek farkán

mért alap fájdalom küszöbértékekben találtunk. A korábbi adatokkal megegyezően, ez a

különbség a lábon mérve kísérleteinkben sem jelentkezett (Caterina és mtsai. 2000, Almási

és mtsai. 2003). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az egerek hőérzékelésében a farok

nagyobb relevanciával bír, mint a láb, illetve az egyes testtájak feltehetően eltérő receptor

denzitással jellemezhetők.

A metodikai fejlesztésünk másik része egy megbízhatóan működő, validált mustárolaj által

kiváltott hiperalgézia modell beállítása volt. Korábbi irodalmi adatokból ismert, hogy a

mustárolaj TRPA1 receptor aktivátor (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai. 2004).

Kísérleteinkben a TRPA1 génhiányos egerekben és vad típusú kontrolljaikban a mustárolaj

által kiváltott gyulladásos hiperalgézia mind a farkon, mind pedig a lábon ugyanakkora

mértékű volt, amelyből arra következtettünk, hogy bár a mustárolaj számos rendszerben

aktiválja a TRPA1 receptort, esetünkben csak a mustárolaj kiváltotta nocifenzív

viselkedésben játszott szerepet. A mustárolaj a TRPV1 vad típusú egerekben is testtájtól

függetlenül indukált gyulladásos (termális és mechanikai) hiperalgéziát. A kialakuló

hiperalgézia mértéke azonban TRPV1 génhiányos egerek esetében szignifikánsan kisebb

mértékű volt. Mivel azonban a TRPV1-/-

egerekben is kialakult a hiperalgézia, feltehetően

más, még nem azonosított elemek is szerepet játszhatnak kialakulásának

mechanizmusaiban.

57

A kapott eredmények alapján erősen feltételezhető, hogy a mustárolaj nem szelektív a

TRPA1 receptorra nézve, hanem a TRPV1 receptort is aktiválja. Ezt a nézetet támasztja alá

Everaerts és munkatársai, akik szerint a mustárolaj a TRPV1 ioncsatorna meghatározó

mediátora. (Everaerts és mtsai. 2011). Feltételezésük szerint a mustárolaj a TRPV1 lassú

és tartós aktiválásával az akut fájdalomérzést, míg a TRPA1 gyors és átmeneti

stimulálásával a már korábban részletezett neurogén gyulladást hozza létre (Everaerts és

mtsai. 2011). Az elektrofil ágensek e csatornákat a citoszolikus cisztein oldalláncok

kovalens modifikációja révén aktiválják (Hinman és mtsai. 2006), azonban a mustárolaj

okozta TRPV1 aktiváció mechanizmusa nem pontosan ismert. Feltételezések szerint a

mustárolaj által kiváltott TRPV1 receptor aktivációban a cisztein oldalláncok kovalens

módosulása mellett az aktiváció eredményessége nagymértékben függ az S513-as

kapszaicin kötőhelyet is tartalmazó oldallánc modifikációjától (Gees és mtsai. 2013). In

vitro kísérletek során Alpizar és munkatársai TRPV1 receptor-overexpresszált

sejtvonalakat vizsgáltak patch clamp és intracelluláris Ca2+

imaging módszerekkel. A

vizsgált sejtvonalak hőingerekre mustárolaj jelenlétében szignifikánsan nagyobb

csatornaaktivációt mutattak, mint kontroll körülmények között (Alpizar és mtsai. 2014).

Kísérleteinkban a TRPA1 receptor a mustárolaj indukálta hiperalgézia modellben nem,

csak a nocifenzív reakció vizsgálatakor játszott szerepet. Ezen eredmények

ellentmondanak Salas és munkatársai génexpressziós hipotézisének, mely szerint TRPV1

gén kiütésével, a TRPA1 receptor génexpressziója is csökken egy még nem ismert

mechanizmusú interakció révén, és ennek eredményeképpen a sejtfelszínen a TRPA1

receptor „down-regulálódik” (Salas és mtsai. 2009). Így a mustárolaj csak azokon az

idegvégződéseken tudja kifejteni a hatását, ahol e két ioncsatorna nem koexpresszálódik,

azonban ezek a neuronok az összmennyiséghez képest kis hányadot képviselnek, így a

gyulladásos hiperalgázia kisebb és az akut fájdalom elhárító viselkedés reakcióideje

hosszabb lesz a TRPV1 gén hiánya esetén. Tehát fájdalommodelljeinkben a TRPV1

játszotta a kulcsszerepet, hiszen esszenciálisnak bizonyult mind a fájdalomérzékelésben,

mind a mustárolaj-indukált hiperalgéziában.

A perifériás és centrális szenzitizáció patomechanizmusaiban feltételezhetően a TRPV1 és

TRPA1 receptorok is szerepet játszanak. Szöveti károsodás során a bőrben vagy a belső

szervekben található nociceptorok ingerküszöbe lecsökken a felszabaduló gyulladásos

mediátorok hatására, így kialakul a perifériás szenzitizáció (Mezei és mtsai. 2002). Ezek a

gyulladásos mediátorok (pl. lipoxigenáz termékek, prosztaglandinok, bradikinin stb., lásd

58

9. oldal) a TRPV1 és a TRPA1 receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Ezt követően a

gerincvelő hátsó szarvában elhelyezkedő neuronok érzékenysége fokozódik, mivel a

nociceptorok felől érkező folyamatos ingerek hatására excitátoros neurotranszmitterek (pl.

glutamát) szabadulnak fel. Krónikus fájdalomingerek hatására ezen neurotranszmitterek

túlprodukciója eredményeként a hátsószarvi gátló interneuronok egy része elpusztul.

Fokozódik a Na+- és a Ca

2+ csatornák illetve a kolecisztokinin (CCK) receptorok

expressziója, ami hiperexcitabilitáshoz és leszálló fájdalom-moduláló pálya gátlásához

vezet (a CCK antagonizálja az endogén opioidok hatását). Mindezek következtében

csökken a fájdalomküszöb, az agyat egyre több fájdalominger bombázza, amely az agyi

fájdalom-feldolgozásban részt vevő struktúráinak túlérzékenységéhez, vagyis a centrális

szenzitizációhoz vezet (Meyer 2006). A TRPV1 receptor hiánya feltehetően csökkentette a

mustárolaj beadása után (korai fázisban) a perifériás szenzitizáció révén kialakuló termális

hiperalgéziát, illetve a centrálisan (késői fázisban) kialakuló mechanikai hiperalgéziát.

59

4. fejezet: Komplex Regionális Fájdalom Szindróma (CRPS)

passzív transzfer-trauma egérmodellje

Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János

Szolcsányi, Victoria Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A

CRPS-IgG-transfer-trauma model reproducing inflammatory and positive sensory signs

associated with Complex Regional Pain Syndrome.

Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18


Neuro-immun interakciók

Az idegrendszer és az immunrendszer között kétirányú kapcsolat áll fenn. Az

idegvégződésekből felszabaduló mediátorokaz immunsejtek működésének modulálása

révén a gyulladásos folyamatokat fokozni vagy csökkenteni képesek. Az aktivált

immunsejtekből felszabaduló transzmitterek visszahatnak az érzőideg-végződésekre,

stimulálják, szenzitizálják azokat, amely a fájdalom fokozódásához, további neuropeptid-

kiáramláshoz vezet (Gallowith-Puerta és Pavlov 2007).

A neurogén gyulladásos mechanizmusok fontos szerepet játszanak számos krónikus,

perzisztáló fájdalommal járó gyulladásos kórképben, pl. rheumatoid artritiszben (Levine és

mtsai. 1986), így feltételezésünk szerint a Komplex Regionális Fájdalom Szindróma

(Complex Regional Pain Syndrom: CRPS) kialakulásában is.

A CRPS klinikai jellemzői

Pontos epidemiológiai adatok a betegség sokféle formája és diagnosztikus nehézségei miatt

nem állnak rendelkezésre. A nemek közti megoszlási aránya 4:1, melyben a nők aránya

sokkal nagyobb. A megbetegedettek átlagos életkora 37 év (de M és mtsai. 2007). Sem a

betegség etiológiája sem pedig pontos patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek.

Hátterében kisebb sérülés (rándulás, ficam, törés) hatására az érzőideg végződésekből

felszabaduló antigének elleni túlzott immunválaszt és összetett neuro-immun interakciókat

valószínűsítenek (Blaes és mtsai. 2007) (28. ábra).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24145209

60

28. ábra: A betegség kialakulásának feltételezett mechanizmusa.

A betegség korábbi elnevezése volt többek közt a reflex szimpatikus disztrófia (CRPS I)

vagy kauzalgia (CRPS II). Az egyes tünetek egyénenként eltérő módon és gyakorisággal

jelentkeznek, mely rendkívül nehézzé teszi a diagnózis felállítását. Az IASP 2010-ben

egységesítette az elnevezését és meghatározta a diagnosztikus kritériumokat (Harden és

mtsai 2010). Két fő típusát különböztetik meg: 1) egyes megbetegedések (vírusfertőzés,

szívroham) után kialakuló valódi idegsérüléssel nem járó típusát (CRPS I), illetve 2)

tényleges idegsérüléssel járó formáját (CRPS II).

A betegség klinikai tüneteit 4 nagy csoportba oszthatjuk: a; abnormálisan fokozott

fájdalomérzékelés, b; ödéma, vasomotor és szudomotor abnormalitások, c; a bőr színének

és hőmérsékletének megváltozása, d; motoros funkciózavarok és trófikus elváltozások (29.

ábra).

29. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek végtag- elváltozásai.

61

A tünetek az esetek egy részében spontán gyógyulnak, azonban nagyobb részüknél

fokozódnak és hosszan, akár hónapokig, sőt évekig fennmaradó perzisztáló intenzív

fájdalomállapot alakul ki. A jelenleg rendelkezésre álló terápia nem kielégítő, az

alkalmazott gyógyszerek nem, vagy kismértékben hatásosak, ugyanakkor súlyos

mellékhatásokkal járnak. A betegség lefolyását nagymértékben meghatározza a kezelés

megkezdésének időpontja.

A korábban néhány páciensnél alkalmazott plazmaferezis hatékonynak bizonyult, mely az

autoantitestek által mediált immunreakciók lehetséges szerepére utalnak (Goebel és mtsai.

2010, 2011, Kohr és mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011). A patogén autoantitestek által

okozott megbetegedések vizsgálatára alkalmazható egyik módszer a humán vérszérumok

tisztított IgG frakcióinak intraperitoneális beadása rágcsálókba (passzív transzfer).

Miaszténia gravisz és pemfigusz vizsgálata során leírták, hogy a sejtfelszíni epitópok

felismerésének képessége a fajok közti transzfert követően megőrződtek (Toyka és mtsai

1975, Anhalt és mtsai. 1982). A sikeres passzív transzfer kísérletek e típusa ezért alkalmas

az autoantitestek betegségben betöltött szerepének közvetlen vizsgálatára (Rose és mtsai.

1993), emellett megfelelő modellként szolgál az egyes patomechanizmusok

feltérképezésére, illetve új terápiás eszközök fejlesztésére. Kollaborátorunk korábbi

eredménye (Goebel és mtsai 2011, 2013), hogy hosszan fennálló CRPS-ben szenvedő

páciensek passzív transzferrel átvitt tisztított IgG frakciói csökkentik intakt egerek (sérülés

nélküli) exploráló viselkedését, bár fokozott fájdalomérzetet (hiperalgézia) és ödémát nem

tapasztaltak. Mivel a CRPS főként valamilyen trauma után alakul ki, feltételezhető, hogy a

passzív transzfer sikere függ a trauma meglététől, például valamilyen sérülés által kiváltott

helyi gyulladás szükséges a keringő autoantitestek megkötéséhez (a megkötött antitestek

pedig valószínűleg tovább fokozzák a már kialakult gyulladás mértékét).

A SP, CGRP, TNF-alfa és interleukin-6 (IL-6) szintek kórosan emelkedtekCRPS-sel

érintett bőrből vett ödémafolyadékban (Weber és mtsai 2001, Huygen és mtsai 2002).

CRPS csonttöréses rágcsáló modelljeiben az interleukin 1-béta (IL-1 béta) szintje és a

korábbi eredeményekkel összhangban a szöveti SP koncentrációja is megemelkedett (Guo

és mtsai. 2004, Kingery és mtsai 2010). Kísérleteink során a szöveti mikrosérülés

modellezésére plantáris bőr-izom incíziót végeztünk az állatokon.

62

CÉLKITŰZÉS

Mivel a betegség etiológiája és patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek, a

rendelkezésre álló terápia pedig sok esetben egyáltalán nem hatásos, feltétlenül szükség

van a pontos kórélettani folyamatok feltérképezésére és potenciális új típusú

gyógyszercélpontok azonosítására. Ez megfelelő állatmodell hiányában ezidáig nehéznek

bizonyult.

PhD munkám e részének célja ezért egy megbízhatóan működő CRPS passszív-transzfer

egérmodell beállítása és integratív vizsgálata volt a Liverpooli Egyetem Fájdalom

Központjával való kollaboráció segítségével (dr. Andreas Goebel, Department of

Translational Medicine, és Walton Pain Center, University of Liverpool).

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés

Kísérleteinkben dr. Andreas Goebel által küldött 6 CRPS szindrómában szenvedő páciens

és 6 egészséges önkéntes szérumaiból tisztított IgG frakciót vizsgáltuk az általunk

kidolgozott egérmodell kísérleti paradigmájában. A kiválasztott 6 beteg mindegyike esetén

a 12 hónapnál régebben fennálló tüneteik kielégítették az IASP által elfogadott CRPS

diagnosztikus kritériumait (Harden és mtsai. 2010), perzisztáló fájdalmaik intenzitása 5

vagy annál magasabb volt a numerikus fájdalom-mérő skálán (0-10), nem szenvedtek más

krónikus fájdalommal vagy gyulladással járó megbetegedésben, illetve a Walton Pain

Center gondozása alatt álltak minimum egy éve. Egészséges önkénteseknek a páciensekkel

megegyező korú és nemű (+ 10 év) alanyokat választottunk, akik nem szenvedtek

semmilyen krónikus fájdalommal járó kórképben és elsőfokú rokonaik között nem volt

autoimmun beteg.

A vizsgálati alanyoktól 150 ml vért vettek, melyet lecentrifugáltak. Az IgG frakciók

elválasztásához az így kapott szérumokat affinitás kromatográf módszer alkalmazásával G

protein-kötő microgyöngyöket (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) tartalmazó oszlopon

engedték át a korábban leírt módszer alapján (Buckley és mtsai 2005). Az etikai

engedélyek száma: ISRCTN63226217, 12/NW/0126.


Kísérleteinkhez C57Bl/6 állattörzsbe tartozó nőstény egereket (8-10 hetes, 18-23 g)

használtunk. Az eredeti szülőpárokat a Jackson Laboratories (USA) cégtől vásároltuk

63

magyarországi forgalmazójukon a Charles River Hungary-n keresztül, majd intézetünk

állatházában tartottuk és szaporítottuk 24-25 °C-on, normál rágcsálótáppal és vízzel ad

libitum ellátva. Az egyes vizsgálatokat minden esetben azonos személy végezte, aki a

pontos kezelési protokollt nem ismerte.

Kísérleti protokoll

6 CRPS beteg véréből származó tisztított IgG frakciót adtunk be i. p. az állatoknak (5-7

egér/csoport/páciens). A kontroll egerek csoportjai egészséges önkéntesekből származó

tisztított IgG-t vagy fiziológiás sóoldatot kaptak. A beadott egészséges és CRPS-ben

szenvedő betegekből származó IgG-k koncentrációi megegyeztek.

A három egymást követő napon mért kontrollmérések előtt minden esetben szoktató

mérést végeztünk, melynek eredményeit a kiértékelésnél nem vettük figyelembe. A kísérlet

0. napjának a talpbőr-izom incízió műtét idejét tekintettük. A kezeléseket a -1., 0. illetve

az 5. és 6. napokon alkalmaztuk i.p. injekció formájában napi kétszer. Minden egér

összesen 6 ml IgG szérumot, illetve fiziológiás sóoldatot kapott (reggelente 1ml, és késő

délután 0,5 ml minden kezelési napon). A kísérlet 8. napja alatt mértük a mechanikai

érzékenységet (fájdalomküszöböt) dinamikus plantáris észteziométerrel, a lábtérfogatot

pletizmométerrel, a hideg érzékenységet a 0°C-os vízből való végtagkihúzás

latenciaidejének detektálásával, a spontán lokomotoros aktivitást open field teszttel, a

mozgáskoordinációt RotaRod kerékkel, továbbá a talphőmérsékletet kontakthőmérővel-,

ill. a testsúlyt. A kísérlet 8. napján az állatokat túlaltattuk, a hátsó végtagokat a tibio-

tarzális ízületekkel együtt eltávolítottuk és -80°C-on tároltuk a szövetek neuropeptid és

citokin koncentrációinak meghatározásáig (30. ábra).

64

30. ábra A kísérleti protokoll.

Vizsgálati modell

A kísérleti elrendezést és paradigmát a 30. ábra foglalja össze.

Plantáris bőr és izom incízió

Az értekezésem korábbi fejezetében már ismertetett, eredetileg patkány modellen (Brennan

és mtsai. 1996) kidolgozott, de egérre is adaptált (Banick és mtsai. 2006, Pogatzki-Zahn és

mtsai. 2007) plantáris bőr-izom incíziót alkalmaztunk. Az állatokat ketamin és xylazin

keverékével (100 és 5 mg/kg i.p) altattuk, majd a jobb talp bőrét 0,2 cm-re a saroktól 0,5

cm hosszan hosszanti irányban bemetszettük az izmot és kötőszövetet is érintve. A sebet

5.0 steril fonallal zártuk, majd fertőtlenítettük. Az állatok mindhárom kezelési csoportban

az inciziót követően maguk távolították el a varratokat 1-2 napon belül.

VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

Érintési érzékenység vizsgálata

A CRPS egyik leggyakoribb klinikai tünete a fájdalom és a mechanikai hiperalgézia. A

talpbőr érintési érzékenységének vizsgálatára a korábban már bemutatott dinamikus

plantáris észteziométert használtuk. A méréseket a passzív-transzfer kezelés előtt és az 1.,

2., 3., 7. és a 8. napokon végeztük.

65

Lábtérfogat mérése

Mivel a CRPS másik meghatározó klinikai tünete az érintett végtagok erőteljes duzzadása,

kísérleteinkben a láb térfogatának változásait pletizmométerrel vizsgáltuk a passzív-

transzfer kezelés előtt (kontroll) és 1., 2., 3., 7. és a 8. napon.

Hő- és hidegérzékenység

Mind a hő, mind a hideg hiperalgézia/allodínia a CRPS-ben szenvedő páciensek közel

egyharmadát érinti. A korábban már bemutatott emelkedő hőmérsékletű forró lappal

vizsgáltuk az állatok fájdalmas hőküszöbét a műtét előtt, valamint az 1., 2., 3., 7. és 8.

napokon. A hideg érzékenység meghatározásához az egerek érintett végtagját 0°C-os

(jeges) vízbe merítettük és az elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk a kezelések előtt,

illetve a 3., 7. és 8. napokon.

Spontán súlyeloszlás vizsgálata

A hátsó végtagok spontán súlyeloszlásának vizsgálatát a kontroll mérések elvégzése után a

kísérlet 1, 2, 3, 7 és 8. napján végeztük.

Spontán lokomotoros aktivitás

Spontán lokomotoros aktivitás mérésére open field tesztet alkalmaztunk. A méréseket a

kísérlet 0. és 6. napján végeztük.

Motoros koordináció

A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát RotaRod készülékkel vizsgáltuk a kísérlet

0. és 6. napján. A forgó henger sebessége az első 10 másodpercben konstans 4 rpm volt,

majd 5 perc alatt 40 rpm-re gyorsult fel.

Talphőmérséklet meghatározása

A talp hőmérsékletét kontakthőmérővel mértük meg a kísérlet 7. napján.

Testtömeg monitorozása

Az állatok testsúlyát a kísérlet minden napján azonos időben mértük.

Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet-homogenizátumokból

Miután az összes funkcionális tesztet elvégeztük a kísérlet 8. napján (30. ábra), az

egereken ketamin-xilazin altatás alatt cervikális dislokációt végeztünk. Ezt követően

66

mindkét hátsó lábat lemetszettük a tibiotarzális ízülettel együtt, majd az ujjakat

eltávolítottuk és a mintákat steril foszfát pufferben homogenizáltuk. A CGRP- és SP- szerű

immunreaktivitás mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk, míg a

vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex® 100™ x MAP módszerrel határoztuk

meg a gyártó cég ajánlása szerint. A kapott értékeket a neuropeptidek esetében fmol/mg-

ban, míg a citokinek esetében pg/mg-ban, 1 mg nedves szövetre vizsgálva ábrázoltuk.

EREDMÉNYEK

A kísérletsorozatba bevont 6 CPRS-ben szenvedő páciens demográfiai megoszlását és

betegség karakterisztikáját az 4. táblázat mutatja.

Páciensek

1 2 3 4 5 6

Kor 48 43 60 34 37 50

Nem nő férfi férfi nő nő nő

Érintett végtag alsó mindkét

alsó felső alsó alsó alsó

Kiváltó ok táncolás kis ütés

plexus

brachiális

malignus

tumor operáció

Freiberg-

szindróma

operáció

és

reoperáció

Morton-

neuroma

operáció

bokatörést

követő

operáció

CRPS típusaa 1 1 2 1

nincs

meghatá-

rozva

1

Betegség

fennállása 6 5,1 7 5-7

b 1 8-10

b

Fájdalom

intenzitásac

7 7,5 10 7 5,5 8

Nyomásérzékeny-

ség az érintett

végtagon

+ + + + + +

További

megbetegedések

pikkelysömör

, glutén-

érzékeny

enteropátia,

anémia

pernicióza

nincs

korábbi

miokardiális

infarktus

Freiberg-

szindróma asztma

diabetes

mellitusz 2-es

típus, magas

vérnyomás,

magas

koleszterin,

pajzsmirigy

túlműködés

4. táblázat A vizsgált páciensek demográfiai és betegség jellemzői a 1 = tényleges idegsérülés nélküli típus, 2 = tényleges idegsérüléssel járó típus

b A sorozatos operációk miatt a megbetegedés pontos időpontja nem meghatározható vagy a páciens nem

emlékszik c

: 24 órán keresztül a 11 pontos numerikus skálán (0-10) vizsgált fájdalom átlaga, ahol 0= nincs fájdalom,

10= az elképzelhető legnagyobb fájdalom

67

Mechanikai hiperalgézia

A műtött lábon az operációt megelőzően mért mechanonociceptív küszöbök átlagai között

nem volt szignifikáns különbség, 7,22 + 0,09 g volt a fiziológiás sóoldatottal kezelt, 7,23 +

0,09 g és 7,09 + 0,10 az egészséges és CRPS IgG-t kapott csoportokban. Az elvégzett talp

bőr-izom incízió 45-50%-kal csökkentette a küszöbértéket az 1. napon mindhárom

csoportban, mely a fokozott fájdalomérzékenységet demonstrálta. A fiziológiás sóoldattal

kezelt kontroll csoportban a mechanikai hiperalgézia 25,74 + 2,30 %-ra és 16,01 + 2,24 %

-ra mérséklődött a műtétet követő 2. és 3. napra, majd később ez utóbbi szinten állandósult.

Szignifikánsan nagyobb mechanikai küszöbcsökkenést detektáltunk a CRPS IgG-vel kezelt

állatcsoportban a 7. napon az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post

hoc teszt, p <0,001, 31. ábra). A 7. napon mért átlag küszöbcsökkenés a CRPS IgG

csoportban 31,41 + 1,7 % volt, mely szignifikánsan nagyobb volt az egészséges IgG-vel

kezelt csoport küszöbcsökkenésénél (-19,94 + 3,42 %). Az ellenoldali, nem műtött lábon a

küszöbcsökkenés 5 %-nál kisebb volt mindhárom csoportban (nem ábrázolt adatok).

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG

***

###

++ ++

### ###

Mûtét után eltelt napok

Me

ch

an

on

oc

ice

ptí

v k

üs

zö

b

vá

lto

zá

sa

(%

)

Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG-40

-30

-20

-10

0

**###

Me

ch

an

on

oc

ice

ptív

kü

szö

b

vá

lto

zá

sa

(%

)

A B

31. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek és egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy a

fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott mechanikai hiperalgéziában egérlábon. A szérum

IgG-k vagy a fiziológiás sóoldat teljes mennyisége 1,5 ml/nap/ egér, a kezelések a kísérlet -1. 0. 5. és 6.

napján intraperitoneálisan történtek. Az ábra A része az összes kísérletből származó eredményt szemlélteti,

melyek az egyes kezelt csoportok érintési érzékenységének százalékos változásainak átlagait a standard

hibával együtt ábrázolják (n=30-37 egér/csoport). *** p <0,001 CRPS vs. Egészséges IgG; ### p <0,001

CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás sóoldat (kétutas ANOVA Bonferroni

post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat muatatja, ahol az egyes pontok az állatok azon

csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy

normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az átlagot jelzik.

68

Lábduzzadás

Az operációt megelőzően mért lábtérfogat-értékek átlaga mindhárom csoportban

(fiziológiás sóoldattal, illetve egészséges- vagy CRPS- IgG–vel kezelt egerek) hasonló,

10,29 + 0,2 cm3, 10,04 + 0,1 cm

3 és 9,97 + 0,1 cm

3 volt. A plantáris inciziót követő 1.

napon a lábduzzadás 20,56 + 2,52 % volt a fiziológiás sóoldattal kezelt csoportban, majd a

7. napig fokozatosan csökkent 10,52 + 1,83 % -ra. A CRPS IgG-vel kezelt csoportnál a 2.

és 3. napon szignifikánsan nagyobb volt a lábduzzadás mértéke az egészséges IgG-vel

kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post hoc teszt, p <0,001, 32. A ábra). A CRPS

betegekből származó IgG-vel kezelt csoportban a 2. napon mért átlag lábtérfogat 32,3 + 1,8

% volt, mely 45 %-kal magasabbnak bizonyult az egészséges IgG-vel kezelt állatok

lábtérfogat értékénél (22,3 + 2,2 %). A lábtérfogat változások minden sorozatban

nagyobbak voltak a beteg IgG-vel kezelt állatoknál, mint az egészséges IgG-vel kezelt

csoportban. Az ellenoldali, nem műtőtt lábon mért lábtérfogat-változás minden csoportban

3%-nál kisebb volt (nem ábrázolt adat).

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 80

10

20

30

40

Fiz. só

CRPS IgG

Egészséges IgG

***###

# ##

+

*###

Műtét után eltelt napok

Lá

bd

uzza

dá

s (

%)

Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG0

10

20

30

40

**###

Lá

bd

uzza

dá

s (

%)

A B

32. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek illetve egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy

fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott lábduzzadásra. A kezelés időpontjait lásd a 33.

ábrán. Az ábra A része a kísérletsorozat összesített eredményét mutatja (n=30-37/kezelés/állat, melyben a

megfelelő kezdeti kontroll értékekhez viszonyított százalékos változásokat ábrázoltuk. *** p <0,001 CRPS

vs. Egészséges IgG; ### p <0,001 CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás

sóoldat (Kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat mutatja,

ahol az egyes pontok az állatok azon csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges

önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az

átlagokat jelölik.

69

Hő- és hideghiperalgézia

A termonociceptív hőküszöböt emelkedő hőmérsékletű forró lappal határoztuk meg

kísérleteink első két sorozatában, azonban szignifikáns változásokat nem találtunk az egyes

csoportok között (33. A ábra). Ezért későbbi kísérleteink során e módszerrel nem

folytattuk tovább a tesztelést, helyette a hideg érzékenységet kezdtük el vizsgálni. A

fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll állatoknál a 0 °C-on mért lábkihúzás átlag

latenciaideje az incízió előtt 157,25 + 8,26 s volt, mely a műtétet követő 3. napon 52,04 +

6,45 s-ra csökkent, ehhez hasonló eredményeket tapasztaltunk a CRPS-es és az egészséges

IgG–vel kezelt csoportoknál is. A kialakuló hideg hiperalgézia a kísérlet elejétől a 8. napig

mindhárom csoportban fennállt, az egyes csoportok között szignifikáns különbség nem

volt (33. B. ábra).

Spontán súlyeloszlás

A spontán súlyeloszlást kísérleteink első két sorozatában vizsgáltuk. Mivel azonban a 3.

napon mindhárom csoportban a műtőtt oldali terhelésben csak kismértékű, de nem

szignifikáns csökkenést detektáltunk, kísérleteink további részében a vizsgálatokat nem

folytattuk tovább (33. C ábra).

Spontán lokomotoros aktivitás és motoros koordináció

A 0. és 6. napon meghatározott spontán lokomotoros aktivitást a keresztezett mezők és az

ágaskodások száma, a vizsgálati mező közepén tartozkodás ideje, illetve a mozgással és

mosakodással töltött idő alapján értékeltük, azonban egyik paraméterben sem volt

szignifikáns eltérés (33. D ábra).

A kísérlet 0. napján RotaRod készülékkel elvégzett motoros koordinációs mérésekben sem

találtunk szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (nem ábrázolt adat).

Kísérleteink első két sorozatában a 6. napon is végeztünk méréseket. Mindhárom kezelési

csoportban egyformán megnyúlt a leesésig eltelt idő, az ebben szerepet játszó tanulási

folyamatnak köszönhetően (Butriago és mtsai 2004), így a későbbiekben a 6. napon már

nem folytattuk a tesztelést.

70

Talphőmérséklet és a testsúly változása

Nem találtunk szignifikáns különbséget sem a műtőtt lábon mért talphőmérsékletek

abszolút értékeinek átlagaiban, sem pedig a 7. napon mért átlag talphőmérséklet

különbségekben egyik vizsgált csoportban sem. Így a 3. sorozat után abbahagytuk a

talphőmérséklet vizsgálatát (33. E ábra).

A fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoport testsúlyának átlaga 18,26 + 0,25 g volt, míg

az egészséges IgG-vel illetve betegekből származó IgG-vel kezelt csoportoknál 18,95 +

0,29 g és 18,53 + 0,23 g volt. A kísérletek során mért súlyváltozások nem voltak

szignifikánsan különbözőek (33. F ábra).

1 2 3 4 5 6 7 842

43

44

45

46

47

48

Fiz. sóEgészséges IgG

CRPS IgG


Fá

jda

lma

s h

ők

üs

zö

b (

°C)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

40

60

80

100

120

140

160

180

Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG


0°C

fo

ko

s v

ízb

en

tö

ltö

tt id

ő (

s)

0 1 2 3 4 5 6 7 8-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG


Te

sts

úly

-vá

lto

zá

s (

%)

A B

C D

E F

0 1 2 3 4 5 6 7 8-10

-5

0

5

Fiz. só

Egészséges IgG

CRPS IgG


Éri

nte

tt v

ég

tag

sú

lye

los

zlá

s

vá

lto

zá

sa

(%

)

Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG0.0

0.5

1.0

1.5

7. n

ap

on

mé

rt

job

b é

s b

al

talp

hő

mé

rsé

kle

t

kü

lön

bs

ég

e (

°C)

0

5

10

15

20

25

30

35

400. nap 6. nap

Fiz. só Fiz.só EgészségesIgG

EgészségesIgG

CRPSIgG

CRPSIgG

Ág

asko

dáso

k s

zám

a

33. ábra A humán IgG kezelés és a plantáris bőr-izom incízió következtében kialakuló viselkedésbeli

eltérések valamint a testsúly változásai. Az ábra A része az első két szériában vizsgált emelkedő

hőmérsékletű forró lappal mért fájdalmas hőküszöböt, a B rész a jeges vízből való lábkihúzási

latenciaidőkkel jellemzett hideg érzékenységet mutatja a két első széria kivételével az összes vizsgálati

71

csoportban, míg a C rész az első 2 széria érintett végtagon mért spontán nehézkedését ábrázolja. A D

grafikon a kísérlet 0. és 6. napján open field tesztben mért ágaskodások számát szemlélteti, míg az E

grafikonon a kontakthőmérővel a 7. napon mért talphőmérsékleti különbségek (abszolút értékű különbségek

a műtött és kezeletlen talpak között) látszanak. Az F grafikon a kísérlet során naponta megmért testsúly

változásait szemlélteti. Az adatok átlagait a standard hibákkal együtt ábrázoltuk.

Lábhomogenizátumokban mért gyulladásos neuropeptidek és citokinek

koncentrációja

Az intakt lábak homogenizátumaiból meghatározott SP immunreaktivitásban nem találtunk

szignifikáns különbséget a csoportok között. Incízió hatására a 8. napon kivett mintákban

nagymértékben megemelkedett a SP koncentráció mindhárom csoportban a kontroll lábhoz

viszonyítva, ugyanakkor a műtött lábból mért a SP koncentráció a CRPS IgG-vel kezelt

csoportban szignifikánsan magasabb volt az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest

(34. A ábra, CRPS csoport: 30,3 + 9,3 fmol/mg, egészséges csoport: 22,9 + 6 fmol/mg,

átlag különbség: 7,5 fmol / mg, a különbség 95%-os konfidencia intervalluma: 2,8-12,1

fmol/mg, p <0,001 egyutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Ezzel szemben a CGRP

immunoreaktivitás nem változott sem az incízió, sem pedig az IgG kezelések hatására (34.

B ábra). Az IL-1béta, IL-6 illetve TNF-alfa koncentrációi nem különböztek az egyes

kezelési csoportok között (34. C-E ábra).

Potenciálisan befolyásoló tényezők

A kísérletsorozat során vizsgált betegek közül az egyik kísérőbetegségként

pikkelysömörben (arthritis psoriatica) szenvedett (4. táblázat), mely ugyan fájdalommal

járó, de nem autoantitestek által mediált megbetegedés. Összességében a 6 vizsgált beteg

többé-kevésbé eltérő etiológiai tényezői és klinikai jellegzetességei ellenére a 6

egérkísérlet-sorozat eredményeiben jelentős különbségeket nem tapasztaltunk.

72

0

5

10

15

20

25

30

35

40

intakt műtőtt

SP

##

***+++

###

#

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

P-a

ny

ag

(S

P)

ko

nc

en

trá

ció

(fm

ol/m

g)

CGRP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

intakt műtött

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgGFiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

CG

RP

ko

nc

en

trá

ció

(fm

ol/m

g)

IL-1

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

intakt műtött

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgG

CRPS

IgG

pg

/1m

g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

IL-6

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

intakt műtött

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgG

CRPS

IgG

pg

/1m

g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

TNF-

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

intakt műtött

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgGCRPS

IgG

Fiziológiás

sóoldat

Egészséges

IgG

CRPS

IgG

pg

/1m

g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

A B

C D

E

34. ábra A humán IgG kezelés hatásai szenzoros neuropeptidek és gyulladásos citokinek hátsó lábakban

mért koncentrációira. A műtét utáni 8. napon a szöveti P-anyag (SP; A ) és kalcitonin gén- rokon peptid

(CGRP; B) koncentrációit a hátsó lábak homogenizátumaiból vizsgáltuk rádióimmunesszé módszerrel. Míg

az interleukin 1-béta (IL-1β; C), interleukin-6 (IL-6; D) és tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α; E)

koncentrációit Luminex módszerrel és/vagy enzim-kötött immunspecifikus módszerrel (ELISA) határoztuk

meg ugyanazon mintákból. Az oszlopok a koncentrációk átlagait jelölik a standard hibával együtt, ahol n=

30-37 egér/ kezelés (SP, CGRP, TNF- α) és n= 6-13 egér/ kezelés (IL-1β, IL-6). # p <0,05, ## p <0,01, ### p

<0,001 vs. a megfelelő intakt láb,*** p <0,001vs. Egészséges IgG kezelés és +++ p <0,001vs. fiziológiás

sóoldat a kezelt lábon vizsgálva (kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel).

73


Elsőként igazoltuk, hogy mikrosérülést követően kialakuló CPRS legjelentősebb klinikai

tünetei (perzisztáló fájdalom/hiperalgézia, ödéma) a betegek tisztított IgG frakcióival,

passzív transzferrel átvihetők egerekbe. A CRPS-ben szenvedő betegek a kiváltó trauma

után nem sokkal, tipikusan erős fájdalomról illetve jelentős, a végtagot érintő különböző

kóros változásokról számolnak be. A betegek többsége viszonylag hamar spontán gyógyul,

míg az esetek körülbelül 15 %-ban a tünetek krónikussá válnak (Birklein és mtsai. 2004, de

MM és mtsai. 2009), a fájdalom perzisztál, a kezdeti végtag-elváltozások, mint pl. az

ödéma, fokozódik. Egérmodellünk is jellemzően ez utóbbi mintázatot követi. A kapott

eredmények arra utalnak, hogy a CRPS-es megbetegedésekben az autoantitestek fontos

szerepet játszanak. Az ínciziós műtét nélküli passzív transzferes kezelés korábban közölt

irodalmi adataihoz hasonlóan, jelenlegi kísérleteinkben is minden funcionális eltérés

viszonylag gyorsan, a 8. napra normalizálódott, amely az egereknek beadott humán IgG

metabolizmusával magyarázható (Goebel és mtsai. 2005). Ennek kivédésére a 7. illetve 8.

napon alkalmazott újbóli IgG-kezelés jó megoldásnak ígérkezik, azonban ehhez szükség

lenne mind a rendelkezésre álló szérum mennyiségének növelésére, vagy kiegészítő

ciklofoszfamid kezelésre, mely mérsékli az ismeretlen immunmechanizmusok

következtében kialakuló szérumbetegséget (Bucley és mtsai. 2005).

A hideg hiperalgézia feltehetően elsősorban a perifériás idegvégződések szenzibilizációja

révén alakul ki, míg a mechanikai hiperalgézia kialakulásában centrális szenzibilizációs

mechanizmusok is játszanak fontos szerepet (Meyer 2006). Bár a hideg hiperalgéziában az

egyes csoportok között nem volt különbség, a mechanikai hiperalgézia súlyosbodott a

CRPS- IgG-vel kezelt állatokban. Ennek oka feltehetően az, hogy a centrális szenzitizáció

is szerepet játszhat a CRPS IgG által közvetített mechanikai hiperalgézia súlyosságának

kialakításában. A centrális szenzitizáció, perifériás trauma által kiváltott érzékenység-

fokozódás a hátsó gyöki primér szenzoros neuronokban és a gerincvelői szekunder érző-

idegsejtekben, melynek következtében perifériás hiperérzékenység alakul ki (Latremoliere

és Woolf 2009). Scherer és mtsai. 2010-ben publikált eredménye, hogy plantáris inciziót

követően nem változott egerekben a hidegérzékenység, ha az állatokat 0°C-os lapra

állították és a lábnyalási latenciaidejőt vizsgálták. Ezzel szemben mia kísérleteink során

erős posztoperatív hideg hiperalgéziát detektáltunk. Az eltérő eredmények magyarázata az

lehet, hogy a műtőtt láb 0°C-os vízbe merítésekor sokkal nagyobb terület válik érintetté,

mint a hideg lapon, ahol csak a talp van kitéve a stimulusnak. Mivel hidegtolerancia-

74

csökkenés a CRPS kezeléstől függetlenül jelentkeztek, nem tekinthetők a CRPS-transzfer

következményének.

Kollaborátorunk (Goebel és mtsai. 2011) intakt egreken mért korábbi eredményeivel

szemben az open field tesztben nem találtunk lényeges eltérést az egyes vizsgált csoportok

között, melynek oka az lehet, hogy a 6. posztoperatív napon a kiváltott végtag trauma még

jelentős befolyásoló hatást gyakorolt a viselkedési paraméterekre.

A funkcionális eredmények mellett további jelentős megállapítás, hogy a humán

megbetegedéssel párhuzamban (Weber és mtsai. 2001) szignifikáns emelkedést

tapasztaltunk a gyulladáskeltő szenzoros neuropeptid, a SP, szöveti koncentrációjában a

CRPS-kezelést kapott állatok műtött lábában az incízió utáni 8. napon. Ezzel szemben a

CGRP, TNF-alfa, IL-1-béta és IL-6 koncentrációi nem változtak az intakt állapothoz

viszonyítva ellentétben a CRPS szindrómában szenvedő betegek bőr mintájának

vizsgálatával (Weber és mtsai. 2001, Huygen és mtsai. 2002) és azon állatmodellek

eredményeivel, melyeknél a trauma létrehozásához csonttörést alkalmaztak (Sahbaie és

mtsai. 2009, Wei és mtsai. 2012). Míg a CGRP főként szenzoros neuronális eredetű (Brain

és mtsai. 2006), addig a SP, a kapszaicin érzékeny peptiderg afferensek mellett

immunsejtekben is megtalálható (Howard 2008). E két peptid csak részben ko-

lokalizálódik a szenzoros idegvégződésekben (Schulze és mtsai. 1997). Mivel azonban a

funkcionális eltérések többsége a mintavétel (8. nap) idejére normalizálódott (31. és 32.

ábra), lehetséges, hogy a CGRP és a citokinek koncentrációi is emelkedtek a kísérlet

korábbi időpontjában. Más csoportok korábban közölt adatai szerint, a plantáris incízió

modelljében (IgG transzfer nélkül) a SP-nek alapvető szerepe van a hiperalgézia

fenntartásában: SP génhiányos egerekben incízió után csökkent mértékű mechanikai

hiperalgéziát detektáltak vad típusú kontrolljaikhoz viszonyítva (Sahbaie és mtsai. 2009).

A megfigyelt CRPS IgG hatások és a SP hatásai közti kölcsönhatások tisztázására további

vizsgálatok szükségesek.

Eredményeink legnagyobb jelentősége, hogy elsőként sikerült olyan jól reprodukálható,

megbízható egérmodellt kidolgoznunk, amelyben mind a végtag sérülése, mind aspecifikus

IgG autoantitestek jelen vannak, a humán betegséghez hasonlóan. Emberi CRPS IgG

hatására sikerült kimutatnunk egerekben a legjelentősebb klinikai eltéréseket (fájdalom,

duzzadás), a P-anyagot fontos pathofiziológiai tényezőként azonosítottuk. Modellünk

egyik korlátozó tényezője, hogy a CRPS klinikai kórképét teljes mértékben nem tudtuk

reprodukálni. Ilyen tünet például, a humán CRPS megbetegedésre jellemző változó

75

hőmérsékleti különbség az érintett és az ép végtag között, melyet részben a szimpatikus

diszfunkció okoz (Krumova és mtsai. 2008). Önmagában csak a hiperalgézia és ödéma

súlyosbodása, melyet modellünkben is tapasztaltunk, még nem elégítené ki szükségszerűen

a CRPS Nemzetközi Fájdalom Társaság (IASP) által 2010-ben megállapított diagnosztikus

kritériumait (Harden és mtsai. 2010). Ugyan modellünk nem képes az összes humán CRPS

tünetet utánozni, azonban ezek kialakulásában is összetett mechanizmusok (Goebel és

mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011), illetve más klinikai tünetek esetében egymással

össze nem függő mechanizmusok sorozata játszhat szerepet. Azonkívül, mivel ebben az

első kísérletsorozatban nem volt lehetőségünk a fenotípusosan eltérő klinikai tüneteket

mutató páciensekből (pl. mechanikai hiperalgéziával rendelkező, illetve nem rendelkező)

vett szérum IgG-k hatásainak összehasonlítására, nem vonható le messzemenő

következtetés azzal kapcsolatban, hogy az adott páciensek klinikai tünetei korrelálnak-e az

állatoknál tapasztalt funkcionális és viselkedésbeli eltérésekkel. A modell

használhatóságának gyakorlati korlátja az a viszonylag rövid „időablak”, melyben a

szignifikánsan emelkedett mechanikai hiperalgézia vagy lábduzzadás jelen van. Erre

vonatkozóan a közeljövőben 14 napos kísérletsorozatokat indítunk naponta történő IgG

adással.

A patogén antitestek epitóp specifitása egyelőre ismeretlen, és további kutatást igényel.

Eredményeink klinikai szempontból is meghatározóak, mivel igazolhatják a hosszantartó

CRPS egyik fontos terápiás lehetőségét, az autoantitestek plazmaferezissel való

eltávolítását. A modell lehetőséget nyújt a betegség pontos mechanizmusainak feltárására

kulcsmediátorok és célmolekuláik azonosítására, mely új gyógyszerfejlesztési

perspektívákat is nyithat.

76

AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

PhD munkám során a fájdalomban szerepet játszó mechanizmusok komplex állatkísérletes

vizsgálatára törekedtem. A disszertációban bemutatott legfontosabb új eredményeim,

megállapításaim a következők:

1. Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris

adása után több napon keresztül mindkét hőmérsékleti tartományban meghatároztuk azt a

pontos küszöbhőmérsékletet, melynél az állatok nocifenzív reakciót mutattak. A

hidegtartományban mért küszöbértékek gyorsabban normalizálódtak a fájdalmas hőküszöb

értékeknél. E változások a TRPV1 receptort expresszáló szenzoros neuronok perifériás

végződéseinek reverzibilis deszenzibilizációját jelzik, mely felelős a fájdalmas hő, illetve

hideg által kiváltott válaszok elmaradásáért. Kis dózisú RTX illetve OLDA adásakor a

TRPV1 receptor deszenzibilizálódott, az érzőideg-végződés funkciójának károsodása

nélkül, hiszen a TRPA1 receptor agonista formalin képest volt hatást kifejteni. A

deszenzibilizáció mindkét típusa nagy jelentőséggel bír a periférián ható új típusú

analgetikumok kifejlesztése szempontjából. Az idegvégződés deszenzibilizációja a

fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, viszont az általunk alkalmazott fájdalmas

küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika a jövőben új in vivo preklinikai szűrő

módszerként szolgálhat.

2. Adatokat szolgáltattunk különböző gyógyszercégek által kifejlesztett három TRPV1

antagonista hatásainak közvetlen összehasonlításáról, új fájdalmas hőküszöbmérő és a

tradicionális elhárító reakciók latenciaidejének mérésén alapuló módszerekkel.

Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöbcsökkenés RTX adás,

enyhe hőtrauma vagy sebészi talpincízió után TRPV1 receptor aktiváción keresztül valósul

meg, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1 antagonistákkal

szemben. A nociceptív hőküszöbök vizsgálatára az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő

megbízhatóan müködő, érzékenyebb módszernek bizonyult a hagyományos latenciaidő

mérésen alapuló Plantar Test készülékhez képest.

3. Kimutattuk, hogy a farkon mért fájdalmas hőküszöb értékek a TRPV1 génhiányos

egerekben szignifikánsan magasabbak voltak vad típusú megfelelőikhez képest, míg a

77

talpon nem volt különbség. Ez azt jelenti, hogy a korábbi adatokkal ellentétben a TRPV1

receptor szerepet játszik a forró ingerek detektálásában, legalábbis az egerek farkán. A

mustárolajjal kiváltott gyulladásos termális hiperalgézia a TRPV1 génhiányos egerekben

mindkét testtájon, míg a mechanikai hiperalgézia csak a lábon csökkent szignifikánsan.

TRPA1 receptor hiánya esetén egyik testtájon sem detektáltunk különbséget. Az akut

nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata során TRPA1 és a TRPV1 génhiányos

egerek is később mutattak elhárító reakciót vad típusú társaikhoz képest. Ezek alapján

feltételezhető, hogy a TRPA1 agonista mustárolaj nem szelektív a TRPA1 receptorra,

hanem a TRPV1 receptort is képes aktiválni. Ez utóbbi mechanizmus közvetítheti a

gyulladásos hiperalgéziát és szerepet játszhat a nocifenzív reakcióban is.

4. Elsőként dolgoztunk ki egy megbízható passzív-transzfer-trauma modellt CRPS

vizsgálatára, melyben a páciensekből származó tisztított szérum IgG intraperitoneális

kezelésével váltottuk ki egerekben a humán megbetegedés legfontosabb klinikai tüneteit.

Eredményeink igazolták az IgG antitestek meghatározó szerepét a CRPS

pathomechanizmusában. Egérmodellünk lehetőséget teremt a folyamatok kísérletes

vizsgálatára, kulcsmediátorok és célmolekuláig azonosítására, amely új gyógyszerek

kifejlesztéséhez is segítséget nyújthat.

78

IRODALOMJEGYZÉK

Almási R, Pethö G, Bölcskei K, Szolcsányi J. (2003). Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold

temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br. J. Pharmacol. 139, 49–58.

Alpizar YA, Boonen B, Gees M, Sanchez A, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2014). Allyl isothiocyanate

sensitizes TRPV1 to heat stimulation. Pflugers Arch. 466(3):507-15. doi: 10.1007/s00424-013-1334-9.

Anhalt GJ, Labib RS, Voorhees JJ, Beals TF, Diaz LA. (1982). Induction of pemphigus in neonatal mice by

passive transfer of IgG from patients with the disease. The New England Journal of medicine; 306,

(20):1189-1196.

Atkinson TJ, Fudin J, Pandula A, Mirza M. (2013). Medication pain management in the elderly: unique and

underutilized analgesic treatment options. Clin Ther. (11):1669-89. doi: 10.1016/j.clinthera.

Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. (2004).

Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849–857.

Banik, RK, Brennan, TJ.( 2009). Trpv1 mediates spontaneous firing and heat sensitization of cutaneous

primary afferents after plantar incision. Pain 141, 41–51.

Banik RK, Woo YC, Park SS, Brennan TJ. (2006). Strain and sex influence on pain sensitivity after plantar

incision in the mouse. Anesthesiology; 105 (6):1246-1253.

Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, Poblete J, Yamoah EN, Basbaum AI, Julius D.

(2006.) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell.

24;124(6):1269-82.

Bessac BF, Jordt SE. (2008a). Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation

and reflex control. Physiology (Bethesda). 23:360-70. doi: 10.1152/physiol.00026.2008.

Bessac BF, Sivula M, von Hehn CA, Escalera J, Cohn L, Jordt SE. (2008b). TRPA1 is a major oxidant

sensor in murine airway sensory neurons. J Clin Invest 118: 1899–1910.

Bevan S, Andersson DA. (2009). TRP channel antagonists for pain--opportunities beyond TRPV1. Curr

Opin Investig Drugs.10(7):655-63.

Bevan S, Szolcsányi J. (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications.

Trends in Pharmacological Sciences 11: 330-333.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Alpizar%20YA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Boonen%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gees%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sanchez%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nilius%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Voets%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Talavera%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23955021


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Atkinson%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24161287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fudin%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24161287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pandula%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24161287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mirza%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24161287


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bandell%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Story%20GM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hwang%20SW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Viswanath%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Eid%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petrus%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Earley%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Patapoutian%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15046718

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bautista%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jordt%20SE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nikai%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tsuruda%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Read%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Poblete%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yamoah%20EN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Basbaum%20AI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Julius%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16564016


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bessac%20BF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19074743




79

Bánvölgyi A, Pozsgai G, Brain SD, Helyes ZS, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér E. (2004). Mustard

oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a

non-neurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience. (2):449-59.

Bhave G, Zhu W, Wang H, Brasier DJ, Oxford GS, Gereau RW. (2002). cAMP dependent protein kinase

regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron 35, 721–731.

Birklein F, Riedl B, Sieweke N, Weber M, Neundorfer B. (2000/4). Neurological findings in complex

regional pain syndromes--analysis of 145 cases. Acta NeurolScand; 101(4):262-269.

Bishnoi M, Premkumar LS. (2011). Possible consequences of blocking transient receptor potential vanilloid.

Curr Pharm Biotechnol. 12(1):102-14.

Bittner MA, Lahann TR. (1984). Biphasic time-course of capsaicin-induced substance P depletion: failure to

correlate with thermal analgesia in the rat. Brain Res. 322:305–9.

Blaes F, Tschernatsch M, Braeu ME, Matz O, Schmitz K, Nascimento D, Kaps M, Birklein F. (2007).

Autoimmunity in complex-regional pain syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1107:168-73.

Brain SD, Cox HM. (2006). Neuropeptides and their receptors: innovative science providing novel

therapeutic targets. British Journal of Pharmacology; 147 Suppl 1: S202-211.

Brederson JD, Kym PR, Szallasi A. (2013). Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol. 716

(1-3):61-76. doi: 10.1016/j.ejphar.2013.03.003.

Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. (1996). Characterization of a rat model of incisional pain.

Pain. 64(3):493-501.

Bölcskei K, Horváth D, Szolcsányi J, Pethö G. (2007). Heat injury-induced drop of the noxious heat

threshold measured with an increasing-temperature water bath: a novel rat thermal hyperalgesia model. Eur.

J. Pharmacol. 564, 80–87.

Bölcskei K, Helyes Z, Szabó A, Sándor K, Elekes K, Németh J, Almási R, Pintér E, Pethő G, Szolcsányi J.

(2005). Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-

deficient mice. Pain. 117(3):368-376.

Buckley C, Vincent A. (2005). Autoimmune channelopathies. NatClinPractNeurol. 1(1):22-33.

Buitrago M.M., J.B. Shulz, J. Dichgans, A.R. Luft. (2004). Short and long-term motor skill learning in an

accelerated rotarod training paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 81(3): 211-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=B%C3%A1nv%C3%B6lgyi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pozsgai%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brain%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Helyes%20ZS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szolcs%C3%A1nyi%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ghosh%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Melegh%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pint%C3%A9r%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15062987


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bishnoi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20932252

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Premkumar%20LS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20932252


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blaes%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tschernatsch%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Braeu%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Matz%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schmitz%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nascimento%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kaps%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Birklein%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17804544


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brederson%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23500195

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kym%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23500195

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szallasi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23500195


80

Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. (1997). The capsaicin

receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389: 816-824.

Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum

AI, Julius D. (2000). Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science.

288, 306–313.

Chen HS, He X, Wang Y, Wen WW, You HJ, Arendt-Nielsen L. (2007). Roles of capsaicinsensitive primary

afferents in differential rat models of inflammatory pain: a systematic comparative study in conscious rats.

Exp Neurol. 204:244–51.

Chu CJ, Huang SM, De Petrocellis L, Bisogno T, Ewing SA, Miller JD, Zipkin RE, Daddario N, Appendino

G, Di Marzo V, Walker JM. (2003). Noleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces

hyperalgesia. J Biol Chem. 278:13633–9.

Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latchman J, Clapham C,

Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PA, Rogers DC, Bingham S, Randall A,

Sheardown AS. (2000). Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature. 405,

183–187.

Dai Y, Wang S, Tominaga M, Yamamoto S, Fukuoka T, Higashi T. (2007). Sensitization of TRPA1 by

PAR2 contributes to the sensation of inflammatory pain. J Clin Invest 117: 1979–1987.

Davis KD, Pope GE. (2002). Noxious cold evokes multiple sensations with distinct time courses. Pain.

98:179–85.

Dray A, Bettaney J, Forster P. (1990). Resiniferatoxin, a potent capsaicin-like stimulator of peripheral

nociceptors in the neonatal rat tail in vitro. Br J Pharmacol. 99:323–6.

de M Mos, de Bruijn AG, Huygen FJ, Dieleman JP, Stricker BH, Sturkenboom MC. (2007). The incidence

of complex regional pain syndrome: a population-based study. Pain. 129:12–20.

de M M, Huygen FJ, Hoeven-Borgman M, Dieleman JP, Ch Stricker BH, Sturkenboom MC. (2009).

Outcome of the complex regional pain syndrome. Clin. J. Pain. 25(7):590-597.

Dux M, Sann H, Schemann M, Jancsó G. (1999). Changes in fibre populations of the rat hairy skin following

selective chemodenervation by capsaicin. Cell Tissue Res. 296:471–7.

Eddy N.B, Leimbach D. (1953). Synthetic analgesics II. Dithienylbutenyl and dithienylbutylamines J.

Pharmacol. Exp. Ther, 45, p. 339.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chu%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Huang%20SM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Petrocellis%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bisogno%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ewing%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miller%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zipkin%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Daddario%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Appendino%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Di%20Marzo%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Walker%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12569099

81

Everaerts W, Gees M, Alpizar YA, Farre R, Leten C, Apetrei A, Dewachter I, van Leuven F, Vennekens

R, De Ridder D, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2011). The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator

of the noxious effects of mustard oil. Curr Biol. 21(4):316-21.

Fernandes ES, Fernandes MA, Keeble JE. (2012). The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from

sensory nerves. Br J Pharmacol. 166(2):510-21.

Fernandes ES, Russell FA, Spina D, McDougall JJ, Graepel R, Gentry C, Staniland AA, Mountford DM,

Keeble JE, Malcangio M, Bevan S, Brain SD. (2011). A distinct role for transient receptor potential ankyrin

1, in addition to transient receptor potential vanilloid 1, in tumor necrosis factor α-induced inflammatory

hyperalgesia and Freund's complete adjuvant-induced monarthritis. Arthritis Rheum. (3):819-29. doi:

10.1002/art.30150.

Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2009). Effects of analgesics on the plantar incision-induced

drop of the noxious heat threshold measured with an increasingtemperature water bath in the rat. Eur. J.

Pharmacol. 605, 63–67.

Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2010). Comparison of the peripheral mediator background of

heat injury- and plantar incision-induced drop of the noxious heat threshold in the rat. Life Sci. 86, 244–250.

Gallowitsch-Puertaa M, Pavlova V. (2007). Neuro-immune interactions via the cholinergic anti-

inflammatory pathway. Life Sciences. 80. 24–25. 2325–2329.

Gamse R. (1982). Capsaicin and nociception in the rat and mouse. Possible role of substance P. Naunyn

Schmiedebergs Arch Pharmacol. 320:205–16.

Gaszner B, Kormos V, Kozicz T, Hashimoto H, Reglodi D, Helyes Z. (2012). The behavioral phenotype of

pituitary adenylate–cyclase activating polypeptide-deficient mice in anxiety and depression tests is

accompanied by blunted c-Fos expression in the bed nucleus of the stria terminalis, central projecting

Edinger–Westphal nucleus, ventral lateral septum, and dorsal raphe nucleus. Neuroscience. pp. 283–299.

Gavva NR, Tamir R, Qu Y, Klionsky L, Zhang TJ, Immke D, Wang J, Zhu D, Vanderah TW, Porreca F,

Doherty EM, Norman MH, Wild KD, Bannon AW, Louis JC, Treanor JJ. (2005). AMG 9810 [(E)-3-(4-t-

butylphenyl)-N-(2, 3 dihydrobenzo[b][1, 4] dioxin-6-yl)acrylamide], a novel vanilloid receptor 1 (TRPV1)

antagonist with antihyperalgesic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 474–484.

Gavva NR, Bannon AW, Surapaneni S, Hovland Jr, DN Lehto SG, Gore A, Juan T, Deng H, Han B,

Klionsky L, Kuang R, Le A, Tamir R, Wang J, Youngblood B, Zhu D, Norman MH, Magal E, Treanor JJ,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Everaerts%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Farre%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leten%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Apetrei%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dewachter%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20Leuven%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vennekens%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=De%20Ridder%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21315593




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=everaerts+2011+mustard+oil

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fernandes%20ES%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22233379

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fernandes%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22233379

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Keeble%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22233379






http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0024320507000331





http://www.sciencedirect.com/science/journal/00243205

http://www.sciencedirect.com/science/journal/00243205/80/24

82

Louis JC. (2007). The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body

temperature regulation. J. Neurosci. 27, 3366–3374.

Gavva NR, Treanor JJ, Garami A, Fang L, Surapaneni S, Akrami A, Alvarez F, Bak A, Darling M, Gore A,

Jang GR, Kesslak JP, Ni L, Norman MH, Palluconi G, Rose MJ, Salfi M, Tan E, Romanovsky AA,

Banfield C, Davar G. (2008). Pharmacological blockade of the vanilloid receptor TRPV1 elicitsmarked

hyperthermia in humans. Pain 136, 202–210.

Gees M1, Alpizar YA, Boonen B, Sanchez A, Everaerts W, Segal A, Xue F, Janssens A, Owsianik G, Nilius

B, Voets T, Talavera K. (2013). Mechanisms of transient receptor potential vanilloid 1 activation and

sensitization by allyl isothiocyanate. Mol Pharmacol. 84(3):325-34. doi: 10.1124/mol.113.085548.

Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S. (2008). The concept of neurogenic inflammation. BJU

Int.;101 Suppl 3:2-6. doi: 10.1111/j.1464-410X.2008.07493.x. Review.

Gierthmuhlen J, Maier C, Baron R, Tolle T, Treede RD, Birbaumer N, Huge V, Koroschetz J, Krumova

EK, Lauchart M, Maihofner C, Richter H, Westermann A. (2012). Sensory signs in complex regional pain

syndrome and peripheral nerve injury. Pain. 153(4):765-774.

Goebel A. (2011).Complex regional pain syndrome in adults. Rheumatology (Oxford) 50(10):1739-1750.

Goebel A, Baranowski AP, Maurer K, Ghiai A, McCabe C, Ambler G. (2010). Intravenous Immunoglobulin

Treatment of Complex Regional Pain Syndrome: A Randomized Trial. AnnInternMed. 152(3):152-158.

Goebel A, Leite MI, Yang L, Deacon R, Cendan CM, Fox-Lewis A, Vincent A. (2011). The passive transfer

of immunoglobulin G serum antibodies from patients with longstanding Complex Regional Pain Syndrome.

Eur J Pain 15(5):504 e501-506.

Goebel A, Misbah, S., McKiver, K., Haynes, L., Burton, J., Philips, C., Frank, B., Poole, H. (2013).

Immunoglobulin Maintenance Therapy in Lonstanding Complex Regional Pain Syndrome. Rheumatology

(Oxford). 52(11):2091-3. doi: 10.1093/rheumatology/ket282.

Goebel A, Stock M, Deacon R, Sprotte G, Vincent A. (2005). Intravenous immunoglobulin response and

evidence for pathogenic antibodies in a case of complex regional pain syndrome 1. AnnNeurol 3;57(3):463-

464.

Gu Q, Lin RL. (2010). Heavy metals zinc, cadmium, and copper stimulate pulmonary sensory neurons via

direct activation of TRPA1. J Appl Physiol 108: 891–897.



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Boonen%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sanchez%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Everaerts%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Segal%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Xue%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Janssens%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Owsianik%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23757176








83

Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB. (2002). The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor

family of ion channels. Trends Pharmacol Sci. 23: 183-191.

Guo TZ, Offley SC, Boyd EA, Jacobs CR, Kingery WS. (2004). Substance P signaling contributes to the

vascular and nociceptive abnormalities observed in a tibial fracture rat model of complex regional pain

syndrome type I. Pain. 108(1-2):95-107.

Harden RN, Bruehl S, Perez RS, Birklein F, Marinus J, Maihofner C, Lubenow T, Buvanendran A, Mackey

S, Graciosa J, Mogilevski M, Ramsden C, Chont M, Vatine JJ. (2010). Validation of proposed diagnostic

criteria (the "Budapest Criteria") for Complex Regional Pain Syndrome. Pain. 8; 150 (2):268-274.

Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. (1988). A new and sensitivemethod for measuring

thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 32, 77–88.

Hayes AG, Tyers MB. (1980). Effects of capsaicin on nociceptive heat, pressure and chemical thresholds

and on substance P levels in the rat. Brain. Res.189:561–4.

Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J. (2003). Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic

inflammation. Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in Curr. Med. Chem. 2: 191-218.

Hinman A, Chuang HH, Bautista DM, Julius D. (2006). TRP channel activation by reversible covalent

modification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(51):19564-8.

Hoffmann T, Kistner K, Miermeister F, Winkelmann R, Wittmann J, Fischer MJ, Weidner C, Reeh PW.

(2013). TRPA1 and TRPV1 are differentially involved in heat nociception of mice. Eur J Pain. May 29. doi:

10.1002/j.1532-2149.2013.00331.

Holzer P. (1991). Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons.

Pharmacol. Rev. 43: 143-201.

Holzer P. (2008). The pharmacological challenge to tame the transient receptor potential vanilloid-1

(TRPV1) nocisensor. Br. J. Pharmacol. 155, 1145–1162.

Honoré P, Wismer CT, Mikusa J, Zhu CZ, Zhong C, Gauvin DM, Gomtsyan AE, Kouhen R, Lee CH, Marsh

K, Sullivan JP, Faltynek CR, Jarvis MF. (2005). A- 425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)-

urea], a novel transient receptor potential type V1 receptor antagonist, relieves pathophysiological pain

associated with inflammation and tissue injury in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 410–421.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hinman%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17164327

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chuang%20HH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17164327




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hoffmann%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kistner%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miermeister%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Winkelmann%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wittmann%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fischer%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Weidner%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reeh%20PW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23720338


84

Honoré P, Chandran P, Hernandez G, Gauvin DM, Mikusa JP, Zhong C, Joshi SK, Ghilardi JR, Sevcik MA,

Fryer RM, Segreti JA, Banfor PN, Marsh K, Neelands T, Bayburt E, Daanen JF, Gomtsyan A, Lee CH, Kort

ME, Reilly RM, Surowy CS, Howard MR, Millward-Sadler SJ, Vasilliou AS, Salter DM, Quinn JP. (2008).

Mechanical stimulation induces preprotachykinin gene expression in osteoarthritic chondrocytes which is

correlated with modulation of the transcription factor neuron restrictive silence factor. Neuropeptides. 42(5-

6):681-686.

Hőgyes E (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandsteile de capsicum anuum. Archiv für

Experimentelle Pathologie und Pharmakologie 9: 117-130.

Hu H, Bandell M, Petrus MJ, Zhu MX, Patapoutian A. (2009). Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion

channels. Nat Chem Biol 5: 183–190.

Huygen FJ, De Bruijn AG, De Bruin MT, Groeneweg JG, Klein J, Zijistra FJ. (2002). Evidence for local

inflammation in complex regional pain syndrome type 1. MediatorsInflamm. 11(1):47-51.

Immke DC, Gavva NR. (2006). The TRPV1 receptor and nociception. Semin Cell Dev Biol. 17:582–91.

Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, Denda M. (2002). Functional vanilloid receptors in

cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun. 291(1):124-9.

Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. (1999). An ankyrin-like protein with transmembrane domains is

specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem. 274(11):7325-33.

Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its

prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. British Journal of Pharmacology 31: 138-151.

Jancsó N. (1960). Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull. Millard

Fillmore Hosp. Buffalo N.Y. 7: 53-77.

Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Högestätt ED, Meng ID, Julius D. (2004).

Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427:

260–265.

Julius D. (1997). Another opiate for the masses? Nature. 386 (6624):442.

Jung SR, Kim MH, Hille B, Nguyen TD, Koh DS. (2004). Regulation of exocytosis by purinergic receptors

in pancreatic duct epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 286(3):C573-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jaquemar%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10066796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schenker%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10066796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Trueb%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10066796




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chuang%20HH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14712238

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McKemy%20DD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14712238

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zygmunt%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14712238

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=H�gest�tt%20ED%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14712238

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Meng%20ID%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14712238



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jung%20SR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14602582

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kim%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14602582

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hille%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14602582

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nguyen%20TD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14602582

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Koh%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14602582


85

Karai L, Brown DC, Mannes AJ, Connelly ST, Brown J, Gandal M, Wellisch OM, Neubert JK, Olah

Z, Iadarola MJ. (2004). Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control.

J Clin Invest.113:1344–52.

Kingery WS. (2010). Role of neuropeptide, cytokine, and growth factor signaling in complex regional pain

syndrome. Pain Med.11(8):1239-1250.

Kohr D, Singh P, Tschernatsch M, Kaps M, Pouokam E, Diener M, Kummer W, Birklein F, Vincent A,

Goebel A, Wallukat G, Blaes F. (2011). Autoimmunity against the beta(2) adrenergic receptor and

muscarinic-2 receptor in complex regional pain syndrome. Pain. 152(12):2690-2700.

Krumova EK, Frettloh J, Klauenberg S, Richter H, Wasner G, Maier C. (2008). Long-term skin temperature

measurements - a practical diagnostic tool in complex regional pain syndrome. Pain. 140(1):8-22.

Kuner R, (2007). Genetic approaches for the study of pain. in: Zhuo M, Gebrhardt GF editors. Molecular

Pain. Vol.1. Higher education Press. p. 235-244.

Kym PR, Mantyh PW, Sullivan JP, Jarvis MF, Faltynek CR. (2009). Repeated dosing of ABT-102, a potent

and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV1-mediated analgesic activity in rodents, but attenuates

antagonist-induced hyperthermia. Pain. 142, 27–35.

Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf CJ, Corey DP. (2006).

TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell

transduction. Neuron. 20;50(2):277-89.

Latremoliere A, Woolf CJ. (2009). Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central

neural plasticity. J Pain. 10(9):895-926.

Lehto SG, Tamir R, Deng H, Klionsky L, Kuang R, Le A, Lee D, Louis JC, Magal E, Manning BH, Rubino

J, Surapaneni S, Tamayo N, Wang T, Wang J, Wang J, Wang W, Youngblood B, Zhang M, Zhu D, Norman

MH, Gavva NR. (2008). Antihyperalgesic effects of (R, E)-N-(2-hydroxy-2, 3-dihydro-1H-inden-4-yl)-3- (2-

(piperidin-1-yl)-4-(trifluoromethyl)phenyl)-acrylamide (AMG8562), a novel transient receptor potential

vanilloid type 1 modulator that does not cause hyperthermia in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 218–229.

Leem JW, Willis WD, Chung JM. (1993). Cutaneous sensory receptors in the rat foot. J Neurophysiol.

69:1684 99.

Levine JD, Collier DH, Basbaum AI, Moskowitz MA, Helms CA. (1986). Hypothesis: the nervous system

may contribute to the pathophysiology of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 12: 406-11.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Karai%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brown%20DC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mannes%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Connelly%20ST%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brown%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gandal%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wellisch%20OM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Neubert%20JK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Olah%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Iadarola%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15124026



86

Liu L, Oortgiesen M, Li L, Simon SA. (2001). Capsaicin inhibits activation of voltage-gated sodium currents

in capsaicin-sensitive trigeminal ganglion neurons. J Neurophysiol. 85:745–58.

Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. (2006). More than cool:

promiscuous relationships ofmenthol and other sensory compounds. Mol. Cell. Neurosci. 32:335–343.

Macpherson LJ, Geierstanger BH, Viswanath V, Bandell M, Eid SR, Hwang S, Patapoutian A. (2005). The

pungency of garlic: activation of TRPA1 and TRPV1 in response to allicin. Curr. Biol. 15: 929–934.

Maggi CA, Bevan S, Walpole CS, Rang HP, Giuliani S. (1993). A comparison of capsazepine and ruthenium

red as capsaicin antagonists in the rat isolated urinary bladder and vas deferens. Br. J.

Pharmacol. 108(3):801-5.

Marinus J, Moseley GL, Birklein F, Baron R, Maihofner C, Kingery WS, Van Hilten JJ. (2011). Clinical

features and pathophysiology of complex regional pain syndrome. Lancet Neurol.10(7):637-648.

McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. (2002). Identification of a cold receptor reveals a general role for

TRP channels in thermosensation. Nature. 416:52–8.

McNamara CR, Mandel-Brehm J, Bautista DM, Siemens J, Deranian KL, Zhao M, Hayward NJ, Chong JA,

Julius D, Moran MM, Fanger CM. (2007). TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 104(33):13525-30.

Merskey & Bogduk (Eds.) (1994). Classification of Chronic Pain. Seattle: IASP Task Force on Taxonomy

Messeguer A, Planells-Cases R, Ferrer-Montiel A. (2006). Physiology and pharmacology of the vanilloid

receptor. Curr. Neuropharmacol. (1):1-15.

Mezei M, Pénzes I. (2002) Megelőzhető-e az akut fájdalom krónikusáá válása? Hippocrates. IV. évf. 4.

szám.

Meyer RA, Ringkamp, M., Campbell, J.N, Raja, S.N. (2006). Peripheral mechanisms of cutaneous

nociception. In: SB McMahon, Kotzenburg, M., editor. Textbook of Pain. Amsterdam: Elsevier. pp. 3-33.

Miyamoto R, Otsuguro K, Ito S. (2011). Time- and concentration-dependent activation of TRPA1 by

hydrogen sulfide in rat DRG neurons. Neurosci Lett. 499(2):137-42.

Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Iida T, Segi E, Sugimoto Y, Tominaga T, Narumiya S, Tominaga M.

(2005). Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins.

Mol. Pain 1, 3.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Macpherson%20LJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15916949

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geierstanger%20BH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15916949

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Viswanath%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15916949

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bandell%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15916949


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hwang%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15916949


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Maggi%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7682139

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bevan%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7682139

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Walpole%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7682139

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rang%20HP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7682139

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Giuliani%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7682139




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Messeguer%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18615132

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Planells-Cases%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18615132

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferrer-Montiel%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18615132


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miyamoto%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21658433

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Otsuguro%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21658433

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ito%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21658433

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=miyamoto+and+2011+and+trpa1

87

Mousa SA, Zhang Q, Sitte N, Ji R, Stein C. (2001). Beta-endorphin-containing memory-cells and mu-opioid

receptors undergo transport to peripheral inflamed tissue. J. Neuroimmunol. 115:71-78.

Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J. (2005). Nociceptor and hair cell transducer properties

of TRPA1, a channel for pain and hearing. J. Neurosci. 25(16):4052-61.

Nemeth J, Gorcs T, Helyes Z, Oroszi G, Kocsy T, Pinter E, Szolcsanyi J. (1998). Development of a new

sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp). (4):473-475.

Nemeth J, Oroszi G, Than M, Helyes ZS, Pinter E, Farkas B, Szolcsanyi J. (1999). Substance P

radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology (Bp).

7(4):437-444.

Neubert JK, Karai L, Jun JH, Kim HS, Olah Z, Iadarola MJ. (2003). Peripherally induced resiniferatoxin

analgesia. Pain. 104:219–28.

Nolano M, Simone DA, Wendelschafer-Crabb G, Johnson T, Hazen E, Kennedy WR. (1999). Topical

capsaicin in humans: parallel loss of epidermal nerve fibers and pain sensation. Pain. 81:135–45.

Obál Jr F, Benedek G, Jancsó-Gábor A, Obál F. (1979). Salivary cooling, escape reaction and heat pain in

capsaicin-desensitized rats. Pflügers Arch. 382:249–54.

Obata K, Katsura H, Mizushima T, Yamanaka H, Kobayashi K, Dai Y, Fukuoka T, Tokunaga A, Tominaga

M, Noguchi K. (2005). TRPA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after

inflammation and nerve injury. J. Clin. Invest. 115(9):2393-401.

O'Callaghan JP, Holzman SG. (1975). Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a

modified hot plate procedure. J. Pharmacol. Exp. Ther. 192: 497-505.

Pan HL, Khan GM, Alloway KD, Chen SR. (2003). Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal

and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23. 2911–9.

Peier AM, Moqrich A, Hergarden AC, Reeve AJ, Andersson DA, Story GM, Earley TJ, Dragoni I, McIntyre

P, Bevan S, Patapoutian A. (2002). A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell. 108:705–15.

Pecze L, Pelsoczi P, Kecskés M, Winter Z, Papp A, Kaszás K, Letoha T, Vizler C,. Oláh Z. (2009).

Resiniferatoxin mediated ablation of TRPV1+ neurons removes TRPA1 as well. Can. J. Neurol. Sci. 234–

141.






http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Peier%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Moqrich%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hergarden%20AC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reeve%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Andersson%20DA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dragoni%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McIntyre%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11893340





88

Pingle SC, Matta JA, Ahern GP. (2007). Capsaicin receptor: TRPV1 a promiscuous TRP channel. Handbook

of Experimental Pharmacolog. 179:155-171.

Pizziketti RJ, Pressman NS, Geller EB, Cowan A, Adler MW. (1985). Rat cold water tail-flick: a novel

analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of

Pharmacology. 119(1-2):23-29.

Pogatzki-Zahn EM, Shimizu I, Caterina M, Raja SN. (2005). Heat hyperalgesia after incision requires

TRPV1 and is distinct from pure inflammatory pain. Pain. 115, 296–307.

Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK, Brennan TJ. (2007). Postoperative pain--clinical implications of basic

research. Best Practice & Research Clin. Anaesthesiology; 21 (1):3-13.

Pomonis JD, Harrison JE, Mark L, Bristol DR, Valenzano KJ, Walker K. (2003.) N-(4- tertiarybutylphenyl)-

4-(3-cholorphyridin-2-yl) tetrahydropyrazine-1(2H)-carboxamide BCTC), a novel, orally effective vanilloid

receptor 1 antagonist with analgesic properties: II. In vivo characterization in ratmodels of inflammatory and

neuropathic pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306, 387–393.

Premkumar LS, Ahern GP. (2000). Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C.

Nature 408, 985–990.

Ralevic V, Jerman JC, Brough SJ, Davis JB, Egerton J, Smart D. (2003). Pharmacology of vanilloids at

recombinant and endogenous rat vanilloid receptors. Biochem. Pharmacol. 65:143–51.

Rami HK, Thompson M, Stemp G, Fell S, Jerman JC, Stevens AJ, Smart D, Sargent B, Sanderson D,

Randall AD, Gunthorpe MJ, Davis JB. (2006). Discovery of SB-705498: a potent, selective and orally

bioavailable TRPV1 antagonist suitable for clinical development. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 3287–3291.

Rose NR, Bona C. (1993). Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited).

Immunol.Today. 9;14(9):426-430.

Salas MM, Hargreaves KM, Akopian AN. (2009). TRPA1-mediated responses in trigeminal sensory

neurons: interaction between TRPA1 and TRPV1. Eur. J. Neurosci. (8):1568-78.

Sahbaie P, Shi X, Guo TZ, Qiao Y, Yeomans DC, Kingery WS, Clark JD. (2009). Role of substance P

signaling in enhanced nociceptive sensitization and local cytokine production after incision. Pain.145(3):341-

349.

Scherer M, Reichl SU, Augustin M, Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK. (2010). The assessment of cold

hyperalgesia after an incision. Anesthesia and analgesia. 110(1):222-227.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Salas%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19419422

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hargreaves%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19419422

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Akopian%20AN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19419422

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=salas+2009+trpa1

89

Schulze E, Witt M, Fink T, Hofer A, Funk RH. (1997). Immunohistochemical detection of human skin nerve

fibers. Acta histochemica. 99(3):301-309.

Sawada Y, Hosokawa H, Matsumura K, Kobayashi S. (2008). Activation of transient receptor potential

ankyrin 1 by hydrogen peroxide. Eur J Neurosci. 27(5):1131-42.

Simone DA, Nolano M, Johnson T, Wendelschafer-Crabb G, Kennedy WR. (1998). Intradermal injection of

capsaicin in humans produces degeneration and subsequent reinnervation of epidermal nerve fibers:

correlation with sensory function. J Neurosci. 18:8947–59.

Simone DA, Cajander KC. (1996). Excitation of rat cutaneous nociceptors by noxious cold. Neurosci Lett.

213. 53–6.

Staud R, Craggs JG, Robinson ME, Perlstein WM, Price DD. (2007). Brain activity related to temporal

summation of C-fiber evoked pain. Pain. 129(1-2):130-42.

Stein C, Hassan AH, Przewłocki R, Gramsch C, Peter K, Herz A. (1990). Opioids from immunocytes

interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 87, 5935-5939.

Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson

DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. (2003). ANKTM1, a TRP like channel

expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell. 112:819–29.

Sugiura T, Tominaga M, Katsuya H, Mizumura K. (2002). Bradykinin lowers the threshold temperature for

heat activation of vanilloid receptor 1. J. Neurophysiol. 88, 544–548.

Szabo A, Helyes Z, Sandor K, Bite A, Pinter E, Nemeth J, Banvolgyi A, Bolcskei K, Elekes K, Szolcsanyi J.

(2005). Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo

study using gene-deficient mice. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 314(1):111-

119.

Szallasi A, Szabó T, Bíró T, Modarres S, Blumberg PM, Krause JE, Cortright DN, Appendino G. (1999).

Resiniferatoxin-type phorboid vanilloids display capsaicin-like selectivity at native vanilloid receptors on rat

DRG neurons and at the cloned vanilloid receptor VR1. Br J Pharmacol. 128(2):428-34.

Szallasi A, Cortright DN, Blum CA, Eid SR. (2007). The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel

cloning to antagonist proof-of-concept. Nat. Rev. Drug Discov. 6(5):357-72.







http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stein%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hassan%20AH%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Przew%26%23x00142%3Bocki%20R%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gramsch%20C%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peter%20K%5Bauth%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Peier%20AM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Reeve%20AJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mosbacher%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hricik%20TR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hergarden%20AC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hwang%20SW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jegla%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12654248




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szab�%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=B�r�%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Modarres%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blumberg%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Krause%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cortright%20DN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10510454




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cortright%20DN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17464295

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blum%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17464295



90

Szallasi A, Joo F, Blumberg PM. (1989). Duration of desensitization and ultrastructural changes in dorsal

root ganglia in rats treated with resiniferatoxin, an ultrapotent capsaicin analog. Brain Res. 503(1):68-72.

Szolcsányi J. (2008). Hot target on nociceptors: perspectives, caveats and unique features. Br. J. Pharmacol.

155, 1142–1144.

Szolcsányi J, Sándor Z, Petho G, Varga A, Bölcskei K, Almási R, Riedl Z, Hajos G, Czéh G. (2004). Direct

evidence for activation and desensitization of the capsaicin receptor by Noleoyldopamine on TRPV1-

transfected cell, line in gene deleted mice and in the rat. Neurosci Letter. 361:155–8.

Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E. (1998a). Release of somatostatin and its role in the

mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic

nerve. British Journal of Pharmacology. 123: 936-942.

Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J. (1998b). Systemic anti-inflammatory effect induced

by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. British Journal of

Pharmacology 125: 916-922.

Szolcsányi J. (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In: Wood J, editor. Capsaicin in the Study of

Pain. London: Academic Press. p. 1–26.

Szolcsanyi J, Szallasi A, Szallasi Z, Joo F, Blumberg PM. (1990). Resiniferatoxin: an ultrapotent selective

modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J Pharmacol Exp Ther. 255(2):923-8.

Szolcsányi J. (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions. 23: 4-11.

Szolcsányi J. (1987). Selective responsiveness of polymodal nociceptors of the rabbit ear to capsaicin,

bradykinin and ultra-violet irradiation. J Physiol (Lond). 388:9–23.

Szolcsányi J. (1985). Sensory receptors and the antinociceptive effects of capsaicin. In: Hakanson R, Sundler

F, editors. Tachykinin Antagonists. Amsterdam: Elsevier. p45–54.

Szolcsányi J. (1984a.) Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings. In: Antidromic

Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 7-26,

Akadémiai Kiadó, Budapest.

Szolcsányi J. (1984b). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensoryefferent function.

In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp.

27-53, Akadémiai Kiadó, Budapest.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Joo%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2611660

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blumberg%20PM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2611660


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Szolcs%C3%A1nyi%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=S%C3%A1ndor%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Petho%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Varga%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=B%C3%B6lcskei%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Alm%C3%A1si%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Riedl%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hajos%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cz%C3%A9h%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15135917




91

Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1976). Sensory effects of capsaicin congeners II: Importance of chemical

structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin type compounds. Arzneimittelforschung. 26: 33-

37.

Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I: Relationship between

chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung. 25: 1877-1881.

Tajti J, Vécsei L. (2006). Mozgásszervi megbetegedéseket utánzó neuropátiás fájdalmak patomechanizmusa

és terápiája. Magyar Tudomány 167: 1191-1196.

Taylor-Clark TE, Undem BJ, Macglashan DW Jr, Ghatta S, Carr MJ, McAlexander MA. (2008).

Prostaglandin-induced activation of nociceptive neurons via direct interaction with transient receptor

potential A1 (TRPA1). Mol Pharmacol 73: 274–281.

Teeling JL, Felton LM, Deacon RM, Cunningham C, Rawlins JN, Perry VH. (2007). Sub-pyrogenic

systemic inflammation impacts on brain and behavior, independent of cytokines. Brain Behav.Immun.

21(6):836-850.

Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann, B.E., Basbaum,

A.I., Julius, D. (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron.

21:531-543.

Toyka KV, Brachman DB, Pestronk A, Kao I. (1975). Myasthenia gravis: passive transfer from man to

mouse. Science. 190. (4212):397-399.

Trevisani M, Gatti R. (2013). TRPV1 Antagonists as Analgesic Agents. The Open Pain Journal. 108-118.

Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Campi B, Imamachi N, Andrè E, Patacchini

R, Cottrell GS, Gatti R, Basbaum AI, Bunnett NW,Julius D, Geppetti P. (2007). 4-Hydroxynonenal, an

endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor

TRPA1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13519–13524.

Varga A, Bölcskei K, Szőke É, Almási R, Czéh G, Szolcsányi J, Pethő G. (2006). Relative roles of protein

kinase A and protein kinase C in modulation of transient receptor potential vanilloid type 1 receptor

responsiveness in rat sensory neurons in vitro and peripheral nociceptors in vivo. Neuroscience 140, 645–

657.

Vellani V, Mapplebeck S, Moriondo A, Davis JB, McNaughton PA. (2001). Protein kinase C activation

potentiates gating of the vanilloid receptor VR1 by capsaicin, protons, heat and anandamide. J. Physiol. 534,

813–825.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Trevisani%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Siemens%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Materazzi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nassini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Campi%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Imamachi%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Andr?%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Patacchini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Patacchini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cottrell%20GS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gatti%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Basbaum%20AI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bunnett%20NW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geppetti%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17684094

92

Xu XJ, Farkas-Szállási T, Lundberg JM, Hökfelt T, Wiesenfeld-Hallin Z, Szállási A. (1997). Effects of the

capsaicin analogue resiniferatoxin on spinal nociceptive mechanisms in the rat: behavioral,

electrophysiological and in situ hybridization studies. Brain Res.752:52–60.

Walker KM, Urban L, Medhurst SJ, Patel S, Panesar M, Fox AJ, McIntyre P. (2003). The VR1 antagonist

capsazepine reverses mechanical hyperalgesia in models of inflammatory and neuropathic pain. J.

Pharmacol. Exp. Ther. 304, 56–62.

Walpole CS, Bevan S, Bovermann G, Boelsterli JJ, Breckenridge R, Davies JW, Hughes GA, James

I, Oberer L, Winter J. (1994). The discovery of capsazepine, the first competitive antagonist of the sensory

neuron excitants capsaicin and resiniferatoxin. J Med Chem. 37(13):1942-54.

Weber M, Birklein F, Neundorfer B, Schmelz M. (2001). Facilitated neurogenic inflammation in complex

regional pain syndrome. Pain. 91(3):251-257.

Wei T, Guo TZ, Li WW, Hou S, Kingery WS, Clark JD. (2012). Keratinocyte expression of inflammatory

mediators plays a crucial role in substance P-induced acute and chronic pain. Journal of Neuroinflammation.

9:181.

Weil A, Moore SE, Waite NJ, Randall A, Guntrope MJ. (2005). Conservation of functional and

pharmacological properties in the distantly related temperature sensors TRPV1 and TRPM8 . Mol.

Pharmacol. 68(2): 518-27.

Woodbury CJ, Zwick M, Wang S, Lawson JJ, Caterina MJ, Koltzenburg M, Albers KM, Koerber

HR, Davis BM. (2004). Nociceptors lacking TRPV1 and TRPV2 have normal heat responses. J Neurosci.

24:6410–5.

Wu C, Gavva NR, Brennan TJ. (2008). Effect of AMG0347, a transient receptor potentialtype V1 receptor

antagonist, and morphine on pain behavior after plantar incision. Anesthesiology 108, 1100–1108.

Zimmermann M. (1983). Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals.

Pain 16, 109–110.

Zimmermann K, Leffler A, Fischer MM, Messlinger K, Nau C, Reeh PW. (2005). The TRPV1/2/3 activator

2-aminoethoxydiphenyl borate sensitizes native nociceptive neurons to heat in wildtype but not TRPV1

deficient mice. Neuroscience 135, 1277–1284.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Walpole%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bovermann%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Boelsterli%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Breckenridge%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davies%20JW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hughes%20GA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=James%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Oberer%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Winter%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8027976


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Albers%20KM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15254097

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Koerber%20HR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15254097



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davis%20BM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15254097

93

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet mindazoknak, aki az eltelt évek során segítették

a munkámat.

Köszönöm témavezetőimnek, dr. Helyes Zsuzsanna és dr. Pethő Gábor professzoroknak,

hogy bevezettek a kutatás világába, szakmai felkészültségükkel, lelkesedésükkel és

precizitásukkal mutatva jó és követendő példát.

Köszönettel tartozom dr. Bölcskei Katának, akihez mind a kísérletes munka során, mind

pedig az értekezés készítésekor mindig bizalommal fordulhattam. Hálával tartozom dr.

Pintér Erika és dr. Szolcsányi János professzoroknak, akik rendkivül magasszintű szakmai

tanácsaikkal folyamatosan segítették munkámat.

Köszönöm „szobatársaimnak” dr. Borbély Évának és dr. Hajna Zsófiának, hogy

barátságukkal, lelkesedésükkel és szakmai tanácsaikkal folyamatosan inspiráltak és jobb

teljesítményre ösztökéltek.

Köszönöm a kísérletek során nyújtott nélkülözhetetlen segítséget Ömböliné Dórának,

Góglné Katinak, Zádor Csillának, Bagoly Teréznek, Zöldhegyi Máriának, dr. Scheich

Bálintnak, dr. Markovics Adriennek, dr. Kemény Ágnesnek, dr. Botz Bálintnak, Boros

Melindának és diákköröseimnek Horváth Ádámnak és Kóger Tamásnak.

Köszönöm dr. Andreas Goebelnek a komplex regionális fájdalom szindrómával

kapcsolatos kooperációt.

Köszönöm a „volt Richteres” kollegáimnak dr. Szőke Évának, dr. Sándor Zoltánnak, dr.

Tóth Dániel Mártonnak és dr. Dézsi Lászlónak, hogy mindig számíthattam szakmai

tanácsaikra.

Továbbá köszönettel tartozom a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet összes

munkatársának.

Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családom támogatását, férjem türelmét és mindazt

a szeretetet, amit tőlük kaptam.

94

Publikációs lista

Értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények:

Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János Szolcsányi, Victoria

Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A CRPS-IgG-transfer-trauma model

reproducing inflammatory and positive sensory signs associated with Complex Regional Pain Syndrome.

Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18. (IF:5,644)

Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C., Szolcsányi J.,

Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor antagonist compounds

SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia measured with an increasing-

temperature water bath.

Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141. (IF: 2.737 FC:4)

Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1

receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the

noxious heat and cold thresholds in the rat.

Eur. J. Pain 14 (5), 2010, 480-486. (IF:3.819 FC:3) (megosztott első szerző)

Az értekezés alapját képező publikációk kumulatív impact faktora: 12,2

Független citációk száma: 7

Egyéb teljes közlemények:

de Oliveira C, Garami A, Lehto SG, Pakai E, Tekus V, Pohoczky K, Youngblood BD, Wang W, Kort

ME, Kym PR, Pinter E, Gavva NR, Romanovsky AA.: Transient receptor potential channel ankyrin-1 is not

a cold sensor for autonomic thermoregulation in rodents.

J. Neurosci. 2014 Mar 26;34 (13):4445-52. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5387-13.2014. (IF: 7,271; FC:0)

Helyes Zs., Sándor K., Borbély É., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall:

Involvement of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 receptors in Protease-Activated Receptor 2-induced

joint inflammation and nociception.

Eur. J. Pain 14(4), 2010, 351-358. (IF: 3.819; FC: 7)

Elekes K., Helyes Zs., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Bánvölgyi Á., Németh J.,

Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on

acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. Eur. J. Pharmacol. 578(2-3), 2008,

313-322. (IF:2,787, FC:14)


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Oliveira%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garami%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lehto%20SG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pakai%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tekus%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pohoczky%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Youngblood%20BD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kort%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kym%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pinter%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gavva%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Romanovsky%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24671991




95

Az értekezés alapját képező konferencia-prezentációk:

Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson

Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the

Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice

II. Pécs-Oklahoma Szimpózium, Pécs, 2013. (előadás)

Hajna Zsófia, Valéria Tékus, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson



Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)

Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson



From Bionics to Medicine 1st European Ph.D. Conference Budapest, 2013. (poszter)

Tékus Valéria, Kóger Tamás, Scheich Bálint, Hajna Zsófia Pintér, Erika, Szolcsányi János, Helyes

Zsuzsanna: A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) ioncsatorna szerepe fájdalomérző

folyamatokban

Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar

Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)

Zsuzsanna Helyes, Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz,

Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel: A komplex regionális fájdalom

szindróma (CRPS) passzív transzfer-trauma egérmodellje


Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)

Valéria Tékus, Tamás Kóger, Bálint Scheich, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér, János Szolcsányi,

Zsuzsanna Helyes: Role of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) ion channel in nociceptive

processes

10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia

2013. (poszter)

Valéria Tékus, Bálint Scheich, Tamás Kóger, Ádám Horváth, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér,

János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Role of Transient Receptor Ankyrin 1 ( TRPA1) ion channel in

nociceptive processes

Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)

96

Tékus V., Helyes Z., Hajna Z., Horváth Á,, Kun J., Bölcskei K., Pintér E., Szolcsányi J.:

Transient Receptor Potential Vanilloid (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels mediate mustard

oil-induced hyperalgesia in mice

I. International Doctoral Workshop of Natural Sciences 2012. Pécs (előadás)

Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. :

Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in

thermonociception in mice

IBRO International Workshop 2012. Szeged, Hungary (poszter)

Tékus, V, Helyes Z., Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Pintér E. Szolcsányi, J:

Involvement of Transient Receptor Vanilloid 1 (TRPV1) but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels in

mustard oil-induced hyperalgesia in the mouse

9th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, London

2012. (poszter)

Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Pethő Gábor, Szolcsányi János: A termonocicepció új állatkísérletes

vizsgálómódszerei: a magatartási nociceptív hőküszöb mérése


Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen, 2012. (előadás)

Valéria Tékus, Kata Bölcskei, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, Gábor Pethő, János

Szolcsányi: Antihyperalgesic effect of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) receptor

antagonists SB705498, BCTC, AMG9810 in the rat measured with an increasing-temperature water bath

IBRO International Workshop, Pécs, 2010. (poszter)

Gábor Pethő, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, János

Szolcsányi: Models for screening in rats the effects of TRPV1 receptor antagonists on thermal hyperalgesia

and thermoregulation

WorldPharma, Copenhagen, 2010. (poszter)

Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists

SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold

measurements

12th World Congress of Pain, Glasgow, 2008 (poszter)

97

Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Szolcsányi János: Kapszaicin (TRPV1) receptor blokkolók

hatása a nociceptív hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben

Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, 2008. Zalakaros (előadás)

Dézsi László, Bölcskei Kata, Sándor Zoltán, Tékus Valéria, Szőke Éva, Tóth Dániel Márton és Szolcsányi

János: Kísérletes mérési módszerek alkalmazása a fájdalomcsillapítók kutatásában

In: Proc. of BUDAMED '08 14. MATE, 5 MEDING Orvostechnikai Konferencia, 2008. Budapest

Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists

SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold

measurements

Richter Gedeon Kutatási Fórum, Visegrád 2008. (poszter)

Tékus Valéria, Dézsi László, Bölcskei Kata, Szolcsányi János: TRPV1 receptor antagonisták hatása a

fájdalmas hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben MKKFT-MÉT Vándorgyűlés, Debrecen

2008. (poszter)

Tékus Valéria, Bölcskei Kata, Tóth Dániel Márton, Dézsi László, Szolcsányi János: Az SB705498 TRPV1

receptor antagonista vegyület hatásai patkány in vivo nociceptív modellekben. Magyarországi Fájdalom

Társaság Konferenciája, Kecskemét, 2007. (poszter)

Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Horváth Csilla,Pethő Gábor, Szolcsányi

János: Kísérleti módszerek kapszaicin érzékenyreceptorok által közvetített fájdalom vizsgálatára.

Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, Eger, 2007. (előadás)

Dézsi László, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Bölcskei Kata, Horváth Csilla, Pethő Gábor és

Szolcsányi János: Nocicepció vizsgálata patkány in vivo modelleken a PTE-RG Analgetikum

Kutatólaboratóriumban

Richter Gedeon Kutatási Fórum, Dobogókő, 2007. (előadás)

Egyéb konferencia-prezentációk:

Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gaszner, Kristóf László, László

Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes

Functional and immunocytochemical evidence for anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin

receptor subtype 4 activation in mice Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)

Pintér Erika, Hajna Zsófia, Szabadfi Krisztina, Gábriel Róbert, Balla Zsolt, Bíró Zsolt, Degrell Péter,

Kőszegi Tamás, Tékus Valéria, Helyes Zsuzsanna, Dobos András, Farkas Sándor, Szűcs Gyula: Az 1-es

98

típusú diabetes mellitus modellezése diabeteses neuropathia, nephropathia és szemelváltozások vizsgálatára

patkányban


Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)

Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: A

citokin profil változása monojód-acetáttal kiváltott izületi gyulladás modellben


Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)

Scheich Bálint, Kormos Viktória, Tékus Valéria, Hajna Zsófia, Gaszner Balázs, Pintér Erika, Szolcsányi

János, Helyes Zsuzsanna: Inhibitory function of Somatostatin Receptor Subtype 4 (sst4) in anxiety and

depression-like behaviours in the mouse


2013. (poszter)

Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: Changes

of cytokyne profile in monosodium-iodoacetate-induced joint inflammation in TRPA1 WT and KO mice


2013. (poszter)

Éva Borbély, Liza Nabi, Zsófia Hajna, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi,

László Lénárd, John P.Quinn, Alexandra Berger, Christopher J Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika

Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of Hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like

behaviour in mice


2013. (poszter)

Hajna Zsófia, Szitter István, Kemény Ágnes, Kereskai László, Tékus Valéria, Markovics Adrienn,

Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna: Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) receptor

plays a protective role in endotoxin-induced acute pneumonia, but not in smoking-related chronic bronchitis

of the mouse


2013. (poszter)

Zsófia Hajna, Éva Borbély, Valéria Tékus, István Tóth, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Erika

Pintér, József Kun, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory

and neuropathic pain models of the mouse

99


Éva Borbély, Zsófia Hajna, Lisa Nabi, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi,

László Lénárd, John P. Quinn, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika

Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like

behaviour in mice


Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gasztner, Kristóf László, László

Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Funtional and immunochemical evidence for

anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin receptor subtype 4 activation in mice


Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall, Helyes Zs.:

Involvement of Transient receptor potential vanilloid 1 receptors in proteinase-activated receptor 2-induced

joint inflammation and nociception. 30th Winter Neuropeptide Conference, Breckenridge, Colorado, USA,

2009 (poszter)

Dániel Márton Tóth, Éva Szőke, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, László Dézsi, Zoltán Sándor, János

Szolcsányi: Inhibition of the expression of the rat TRPV1 receptor by RNA interference. European Opioid

Conference-European Neuropeptide Club, 2008, Ferrara (poszter)

Sándor Z, Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J: RNS interferencia alkalmazása a

TRPV1 receptor kutatásában. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII.

Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (előadás)

Sándor Zoltán, Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Szolcsányi

János: RNS interferencia alkalmazása a TRPV1 receptor kutatásában.

A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen

Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi

János: Patkány TRPV1 receptor expressziójának gátlása RNS interferenciával.

Membrán-transzport Konferencia, 2008, Sümeg

Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi

János: Patkány TRPV1 receptor expressziójánakgátlása RNS interferenciával.

A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen

100

Idézhető absztraktok:

Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. :

Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in

thermonociception in mice Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.68 (IF:1.247)

Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Z, Gaszner B, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z: Somatostatin

receptor subtype 4 (sst4) plays an inhibitory role in anxiety and depression-like behaviours of mice

Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.57 (IF:1.247)

Pethő G, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J. Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1

receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the

noxious heat and cold thresholds in the rat.

Acta Physiol Hung 2010; 97:(1) pp. 129-130 (IF: 0.453)

Helyes Z, Sandor K, Tekus V, Pinter E, Elekes K, Toth DM, Szolcsanyi J, McDougall JJ

Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and

nociception NEUROPEPTIDES 43: (5)451 (2009) (IF:2.036)

Helyes Zs., Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall:

Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and

nociception. Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference,

Salzburg, Austria, 2009 - absztrakt: Neuropeptides 43(5), p.451., 2009. (IF:2.438)

Tékus V, Dézsi L, Bölcskei K, Szolcsányi J.: Effects of TRPV1 receptor antagonists on the noxious heat

threshold in rat thermal hyperalgesia models. Acta Physiol Hung 96:(1), 2009. p. 68. (IF: 0.75)

Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Sándor Z, Szolcsányi J; Inhibition of the expression of

the rat TRPV1 receptor by RNA interference. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a

MÉT LXXII. Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (poszter). absztrakt: Acta Physiol Hung 2009,

96:(1): p.138 (IF: 0.75)

Dézsi L, Laszy J, Kocsis P, Bölcskei K, Tékus V, Tarnawa I, Gyertyán I, Szolcsányi J. Hippocampus-

dependent learning and cortical spreading depression unaffected by TRPV1 receptor.

Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference, Salzburg, Austria,

2009 - absztrakt: Neuropeptides 2009; 43:(5) pp. 450-451 (IF: 2.036)

Az összes publikáció kumulatív impact factora: 26,077

Összes független citációk száma: 27

fÁjdalomban szerepet jÁtszÓ mechanizmusok...

Documents