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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA

EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

CIIDIR UNIDAD SINALOA

INFORME TÉCNICO PARCIAL

PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO

Clave del Programa: 1336

“NUEVAS FORMULACIONES DE BIOINSECTICIDAS PARA EL CONTROL DE LAS PRINCIPALES PLAGAS DEL TOMATE EN

SINALOA”

MÓDULOS:

1.-“Caracterización molecular de líneas genéticas de hongos entomopatógenos e insectos plaga de tomate (Solanum lycopersicum)” SIP-20113544. Director: Dra. Norma Karina Hernández Ibarra (CIIDIR-Sinaloa).

2.-"Escalamiento de procesos de producción de hongos entomopatógenos y nematodos" SIP-20113532. Director: Dr. Sergio García Salas (UPIBI).

3.- “Diseño y evaluación de formulaciones micro y nanoencapsuladas para el control de plagas de hortalizas” SIP-20113533. Director: Dr. Cipriano García Gutiérrez (CIIDIR-SIN).

4.- “Validación de la efectividad de bioinsecticidas para el control de las principales plagas de tomate” SIP-20113605. Director: Dr. Adolfo Dagoberto Armenta Bojorquez (CIIDIR-SIN).

Informe Técnico Parcial (Programa 1336) Página 2

RESUMEN

En Sinaloa se generan importantes divisas con el cultivo de hortalizas, ya que cada año se siembran 23,000 ha y se producen de 65-99 mil ton/ciclo. Sin embargo, el cultivo enfrenta el ataque de diferentes tipos de insectos plaga, los cuales dañan al cultivo y provocan cuantiosas pérdidas económicas. Para el control biológico de estas plagas se utilizan de manera exitosa una amplia gama de bioinsecticidas comerciales. Sin embargo, es necesario la elaboración de nuevas formulaciones micro encapsulada que se distingan por el uso de cepas nativas de los organismos que se utilizan como ingrediente activo (virus, bacterias, hongos y nematodos), utilizando nuevos materiales biodegradables en las formulaciones. Estas propiedades ofrecen nuevas aplicaciones para el control efectivo de las plagas locales, sin alterar el ambiente. En este primer año del desarrollo de estos productos, se logro la caracterización molecular de 30 cepas nativas de hongos entomopatógenos (PCR, región Ts1, Ts4) los cuales serán enviados a secuenciación; de estas se seleccionaron tres cepas nativas para su producción en matraz y fermentador de 7l; también se logro el aislamiento y la propagación de una cepa de colección de Bt y otra de una colonia de un nematodo rabditido. Se formularon 2 productos microencapsulados, uno a base de polímeros naturales y otro con quitosano, utilizando al hongo B. bassiana, y con Bt un polvo humectable. En las pruebas de patogenicidad de dichos productos en laboratorio el microencapsulado causo mortalidad de larvas de gusano del fruto y gusano alfiler de 90 a 100%, mientras que Bt tuvo toxicidad contra larvas del gusano del fruto 98% de mortalidad de larvas jóvenes; las pruebas de efectividad de productos en campo se encuentran en desarrollo, mientras que las de residualidad y persistencia de productos se realizaran en la segunda etapa del proyecto.


INTRODUCCIÓN

En México, el tomate Lycopersicum esculetum Mill, es la hortaliza más importante desde el punto de vista socioeconómico, los principales Estados productores son: Sinaloa, Morelos, San Luis Potosí, Baja California Norte y Michoacán; en Sinaloa se generan importantes divisas, ya que cada año se plantan 23,000 ha y se producen de 65-99 mil ton/ciclo. Sin embargo, el cultivo enfrenta el ataque del gusano del fruto Heliothis virencens, gusano alfiler Keyferia lycopersicella, paratrioza Bactericera cockerellii, mosquita blanca (Bemisia argentifolii, B. tabaci y T. vaporarorium), trips Frankliniella occidentalis y áfidos (Myzus persicae), los cuales dañan al cultivo y provocan cuantiosas pérdidas económicas. Para el control biológico de estas plagas se utilizan de manera exitosa una amplia gama de bioinsecticidas comerciales.

Dentro de las alternativas para la elaboración de bioinsecticidas usados para controlar plagas se encuentran los producidos por medio de Microencapsulación; estas formulaciones se componen de sustancias bioactivas hongos, bacterias y nematodos (esporas, micelio, complejo espora-cristal e infectivos juveniles) encapsuladas en una matriz o sistema pared (Yáñez et al., 2002). El diseño de un bioinsecticida incluye la elaboración de mezclas del ingrediente activo con adyuvantes, fagoestimuladores y adherentes, a fin de ofrecer selectividad, biodegradabilidad y capacidad de dirigirse a un rango estrecho de insectos plaga (Joung y Côté 2000). La formulación debe proporcionar estabilidad a los agentes microbianos durante la distribución y el almacenamiento del bioinsecticida. El diseño en microcápsulas podría facilitar el transporte, almacenamiento y la aplicación en campo. Durante el almacenamiento del mismo se busca una mayor vida de anaquel, y una vez en campo, el objetivo es reducir la cantidad liberada al medio ambiente (Masuda, 2011). En cuanto a la persistencia, se pretende que desarrolle resistencia a condiciones ambientales extremas, tal como la lluvia, el viento, radiación UV, etc. (Asencio, 2010; Masuda, 2011). Finalmente, al encapsular el ingrediente activo se desea que se tenga una degradación más lenta de este, así como conseguir que se libere menor cantidad de ingrediente activo durante tiempos más prolongados. Por lo anterior, el objetivo de esta investigación es el desarrollo de formulaciones microencapsulada a base de microorganismos nativos; hongos, bacterias y nematodos con polímeros biodegradables (pectina y quitosan y, harinas), para evaluar su efectividad toxica para el control de diverso insectos plagas de hortalizas, en laboratorio e invernadero; así como evaluar su residualidad y vida de anaquel.


Módulo 1. “Caracterización molecular de líneas genéticas de hongos entomopatógenos e insectos plaga de tomate (Solanum lycopersicum)”

1. Objetivo y metas cumplidas

Caracterizar genéticamente a poblaciones de hongos entomopatógenos e insectos plaga en tomate con el fin de correlacionar la virulencia de las diferentes cepas de hongos a las distintas poblaciones de insectos y de esta manera lograr una óptima selección de las cepas patógenas.

Metas

1.- Colecta de muestras

2.- Análisis de ADN.

2. Métodos y materiales

Meta 1. Colecta de muestras.

Área de estudio El área de estudio se localiza en la zona agrícola del Estado de Sinaloa ubicado en el Noroeste del país a los 22° 31' y 26° 56' de Latitud norte y a los 105° 24' y 109° 27' de longitud oeste del meridiano de Greenwich. Limita al norte con los estados de Sonora y Chihuahua; al sur con Nayarit; al este con Durango y al oeste con el Océano Pacífico. Precipitación media anual de 790 mm en los valles, y en las partes altas de la sierra la precipitación media anual es de 1188 mm. La temperatura media anual del estado es alrededor de 25°C, las temperaturas mínimas promedio son alrededor de 10.5°C en el mes de enero y las máximas promedio pueden ser mayores a 36°C durante los meses de mayo a julio (INEGI, 2009). Colecta de suelo Se colecto suelo de sistemas agro-ecológicos usando la técnica de zig-zag recomendada por Cline (1944), el suelo se tomo de los primeros 15 cm obteniéndose al final 1 kg, se guardo en bolsas de plástico negro de 2 kg de capacidad, debidamente etiquetadas y cerradas, se trasladaron al laboratorio de bioinsecticidas del CIIDIR-SINALOA, colocándolas en un sitio fresco. En el laboratorio las muestras de suelo fueron secadas a la sombra, tamizadas para eliminar tierra muy compactada y residuos de desperdicios, y clasificadas por sitio (previamente georreferenciadas). A su vez se realizó una búsqueda intensiva en campo de insectos con síntomas de infección por hongos entomopatógenos.


Meta 2. Análisis de ADN.

Caracterización Molecular

Extracción de ADN.- Se creció micelio del hongo en caldo Sabouraud Dextrosa (Alves, 1986) con agitación a 27 ºC por 24-48 hr. Pasado este tiempo el contenido de cada tubo de ensayo estándar se coloco en tubos eppendorff y se centrifugo 5 min a 10, 000 rpm para separar el micelio del medio. El micelio se lavo con agua destilada para eliminar los restos del medio. La extracción del DNA geonómico del micelio se hizo siguiendo el protocolo de Skroch y Nienhuis (1995) con mínimas modificaciones. El micelio se macero con el tampón compuesto por: 100 mM Trizma; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA; 1% Polivinilpirrolidona y 2% CTAB, ajustado a un pH 8,0; a cada muestra se le agregaron 8 µL de proteinasa K. La mezcla se incubo a 65ºC por 60 min y se homogeneizo a intervalos de 10 min. Las muestras se dejaron enfriar y se mezclaron con cloroformo-isoamílico (24:1), posteriormente se centrifugaron a 10,000 rpm. por 8 min, el sobrenadante acuoso se transfirió a otro tubo y se le agrego isopropanol, las muestras se incubaron a -20ºC por toda la noche para precipitar el ADN. El pellet de ADN se colecto mediante centrifugación, se lava con alcohol al 70% y alcohol absoluto 90% para luego ser secado a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN se diluyo en agua libre de RNAsas. La calidad del ADN se verifico mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8%; teñido con bromuro de etidio.

Amplificación del ADN.- Se amplifico la región ITS del rADN utilizando los iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (White et al, 1990). La reacción se llevo a cabo en un volumen de 25 ul que incluye 20 pM de cada uno de los iniciadores, 1X de amortiguador de reacción de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 50 uM de cada dNTP, 1.5 unidades de Taq ADN polimerasa y 25 ng de ADN molde. El ciclo termal es iniciado con 4 min a 94 ºC seguido por 25 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 1 min, hibridación a 55 ºC por 30 seg, extensión a 72 ºC por 1 min y 4 min a 72 ºC de extensión final en un termociclador. Los productos amplificados se clonaron y se enviaron a secuenciar a otros laboratorios, a través de los colaboradores.

3. Resultados y discusión

Se obtuvieron 30 aislamientos de hongos entomopatógenos, de los cuales 18 aislados, 12 de B. bassiana y 6 de M. anisopliae, furon los que expresaron los mejores morfo tipos por lo que actualmente se encuentran en proceso de caracterización molecular.


Sitios de colecta de hongos entomopatógenos en la región norte de Sinaloa

Municipio Sitio Localidad Cultivado / No impactado

Ecosistema Ubicación geográfica Altura (msnm)

N W

Ahome 1 El Carrizo Cultivado Agroecosistema 26° 14.207’ 108° 56.767’ 33.22

2 El Carrizo Cultivado Agroecosistema 26° 14.360’ 108° 56.767’ 31.39

3 Camayeca Cultivado Agroecosistema 25° 57.303’ 109° 5.262’ 15.11

4 Ej. La Arrocera Cultivado Agroecosistema 25° 49.351’ 108° 52.597’ 15.24

5 Ej. Luis Echeverria Cultivado Agroecosistema 25° 48.352’ 108° 50.517’ 15.56

El Fuerte 6 Capomos No impactado Selva* 26° 26.551’ 108° 32.213’ 146.30

7 Jahuara Cultivado Agroecosistema 26° 13.202’ 108° 57.025’ 28.43

8 Jahuara Cultivado Agroecosistema 26° 11.269’ 108° 55.347’ 52.12

9 Charay Cultivado Agroecosistema 26° 2.081’ 108° 49.208’ 40.47

10 Constancia Cultivado Agroecosistema 25° 58.508’ 108° 54.724’ 13.13

Choix 11 El Vado No impactado Selva 26° 43.707’ 108° 18.577’ 200.25

12 El Guayabito No impactado Selva 26° 43.014’ 108° 24.260’ 289.86

13 Bajosori Cultivado Agroecosistema T 26° 40.17’ 108° 23.009’ 351.73

14 Colexio No impactado Selva 26° 33.035’ 108° 26.486’ 164.60

15 Colexio Cultivado Agroecosistema T 26° 33.044’ 108° 26.515’ 162.15

Guasave 16 La Cofradia Cultivado Agroecosistema 25° 30.468’ 108° 26. 193’ 19.53

17 Buenos A. Cultivado Agroecosistema 25° 24.234’ 108° 25. 341’ 17.92

18 Cortines Cultivado Agroecosistema 25° 41.352’ 108° 40.829’ 39.80

19 Calle II Cultivado Agroecosistema 25° 39.139’ 108° 37.186’ 22.28

20 La Uva (reserva ecológica)

No impactado Selva 25° 29.324’ 108° 27.870’ 9.14

Sinaloa de Leyva

21 Cubiri de la Loma Cultivado Agroecosistema 25° 46.098’ 108° 15.732’ 54.86

22 El Opochi Cultivado Agroecosistema T 25° 49.211’ 108° 10.713’ 96.01

23 Bacubirito No impactado Selva 25° 48.675’ 107° 54.909’ 191.71

24 Burague Cultivado Agroecosistema T 25° 49.401’ 107° 57.810’ 138.68

25 Porohui No impactado Selva 25° 53.182’ 107° 59.061’ 114.60


4. Conclusiones e impacto de la investigación

Los aislamientos de hongos entomopatógenos obtenidos de B. bassiana y de M. anisopliae, forman parte de la colección de hongos del laboratorio de Bioinsecticidas de este Centro. A partir de este material será posible hacer los estudios genéticos con marcadores moleculares para las diferentes especies de hongos y su relación con los insectos infectados con estos hongos colectados en campo, para vislumbrar de esta manera las líneas genéticas que tienen estos organismos con los insectos plaga de hortalizas de la región de estudio.

Clave

Aislamiento Localidad y municipio

B1 Beauveria El vado, Choix





M1 Metarhizium El vado, Choix



B4 Beauveria El Guayabito, Choix

B5 Beauveria Colexio, Choix




M4 Metarhizium La Uva, Guasave

M5 Metarhizium Cubiri, Sinaloa de Leyva

M6 Metarhizium Cubiri, Sinaloa de Leyva

B9 Beauveria Bacubirito, Sinaloa de Leyva

B10 Beauveria Porohuí, Sinaloa de Leyva


5. Bibliografía

Alves, S. 1986. Controle Microbiano de Insectos. Brasil. Ed. Manole. Sao Paulo Cline, M.G. (1944): Principles of soil sampling. Soil Science, 58, 275-288. INEGI, 2011. En línea disponible en: www.inegi.gob.mx Martha Dávila, Karla Zambrano y Miguel A. Castillo. 2001. Uso de la Técnica RAPD

para la Identificación de Fragmentos de ADN Posiblemente Relacionados con Virulencia de Hongos Entomopatógenos. Bioagro 13(3) :93-98.

McGuire, M.R., Ulloa, M., Park, Y.-H., Hudson, N., 2005. Biological and molecular characteristics of Beauveria bassiana isolates from California Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) populations. Biol. Control 33, 307–314.

National Center for Biotechnology Information, 2012. En línea disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Saitou N & Nei M (1987) The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.Skroch, P. and J. Nienhuis. 1995. Qualitative and quantitative characterization of RAPD variation among snap bean (Phaseolus vulgaris) genotypes. Theor. Appl. Genet. 91:1078-1085.

Viviana Becerra V. Mario Paredes C. Carmen Rojo M. y Andrés France I. 2007. RAPD e ITS detectan variación molecular en poblaciones chilenas de Beauveria bassiana. AGRICULTURA TÉCNICA (CHILE) 67(2):115-125

White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Pp. 315-322 In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White. Academic Press, Inc., New York


Módulo 2. "Escalamiento de procesos de producción de hongos entomopatógenos y nematodos"


Realizar el escalamiento de procesos de producción de hongos entomopatógenos y nemátodos para su aplicación en cultivos agrícolas de la región norte de México. Las metas cumplidas son las propuestas en el protocolo 2011 de este proyecto, las cuales corresponden al primer año de realización del mismo. Estas metas se describen en la sección de resultados. 2. Métodos y materiales Tres cepas del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana: BbPM, BbP1 y BbHM04, y una cepa del nemátodo Heterorhabditis, proporcionadas por el CIIDIR Sinaloa. Formulación del medio de cultivo: 14.5 mL/L de melaza, 6 g/L de (NH4)2SO4, 3.5 g/L de KH2PO4, 0.5 g/L de MgSO4, 0.1 g/L de NaCl y 0.1 g/L de CaCl2. Las condiciones de cultivo fueron pH de 5.4 y temperatura de 30oC. Equipo utilizado: Biorreactores y condiciones de operación: Tanque agitado de 400 mL; 250 rpm y 1 vvm. De columna de burbujeo de 400 mL; 1 vvm. Airlift de 400 mL; 1 vvm Tanque agitado de 2 L, 200 rpm y 1 vvm. Tanque agitado de 14 L; 200 rpm y 1 vvm. Métodos analíticos

a) Determinación de viscosidad con el viscosímetro Haake modelo RV20 con control de temperatura.

b) Determinación de velocidad de corte en matraz de acuerdo a Fujita et al. (1994) y en biorreactor de tanque agitado de acuerdo a Sánchez et al. (2006).

c) Consumo de potencia, de acuerdo a Aiba et al. (1973). d) Número de esporas, emplendo cámara de Neubawer. e) Azúcares reductores, por el método del DNS. f) Biomasa, por peso seco.

3. Resultados y discusión Meta 1: Cinéticas en matraz


Actividades: Obtención de información sobre los antecedentes relacionados con el cultivo de hongos y nemátodos en matraz. La información obtenida para iniciar el proyecto fue la formulación del medio y las condiciones del medio de cultivo (mostradas en la sección 5) usadas en fermentaciones líquidas en el CIIDIR Sinaloa. También, la preparación del inoculo a partir de tubos inclinados con el hongo después de haber sido incubados por 15-18 días a 27 oC. El inoculo que emplean para fermentación en sustrato sólido es el crecimiento del hongo en un matraz, a 37°C y 130 rpm, con el medio de cultivo mencionado anteriormente, al cual se le adiciona una suspensión de esporas producidas en tubo inclinado, en agua estéril con 0.5 % y Tween al 80 %. Meta 2: Preparación de inóculos Actividades: Establecimiento de un programa de preparación de inoculo La preparación de inoculo debe producir microorganismos en gran número y con un estado de crecimiento activo, libre de contaminación y con la habilidad de formar producto. El programa consistió en sembrar el hongo en medio PDA, incubar a 27oC durante 20 días, preparar una suspensión en agua estéril con 0.5 % de Tween al 80 % a una concentración de 106 esporas/mL, adicionar 10 % en volumen de la suspensión a un matraz, incubando a 27oC durante 3 días. A este tiempo el crecimiento de biomasa se encuentra en fase exponencial y con este cultivo se inocula al 10 % un biorreactor. Meta 3: Cinéticas en matraz con reactivos grado técnico Actividades: Determinación de cinéticas de crecimiento y producción en el cultivo de hongos en matraz, empleando reactivos grado técnico. Los reactivos usados como nutrientes fueron de grado técnico, con el propósito de disminuir el costo de producción de las esporas al emplear biorreactores de gran volumen. La figura 1 muestra la formación de esporas de tres cepas de Beauveria bassiana. La cepa que produjo mayor concentración de esporas fue la BbPM, razón por la cual fue la que se usó en los demás experimentos.


Figura 1. Formación de esporas en matraz a 27°C y 130 rpm, en cepas de Beauveria bassiana: BbP1(◊), BbPM(□) y HM04 (∆). Las velocidades específicas de crecimiento y rendimientos de biomasa a sustrato de las cepas evaluadas fueron semejantes, del orden de µmax = 0.044 h-1 y 1 g biomasa/g sustrato. La productividad de esporas en la cepas BbPM fue de 1 x 109 esporas/ L h. Meta 4: Fenómenos de transferencia en matraz Actividades: Estudio de reología, parámetros hidrodinámicos, de transferencia de oxígeno y consumo de potencia en el cultivo de hongos en matraz. Determinación de morfología y tamaño celular/pellets. La figura 2 muestra que el comportamiento reológico del medio de cultivo conteniendo 4.3 g/L de biomasa y 1. 6x108 a 27°C corresponde al de un fluido Newtoniano, debido a que la relación entre el esfuerzo de corte y la velocidad de corte aplicada es lineal.

0.00E+00

2.00E+07

4.00E+07

6.00E+07

8.00E+07

1.00E+08

1.20E+08

1.40E+08

1.60E+08

1.80E+08

0 20 40 60 80 100 120 140

Esp

oras

/mL

Tiempo (h)


Figura 2. Relación de esfuerzo de corte vs velocidad de corte de medio de cultivo conteniendo 4.3 g/L de biomasa y 1.6x108 a 27°C. La naturaleza Newtoniana del medio de cultivo indica que en el matraz el medio de cultivo conteniendo células circuló “en fase” (número de fase > 1.26) con la agitadora, es decir, la transferencia de oxígeno y la intensidad de mezclado no se reducen significativamente (Büchs 2000). Uno de los parámetros hidrodinámicos determinados fue la velocidad de corte. En matraz fue de 40 s-1 y en biorreactor de tanque agitado de 220 s-1. Esta diferencia al parecer no afecta la capacidad de formación de esporas, pues como se describe más adelante, la producción de esporas en matraz es semejante a la de biorreactor. La velocidad de transferencia de oxígeno se determinó en el matraz de 250 mL usado para el cultivo del hongo, pero sin contar con el tapón de algodón, razón por la cual, el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno (kLa) pudo haber sido sobreestimado. El kLa del matraz a las condiciones de cultivo fue de 10 h-1. El consumo de potencia específico en matraz fue de 0.1 kW/m3. El cultivo de Beauveria bassiana no formo pellets, crece en forma dispersa. Meta 5: Producción de nemátodos Actividades: Determinación de productividad y rendimiento en el cultivo de nematodos en biorreactor de 9 L El primer paso fue caracterizar el desempeño hidrodinámico y de transferencia de oxígeno de biorreactores con agitación neumática para el cultivo del nemátodo Heterorhabditis. El líquido de prueba empleado fue agua destilada, la cual presenta propiedades de medio coalescente. La caracterización de los

y = 0,0016x - 0,0624r² = 0,9972

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Esf

uer

zo d

e co

rte

(Pa)

Velocidad de corte (1/s)


biorrectores se llevó a cabo empleando el método dinámico para determinar la velocidad de transferencia de oxígeno. La velocidad de corte se calculó de acuerdo a Chisti and Moo-Young (1989) y el tiempo de mezclado con el método de adición de pulsos (Deckwer, 1992). La tabla 1 muestra el desempeño hidrodinámico y de transferencia de oxígeno de los biorreractores que pueden satisfacer los requerimientos para cultivar a Heterorhabditis. TABLA 1. Parámetros hidrodinámicos y de transferencia de oxígeno en biorreactores neumáticos obtenidos a 1 vvm.

Parámetro Airlift Columna kLa (h-1) 100 106 Tm (s) 46 30 (s-1) 40 20

kLA. Coeficiente de transferencia de oxigeno. Tm. Tiempo de mezclado. . Velocidad de corte

La mayor transferencia de oxígeno y la menor velocidad de corte que tiene el biorreactor de columna de burbujas, lo hace ser el biorreactor que eventualmente podría ser la mejor opción para cultivar al nemátodo, debido a que los nematodos en general presentan demandas de oxígeno bajas. Por otro lado, la fuerza boyante de las burbujas en el biorreactor aunada a la baja velocidad de corte, permitiría el mezclado de líquido y el contacto entre nemátodos para su reproducción Meta 6: Estrategia de escalamiento de matraz a biorreactor de 7 L Actividades: Desarrollo de la estrategia de escalamiento de matraz a biorreactores de 0.7 L y 7 L. Para definir la estrategia de escalamiento fue necesario hacer experimentos en biorreactor de 2 L para conocer la demanda de oxígeno por parte del microorganismo. La figura 3 muestra la concentración de oxígeno disuelto después de suspender la aireación al biorreactor, a la hora 72 de un cultivo de Beauveria bassiana BbPM. La concentración de oxígeno disuelto disminuye debido que el oxígeno disuelto es consumido por los microorganismos mientras que la velocidad de transferencia de oxígeno es cero.


Figura 3. Concentración de oxígeno disuelto al suspender la aireación en un biorreactor de tanque agitado de 2 L, a la hora 72 de un cultivo de Beauveria bassiana BbPM. La velocidad de consumo de oxígeno fue de 0.0252 g oxígeno/Lh. Al momento de la determinación, la concentración de peso seco fue de 4.1 g/L. Si consideramos que todo el peso seco son células, cosa que no es así, entonces la velocidad específica de consumo de oxígeno es de 0.0063 g oxígeno/g células h. Puesto que las propiedades reológicas del medio de cultivo no ofrecen complicación alguna para mantener condiciones homogéneas y la demanda de oxígeno por parte de los microorganismos es plenamente satisfecha aún en matraz, es entonces de especial interés la velocidad de corte y la velocidad de agitación aunados al tipo de impulsor. Meta 7: Escalamiento a biorreactor de 7 L Actividades: Caracterización cinética, reológica, hidrodinámica y de transferencia de oxígeno en biorreactor de 0.7 L y 7 L. Determinación de morfología y tamaño celular/pellets. La figura 4 muestra la formación de esporas en matraz y en biorreactores de tanque agitado de 1.4 L y 7 L. La formación de esporas es semejante hasta la hora 96, alcanzando una concentración de 1.6x108 esporas/mL. La máxima concentración de esporas alcanzada en este trabajo (2.8x108 esporas/mL) es aún menor que la obtenida en un biorreactor de tanque agitado equipado con un impulsor de flujo axial y otro radial (1.2x109 esporas/mL; Aquiles Solís y col., 2006).

y = ‐0.007x + 6.570R² = 0.991

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 100 200 300 400 500

Oxí

gen

o d

isu

elto

(m

g/L

)

Tiempo (s)


Figura 4. Producción de esporas en matraz (□) y en biorreactores de tanque agitado de 1.4 L (○) y 7 L (Δ) equipados con 2 turbinas Rushton, ambos a 200 rpm y 1 vvm. La menor concentración de esporas obtenida en este trabajo con respecto a la obtenida por Aquiles Solís y col. (2006), es probable que la causa sea que los biorreactores usados en este trabajo tenían turbinas Rushton y el de Aquiles Solís y col. (2006) tenía un impulsor axial y otro radial (Rushton). Es probable que las turbinas Rushton produzcan velocidades de corte mayores que el impulsor axial; sin embargo, aún con una sola turbina Rushton si hay buen mezclado que provea condiciones de homogeneidad, el micelio es seguro que pase por los campos de flujo generados por la turbina Rushton, de tal manera que afecten a las hifas en donde se están formando las esporas, de manera semejante a cuando hay dos turbinas Rushton, puesto que el tiempo de fermentación es de más de 48 h.


La velocidad específica de crecimiento y el rendimiento de biomasa a sustrato de las cepa Beauveria bassiana BbPM, que fue la mayor productora de esporas, fueron de µmax = 0.044 h-1 y 0.6 g biomasa/g sustrato, respectivamente; y la productividad fue de 1 x 109 esporas/Lh. El comportamiento reológico del medio de cultivo conteniendo 4.3 g/L de biomasa y 1. 6x108 esporas/mL fue de tipo Newtoniano. La concentración de 1.6x108 esporas/mL se alcanzó a las 96 horas en matraz y en biorreactores de 1.4 L y 7 L, indicando que el propósito del escalamiento se cumplió. Sin embargo, la concentración alcanzada todavía es menor que la alcanzada en otros estudios.

0.00E+00

5.00E+07

1.00E+08

1.50E+08

2.00E+08

2.50E+08

3.00E+08

0 20 40 60 80 100 120 140

Esp

oras

/mL

Tiempo, h


Es recomendable hacer un estudio del efecto de las condiciones de mezclado sobre la forma y tamaño de las esporas obtenidas, más aún, sobre la toxicidad de las esporas. Los biorreactores tipo airlift y columna burbujeante lograron cumplir las necesidades de oxígeno y mezclado de los nemátodos, sin exponerlos a velocidades de deformación excesivas y permitiendo el contacto entre ellos para su reproducción. 5. Bibliografía

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Módulo 3. “Diseño y evaluación de formulaciones micro y nanoencapsuladas para el control de plagas de hortalizas”.


Objetivo

Diseñar nuevas formulaciones a partir de hongos, bacterias y nematodos que sean efectivos para el control de las principales plagas del tomate en Sinaloa, así como evaluar su toxicidad, persistencia y estabilidad en el ambiente.

Metas

1.- Propagación y Formulación de hongos entomopatógenos (HE).

2.- Producción y Formulación de bacterias entomopatógenas.

3.- Formulación de nematodos entomopatógenos.

4.-Evaluación de la toxicidad, estabilidad y residualidad de productos.


Meta 1.Propagación de hongos.

Preparación del inoculo: Se preparo un inóculo de los HE B. bassiana, M. anisopliae y P. fumosoroseus a partir de cepas nativas de la colección de referencia del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa, la propagación líquida se realizó en un medio de cultivo a base de fuentes de carbono- nitrógeno y sales minerales en matraces Erlenmeyer de 500 ml diferentes temperaturas (27-30 °C) y velocidades de agitación (120-200 rpm) dependiendo de las características de cada hongo, para la obtención de esporas-micelio (1x106 blastosporas/ml).

Aislamientos de HE. Se partió de 1 cepa de HE de cada uno de los tres géneros: Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea, Metarhizium anisopliae, los cuales fueron resembrados en medio de cultivo SDA y extracto de levadura al 1%, fue necesario observar la velocidad de crecimiento y la formación de cuerpos fructíferos: esporas, micelio, mediante microcultivos, se reinfectaron larvas de alguna plaga en tomate (lepidóptero) con estos HE con la finalidad de reactivarlas, así como realizar bioensayos. Preparación del ingrediente activo (inóculo)

a) Producción de blastosporas en medio líquido La preparación del inoculo se hizo en matraces de 500 mL con un medio de cultivo a base de melaza de caña de azúcar como fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales minerales, hasta la producción de blastosporas, En fermentador, se ajusto la concentración hasta 6.1x107 y 2.5x107

blastosporas/mL, pH 5.4, agitación 150 rpm, temperatura 27°C, inóculo 10%,


durante 3-4 días, hasta que se alcanzo el 80% de la fase logarítmica de crecimiento. Cuadro 1. Composición del medio de cultivo líquido para la producción de blastosporas.

INGREDIENTE CANTIDAD Melaza 14.5 mL Sulfato de amonio 6 g Fosfato dibásico de potasio 3.5 g Sulfato de magnesio 0.5 g Cloruro de sodio 0.1 g Cloruro de calcio 0.1 g Agua 1L

b) Producción de esporas en sustrato sólido

Se colocaron 300 g de arroz en bolsas de polipapel de alta densidad de 22 x 30 cm, y se cerraron con grapas. Se esterilizaron por 15 min a una temperatura de 120 °C, posteriormente es enfriarán por 24 h a temperatura ambiente. Se raspo la superficie de las cajas de Petri con un asa bacteriológica y se colocaron en un tubo de ensaye con 20 mL de agua destilada y 0.5% de dispersante. Esta suspensión se adiciono a un matraz con 1 L de agua destilada previamente esterilizada con antibiótico y se dejo enfriar por 24 h en agitación para homogenizar las conidias o esporas (cuerpos infectivos). Con una jeringa de uso veterinario se colocaron 10 mL de la suspensión por cada bolsa con 300 g de arroz, a una concentración de 1 x 106 esporas mL-1. Se homogenizo cada bolsa y se pusieron a germinar y crecer. Desarrollo del hongo y obtención de esporas. Se colocaron las bolsas en estantes a 28 ± 1 °C durante 16 ± 2 d hasta la esporulación. Se removieron las bolsas cada cuatro días para aumentar la superficie de contacto entre espora – sustrato e incrementar la productividad. Formulación de hongos entomopatógenos (HE).

a) Obtención de microencapsulados por secado por aspersión.

Para determinar el peso del formulado obtenido se realizó una diferencia de pesos entre el frasco y el formulado de la siguiente manera: Primero se obtuvo el peso promedio de los frascos, después se determinó el peso total (frasco + formulado) y luego se obtuvo el peso del formulado, restando el peso promedio del frasco al peso total, con los resultados obtenidos de la determinación de sólidos totales se hizo una relación a 1000 mi para obtener la cantidad de sólidos totales presentes en este volumen. Después se obtuvo el porcentaje del formulado haciendo una relación de sólidos totales y la cantidad de formulado obtenido.


Contenido de humedad. A cada formulado se le determinó la humedad contenida de la siguiente manera: Se utilizaron vidrios de reloj previamente tarados, a los cuales se les agregó 0.1 g del formulado. Los vidrios de reloj con la muestra se colocaron en una estufa a 95 °C por 24 horas, para después obtener la diferencia del peso correspondiente a la humedad, la cual se determinó en %. Concentración de conidios totales iníciales en los formulados. Se disolvió 0.01 g de cada formulado en 1 mL de agua destilada estéril, se hicieron las diluciones necesarias y se procedió al conteo de conidias en una Cámara de Neubauer. Viabilidad de las conidias después del secado por aspersión.En matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo 50 mL de CSD + 1% de Ext. Lev. estéril y 0.025 mg de estreptomicina, se agregaron 0.05 g de cada uno de los formulados a base de conidias, y se sometieron a una agitación de 200 rpm por 24 horas, para determinar el porcentaje de germinación. Una vez obtenido el % de germinación, se calculó el número de conidios viables, haciendo una relación entre el % de germinación y el número de conidias iniciales del formulado, el cual representa el 100% de viabilidad. El resultado se expresó en forma exponencial. Porcentaje de germinación. Se prepararon matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo cada uno 50 mL de Caldo dextrosa saboraud + Ext. Lev al 1% y se agregó 0.05 g de cada formulado a probar. Se colocaron los matraces en un agitador a 250 rpm, las determinaciones se realizaron en un intervalo de 24 hr. Se tomó una muestra que se colocó en un portaobjetos con un cubre objetos y se observó al microscopio. Se contaron 100 conidias en total, para determinar las Germinadas y No Germinadas, se consideran germinadas aquellas conidias cuyo tubo germinativo fue de la mitad del diámetro de la conidia.Esta cuenta se hizo por triplicado para cada formulado hecho a base de conidios. Aislamiento de HE en insectos con micosis. La cepa elegida se aisló nuevamente de alguna de las larvas que presentó micosis, para asegurar que la cepa utilizada en los formulados fue realmente infectiva, las larvas muertas se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 2.5% por 3 min y después se lavaron con agua destilada estéril, posterior a este tratamiento los insectos se transfirieron a cajas de Petri que contenían un papel filtro humedecido con agua destilada estéril y se incubaron por 7 días para obtener las conidias (Silva y Messias, 1986). 3. Resultados y discusión Meta 1. Propagación y formulación de hongos entomopatógenos (he).


La elaboración de los tres formulados microencapsulados con el proceso de secado por aspersión aparece en el Cuadro 2. Cuadro 2. Condiciones del secador por aspersión.

Almacenar a 4°C durante 6 meses. Microencapsulado con quitosano. El ingrediente activo (blastosporas-

micelio) fue mezclado con diferentes proporciones de quitosano (base1:10) para alimentar a un secador por aspersión con diferentes velocidades de alimentación (10-12 L/h) y diferentes temperaturas de entrada y salida (70-110°C), a una presión de 4 psi hasta la obtención del bioinsecticida en polvo con una humedad menor al 10%, y tamaño de partícula de 10-200 µ.

Parámetros evaluados en el bioinsecticida microencapsulado B. bassiana + Quitosano. DETERMINACIÓN Resultado Tamaño de partícula >10 µm Forma de los gránulos formados Circular con superficies rugosas Viabilidad de conidias >80% % de germinación al inicio y después del almacenamiento a temperatura ambiente y de refrigeración

>90%

Humedad residual de las formulaciones <10% Pureza 100% Virulencia 90-100% Concentración de esporas totales 5.1x109 esporas/g Peso del formulado 12.5 g Recuperación de los formulados después del secado por aspersión

Gránulos secos solubles en agua

Peso del formulado 12 g

INGREDIENTES TEMP ENTRADA

TEMP SALIDA

VELOCIDAD DE ALIMENTACIÓN

CONCENTRACIÓN DE ESPORAS

10% Dextrina 10% Leche desnatada 5% Polivinilpirolidona (material de cubierta) 2.5% Azúcar

60±2°C 40±2°C 1.4 a 3 ml/min 2.1 a 6.1x107

Quitosano (peso molecular medio) 250 mL 1% (p/v)

80 ± 5°C

60 ± 5°C. 1.2 a 4 ml/min 2.4 a 2.6 x107


Morfología de las microcapsulas. Las muestras se tomaron directamente y se colocaron en una base cilíndrica de aluminio, con cinta adherible para mantener fija la muestra, la suspensión de esporas se dejo secar en la base cilíndrica de aluminio con cinta adherible por 2 h. Posteriormente las muestras fueron cubiertas con oro en un recubridor iónico de capa fina y se procedió a su observación en un microscopio electrónico de barrido de energía de aceleración, las partículas fueron observadas para ver la forma, el tamaño y la textura de la superficie, las esporas fueron también observadas para determinar el tamaño de las partículas microencapsuladas (Fig.1).

Granulado a de base a quitina. Se mezclo cáscara de arroz, alginato de sodio, y distintas concentraciones de quitina, se agregaron esporas deshidratadas como inoculo las cuales fueron producidas por fermentación difásica (líquido-sólido), el proceso de obtención del granulado fue por gelificación iónica.

Empaque y/o envasado del producto: El peso del producto obtenido fue de 250 g/ha. Dosis: 1x1012-13 esporas/g.

a) Bacterias entomopatógenas: B. thuringiensis.

Preparación del inóculo: Las cepas de referencia fueron obtenidas del Centro de Biotecnología Genómica del IPN. El inóculo (complejo espora-cristal) fue elaborado por medio de fermentación, fuente de carbono: glucosa, almidón y sacarosa, de nitrógeno orgánico: proteínas de semilla y/o agua de cocimiento de maíz, y sales minerales: Manganeso, potasio, calcio y zinc.

Meta 2. Producción y Formulación de bacterias entomopatógenas.

Formulaciones granuladas. a base de polímeros biodegradables como Capsul®, pectina, gelatina y componentes naturales de plantas (mezclas entre ellos para encontrar la mejor combinación), y melaza como fagoestimulante.

Microencapsulación por secado por aspersión. Se mezclaron los ingredientes del microencapsulado: almidones, harinas, protector de UV, formaldehido, adicionando agua hasta formar una mezcla homogénea para agregar el inóculo, y alimentar al secador por aspersión (con diferentes temperaturas entrada y salida, velocidad de alimentación).

Empaque y/o envasado del producto: El peso o presentación del producto fue de de 1Kg/ha. Dosis: 1.2x109 ufc/L.


Meta 3. Formulación de nematodos entomopatógenos.

Nematodos entomopatógenos: Rabditido sp. y Heterorhabditis sp.

Preparación del inóculo: El bioinsecticida se produce in vivo con larvas de G. mellonella o in vitro. Se elaboraron formulaciones acuosas a partir del principio activo de nematodos entomopatógenos (IJ).

Principio activo: Infectivos juveniles (IJ). Procedimiento de preparación (mezclas y productos): Produción del bioinsecticida in vivo, reproduciendo a los IJ con larvas de G. mellonella y mantenerlos en bandejas con agua. Temperatura: 23-27 °C. 1x105 IJ/mL Formular el bioinsecticida por diferentes técnicas (turba y vermiculita).

Concentración: 3.5x105 juveniles infectivos por insecto.

4. Conclusiones e impacto de la investigación Los microencapsulados a base de hongos entomopatógenos y bacterias tuvieron características de un granulo microencapsulado en rangos de 10 a 100 micrómetros, de forma irregular y textura rugosa en la superficie, las esporas fueron también observadas en forma de micelio y estructuras microscópicas típicas de los hongos utilizados como ingrediente activo.

En los microencapsulado utilizando quitosano el secador por aspersión tuvo una velocidades de alimentación (12 L/h) y temperaturas de entrada y salida de 70-90°C respectivamente, a una presión de 4 psi obteniendo un bioinsecticida microencapsulado con una humedad menor al 10%, y tamaño de partícula de 10-100 µm.

Granulado a de base a quitina. Resulto en la obtención de un bioinsecticida granulado con una humedad menor al 10% y tamaño de partícula de 120 µ-m.

Formulaciones de Bt: El Microencapsulado obtenido por secado por aspersión, a base de Bt + almidones, harinas, protector de UV, formaldehido, y agua, se obtuvo alimentando a un secador por aspersión, con velocidad de alimentación (12 L/h) y temperaturas de entrada y salida (70°C), a una presión de 4 psi hasta la obtención del bioinsecticida en polvo con una humedad de 12%, y tamaño de partícula de 160 µm.

Para el caso de los nematodos se usaron larvas de G. mellonella y se mantuvieron en bandejas con agua a temperatura: 25 °C.(1x105 IJ/mL)


Infectivos juveniles (IJ) en suspensiones acuosas como ingrediente activo. Los nematodos se formularon en vermiculita y turba en proporción 1ml: 1kg Es necesario continuar con las pruebas de residualidad y toxicidad de los microencapsulados obtenidos, así como las pruebas de la viabilidad y persistencia de las esporas obtenidas, en el caso de los nematodos es necesario mejorar su propagación y la técnica de formulación para obtener material biológico para su uso en las pruebas de invernadero y campo, además de continuar con los bioensayos para determinar la capacidad infectiva de estos organismos. 5. Bibliografía Fernández, Claudia, Medrano, Hiram, Roldán, Solís, Soto, Aquiles (2001).

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Módulo 4. “Validación de la efectividad de bioinsecticidas para el control de las principales plagas de tomate”.


Evaluar los productos formulados a base de microorganismos entomopatógenos, en plagas de tomate en laboratorio, invernadero y campo.

Metas

1.- Cría masiva de insectos-plagas de tomate en laboratorio.

2.- Definir DL50 de entomopatógenos en laboratorio.


Establecimiento de un cultivo de tomate en campo:

Se estableció un cultivo de tomate con dos fechas de siembra, tardía y temprana con el objetivo de infestar con insectos plagas y mantener un resvorio natural de plagas de tomate durante el proyecto.

Colecta de insectos plagas de tomate.

Se muestrearon lotes de tomate para obtener larvas de gusano soldado y del fruto una vez localizadas esta fueron recolectadas para infestar el cultivo de tomate y obtener un reservorio libre de pesticidas, posteriormente se estableció una cría de estos insectos en el laboratorio.

Cría de gusano soldado y del fruto del tomate en laboratorio.

Larvas sanas de ambos lepidópteros fueron colocadas individualmente en vasitos de plástico transparentes del No 1, colocándole un trozo de fruto de tomate para ser trasladada al laboratorio.

Para la alimentación de la cría se empleó una de las dietas más utilizadas en la alimentación de lepidópteros creada por Hernandez et al, (1989), la cual está hecha a base de harinas, vitaminas, minerales, un agente fungistático y el medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), que se utiliza para darle consistencia. Se mantuvieron condiciones ambientales óptimas para tener una cría exitosa; la temperatura se mantuvo entre 27-30o C y una humedad relativa de 50 y 60%.

Evaluación en laboratorio (Bioensayos de hongos entomopatógenos).

Antes de realizar la evaluación en campo, previamente se llevó a cabo una evaluación de hongos entomopatógenos de los géneros de B. bassiana y M. anisopliae en larvas criadas en laboratorio de gusanos del fruto y soldado de 1er y 2do estadío larval de los cuales se seleccionaron los que presentan mayor virulencia sobre estos insectos. Para el bioensayo se utilizaron


diferentes concentraciones de esporas, con mediciones durante 24, 48 y 72 horas y se cuantificaran las larvas muertas por infección del hongo.

La virulencia y la rapidez con las que una concentración mata a las larvas se cuantifico para determinar la DL50 y el TL50, utilizando un análisis PROBIT. El bioensayo tendrá control de los factores ambientales dentro del laboratorio, para que éstos no afecten al insecto y la muerte de la larva sea únicamente por la virulencia del hongo.

Preparación del inoculo.

Para llevar a cabo la evaluación se preparó el inoculo primeramente se sembraran en cajas petri una vez que los aislados presenten esporulación suficiente (10 días de incubación), con un bisturí se realizó un raspado de esporas y el concentrado se vacío en un tubo de ensaye con 10 ml con agua estéril + 0.1 ml de Tween 80 con la ayuda de una micro pipeta con puntas esterilizadas. Cada tratamiento consistió en una cepa diferente del hongo entomopatógeno (10 de B. bassiana y cinco M. anisopliae), cada unidad experimental fue una caja de petri con diez larvas de cada lepidóptero.

Bioensayos de nematodos entomopatógenos.

En larvas criadas en laboratorio de gusanos del fruto y soldado de 1er y 2do estadío larval se evaluaron tres tratamiento (dos especies de nematodos entompopatógeno y un testigo cada unidad experimental fue una caja de petri con diez larvas de cada lepidóptero con tres repeticiones cada tratamiento, las mediciones durante 24, 48 y 72 horas y se cuantificaran las larvas muertas por infección del nematodo.

3. Resultados y discusión

Establecimiento de 2500 m2 de cultivo de tomate libre de pesticidas, como reservorio de diferentes plagas de tomate.

Cría de gusano soldado y gusano del fruto en laboratorio, obteniéndose más de 1000 larvas de cada uno por generación.

La evaluación in Vitro de hongos entomopatógenos, se obtuvo una cepa nativa de Beauveria spp que mostró patogenicidad, para el control de larvas de gusano soldado y del fruto en tomate la cual se evaluará en condiciones de campo, las cepas evaluadas de hongos de Metarhizium spp. no presentaron resultados de patogenicidad, se espera realizar otro bioensayo.

Evaluación de nematodos entomopatógenos. La evaluación in vitro presentó una mortandad de 100% con el nematodo entomopatógeno de Steinernema carpocapsae y un 70% con Steinernema feltiae en larvas de gusano soldado a las 72 hr de aplicación.

Las evaluaciones en invernadero de gusano soldado y del fruto así como de mosquita blanca se encuentran en proceso para su posterior evaluación en campo.



Las pruebas de efectividad de hongos entomopatógenos contra gusano del fruto y gusano soldado presentaron niveles de mortalidad de larvas de 90 a 100%, para el caso de B. bassiana y con menores niveles de mortalidad <70% en M. anisopliae. Para el caso de nematodos S. carpocapsae y S. feltiae causaron mortalidad de larvas de 70-100% de ambos gusanos.

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