nghiÊn cỨu sỬ dỤng nẤm lecanicillium · sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM

KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM

KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI

LUẬN VĂN ĐƯỢC THỰC HIỆN Ở VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2011

Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt

Trường Đại học KHTN i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền

Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng

nghiên cứu, sửa luận văn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất và thiết bị.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh đã hướng dẫn thí

nghiệm, trao đổi chuyên môn và chỉnh sửa luận văn cùng tập thể Phòng Công

nghệ Sinh học Enzyme đã giúp đỡ tận tình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô trong khoa Sinh học, trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho

tôi trong quá trình học tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Hậu cần, Bộ Quốc phòng đã cử tôi

đi đào tạo sau đại học.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn luôn động viên tinh thần để tôi

hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 11 năm 2011

Học viên

Vũ Xuân Đạt


Trường Đại học KHTN ii

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU.....................................................................................................1

1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................2

1.1 Rệp hại cây trồng ......................................................................................2

1.1.1 Đặc điểm sinh học..............................................................................2

1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới.............................................5

1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học ....................................................................8

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng............................................................8

1.2.2 Ưu và nhược điểm..............................................................................9

1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học ................................................11

1.3.1 Phân loại ..........................................................................................11

1.3.2 Ưu và nhược điểm............................................................................12

1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng.......................................13

1.3.4 Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium ..........17

1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng.....................................................18

1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium.....19

1.5.1 Nguồn carbon...................................................................................19

1.5.2 Nguồn nitơ .......................................................................................20

1.5.3 Nhiệt độ môi trường.........................................................................21

1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất ..................................................21

1.5.5 Một số yếu tố khác...........................................................................21

2 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................23

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị ....................................................................23

2.1.1 Chủng giống và plasmid...................................................................23

2.1.2 Hóa chất...........................................................................................23

2.1.3 Dung dịch và đệm ............................................................................24

2.1.4 Môi trường nuôi cấy.........................................................................24


Trường Đại học KHTN iii

2.1.5 Thiết bị ............................................................................................24

2.2 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................25

2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao .....................................25

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử...................................................27

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của

chủng nấm 485 ..............................................................................................29

3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................32

3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao.........................................................32

3.2 Định tên chủng nấm 485 .........................................................................34

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của

L. lecanii 485.....................................................................................................36

3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất..........................................................36

3.3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất .....................................37

3.3.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất .........................................................37

3.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất ..........................................................39

3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................40

3.3.6 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ ..........................................41

3.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 .................................................42

3.3.8 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4.......................................................43

3.3.9 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 .....................................................44

3.3.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng ................................................45

3.3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men.....................................................46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................50

PHỤ LỤC..................................................................................................60


Trường Đại học KHTN iv

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh.............................. 5

Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm ........................................................................... 24

Bảng 2.2. Các thiết bị ............................................................................................ 25


Trường Đại học KHTN v

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp............................................................................... 2

Hình 1.2. Rệp hại cây trồng ..................................................................................... 3

Hình 1.3. Vòng đời của rệp ..................................................................................... 4

Hình 2.1. Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm................................... 26

Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp cải ...................................................... 32

Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp.. ................................... 33

Hình 3.3. Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA................................................... 34

Hình 3.4. Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 (A) và cây phân loại (B).......... 35

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất................................................................ 36

Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường...................... 37

Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất ............................................................... 38

Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất................................................................ 39

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................... 40

Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ .............................................. 41

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 ..................................................... 42

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 .......................................................... 44

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 ......................................................... 45

Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng .................................................... 46

Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men ........................................................ 47


Trường Đại học KHTN vi

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume w/v weight/volume w/w weight/weight


Trường Đại học KHTN 1

MỞ ĐẦU

Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên

thế giới, phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới. Chúng kí

sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng

quan trọng như bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39].

Rệp không chỉ phá hoại trực tiếp bằng cách chích hút nhựa cây mà còn truyền virus

gây bệnh cho cây. Hàng năm, rệp cùng với các côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản

lượng cây trồng trên toàn thế giới [22]. Do tính chất nguy hại của rệp, việc sử dụng

các biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết.

Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng thuốc diệt

côn trùng hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng và hiệu quả tác dụng

nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị

kháng bởi côn trùng sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng

xấu đến sức khỏe con người. Với ưu điểm vượt trội về độ thân thiện với môi trường,

hệ sinh thái và sức khỏe con người, thuốc diệt côn trùng sinh học được coi là sự lựa

chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững.

Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên rệp và nhiều loài

côn trùng khác. Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên

cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã được

sản xuất và thương mại hóa. Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử

dụng thuốc diệt côn trùng sinh học còn hạn chế. Năm 2000, giá trị thương mại của

thuốc diệt côn trùng sinh học được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng

giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng. Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát

triển các chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium là cần thiết.

Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế của Phòng Công nghệ Sinh học

Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện KH và CN Việt Nam năm 2010-2013 do Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ quản, tôi thực hiện đề tài: "Nghiên

cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau".



1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rệp hại cây trồng

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Rệp (Aphidoidae) là một họ lớn thuộc lớp côn trùng, là các động vật không

xương sống, cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt,

mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin, chiều dài từ 1 đến

10 mm (hình 1.1). Khoảng 3700 loài rệp đã được biết đến trên thế giới [39].

Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp

Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố

tập trung nhất ở các vùng ôn đới [51], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng

nhiệt đới và cận nhiệt với độ đa dạng thấp hơn. Khoảng 250 loài rệp là côn trùng

phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát. Tuy nhiên, đứng

trên quan điểm động vật học, rệp là nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường

nhờ khả năng sinh sản vô tính [67].

Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng hoặc hầu như không

màu (hình 1.2). Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng

có cấu tạo kiểu chích hút. Khi chất dinh dưỡng của cây trở nên nghèo nàn hoặc mật

độ rệp quá đông, một số loài rệp sinh ra con có cánh để phát tán đi nơi khác. Nhiều

loài rệp chỉ kí sinh trên một loài cây duy nhất, một số khác chẳng hạn như Myzus

Mắt kép

Đầu Ngực Bụng

Râu

chân chân

chân Vòi chích hút

Đuôi Ống tiết

Mắt



persicae (rệp đào) có thể kí sinh trên hàng trăm loài cây thuộc nhiều họ khác nhau.

Khi chích hút, chúng truyền virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh ở một số cây

trồng như: khoai tây, ngũ cốc, củ cải đường, cam, quýt [36]. Những vết chích hút

bởi rệp trở thành nơi bị tổn thương dễ dàng bị nấm xâm nhập và gây bệnh cho cây.

A B C D

Hình 1.2. Rệp hại cây trồng

Myzus persicae (A và B), Aphis gossypii (C) và Aphis illinoisensis (D)

Ở rệp có cả hai kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính. Nhiều loài có sự thay đổi

giữa kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính khá phức tạp. Sự thay đổi giữa hai kiểu sinh

sản để sinh ra trứng hoặc ấu trùng, thay đổi giữa cây chủ thân gỗ và cây chủ thân

thảo. Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với sự thay đổi cây

chủ [51].

Mặc dù một số ít loài rệp có cả con đực và con cái, nhưng chỉ con cái có

trong quần thể. Vào mùa đông, khi nhiệt độ thấp trứng được sinh ra, mùa xuân

trứng nở thành rệp cái. Dạng sinh sản phổ biến ở rệp là đơn tính và sinh con, rệp

con sinh ra có các đặc điểm giống hệt rệp mẹ ngoại trừ kích thước. Quá trình sinh

con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ, thời gian sống của mỗi thế

hệ từ 20 đến 40 ngày, từ một rệp cái nở vào mùa xuân có thể sinh ra hàng nghìn rệp

con. Chẳng hạn, rệp bắp cải (Brevicoryne brassicae) có thể sinh ra 41 lứa rệp con

trong mùa sinh sản.



Hình 1.3. Vòng đời của rệp [75]

Vào mùa thu, khi có sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm

sút về nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái

con. Đặc điểm di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một

nhiễm sắc thể giới tính. Rệp con hữu tính có thể thiếu cánh, thậm chí thiếu vòi chích

hút [51]. Khi trưởng thành, rệp cái giao phối với rệp đực rồi đẻ trứng. Trứng sống

sót qua mùa đông khắc nghiệt rồi nở ra thành rệp cái có cánh hoặc không cánh (hình

1.3). Tuy nhiên, ở những môi trường ấm áp như vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính,

rệp có thể sinh sản vô tính qua nhiều năm [36].

Một số loài rệp có thể sinh ra rệp cái có cánh vào mùa hè khi nguồn thức ăn

hoặc chất lượng thức ăn giảm sút. Rệp cái có cánh di cư để sinh ra một quần thể

mới trên cây chủ mới, thường là khác loài với cây chủ ban đầu. Ví dụ như rệp táo

(Aphis pomi), sau khi sinh ra nhiều thế hệ rệp cái không cánh trên cây chủ điển hình

sẽ sinh ra dạng có cánh bay đi và kí sinh trên cỏ hoặc ngô. Đặc biệt, một số loài có

Mùa Đông

Mùa Hè

Mùa Xuân

Mùa Thu

Rệp cái ban đầu

Rệp cái vô tính không cánh

Rệp cái vô tính có cánh

Rệp cái vô tính sinh ra rệp hữu tính

Rệp cái không cánh

Rệp đực *

* có cánh hoặc không cánh

Trứng đình dục



thể sinh sản "lồng", khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì rệp cái con cũng chuẩn bị

sinh ra thế hệ tiếp theo đã có trong cơ thể nó. Cách sinh sản này có thể ảnh hưởng

đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản tăng lên [28], [59].

Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết bởi nhiều kẻ thù tự

nhiên như bọ rùa ăn rệp, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua,

vi khuẩn, virus, các loài nấm kí sinh côn trùng Neozygites fresenii, Entomophthora,

Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Lecanicillium lecanii.

1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới

Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn

trùng [22], ở Mỹ là 13% [63]. Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông

nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [54] thì có

đến 250 loài là rệp. Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan

trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và

rau cải. Nhiều loài rệp có khả năng kí sinh trên nhiều loại cây khác nhau như Aphis

gossypii, Myzus persicae và Aphis craccivora.

Theo thống kế của Tatchell (1989), rệp phá hoại nhiều loại cây trồng ở

Vương quốc Anh. Sản lượng bị thiệt hại thường ở mức 4-10%, và có thể lên đến

46% ở cây đậu (bảng 1.1). Ước tính giá trị thiệt hại lên đến 70 triệu bảng Anh.

Aphis gossypii (rệp bông) kí sinh trên 700 loại cây khác nhau trên toàn thế

giới, bao gồm nhiều cây quan trọng như dưa hấu, dưa chuột, bí xanh, bí ngô, ớt,

cam và quýt. Một trong những cây chủ bị A. gossypii phá hoại nhiều nhất là cây

bông vải (Gossypium hirsutum), thuộc nhóm cây công nghiệp quan trọng nhất thế

giới. Theo Xia (1997), sản lượng bông hàng năm ở Trung Quốc bị thiệt hại 10-15%

và chủ yếu là do A. gossypii [83]. Với sản lượng bông của Trung Quốc năm 2011 là

7,4 triệu tấn (http://www.cotton.org/econ/cropinfo/cropdata/rankings.cfm) thì con

số thiệt hại có thể lên đến 0,8-1,2 triệu tấn.

Bảng 1.1. Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh [78]



Loại cây Rệp gây hại Dạng gây hại Sản lượng bị thiệt hại (%)

Lúa mì đông Sitobion avenae

Metopolophium dirhodum

Phá hoại

Phá hoại

9,7-12,5

13

Lúa mạch đông Rhopalosiphum padi Truyền bệnh 0-86

Lúa mạch xuân M. dirhodum Phá hoại 8,8

Củ cải đường Myzus persicae Truyền bệnh 6,5

Khoai tây Macrosiphum euphorbiae

Myzus persicae

Phá hoại

Phá hoại

5,7

4,4

Các loại đậu Aphis fabae Phá hoại 16,4-46,3

Đậu Hà Lan Acyrthosiphon pisum Phá hoại 8,0-15,8

Cây hoa bia Phorodon humuli Phá hoại 9,2

Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất thế giới [5], nhưng năng

suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi A. glycines (rệp đậu tương). Sản lượng hạt bị thiệt

hại ước tính khoảng 34% [72], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con

số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72%. Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm

giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [18].

Đậu đũa (Vigna unguiculata) là loại cây được trồng nhiều ở châu Phi, ước

tính sản lượng hàng năm ở khu vực này khoảng 3,36 triệu tấn. Không giống bông

vải bị phá hoại chủ yếu bởi A. gossypii, đậu đũa bị phá hoại bởi nhiều loại rệp như

A. craccivora, A. leguminosae, A. laburni, A. fabae, Myzus persicae và cả

A. gossypii. Ở những khu vực không có biện pháp bảo vệ, sản lượng thiệt hại có thể

lên đến 20-100% [60].

Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là

các loại cải và cải dầu. Ngoài ra nó còn kí sinh trên cà chua và bí xanh. Ở phía đông

của miền trung Ấn Độ, L. erysimi cùng với M. persicae và Brevicoryne brassicae là

ba loài rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea). Trong đó L. erysimi



phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4-91,3% sản lượng [15], [76]. Theo

nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, L. erysimi

có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải dầu [61]. Trong một nghiên cứu khác,

Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng, Brevicoryne brassicae và L. erysimi cũng

gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [69]. Ngoài

cải dầu, B. brassicae còn phá hoại nhiều cây quan trọng khác như, súp lơ, cà rốt và

củ cải.

Myzus persicae kí sinh trên hàng trăm loại cây thuộc 40 họ khác nhau. Các

cây này phân bố rộng khắp thế giới, nhiều cây phân bố ở những vùng khá lạnh như

atisô, củ cải, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu. Củ cải đường, cà chua,

khoai tây cũng là những cây chủ bị M. persicae phá hoại [35].

Aphis craccivora (rệp đậu lăng) cũng là một loại rệp kí sinh trên nhiều cây

chủ khác nhau. Ngoài cây đậu đũa, chúng còn phá hoại nhiều cây khác như bông,

táo, cà rốt, rau diếp, lúa mì, đậu lăng. Hossain và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về

thiệt hại do A. craccivora gây ra trên cây đậu lăng, sản lượng bị thiệt hại cao nhất

lên đến 9% [40]. Cũng trong nghiên cứu này, sản lượng đậu lăng đã tăng

0,91-9,89% khi áp dụng biện pháp diệt rệp hoặc gieo trồng tránh rệp. Ước tính

A. craccivora còn gây thiệt hại 12,8-61,1% sản lượng đậu răng ngựa (Vicia faba) ở

Sids ARS, Beni-Suef Governorate, miền Trung Ai Cập [25].

Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do

truyền virus gây bệnh. A. craccivora truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu

răng ngựa, đậu gà [44], [58]. M. persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp

truyền virus gây bệnh rụng lá ở cây khoai tây [57], [77]. Rệp truyền virus gây bệnh

khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [79].

Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy

hiểm đối với cây lương thực. Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa

mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch. Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng

sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2% do D. noxia phá hoại [7].



Như vậy, với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có

biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết. Biện pháp kiểm soát rệp

và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng

hóa chất diệt côn trùng tổng hợp. Cho đến nay, đây vẫn là biện pháp được sử dụng

chủ yếu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển.

1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng

Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn trong thuốc bảo vệ thực

vật. Chúng có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp hoàn toàn trong các nhà máy

hóa chất, được sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, hoặc phi nông

nghiệp để tiêu diệt các vectơ truyền bệnh cho người và vật nuôi như ruồi, muỗi.

Từ 2000 năm trước công nguyên con người đã biết sử dụng thuốc diệt côn

trùng có nguồn gốc tự nhiên để bảo vệ mùa màng [52], nhưng việc sử dụng chỉ trở

nên phổ biến khi các hóa chất diệt côn trùng được tổng hợp dễ dàng trong các nhà

máy hóa chất, đặc biệt là sau khi Paul Hermann Müller khám phá ra khả năng diệt

côn trùng mạnh mẽ của DDT vào năm 1939. Từ 1945 đến 1975, lượng thuốc bảo vệ

thực vật được sản xuất ở Mỹ tăng 40 lần, từ 15,9 nghìn tấn/năm lên 636,3 nghìn

tấn/năm. Năm 1975, ước tính toàn thế giới đã sản xuất 1,7 triệu tấn thuốc bảo vệ

thực vật với giá trị thương mại khoảng 3,9 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng

chiếm 32% [71].

Năm 1997 toàn thế giới sử dụng 2,58 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật với giá

trị 37,0 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm 0,67 triệu tấn với giá trị

11,6 tỉ đô la Mỹ [11]. Năm 2001 các con số trên lần lượt là 2,29 triệu tấn; 31,8 tỉ đô

la Mỹ; 0,57 triệu tấn; 8,8 tỉ đô la Mỹ [45]. Và năm 2007 là 2,37 triệu tấn; 39,4 tỉ đô

la Mỹ; 0,40 triệu tấn; 11,2 tỉ đô la Mỹ [31].



Ở Việt Nam, lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng càng ngày càng tăng:

từ 10300 tấn lên 33000 tấn vào đầu những năm 1990, đến năm 2003 tăng lên 45000

tấn và năm 2005 là 50000 tấn (http://www.donre.hochiminhcity.gov.vn).

Mặc dù thế giới đã cố gắng cắt giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử

dụng nhưng kết quả đạt được còn hạn chế. Khối lượng thuốc bảo vệ thực vật được

sử dụng trên toàn thế giới năm 2007 so với năm 1997 chỉ giảm 8%. Tuy nhiên, kết

quả đạt được với thuốc diệt côn trùng tương đối khả quan, trong cùng thời gian trên

khối lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng đã giảm 40%.

1.2.2 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học là dễ sản xuất ở quy mô lớn với

giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy

nhiên, chúng ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn

trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con

người.

Thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc diệt côn trùng nói riêng được sử

dụng tràn lan làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và kháng thuốc. Hiệu

quả của viêc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngược lại với chi phí ngày càng cao

[17]. Ước tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài vi sinh vật gây bệnh cây và

273 loài cỏ dại đã kháng lại thuốc (http://www.nd.edu/%01chem191/e2.html).

Một số thuốc diệt côn trùng có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun

cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nước ngầm. Các chất này

khi đã ngấm vào đất, vào nước ngầm sẽ tồn tại lâu dài vì trong đất có rất ít vi sinh

vật phân hủy chúng và mỗi năm chỉ 1% lượng nước ngầm được hồi phục. Điều

đáng lo ngại là nhu cầu nước ngọt của một nửa dân số thế giới được đáp ứng từ

nước ngầm [19], do đó nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng rất cao.

Một lượng thuốc diệt côn trùng sau khi được sử dụng trên đồng ruộng sẽ

theo kênh thoát nước đi vào các thủy vực. Tại đây chúng giết chết các sinh vật phù



du, làm giảm nguồn cung cấp thức ăn cho cá hoặc giết chết cá, làm giảm sút nguồn

lợi thủy sản. Trong trường hợp cá bị nhiễm độc nhưng không chết sẽ gây độc gián

tiếp cho người ăn phải.

Thuốc diệt côn trùng tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng cũng có

nghĩa là có tính chọn lọc kém. Chúng không chỉ tiêu diệt các côn trùng gây hại mà

còn tiêu diệt cả những loài có ích như động vật ăn côn trùng, các loài kí sinh côn

trùng hại cây trồng [65], tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm cho

nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lượng [56].

Thuốc diệt côn trùng được sử dụng nhằm mục đích tăng năng suất cây trồng,

nhưng đôi khi nó lại làm giảm năng suất. Điều này xảy ra khi các chất này ức chế sự

phát triển bình thường của cây trồng, thuốc được phun cho các cây trồng mục tiêu

nhưng lại bị phát tán do gió gây thiệt hại cho những cây trồng ở vùng lân cận, nông

sản bị đổ bỏ vì dư lượng hóa chất độc hại vượt mức cho phép [64]. Bên cạnh đó, đất

trồng trọt có độ tơi xốp cao nên thuốc diệt côn trùng dễ ngấm vào đất. Trong đất có

nhiều loài sinh vật cần thiết cho hệ sinh thái đất trồng như động vật chân đốt, động

vật nguyên sinh, giun đất, nấm, vi khuẩn [66]. Thuốc diệt côn trùng sẽ gây độc và

làm đảo lộn hệ sinh thái đất, dẫn đến giảm năng suất cây trồng.

Việc lạm dụng thuốc diệt côn trùng làm cho thực phẩm bị nhiễm độc [87]

gây ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho người sử dụng. Trên thế giới, hàng năm có

khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc (không tử vong) thuốc bảo vệ thực vật [70]

(trong đó có thuốc diệt côn trùng), 750 nghìn trường hợp ngộ độc mạn tính, 3 triệu

trường hợp phải nhập viện và 200 nghìn trường hợp tử vong [34].

Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu người thường xuyên phơi nhiễm với thuốc

bảo vệ thực vật (http://ca.cand.com.vn). Theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng và

Môi trường - Bộ Y tế, năm 2009 có 4515 trường hợp bị nhiễm độc thuốc bảo vệ

thực vật trong đó có 138 trường hợp tử vong (http://www.thuocbietduoc.com.vn).

Con số trên mới chỉ là kết quả thống kê được đối với các trường hợp đã nhập viện.



Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, người phơi nhiễm thuốc trừ sâu và các loại

thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp khác có thể tăng nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn

cảm giác, rối loạn trí nhớ [34], hen suyễn, viêm xoang mạn tính, viêm phế quản

mạn tính [82], rối loạn chức năng tinh hoàn hoặc vô sinh [20], đột biến gene [41],

u lympho không Hodgkin [38], bệnh máu trắng, ung thư da, ung thư thực quản,

ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư vú,

ung thư tiền liệt tuyến và bàng quang [8], [14]. Thời gian phơi nhiễm càng nhiều thì

nguy cơ mắc các bệnh này càng tăng lên.

Vì những nhược điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung trên

thế giới hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có

nguồn gốc sinh học để thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững.

1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học

1.3.1 Phân loại

Thuốc diệt côn trùng, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ bệnh được gọi chung là thuốc

diệt hại. Thuốc diệt hại sinh học là các chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Chúng là

các cơ thể sống như vi khuẩn, nấm, động vật hay các chất được tách chiết từ sinh

vật như protein, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Theo EPA, Hoa Kỳ

(2011), thuốc diệt hại sinh học được chia thành ba nhóm chính

(http://www.epa.gov):

1. Thuốc diệt hại có nguồn gốc vi sinh vật: thành phần có hoạt lực diệt hại là

các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus hoặc động vật nguyên sinh). Thuốc diệt hại

nguồn gốc vi sinh vật được dùng để kiểm soát nhiều loại gây hại khác nhau như côn

trùng, cỏ dại. Protein độc của vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) hay các sản phẩm

trao đổi chất khác của vi sinh vật cũng thuộc nhóm này.

2. Các yếu tố bảo vệ được chuyển vào thực vật (plant incorporated

protectants, PIPs): là các chất diệt hại thực vật vốn không sản xuất được, nhưng do

nhận được gene ngoại lai nên thực vật có khả năng sản sinh ra để tự bảo vệ. gene



mã hóa protein độc của B. thuringensis là một ví dụ điển hình được chuyển vào thực

vật [86].

3. Các chất diệt hại hóa sinh: là các hợp chất kiểm soát dịch hại bằng cơ chế

không độc. Không giống các thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp trực tiếp giết chết hoặc

ức chế dịch hại, các chất diệt hại hóa sinh có thể là pheromone giới tính ức chế

trưởng thành giới tính, ức chế sự giao phối của côn trùng [50] từ đó kiểm soát được

dịch hại, hoặc là các chất được chiết từ thực vật có khả năng dẫn dụ được dùng để

bẫy côn trùng.

1.3.2 Ưu và nhược điểm

Mặc dù có một số nhược điểm như giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực

không mạnh bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh

hưởng nhiều bởi các điều kiện ngoại cảnh, nhưng với các ưu điểm vượt trội so với

hóa chất tổng hợp về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con

người, các chế phẩm sinh học ngày càng được nhận được nhiều sự quan tâm trong

nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp.

Các chế phẩm sinh học tác dụng có chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên

một hay một số loài côn trùng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số

ít thiên địch và các sinh vật có ích khác. Do vậy, các hệ sinh thái được phun các chế

phẩm này không bị xáo trộn, đảm bảo sự ổn định bền vững của đất trồng trọt. Chế

phẩm khi phát tán sang các khu vực lân cận cũng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến

cây trồng ở đó.

Các chế phẩm chứa yếu tố diệt côn trùng là vi sinh vật có khả năng duy trì

hiệu quả kéo dài, chúng không chỉ tiêu diệt lứa côn trùng đang phá hoại mà còn lây

nhiễm trên côn trùng từ thế hệ này sang thế hệ khác.

Do có tác dụng chọn lọc đến côn trùng gây hại, các chế phẩm sinh học sẽ

không được sử dụng tràn lan, do vậy nguy cơ kháng thuốc của côn trùng sẽ được



giảm thiểu, mỗi chế phẩm được sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm mới thay thế.

Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ thể sống hoặc có

nguồn gốc từ cơ thể sống, chúng dễ bị phân hủy thành các chất không độc sau một

thời gian ngắn sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nước, không khí. Vì các chế phẩm

này đã được chọn lọc để tác dụng đến từng loài côn trùng nhất định, trong trường

hợp các cơ thể sống từ chế phẩm còn tồn tại được trên các nông sản cũng không gây

ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nếu phát tán vào các thủy vực, các chế phẩm

này ít gây ảnh hưởng xấu đến các sinh vật ở đó và do vậy không làm giảm giá trị

khai thác nguồn lợi thủy sản cũng như sự cân bằng của hệ sinh thái.

1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng

Hầu hết các loài côn trùng gây hại đều có thể bị nhiễm bệnh bởi các vi sinh

vật [54]. Trong tự nhiên, hiện tượng các vi sinh vật nhiễm bệnh và kiểm soát số

lượng côn trùng là phổ biến, ví dụ như bọ xít hại vải, nhãn bị nhiễm tự nhiên và bị

giết bởi nấm Beauveria bassiana. Đó chính là cơ sở khoa học vững chắc cho việc

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học diệt côn trùng.

A. Thế giới

Sự đóng góp đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh

vật là của Mechnikoff (1879) và Krassilnikow (1888), khi lần đầu tiên trình bày các

nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae để

diệt côn trùng gây hại ngũ cốc và củ cải đường. Năm 1914, lần đầu tiên d’Herelle

thử nghiệm kiểm soát côn trùng bằng vi khuẩn [54]. Cho đến năm 2001, có khoảng

195 yếu tố diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã được đăng kí với

780 sản phẩm khác nhau (http://www.epa.gov).

ENomita và Azaguard Tech là các chất được chiết từ thực vật. ENomita chứa

chất furoflavone chiết từ cây karanjin tác dụng lên ve bét và các côn trùng chích

hút. Azaguard Tech là chế phẩm chiết từ hạt neem, tác dụng lên hơn 400 loài côn



trùng khác nhau nhưng không ảnh hưởng đến côn trùng có lợi. Các chất này kiểm

soát sự sinh trưởng và do đó kiểm soát số lượng côn trùng.

Bacillus thuringensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm

soát côn trùng sớm nhất. Năm 1901, Ishiwatari phát hiện ra một loại vi khuẩn gây

bệnh chết đột ngột ở tằm và đặt tên là Bacillus sotto. Năm 1911, Berliner phát hiện

ra vi khuẩn này giết chết mọt bột mì và đặt tên lại là Bacillus thuringensis. Chế

phẩm từ B. thuringensis (thường được gọi là Bt) bắt đầu được sử dụng để diệt côn

trùng từ năm 1920 (http://www.bt.ucsd.edu/bt_history.html). Bt được đăng kí để sử

dụng làm thuốc diệt côn trùng lần đầu tiên ở Mỹ từ năm 1961, và được đăng kí lại

vào năm 1998 (http://npic.orst.edu/ingred/aifact.html). Năm 2007, Ahmad và cộng

sự (2007) đã so sánh khả năng diệt rệp của Bt với một số hóa chất tổng hợp. Kết

quả cho thấy, Bt làm giảm 70% số lượng rệp, xấp xỉ với hiệu quả của các hóa chất

này [6].

Cho đến nay, có một số sản phẩm Bt thương mại như Able™, Biobit®,

Cutlass™, Dipel®, Foray®, Javelin®, Thuricide®, Vectobac® đã được sử dụng để

bảo vệ cây trồng. Larvorid là sản phẩm chứa protein độc của

B. thuringiensis, tác dụng lên mọt và ruồi trắng. Khi ăn phải độc tố của

B. thuringensis, côn trùng không tiêu hóa được thức ăn và chết.

Gindin và cộng sự (2006) đã nghiên cứu khả năng diệt mọt cọ

Rhynchophorus ferrugineus của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana.

Kết quả cho thấy, sau 1 tuần M. anisopliae diệt được 100% ấu trùng trong khi

B. bassiana diệt được 80-82% ấu trùng và trứng của mọt cọ [29].

Kim và cộng sự (2001) sử dụng B. bassiana và Verticillium lecanii để kiểm

soát rệp bông Aphis gossypii. Kết quả cho thấy chủng B. bassiana CS-1 diệt được

50% rệp sau 4,6-4,7 ngày và sau 5 ngày diệt được 64-75%. Chủng V. lecanii

CS-625 diệt rệp tốt hơn, diệt được 50% rệp chỉ sau 2,7-3,3 ngày và diệt được

97-100% sau 5 ngày. V. lecanii cũng được sử dụng để kiểm soát ruồi trắng



Trialeurodes vaporariorum. Sau 7 ngày phun, ruồi trắng bị diệt 98% ở 25°C, xấp

xỉ 80% ở 15°C và 35°C bởi chủng V. lecanii CS-626 [47].

Lecanicillium muscarium trong nghiên cứu của Cuthbertson và cộng sự

(2010) đã được làm tăng hiệu quả diệt bướm khoai lang (Bemisia tabaci) nhờ phụ

gia. Từ dung dịch bào tử nấm chỉ diệt được xấp xỉ 60%, sau khi được trộn thêm dầu

và phụ gia, hỗn hợp này diệt được 95% B. tabaci [21]. Trong nghiên cứu của Park

và cộng sự (2010), chủng Lecanicillium sp. 4078 diệt được trứng, ấu trùng và con

trưởng thành của B. tabaci với các tỉ lệ lần lượt là 77,68 ± 12,01%, 75,55 ± 6,68%

và 93,33 ± 11,55%. Còn trong nghiên cứu của Guclu và cộng sự (2010),

L. muscurium có thể diệt 60-75% bướm Ricania simulans sau 7 ngày phun [32].

Nấm kí sinh không chỉ được nghiên cứu để diệt côn trùng gây hại cây trồng,

mà còn được nghiên cứu để diệt các côn trùng kí sinh truyền bệnh cho người và vật

nuôi. Angelo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu khả năng kiểm soát rận

Rhipicephalus microplus của L. lecanii. Trong hỗn hợp với phụ gia, bào tử nấm

L. leacnii diệt được 97,6% R. microplus trước khi rận kịp đẻ trứng [9]. Bukhari và

cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng kiểm soát ấu trùng muỗi Anopheles truyền

bệnh sốt rét của Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae. Hỗn hợp bào tử

của hai chủng nấm này diệt được 39-50% ấu trùng muỗi [16].

Trên thế giới hiện đã có nhiều chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm kí

sinh côn trùng được thương mại hóa. Theo thống kê của de Faria và cộng sự (2007),

có ít nhất 12 loài (hoặc dưới loài) nấm được ứng dụng để sản xuất chế phẩm diệt

côn trùng. Sản phẩm dựa trên B. bassiana (33,9%), M. anisopliae (33,9%),

Lecanicillium spp. (9,4%), Isaria fumosorosea (5,8%), và B. brongniartii (4,1%) là

phổ biến nhất trong số 171 sản phẩm được thống kê. Trong đó 75% số sản phẩm đã

được thương mại hóa, 15% hiện không còn được sử dụng và 10% hiện chưa biết

thông tin [23].

Beevicide và LarvoEnd là hai trong số các sản phẩm thương mại chứa bào tử

B. bassiana. Đích tác dụng là sâu đục thân, sâu đục quả, bọ trĩ, sâu cuốn lá, bướm



đêm. TermoENd chứa M. anisopliae, tác dụng lên mối, kiến, bọ cánh cứng hại mía,

ấu trùng hại rễ cây và ruồi quả. Grubkill và Bioter là các chế phẩm chứa cả nấm kí

sinh côn trùng và vi khuẩn, tác dụng lên các côn trùng chích hút, sâu đục thân và

côn trùng thân cứng. Biomite: chứa hỗn hợp của V. lecanii và một số sinh vật kí

sinh khác, tác dụng lên ve bét phá hoại mùa màng. Cơ chế diệt côn trùng của các

chế phẩm này: Nấm tiết ra enzyme phân giải biểu bì côn trùng, sợi nấm đâm vào cơ

thể côn trùng, kí sinh, hình thành bào tử và giết chết côn trùng sau 5-7 ngày phun.

Liều sử dụng: 250 ml chế phẩm (2×108 CFU/ml) cho 4000 m2 cây trồng.

B. Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng

của vi sinh vật. Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2007) đã nghiên cứu khả năng diệt

sâu khoang hại rau cải của M. anisopliae. Kết quả chủng nấm này diệt được trên

70% sâu khoang sau 7 ngày phun [2]. Ho và cộng sự (2010) nghiên cứu khả năng

diệt rầy nâu trên lúa của M. anisopliae. Kết quả là 74,8-84,3% rầy nâu bị diệt trong

khi chi phí chỉ bằng 24,4% so với sử dụng hóa chất tổng hợp [37]. Phạm Thị Thùy

và cộng sự (2005) đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi

nấm sử dụng Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương và đậu

xanh [3], Nguyễn Dương Khuê (2005) đã sử dụng M. anisopliae để phòng trừ mối

nhà [1].

Mặc dù đã được nghiên cứu từ gần 100 năm qua, nhưng việc ứng dụng các

chế phẩm diệt côn trùng sinh học trong nông nghiệp vẫn còn hạn chế. Tổng lượng

chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng năm 2000 trên toàn thế giới có giá

trị thương mại khoảng 160 triệu đô la Mỹ (chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại

thuốc diệt côn trùng), trong đó riêng chế phẩm Bt chiếm hơn 90%. Tuy nhiên, việc

ứng dụng các chế phẩm sinh học sẽ tăng trưởng mạnh trong tương lai. Ở châu Âu và

Mỹ, nhiều chế phẩm mới có phổ tác dụng rộng đã được thương mại hóa và lượng

bán ra tăng theo từng năm. Ngoài ra, nhiều dự án và nghiên cứu đang được thực

hiện để phát triển các chế phẩm diệt côn trùng từ các vi sinh vật như Bacillus



thuringensis, B. popilliae, V. lecanii, M. anisopliae, Beauveria bassiana và

Paecilomyces. Theo dự báo của công ty tư vấn Chuck Benbrook, chế phẩm sinh học

được sử dụng sẽ tăng 5-7,5 lần sau năm 2013 (http://eng.coa.gov.tw), [45].

1.3.4 Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium

Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota,

lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Lecanicillium trước đây

được gọi là Verticillium lecanii [85]. Cùng trong họ Clavicipitaceae với chi nấm

Lecanicillium còn có một chi nấm kí sinh côn trùng khác là Metarhizium.

Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng

như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [12], [30],

[33], [43], [53]. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực

tiếp của bào tử với côn trùng. Sau khi bám trên vỏ côn trùng (chitin), các bào tử nảy

mầm rồi tiết enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu bì, kết hợp với áp lực

nảy mầm của bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể. Tại

đây, sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết

các độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng. Kết quả là côn trùng bị tổn thương,

bị đa nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác. Sau khi côn trùng

chết, nấm tiếp tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây

truyền bệnh cho côn trùng khác [54].

Vu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium spp. phân

lập từ rệp Myzus persicae để kiểm soát M. persicae và Aphis gossypii. Trong điều

kiện phòng thí nghiệm, 100% M. persicae và A. gossypii đã bị diệt sau 4-5 ngày

phun. Trong nhà kính, A. gossypii đã bị diệt 78% sau 14 ngày phun.

Trong một nghiên cứu khác, Kim và cộng sự (2008) đã sử dụng

L. attenuatum CNU-23 để kiểm soát M. persicae. Trong phòng thí nghiệm,

L. attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp sau 3,7 ngày phun và 80% sau 7 ngày

phun. Khi thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà kính, chủng nấm này diệt

được 72-97% rệp sau 12 ngày phun [46].



Năm 2009, Diaz và cộng sự đã khảo sát độc lực của L. lecanii đối với một số

loài rệp. Kết quả là chủng này diệt được 95% M. persicae, trong khi sản phẩm

thương mại Vertalec® chỉ diệt được 91,6% [24].

Có nhiều sản phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc từ Lecanicillium đã được

thương mại hóa. Một số sản phẩm tiêu biểu như Vertalec, Verelac, Mycotal,

Enverto. Liều sử dụng: 250 ml chế phẩm (2×108 CFU/ml) cho 4000 m2 cây trồng.

Côn trùng chết sau 5-7 ngày phun. Các chế phẩm này không chỉ có tác dụng lên rệp

mà còn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác như ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét.

Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm

Lecanicillium rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ cây

trồng cũng như kết quả đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam. Hiệu quả diệt côn

trùng của chế phẩm Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém,

khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng

thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng cường

nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết.

1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng

Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh

côn trùng. Việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là

cần thiết để sản xuất được nhiều bào tử với hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay có hai

phương pháp lên men phổ biến nhất là lên men lỏng và lên men rắn.

Phương pháp lên men lỏng có ưu điểm là dễ pha môi trường lên men với độ

đồng nhất cao, có thể tiếp giống liên tục và đơn giản, dễ dàng kiểm soát pH. Tuy

nhiên, phương pháp này có nhược điểm là yêu cầu thiết bị và vận hành phức tạp,

đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, sử dụng nhiều

năng lượng và nước, nhiều nước thải, khó xử lí khi bị tạp nhiễm và có nguy cơ phải

bỏ đi hỗn hợp lên men trong một bồn lên men lớn, chi phí đầu tư thiết bị và vận

hành lớn [68]. Bênh cạnh đó, bào tử thu được nhanh chóng mất khả năng sống sót

trong quá trình bảo quản [48], [73].



Phương pháp lên men rắn mặc dù có một số nhược điểm là khó khăn trộn

môi trường lên men, môi trường lên men có độ đồng nhất không cao, khó tiếp giống

và phải tiếp giống theo từng đợt, việc kiểm soát pH khá phức tạp, độ ẩm cơ chất liên

tục thay đổi trong quá trình lên men, khả năng truyền nhiệt của cơ chất kém. Nhưng

nó có nhiều ưu điểm quan trọng như yêu cầu thiết bị và vận hành đơn giản, có thể

tận dụng các nguồn cơ chất không tan trong nước và sản phẩm phụ của nông nghiệp

với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề mặt lên men rộng nên dễ trao

đổi nhiệt và không khí, không đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các thông số trong quá

trình lên men, tiêu thụ ít nước và năng lượng, ít nước thải, dễ dàng kiểm soát sự tạp

nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành rẻ [68].

Từ những ưu điểm và nhược điểm của hai phương pháp lên men, phương

pháp lên men rắn được coi là phương pháp phù hợp cho việc sản xuất bào tử nấm để

phối trộn với phụ gia tạo thành chế phẩm [42]. Phương pháp lên men rắn được áp

dụng để lên men các chi nấm kí sinh côn trùng như Beauveria, Metarhizium,

Trichoderma và Lecanicillium [68], [74], [81].

Trong quá trình lên men, cũng giống như các nấm khác, sự sinh bào tử của

Lecanicillium chịu ảnh hưởng chủ yếu của một số yếu tố như nguồn cơ chất, nguồn

carbon và nitơ bổ sung, chất khoáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ thoáng khí và ánh sáng.

1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium

1.5.1 Nguồn carbon

Cùng với nitơ, chất khoáng và nước, carbon là một trong bốn yếu tố không

thể thiếu đối với mọi loài nấm cũng như vi sinh vật. Tuy nhiên, nồng độ carbon

trong môi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật.

Gao và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ carbon trong

môi trường lên sự sinh bào tử của một số chủng nấm. Kết quả cho thấy, nồng độ

carbon tốt nhất cho khả năng sinh bảo tử của chủng nấm Lecanicillium lecanii

CA-1-G và M. anisopliae RS-4-1 là 4 g/l, Paecilomyces lilacinus IPC-P là 1 g/l,



P. lilacinus M-14 là 2 g/l, Metarhizium anisopliae SQZ-1-21 là 16 g/l, Trichoderma

viride TV-1 là 2 g/l [27].

Trong thực tế, nguồn carbon được sử dụng có thể là glucose, lactose, bột

ngô, bột gạo, bột mì. Trong trường hợp nguồn carbon là bột ngũ cốc thì ngoài khả

năng cung cấp cacbon, chúng còn cung cấp cả nitơ, chất khoáng và giữ luôn vai trò

là giá thể. Shi và cộng sự (2009) đã dùng bột ngô, cám mì là nguồn carbon để sản

xuất bào tử nấm Verticillium lecanii [74]. Feng và cộng sự (2000) đã dùng gạo và

cám gạo để sản xuất bào tử nấm V. lecanii [26]. Pham và cộng sự (2010) đã sử dụng

gạo làm nguồn carbon để sản xuất bào tử nấm Beauveria bassiana [62].

1.5.2 Nguồn nitơ

Nitơ được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau như muối ammonium, muối

nitrate, peptone, cao nấm men, bột đậu tương hay chitin. Nguồn nitơ nào phù hợp

cho sự sinh bào tử tùy thuộc vào từng chủng nấm. Nồng độ nitơ tối ưu cho sự sinh

bào tử của nấm còn phụ thuộc vào tỉ lệ của nó so với cacbon.

Trong nghiên cứu về sự ảnh hưởng của tỉ lệ C:N lên sự sinh bào tử của một

số chủng nấm, Gao và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng tỉ lệ C:N phù hợp cho chủng

nấm Lecanicillium lecanii CA-1-G, Paecilomyces lilacinus IPC-P và Metarhizium

anisopliae RS-4-1 là 5:1, P. lilacinus M-14 và Trichoderma viride TV-1 là 10:1,

M. anisopliae SQZ-1-21 là 80:1 [27]. Tuy nhiên, trong môi trường có nguồn dinh

dưỡng tự nhiên là bột ngũ cốc, peptone, cao nấm men thì rất khó kiểm soát được

hàm lượng nitơ cũng như tỉ lệ C:N.

Shi và cộng sự (2009) đã dùng cao nấm men, peptone, bột đậu tương làm

nguồn carbon để lên men Verticillium lecanii, kết quả là chủng nấm này sinh bào tử

cao nhất với nguồn nitơ là cao nấm men [74]. Vu và cộng sự (2008) đã chọn được

KNO3 với nồng độ 0,6% làm nguồn nitơ phù hợp cho sự sinh bào tử của

Lecanicillium lecanii 41185 [81].



1.5.3 Nhiệt độ môi trường

Dựa vào khoảng nhiệt độ thích nghi, vi sinh vật được chia ra thành 3 nhóm.

Nhóm ưa lạnh sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dưới 15°C, nhóm ưa ấm sinh trưởng tốt ở

20-37°C, nhóm ưa nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở trên 50°C. Phần lớn nấm là

vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt nhất ở 25-30°C.

Nấm Lecanicillium spp. trong nghiên cứu của Kope và cộng sự (2008) sinh

trưởng tốt nhất ở 25°C [49]. Chủng L. lecanii 41185 trong nghiên cứu của Vu và

cộng sự (2008) sinh bào tử cao nhất ở 25°C [81]. Trong khi trong nghiên cứu của

Arevalo và cộng sự (2009), L. psalliotae sinh trưởng tốt nhất ở 30°C [10].

1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất

Nước là yếu tố không thể thiếu đối với mọi sinh vật nói chung và nấm nói

riêng bởi vì tất cả phản ứng sinh hóa ở các cơ thể sống đều diễn ra trong môi trường

nước. Nhìn chung, nấm có thể sinh trưởng trong giới hạn độ ẩm khá rộng, nấm sinh

trưởng được trên gạo có độ ẩm 20% hay trong môi trường dinh dưỡng lỏng hoàn

toàn. Tuy nhiên, mỗi loài nấm đòi hỏi độ ẩm tối ưu khác nhau, trên mỗi loại cơ chất

thì độ ẩm tối ưu cho nấm phát triển cũng khác nhau.

Theo Vu và cộng sự (2008), chủng L. lecanii 41185 sinh bào tử cao nhất ở

độ ẩm không khí 75% và độ ẩm cơ chất 28,5% [81]. Trong nghiên cứu của Shi và

cộng sự (2009), Verticillium lecanii được lên men ở độ ẩm không khí 97%, độ ẩm

cơ chất là 7 ml nước/2 g bã mía [74]. Trong thí nghiệm của Xu và cộng sự (2011),

V. lecanii cũng được lên men ở độ ẩm cơ chất 7 ml nước/2 g bã mía, nhưng độ ẩm

không khí là 95% [84].

1.5.5 Một số yếu tố khác

Trong môi trường lên men rắn, nguồn cơ chất tự nhiên như bột gạo, bột ngô,

bột đậu tương, lõi ngô ngoài khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng (cacbon, nitơ,

khoáng), chúng còn ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của Lecanicillium vì mỗi nguồn

cơ chất sẽ tạo độ thoáng khí, khả năng trao đổi nhiệt cho môi trường lên men khác

nhau. Trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), Verticillium lecanii sinh bào tử



trên cơ chất bã mía tốt hơn trên cơ chất cám mì [74]. Từ nhiều nguồn cơ chất như

cám mì, gạo, trấu, than bùn, gạo trộn cám gạo, gạo trộn bột mì, gạo trộn gạo tấm,

Vu và cộng sự (2008) đã chọn được gạo là nguồn cơ chất tốt nhất để lên men

Lecanicillium sản xuất bào tử [81].

Mặc dù chất khoáng có mặt khá đầy đủ trong các môi trường giàu hay môi

trường tự nhiên nhưng tùy thuộc vào thành phần môi trường mà hàm lượng chất

khoáng khác nhau và có thể không tối ưu cho việc sinh bào tử của Lecanicillium.

Trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2008), chủng L. lecanii 41185 sinh bào tử cao

nhất khi môi trường được bổ sung 0,6% KNO3 và 0,02% MgSO4 [81]. Chủng

V. lecanii trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009) lại sinh bào tử cao nhất khi

môi trường được bổ sung 0,163% KH2PO4, 0,0325% K2HPO4 và 0,0325% MgSO4

[74].

Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của nấm

Lecanicillium như pH, độ thoáng khí hay ánh sáng.



2 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Chủng giống và plasmid

Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 do

Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN

Việt Nam cung cấp.

Chủng E. coli DH5α (Invitrongen, Mỹ) được sử dụng để nhân plasmid.

Plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas, Litva) kích thước 2974 bp, có T7

promoter, gene kháng kháng sinh ampicillin (Ampr).

Rệp hại rau lấy trên rau cải ngoài đồng ruộng sau đó được nuôi trên cải thảo

trong phòng thí nghiệm. Dựa trên các đặc điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước

đầu được nhận định thuộc loài Myzus persicae.

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: Agarose

từ Rockland (Mỹ); Tween 80, chloroform/isoamyl aclohol (24:1) của Merck (Đức);

Ethidium bromide, T4 ligase, Taq polymerase, protease K, RNase, enzyme giới hạn

của Fermentas (Litva); mồi của Invitrogen (Mỹ), ampicillin của Mekopha (Việt

Nam).

Các hóa chất khác để pha môi trường: Peptone của Merck; cao nấm men của

Difco (Mỹ); NaNO3, KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, KH2PO4

của Trung Quốc; glucose của Việt Nam.

Một số vật liệu cần thiết khác như cải thảo, khoai tây, gạo, ngô, cám gạo, lõi

ngô, bã mía được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội.



2.1.3 Dung dịch và đệm

Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8

Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K

Dung dịch RNase 10 μg/ml RNase

Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) Brommophenol Blue; 0,09% (w/v) xylene

xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol

Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8

Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0

Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8

Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS

Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid acetic

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PD (potato dextrose) (g/l): 20, khoai tây, đun sôi cách thủy

2 giờ thu dịch chiết; 10, glucose; 5,7 KNO3.

Môi trường PDA (potato dextrose agar): môi trường PD được bổ sung

20 (g/l) agar.

Môi trường LB (Luria-Bertani) (g/l): 10, peptone; 5, cao nấm men;

10, NaCl; pH 7,5. Môi trường rắn được bổ sung 20 agar. Môi trường chọn lọc

khuẩn lạc mang plasmid được bổ sung 100 g/ml ampicillin.

2.1.5 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện

Công nghệ sinh học, Viện KH và CN Việt Nam (bảng 2.2).



Bảng 2.2. Các thiết bị

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Bể ổn nhiệt Trung Quốc

Box cấy LB-1234 Việt Nam

Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG công nghệ, Việt Nam

Buồng đếm hồng cầu Hirschmann (Đức)

Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ)

Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển)

Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản)

Kính hiển vi quang học Trung Quốc

Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc)

Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ)

Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)

Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)

Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức)

Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)

Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao

Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 được

nuôi cấy 7-10 ngày trên đĩa môi trường PDA ở 27-30°C, bào tử được thu trong

dung dịch Tween 80 (0,05%) và được điều chỉnh về mật độ 3×108/ml.

Lá cải thảo tươi, kích thước 10-15×20-25 cm, không bị bệnh, không bị rách

được giữ tươi bằng cách đặt phần cuống lá vào đĩa agar-nước sau đó được đặt vào

hộp nhựa trong suốt và cho phép không khí lưu thông dễ dàng. 40 con rệp khỏe

mạnh, kích thước trung bình được thả lên mặt trên lá cải. Một ngày sau, rệp bò

xuống mặt dưới lá, 30 con rệp khỏe mạnh được giữ lại, những con khác bị nhặt bỏ.



20 ml dịch bào tử (mật độ 3×108/ml trong dung dịch 0,05% Tween 80 được

phun đều dưới dạng sương cách 30 cm lên hai mặt lá (mẫu thí nghiệm). Dung dịch

0,05% Tween 80 được sử dụng để phun lên mẫu đối chứng. Số rệp chết và sống sót

được đếm qua từng ngày cho đến ngày thứ 7, ngày phun được tính là ngày 0. Nhiệt

độ và độ ẩm không khí được duy trì trong thời gian thí nghiệm lần lượt là 21-25°C

và 75-80%. Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.

Hình 2.1. Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm

Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được đánh giá theo phương pháp của

Abbott (1925) [4]:

+ LT50 (Lethal Time) là thời gian cần thiết để bào tử nấm gây chết 50% số

lượng rệp. Giá trị LT50 càng nhỏ thì độc lực của bào tử nấm đối với rệp càng mạnh.

+ Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được tính theo công thức:

Kết quả sau đó được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần

mềm thống kê SAS.

Khả năng gây chết rệp của bào tử nấm (%)

Phần trăm (%) rệp sống sót ở lô thí nghiệm

Phần trăm (%) rệp sống sót ở lô đối chứng = 1 –



2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Tách chiết DNA tổng số: Nấm 485 được nuôi cấy 96 giờ trong môi trường

PDA ở 30C, lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi được ly tâm 4000 vòng/phút trong

10 phút. Tủa sợi nấm được nghiền nhẹ trong nitơ lỏng rồi bổ sung 600 µl đệm phá

tế bào, lắc nhẹ, bổ sung tiếp 65 µl dung dịch lysozyme, ủ 37°C trong 45 phút. Hỗn

hợp sau đó được bổ sung 5 µl dung dịch protease K, ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung

chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong

15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung

isopropanol theo tỷ lệ 1:1, để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm

12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C được làm khô dưới ánh sáng đèn sợi đốt và

được bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly

tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE

và bảo quản ở -20°C.

Khuếch đại gene bằng PCR: Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng

nấm 485, cặp mồi NL1-F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và

NL4-R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') được sử dụng.

Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR

gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x;

0,25 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl.

Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/4 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút;

53°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút.

Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2: Ủ hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản

phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung

0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C.

Biến nạp plasmid: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5

theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được

xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các

lỗ màng tế bào mở rộng làm các chuỗi DNA đi vào dễ dàng.



Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 2 ml LB lỏng,

lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Nuôi lắc tiếp giống 1% ở 37°C trong 2-3 giờ

đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào

5000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào được ủ lần 1 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong

1 giờ, ly tâm thu tế bào. Rửa lần 2 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào

đã qua xử lý được hòa trong 100 l dung dịch 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp.

Các thao tác được thực hiện ở điều kiện 4°C.

Biến nạp plasmid vào E. coli: tế bào khả biến tươi hoặc lấy từ -80°C đã để

30 phút trong đá. Hút 40 µl dịch tế bào khả biến và 5 µl dung dịch nối ghép gene

vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng rồi ủ trong đá 30 phút. Sau đó, hỗn hợp

được sốc nhiệt 42°C trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt 5 phút trong đá. Bổ sung

250 µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải

100 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung ampicilin (100 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm.

Tách chiết plasmid: Mỗi khuẩn lạc đã được biến nạp mọc trên đĩa thạch

được nhặt cấy vào 1,5 ml môi trường LB chứa ampicillin (100 µg/ml), nuôi lắc

200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tủa tế bào thu được sau khi ly tâm 6000 vòng/phút

trong 5 phút được bổ sung 150 µl Sol I rồi lắc rung 30 giây tạo thành dịch đồng

nhất. Ủ dịch 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung 150 µl Sol II rồi đảo nhẹ, tiếp tục

bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp và đảo nhẹ. Hỗn hợp được bổ sung 450 µl

chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 12500 vòng/phút trong 10 phút.

450 µl pha trên được hút sang ống eppendorf mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc

nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa plasmid. Tủa plasmid thu được sau khi ly tâm

12500 vòng/phút trong 5 phút được rửa bằng 500 µl ethanol 70% ở 4°C để loại

muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid được

hòa trong đệm TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm

tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C.

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có

mang sản phẩm mong muốn hay không, plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được

cắt bằng cặp enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C. Hỗn hợp phản ứng



gồm 3 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,5 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango

Y+ và bổ sung nước cất tiêm đến 10 µl. Sản phẩm cắt được điện di trên gel

0,8% agarose để kiểm tra.

Đọc trình tự nucleotide: Sau khi plasmid tái tổ hợp được tinh sạch, đoạn

DNA chèn vào plasmid được đọc trình tự nucleotide theo nguyên lý Sanger cải tiến

dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào đầu

3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp

dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn

hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém

nhau một nucleotide và được phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc

trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 được

gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngược M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn

DNA ngoại lai.

Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh

trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của

chủng nấm 485

Chủng nấm 485 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 27-30°C trong

7-10 ngày, sau đó một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón

chứa 100 ml môi trường PD lỏng và được nuôi lắc 150 vòng/phút ở 27-30°C.

Sau 4 ngày, dịch nuôi có mật độ bào tử 3-5×108/ml được cấy vào các bình nón

250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất.

Sau khi lên men 10 ngày ở 27-30°C trong điều kiện tĩnh, bào tử được thu

trong dung dịch 0,05% Tween 80 và được đếm dưới kính hiển vi quang học (độ

phóng đại 640 lần) sử dụng buồng đếm hồng cầu. Các thí nghiệm được lặp lại ít

nhất 3 lần. Kết quả được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm

thống kê SAS.



Ảnh hưởng của nguồn cơ chất: Tám cơ chất khác nhau đã được khảo sát:

gạo, bột gạo, cám gạo, bột ngô, hỗn hợp bột lõi ngô/bột gạo (1:1, w/w), hỗn hợp bột

lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), hỗn hợp bột bã mía/bột gạo (1:1, w/w) và hỗn hợp bột

bã mía/bột ngô (1:1, w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình và các loại môi trường

được bổ sung lượng nước lần lượt là 4; 4; 6; 4; 6; 6; 10 và 10 ml/bình.

Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất: Thành phần bột lõi ngô và

bột ngô đã được khảo sát ở các tỉ lệ 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7 và 2:8 (w/w).

Khối lượng cơ chất là 10 g/bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.

Ảnh hưởng của độ dày cơ chất: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được

khảo sát ở các độ dày cơ chất: 9; 11; 13; 15; 17,5; 20; 22,5; 25; 27,5 và 30 mm

(tương đương với 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22 và 24 g/bình). Với cơ chất là bột

lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.

Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất: Nước được bổ sung vào cơ chất theo các tỉ

lệ 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100 và 110% (so với khối lượng cơ chất) để đánh giá ảnh

hưởng của độ ẩm cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng nấm. Với 10 g cơ chất bột lõi

ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình.

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được khảo

sát ở 25; 28; 30 và 37°C. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi

bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất.

Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ: Ảnh hưởng của năm nguồn nitơ

khác nhau lên sự sinh bào tử của 485 đã được khảo sát: NaNO3; KNO3; NH4NO3;

(NH4)2SO4; (NH4)2HPO4. Nguồn nitơ được bổ sung tương đương 0,1 mol

N/1000 g cơ chất. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình,

nước được bổ sung bằng 70% cơ chất.

Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4: Để đánh giá ảnh hưởng của

(NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485, sáu

nồng độ (NH4)2SO4 tương đương: 0; 0,02; 0,05; 0,10; 0,20 và 0,50 mol N/1000 g cơ



chất đã được khảo sát. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi

bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất.

Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4: Để đánh giá ảnh hưởng của MgSO4 lên

sự sinh bào tử của 485, sáu nồng độ: 0; 0,020; 0,030; 0,035; 0,040 và 0,050%

(so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô

(1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung

(NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất.

Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4: Sáu nồng độ: 0; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25

và 0,30% (so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của

KH2PO4 lên sự sinh bào tử của 485. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w)

trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ

0,1 mol N/1000 g cơ chất.

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng: Trong thí nghiệm này, chủng 485

được lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C, thành phần môi trường trong

mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước bằng 70% cơ

chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất,

KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự

sinh bào tử, chủng nấm được lên men ở ba chế độ chiếu sáng 0 giờ/ngày, 12 giờ/ngày

và 24 giờ/ngày.

Ảnh hưởng của thời gian lên men: Trong thí nghiệm này, chủng 485 được

lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày,

thành phần môi trường trong mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô

(1:1, w/w), nước bằng 70% cơ chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất,

MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để tìm thời gian lên

men tối ưu cho sản xuất bào tử, chủng 485 đã được lên men và thu bào tử sau

6; 8; 10; 12 và 14 ngày.



3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao

Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng

điều kiện môi trường khác nhau. Dịch bào tử của bảy chủng nấm Lecanicillium spp.

được phun lên rệp cải ở 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, số lượng rệp cải sống

sót được theo dõi sau bảy ngày phun. Kết quả chỉ có hai chủng 85k và 485 có khả

năng diệt được 50% rệp trong thời gian 5 và 4 ngày. Năm chủng còn lại chưa xác

định được thời gian để giết chết 50% rệp (hình 3.2).

A B C

Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp cải

A. mẫu đối chứng; B. mẫu phun bào tử nấm; C. rệp bị chết bởi nấm

được chụp qua kính hiển vi quang học

Độc lực của các chủng nấm này khá yếu so với các chủng Lecanicillium

trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2007). Trong nghiên cứu này, khi phun dịch

bào tử có nồng độ 1×107 bào tử/ml (không có khác biệt nhiều so với nồng độ 1×108

bào tử/ml) ở 25°C và độ ẩm không khí 75%, chủng có độc lực mạnh nhất là

L. lecanii 41185 có khả năng diệt 50% Myzus persicae và Aphis gossypii chỉ trong



1,6 và 1,4 ngày. Chủng yếu nhất là L. fusisporum 4078 cũng diệt được 50% hai loại

rệp trên trong 4,2 và 1,6 ngày [80]. Chủng Verticillium lecanii CS-625 trong nghiên

cứu của Kim và cộng sự (2001) cũng diệt được 50% A. gossypii sau 2,7 ngày ở

20°C [47].

Sau 7 ngày phun, chủng 485 có khả năng diệt rệp cải cao nhất với 67 ± 7%

rệp bị diệt, tiếp theo là chủng 85k với 57 ± 16% rệp bị diệt. Hai chủng có độc lực

diệt rệp khá cao khác là L1185 ( diệt được 47 ± 14% rệp) và L43 (diệt được

46 ± 21% rệp). Chủng L18 hầu như không diệt được rệp, là chủng có độc lực yếu

nhất (P < 0,01).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 2 3 4 5 6 7Thời gian sau phun (ngày)

Tỉ lệ

rệp

chết

(%)

Đối chứng

L18

L43

L85

85k

485

8514

41185

Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp.

Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2008), chủng L. attenuatum CNU-23

với nồng độ bào tử 108/ml diệt được 80% M. persicae trong điều kiện 25 ± 2°C và

độ ẩm 85 ± 5% [46]. Các chủng Lecanicillium trong thí nghiệm của Vu và cộng sự

(2007) cũng diệt được 72 đến 100% rệp sau 4 đến 8 ngày phun ở điều kiện 25°C và

độ ẩm 75% [80].

Trong phạm vi luận văn này, chủng 485 được chọn để tiếp tục tiến hành các

thí nghiệm tiếp theo.

L1185



3.2 Định tên chủng nấm 485

Chủng 485 được định tên bằng phương pháp đọc và so sánh trình tự gene

28S rRNA với trình tự của các chủng đã được công bố trên GenBank.

DNA của chủng 485 sau khi tách chiết được điện di trên gel 0,8% agarose.

DNA tổng số đủ độ tinh sạch để tiến hành PCR (hình 3.3A). Sản phẩm PCR trên gel

agarose có một băng với kích thước khoảng 600 bp (hình 3.3B), đúng với kích

thước của gene 28S rRNA được khuếch đại bởi cặp mồi NL1-F và NL4-R theo lí

thuyết.

Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 và được biến nạp vào

tế bào khả biến E. coli DH5α. Các dòng plasmid tái tổ hợp (hình 3.3C) được lựa

chọn và cắt kiểm tra bằng XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8% cho

hai băng DNA, một băng có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với vector

pJET1.2, băng còn lại có kích thước khoảng 600 bp tương ứng với đoạn DNA ngoại

lai (hình 3.3D).

Hình 3.3. Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA

DNA tổng số (A); sản phẩm PCR (B): M. Marker, 1. sản phẩm PCR;

Plasmid (C): ĐC. plasmid không mang gene 28S rRNA, P1, P2. plasmid mang gen

28S rRNA; sản phẩm cắt (D): M. Marker, 2. sản phẩm cắt.

Plasmid tái tổ hợp mang gene 28S rRNA mong muốn được tách và tinh sạch

để xác định trình tự nucleotide.

3000

1000 750

500 250 (bp)

600 bp

3000

1000 750

500 250 (bp)

600 bp

A B C D 1 M 2 M P1 P2 ĐC



Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 (604 nucleotide, hình 3.4A) có độ

tương đồng 99,8% với các chủng L. lecanii trong GenBank (EF026003 và

EF026005) (hình 3.4B). Từ kết quả trên bước đầu có thể kết luận chủng 485 thuộc

loài Lecanicillium lecanii.

A

1 GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACCA ACAGGGATTG CCCCAGTAAC

51 GGCGAGTGAA GCGGCAACAG CTCAAATTTG AAACCTGGCC CTTGGGTCCG

101 AGTTGTAATT TGTAGAGGAT GCTTTTGGCG AGGTGCCTTC CGAGTTCCCT

151 GGAACGGGAC GCCATAGAGG GTGAGAGCCC CGTCTGGTCG GACACCGAGC

201 CTCTGTAAAG CTCCTTCGAC GAGTCGAGTA GTTTGGGAAT GCTGCTCAAA

251 ATGGGAGGTA TATGTCTTCT AAAGCTAAAT ATTGGCCAGA GACCGATAGC

301 GCACAAGTAG AGTGATCGAA AGATGAAAAG CACTTTGAAA AGAGGGTTAA

351 AAAGTACGTG AAATTGTTGA AAGGGAAGCG CCTATGACCA GACTTGGGCC

401 CGGTGAATCA TCCAGCGTTC TCGCTGGTGC ACTTTGCCGG GCACAGGCCA

451 GCATCAGTTT GGCGCGGGGG AAAAAGGCTT TGGGAATGTG GCTCCCTCGG

501 GAGTGTTATA GCCCATTGTG TAATACCCTG CGCCGGACTG AGGTACGCGC

551 ATTGCAAGGA TGCTGGCGTA ATGGTCATCA GCGACCCGTC TTGAAACACG

601 GACC

B

Hình 3.4. Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 (A) và cây phân loại (B)

Chủng 485 và các chủng từ GenBank (kèm theo mã số)

EF026004 Lecanicillium fusisporum HM057107 Verticillium sp. AY312604 Verticillium sp. EF026003 Lecanicillium lecanii EF026005 Lecanicillium lecanii Lecanicillium sp. 485

80 70 60 50 40 30 20 10 0

82,7



3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của L. lecanii 485

3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất

Trong tám môi trường đã khảo sát, môi trường bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w)

cho sự sinh bào tử cao nhất với (5,02 ± 0,26)×109 bào tử/g cơ chất, môi trường bột

lõi ngô/bột gạo (1:1, w/w) cho sự sinh bào tử cao thứ hai với (4,44 ± 0,76)×109 bào

tử/g cơ chất, môi trường bột bã mía/bột ngô (1:1, w/w) cũng cho sự sinh bào tử khá

cao với (3,87 ± 0,81)×109 bào tử/g cơ chất, trong khi đó gạo và bột gạo cho sự sinh

bào tử kém nhất lần lượt là (0,55 ± 0,55)×109 và (0,82 ± 0,49×109 bào tử/g cơ chất

(P < 0,01) (hình 3.5).

0

1

2

3

4

5

6

G BG CG BN LG LN MG MN

Các nguồn cơ chất

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất

lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

G: gạo, BG: bột gạo, CG: cám gạo, BN: bột ngô, LG: bột lõi ngô/bột gạo,

LN: bột lõi ngô/bột ngô, MG: bột bã mía/bột gạo, MN: bột bã mía/bột ngô.

Từ kết quả này, môi trường gồm bột lõi ngô và bột ngô được sử dụng để sản

xuất bào tử nấm L. lecanii 485.

Kết quả này có sự khác biệt với một số nghiên cứu sản xuất bào tử nấm

Lecanicillium trước đó. Vu và cộng sự (2008) đã chọn được gạo làm cơ chất sản

xuất bào tử chủng L. lecanii 41185 phù hợp nhất so với các cơ chất cám gạo, trấu,



gạo trộn cám gạo, gạo trộn bột mì, cám mì, gạo trộn gạo tấm [81]. Shi và cộng sự

(2009) đã chọn được bã mía trộn bột ngô làm cơ chất để sản xuất bào tử V. lecanii

phù hợp hơn so với cám mì [74].

3.3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất

Môi trường gồm bột lõi ngô/bột ngô sau khi được lựa chọn, ảnh hưởng của tỉ

lệ hai thành phần này lên sự sinh bào tử của chủng nấm L. lecanii 485 đã được khảo

sát. Tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô bằng 1:1 (w/w) cho sự sinh bào tử cao nhất với

(5,37 ± 0,95)×109 bào tử/g cơ chất, trong khi với tỉ lệ 8:2 chủng L. lecanii 485

không sinh trưởng được và không có bào tử được tìm thấy. Tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô

bằng 6:4 và 4:6 (w/w) cũng cho sự sinh bào tử khá cao và xấp xỉ nhau, lần lượt là

(4,38 ± 1,57)×109 và (4,26 ± 0,32)×109 bào tử/g cơ chất (P < 0,01) (hình 3.6).

0

1

2

3

4

5

6

7

8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 2:8

Tỉ lệ lõi ngô/bột ngô

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường


Tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô bằng 1:1 (w/w) đã được sử dụng để tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

3.3.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất

Khi độ dày cơ chất quá nhỏ, tỉ lệ tương đối giữa bề mặt tiếp xúc và khối

lượng cơ chất lớn, nước sẽ bị thất thoát nhanh không tốt cho quá trình lên men.



Ngược lại, khi độ dày cơ chất quá lớn, tỉ lệ tương đối giữa bề mặt tiếp xúc và khối

lượng cơ chất nhỏ, độ thoáng khí giảm, khả năng thoát nhiệt kém cũng không tốt

cho sự sinh bào tử.

Trong thí nghiệm này, lên men được thực hiện trong bình nón 250 ml, đường

kính đáy 8 cm. Độ dày cơ chất 27,5 mm (tương đương 22 g cơ chất/bình) thích hợp

nhất cho sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 với số lượng bào tử đạt được

(1,032 ± 0,032)×1010 bào tử/g cơ chất, xấp xỉ số lượng bào tử đạt được khi lên men

ở độ dày cơ chất 25 mm và 30 mm với số lượng bào tử đạt được lần lượt là

(9,90 ± 1,22)×109 và (9,79 ± 0,60)×109 bào tử/g cơ chất. Độ dày cơ chất 22,5 mm

cũng cho sự sinh bảo tử khá cao, đạt được (9,04 ± 1,12)×109 bào tử/g cơ chất. Trong

khi lên men ở độ dày cơ chất từ 9 đến 15 mm, số lượng bào tử đạt được thấp hơn

nhiều, chỉ từ (5,88 ± 0,28)×109 đến (6,28 ± 0,88)×109 bào tử/g cơ chất (P < 0,01)

(hình 3.7).

3

6

9

12

8 12 16 20 24 28 32

Độ dày cơ chất (mm)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất


Ở quy mô khảo sát trong phòng thí nghiệm, độ dày cơ chất 27,5 mm (tương

đương 22 g cơ chất/bình nón 250 ml) được chọn để sản xuất bào tử chủng nấm

L. lecanii 485.



3.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất

Độ ẩm cơ chất có vai trò quan trọng đối với sự sinh bào tử của nấm [42]. Độ

ẩm cơ chất thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc tối ưu độ ẩm cho

cơ chất rất quan trọng [13]. Độ ẩm cơ chất thấp sẽ không đủ lượng nước cho nấm

sinh trưởng và sinh bào tử, ngược lại, độ ẩm cơ chất quá cao cũng không tốt cho sự

sinh trưởng và sinh bào tử của nấm do độ thoáng khí thấp [55].

Trong thí nghiệm này, khi lượng nước được bổ sung bằng 70% cơ chất

(tương đương với độ ẩm môi trường cơ chất 41%), chủng L. lecanii 485 sinh bào tử

cao nhất, đạt được (5,43 ± 1,08)×109 bào tử/g cơ chất. Số lượng bào tử đạt được khi

lượng nước được bổ sung bằng 60, 80 và 90% cơ chất xấp xỉ nhau, đạt được lần

lượt là (4,70 ± 0,45)×109, (5,04 ± 0,47)×109 và (5,07 ± 0,42)×109 bào tử/g cơ chất.

1

2

3

4

5

6

7

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

Lượng nước bổ sung so với cơ chất khô (%)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất


Số lượng bào tử đạt được thấp nhất khi lượng nước được bổ sung bằng 40% cơ

chất, bằng (2,11 ± 0,22)×109 bào tử/g cơ chất. Trong khi đó, lượng nước được bổ

sung bằng 110% cơ chất, số lượng bào tử cũng chỉ đạt được (3,36 ± 0,08)×109 bào

tử/g cơ chất (P < 0,01) (hình 3.8).



Lượng nước bổ sung bằng 70% cơ chất (tương đương độ ẩm môi trường cơ

chất là 41%) được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong một dải hạn chế nhiệt độ đã được khảo sát, sự sinh bào tử của chủng

L. lecanii 485 tốt nhất ở 30°C, đạt được (7,88 ± 0,64)×109 bào tử/g cơ chất, trong

khi ở 37°C nấm bị ức chế hoàn toàn. Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 không

có sự khác biệt lớn khi lên men ở 25 và 28°C, số lượng bào tử đạt lần lượt là

(3,54 ± 0,66)×109 và (4,54 ± 0,49)×109 bào tử/g cơ chất (P < 0,01) (hình 3.9).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

20 25 30 35 40

Nhiệt độ (oC)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ


Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Arevalo và cộng sự (2009) khi

chủng L. psalliotae sinh trưởng tốt nhất ở 30°C [10], trong khi có sự khác biệt với

nghiên cứu của Kope và cộng sự (2008) khi nấm Lecanicillium spp. sinh trưởng cao

nhất ở 25°C [49]. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng có thể

không giống với nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh bào tử. Xét về cận trên nhiệt độ

sinh trưởng của nấm Lecanicillum, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của

Vu và cộng sự (2008) khi chủng L. lecanii 41185 bị ức chế hoàn toàn ở 35°C [81].

Từ kết quả trên, nhiệt độ 30°C được chọn để sản xuất bào tử chủng 485 trong

nghiên cứu này.



3.3.6 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ

Bột ngô được sử dụng làm nguồn carbon nhưng đồng thời nó cũng có thể

cung cấp nitơ cho nấm. Tuy nhiên, hàm lượng nitơ có thể chưa phù hợp cho việc

sinh bào tử của nấm. Nguồn nitơ vô cơ được sử dụng để bổ sung nitơ trong sản xuất

bào tử nấm thay vì cao nấm men như nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009) [74]

nhằm làm giảm chi phí sản xuất bào tử.

Trong số các nguồn nitơ vơ cơ được khảo sát, sự sinh bào tử của chủng

L. lecanii 485 cao nhất với nguồn (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, số lượng bào tử đạt

được lần lượt là (1,159 ± 0,050)×1010 và (1,099 ± 0,077)×1010/g cơ chất (P < 0,01).

Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ


KBS: không bổ sung nguồn nitơ vô cơ

Khi không được bổ sung nguồn nitơ vô cơ, số lượng bào tử chỉ đạt được

(5,43 ± 1,08)×109/g cơ chất. Như vậy, việc bổ sung (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 đã

làm tăng sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 lên 113% và 102%. Khi bổ sung

NH4NO3, sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 cũng tăng lên 31%, đạt được

(7,11 ± 0,74)×109 bào tử/g cơ chất. Chủng L. lecanii 485 sinh bào tử kém nhất khi

bổ sung NaNO3, muối này ức chế 38% sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485, số

0

2

4

6

8

10

12

14

KBS NaNO3 KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4

Một số nguồn nitơ vô cơ

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

KBS NaNO3 KNO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 (NH4)2HPO4



lượng bào tử chỉ đạt (3,38 ± 0,44)×109/g cơ chất (P < 0,01). Trong môi trường được

bổ sung KNO3, số lượng bào tử đạt được (5,26 ± 0,33)×109/g cơ chất, không có sự

khác biệt so với môi trường không được không được bổ sung nguồn nitơ vô cơ

(P < 0,01) (hình 3.10).

Với kết quả như trên, nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 được sử dụng để tiến

hành các thí nghiệm tiếp theo.

Khi sản xuất bào tử chủng L. lecanii 41185, Vu và cộng sự (2008) cũng sử

dụng muối vô cơ (KNO3) để bổ sung nitơ [81].

3.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4

Sau khi được xác định là nguồn nitơ vô cơ phù hợp, ảnh hưởng của

(NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 đã

được khảo sát. Kết quả nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000g cơ chất

cho sự sinh bào tử cao nhất với (1,071 ± 0,028)×1010 bào tử/g cơ chất (P < 0,01).

0

2

4

6

8

10

12

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

Nồng độ (NH4)2SO4 (mol N/1000 g cơ chất)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4


Chủng L. lecanii 485 cũng sinh bào tử khá tốt trong môi trường được bổ sung

(NH4)2SO4 với nồng độ tương đương 0,02 và 0,05 mol N/1000g cơ chất, đạt được



(8,41 ± 1,28)×109 và (9,13 ± 0,84)×109 bào tử/g cơ chất. Trong khi đó, sự sinh bào

tử của chủng L. lecanii 485 bị ức chế mạnh ở nồng độ (NH4)2SO4 tương đương

0,2 mol N/1000g cơ chất (đạt được (1,52 ± 0,08)×109 bào tử/g cơ chất) và gần như

bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,5 mol N/1000g cơ chất

(P < 0,01) (hình 3.11).

Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 bị ức chế bởi (NH4)2SO4 nồng độ

cao có thể giải thích được. Muối (NH4)2SO4 nồng độ cao làm cho áp suất thẩm thấu

của môi trường quá cao, hơn nữa, (NH4)2SO4 là muối vô cơ có tính acid yếu, khi

được bổ sung với nồng độ cao nó hạ thấp pH môi trường, môi trường có áp suất

thẩm thấu quá cao hay pH quá thấp đều không thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh

bào tử của chủng L. lecanii 485.

Trong nghiên cứu này, (NH4)2SO4 với nồng độ tương đương 0,1 mol

N/1000g cơ chất được chọn để sản xuất bào tử chủng L. lecanii 485.

3.3.8 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4

Ảnh hưởng của MgSO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 ở các

nồng độ khác nhau đã được khảo sát. Kết quả cho thấy nồng độ MgSO4 tối ưu là

0,035% với số lượng bào tử đạt được (1,304 ± 0,018)×1010 bào tử/g cơ chất

(P < 0,01), tăng 22% so với khi MgSO4 không được bổ sung (số lượng bào tử đạt

được (1,066 ± 0,066)×1010/g cơ chất). Trong khi môi trường được bổ sung MgSO4

với nồng độ 0,03%, 0,04% và 0,05% số lượng bào tử đạt được lần lượt là

(1,080 ± 0,069)×1010, (1,147 ± 0,015)×1010 và (1,109 ± 0,062)×1010/g cơ chất, có sự

khác biệt không đáng kể so với môi trường không được bổ sung MgSO4. Nồng độ

MgSO4 0,02% lại ức chế sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485, số lượng bào tử

đạt được (9,51 ± 0,35)×109/g cơ chất (P < 0,01) (hình 3.12).



8

9

10

11

12

13

14

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Nồng độ MgSO4 (%)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4


Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), khi lên

men trên chất mang là bã mía, nấm V. lecanii sinh bào tử cao nhất ở nồng độ

MgSO4 0,0325% [74]. Trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2008), sự sinh bào tử

của chủng nấm L. lecanii 41185 không có sự khác biệt giữa môi trường không được

bổ sung và được bổ sung MgSO4 với nồng độ 0,02% [81].

Từ kết quả trên, MgSO4 nồng độ 0,035% được sử dụng để sản xuất bào tử

chủng L. lecanii 485.

3.3.9 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4

Trong dải nồng độ KH2PO4 đã được khảo sát, số lượng bào tử của chủng

nấm L. lecanii 485 đạt được thấp nhất khi không bổ sung KH2PO4 với

(1,066 ± 0,066)×1010 bào tử/g cơ chất. Sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 cao

nhất khi bổ sung KH2PO4 ở nồng độ 0,1% và 0,25%, với số lượng bào tử đạt được

lần lượt là (1,156 ± 0,043)×1010 và (1,159 ± 0,008)×1010 bào tử/g cơ chất. Tuy

nhiên, với các nồng độ KH2PO4 đã được khảo sát, sự khác biệt về sự sinh bào tử của

chủng L. lecanii 485 trong môi trường được bổ sung và không được bổ sung

KH2PO4 không có ý nghĩa thống kê (P > 0,1) (hình 3.13).



9

10

11

12

13

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35

Nồng độ KH2PO4 (%)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4


Shi và cộng sự (2009) đã dùng phương pháp tối ưu toán học để tìm ra nồng

độ phù hợp của một số muối vô cơ với sự sinh bào tử của nấm V. lecanii, kết quả

cho thấy nấm V. lecanii sinh bào tử cao nhất khi KH2PO4 được bổ sung vào môi

trường với nồng độ 0,163% [74].

Mặc dù sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485 trong môi trường được bổ

sung và không được bổ sung MgSO4 khác biệt không có ý nghĩa thống kê, MgSO4

với nồng độ 0,1% vẫn được sử dụng để sản xuất bào tử chủng L. lecanii 485.

3.3.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng

Trong ba chế độ chiếu sáng đã được khảo sát, chủng L. lecanii 485 sinh bào

tử cao nhất ở chế độ chiếu đáng thông thường (12 giờ/ngày) và ở chế độ tối hoàn

toàn với số lượng bào tử đạt được lần lượt là (1,326 ± 0,050)×1010 và

(1,296 ± 0,028)×1010 bào tử/g cơ chất, trong khi ở chế độ chiếu sáng 24 giờ/ngày số

lượng bào tử chỉ đạt được (1,191 ± 0,020)×1010/g cơ chất (P < 0,01) (hình 3.14).



8

10

12

14

0 12 24

Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng


Từ kết quả thu được, chế độ chiếu sáng thông thường (12 giờ/ngày) được

chọn để sản xuất bào tử chủng L. lecanii 485. Với chế độ chiếu sáng này, điện chiếu

sáng không cần thiết phải được sử dụng, quá trình lên men sẽ tận dụng ánh sáng tự

nhiên, làm giảm chi phí điện năng cho quá trình lên men.

Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ba chế độ

chiếu sáng 0 giờ/ngày, 12 giờ/ngày và 24 giờ/ngày lên sự sinh trưởng và sinh bào tử

của nấm Metarhizium anisopliae, kết quả cho thấy nấm này sinh bào tử cao nhất ở

chế độ chiếu sáng 24 giờ/ngày [2].

3.3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Số lượng bào tử đạt được phụ thuộc nhiều vào thời gian lên men vì trước khi

sinh bào tử nấm cần có thời gian để phát triển hệ sợi. Khi thời gian lên men để đạt

được số lượng bào tử tối đa càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp.

Trong nghiên cứu này, sau 8 ngày lên men, số lượng bào tử của nấm

L. lecanii 485 đạt được tối đa với (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất. Tiếp tục

kéo dài thời gian lên men đến 10, 12 và 14 ngày, số lượng bào tử đạt được lần lượt

là (1,326 ± 0,050)×1010, (1,330 ± 0,038)×1010, và (1,327 ± 0,012)×1010/g cơ chất,

tương đương với số lượng bào tử đạt được sau 8 ngày lên men. Sau 6 ngày lên men,



số lượng bào tử còn thấp, đạt được (1,257 ± 0,033)×1010 bào tử/g cơ chất, bằng 93%

số lượng bào tử tối đa đạt được sau 8 ngay lên men (P < 0,05) (hình 3.15).

9

10

11

12

13

14

15

4 6 8 10 12 14

Thời gian lên men (ngày)

Số lư

ợng

bào

tử (x

109 /g

cơ

chất

)

Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men


Thời gian lên men 8 ngày tương đương với thời gian trong nghiên cứu của

Shi và cộng sự (2009) (8 ngày), khi các tác giả lên men nấm V. lecanii thu bào tử

[74]. Feng và cộng sự (2000) cũng cần 9 ngày để lên men thu bào tử nấm V. lecanii

[26]. Vu và cộng sự (2008) cần đến 12 ngày để lên men chủng L. lecanii 41185 đạt

được số lượng bào tử tối đa [81].

Như vậy, sau khi lên men chủng nấm L. lecanii 485 với các điều kiện tối ưu,

cụ thể: 8 ngày lên men ở 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với cơ chất bột lõi

ngô/bột ngô (1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm (tương đương 22g cơ chất/bình lên men

250 ml), được bổ sung lượng nước bổ sung bằng 70% cơ chất (tương đương độ ẩm

môi trường cơ chất là 41%), nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000 g cơ

chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất, đã đạt được số

lượng (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất.



So với kết quả khi lên men chủng L. lecanii 485 với cơ chất bột lõi ngô/bột

ngô (tỉ lệ 1:1, w/w), số lượng bào tử đạt được sau khi tối ưu các điều kiện nuôi cấy

đã tăng 2,69 lần, từ (5,03 ± 0,26)×109 lên (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất.

Số lượng bào tử đạt được tương đối cao nếu so sánh với một số nghiên cứu

sản xuất bào tử nấm Lecanicillium khác. Trong nghiên cứu của Feng và cộng sự

(2000) số lượng bào tử đạt được 1,50×109/g cơ chất [26], trong nghiên cứu của Shi

và cộng sự (2009) số lượng bào tử đạt được 1,1×1010/g cơ chất [74], trong nghiên

cứu của Vu và cộng sự (2008) số lượng bào tử đạt được 1,8×1010/g cơ chất [81].

Với các nguồn nguyên liệu được chọn bao gồm bột lõi ngô, bột ngô,

(NH4)2SO4, MgSO4, KH2PO4, kết quả tối ưu này có tính khả thi cao khi áp dụng vào

thực tế vì các nguyên liệu này rẻ tiền và sẵn có. Bên cạnh đó, phương pháp lên men

rắn được sử dụng nên dễ vận hành, chi phí đầu tư ban đầu và vận hành thấp.



KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

1. Chủng 485 có độc lực cao nhất đối với rệp cải trong số 7 chủng nấm được

nghiên cứu. Trong điều kiện 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, dung dịch bào

tử của chủng 485 có mật độ 3×108/ml trong Tween 80 nồng độ 0,05% sau 7 ngày

được phun lên rệp cải đã diệt được 67% rệp.

2. Chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii theo phân tích và so sánh trình

tự gene 28S rRNA.

3. Điều kiện cho sự sinh bào tử tối đa của chủng L. lecanii 485 trong môi

trường rắn là: lên men 8 ngày ở 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với cơ chất

bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm, độ ẩm môi trường cơ chất 41%,

nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035%

cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất. Chủng L. lecanii 485 khi lên men trong điều

kiện tối ưu, đạt được số lượng bào tử (1,353 ± 0,019)×1010/g cơ chất.

ĐỀ NGHỊ

1. Nghiên cứu phối trộn bào tử của L. lecanii 485 với các chất phụ gia phù

hợp để tạo chế phẩm có độc lực diệt rệp cải cao.

2. Phun thử nghiệm trên đồng ruộng với quy mô nhỏ để đánh giá hiệu quả

diệt rệp cải của chế phẩm bào tử nấm L. lecanii 485.

3. Đánh giá độc lực của L. lecanii 485 trên rệp ngô.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Nguyễn Dương Khuê (2005), Sử dụng nấm Metarhizium anisopliae Sorok. phòng

trừ mối nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo phương pháp lây

nhiễm, Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần thứ 5, Hà Nội.

2. Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (2007), “Đặc điểm sinh học và

khả năng gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae (METSCH.) Sorokin

đối với sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea

L.)”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, 1&2, pp. 58-63.

3. Phạm Thị Thuỳ, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn (2005), Nghiên cứu hoàn

thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để

phòng trừ sâu hại đậu tương và đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003-2004, Hội

nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội.

Tài liệu tiếng Anh:

4. Abbott W. S. (1925), “A method of computing the effectiveness of an

insecticide”, J Econ Entomol, 18, pp. 265-267.

5. Agnihotri A., Prem D. (2007), Oils Quality Improvement in Rapeseed-Mustard,

Souvenir, National Seminar on Changing Global Vegetable Oils Scenario:

Issues and Challenges Before India.

6. Ahmad S., Ali Khan I., Hussain Z., Ali Shah S. I., Ahmad M. (2007),

“Comparison of a biopesticide with some synthetic pesticides against aphids

in rapeseed crop”, Sarhad J Agric, 24(4), pp. 1117-1120.

7. Akhtar L. H., Hussain M., Iqbal R. M., Amer M., Tarig A. H. (2010), “Losses in

grain yield caused by russian wheat aphid Diuraphis noxia (Mordvilko)”,

Sarhad J Agric, 26(4), pp. 625-628.

8. Andreotti G., Hou L., Freeman L. E. B., Mahajan R., Koutros S., Coble J., Lubin

J., Blair A., Hoppin J. A., Alvanja M. (2010), “Body mass index, agricultural



pesticide use, and cancer incidence in the agricultural health study cohort”,

Cancer Causes Control, 21(11), pp. 1759-1775.

9. Angelo I. C., Fernandes E. K., Bahiense T. C., Perinotto W. M., Moraes A. P.,

Terra A. L., Bittencourt V. R. (2010), “Efficiency of Lecanicillium lecanii to

control the tick Rhipicephalus microplus”, Vet Parasitol, 172(3-4),

pp. 317-322.

10. Arevalo J., Hidalgo-Díaz L., Martins I., Souza J. F., Castro J. M. C., Carneiro R.

M. D. G., Tigano M. S. (2009), “Cultural and morphological characterization

of Pochonia chlamydosporia and Lecanicillium psalliotae isolated from

Meloidogyne mayaguensis eggs in Brazil”, Trop Plant Pathol, 34(3),

pp. 158-163.

11. Aspelin A. L., Grube A. H. (1999), Pesticides industry sales and usage 1996

and 1997 market estimates, United States EPA.

12. Barson G. (1976), “Laboratory studies on the fungus Verticillium lecanii, a

larval pathogen of the large elm bark beetle (Scolytus scolytus)”, Ann Appl

Biol, 83, pp. 207-214.

13. Baysal Z., Uyar F., Aytekin C. (2003), “Solid state fermentation for production

of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot-spring water”,

Process Biochem, 38, pp. 1665-1668.

14. Blair A., Freeman L. B. (2009), “Epidemiologic studies of cancer in agricultural

populations: observations and future directions”, J Agromed, 14,

pp. 125-131.

15. Brar N. S., Bakhetia D. R. C., Sekhon B. S. (1987), “Estimation of losses in

yield of rapeseed and mustard due to mustard aphid, Lipaphis erysimi

(Kalt.)”, J Oilseeds Res, 4(2), pp. 261-264.

16. Bukhari T., Takken W., Koenraadt C. J. M. (2011), “Development of

Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana formulations for control of

malaria mosquito larvae”, Parasit Vectors, 4(23), pp. 1-14.



17. Carrasco-Tauber C. (1989), Pesticide Productivity Revisited, MA, University of

Massachusetts.

18. Catangui M. A., Beckendorf E. A., Riedell W. E. (2009), “Soybean aphid

population dynamics, soybean yield loss, and development of stage-specific

economic injury levels”, Agron J, 101(5), pp. 1080-1092.

19. CEQ (1980), The Global 2000 Report to the President of the US Entering the

21st Century, Pergamon Press, New York.

20. Colborn T., Myers J. P., Dumanoski D. (1996), Our Stolen Future: How We Are

Threatening Our Fertility, Intelligence, and Survival: A Scientific Detective

Story, Dutton, New York.

21. Cuthbertson A. G. S., Blackburn L. F., Northing P., Luo W., Cannon R. J. C.,

Walters K. F. A. (2010), “Chemical compatibility testing of the

entomopathogenic fungus Lecanicillium muscarium to control Bemisia

tabaci in glasshouse environment”, Int J Environ Sci Tech, 7(2),

pp. 405-409.

22. Damalas C. A. (2009), “Understanding benefits and risks of pesticide use”,

Sci Res Essay, 4(10), pp. 945-949.

23. De Faria M. R., Wraight S. P. (2007), “Mycoinsecticides and Mycoacaricides:

A comprehensive list with worldwide coverage and international

classification of formulation types”, Biol Control, 43, pp. 237-256.

24. Diaz B. M., Oggerin M., Lopez Lastra C. C., Rubio V., Fereres A. (2009),

“Characterization and virulence of Lecanicillium lecanii against different

aphid species”, Bio Control, 54, pp. 825–835.

25. El-Defrawi G. M., El-Harty E. H. (2009), Injury levels and yield loss model for

the cowpea aphid (Aphis craccivora Koch) on Vicia faba L., 6th International

Symposium of Mediterranean Group on Pesticide Research, Cairo, Egypt.

26. Feng K. C., Liu B. L., Tzeng Y. M. (2000), “Verticillium lecanii spore

production in solid-state and liquid-state fermentations”, Bioprocess Biosyst

Eng, 23, pp. 25-29.



27. Gao L., Liu X. Z. (2009), “A novel two stage cultivation method to optimize

carbon concentration and carbon to nitrogen ratio for sporulation of

biocontrol fungi”, Folia Microbiol, 54(2), pp. 142-146.

28. Gary C. J., Liberty P. A., Jocelyn B. P. (2005), “Effect of nitrogen fertilizer on

the intrinsic rate of increase of the rusty plum aphid, Hysteroneura setariae

(Thomas) (Homoptera: Aphididae) on rice (Oryza sativa L.)”, Environ

Entomol, 34(4), pp. 938-943.

29. Gindin G., Levski S., Glazer I., Soroker V. (2006), “Evaluation of the

entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana

against the Red Palm Weevil Rhynchophorus ferrugineus”, Phytoparasitica,

34(4), pp. 370-379.

30. Gopalakrishnan C. (1989), “Susceptibility of cabbage diamondback moth

Plutella xylostella L. to the entomofungal pathogen Verticillium lecanii

(Zimmerman)”, Viegas Current Science, 58(22), pp. 1256-1257.

31. Grube A., Donaldson D., Kiely T., Wu L. (2011), Pesticides industry sales and

usage, 2006 and 2007 market estimates, United States EPA.

32. Guclu S., Ak K., Eken C., Akyol H., Sekban R., Beytut B., Yildirim R. (2010),

“Pathogenicity of Lecanicillium muscarium against Ricania simulans”, Bull

Insectol, 63(2), pp. 243-246.

33. Hall R. A. (1981), “A new insecticide against greenhouse aphids and whitefly:

the fungus Verticillium lecanii”, Ohio Florists’ Assoc Bull, 626, pp. 3-4.

34. Hart K., Pimentel D. (2002), “Public health and costs of pesticides”,

Encyclopedia of Pest Management, Marcel Dekker, New York, pp. 677-679.

35. Heathcote G. D. (1962), “The suitability of some plant hosts for the

development of the peach-potato aphid, Myzus persicae (Sulzer)”, Entomol

Exp Appl, 5(2), pp. 114-118.

36. Henry G. S. (1997), “Aphid”, McGraw-Hill Encyclopedia of Science and

Technology, McGraw-Hill, New York.



37. Ho Q. T., Tran T. P., Nguyen T., Tran V. H., Trinh T. X., Bui X. H., Dang T.

C., Tran T. B. (2010), Rearing Metarhizium anisopliae fungi at the

household level for management of brown planthoppers in rice fields, 28th

International Rice Research Conference, Hanoi, Vietnam.

38. Hohenadel K., Harris S. A., Mclaughlin J. R., Spinelli J. J., Pahwa P., Dosman

J. A., Demers P. A., Blair A. (2011), “Exposure to multiple pesticides and

risk of non-Hodgkin lymphoma in men from six Canadian provinces”, Int J

Environ Res Public Health, 8, pp. 2320-2330.

39. Holman J. (2009), Host Plant Catalog of Aphids: Palaearctic Region, Springer

Verlag, Berlin, Germany.

40. Hossain A., Ferdous J., Salim M. M. R. (2006), “Relative abundance and yield

loss assessment of Lentil aphid, Aphis craccivora Koch in relation to

different sowing dates”, J Agric Rural Dev, 4, pp. 101-106.

41. Howard T. D., Hsu F. C., Grzywacz J. G., Chen H., Quandt S. A., Vallejos Q.

M., Whalley L. E., Cui W., Padilla S., Arcury T. A. (2010), “Evaluation of

candidate genes for cholinesterase activity in farmworkers exposed to

organophosphorus pesticides: Association of single nucleotide

polymorphisms in BCHE”, Environ Health Perspect, 118(10),

pp. 1395-1399.

42. Jenkins N. E., Heviefo G., Langewald J., Cherry A. J., Lomer C. J. (1998),

“Development of mass production technology for aerial conidia for use

mycopesticides”, Biocontrol News Inf, 19(1), pp. 21-31.

43. Johnson D. L., Huang H. C., Harper A. M. (1988), “Mortality of grasshoppers

(Orthoptera: Acrididae) inoculated with a Canadian isolate of the fungus

Verticillium lecanii”, J Invertebr Pathol, 52, pp. 335-342.

44. Kaiser W. J., Danesh D. (1971), “Biology of four viruses affecting Cicer

arietinzrm in Iran”, Phytopathology, 61, pp. 372-375.

45. Kiely T., Donaldson D., Grube A. (2004), Pesticides industry sales and usage,

2000 and 2001 market estimates, United States EPA.



46. Kim H. Y., Lee H. B., Kim U. C., Kim I. S. (2008), “Laboratory and field

evaluations of entomopathogenic Lecanicillium attenuatum CNU-23 for

control of green peach aphid (Myzus persicae)”, J Microbiol Biotechnol,

18(12), pp. 1915-1918.

47. Kim J. J., Lee M. H., Yoon C. S., Kim H. S., Yoo J. K., Kim K. C. (2001),

“Control of cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen”,

Biological Control of Greenhouse Pests, Food & Fertilizer Technology

Center, Taipei, Taiwan, pp. 8-15.

48. Kleespies R. G., Zimmermann G. (1992), “Production of blastospores by three

strains of Metarhizium anisopliae (Metch.) Sorok. In submerged culture”,

Biocontrol Sci Technol, 2, pp. 127-135.

49. Kope H. H., Alfaro R. I., Lavallée R. (2008), “Effects of temperature and water

activity on Lecanicillium spp. conidia germination and growth, and mycosis

of Pissodes strobi”, BioControl, 53, pp. 489-500.

50. Le V. V., Nguyen D. D., Le K. A., Pham K. S., Tetsu A. (2011), “Sex

pheromone components and control of the citrus pock caterpillar, Prays

endocarpa, found in the Mekong Delta of Vietnam”, J Chem Ecol, 37(1),

pp. 134-140.

51. Mcgavin G. C., Preston-Mafham K. (1993), Bugs of the World, Of the World

Series, Facts on File, New York.

52. Miller G. T. (2002), Living in the Environment: Principles, Connections, and

Solutions (12th Ed.), Wadsworth/Thomson Learning, Belmont, Califorlia.

53. Milner R. J. (1997), “Prospects for biopesticides for aphid control”, Biocontrol,

42(1-2), pp. 227-239.

54. Moazami N. (2002), “Biopesticides production”, Encyclopedia of Biological

physiological and Health Sciences, Encyclopedia Of Life Support Systems,

pp. 1-52.

55. Moo Y., Moreira M. A. R., Tengerdy R. P. (1983), “Principles of solid substrate

fermentation”, Fungal Technology, Edward Arnold, London, pp. 117-144.



56. Mussen E. (1990), “California crop pollination”, Gleanings in Bee Culture, 118,

pp. 646-647.

57. Nault L. R. (1997), “Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis”,

Ann Entomol Soc Amer, 90, pp. 521-541.

58. Nene Y. L., Reddy M. V. (1976), “Preliminary information on chickpea stunt”,

Tropical Grain Legume Bulletin, 5, pp. 31-32.

59. Nevo E., Coll M. ( 2001), “Effect of nitrogen fertilization on Aphis gossypii

(Homoptera: Aphididae): variation in size, color, and reproduction”, J Econ

Entomol, 94(1), pp. 27-32.

60. Ofuya T. T. (1997), “Control of cowpea aphid, Aphis craccivora Koch

(Homoptera: Aphididae), in cowpea, Vigna unguiculata (L.) Walp.” Integr

Pest Manag Rev, 2(4), pp. 199-207.

61. Patel S. R., Awasthi A. K., Tomar R. K. S. (2004), “Assessment of yield losses

in mustard (Brassica juncea L.) due to mustard aphid (Lipaphis erysimi

Kalt.) under differrent thermal environments in Eastern Central India”, Appl

Eco Environ Res, 2(1), pp. 1-15.

62. Pham T. A., Kim J. J., Kim K. (2010), “Optimization of solid-state fermentation

for improved conidia production of Beauveria bassiana as a

mycoinsecticide”, Mycobiology, 38(2), pp. 137-143.

63. Pimentel D. (1997), “Pest management in agriculture”, Techniques for Reducing

Pesticide Use: Environmental and Economic Benefits, John Wiley & Sons,

Chichester, UK, pp. 1-11.

64. Pimentel D. (2005), “Enviromental and economic costs of the application of

pesticides primarily in the United States”, Environ Dev Sustain, 7, pp. 229-

252.

65. Pimentel D., Acquay H., Biltonen M., Rice P., Silva M., Nelson J., Lipner V.,

Giordana S., Horowitz A., D’amore M. (1993), “Assessment of

environmental and economic impacts of pesticide use”, The Pesticide



Question: Environment, Economics and Ethics, Chapman & Hall, New York,

pp. 47-84.

66. Pimentel D., Stachow U., Takacs D. A., Brubaker H. W., Dumas A. R., Meaney

J. J., O’neil J. A. S., Onsi D. E., Corzilius D. B. (1992), “Conserving

biological diversity in agricultural/forestry systems”, Bioscience, 42,

pp. 354-362.

67. Piper R., Shanahan M. (2007), Extraordinary Animals: An Encyclopedia of

Curious and Unusual Animals, Greenwood Press, United States.

68. Raimbault M. (1998), “General and microbiological aspects of solid substrate

fermentation”, Electron J Biotechnol, 1(3), pp. 1-15.

69. Razaq M., Mehmood A., Aslam M., Ismail M., Afzal M., Ali-Shad S. (2011),

“Losses in yield and yield components caused by aphids to late sown

Brassica napus L., Brassica juncea L. and Brassica carrinata A. at Multan,

Punjab (Pakistan)”, Pak J Bot, 43(1), pp. 319-324.

70. Richter E. D. (2002), “Acute human pesticide poisonings”, Encyclopedia of Pest

Management, Dekker, New York, pp. 3-6.

71. Ridgway R. L., Tinney J. C., Macgregor J. T., Starlert N. J. (1978), “Pesticide

use in agriculture”, Environ Health Perspect, 27, pp. 103-112.

72. Riedell W. E., Catangui M. A., Beckendorf E. A. (2009), “Nitrogen, fixation,

ureide, and nitrate accumulation responses to soybean aphid injury in

Glycine max”, J Plant Nutr, 32(10), pp. 1674-1686.

73. Rombach M. C. (1989), “Production of Beauveria bassiana [Deuteromycotina:

Hyphomycetes] sympoduloconidia in submerged culture”, Entomophaga, 34,

pp. 45-52.

74. Shi Y., Xu X., Zhu Y. (2009), “Optimization of Verticillium lecanii spore

production in solid-state fermentation on sugarcane bagasse”, App Microbiol

Biotechnol, 82, pp. 921-927.



75. Shingleton A. W., Sisk G. C., Stern D. L. (2003), “Diapause in the pea aphid

(Acyrthosiphon pisum) is a slowing but not a cessation of development”,

BMC Dev Biol, 3(7), pp. 1-12.

76. Singh C. P., Sachan G. C. (1994), “Assessment of yield losses in yellow sarson

due to mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt)”, J Oilseeds Res, 11(2),

pp. 179-184.

77. Sylvester E. S. (1980), “Circulative and propagative virus transmission by

aphids”, Ann Rev Entomol, 25, pp. 257-286.

78. Tatchell G. M. (1989), “An estimate of the potential economic losses to some

crops due to aphids in Britain”, Crop Prot, 8, pp. 25-29.

79. Thackray D. J., Diggle A. J., Berlandier F. A., Jones R. A. (2004), “Forecasting

aphid outbreaks and epidemics of Cucumber mosaic virus in lupin crops in a

Mediterranean-type environment”, Virus Res, 100(1), pp. 67-82.

80. Vu V. H., Hong S. I., Kim K. (2007), “Selection of entomopathogenic fungi for

aphid control”, J Biosci Bioeng, 104(6), pp. 498-505.

81. Vu V. H., Hong S. I., Kim K. (2008), “Production of aerial conidia of

Lecanicillium lecanii 41185 by solid-state fermentation for use as

mycoinsecticide”, Mycobiology, 36(3), pp. 183-189.

82. Weiner B. P., Worth R. M. (1972), “Insecticides: household use and respiratory

impairment”, Adverse Effects of Common Environmental Pollutants, MSS

Information Corporation, New York, pp. 149-151.

83. Xia J. (1997), Biological control of cotton aphid (Aphis gossypii Glover) in

cotton (inter) cropping systems in China: a simulation study, S.L. Xia,

Florida.

84. Xu X., Yu Y., Shi Y. (2011), “Evaluation of inert and organic carriers for

Verticillium lecanii spore production in solid-state fermentation”, Biotechnol

Lett, 33, pp. 763-768.

85. Zare R., Gams W. (2001), “A revision of Verticillium sect. Prostrata. III.

Generic classification”, Nova Hedwigia, 72, pp. 329-337.



86. Zhang M., Tang Q., Chen Z., Liu J., Cui H., Q. S., Xia Y., Altosaar I. (2009),

“Genetic transformation of Bt gene into sorghum (Sorghum bicolor L.)

mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,

25(3), pp. 418-423.

87. Zhou P., Zhao Y., Li J., Wu G., Zhang L., Liu Q., Fan S., Yang X., Li X., Wu

Y. (2011), “Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007

Chinese total diet study”, Environ Int, Epub ahead of print, available at

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412011001632.



PHỤ LỤC

Bảng 4.1. Độc lực diệt rệp cải của các chủng nấm Lecanicillium spp. Tỉ lệ rệp chết (%)

Thời gian sau phun (ngày) 0 1 2 3 4 5 6 7

Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0

L18 0 2,3

± 4,0 1,1

± 2,0 2,9

± 5,1 5,1

± 8,9 10,3

± 17,8 17,9

± 31,1 17,3

± 30,0

L43 0 2,6

± 5,2 16,7

± 19,0 29,2

± 18,7 35,9

± 19,4 41,0

± 18,1 47,6

± 19,3 46,2

± 20,9

L85 0 1,7

±3,4 2,6

± 1,7 11,3

± 10,3 11,0

± 7,4 17,1

± 14,4 24,7

± 30,5 24,8

± 32,3

85k 0 12,9

±11,4 29,7

± 28,8 47,4

± 17,8 47,2

± 20,1 50,5

± 18,5 52,8

± 22,3 56,6

± 15,5

485 0 9,2

± 13,1 21,5

± 8,6 31,3

± 21,3 51,3

± 18,6 61,7

± 14,6 60,8

± 16,3 67,4

± 7,4

8514 0 5,2

± 6,6 6,3

± 6,1 17,8

± 21,5 20,7

± 24,7 32,2

± 29,7 39,0

± 31,8 37,5

± 31,4

L1185 0 3,4

± 4,9 7,0

± 7,5 25,7

± 11,2 27,3

± 13,1 39,3

± 10,9 49,4

± 15,4 47,2

± 14,3

Ghi chú: nhiệt độ 21-25°C, độ ẩm không khí 75-80%

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Nguồn cơ chất Kí hiệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 Gạo G 0,19 0,28 1,19 0,55 ± 0,55 2 Bột gạo BG 0,84 0,32 1,30 0,82 ± 0,49 3 Cám gạo CG 2,67 1,37 1,13 1,72 ± 0,83 4 Bột ngô BN 2,25 2,75 3,73 2,96 ± 0,76 5 Bột lõi ngô + bột gạo (1:1, w/w) LG 4,90 4,87 3,57 4,44 ± 0,76 6 Bột lõi ngô + bột ngô (1:1, w/w) LN 4,83 5,33 4,93 5,03 ± 0,26 7 Bột bã mía + bột gạo (1:1, w/w) MG 2,08 1,82 3,07 2,32 ± 0,66 8 Bột bã mía + bột ngô (1:1, w/w) MN 4,10 4,53 2,97 3,87 ± 0,81

Ghi chú: F = 18,57; P < 0,001



Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường lên sự sinh bào tử của

chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Bột lõi ngô: bột ngô (w/w)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 8:2 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00

2 7:3 0,36 0,39 0,49 0,41 ± 0,07

3 6:4 3,10 3,90 6,13 4,38 ± 1,57

4 5:5 4,40 5,40 6,30 5,37 ± 0,95

5 4:6 4,60 4,20 3,97 4,26 ± 0,32

6 3:7 3,50 3,90 3,83 3,74 ± 0,21

7 2:8 3,33 3,67 3,77 3,59 ± 0,23

Ghi chú: F = 25,06; P < 0,001

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Độ dày cơ

chất (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Trung bình

1 9 6,90 6,37 5,43 6,23 ± 0,74

2 11 6,20 5,67 5,77 5,88 ± 0,28

3 13 5,40 6,27 7,17 6,28 ± 0,88

4 15 4,93 5,37 8,23 6,18 ± 1,79

5 17.5 7,30 8,03 7,07 7,47 ± 0,50

6 20 8,37 7,73 7,57 6,93 8,33 8,57 7,92 ± 0,62

7 22,5 7,87 8,00 9,20 10,53 9,60 9,04 ± 1,12

8 25 8,33 11,07 9,57 10,63 9,90 ± 1,22

9 27,5 10,67 10,07 10,17 10,32 ± 0,32

10 30 9,20 10,40 9,77 9,79 ± 0,60

Ghi chú: F = 11,50; P < 0,001



Bảng 4.5. Ảnh hưởng của độ ẩm lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Lượng nước được bổ sung

(% so với cơ chất) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 40 2,00 2,37 1,97 2,11 ± 0,22

2 50 3,57 2,40 2,83 2,93 ± 0,59 3 60 4,20 4,83 5,07 4,70 ± 0,45

4 70 4,37 6,53 5,40 5,43 ± 1,08 5 80 5,03 5,50 4,57 5,04 ± 0,47

6 90 5,20 4,60 5,40 5,07 ± 0,42 7 100 4,30 3,73 4,07 4,03 ± 0,28

8 110 3,27 3,37 3,43 3,36 ± 0,08 Ghi chú: F = 14,96; P < 0,001

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Nhiệt độ (°C)


1 25 4,30 3,20 3,13 3,54 ± 0,66

2 28 4,00 4,70 4,93 4,54 ± 0,49 3 30 8,60 7,63 7,40 7,88 ± 0,64

4 37 0,00 0,00 0,00 0,00 ± 0,00 Ghi chú: F = 117,78; P < 0,001

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Nguồn nitơ


1 Không bổ sung 4,37 6,53 5,40 5,43 ± 1,08

2 NaNO3 2,90 3,47 3,77 3,38 ± 0,44

3 KNO3 5,63 5,00 5,13 5,26 ± 0,33

4 NH4NO3 6,90 7,93 6,50 7,11 ± 0,74

5 (NH4)2SO4 11,73 11,03 12,00 11,59 ± 0,50

6 (NH4)2HPO4 10,80 11,83 10,33 10,99 ± 0,77 Ghi chú: F = 69,36; P < 0,001



Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109)

TT Nồng độ (NH4)2SO4

(mol N/1000g cơ chất) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 0 7,03 6,90 7,07 7,00 ± 0,09

2 0,02 7,00 9,50 8,73 8,41 ± 1,28 3 0,05 8,17 9,57 9,67 9,13 ± 0,84

4 0,1 10,57 11,03 10,53 10,71 ± 0,28 5 0,2 1,60 1,53 1,43 1,52 ± 0,08

6 0,5 0,03 0,01 0,02 0,02 ± 0,01 Ghi chú: F = 139,79; P < 0,001

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Nồng độ MgSO4

(% so với khối lượng cơ chất) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 0,000 11,23 10,80 9,93 10,66 ± 0,66

2 0,020 9,13 9,83 9,57 9,51 ± 0,35

3 0,030 11,53 10,70 10,17 10,80 ± 0,69

4 0,035 12,87 13,23 13,03 13,04 ± 0,18

5 0,040 11,63 11,33 11,43 11,47 ± 0,15

6 0,050 10,50 11,73 11,03 11,09 ± 0,62 Ghi chú: F = 16,40; P < 0,001

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Nồng độ KH2PO4

(% so với khối lượng cơ chất) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1 0,00 11,23 10,80 9,93 10,66 ± 0,66

2 0,10 12,03 11,20 11,43 11,56 ± 0,43

3 0,15 11,30 11,50 11,47 11,42 ± 0,11

4 0,20 11,20 11,27 11,37 11,28 ± 0,08

5 0,25 11,63 11,63 11,50 11,59 ± 0,08

6 0,30 11,87 10,57 11,27 11,23 ± 0,65 Ghi chú: F = 1,96; P > 0,1



Bảng 4.11. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Giờ/ngày


1 0 12,97 13,23 12,67 12,96 ± 0,28

2 12 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50

3 24 11,83 11,77 12,13 11,91 ± 0,20 Ghi chú: F = 12,12; P < 0,01

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sự sinh bào tử của chủng L. lecanii 485

Số lượng bào tử/g cơ chất (x109) TT Thời gian lên men (ngày)


1 6 12,90 12,23 12,57 12,57 ± 0,33

2 8 13,70 13,33 13,57 13,53 ± 0,19

3 10 13,73 12,73 13,30 13,26 ± 0,50

4 12 13,43 13,60 12,87 13,30 ± 0,38

5 14 13,23 13,17 13,40 13,27 ± 0,12 Ghi chú: F = 3,54; P < 0,05



CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

Vu Van Hanh, Le Thi Thuy Duong, Nguyen Huu Quan, Vu Xuan Dat, Quyen Dinh

Thi, Kim Keun (2011), Improvement of Virulence of Entomopathogenic

fungus Lecanicillium sp. L43 towords Aphids, 2011 International Symposium

& Annual Meeting, Translational research in Microbiology and

Biotechnology, Korea.

Vu Van Hanh, Quyen Dinh Thi, Vu Xuan Dat, Nguyen Huu Quan, Kim Keun

(2011), Virulence of Entomopathogenic Fungus Lecanicillium sp. Le85

towards Cotton Aphids, 2011 International Symposium & Annual Meeting,

Translational research in Microbiology and Biotechnology, Korea.

nghiÊn cỨu sỬ dỤng nẤm lecanicillium · sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ...

Documents