molecular probes®流式试剂最新进展新一代荧光染料在流式细胞 …

1 Proprietary & Confidential The world leader in serving science Proprietary & Confidential

杨林森

流式产品市场经理

Life Sciences Solutions

Molecular Probes®流式试剂最新进展

新一代荧光染料在流式细胞术中的应用

2 Proprietary & Confidential

Molecular Probes®： Cellular Analysis Portfolio 实现“流式梦”

Assays, Reagents &

Antibodies

• Reagents for Labeling,

Imaging, and Flow Cytometry

• 10,000’s of kits, antibodies and dyes

Imaging Systems

• Full Range of simple,

intuitive instruments • Cell counts and cell

health analysis • Fluorescence and Bright

field imaging

Flow Cytometry

• Innovative Flow

Cytometers using Acoustic Focusing

• Cell population analysis

HCA/HCS

• Automated imaging and analysis at individual cells and cell population level


流式细胞术与试剂在细胞结构与活性分析中的应用

Flow Cytometry for Cell Analysis

流式细胞技术是集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种对细胞进行自动分析和分选的仪器它可以快速测量１０５－１０９细胞，存贮、显示悬液中分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群进行分析仪器和选择的试剂配套使用，可达到出色的多色分析效果可以为细胞学研究提供具有统计学意义的数据


Main Components of Flow Cytometer

The optical-

to-electronic

coupling

system

records how

the cell or

particle

scatters

incident laser

light and emits

fluorescence

Flow Cytometry is dependent on the control of,

collection of, and separation of lights by wavelengths

Detectors

(PMTs)

Fluidics

System

Lasers

Optics

(filters)

Electronics and

Computer System

Cell input

液流系统

光学系统

检测器

(光电倍增管）

电子与计算机系统


1. 2D dot plots: multiple parameter studies, identification of cell

populations by size, see Figure A. (二維點圖)

2. Distribution histograms: single parameter studies, analyze

immunophenotypes by antibody binding (violet-C intensity),

see Figure B. (單参数直方圖)

3. Closer looks at the characteristics of sub populations are

possible by carefully selecting or 'gating' on the those cell

subsets of interest (such as P1, P2, and P3).

Typically Displayed Forms of Flow Cytometry Result

Figure A Figure B


内容

荧光染料概述

流式细胞术应用

免疫分型

细胞活性

细胞增殖

细胞周期

活性氧（ROS）

细胞凋亡

资源


荧光探针类型

• 细胞表面/内部蛋白：抗体-荧光染料如FITC、Alexa Fluor® 、Pacific

Blue® 、PE、Qdots® 抗原

• DNA含量：如PI、SYTOX® 、Hoechst 、DyeCycle™、FxCycle™

• 新DNA合成：如BrdU、Click-iT® EdU

• DNA 断裂：如TUNEL

DNA

• 膜不对称性：如荧光染料偶联的annexin V

• 膜完整性/通透性：如非通透性核酸染料SYTOX®

• 膜势能：如DiBAC4(3)、JC-1或DiOC2(3)

细胞膜

• Ca2+ ：如Fluo-3、Fluo-4及比率测定染料(Indo-1 AM)

• pH ：如比率测定染料(SNARF-1, BCECF)

• ROS：如CellROX®、Dichlorokihydrofluorescein

细胞内离子

• 凋亡/活性：参见DNA含量、膜不对称性、膜完整性/通透性及酶活

力

• 细胞分裂：如脂类染料、CFSE-SE

• 吞噬/内吞：如pHrodo™ 染料、荧光染料标记细菌或荧光微球

细胞功能


流式细胞术应用

表面抗原:

免疫分型

IL-12

酯酶

ROS

胞内:

胞内抗原 /细胞因子检测（需固定及通透）

细胞增殖

ROS检测

细胞凋亡

细胞核:

细胞周期分析

DNA合成

DNA断裂

细胞死/活

细胞膜:

细胞凋亡

细胞活性


• 基于蛋白表达(细胞表面或细胞内)标识

细胞类型

• 临床应用

• 白血病或淋巴瘤分型

• 艾滋病患者CD4 T细胞的绝对计数

• 实验应用

• 异源群体中标识和计数不同类型细胞

• 细胞功能分析 (如细胞因子的产生、细胞毒

性)

免疫表型分型


免疫分型研究现况:需要多激光

越来越复杂的多色实验

• 好处

• 基于单细胞分析多个markers

• 更佳的群确定

• 相关数据的多重分析

• 效率

• 更高通量

• 需更少的样品

• 复杂性

• 更多的颜色意味着更多的复杂性

• 需适当的Panel设计和仪器优化

• 需更多时间来设计和分析实验


多色-免疫分型分析时需考虑：

I. 选择合适的流式细胞仪

II. 选择合适的检测Markers

III. 选择标记Marker的荧光基团

IV. 抗体滴定

V. 样品制备

VI. 死细胞排除

VII. 补偿

• 更多的颜色意味着更多的复杂性

• 需进行优化

• 关注细节


Available with 1-4 lasers

Lasers are spatially separated

Initial Laser Choices: Blue (50mW), Red

(100mW), Violet (50mW), and Yellow(50mW)

Size- Fits easily on laboratory bench (16” (W)

x 22”(H) x 17”(D) )

Sample Rates- up to 1000 microliters per

minute to facilitate analysis of small samples

or rare events

Compatible with the auto sampler for 96/384

well plates

Updated Software for acquisition and analysis

2015年1月声波聚焦流式细胞仪上市 Attune® NxT Acoustic Focusing Cytometer


Acoustic focusing

Prior to mixing with

sheath

Intensity C

ount

Narrow particle focus = Narrow distribution

Intensity

Cou

nt

Narrow particle focus = Narrow distribution

1000 µL/min 25 µL/min

声波聚焦流式细胞技术


Forward Scatter

Sid

e S

ca

tte

r

CD45.2 APC-Cy®7

B2

20

Pa

cific

Ora

nge

TM

CD3 PerCP-Cy®5.5

T Cells

Dendritic Cells

CD4 Pacific GreenTM

CD

8 A

lexa

Flu

or®

70

0

Foxp3 PE

CD

25

AP

C

CD11c PE-Cy®7

MH

CII

Pa

cific

Blu

eT

M

CD11b FITC

CD

8 A

lexa

Flu

or®

70

0

Cou

nts

Regulatory T cells

10.9

6.81

19.4

64.8

A

C

更多颜色选择，拓展检测可能


"One of the main projects in my laboratory is focused

on the description and functional analysis of an

emerging innate lymphoid cell type. These cells are

extremely rare both in blood and in tissues. For flow

cytometry analysis we use the Attune® Acoustic

Focusing Cytometer. The high sample rates of

Attune® allow me to reduce centrifugation steps so

that we retain more cells and more rapidly detect rare

events. We could not have performed these studies

with any other instrument."

Prof. David Cousins, University of Leicester

新发现-曾经与它擦肩而过…


更省时的流程

No Wash/No Lyse Assays

• Acoustic is more efficient

• Doesn’t require magnetic bead separation prior to

acquiring data

• Requires minimal sample prep

• Samples can be run without manipulation

5µL whole human blood +/- Ab dilute in 3mL DPBS/1% BSA acquire ~ 900K

events (FSC trigger)

Antibody

labeling is

required to

resolve blood

populations

No antibodies

required


激光数目

激光颜色检测通道数

405 nm 488 nm 561 nm 640 nm

4 Violet Blue Yellow Red 14

3 Violet Blue Yellow —— 11

3 Violet Blue —— Red 11

2 Violet Blue —— —— 8

2 —— Blue —— Red 7

2 —— Blue Yellow —— 7

1 —— Blue —— —— 4

4色激光7款不同型号

• Choice of 1-4 laser configurations to detect up to 14 colors

• Facilitates use of broad range of reagents

• Fully upgradeable in your laboratory

Field Upgrades < 4 hours


Laser Intended Dye

Blue

FSC

SSC

FITC

PI

PerCP-Cy™5.5

Red

APC

Alexa Fluor® 700

APC-Alexa Fluor®750

Violet

Pacific Blue™

Pacific Green™

Pacific Orange™

Qdot® 705

Yellow

PE

PE-Texas Red™

PE-Cy™5.5

PE-Cy™7

Yellow Laser Present

Attune流式细胞荧光标记试剂组合


Pacific Blue™ 偶联物

Pacific Orange™偶联物

Alexa Fluor® 488偶联物

异硫氰酸荧光素 (FITC)

Alexa Fluor® 647偶联物

藻红蛋白 (PE)

多甲藻黄素叶绿素蛋白 (PerCP)

别藻蓝蛋白 (APC)

Alexa 405

Alexa 405

Alexa 405

Alexa 488

Alexa 488

Alexa 488

Alexa 647

Alexa 647

Alexa 647

Pac

Blue

Pac

Blue

Pac

Blue

Pac

Orange

Pac

Orange

Pac

Orange

用于免疫型分型的荧光基团

有机小分子

荧光基团

荧光蛋白


Pacific dyes compatible with violet laser excitation

Pacific Blue™ dye (blue lines),

Pacific Green™ dye (green lines),

Pacific Orange™ dye (orange lines).

Bivariate plot displays for multicolor immunophenotyping by flow cytometry.


Tandem Conjugates

– 基于荧光共振能量转移的荧光染料

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Donor

R-PE

APC

Acceptor

Alexa Fluor® 染料


Qdot® Nanocrystals（量子点）

高消光系数 >> 高亮度

可用同一波长激发所有颜色

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

5.0E+06

350 450 550 650 750 850

Wavelength (nm)

Extin

ctio

n C

oe

ffic

ien

t (M

-1cm

-1)

Qdot 525 Conjugate AbsorbanceQdot 565 Conjugate AbsorbanceQdot 585 Conjugate AbsorbanceQdot 605 Conjugate AbsorbanceQdot 655 Conjugate AbsorbanceQdot 705 Conjugate AbsorbanceQdot 800 Conjugate Absorbance

400 500 600 700 800 900

Wavelength (nm)

525

605

655

705

800

565

最小化 (<5%) cross-talk >> 简化多重标记

•纳米晶体的大小决定了颜色

发射光谱激发光谱


0.44 s 曝光时间

0.019 s 曝光时间

• SK-BR-3 细胞:

高Her2/neu表达

• MDA-MB-231细胞:

低Her2/neu表达

量子点的亮度及光稳定性>>高灵敏度

Qdot® 655 偶联物 Cy5 偶联物 Anti-Her2/neu +

anti-mouse IgG 偶联物 1.22 s 曝光时间

8.12 s 曝光时间

60X

Qdot®可用于检测低丰度的靶分子


“Typical”4 color pallette 405 nm excitation

Cascade Blue®-CD27

Qdot®525-CD4

Qdot 545-HIV nef tetramer

Qdot 565-HIV gag tetramer

Qdot 585-CD57

Qdot 605-EBV tetramer

Qdot 655-CD45RA

Qdot 705-CMV pp65 tetramer

488 nm Excitation

Fluorescein-CD7

RPE-CD28

RPE/Texas Red-CD14

Propidium Iodide

RPE/Cy5.5-CD19

RPE/Cy7-HLA-DR

633 nm Excitation

APC-CD11a

Alexa Fluor®680-CD8

APC/Cy7-CD3

17 color panel (NIH Lab)

488 nm Excitation

• Fluorescein

• R-Phycoerythrin (RPE)

• RPE/Texas Red™dye or PerCP or PE/Cy5

633 nm Excitation

• Allophycocyanin (APC)

Getting more colors:

• Longer Stokes shift fluors off given laser

• Add another laser

≤4 Colors versus ≥9 Colors


荧光基团比较

荧光团例子优势劣势

有机染料 •FITC

•Alexa Fluor® 488

•Pacific Blue™

•Alexa Fluor® 647

•偶联物的种类

•相对稳定的染料

•仪器配置

•斯托克斯位移小

荧光蛋白 •R-PE

•PerCP

•APC

•明亮(PE, APC)

•偶联物的种类

•仪器配置

•颜色选择有限

Tandem

Conjugates

•TRI-COLOR

•PE-Alexa® Fluor

700

•APC-Cy5.5

•APC-Cy7

•斯托克斯位移大

•更多颜色选择

•FRET稳定性

•供体检测通道需补偿

•批间差异性

量子点 •Qdot® 605

•Qdot® 655

•Qdot® 705

•Qdot® 800

•明亮的信号

•斯托克斯位移大

•窄的发射峰

•偶联分子的种类


多色流式检测荧光素选择原则:

了解仪器的配置（如激光和滤光片）；

选择与仪器兼容的荧光基团；

通过荧光染料亮度（染色指数值）和抗原丰度搭配相应的荧光基团与抗体；

使用信号弱的荧光基团搭配高表达靶抗原的抗体

使用信号强的荧光基团搭配低表达靶抗原的抗体

尽可能减少溢出（Spillover）；

使用光谱查看器帮助选择荧光光谱的重叠尽量少的荧光基团

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html


问题: 标记反应通常需较大量IgG；

抗体中含其它蛋白如BSA；

活性染料可能会标记IgG分子可变区，影响抗原结合能力；

抗体标记

Zenon®抗体标记试剂盒非共价连接标记;

标记仅需10min；

最少可标记1 µg IgG 抗体；

标记过程不会导致抗体丢失

APEX ® 抗体标记试剂盒 • 共价连接

• 标记10-20 ug抗体

• 不需额外地去除抗体中BSA

或其它含有胺基的分子

SiteClick™ 抗体标记试剂盒标记 100 ug抗体

位点特异性地标记抗体重链糖基

解决方案:


细胞活性检测

- 死细胞排除


为何需使用细胞活性指示剂?

死细胞非特异地结合抗体和染料

Scatter gating的“准确性”

FSC

-A

rea

SSC

Fixable Violet

FSC

-A

rea

Stimulated with SEB + Brefeldin A

Perfetto et al. (2006) J Immunol Methods 313:199


染料染料

质膜

染料

细胞膜非通透性核酸染料

• 通过受损的细胞膜；

• 标记死细胞核酸；

• 不能透过活细胞细胞膜；

传统染料

• Propidium Iodide (488 nm ex, dsDNA/RNA)

• 7-AAD (488 nm ex, dsDNA/RNA)

多种光谱可供选择：

• SYTOX® AADvanced™ 死细胞染料(488 nm ex)

• SYTOX® Green死细胞染料(488 nm ex)

• SYTOX® Orange死细胞染料(488 /532 nm ex)

• SYTOX® Blue死细胞染料(405 nm ex)

• SYTOX® Red死细胞染料(633 nm ex)

PI

固定前固定后18h


可固定的死细胞染料

活细胞死细胞

检测原理

染料被排除在活细胞外

胺基反应性的荧光染料

- LIVE/DEAD® 可固定的死细胞染料

• 胞质标记

• 可固定

• 适于胞内免疫分型分析

固定前固定后18h


常用细胞活性染料列表

激光核酸染料可固定的染料

UV SYTOX® Blue (450/50)* LIVE/DEAD® Fixable Blue Dead Cell Stain

(350/40)*

405 nm SYTOX® Blue (350/40)*

LIVE/DEAD® Fixable Violet Dead Cell Stain

(450/40)*

LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain

(530/50)*

LIVE/DEAD® Fixable Yellow Dead Cell Stain

(585/42)*

488 nm SYTOX® Green (530/30)*

SYTOX® AADvanced™ stain

(>650)*

LIVE/DEAD® Fixable Green Dead Cell Stain

(530/30)*

LIVE/DEAD® Fixable Red Dead Cell Stain (>650

or 600/20)*

532 nm SYTOX® Orange (585/42)*

SYTOX® AADvanced™ stain

(>650)*

LIVE/DEAD® Fixable Red Dead Cell Stain

(>650 or red bandpass)*

561 nm LDS 751 (700/20)* LIVE/DEAD® Fixable Red Dead Cell Stain

(>650 or red)*

633/5 nm SYTOX® Red (660/20)*

LIVE/DEAD® Fixable Far Red Dead Cell Stain

(660/20)*

LIVE/DEAD® Fixable Near IR Red Dead Cell Stain

(780/60)*


细胞健康（Cell Health）

Y

Z

b X a

蛋白过表达

RNAi/miRNA

药物/信号通路影响因子

正常细胞

死亡细胞

细胞增殖或各种压力

信号转导

细胞增殖

氧化应激、凋亡

细胞吞噬、离子平衡


细胞健康、压力 & 死亡

细胞还活着吗？

细胞活力/活性

细胞在行使基本功能吗？

蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡

细胞是健康的，还是有压力？

氧化应激、损伤

凋亡

自噬

细胞在分裂和增殖吗？

细胞增殖

细胞周期


细胞活性

活死

完整的质膜受损的质膜

活性酶失活酶

• 质膜的完整性

– 反应性染料（LIVE/DEAD® 可固定的死细胞染料）

– 膜非通透性的核酸染料（PI、SYTOX®）

• 酶的活性

– 切割酯基（Calcein AM）


预期的实验结果

检测类型活死

质膜—胺基反应性染料暗/阴性亮/阳性

质膜—核酸染料暗/阴性亮/阳性

酶活性亮/阳性暗/阴性

双色(LIVE/DEAD® 试剂盒) 绿色红色


• 设置对照

• 酚红

– 染色液中避免使用酚红；

– 酚红会淬灭染料；

• 核酸染料

– 随时间的增加会解离；

– 标记后，建议1小时内检测，避免信号丢失；

– 不可固定；

• 酯基染料（Calcein AM）

– 标记浓度和时间因细胞间酯酶活性差异而不同，需通过预实验确定

合适的染色条件；

– 如酯基染料标记失败，请确认标记溶液中不含有血清；

– 血清中成分存在酯酶活性，会在细胞外过早地切割酯基，导致染料

不能进入细胞。

细胞活性检测：Tips




细胞活力/活性


蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡



凋亡

自噬


细胞增殖

细胞周期


细胞增殖检测方法

DNA合成- 核苷类似物

BrdU, anti-BrdU

Click-iT® EdU

Click-iT® Plus EdU

细胞分裂-细胞示踪染料

• CFSE (CellTrace®试剂)

细胞计数

计数微球


Br

Br

Br

Br

• 无放射性

• 兼容多重分析，但需要分离双链，以便BrdU抗体接近，可能影响：

• 其他抗体的结合能力

• 形态

• 需要双链DNA才能高效结合的染料的能力，如细胞周期染料

细胞增殖: 检测DNA合成

BrdU (5-溴-2‘-脱氧尿苷)


Click-iT EdU标记DNA

Azide（叠氮基）

Alkyne（炔基）

+

Alexa Fluor® 488 Dye

DNA DNA

+

Triazole

•无需DNA变性

• 简单的操作步骤

•兼容多重分析，包括

• 其他抗体

• 细胞周期分析的染料


Simplified Workflow:

Click-iT® EdU follows a basic protocol of

aldehyde fixation and detergent permeabilization

A. 固定： Fix for 15 minutes, wash

B. 通透： Permeabilize for 30 minutes, wash

C. 孵育： Incubate in click labeling mixture for 30 minutes, wash

D. Optional: Incubate with cell cycle stain for 15-30 minutes

E. 分析： Analyze

Click-iT® EdU 细胞增殖检测步骤：

S-phase

cells

FxCycle Far Red

fluorescence


Click-iT® Plus EdU 不影响 PE-Cy®7 的荧光信号! H

u C

D3

PE

-Cy®

7

Flu

ore

scen

ce

Classic Click

PE-Cy®7 Signal Missing

Click-iT® EdU

Alexa Fluor® 488

Fluorescence

NEW Click-iT® Plus EdU Kit

No Copper Control

Expected PE-Cy®7 Signal

Click-iT® Plus EdU

Alexa Fluor® 488

Fluorescence

Hu C

D3 P

E-C

y®

7

Flu

ore

scen

ce

Click-iT® Plus EdU

Alexa Fluor® 488

Fluorescence


PE-Cy®7 Signal Observed

Hu

CD

3 P

E-C

y®

7

Flu

ore

scen

ce


Click-iT® Plus EdU 不影响 GFP 的荧光信号! G

FP

Flu

ore

scen

ce

Click-iT® EdU

Alexa Fluor® 647

Fluorescence

Classic Click

GFP Signal Suboptimal


No Copper Control

Expected GFP Signal

Click-iT® Plus EdU

Alexa Fluor® 647

Fluorescence

GF

P

Flu

ore

scen

ce


GFP Observed

Click-iT® Plus EdU

Alexa Fluor® 647

Fluorescence

GF

P

Flu

ore

scence


通过染料稀释检测细胞增殖

First

Generation

Second

Generation

Third

Generation

Fourth

Generation

Brightness

Nu

mbe

r of

Ce

lls

O OCCH3CH3CO

OO

OO

CO

O

N

O

O

羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯

(CFSE)

面临的问题：

占用绿色荧光检测通道

解决方案：

CellTrace™ 紫色细胞增殖检测试剂盒（Ex 405nm）

CellTrace™ 远红细胞增殖检测试剂盒（Ex 635nm）


多因素分析

Several generations of live CD4+ T

Cells as visualized with the Attune®

Acoustic Focusing Cytometer.

CellTrace™ Violet Fluorescence

Nu

mb

er

of

ce

lls

co

un

ted

Several generations of live CD4+ and

CD4- T Cells as visualized with the

Attune® Acoustic Focusing Cytometer.

CellTrace™ Violet Fluorescence

CD

4-A

lex

a F

luo

r® 4

88

Flu

ore

sc

en

ce

多参数分析－同时标记其他表面或内部分子，以分析各细胞分裂相抗原的表达情况。


Absolute Cell Counting

Determine Cell Concentration Of Individual Populations

• C36950 CountBright™ absolute

counting beads

• Determine Cell Concentration Of

Individual Populations.

• Most accurate way to determine

cell density by flow cytometry.

• Easy to use in any application.

Quantifying cell populations and disease progression, including studies

of stem cells and HIV/AIDS.

Combining a separate cell concentration determination from a

hematology analyzer with flow cytometric population data (multiple

platform testing)

Adding an internal microsphere counting standard to the flow

cytometric sample (single platform testing)




细胞活力/活性


蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡



凋亡

自噬


细胞增殖

细胞周期


细胞周期

Laser

活细胞固定细胞

UV

Hoechst 33342

(450/50)*

FxCycle™ Violet

(450/50)*

405 nm

DyeCycle®

Violet

(440/40)*

FxCycle™ Violet

(450/50)*

488 nm

DyeCycle®

Green

(530/30)*

SYTOX®

AADvanced™

695/40*

532 nm

DyeCycle®

Orange

(585/42)*

SYTOX®

AADvanced™

695/40*

561 nm

--

SYTOX®

AADvanced™

695/40*

633/5 nm

DyeCycle®

Ruby

(695/40)*

FxCycle™ Far

Red

(660/20)*

• 多种细胞周期染料供你选择：

FxCycle™ 染料 • 操作简单，适于固定细胞

• 多种颜色可供选择

SYTOX® AADvanced™染料 • 死细胞染料

• 高亲合力核酸染料

• 488 nm 激发

Vybrant® DyeCycle® 染料 • 适于活细胞

• 低细胞毒性

• 分析后细胞可用于分选或培养

• 多种颜色可供选择


Cell Cycle Analysis with DNA Dyes in Living Cells

5 μM Hoechst 33342 (UV excitation)

440 BP emission

events

440 BP emission

events

5 μM DyeCycle™ Violet stain (405 nm excitation)

G2/G1: 1.99

%CV: 4.46

530 BP emission

5 μM DyeCycle™ Green stain (488 nm excitation)

G2/G1: 1.83

%CV G1: 3.80

events

G2/G1: 1.83

%CV: 4.74

585 BP emission

5 μM DyeCycle™ Orange stain (488nm excitation)

events

G2/G1: 1.86

%CV G1: 5.71


分选: Vybrant® DyeCycle™ 橙色核酸染料

Vybrant® DyeCycle™ Orange dye: sorting NIH 3T3 cells

Post-sort verification of populations

G0G1: 3 days post sort G2M: 3 days post sort


干细胞边缘细胞（side population cells）分析

- Vybrant® DyeCycle™ 紫色染料鼠骨髓人脐带血

紫色激光

(408 nm, 25 mW)

紫外光

(355 nm, 20 mW)

DyeCycle™ 紫色染料

(10 µM, 90 minutes, 37ºC)

Hoechst 33342

STEM CELLS -2007, VOL 25; NUMB 4, pages 1029-1036

DyeCycle™紫色染料

Blu

e flu

ore

scence

(4

50

/55 n

m)




细胞活力/活性


蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡



凋亡

自噬


细胞增殖

细胞周期


活性氧水平(Reactive Oxygen Species，ROS)与疾病

癌症：

如肺癌、乳腺癌

心血管疾病：

如动脉粥样硬化、高血压

慢性炎症类疾病：

如糖尿病、风湿病

神经类疾病：

如老年痴呆症、帕金森综合症

感染性疾病：

肝炎、HIV

纤维化疾病：

肺部纤维化、肝脏纤维化

感官受损：

如视觉疾病、听觉疾病


CellROX® Deep Red

Reagent

CellROX® Orange

Reagent

CellROX® Green

Reagent CM-H2-DCFDA

最大激发/发射波长(nm)

640/665 545/565 485/520 495/527

适用于活细胞检测 Yes Yes Yes Yes

完全培养基中标记 Yes Yes Yes No

可甲醛固定 Yes No Yes No

可抵抗通透剂 No No Yes No

成像稳定性

信噪比

成像检测 Yes Yes Yes Yes

高含量检测 Yes Yes Yes Yes

微板检测 Yes Yes Yes

流式检测 Yes Yes Yes Yes

规格 5 x 50 uL 5 x 50 uL 5 x 50 uL 20 x 50 ug

货号 C10422 C10443 C10444 C400/D399

C6827

解决方案 CellROX™ Deep Red 试剂适用于氧化应激的检测

问题/困扰：通常用于细胞内ROS检测的还原型荧光素必须添加到无血清培

养基中，还必须忍受高背景、光氧化和光不稳定




细胞活力/活性


蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡



凋亡

自噬


细胞增殖

细胞周期


凋亡的主要检测指标检测染料

膜的不对称性 Annexin V, F2N12S

Caspase 酶活性 CellEvent™, FLICA , Caspase底物

核浓缩 Hoechst, DyeCycle™ Violet dye

膜通透性 YO-PRO®-1

G0 期的峰值变化 DyeCycle™ Orange dye

膜的完整性 PI, SYTOX® Green dye

DNA片段化 TUNEL Assay

凋亡过程中的主要发生事件


Annexin V 细胞凋亡检测： TIPS

• 结合需钙和镁两价阳离子；

• 结合是可逆地；

• 标记结合后需尽快检测；

• 一些细胞类型如巨核细胞、骨髓细胞和血小板细胞表面存在大量PS;

• 物理刮或胰酶消化贴壁细胞可能会导致PS的外翻，与凋亡无关；


A35137-紫色荧光比值膜不对称性检测探针(F2N12S)

Shynkar, V.V., et al. J. Am. Chem. Soc. 2007. 129: 2187-2193

问题：

Annexin V假阳性

解决方案：

紫色荧光比值膜不对称性检测探针

通过荧光强度比值(585/ 530nm)的变化来

监测细胞外膜表面电荷的改变

与细胞大小、细胞浓度和仪器差异无关；

标记仅需5分钟，不需洗涤；

无需特定缓冲液；


核酸染料可与DEVD肽段结合

Caspase 3/7 的荧光底物

活性的caspase 3/7切割DEVD肽段，且游离的核酸染料与DNA结合时，才发出荧光

优势：

− 适合活细胞，无需洗涤

− 可添加到完整培养基中

− 固定和透化之后保留

− 可与其他活细胞或固定细胞探针实现多重分析

DEVD

活性的

Caspase-3/7 酶

不与DNA结合时不发荧光

Bound

DNA dye DNA 染料

读取

添加CellEvent™

试剂

孵育30分钟

Caspase 活化 - CellEvent™ Caspase 3/7 Green 试剂


洗涤步骤将会洗去脆弱的凋亡细胞

洗涤对凋亡细胞检测的影响

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

No Wash 1 Wash 2 Wash 3 Wash 4 Wash

CellEvent™检测无需洗涤操作步骤

对照组处理组

多重分析


建议采用多参数进行细胞凋亡检测

• 单一参数难以准确地确定细胞凋亡

• 多阶段、多因素过程

• Annexin V - 磷脂酰丝氨酸外翻也发生于非细胞死亡途径如T淋巴

细胞活化；

• Caspase 活化 – 炎症反应或造血前体细胞分化时Casepase3和

Casepase 8也会发生活化；

• 多重内部验证，确认细胞凋亡确定发生；

• 了解细胞凋亡途径的更多信息

NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY VOLUME 10 | MARCH 2011 | 221




细胞活力/活性


蛋白/基因表达

信号转导

内吞/吞噬

离子平衡



凋亡

自噬


细胞增殖

细胞周期


问题/困扰：传统pH传感器对活细胞的内化分析并非最佳

0

10

20

30

40

50

60

70

550 600 650 700

pH 10

pH 8

pH 7

pH 6

pH 5

pH 4

Fl

(rfu

)

l (nm)

pHrodo™: pH 敏感的荧光

pHrodo™ S. aureus BioParticles® conjugates 适用于吞噬

pHrodo™ E. coli BioParticles® conjugates 适用于吞噬

pHrodo™-10k-dextran Conjugates 适用于内吞

pHrodo™ succinimidyl ester 可制备您自己的结合物

解决方案 pHrodo™ Red 和 Green 染料适用于吞噬、内吞、受体/抗体内化研究


Reagents for Cell Health

细胞健康产品分类一览表功能主要产品

细胞生存能力 & 活力 LIVE⁄DEAD® Viability ⁄ Cytotoxicity Kit

SYTOX® Dead Cell Stains

LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stains

细胞增殖 & 细胞周期 Click-iT® EdU Cell Proliferation Assays

Vybrant® Dye Cycle™ Stains

Premo™ FUCCI Cell Cycle Sensor

氧化应激 CellROX™ Deep Red Reagent

细胞凋亡 MitoTracker® Red dye, CellEvent™ Caspase-3/7 Reagents

SYTOX® Green dye

Click iT® TUNEL assay

细胞器标记 CellLight™ reagents for mitochondria and lysosomes.

LysoTracker® and LysoSensor® stains for lysosomes

MitoTracker® stains for mitochondria

(细胞)内吞 & 吞噬作用 pHrodo™, CellLight®

Alexa Fluor® 488 conjugate

细胞示踪 CellTracker™, Qtracker® 655, Qtracker® 800


Reagents for Sample Preparation

• Cell Preservation

• TransFix® Reagent

• Whole blood preservative

• Cell Lysis

• Cal-Lyse™ Whole Blood Lysing

Solution

• RBC lysis following antibody staining

• Fixative-Free High Yield Lyse

• No need for wash step

• Fixation and Permeabilization

• FIX & PERM® reagents and kits

• No effect on cell morphological

scatter

• Reduced background staining

• Proven protocols

Use of FIX & PERM® Cell Permeabilization Kit

for simultaneous surface antigen and

intracellular antigen staining.


Sub-micron Particle Size Reference Kit

The Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit:

• six sizes of green-fluorescent beads (FITC channel)

• ranging in diameter from 0.02 µm to 2.0 µm

• packaged in individual vials

• each bead is uniform in size

• the green-fluorescent dye is localized within the bead


Sub-micron Particle Size Reference Kit

These size standards can help identify small bioparticles, or as a tool to

verify instrument performance and establish parameters suitable for

analyzing sub-micron particles:

• Particle size resolution limit and dynamic range

• Sensitivity of forward and side scatter photomultiplier tubes

• Level of instrument baseline noise

• Laser and optical alignment and stability

• Stability of the fluidics system


Microbial detection and/or

counting


Microbiology Assays for Flow Cytometry


Application Reagent Quantity Cat. No.

Bacterial viability LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit 1 kit L7007, L7012,

L13152

Bacterial viability and cell

counting

LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability and Counting

Kit 1 kit L34856

Bacterial cell counting Bacteria Counting Kit * for flow cytometry* 1 kit B-7277

Bacterial cell staining

BacLight™ Green *special packaging* 20 x 50µg B-35000

BacLight™ Red *special packaging* 20 x 50µg B-35001

SYBR® Green I nucleic acid stain 500 µL S7563

SYTO® BC green fluorescent nucleic acid stain *5 mM

solution in DMSO* 100 µL S-34855

SYTO® 9 green fluorescent nucleic acid stain *5mM

solution in DMSO* 100 µL S-34854

Determination of bacterial Gram-

character

LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit *for

microscopy and quantitative assays* 1,000 assays L7005

Microbial membrane

potential/microbial vitality

BacLight™ Bacterial Membrane Potential Kit *for flow

cytometry * 100 assays B34950

Microbial metabolism

BacLight™ RedoxSensor™ Green Vitality Kit *for flow

cytometry* 1 kit B34954

BacLight™ RedoxSensor™ CTC Vitality Kit *for flow

cytometry and microscopy* 1 kit B34956

Common reagents used for bacterial and yeast analysis


Calibration Standards for Flow Cytometry

AlignFlow™ (2.5 & 6 m)

•Quality Control •UV, Blue, Green/Yellow, and Red Lasers

LinearFlow™ (2.5 & 6 m)

•PMT Linearity •Blue, Green, Orange, Carmine, Deep Red

CompenFlow™ (2.5 & 6 m)

•Spectral Overlap •FITC/R-PE

Cell Sorting Set-up Beads (2.5 & 6 m)

• UV, Blue, Green/Yellow, and Red Lasers

Counting Beads

• Cell concentration in samples


样品制备染色分析

固定&透化

死细胞排除

不兼容固定 -PI 、7-AAD、SYTOX

兼容固定- Live/Dead 可固定染料

免疫分型

干细胞鉴定

细胞增殖

细胞周期

ROS检测

细胞凋亡

一抗

补偿珠子

抗体标记试剂

细胞功能标记染料

流式细胞术检测流程

流式细胞术关键：

• 样品制备

• 知已（试剂）

• 使用细胞活性染料，排除死细胞的干扰

• 尽可能减少差异 - 补偿调节


流式移动应用程序流式细胞术荧光素的选择指南

资源

荧光检测工具书

http://www.lifetechnologies.com/us

/en/home/references/molecular-

probes-the-handbook.html

http://www.lifetechnologies.com/us/en/ho

me/support/research-tools/iphone-apps-

and-widgets/flow-cytometry-reagent-

selection-guide-protocols-app.html

http://www.lifetechnologies.com/cont

ent/dam/LifeTech/migration/en/filelibr

ary/cell-tissue-

analysis/pdfs.par.13383.file.dat/fluor

ophore-selection-guide-flow-

cytometry.pdf

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook.html








http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf/probes.Par.83037.File.dat/O-072942-Flow-Instrumentation-Guide.pdf























http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/cell-tissue-analysis/pdfs.par.13383.file.dat/fluorophore-selection-guide-flow-cytometry.pdf

















谢谢！

molecular probes®流式试剂最新进展 新一代荧光染料在流式细胞 …

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