neumodx™ h v quant test strip 201300 istruzioni per l'uso · per prepararsi...

NeuMoDx™ HBV Quant Test Strip ISTRUZIONI PER L'USO

201300

NeuMoDx Molecular, Inc. RISERVATO P/N 40600136-IT_Rev A Gennaio 2019

Pag. 1 di 19 Solo per distribuzione in Europa

201300 NeuMoDx™ HBV Quant Test Strip Rx only ATTENZIONE: non disponibile per la vendita negli Stati Uniti

Per uso diagnostico in vitro con NeuMoDx™ 288 e NeuMoDx™ 96 Molecular Systems

Per istruzioni dettagliate, fare riferimento al Manuale dell'operatore del NeuMoDx™ 288 Molecular System; p/n 40600226 Per istruzioni dettagliate fare riferimento al Manuale dell’operatore del NeuMoDx™ 96 Molecular System; p/n 40600224

USO PREVISTO NeuMoDx™ HBV Quant Assay è un sistema automatizzato in vitro per l’amplificazione degli acidi nucleici al fine di quantificare il DNA del virus dell'epatite B (Hepatitis B virus, HBV) da campioni di plasma umano. Il NeuMoDx HBV Quant Assay implementato sul NeuMoDx™ 288 Molecular System e sul NeuMoDx™ 96 Molecular System (NeuMoDx™ System(s)) comprende l’estrazione automatizzata del DNA per isolare l’acido nucleico target dal campione e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (polymerase chain reaction, PCR) per prendere come target le sequenze altamente conservate nella regione che codifica la proteina X e la proteina pre-C nel genoma virale dell'epatite B. Il NeuMoDx HBV Quant Assay è stato ideato per essere utilizzato come supporto nella determinazione del corretto trattamento di pazienti con infezione da HBV. Il NeuMoDx HBV Quant Assay dev'essere utilizzato in combinazione con tutti i dati clinici e di laboratorio in modo da orientare nella scelta del corretto trattamento e non dev'essere usato per la sola diagnosi o l'analisi del sangue.

SOMMARIO E SPIEGAZIONI Il sangue umano intero viene raccolto in apposite provette sterili contenenti acido etilendiamminotetraacetico (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) oppure acido citrico-citrato-destrosio (acid citrate-dextrose, ACD) come agenti anticoagulanti per la preparazione del plasma. Per prepararsi all'analisi, il plasma in una provetta per campioni compatibile con il NeuMoDx System viene caricato sul NeuMoDx System tramite un apposito portaprovette, per iniziare l'elaborazione. Per ciascun campione, viene miscelata un'aliquota di 550 μl di campione di plasma con il tampone di lisi NeuMoDx™ Lysis Buffer 1 e il NeuMoDx System esegue automaticamente tutti i passaggi necessari per estrarre l'acido nucleico target, preparare il DNA isolato per l'amplificazione mediante PCR in tempo reale e, se presenti, amplificare e rilevare i prodotti di amplificazione (sezioni del genoma target dell'HBV nella regione altamente conservata che codifica la proteina X e la proteina pre-C). Il NeuMoDx HBV Quant Assay include un Controllo di elaborazione dei campioni del DNA (Sample Process Control, SPC1) per aiutare a monitorare la presenza di potenziali sostanze inibitorie, nonché gli errori relativi al NeuMoDx System o ai reagenti, che si possono verificare durante i processi di estrazione e di amplificazione. Il virus dell'epatite B (HBV) è l'agente causale dell'infezione al fegato chiamata epatite B e costituisce un problema sanitario a livello mondiale. L'epatite B può causare epatite acuta oppure progredire sino a raggiungere una condizione cronica, degenerando in cirrosi o cancro al fegato. Il rischio dello sviluppo di una condizione cronica è in primo luogo legato all'età; se il virus si trasmette alla nascita, vi sono probabilità superiori al 90% di sviluppare la condizione cronica, mentre un adulto che acquisisce l'infezione ha una probabilità del 2-6% di sviluppare la condizione cronica1. L'HBV si trasmette tramite contatto diretto del sangue con il sangue di una persona infetta, per trasmissione sessuale, condividendo aghi con una persona infetta nell'uso di droghe in vitro o per trasmissione verticale madre-figlio durante la nascita. Negli Stati Uniti circa 850.000 persone vivono con un'infezione da HBV e la maggioranza delle nuove infezioni è dovuta a trasmissione sessuale o all'uso di droghe iniettabi li2. In Africa e nel Pacifico occidentale si registra un'incidenza di popolazione infetta pari a circa il 5%. A livello mondiale, nel 2015 l'infezione da HBV ha causato 885.000 decessi, prevalentemente da cirrosi o carcinoma epatocellulare4. Esiste un vaccino che ha un'efficacia del 95% nella prevenzione dell'HBV, grazie al quale vengono diagnosticati sempre meno casi ogni anno3.

Lo standard attuale per il trattamento dell'infezione da HBV è la terapia antivirale, che richiede un monitoraggio costante p er garantire che il trattamento stia procedendo come desiderato. Il monitoraggio della terapia con il NeuMoDx HBV Quant Assay è in grado di fornire ai medici le informazioni necessarie per contribuire a gestire i pazienti con infezioni da HBV.

PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il NeuMoDx HBV Quant Assay combina l'estrazione automatizzata, l'amplificazione e la rilevazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction, PCR) in tempo reale. I campioni di sangue intero vengono raccolti in provette con EDTA o ACD, per la preparazione del plasma. Il campione di plasma in una provetta per campioni compatibile con il NeuMoDx System viene posizionato in un apposito portaprovette, che viene quindi caricato sul NeuMoDx System per l'elaborazione. Non sono necessari ulteriori interventi da parte dell'operatore. Il NeuMoDx System utilizza una combinazione di calore, enzima litico e reagenti per l’estrazione per eseguire automaticamente la lisi cellulare , l’estrazione del DNA e l’eliminazione degli inibitori. Gli acidi nucleici rilasciati sono catturati da microsfere ad affinità magnetica. Le microsfere, con gli acidi nucleici legati, sono caricate nella cartuccia NeuMoDx™ Cartridge dove i componenti non legati e diversi dal DNA vengono ulteriormente rimossi con NeuMoDx™ WASH Solution e il DNA legato viene eluito utilizzando NeuMoDx™ RELEASE Solution. Il NeuMoDx System utilizza quindi il DNA rilasciato per reidratare i reagenti di analisi essiccati contenenti tutti gli elementi necessari per l'amplificazione dei target specifici per HBV e SPC1. Alla ricostituzione dei reagenti PCR essiccati, il NeuMoDx System eroga la miscela pronta per PCR presente nella NeuMoDx Cartridge. L'amplificazione e la rilevazione delle sequenze di DNA di controllo e target (se presenti) avvengono nell'area della camera PCR della NeuMoDx Cartridge. La NeuMoDx Cartridge è studiata anche per contenere l’amplicone dopo la PCR in tempo reale ed eliminare fondamentalmente il rischio di contaminazione post-amplificazione.


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I target amplificati sono rilevati in tempo reale utilizzando la chimica delle sonde a idrolisi (comunemente note come chimica TaqMan®) che utilizza molecole di sonde oligonucleotidiche fluorogeniche specifiche per gli ampliconi per i rispettivi target.

Le sonde TaqMan sono costituite da un fluoroforo collegato in modo covalente all’estremità 5’ della sonda dell'oligonucleotide e da un colorante quencher all'estremità

3’ (Figura 1). Mentre la sonda è intatta, il fluoroforo e il quencher sono in prossimità, di

conseguenza la molecola quencher estingue la fluorescenza emessa dal fluoroforo tramite il trasferimento di energia per risonanza descritto da Theodor Förster (Förster Resonance Energy Transfer, FRET).

Le sonde TaqMan sono progettate in modo tale da eseguire l’annealing all’interno di una regione del DNA amplificata da un set specifico di primer. Quando la Taq DNA polimerasi estende il primer e sintetizza il nuovo filamento, l'attività di esonucleasi 5' - 3' della Taq DNA polimerasi degrada la sonda che ha eseguito l'annealing allo stampo. La degradazione della sonda rilascia il fluoroforo e spezza la stretta prossimità con il quencher, superando quindi l'effetto di smorzamento dovuto al FRET e consentendo il rilevamento della fluorescenza del fluoroforo. Il segnale fluorescente risultante rilevato nel termociclatore per PCR quantitativa del NeuMoDx System è direttamente proporzionale al fluoroforo rilasciato e può essere correlato alla quantità di DNA target presente.

Una sonda TaqMan® contrassegnata da un fluoroforo (Eccitazione: 490 nm ed Emissione: 521 nm) all'estremità 5’ e un quencher scuro all'estremità 3’ vengono utilizzati per rilevare il DNA di HBV. Per il rilevamento dell'SPC1, la sonda TaqMan® è contrassegnata con un colorante fluorescente alternativo (Eccitazione: 535 nm ed Emissione: 556 nm) all'estremità 5’ e un quencher scuro all'estremità 3’. Il software del NeuMoDx System controlla il segnale fluorescente emesso dalle sonde TaqMan alla fine di ogni ciclo di amplificazione. Quando l’amplificazione è completa, il software del NeuMoDx System analizza i dati e riporta un risultato finale (POSITIVE (POSITIVO) / NEGATIVE (NEGATIVO) / INDETERMINATE (INDETERMINATO) / UNRESOLVED (IRRISOLTO)). Se il risultato è POSITIVE (POSITIVO), il software del NeuMoDx System fornisce anche un valore quantitativo associato al campione oppure indica se la concentrazione calcolata rientra nei limiti della quantificazione.

REAGENTI/MATERIALI DI CONSUMO

Materiali in dotazione

RIF Contenuto Test per unità Test per scatola

201300 NeuMoDx™ HBV Quant Test Strip Reagenti PCR essiccati contenenti sonda e primer TaqMan® specifici per HBV insieme a sonda e primer TaqMan® specifici per SPC1.

16 96

Reagenti e materiali di consumo NeuMoDx™ necessari ma non forniti

RIF Contenuto

100200 NeuMoDx™ Extraction Plate Microsfere ad affinità magnetica essiccate, enzimi litici e controlli elaborazione campioni

800100 NeuMoDx™ HBV Calibrator Kit Calibratore HBV alto e calibratore HBV basso monouso per stabilire la validità della curva di calibrazione

900100 NeuMoDx™ HBV External Control Kit Controllo positivo e controllo negativo monouso per stabilire la validità giornaliera di NeuMoDx HBV Quant Assay

400400 NeuMoDx™ Lysis Buffer 1

400100 NeuMoDx™ WASH Solution

400200 NeuMoDx™ RELEASE Solution

100100 NeuMoDx™ Cartridge

235903 Puntali Hamilton CO-RE (300 µl) con filtri (disponibili presso NeuMoDx o Hamilton)

235905 Puntali Hamilton CO-RE (1000 µl) con filtri (disponibili presso NeuMoDx o Hamilton)

Figura 1: Meccanismo d'azione della chimica TaqMan®

Fluorescenza Spostamento e

scissione della sonda

Fluorescenza

Prodotti della PCR

Prodotti della scissione

Risultato

Primer forward per PCR Fluoroforo

Colorante quencher

Polimerizzazione Test di amplificazione

Primer reverse per PCR

Sonda TaqMan

https://en.wikipedia.org/wiki/Covalent_bond

https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide

https://en.wikipedia.org/wiki/Förster_resonance_energy_transfer

https://en.wikipedia.org/wiki/Förster_resonance_energy_transfer

https://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase

https://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase

https://en.wikipedia.org/wiki/Primer_(molecular_biology)

https://en.wikipedia.org/wiki/Exonuclease

https://en.wikipedia.org/wiki/Quantitative_PCR

https://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_cycler


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Altri materiali e apparecchiature necessari ma non forniti NeuMoDx 288 Molecular System [RIF 500100] o NeuMoDx™ 96 Molecular System [RIF 500200]

AVVERTENZE E PRECAUZIONI • La NeuMoDx HBV Quant Test Strip è per uso diagnostico in vitro solo con i sistemi NeuMoDx System.

• Non usare i reagenti o i materiali di consumo dopo la data di scadenza indicata.

• Non utilizzare alcun reagente se il sigillo di sicurezza è rotto o se la confezione risulta danneggiata all’arrivo.

• Non utilizzare i materiali di consumo o i reagenti se la confezione di protezione appare aperta o rotta all'arrivo.

• Prima di poter generare i risultati dei test per i campioni clinici, è necessario avere a disposizione una calibrazione di test valida (generata elaborando i calibratori alto e basso presenti nel NeuMoDx HBV Calibrator Kit).

• I controlli esterni (dal NeuMoDx HBV External Control Kit) devono essere elaborati ogni 24 ore.

• Il volume minimo della provetta per campioni è pari a 1 ml di plasma trattato con EDTA/ACD; un volume inferiore a 1 ml può comportare un errore del NeuMoDx System.

• L'esecuzione di un test HBV su campioni conservati a temperature non corrette oppure oltre i tempi di conservazione specificati può comportare risultati non validi o errati quando si usa la NeuMoDx HBV Quant Test Strip.

• Evitare sempre la contaminazione microbica e da desossiribonucleasi (DNasi) di tutti i reagenti e i materiali di consumo. Si raccomanda l'uso di pipette di trasferimento monouso sterili prive di DNasi. Utilizzare una nuova pipetta per ciascun campione.

• Per evitare la contaminazione dei campioni dei pazienti e del laboratorio, non manipolare né spezzare alcuna NeuMoDx Cartridge che sia stata smaltita automaticamente dal NeuMoDx System nell'apposito contenitore per materiali di scarto a rischio biologico. In nessun caso recuperare le cartucce NeuMoDx Cartridges dal contenitore per scarti a rischio biologico. La cartuccia NeuMoDx Cartridge è stata progettata in modo da prevenire la contaminazione.

• Nei casi in cui dal laboratorio siano condotti anche test per PCR in provetta aperta, è necessario assicurarsi che NeuMoDx HBV Quant Test Strip, i materiali di consumo e i reagenti aggiuntivi necessari per i test, i dispositivi di protezione individuale come guanti e camici da laboratorio e il NeuMoDx System non siano contaminati.

• Durante la manipolazione dei reagenti e dei materiali di consumo NeuMoDx, occorre indossare guanti in nitrile, puliti e privi di polvere. Prestare attenzione a non toccare la superficie superiore della cartuccia NeuMoDx Cartridge, la superficie del sigillo della striscia reattiva NeuMoDx HBV Quant Test Strip o della piastra di estrazione NeuMoDx™ Extraction Plate, né la superficie superiore del tampone di lisi NeuMoDx Lysis Buffer 1; la manipolazione dei materiali di consumo e dei reagenti deve essere effettuata toccando solo le superfici laterali.

• Per ogni reagente vengono fornite le schede di sicurezza (Safety Data Sheets, SDS).

• Lavarsi bene le mani dopo avere eseguito il test.

• Non pipettare con la bocca. Non fumare, mangiare o bere nelle aree in cui vengono manipolati i campioni o i reagenti.

• Trattare sempre i campioni come se fossero infettivi e in conformità con procedure di laboratorio sicure, come quelle descritte in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4 e nel Documento M29-A3 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

• Smaltire i reagenti inutilizzati e i materiali di scarto in conformità con le normative nazionali, federali, provinciali, regionali e locali.

STOCCAGGIO, MANIPOLAZIONE E STABILITÀ DEL PRODOTTO

• Tutti i reagenti e i materiali di consumo NeuMoDx (ad eccezione dei controlli e dei calibratori esterni) sono stabili nell'imballaggio primario a temperature comprese tra 18 e 23°C fino alla data di scadenza riportata sull’etichetta del prodotto.

• Una striscia reattiva NeuMoDx HBV Quant Test Strip posizionata sul NeuMoDx System è stabile per 14 giorni; il software del NeuMoDx System

richiederà la rimozione dei reagenti che sono stati in uso a bordo del NeuMoDx System per più di 14 giorni e nuove strisce reattive NeuMoDx HBV Quant Test Strip dovranno essere aperte e caricate sul NeuMoDx System.

• Eliminare i controlli esterni e i calibratori NeuMoDx dopo l'uso.


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PRELIEVO/TRASPORTO/CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI

1. Trattare tutti i campioni, i calibratori e i controlli come potenziali mezzi di trasmissione di agenti infettivi.

2. Non congelare sangue intero né altri campioni conservati in provette primarie.

3. Il sangue intero deve essere raccolto in provette sterili utilizzando gli acidi EDTA o ACD come anticoagulanti. Seguire le is truzioni fornite dal produttore delle provette per il prelievo dei campioni.

4. Il sangue intero raccolto nei dispositivi sopra elencati può essere conservato e/o trasportato per un massimo di 24 ore a una temperatura compresa fra 2 e 25°C prima della preparazione del plasma. La preparazione del plasma deve essere eseguita attenendosi alle istruzioni del produttore.

5. I campioni di plasma preparato devono essere conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8°C per non più di 7 giorni prima dell'analisi e per un massimo di 8 ore a temperatura ambiente.

6. I campioni di plasma preparato possono essere conservati a < -20°C per un massimo di 6 mesi prima dell'elaborazione; i cicli di congelamento/scongelamento prima dell'uso devono essere al massimo due.

a. Se i campioni vengono congelati, farli scongelare completamente a temperatura ambiente (15-30°C); agitare con movimenti rotatori per ottenere un campione distribuito uniformemente.

b. Una volta scongelati i campioni congelati, l'analisi deve essere eseguita entro 8 ore, altrimenti occorre conservare i campioni a 2-8°C per non più di 24 ore.

7. Se i campioni vengono spediti, devono essere imballati ed etichettati in conformità con le normative locali e/o internazional i applicabili.

8. Etichettare i campioni in modo chiaro e indicare che si tratta di campioni per i test HBV.

9. Procedere con la sezione Preparazione test.

Il processo complessivo per l'implementazione del NeuMoDx HBV Quant Assay è riepilogato nel seguente diagramma di flusso.

Figura 2: Schema di lavoro per l'implementazione del NeuMoDx HBV Quant Assay

SÌ

IMPLEMENTAZIONE DEL NEUMODX HBV QUANT ASSAY

SCANSIONE CODICE A BARRE

CURVA STANDARD

Ripetere ogni 90 giorni OPPURE se si usa un lotto di NeuMoDx HBV Quant

Test Strip nuovo

Se richiesto dal software del NeuMoDx, caricare i materiali

di consumo richiesti Caricare i reagenti specifici per il test

NeuMoDx Lysis Buffer 1

NeuMoDx HBV Test Strips

Elaborare i NeuMoDx HBV

External Calibrators

Elaborare i NeuMoDx HBV

External Controls

SÌ

I calibratori sono validi?

I controlli sono validi?

Ripetere ogni 24 ore

ELABORAZIONE CAMPIONI DI ROUTINE


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ISTRUZIONI PER L'USO Preparazione del test

1. Applicare l'etichetta con codice a barre del campione su una provetta compatibile con NeuMoDx System.

2. Agitare delicatamente il campione mediante movimenti rotatori per ottenere una distribuzione uniforme.

3. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire ≥ 1 ml di plasma nella provetta per campioni (figlia) dotata di codice a barre. Occorre fare attenzione a non trasferire coaguli dal campione di plasma alla provetta per campioni. Utilizzare una pipetta di trasferimento diversa per ciascun campione. La provetta figlia deve soddisfare le seguenti specifiche delle provette compatibili con il NeuMoDx System in base al portaprovette per campioni utilizzato per l'elaborazione.

• Portaprovette da 32 provette: diametro compreso tra 11 mm e 14 mm e altezza compresa tra 60 mm e 120 mm

• Portaprovette da 24 provette: diametro compreso tra 14,5 mm e 18 mm e altezza compresa tra 60 mm e 120 mm

Funzionamento dei NeuMoDx Systems Per istruzioni dettagliate, fare riferimento al/ai Manuale/i dell'operatore dei sistemi NeuMoDx 288/96 Molecular System (p/n 40600226 e 40600224).

1. Caricare la curva standard specifica per il lotto utilizzando l'apposita scheda dei codici a barre della NeuMoDx HBV Quant Test Strip fornita nella confezione della stessa.

2. Inserire la/le striscia/e reattiva/e NeuMoDx HBV Quant Test Strip in uno o più supporti per strisce reattive NeuMoDx System Test Strip e usare il touchscreen per caricare tali supporti nel NeuMoDx System.

3. Se richiesto dal software del NeuMoDx System, aggiungere i materiali di consumo necessari ai supporti per i materiali di consumo del NeuMoDx System e utilizzare il touchscreen per caricare i supporti nel NeuMoDx System.

4. Se richiesto dal software del NeuMoDx System, sostituire NeuMoDx WASH Solution e NeuMoDx RELEASE Solution e svuotare il contenitore degli scarti di adescamento o il contenitore degli scarti a rischio biologico, a seconda dei casi.

5. Se richiesto dal software del NeuMoDx System, elaborare i calibratori esterni (dal NeuMoDx HBV Calibrator Kit) e/o i controlli esterni (dal NeuMoDx HBV External Control Kit). È possibile trovare ulteriori informazioni sui calibratori e sui controlli nella sezione E laborazione dei risultati.

6. Caricare la provetta o le provette per campioni/calibratori/controlli in un portaprovette standard da 32 provette e assicurarsi che da tutte le provette siano stati rimossi i tappi.

7. Posizionare il portaprovette sul ripiano del caricatore automatico e utilizzare il touchscreen per caricare il portaprovette nel NeuMoDx System. In questo modo si avvierà l'elaborazione dei campioni caricati per il/i test identificato/i.

LIMITAZIONI

1. La striscia reattiva NeuMoDx HBV Quant Test Strip può essere utilizzata solo sui sistemi NeuMoDx System.

2. Le prestazioni della NeuMoDx HBV Quant Test Strip sono state stabilite per campioni di plasma preparati da sangue intero prelevato con EDTA/ACD come anticoagulanti.

3. L'uso della striscia reattiva NeuMoDx HBV Quant Test Strip con altri tipi di campioni clinici non è stato valutato e le caratteristiche prestazionali del test non sono note per altri tipi di campioni.

4. Poiché il rilevamento dell'HBV dipende dal numero di organismi presenti nel campione, l'affidabilità dei risultati dipende dal fatto che i campioni vengano prelevati, trattati e conservati correttamente.

5. I calibratori e i controlli esterni NeuMoDx devono essere elaborati secondo le indicazioni contenute nei foglietti illustrativi presenti nella confezione e richiesti dal software del NeuMoDx System prima di elaborare i campioni clinici di routine.

6. Eventuali risultati errati potrebbero essere dovuti al fatto di non aver eseguito correttamente il prelievo, il trattamento o la conservazione, a errori tecnici o a scambi di provette per campioni. Inoltre potrebbero verificarsi falsi negativi se il numero di organismi n el campione è al di sotto del limite di rilevazione del NeuMoDx HBV Quant Assay.

7. Il funzionamento del NeuMoDx System è limitato all'uso da parte di personale addestrato all'uso del NeuMoDx System.

8. Se non si amplificano sia il target HBV che il target SPC1, si otterrà un risultato non valido (Indeterminate, Indeterminato, o Unresolved, Irrisolto) e si dovrà ripetere il test.

9. Se il risultato del NeuMoDx HBV Quant Assay è Positive (Positivo), ma il valore di quantificazione è oltre i limiti di quanti ficazione, il NeuMoDx System indicherà se l'HBV rilevato era al di sotto del limite di quantificazione inferiore (Lower Limit of Quantitation, LLoQ) o al di sopra del limite di quantificazione superiore (Upper Limit of Quantitation, ULoQ).

10. Nel caso in cui l'HBV rilevato sia al di sotto del limite di quantificazione inferiore, è possibile ripetere il test (se si desidera) con un'altra aliquota del campione.


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11. Nel caso in cui l'HBV rilevato sia al di sopra del limite di quantificazione superiore, occorre ripetere il test con un'aliquota diluita del campione. Si consiglia una diluizione di 1:1000 in plasma HBV-negativo o Basematrix 53.

12. Un risultato positivo non indica necessariamente la presenza di organismi vitali. Tuttavia un risultato positivo è indice di possibile presenza di DNA del virus dell'epatite B.

13. Cancellazioni o mutazioni nella proteina X o nella regione pre-C possono influenzare il rilevamento o potrebbero portare a un risultato errato quando si utilizza la NeuMoDx HBV Quant Test Strip.

14. I risultati del test NeuMoDx HBV Quant Assay dovranno essere impiegati in aggiunta alle osservazioni cliniche e alle altre informazioni a disposizione del medico; il test non è destinato a diagnosticare l'infezione.

15. Si raccomandano buone pratiche di laboratorio, compreso il cambio di guanti tra una manipolazione dei campioni dei pazienti e quella successiva, per evitare la contaminazione.

ELABORAZIONE DEI RISULTATI

I risultati disponibili possono essere visualizzati o stampati dalla scheda "Results" (Risultati) nella finestra Results (Ris ultati) sul touchscreen del NeuMoDx System. I risultati del NeuMoDx HBV Quant Assay vengono generati automaticamente dal software del NeuMoDx System utilizzando l'algoritmo decisionale e i parametri di elaborazione dei risultati sono specificati nel NeuMoDx HBV Assay Definition File (file di definizione del test) (HBV ADF). Il risultato del NeuMoDx HBV Quant Assay può essere: Negative (Negativo), Positive (Positivo) con indicazione di una concentrazione di HBV, Positive above ULoQ (Positivo al di sopra del limite di quantificazione superiore), Positive below LLoQ (Positivo al di sotto del limite di quantificazione inferiore), Indeterminate (Indeterminato) o Unresolved (Irrisolto), a seconda dello stato di amplificazione del controllo target e del controllo di elaborazione dei campioni. I risultati sono riportati nella Tabella 1 in base all'algoritmo decisionale.

Tabella 1. Algoritmo decisionale del NeuMoDx HBV Quant Assay

Risultato HBV Controllo di elaborazione dei

campioni (SPC1) Ct

Positive (Positivo)

[2 ≤ Ct < 9 AND (ED) EPR ≥ 2 AND (ED) EP ≥ 1000]

OR (OPPURE) [9 ≤ Ct ≤ 42 AND (ED) EP ≥ 1000]

N/A

Positive, above Upper Limit of Quantitation [ULoQ] (Positivo, al di sopra del limite di quantificazione superiore) (log10 IU/mL)

Quant > 9,02 N/A

Positive, below Lower Limit of Quantitation [LLoQ] (Positivo, al di sotto del limite di quantificazione inferiore) (log10 IU/mL)

Quant < 0,88 N/A

Negative (Negativo)

N/A OR (OPPURE) (2 ≤Ct< 9 AND (ED) EPR <

2) OR (OPPURE)

[9 ≤ Ct ≤ 42 AND (ED) EP ≥ 1000] OR (OPPURE) Ct > 42

28 ≤ Ct ≤ 34 AND (ED) EP ≥ 2000

Indeterminate (Indeterminato) NOT AMPLIFIED / System Errors Noted (NON AMPLIFICATO / Notati errori di

sistema)

Unresolved (Irrisolto) NOT AMPLIFIED/ No System Errors Noted (NON AMPLIFICATO / Non notati

errori di sistema)

EP = End Point Fluorescence (fluorescenza dell'endpoint) (dopo la correzione della linea basale); EPR = End Point Fluorescence Ratio (rapporto fluorescenza dell'endpoint); Ct = Cycling Threshold (soglia del ciclo); Quant = quantità calcolata di HBV presente espressa in log10 IU/ml. Vedi sotto Calcolo del test.


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Calcolo del test

1. Per i campioni che rientrano nel range di quantificazione del NeuMoDx HBV Quant Assay, la concentrazione di DNA dell'HBV pres ente nei campioni viene calcolata tramite una calibrazione basata sulla curva/equazione standard.

a. In base ai risultati dei calibratori NeuMoDx HBV elaborati per stabilire la validità della curva standard, si calcola anche un “Calibration Coefficient” (Coefficiente di calibrazione), per un particolare lotto della NeuMoDx HBV Quant Test Strip, su uno specifico NeuMoDx System.

b. Il Coefficiente di calibrazione viene inserito nella determinazione finale della concentrazione di DNA dell'HBV.

2. I risultati del NeuMoDx HBV Quant Assay sono espressi in log10 IU/ml.

3. La quantificazione risultante dei campioni non noti è tracciabile secondo il 4o Standard Internazionale sull'HBV della OMS.

Calibrazione del test

Per quantificare il DNA dell'HBV presente nei campioni, è necessaria una calibrazione valida, basata sulla curva (o equazione) standard. L'operatore acquisisce la curva standard che si trova sulla scheda dei codici a barre della NeuMoDx HBV Quant Test Strip in dotazione con ciascun lotto di reagente.

Per ottenere risultati validi, occorre completare la calibrazione del test. Calibratori esterni

1. I calibratori esterni presenti nel NeuMoDx HBV Calibrator Kit [RIF 800100] contengono virus dell'HBV intatto diluito in Basematrix 53.

2. Occorre elaborare un set di calibratori HBV con ogni nuovo lotto di NeuMoDx HBV Quant Test Strips, oppure quando si carica un nuovo file di definizione del test HBV nel NeuMoDx System, oppure quando il set attuale di calibratori ha superato il periodo di validità (attualmente impostato a 90 giorni), o quando viene modificato il software del NeuMoDx System.

3. Il software del NeuMoDx System notificherà all'utente quando è necessario elaborare i calibratori. Nel funzionamento tipico, non è possibile usare un lotto nuovo di strisce reattive finché i calibratori non sono stati elaborati con successo.

4. Se sono necessari i calibratori, elaborare i calibratori NeuMoDx HBV con i seguenti codici a barre (un calibratore alto e un calibratore basso per ogni sistema o lotto di reagenti):

Calibratore NeuMoDx HBV ID codice a barre

High Calibrator (HC, calibratore alto) HCHBV

Low Calibrator (LC, calibratore basso) LCHBV

5. La validità della calibrazione viene stabilita come segue.

a) Per stabilire la validità occorre elaborare un set di due calibratori (alto e basso).

b) Per ottenere risultati validi, almeno 2 replicati su 3 devono dare risultati che rientrino nei parametri predefiniti. Il targ et nominale del calibratore basso è di 3,7 log10 IU/ml e il target nominale del calibratore alto è di 5,7 log10 IU/ml.

c) Viene calcolato un Coefficiente di calibrazione in modo da giustificare la deviazione nella quantificazione; tale Coefficiente di calibrazione viene utilizzato nella determinazione della concentrazione finale di HBV.

6. Se uno o entrambi i calibratori non superano il controllo di validità, ripetere l'elaborazione del/dei calibratore/i che non hanno superato il controllo utilizzando una fiala nuova. Nel caso in cui non superi il controllo di validità uno solo dei due calibratori, è possibile ripetere l'elaborazione solo di quel calibratore, dato che il sistema non richiede all'utente di elaborare entrambi i calibratori.

7. Se il/i calibratore/i non superano il controllo di validità due volte consecutive, contattare NeuMoDx Molecular, Inc.

Controllo qualità Le normative locali in genere specificano che il laboratorio è responsabile delle procedure di controllo che monitorano l'acc uratezza e la precisione dell'intero processo analitico e devono stabilire il numero, il tipo e la frequenza di test dei materiali di controllo utilizzando specifiche di prestazione verificate per un sistema di test approvato e non modificato. Controlli esterni

1. I materiali dei controlli esterni, che contengono il virus HBV intatto in Basematrix 53 sia per il controllo positivo alto che per quello debolmente positivo, sono forniti da NeuMoDx Molecular, Inc. nel NeuMoDx HBV External Control Kit.

2. I controlli esterni positivi e negativi devono essere elaborati una volta ogni 24 ore. Se non esiste un set di controlli esterni validi, il software del NeuMoDx System richiederà all'utente di elaborare questi controlli prima di poter riportare i risultati del campione.


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3. Se sono richiesti controlli esterni, elaborare i controlli esterni NeuMoDx HBV con i seguenti codici a barre (1 controllo positivo e 1 controllo negativo per sistema):

NeuMoDx HBV External Control ID codice a barre

Positive Control (PC) (controllo positivo) HBVPC

Negative Control (NC) (controllo negativo) HBVNC

4. Estrarre il set di controlli esterni dal congelatore e far scongelare le provette a temperatura ambiente (15-30°C) finché non saranno completamente scongelate. Agitare delicatamente mediante movimenti rotatori per garantirne l'omogeneità.

5. Utilizzando il touchscreen e un portaprovette per campioni posizionato sul ripiano del caricatore automatico, caricare le provette del controllo positivo e del controllo negativo nel NeuMoDx System. Il NeuMoDx System riconoscerà il codice a barre e inizierà l'elaborazione delle provette per campioni, a meno che non siano disponibili reagenti o materiali di consumo adeguati necessari per i test.

6. La validità dei controlli esterni sarà valutata dal NeuMoDx System in base al risultato atteso. Il controllo positivo deve fornire un risultato positivo all'HBV e il controllo negativo deve fornire un risultato negativo all'HBV.

7. Risultati discrepanti per i controlli esterni devono essere gestiti come segue:

a) Un risultato positivo riportato per un campione di controllo negativo indica un problema di contaminazione del campione. b) Un risultato del test negativo riportato per un campione di controllo positivo potrebbe indicare l’esistenza di un problema riguardante

un reagente o uno strumento. c) In entrambi i casi ripetere i controlli esterni NeuMoDx HBV con fiale nuove del controllo o dei controlli che non hanno super ato il test

di validità. d) Se il controllo esterno NeuMoDx HBV positivo continua a dare risultato negativo, contattare l'assistenza clienti NeuMoDx. e) Se il controllo esterno NeuMoDx HBV negativo continua a dare risultato positivo, cercare di eliminare tutte le fonti di potenziale

contaminazione, anche sostituendo TUTTI i reagenti, prima di contattare l'assistenza clienti NeuMoDx.

Controlli (interni) di elaborazione dei campioni

Nella NeuMoDx Extraction Plate è incorporato un Controllo di elaborazione dei campioni esogeno (SPC1), che si sottopone all'intero processo di estrazione dell'acido nucleico e amplificazione mediante PCR in tempo reale con ogni campione. In ogni NeuMoDx HBV Quant Test Strip sono inclusi anche primer e sonda specifici per SPC1, consentendo il rilevamento della presenza dell'SPC1 insieme al DNA dell'HBV target (se presente) tramite PCR multiplex in tempo reale. Il rilevamento dell'amplificazione di SPC1 consente al software del NeuMoDx System di monitorare l'efficacia dei processi di estrazione e di amplificazione del DNA mediante PCR.

Risultati non validi

Se un NeuMoDx HBV Quant Assay eseguito sul NeuMoDx System non è in grado di produrre un risultato valido, sarà riportato come Indeterminate (IND, Indeterminato) o Unresolved (UNR, Irrisolto) in base al tipo di errore che si è verificato.

Il risultato sarà IND quando viene rilevato un errore del NeuMoDx System durante l'elaborazione del campione. Se il risultato è IND, si consiglia di ripetere il test.

Il risultato sarà Non risolto quando non viene rilevata alcuna amplificazione valida del DNA dell'HBV o di SPC1, cosa che indica un possibile errore dovuto al reagente o la presenza di inibitori. Se il risultato è Non risolto, si consiglia in primo luogo di ripetere il test. Se ancora non si ottiene un risultato valido, è possibile usare un campione diluito per mitigare gli effett i di un'eventuale inibizione del campione.

CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI

Sensibilità analitica – Limite di rilevazione con lo Standard OMS

La sensibilità analitica del NeuMoDx HBV Quant Assay con l'uso di NeuMoDx HBV Quant Test Strip è stata caratterizzata testando cinque livelli diversi del 4o Standard Internazionale della OMS e i campioni negativi in plasma umano negativo sottoposto a screening sul NeuMoDx 288 Molecular System e un pannello di test abbreviati sul NeuMoDx 96 Molecular System. Gli studi sono stati eseguiti nell'arco di 3 giorni su vari sistemi NeuMoDx System, dove ciascun sistema elaborava 18 e 24 replicati ad ogni livello al giorno rispettivamente sul NeuMoDx 288 Molecular System e sul NeuMoDx 96 Molecular System. Su ciascun sistema è stato testato un unico lotto di ognuno dei seguenti: NeuMoDx HBV Quant Test Strip, NeuMoDx Extraction Plate e NeuMoDx Lysis Buffer 1 sono stati testati su ciascun NeuMoDx System ogni giorno. I tassi di rilevazione sono illustrati nella Tabella 2. È stata utilizzata l'analisi con modello Probit per determinare il limite di rilevazione (Limit of Detection, LoD) per il genotipo A di HBV [Figura 3]; il LoD del NeuMoDx HBV Assay sul NeuMoDx 288 Molecular System è stato determinato a 5,2 IU/ml con un int ervallo di confidenza (IC) di 4,1-7,6 IU/ml, pari a 0,72 log10 IU/ml con IC al 95% di 0,61-0,88 log10 IU/ml. Il LoD del NeuMoDx HBV Assay sul NeuMoDx 96 Molecular System è stato determinato a 4,3 IU/ml (0,63 log10 IU/ml). Il limite di rilevazione conclamato del NeuMoDx HBV Quant Assay è pari a 6,2 IU/ml in base ai risultati del LoD ottenuti attraverso i genotipi HBV.


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Tabella 2. Tassi di rilevamento positivi per i campioni usati per determinare il LoD del NeuMoDx HBV Quant Assay

IU/ml log10

(IU/ml)

NeuMoDx 288 Molecular System NeuMoDx 96 Molecular System

Numero di test validi

Numero di positivi

Tasso di rilevamento

Numero di test validi

Numero di positivi


20 1,3 108 108 100% NA NA NA

10 1 108 107 99% 24 24 100%

5 0,7 108 98 91% 24 23 96%

2,5 0,4 108 97 90% 24 20 83%

1,25 0,1 108 73 68% NA NA NA

0 0 108 0 0% 24 24 0%

Figura 3: Analisi con modello Probit usata per determinare il LoD del NeuMoDx HBV Quant Assay su NeuMoDx 288 Molecular System (a sinistra) e su NeuMoDx 96 Molecular System (a destra)

Limite di quantificazione – Limite di quantificazione inferiore (LLoQ) Al fine di determinare il limite di quantificazione inferiore, è stato calcolato l'errore analitico totale (total analytical error, TAE) per ciascuno dei livelli di HBV target, da cui è emerso un rilevamento ≥95% come parte del calcolo del LoD. Il TAE si definisce come segue:

TAE = deviazione + 2*SD [Statistica Westgard] La deviazione è il valore assoluto della differenza tra la media della concentrazione calcolata e la concentrazione attesa. DS si riferisce alla deviazione standard del valore quantificato del campione.

I risultati compilati del LLoQ per i campioni di HBV su entrambi i sistemi NeuMoDx System sono illustrati nella Tabella 3.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

-2 -1 0 1 2 3

SEN

SITI

VIT

Y

log10 [CONC/ml]

Sigmoid Fit

Experimental Data

Calculated LoD

LoD = 4,3 IU/ml

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

-4 -2 0 2 4

SEN

SITI

VIT

Y

log10 [CONC/ml]

Curve FIT

Experimental

Calculated LoD

LoD = 5,2 IU/ml [con IC al 95% de (4.1,7.6) IU/ml]

ANDAMENTO della curva

Andamento sigmoidale

Sperimentale Dati sperimentali

LoD calcolato LoD calcolato

SEN

SIB

ILIT

À

SEN

SIB

ILIT

À

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2 0,2

0,4

0,6

0,8

1,2


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Tabella 3. Risultati per il LLoQ, con la deviazione e il TAE, per ogni livello testato.

CONC TARGET IU/ml

CONC TARGET

Log10 IU/ml

NeuMoDx 288 Molecular System NeuMoDx 96 Molecular System


Conc. media log10 IU/ml

DS Deviazione TAE Tasso di

rilevamento Conc. media log10 IU/ml

DS Deviazione TAE

20 1,30 100% 1,29 0,23 0,16 0,63 NA NA NA NA NA

10 1,00 99% 1,07 0,25 0,20 0,71 100% 0,97 0,28 -0,03 0,60

5 0,70 91% 0,89 0,35 0,34 1,04 96% 0,86 0,32 0,17 0,81

2,5 0,40 90% 0,75 0,44 0,51 1,39 93% 0,85 0,45 0,45 1,34

1,25 0,10 68% 0,73 0,41 0,68 1,50 NA NA NA NA NA

Il livello target più basso a cui si raggiunge il rilevamento >95% E il TAE ≤ 1,0 è definito come limite di quantificazione i nferiore (LLoQ). Il LLoQ è determinato a 5,5 IU/ml (0,74 log10 IU/ml) e a 4,3 IU/ml (0,63 log 10 IU/ml) usando il 4o Standard Internazionale dell'OMS, rispettivamente per il NeuMoDx 288 Molecular System e il NeuMoDx 96 Molecular System. In base a test su tutti i genotipi, il LLoQ conclamato del NeuMoDx HBV Quant Assay è pari a 7,6 IU/ml (0,88 log10 IU/ml).

LoD e LLoQ sui genotipi HBV Inizialmente è stato stabilito il LoD per il Genotipo A (4o Standard Internazionale OMS), poi sono stati eseguiti ulteriori test sul LoD stabilito con ciascuno degli altri 7 genotipi. Sono stati testati 36 replicati a livelli corrispondenti a 2X, 1X e 0,5X del limite superiore IC al 95% del LoD (~7 IU/ml) con il NeuMoDx HBV Quant Assay. Il valore percentuale positivo per ciascun genotipo ad ognuno di questi livelli testati è stato messo in formato tabulare e usato per calcolare il LoD tramite un'analisi con modello Probit. È stato calcolato anche l'errore analitico totale a questi livelli testati. Il livello inferiore con rilevamento positivo al 95% e il TAE calcolato di ≤ 1,0 sono stati considerati nuovamente come il LLoQ per il genotipo.

Tabella 4. Genotipi HBV testati

GENOTIPO LoD

[Log10IU/ml] LLoQ

[log10IU/ml]

Genotipo A 5,2 5,2

Genotipo B 6,2 6,2

Genotipo C 3,5 6,2

Genotipo D 5,2 5,7

Genotipo E 3,5 3,5

Genotipo F 5,1 6,2

Genotipo G 3,5 3,5

Genotipo H 5,2 7,6

Linearità e determinazione del limite di quantificazione superiore (ULoQ) È stato usato il genotipo A come rappresentativo di altri genotipi per questo studio. Sono stati elaborati undici (11) livell i di campioni di HBV [Pannello di test] con 6 replicati ad ogni livello su 2 NeuMoDx System e 3 lotti di reagenti critici per copre un range di rilevamento di 8 log 10, oltre a punti di decisione clinica critici vicini. Il Pannello di test era composto da un campione clinico HBV-positivo diluito in campione di plasma HBV-negativo precedentemente sottoposto a screening e raggruppato. La tracciabilità secondo il 4o Standard Internazionale della OMS è stata stabilita tramite un'analisi lineare parallela prima dell'esecuzione dello studio di linearità. L'equivalenza del NeuMoDx HBV Quant Assay è stata dimostrata da risultati di performance altamente correlati sul NeuMoDx 288 Molecular System e sul NeuMoDx 96 Molecular System.


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Tabella 5. Linearità del NeuMoDx HBV Quant Assay (valutata con Genotipo A)

Conc. target (IU/ml)

Conc. target (log10 IU/ml)

Conc. media (log10 IU/ml)

Deviazione standard

Deviazione Modello lineare

previsto

Deviazione dal modello non

lineare

1,05E+09 9,02 8,99 0,08 0,06 9,02 -0,04

1,05E+08 8,02 8,05 0,07 0,05 8,02 0,03

1,05E+07 7,02 7,05 0,07 0,06 7,02 0,04

1,05E+06* 6,02 6,05 0,05 0,05 6,02 0,03

1,05E+05 5,02 5,04 0,05 0,04 5,02 0,00

2,82E+04* 4,45 4,43 0,07 0,05 4,45 -0,01

1,05E+04 4,02 3,99 0,09 0,05 4,02 -0,02

2,82E+03* 3,45 3,41 0,07 0,06 3,45 -0,03

1,05E+03 3,02 3,00 0,04 0,04 3,02 -0,03

1,05E+02 2,02 1,99 0,11 0,09 2,02 -0,01

1,05E+01 1,02 1,09 0,29 0,23 1,02 0,06

*Punti di decisione clinica vicini

Il NeuMoDx HBV Quant Assay ha dimostrato la capacità di quantificare l'HBV attraverso il range lineare di 8 log10 con una deviazione di ±0,22 log10

IU/ml. La deviazione massima da un modello di regressione non lineare leggermente migliore era 0,06 log10 IU/ml. Anche il limite di quantificazione superiore (ULoQ) è stato determinato con i dati di questo studio ed è risultato pari a 9,02 log10 IU/ml.

Figura 4: Range lineare del NeuMoDx HBV Quant Assay. x = Quantificazione attesa, y = Quantificazione di NeuMoDx

y = 1x + 1E-06R² = 0,9977

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Co

nce

ntr

azio

ne

di N

euM

oD

x H

BV

A

ssay

[lo

g 10

IU/m

l]

Concentrazione attesa [log10 IU/ml]

Linearità di NeuMoDx HBV Assay


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Linearità sui genotipi La linearità del NeuMoDx HBV Assay in campione di plasma per i genotipi HBV è stata caratterizzata testando almeno quattro (4 ) concentrazioni diverse di ciascun genotipo di HBV preparato in plasma HBV-negativo raggruppato. I livelli testati di HBV target usati in questo studio dipendevano dalla concentrazione del campione originario e quindi differivano sui genotipi. Lo studio è stato realizzato con ciascun geno tipo utilizzando 6 replicati ad ogni livello.

Tabella 6: Linearità del NeuMoDx HBV Quant Assay sui genotipi

Genotipo Equazione di linearità

y = Quantificazione di NeuMoDx HBV Assay x = Quantificazione attesa

R2

A y = 1x + 1E-06 0,9977

B y = 1,0129x - 0,0964 0,9975

C y = 1,0250x - 0,0898 0,998

D y = 1,0379x - 0,0896 0,9975

E y = 1,0182x - 0,096 0,9956

F y = 0,9736x + 0,276 0,9906

G y = 1,0547x - 0,0835 0,9813

Figura 5: Linearità del NeuMoDx HBV Quant Assay sui genotipi

Specificità analitica e reattività crociata La specificità analitica è stata dimostrata sottoponendo a screening 32 organismi comunemente presenti in campioni di sangue/plasma, nonché in specie filogeneticamente simili all'HBV per reattività crociata. Gli organismi sono stati preparati in pool di 4-6 organismi e analizzati ad alta concentrazione. Gli organismi analizzati sono illustrati nella Tabella 7. Non è stata osservata alcuna reattività crociata con nessuno degli organismi analizzati, confermando la specificità analitica del 100% del NeuMoDx HBV Quant Assay.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10

Co

nce

ntr

azio

ne

di N

euM

oD

x H

BV

Ass

ay

[lo

g 10

IU/m

l]

Concentrazione test HBV di riferimento[log10 IU/ml]

Linear (Genotype A)

Linear (Genotype B)

Linear (Genotype C)

Linear (Genotype D)

Linear (Genotype E)

Linear (Genotype F)

Linear (Genotype G)

Lineare (Genotipo A) Lineare (Genotipo B) Lineare (Genotipo C)

Lineare (Genotipo D) Lineare (Genotipo E) Lineare (Genotipo F)

Lineare (Genotipo G)


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Tabella 7. Patogeni usati per dimostrare la specificità analitica – reattività crociata

Adenovirus 2 Dengue V1 Epatite A HPV 16 Ilheus (ILHV) Febbre gialla

Adenovirus 5 Dengue V2 Epatite C HPV 18 Influenza A Virus Zika

Virus Banzi Dengue V3 Virus dell’herpes

umano 6a HSV1 Parvovirus B19

Virus BK Dengue V4

Virus dell’herpes umano 8

HSV 2 Rosolia

Citomegalovirus Virus di

Epstein-Barr HIV 1 HTLV 1

Encefalite di Saint Louis

VZV Virus Vaccinia HIV 2 HTLV 2 Virus del Nilo occidentale

Sostanze interferenti - Organismi commensali È stato interrogato il NeuMoDx HBV Quant Assay per valutare l'interferenza nella presenza di organismi non target tramite pool di organismi uguali a quelli preparati per testare la specificità analitica. Gli organismi sono stati testati singolarmente o raccolti in gruppi di 4-6 organismi in plasma HBV-negativo sottoposto a screening e arricchiti con controlli HBV a una concentrazione di 3,7 log10 IU/ml. Non sono state osservate interferenze significative nella presenza di questi organismi commensali, come indicato dalla deviazione minima della quantificazione dai campioni di controllo che non contenevano alcun agente interferente.

Tabella 8. Test di interferenza – Organismi commensali

Conc. media log10 IU/ml

Deviazione log10 IU/ml

Gruppo 1 [Virus BK, Citomegalovirus, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'herpes

umano 6a, Virus dell'herpes umano 8] 3,51 0,10

Gruppo 2 [Adenovirus 2, Adenovirus 5, Dengue V2, Dengue V3, Dengue V4]

3,38 0,22

Gruppo 3 [Parvovirus B19, HTLV 1, HTLV 2, Ilheus (ILHV), Febbre gialla, Virus Zika]

3,62 0,06

Gruppo 4 [HPV 16, HPV 18, HSV 1, HSV 2, Dengue V1]

3,57 0,04

Gruppo 5 [Virus dell'encefalite di St. Louis, VZV, Virus Vaccinia, Virus del Nilo

occidentale] 3,57 0,03

HAV 3,58 0,05

Virus Banzi 3,41 0,19

HIV-1 3,47 0,15

HIV-2 3,56 0,05

Rosolia 3,16 0,44

Influenza A 3,60 0,03

HCV 3,58 0,04

Sostanze interferenti - Sostanze endogene ed esogene Le prestazioni del NeuMoDx HBV Quant Test Strip sono state valutate in presenza di sostanze interferenti esogene ed endogene tipiche, trovate in campioni clinici di plasma con HBV. Questi includevano livelli insolitamente alti di componenti del sangue, nonché comuni far maci antivirali, che sono stati classificati nella Tabella 9. Ciascuna delle sostanze endogene ed esogene elencate nella sottostante Tabella 10 sono state aggiunte a plasma umano HBV-negativo sottoposto a screening arricchito con 3,7 log10 IU/ml HBV e di dati sono stati esaminati per valutare l'interferenza. Inoltre è stato testato anche il plasma a uno stadio comune di malattia associato con l'infezione da Epatite B per valutare la potenziale interferenza.


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Tabella 9. Test di interferenza - Agenti esogeni (classificazioni dei farmaci)

Pool Farmaco Classificazione

1

Zidovudina (ZDV) Inibitore della trascrittasi inversa

Saquinavir Inibitore della proteasi dell'HIV

Ritonavir Inibitore della proteasi dell'HIV

Claritromicina Antibiotico

Interferone alfa-2a Immunomodulatore

Interferone alfa-2b Immunomodulatore

2

Abacavir solfato Inibitore della trascrittasi inversa

Amprenavir Inibitore della proteasi

Ribavirina Immunomodulatore

Entecavir Antivirale HBV

Fluoxetina Antidepressivo SSRI

Valaciclovir cloridrato Antivirale

3

Tenofovir disoproxil Antivirale HBV/HIV

Lamivudina Antivirale HBV/HIV

Ganciclovir Antivirale CMV

Valganciclovir Antivirale CMV

Nevirapina Inibitore della trascrittasi inversa

4

Efavirenz Inibitore della trascrittasi inversa

Lopinavir Inibitore della proteasi

Enfuvirtide Inibitore della fusione HIV

Ciprofloxacina Antibiotico

Paroxetina Antidepressivo SSRI

5

Adefovir (dipivoxil) Antivirale

Azitromicina Antibiotico

Indinavir solfato Inibitore della proteasi dell'HIV

Sertralina Antidepressivo SSRI


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Tabella 10. Test di interferenza - Agenti esogeni ed endogeni

Endogena Conc. media log10 IU/ml


Emoglobina 3,50 0,20

Trigliceridi 3,51 0,09

Bilirubina 3,56 0,13

Albumina 3,51 0,17

Esogeno (Farmaci) Conc. media log10 IU/ml


Pool 1: Zidovudina (ZDV), saquinavir, ritonavir, claritromicina, interferone alfa-2a, interferone alfa-2b

3,58 0,08

Pool 2: Abacavir solfato, amprenavir, ribavirina, entecavir, fluoxetina, valaciclovir cloridrato

3,56 0,04

Pool 3: Tenofovir disoproxil, lamivudina, ganciclovir, valganciclovir, nevirapina

3,59 0,06

Pool 4: Efavirenz, lopinavir, enfuvirtide, ciprofloxacina, paroxetina

3,60 0,07

Pool 5: Adefovir (dipivoxil), azitromicina, indinavir solfato, sertralina

3,56 0,19

Stato della malattia Conc. media log10 IU/ml


Anticorpo anti-nucleo (ANA) 3,61 0,10

Lupus eritematoso sistemico (LES) 3,63 0,10

Artrite reumatoide (AR) 3,57 0,09

Anticorpi HCV 3,58 0,07

Anticorpi HBV 3,64 0,11

Cirrosi alcolica 3,68 0,15

Fattore reumatoide (FR) 3,63 0,10

Steatoepatite non alcolica (Non-alcoholic Steatohepatitis, NASH)

3,49 0,06

Precisione intra-laboratorio La precisione della striscia reattiva NeuMoDx HBV Quant Test Strip è stata determinata testando un pannello di 8 componenti di campioni di HBV a copertura dei genotipi A e C utilizzando tre NeuMoDx System nell'arco di 12 giorni. Sono state caratterizzate le precisioni intra-sessione, intra-giornata e intra-sistema ed è stata determinata la deviazione complessiva standard a ≤ 0,22 log10 IU/ml. La precisione fra operatori non è stata caratterizzata, in quanto l'operatore non riveste un ruolo significativo nell'elaborazione dei campioni con l'uso del NeuMoDx System.

Tabella 11. Risultati degli studi di precisione intra-laboratorio

COMPONENTE DEL

PANNELLO

CONC. TARGET

[log10 IU/ml]

CONC. MEDIA [log10 IU/ml]

N Deviazione DS intra-sessione

DS intra-giornata

DS intra-sistema

DS complessiva

Genotipo A

7,75 7,89 36 0,14 0,06 0,07 0,07 0,07

5,75 5,83 36 0,11 0,07 0,10 0,10 0,10

3,75 3,70 36 0,11 0,11 0,13 0,15 0,15

1,75 1,54 36 0,23 0,16 0,22 0,22 0,22

Genotipo C

6,27 6,23 36 0,10 0,08 0,09 0,10 0,10

4,27 4,18 36 0,08 0,08 0,10 0,10 0,10

3,27 3,14 36 0,09 0,08 0,12 0,12 0,12

2,27 2,08 36 0,12 0,12 0,15 0,16 0,16


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Riproducibilità lotto a lotto La riproducibilità lotto a lotto della NeuMoDx HBV Quant Test Strip è stata determinata utilizzando tre lotti differenti di reagenti principali: NeuMoDx Lysis Buffer 1, NeuMoDx Extraction Plate e la NeuMoDx HBV Quant Test Strip. Per valutare le prestazioni è stato usato un pannello di 8 componenti di genotipi HBV di tipo A e C. I test sono stati effettuati utilizzando tre lotti di reagenti su tre sistemi NeuMoDx System nell'arco di 6 giorni. È stata analizzata la variazione all'interno dei lotti e fra i lotti. La deviazione complessiva massima era di 0,12 log10IU/ml e la DS massima era di 0,24 log10 IU/ml. Non sono state riscontrate differenze significative nelle prestazioni fra i lotti in quanto la quantificazione di tutt i i componenti del pannello rientrava della specifica di tolleranza.

Tabella 12. Risultati degli studi sulla riproducibilità lotto a lotto

COMPONENTE DEL

PANNELLO

CONC. TARGET [log10 IU/ml]

CONC. MEDIA [log10 IU/ml]

N Deviazione DS intra-LOTTO

DS fra LOTTI DS

complessiva

Genotipo A

8,02 7,99 36 0,03 0,15 0,09 0,17

6,02 5,96 36 0,06 0,17 0,06 0,18

4,02 3,90 36 0,12 0,14 0,09 0,17

2,02 1,92 36 0,10 0,21 0,12 0,24

Genotipo C

6,27 6,32 36 0,05 0,06 0,08 0,10

4,27 4,31 36 0,04 0,22 0,09 0,24

3,27 3,30 36 0,03 0,20 0,07 0,21

2,27 2,32 36 0,05 0,13 0,13 0,18

Efficacia del controllo Utilizzando due genotipi HBV comuni (A e C), è stata valutata l'efficacia dell'SPC1 incluso nel NeuMoDx HBV Quant Assay nel s egnalare eventuali errori nelle fasi del processo o inibizione che influenzasse le prestazioni del NeuMoDx HBV Quant Assay. Le condizioni analizzate sono rappresentative di errori critici delle fasi di processo che si potrebbero verificare durante l'elaborazione dei campioni e c he potrebbero non essere rilevati dai sensori di monitoraggio delle prestazioni del NeuMoDx System. L'efficacia dell'SPC1 è stata valutata simulando tali condizioni di errore. Le lacune di processo che hanno prodotto un effetto avverso sulla rilevazione/quantificazione dell'HBV sono state rispecchiate dalle prestazioni dell'SPC1 target (presenza di inibitore e mancanza della fase di LAVAGGIO). Per le condizioni al di sotto delle quali l'ampli ficazione di SPC1 non ha subito ripercussioni, è emerso anche che l'HBV Target era amplificato entro una quantificazione riportata di 0,2 log10 IU/ml dei campioni di controllo.

Tabella 13. Efficacia del Controllo di elaborazione dei campioni

Errore della fase di processo testata

Stato di amplificazione del Controllo di elaborazione

dei campioni

Stato di amplificazione dell'HBV Target

Risultato del test

Presence of Inhibitor (Presenza di inibitore)

Not Amplified (Non amplificato)


Unresolved (Irrisolto)

No Wash Delivered (Lavaggio non effettuato)



Unresolved (Irrisolto)

No Wash Blowout (Nessun blow-out di

lavaggio) Amplified (Amplificato) Amplified (Amplificato)

Positive with Quantitation within 0.2 Log10 IU/mL of Control (Positivo con

Quantificazione entro 0,2 log10 IU/ml di Controllo)

Contaminazione crociata Il tasso di contaminazione crociata del NeuMoDx HBV Quant Assay è stato determinato testando tre set di campioni di HBV che presentavano campioni alternati altamente positivi e altamente negativi. In totale ciò ha comportato l'analisi di 144 replicati di un normale campione di plasma umano HBV-negativo trattato con EDTA e di 144 replicati di un campione di HBV a titolo alto a 8,0 log10 IU/ml. Tutti e 144 i replicati del campione negativo sono risultati negativi, con un tasso di contaminazione crociata dello 0%.

Equivalenza delle matrici di campioni Sono stati eseguiti test per determinare risultati equivalenti con l'HBV raccolto in apposite provette, sia con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), sia con acido citrico-citrato-destrosio (ACD). Inoltre è stata eseguita un'analisi per determinare l'equivalenza fra campioni freschi e campioni congelati. BioIVT, fornitore di campioni biologici, ha procurato campioni di quaranta donatori singoli. I campioni sono stati raccolti in apposite provette con EDTA e ACD. Questi campioni combinati sono stati conservati a 4°C e spediti, non congelati, alla struttura incar icata di svolgere i test. All'arrivo sono stati arricchiti con quattro livelli di HBV e testati per valutare l'equivalenza. I campioni sono stati arricchiti con il genotipo A o il genotipo C dell'HBV. Dopo l'arricchimento iniziale e i test, i campioni sono stati congelati per un minimo di 24 ore. Dopo questo periodo di conservazione in condizioni di congelamento, i campioni sono stati scongelati e nuovamente analizzati. Sono stati confrontati i risultati dei campioni freschi rispetto a quelli congelati e dell'EDTA rispetto al citrato, per valutare l'equivalenza tramite l'analisi della regressione. Questi dati dimostrano un'equivalenza eccellente fra i campioni freschi e congelati e fra i campioni trattati con EDTA e ACD.


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Tabella 14. Analisi della regressione dei risultati di equivalenza dei campioni

Parametro[Criteri di accettazione] Fresco vs. Congelato ACD vs. K2EDTA

Pendenza [0,9/-1,1] 1,002 0,996

Intercettazione [<0,5] -0,031 0,018

Coefficiente di determinazione [R2>0,95] 0,995 0,993

Stabilità dei campioni I campioni di plasma HBV-negativo trattato con EDTA sono stati arricchiti con virus HBV intatto a 3,7 log10 IU/ml e interrogati in tre momenti diversi: immediatamente (tempo 0), dopo 4 ore nel NeuMoDx System e dopo 8 ore nel NeuMoDx System. Non sono state osservate differenze significative nelle prestazioni, il che indica che una conservazione massima di 8 ore nel NeuMoDx System è accettabile. Sono state eseguite analisi simili anche con plasma conservato in frigorifero in laboratorio (fra 2 e 8°C) per un massimo di 7 giorni prima dei test e non sono state osservate differenze significative nelle prestazioni.

Infine sono stati testati campioni di plasma conservati a ≤ -18°C per un massimo di 6 mesi prima dell'elaborazione e non sono emerse differenze significative rispetto ai campioni freschi. È stato ripetuto il ciclo di congelamento/scongelamento e di nuovo non sono emerse variazioni nelle prestazioni dopo 2 cicli di congelamento/scongelamento. Correlazione dei metodi Le prestazioni qualitative e quantitative del NeuMoDx HBV Quant Assay sono state valutate rispetto ai test di confronto approvati FDA/CE, testando campioni clinici non diluiti provenienti da pazienti affetti da HBV. I test sono stati eseguiti internamente sul NeuMoDx tramite uno studio in singolo cieco, utilizzando campioni clinici ottenuti da tre laboratori di riferimento indipendenti. Nell'anal isi qualitativa sono stati compilati i risultati di un totale di 308 campioni HBV-positivi e negativi, per calcolare la sensibilità e specificità clinica del NeuMoDx HBV Quant Assay. L'analisi qualitativa è stata completata includendo ed escludendo i campioni positivi al di sotto del LLoQ, in quanto la classificazione di tali campioni bassi può variare attraverso i test. È stato usato un totale di 97 campioni clinici HBV-positivi che rientravano nel range lineare comune a entrambi i test per generare la regressione lineare per definire le prestazioni quantitative. Oltre a fornire eccellente sensibilità e specificità, la NeuMoDx H BV Quant Test Strip ha dimostrato una correlazione quantitativa eccellente con il test di confronto. In base a questi risultati, la sensibilità del NeuMoDx HBV Quant Assay è stata stimata come del 100% (IC 96,4-100%) e la specificità è stata stimata come del 95,6% (IC 91,9-97,7%). Questi intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati utilizzando il metodo di intervallo di confidenza con punteggio al 95% secondo la linea guida EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance, Approved Guideline, Vol. 28, N. 3.5

Tabella 15. Parametri di sensibilità e specificità clinica del NeuMoDx HBV Quant Assay sul NeuMoDx 288 Molecular System

Test di riferimento (POS)

Test di riferimento (NEG)

TOTALE

NeuMoDx HBV Quant Assay (POS)

103 9 112

NeuMoDx HBV Quant Assay (NEG)

0 196 196

TOTALE 103 205 308

SENSIBILITÀ = 100% IC 95% (96,4% - 100%) SPECIFICITÀ = 95,6% IC 95% (91,9% - 97,7%)

Tabella 16. Parametri di sensibilità e specificità clinica del NeuMoDx HBV Quant Assay sul NeuMoDx 288 Molecular System con campioni <LLoQ esclusi

Test di riferimento

(POS) Test di riferimento

(NEG) TOTALE


99 5 104


0 196 196

TOTALE 99 201 300

SENSIBILITÀ = 100% IC 95% (96,3% - 100%) SPECIFICITÀ = 97,5% IC 95% (94,3% - 98,9%)


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Figura 6: Studio correlazionale sul metodo quantitativo con l'uso del NeuMoDx HBV Quant Assay

Sono stati eseguiti ulteriori test sul NeuMoDx 96 Molecular System utilizzando 159 campioni clinici residui di plasma. Come con i test eseguiti in precedenza sul NeuMoDx 288, i risultati ottenuti dal NeuMoDx 96 sono stati confrontati con i risultati ottenuti dai test approvati a marcatura FDA e CE utilizzati dai laboratori di provenienza per i test dello standard di trattamento. I risultati, compresa la tabella della verità con la sensibilità e specificità clinica, sono presentati con IC 95% nella Tabella 17.

Tabella 17: Riepilogo delle prestazioni cliniche – NeuMoDx HBV Quant Assay sul NeuMoDx 96 Molecular System

Test di riferimento (POS) Test di riferimento (NEG) TOTALE


60 2 62


1 95 96

TOTALE 61 97 158

SENSIBILITÀ = 98% IC 95% (90% - 100%) SPECIFICITÀ = 98% IC 95% (92% - 100%)

RIFERIMENTI

1. Mother-to-child transmission of hepatitis B virus in sub-Saharan Africa: time to act. Andersson, Monique I et al..The Lancet Global Health , Volume 3 , Issue 7 , e358 - e359

2. Schillie S, Vellozzi C, Reingold A, et al. Prevention of Hepatitis B Virus Infection in the United States: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. MMWR Recomm Rep 2018;67(No. RR-1):1–31. DOI: http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.rr6701a1.

3. World Health Organization. Hepatitis B: fact sheet. April 2017. http://www.who.int (last accessed 20 November 2017) 4. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5 th edition. HHS Publication No.

(CDC) 21-1112, Revised December 2009

5. Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI). User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline – Second Edition. CLSI document EP12-A2; 2008

MARCHI COMMERCIALI

NeuMoDx™ è un marchio di fabbrica di NeuMoDx Molecular, Inc. TaqMan® è un marchio registrato di Roche Molecular Systems, Inc.

y = 1,02x - 0,20R² = 0,97

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 4 6 8 10N

euM

oD

x H

BV

Ass

ay

[lo

g 10

IU/m

l]

Test HBV di riferimento [log10 IU/ml]

http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.rr6701a1

http://www.who.int/


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SIMBOLI SIMBOLO SIGNIFICATO

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Dispositivo medico-diagnostico in vitro

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Marchio CE

NeuMoDx Molecular, Inc. 1250 Eisenhower Place Ann Arbor, MI 48108, USA Numero di contatto: 1-844-527-0111

Brevetto: www.neumodx.com/patents

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2797

http://www.neumodx.com/patents

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