nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma
TRANSCRIPT
I
Diseño de la portada: DD DISSENY GRÀFIC, 2011 www.dddisseny.com 93 804 7170 Fotografía e ilustración de Rosaura Esteve Puig
II
Nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma
Tesis Doctoral
Rosaura Esteve Puig
Barcelona, Julio de 2011
III
IV
Nuevo mecanismo de evasión a estrés energético en melanoma
Memoria presentada por Rosaura Esteve Puig
Para optar al grado de
Doctora por la Universitat de Barcelona
Tesis realizada en el Programa de Recerca en Oncologia Mèdica Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron
dirigida por el Dr. Juan Ángel Recio Conde
Tesis adscrita en la Universitat de Barcelona Facultat de Biologia
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular tutorizada por la Dra. Maria Neus Carbó Carbó
Programa de Doctorado en Biomedicina
Bienio 2005-2007
Barcelona, Julio de 2011
Dr. Juan Ángel Recio Conde Dra. Maria Neus Carbó Carbó Rosaura Esteve Puig Director Tutora Doctoranda
V
VI
VII
VIII
«...que tot està per fer i tot és possible...»
Ara mateix
L'àmbit de tots els àmbits (1981)
Miquel Martí i Pol
IX
X
A tots els qui estan aquí dins
1
2
3
4
CONTENIDO
ÍNDICE 6
ABREVIATURAS 15
INTRODUCCIÓN 23
OBJETIVOS 59
RESULTADOS 63
DISCUSIÓN 111
CONCLUSIONES 125
MATERIALES Y MÉTODOS 129
BIBLIOGRAFÍA 151
ANEXO 173
5
6
ÍNDICE 6
Índice de figuras 10
Índice de tablas 14
ABREVIATURAS 15
Símbolos 22
INTRODUCCIÓN 23
CÁNCER 26
MELANOMA 28
Generalidades del melanoma 28
Aspectos clínicos 29
Biología del melanocito 29
Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del
melanoma 30
Progresión del melanoma cutáneo 31
Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma
maligno 33
MC1R 34
CdkN2A (p16INK4a y p14ARF) 34
PTEN 35
RAS 35
BRAF 35
LKB1/STK11 36
MITF 36
Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK 37
Vía de señalización PI3K/AKT/PKB 37
Otras vías de señalización 40
Tratamiento del melanoma 40
Dianas terapéuticas 41
BRAF 44
Generalidades del gen BRAF 44
BRAF mutante en tumores malignos y benignos 45
BRAF y melanoma 45
Senescencia y BRAF 46
Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia
tumoral 46
7
LKB1/STK11 48
Generalidades del gen LKB1/STK11 48
Complejo LKB1:STRAD:MO25 49
LKB1 como multicinasa 50
LKB1 como supresor tumoral 51
Modificaciones postraduccionales de LKB1 52
Funciones de LKB1 53
Sensor del metabolismo energético 53
Control de la polarización celular 54
Control del ciclo celular 55
MODELOS DE MELANOMA MURINOS 55
OBJETIVOS 59
RESULTADOS 63
Identificación de fosfoproteínas implicadas en la señalización del Factor de
Crecimiento de Hepatocitos (HGF) mediante el análisis proteómico DIGE y MALDI
TOF/TOF 66
El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de la vía de
señalización RAS/RAF/MEK/ERK/p90RSK 69
LKB1S428 se fosforila en respuesta a diferentes factores de crecimiento y se
encuentra constitutivamente fosforilada en líneas celulares de melanoma
mutantes en BRAFV600E y en muestras tumorales 74
Las células de melanoma mutantes en BRAFV600E tienen alterada la respuesta a
estrés metabólico 79
El tratamiento con factores de crecimiento induce el desacoplamiento del
complejo LKB1-AMPKα 84
El efecto oncogénico de BRAFV600E induce el desacoplamiento del complejo LKB1-
AMPKα 90
La reconstitución de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 por la inhibición del
efecto oncogénico de BRAFV600E en condiciones de estrés energético induce
apoptosis 93
8
La apoptosis inducida por estrés metabólico tras la inactivación del oncogén
BRAFV600E está mediada por miembros de la subfamilia BH3 98
La inhibición de la vía de RAS/MEK/ERK bajo estrés energético restaura la
respuesta a estrés energético en células de melanoma mutantes en NRASQ61R
99
Agonistas de AMPK como posibles terapias en cáncer 102
El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto
oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis
102
El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del efecto
oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce apoptosis
en células de melanoma mutantes en NRASQ61K u otras mutaciones derivadas de
pacientes 106
DISCUSIÓN 111
CONCLUSIONES 125
MATERIALES Y MÉTODOS 129
Plásmidos 132
Generación de plásmidos 132
Diseño de los cebadores 132
Amplificación del gen de interés 133
Purificación del producto de la PCR y de la digestión enzimática 134
Defosforilación 134
Ligación 134
Transformación bacteriana 135
Maxipreps 135
Secuenciación del gen de interés clonado en el vector correspondiente
136
Generación de plásmidos mutantes 136
Generación de los plásmidos shRNA 137
Cultivos celulares 138
Líneas celulares 138
9
Congelación 139
Tripsinización 139
Muestras tumorales 140
Reactivos y anticuerpos 140
Inhibidores, factores de crecimiento y fármacos 140
Anticuerpos para western blot 141
Anticuerpos para inmunoprecipitación 142
Transfección, infección retroviral y lentiviral 142
Transfección transitoria de plásmidos 142
Transfección transitoria de siRNA 143
Infección retroviral 143
Infección lentiviral 143
Purificación de fosfoproteínas 144
Análisis proteómico: DIGE y MALDI TOF/TOF 145
Inmunoprecipitación y Western Blot 146
Inmunoprecipitación 146
Western Blot 147
Ensayo de viabilidad celular y apoptosis 148
Ensayo de formación de colonias 149
Análisis de imagen 150
BIBLIOGRAFÍA 151
ANEXO 173
Figuras Anexo 176
Tablas Anexo 181
Publicación 194
10
Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo
fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones
somáticas que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de
los procesos medioambientales que contribuyen en ésta 27
Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito 32
Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma 39
Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de
la organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios
funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína
LKB1 de Mus musculus 49
Figura 5I/ Representación gráfica de una parte del dendograma del cinoma
humano 50
Figura 1R/ Validación de los candidatos identificados por MALDI TOF/TOF
implicados en la señalización del HGF/c-Met 68
Figura 2R/ El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de
la vía de señalización de RAS/MEK/ERK e independientemente de la línea
celular 70
Figura 3R/ El perfil de fosforilación LKB1S428 en respuesta al HGF a lo largo
del tiempo correlaciona con el perfil de fosforilación de p90RSK (T359/S363) y
de ERK1/2T202/Y204 71
Figura 4R/ La inhibición total de MEK1/2 suprime los niveles de fosforilación
de ERK1/2, de p90RSK y de LKB1 71
Figura 5R/ La defosforilación del residuo Ser431 de Lkb1 está mediada por
fosfatasas de residuos Ser/Thr 72
Figura 6R/ La inhibición total de p90RSK suprime parcialmente los niveles de
fosforilación de Lkb1S431 73
11
Figura 7R/ El residuo Ser431 murino/Ser428 humano de LKB1 se fosforila en
respuesta a distintos factores de crecimiento 74
Figura 8R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E muestran una
fosforilación constitutiva de la Ser428 de LKB1 75
Figura 9R/ Correlación positiva entre los niveles de fosforilación de LKB1 y
de ERK1/2 en muestras tumorales murinas 76
Figura 10R/ Los tumores de mama HER-2 positivos presentan elevados niveles de
fosforilación de la Ser428 de LKB1 respecto los tumores HER-2 negativos 77
Figura 11R/ Las muestras tumorales de carcinoma endometrial respecto las
muestras normales del paciente presentan elevados niveles de fosforilación de
la Ser428 de LKB1 78
Figura 12R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E presentan
una mínima respuesta a estrés energético, y la anulación del efecto
oncogénico de BRAF mediante el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126)
recupera la respuesta a estrés energético 80
Figura 13R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAF en las líneas
celulares de melanoma BRAFV600E aumenta la respuesta a estrés energético por
AICAR 81
Figura 14R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E mediante el
tratamiento con sorafenib o el silenciamiento génico de BRAF restaura la vía
de estrés energético en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E
82
Figura 15R/ La inhibición de p90RSK en las líneas celulares de melanoma
BRAFV600E no restaura la vía de estrés energético 84
Figura 16R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPK 86
Figura 17R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα
independientemente de la actividad catalítica de LKB1 y dependientemente de
la integridad del residuo Ser428 de LKB1 88
Figura 18R/ AMPKα se une directamente o indirectamente al dominio C-terminal
de LKB1 89
12
Figura 19R/ La inhibición de la señalización de BRAFV600E reasocia los
complejos de LKB1-AMPKα en respuesta a estrés energético 91
Figura 20R/ El efecto oncogénico de BRAFV600E induce la disociación del
complejo LKB1-AMPKα 92
Figura 21R/ La restauración de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en las células
de melanoma BRAFV600E por la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E induce
apoptosis en condiciones de estrés energético 94
Figura 22R/ Las células de melanoma BRAFV600E se sensibilizan a estrés
energético a partir de las 4 horas de tratamiento por inhibición del efecto
oncogénico de BRAFV600E presentando un mecanismo apoptótico independiente de
p53 96
Figura 23R/ AMPK (AMPKα1 y AMPKα2) se encuentra implicado en la restauración
de la vía de estrés energético y en la activación de la apoptosis bajo estrés
energético 97
Figura 24R/ Miembros de la subfamilia BH3 median la apoptosis inducida por la
inactivación del efecto oncogénico de BRAFV600E bajo estrés metabólico 98
Figura 25R/ La inhibición del efecto oncogénico de NRASQ61R permite la
restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 100
Figura 26R/ La sensibilización a la apoptosis en células de melanoma mutantes
en NRASQ61R está mediada por la restauración de la vía de estrés energético
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 101
Figura 27R/ Restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
en respuesta a metformina e inhibición de la vía de RAS 103
Figura 28R/ Citotoxicidad en las líneas celulares de melanoma humanas BRAFV600E
y NRASQ61R en respuesta a metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS
105
Figura 29R/ Restauración de la vía de estrés energético en células de
melanoma NRASQ61K/WT derivadas de pacientes mediante el tratamiento que combina
la metformina/phenformin junto la inhibición de la vía de RAS 107
13
Figura 30R/ Restauración de la vía de estrés energético en las líneas
celulares de melanoma NRASQ61K derivadas de pacientes en respuesta a
metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS 108
Figura 1D/ Modelo de restauración del metabolismo «normal» en melanoma.
Restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 por la
inhibición de la vía de RAS en condiciones de estrés energético induce
apoptosis 115
Figura 2D/ Modelo de la señalización oncogénica de BRAFV600E, NRASQ61R, u otras
alteraciones en la actividad de los receptores tirosina cinasa en cáncer
118
Figura 3D/ Modelo de regulación negativa de la actividad de la vía de
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediado por la señalización oncogénica de BRAFV600E o
NRASQ61R 120
Figura 1A/ Esquema del procedimiento experimental de purificación de
fosfoproteínas y del análisis proteómico; e imagen del gel DIGE de los
complejos de fosfoproteínas purificados en respuesta al Factor de Crecimiento
de Hepatocitos (HGF) 176
Figura 2A/ Listado de parte de los candidatos identificados implicados en la
señalización del HGF/c-Met por espectometría de masas (MALDI TOF/TOF) 177
Figura 3A/ El inhibidor de MEK1/2 U0126 no tiene efecto sobre la activación
de AMPKα a las concentraciones de 1µM hasta 10µM 178
Figura 4A/ Las líneas celulares de melanoma murinas y humanas silenciadas de
manera estable para LKB1 muestran que tan sólo una pequeña población de LKB1
se modifica en respuesta al HGF 179
14
Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno 33
Tabla 1A/ Modelos murinos de melanoma 181
Tabla 2A/ Secuencias de los oligonucleótidos o cebadores utilizados para el
clonaje y para la mutagénesis dirigida 183
Tabla 3A/ Características de los vectores plasmídicos generados 184
Tabla 4A/ Líneas celulares y sus características 186
Tabla 5A/ Anticuerpos específicos para WB e inmunoprecipitación (IP) 189
15
16
17
18
A ADN Ácido Desoxiribonucleico
AKT3 Oncogén viral del timoma murino AKT homólogo 3 (proteína cinasa
B, gamma), del inglés v-akt murine thymoma viral oncogene
homolog 3 (protein kinase B, gamma)
AMP Adenosina monofosfato, del inglés adenosine monophosphate
AMPc Monofosfato de Adenosina Cíclico, del inglés cyclic Adenosine
3’-5’-Monophosphate o cAMP
AMPK Proteína Cinasa Activada por 5’-AMP, siglas del inglés 5’-AMP
activated Protein Kinase
ARN Ácido Ribonucleico
ARNm Ácido Ribonucleico mensajero, del inglés messenger ribonucleic
acid (mRNA)
ATM Del inglés Ataxia-Telangiectasia-Mutated
ATP Trifosfato de Adenosina, del inglés Adenosine Triphosphate
B BCL-2 Del inglés B-Cell Leukaemia/lymphoma 2
BRAF Oncogén viral de sarcoma murino, del inglés v-raf murine
sarcoma viral oncogene homolog B1
BRG1 Del inglés Brahma/SWI2-Related Gene 1
BSA Albúmina Sérica Bovina, del inglés Bovine Serum Albumin
C CDK Cinasa Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin Dependent
protein Kinases
CdkN2A Inhibidor de Cinasas Dependiente de Ciclina, del inglés Cyclin-
Dependent Kinase inhibitor 2A
CDS Secuencia codificante, del inglés coding sequence
CREB Elemento de respuesta de unión a AMPc, del inglés cAMP-
Responsive Element Binding
D/E DIGE Electroferesis Bidimensional Diferencial Cuantitativa en Gel
con tinción Fluorescente, del inglés Fluorescence 2-D
Difference In Gel Electrophoresis
DMEM Del inglés Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO Del inglés Dimethyl sulfoxide
EGF Factor de Crecimiento Epidérmico, del inglés Epidermal Growth
Factor
19
EGFP Proteína de Fluorescencia Destacadamente Verde, del inglés
Enhanced Green Fluorescent Protein
ERK Cinasa Regulada por señales Extracelulares, del inglés
Extracellular-signal Regulated Kinase
F FACS Del inglés Fluorescence Activated Cell Sorting
FBS Suero Fetal Bovino, del inglés Fetal Bovine Serum
FGF Factor de Crecimiento de Fibroblastos, del inglés Fibroblast
Growth Factor
FITC Isotiocianato Fluorescente, del inglés Fluorescein
Isothiocyanate
Forskolin Forskolin es un extracto que proviene del Coleus forskohlii,
7β-Acetoxy-8,13-epoxy-1α,6β,9α-trihydroxylabd-14-en-11-one
G GFP Proteína Verde Fluorescente, del inglés Green Fluorescent
Protein
GP Genes virales gag (matriz, cápside y nucleocápside), y pol
(integrasa y transcriptasa reversa)
GPCR Receptor con 7 dominios transmembrana Acoplado a la Proteína G,
del inglés G Protein Coupled Receptor
GST Del inglés Glutathione-S-Transferase
H HER-2 Receptor de tipo 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano,
del inglés Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
HGF Factor de Crecimiento de Hepatocitos, del inglés Hepatocyte
Growth Factor
HIF1α Del inglés Hypoxia Inducile Factor 1 alpha
Hsp90 Del inglés Heat-shock protein 90
I/J/K/L IFN-α Interferón alpha, del inglés Interferon-α
IGF-1 Factor de Crecimiento similar a la Insulina de tipo 1, del
inglés Insulin like Growth Factor
IP Inmunoprecipitación
KD Inactividad catalítica de la cinasa, del inglés kinase dead
LKB1 Del inglés Liver Kinase B1 o Serine/threonine kinase 11 (Stk11)
20
M/N MAPK Del inglés Mitogen-Activated Protein Kinase
MC1R Receptor de la Melanocortina de tipo 1, del inglés Melanocortin
Type 1 Receptor
Metformin 1,1-Dimethylbiguanide hydrochloride, fármaco antidiabético
MITF Factor de transcripción asociado a la microftalmia, del inglés
Microphtalmia-associated Transcription Factor
MO25 Del inglés Mouse protein 25
MSH-α Hormona Estimulante del Melanocito de tipo alpha, del inglés
Melanocyte Stimulating Hormone-alpha
mTOR Del inglés mammalian Target Of Rapamycin
NRAS Oncogén viral RAS de neuroblastoma, del inglés neuroblastoma
RAS viral oncogene homolog
NSCLC Del inglés Non-Small Cell Lung Carcinoma
O/P/Q OA Del inglés okadaic acid, aislado en Halichondria okadai
OIS Oncogén inductor de senescencia, del inglés Oncogene-Induced
cellular Senescence
PBS Tampón Salino, del inglés Phosphate Buffered Saline
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa, del inglés Polymerase
Chain Reaction
PDGF Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas, del inglés
Platelet Derived Growth Factor
PDGFRβ Receptor-β del Factor de Crecimiento que Deriva de Plaquetas,
del inglés Platelet Derived Growth Factor Receptor-β
PJS Del inglés Peutz-Jeghers Syndrome
PKA Del inglés Protein Kinase A
pRb Proteína del Retinoblastoma, del inglés Retinoblastoma protein
PTEN Fosfatasa lipídica PTEN, del inglés Phosphatase and Tensin
homolog
PVDF Fluoruro de Polivinilideno, del inglés polyvinyledene fluoride
R/S RAF Del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene
RGP Fase de Crecimiento Radial, del inglés Radial-Growth Phase
RHEB Del inglés Ras Homologue Enriched in Brain
RTK Receptor Tirosina Cinasa, del inglés Receptor Tyrosine Kinase
S Fase de síntesis del ciclo celular
SCF Factor de Célula Madre, del inglés Stem-Cell Factor
21
SDS-PAGE Electroforesis en gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato, del
inglés Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
Ser Serina, del inglés serine
shRNA Del inglés small hairpin ribonucleic acid
siRNA Del inglés small interfering ribonucleic acid (RNA)
STK11 Cinasa 11 de residuos serina y treonina, del inglés
Serine/Threonine Kinase 11 o LKB1
STRAD Del inglés STE20-Related Adaptor
T TB Del inglés Terrific Broth
TBS Del inglés Tris Buffered Saline
TBST TBS-0,1%Tween
TERT Transcriptasa Reversa de la Telomerasa, del inglés Telomerase
Reverse Transcriptase
Thr Treonina, del inglés Threonine
Tm Temperatura de fusión, del inglés melting Temperature
TNFα Factor alpha de Necrosis Tumoral, del inglés Tumor Necrosis
Factor-alpha
TPA Promotor Tumoral de Éster-Forbol, del inglés Phorbol-ester
Tumor Promoter
TPM1 Tropomiosina de tipo 1
Tyr Tirosina, del inglés Tyrosine
TYR Tirosinasa
U/V UV Ultravioleta, del inglés Ultraviolet
VEGF Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR-2 Del inglés Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2
VGP Fase de Crecimiento Vertical, del inglés Vertical-Growth Phase
W/X/Y/Z WB Del inglés Western Blot
wt Tipo Salvaje, del inglés wild type
22
A Alanina
AA Aminoácido
D Ácido aspártico
Da Dalton
E Ácido glutámico
ºC Grados Celsius
h Hora
K Lisina
kb Kilobase
KDa Kilo Dalton
µg Microgramo
min Minuto
µl Microlitro
ml Mililitro
µM Micro Molar
M Molar
ng Nanogramo
nm Nanómetro
pb Pares de bases nucletotídicas
% Porcentaje o tanto por ciento
Q Glutamina
R Arginina
rcf o g Fuerza de centrífuga relativa, del inglés Relative Centrifugal
Force or g-force
rpm Revoluciones por minuto
S Serina
T Treonina
U Unidad/unidades
V Valina
V Volt
Algunas de las siglas y abreviaturas se describen en su lengua de origen, el inglés, y
figuran con la tipología en cursiva, por no tener una clara traducción a la lengua
castellana, o ser ésta poco empleada.
23
24
25
26
CÁNCER
El cáncer es una enfermedad biológica y clínicamente compleja que engloba a
más de 100 enfermedades distintas con diversos factores de riesgo.
Responsable de una de cada ocho muertes en todo el mundo1 y de una de cada
cinco en Estados Unidos2.
Los diferentes tipos de cáncer comparten una patogénesis común, representando
cada uno de ellos el resultado de un proceso de evolución Darwiniano. Así,
inspirado en la teoría evolutiva, los primeros pasos del desarrollo
neoplásico tumoral son debido a un proceso de selección natural. De modo que
la inestabilidad genómica produce poblaciones celulares genéticamente
distintas, generándose así, clones agresivos emergentes con distintos grados
de metástasis como restultado final del proceso evolutivo3,4.
De manera genérica, la tumorogenésis implica múltiples pasos limitados al
mismo linaje celular, que tiene como resultado la conversión de una célula
normal en una tumoral. Esta conversión se basa en dos procesos, la
adquisición continua de alteraciones genéticas y la selección natural que
actúa sobre la diversidad fenotípica resultante (Figura 1I (Introducción)).
En muchos cánceres, la regulación de las moléculas implicadas en la
señalización celular se encuentra alterada, afectando a otras proteínas y a
distintos procesos biológicos celulares. De este modo, la mayor parte de los
tumores adquieren un conjunto de mutaciones ventajosas que son reflejo de los
efectos de los mutágenos internos de la propia célula, y de los mutágenos
externos a la célula. Consideramos mutágenos internos los defectos en la
reparación del ADN que contribuyen en incrementar la carga mutacional5, y
mutágenos externos los factores medioambientales que participan activamente
en el aumento del riesgo de cáncer. Consecuentemente, estos efectos en el
genoma de la célula normal provocan transformaciones en la célula tumoral
maligna que permiten una proliferación celular autónoma no restrictiva, fase
conocida como expansión clonal que puede desencadenar una fase de invasión
tumoral fuera de los límites del tejido normal, hasta llegar a una fase
metastática a órganos distantes. Además, en el genoma de la célula tumoral se
han descrito mutaciones que se seleccionan durante el inicio de los procesos
terapéuticos, confiriendo una resistencia al tratamiento (Fig.1I). También
indicar que el ambiente tumoral crea unas condiciones de estrés, como son los
bajos niveles de oxígeno y de nutrientes, y los elevados niveles de productos
residuales tóxicos que proceden del metabolismo celular tumoral, donde las
27
células tumorales se adaptan para sobrevivir, se transforman en un fenotipo
tumoral resistente a la muerte celular, e incluso prometastático.
Figura 1I/ Linaje de las divisiones celulares mitóticas desde el huevo
fertilizado hasta la célula sencilla tumoral mostrando las mutaciones somáticas
que se adquieren a lo largo del tiempo en la célula tumoral y de los procesos
medioambientales que contribuyen en ésta6.
Las mutaciones pueden ser adquiridas mientras el linaje celular es fenotípicamente normal,
reflejo de las mutaciones intrínsicas adquiridas y de los efectos de los mutágenos exógenos
durante la división celular normal. Así, el ADN de las células normales se encuentra
continuamente dañado por los mutágenos de origen interno y externo, pero la mayor parte de
este daño se repara. En contra, durante el desarrollo del cáncer los defectos en la
reparación del daño al ADN pueden contribuir en la carga mutacional de la célula tumoral5. En azul mutaciones intrínsecas, en naranja mutaciones por exposición a mutágenos externos
medioambientales, en rojo mutaciones dirigidas, en gris mutaciones que confieren resistencia a
la quimioterapia.
En la tumorogénesis, el genoma de la célula tumoral maligna adquiere seis
alteraciones esenciales como son la autosuficiencia a las señales de
crecimiento, la insensibilidad a las señales inhibitorias de crecimiento, la
evasión del programa de muerte celular, la adquisición del potencial de
replicación ilimitado, la sostenida angiogénesis, la invasión a tejidos y la
metástasis7.
Además, se ha añadido una séptima alteración esencial en el genoma de la
célula tumoral8, la adquisición de un metabolismo aberrante, descrita por Otto
Warburg en 19569 y revisada recientemente, donde se sugiere que puede ser
clave en el tratamiento del cáncer. Según Warburg, las células tumorales
pueden obtener la misma cantidad de energía de la fermentación como de la
respiración9, utilizando una cantidad muy elevada de glucosa. Así, las células
tumorales utilizan diez veces más de glucosa respecto las células normales,
metabolizándola principalmente a lactato bajo condiciones normales de
28
oxígeno, proceso denominado glucólisis aeróbica, ya que «fermentan» en
presencia de oxígeno. No obstante, en células normales la fermentación o
glucólisis es un proceso bioenergético ineficiente comparado con la
respiración o fosforilación oxidativa mitocondrial. Así, la glucólisis
aeróbica es un fenómeno característico de las células tumorales, necesario
para sostener el elevado índice de proliferación, y asegurar el crecimiento y
la división celular, procesos que requieren una fuente extra energética y
nutricional.
De este modo, la alteración del metabolismo celular de la célula tumoral
junto a las seis alteraciones descritas previamente, permiten retratar de
manera más completa el fenotipo transformante maligno. De manera que algunas
de las nuevas aproximaciones terapéuticas actuales en cáncer son terapias que
consisten en dianas implicadas en la transformación metabólica tumoral, que
en la actualidad se están investigando en ensayos preclínicos y clínicos10.
Otra subclase de alteraciones en cáncer son las mutaciones que confieren a
algunos tumores resistencia a la radioterapia y quimioterapia, alteraciones
que se pueden atribuir al metabolismo aberrante. De este modo, la
reactivación del metabolismo «normal» en el tumor podría resensibilizar a las
células tumorales, provocando un estado de quiescencia, y ser finalmente más
favorable a otras intervenciones.
MELANOMA
Generalidades del melanoma
El melanoma cutáneo es uno de los cánceres de piel menos frecuente, y
representa el más letal. Su incidencia ha aumentado en la población
occidental hasta triplicarse el número de casos en los últimos 30 años11,12,
siendo la sexta causa de malignidad más frecuente en humanos11.
Como ocurre en muchos cánceres, en el melanoma cutáneo existe una
predisposición genética y un riesgo asociado a ciertos agentes
medioambientales. De esta manera, el aumento de la incidencia del melanoma
cutáneo, y la elevada letalidad asociada a su progresión, ha motivado grandes
esfuerzos para definir los factores genéticos y medioambientales que conducen
a la génesis y a la progresión del melanoma.
El melanoma junto con el carcinoma de células basales y el carcinoma de
células escamosas comprenden los distintos tipos de cáncer de piel. Respecto
a su etiología en relación a los factores medioambientales, estudios
epidemiológicos revelan que el carcinoma de células escamosas y el de células
basales se encuentran asociados a la acumulación del daño al ADN mediado por
29
la radiación ultravioleta (UV) a lo largo de la vida, mientras que el
melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a exposiciones de
radiación UV intensas e intermitentes.
En función del tipo de exposición a la radiación UV y su distribución
anatómica, el melanoma cutáneo se clasifica en diferentes tipos, como son el
melanoma de extensión superficial, el melanoma nodular, el melanoma
lentiginoso, el melanoma lentiginoso maligno, el melanoma mucoso acral, el
melanoma lentiginoso acral, y otros subtipos menos comunes como el nevus
celular maligno azul, el melanoma desmoplásico, y el melanoma nevoide.
Aspectos clínicos
Los signos clínicos clásicos del melanoma son la asimetría, la irregularidad
del perímetro, el color, el diámetro, la elevación, el sangrado y el índice
mitótico13, signo añadido recientemente. Un examen regular de los signos
clínicos clásicos del melanoma permite el diagnóstico del melanoma en una
fase precoz, que junto una resección quirúrgica del melanoma hacen que el
tratamiento sea eficaz en un 80 % de los casos. Sin embargo, la deficiencia
de un examen regular de los signos clínicos del melanoma aumenta las
probabilidades que el primer diagnóstico de un melanoma maligno cutáneo
corresponda a un melanoma de fase avanzada. Desgraciadamente, la inexistencia
de terapias eficaces en el melanoma de fase avanzada conduce a un mal
pronóstico, con un índice de supervivencia de 6 meses; donde solamente un 5 %
de estos casos muestran un índice de supervivencia de 5 años14. Estos datos
indican el requerimiento urgente de nuevas estrategias terapéuticas efectivas
para el melanoma.
Biología del melanocito
El melanoma cutáneo proviene de los melanocitos cutáneos, células pigmentadas
especializadas en la producción del principal pigmento responsable de la
coloración de la piel, denominado melanina. Los melanocitos cutáneos derivan
de la cresta neural y migran hasta la piel durante el desarrollo embrionario,
y éstos finalmente residen en los folículos pilosos y en la lámina basal de
la epidermis, donde se encuentran como células individualizadas intercaladas
entre los queratinocitos basales, existiendo una homeostasis regulada por los
queratinocitos15.
En respuesta a la radiación UV, los queratinocitos secretan factores que
regulan la supervivencia, la diferenciación, la proliferación y la motilidad
del melanocito. Y además, estimulan la producción de melanina en los
melanocitos que tiene como resultado el bronceado de la piel. Concretamente,
en respuesta a la radiación UV los queratinocitos secretan la hormona
30
estimulante del melanocito (MSH-α) que activa a la enzima adenilil ciclasa
(AC) a través de la vía de la activación del receptor de la melanocortina de
tipo 1 (MC1R) del melanocito, donde la vía MC1R es la vía de señalización
reguladora más importante de pigmentación. La activación del MC1R por MSH-α
promueve el aumento intracelular del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc),
que tiene como resultado la activación transcripcional de múltiples genes
diana, como el factor de transcripción de la microftalmia (MITF), de la
tirosinasa (TYR) y de otras enzimas necesarias para la síntesis de melanina16.
Así, los melanocitos tienen una función protectora clave en la piel frente al
daño al ADN por efecto de la radiación UV.
En la biología del melanocito, el AMPc juega un papel muy importante en la
proliferación y en la diferenciación, donde el AMPc activa la vía de ERK de
manera dependiente de RAS y de BRAF17,18. La señalización por AMPc promueve la
fosforilación de CRAF, la incapacidad de unión a RAS, y finalmente su
inactividad19,17. Por este motivo, los melanocitos utilizan BRAF como efector
principal de RAS, y de manera semejante, los melanocitos malignos presentan
predominantemente mutaciones en BRAF y no en CRAF.
Factores genéticos y medioambientales asociados a la adquisición del
melanoma
En el melanoma, como en la mayoría de cánceres, los factores de riesgo
incluyen componentes genéticos y medioambientales.
El melanoma es un tumor heterogéneo y con una elevada complejidad genética
que incluye lesiones genéticas como la pérdida de supresores tumorales y/o la
activación de oncogenes. Además, existen elementos genéticos adicionales que
dirigen el proceso de melanomagénesis.
El melanoma se encuentra asociado a la radiación solar, uno de los agentes
carcinogénicos esencial para el desarrollo de lesiones premalignas en la
piel. Por consiguiente, la exposición a la radiación solar se encuentra
fuertemente implicada en la etiología del melanoma maligno cutáneo, siendo el
máximo responsable la porción de radiación UV que proviene del espectro
solar. La radiación solar está compuesta por radiación visible, infrarroja y
UV, entre otras. Existen tres tipos de radiación UV, radiación UV de tipo A
(UV-A, 400-320nm), UV-B (320-290nm) y UV-C (290-200nm), donde únicamente las
radiaciones de tipo UV-A y UV-B alcanzan la superficie terrestre. La
radiación UV-A y UV-B ejercen muchos tipos de efectos sobre la piel,
incluyendo el bronceado, la carcinogénesis, la inmunomodulación y la
producción de vitamina D.
El aumento de la incidencia de melanoma se ha asociado epidemiológicamente
con la disminución del grosor de la capa de ozono estratosférica durante
estos últimos 30 años20,21, ya que la reducción de la capa de ozono ocasiona un
31
aumento de la radiación UV-A y UV-B en la superfície terrestre22, causando
efectos mutagénicos y carcinogénicos sobre la piel23. Así, la mayor exposición
y el aumento de la intensidad en la superficie terrestre de la radiación UV
inducirían un mayor daño al ADN de los melanocitos, y facilitarían
potencialmente la melanomagénesis. En este sentido, estudios epidemiológicos
indican que una elevada e intensa exposición a la radiación UV,
particularmente en neonatos, puede tener como consecuencia un aumento de la
formación de melanomas cutáneos malignos24,25. En cambio la exposición
acumulativa y crónica a la radiación UV a lo largo de la vida se puede
encontrar asociada al desarrollo de otras formas de cáncer de piel, como son
los carcinomas de células escamosas.
Progresión del melanoma cutáneo
El melanoma cutáneo se encuentra fuertemente asociado a mutaciones críticas
en los genes reguladores del crecimiento, como los onocogenes BRAF y NRAS, y
en los genes reguladores del ciclo celular, como el gen CdkN2A que codifica
dos supresores tumorales p16INK4a y p14ARF. También se encuentra asociado a la
producción autocrina de los factores de crecimiento, como son el factor de
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de crecimiento que
deriva de plaquetas de tipo A (PDGF-A) y el factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF); a la pérdida de los receptores de adhesión que contribuyen
en la disrupción de la señalización intracelular de los melanocitos, como la
molécula de adhesión celular en melanoma (MCAM) y E-cadherina; y en la
capacidad del melanocito a escapar de la regulación fisiológica que existe
por parte de los queratinocitos26. Por lo tanto, la adquisición de las
mutaciones críticas citadas anteriormente en los melanocitos normales son
responsables del desarrollo y progresión del melanoma.
Así, existe un modelo de desarrollo y progresión del melanoma cutáneo
globalmente admitido. En una primera fase, los melanocitos pueden proliferar
y extenderse provocando la formación de un nevus (Fig.2I). Esta proliferación
en los melanocitos puede ser restrictiva en la epidermis, dando lugar al
nevus de adhesión epidérmico; en la dermis, formando el nevus dérmico; o en
ambos compartimientos, sucediendo el nevus compuesto. Los nevus son
generalmente benignos pero pueden progresar a la fase de crecimiento radial
del melanoma cutáneo (Radial Growth Phase, RGP), e incluso pueden dar lugar a
una lesión intraepidérmica con una microinvasión local de la dermis. Las
células de la fase RGP pueden progresar hasta llegar a la fase de crecimiento
vertical (Vertical Growth Phase, VGP), siendo el estadio más peligroso debido
al potencial metastático de las células. Así, entre otras características,
las células en VGP presentan una pérdida de expresión de E-cadherina, y un
32
aumento de expresión de N-cadherina, características que confieren la
capacidad de invadir la dermis, e incluso pudiendo conferir la capacidad de
infiltrarse al sistema vascular y linfático (Fig.2I). No obstante, no todos
los melanomas cutáneos pasan por cada una de estas fases, ya que un 50 % de
los melanomas cutáneos no provienen de la progresión maligna del nevus.
Figura 2I/ Progresión de la transformación del melanocito
(A) Piel normal. Con una distribución de los melanocitos dendríticos en la lámina basal de
la epidermis. (B) Nevus. Como primer estadio del melanoma, el nevus melanocítico benigno
presenta un aumento del número de melanocitos dendríticos. (C) Fase de crecimiento radial
(RGP) del melanoma. Se considera como la primera fase del melanoma maligno con la migración
de los melanocitos a la epidermis, formando nidos de melanocitos que no pueden penetrar la
membrana basal epidérmica. (D) Fase de crecimiento vertical (VGP) del melanoma maligno.
33
Fase con un elevado potencial maligno y metastático, debido a la invasión de los
melanocitos en la dermis y a la capacidad de infiltración de los melanocitos al sistema
vascular linfático.
Alteraciones genéticas y vías de señalización claves en el melanoma
maligno
El melanoma es una enfermedad genéticamente compleja. Las alteraciones
genéticas más frecuentes en melanoma son los polimorfismos en el gen receptor
de la melanocortina de tipo 1 (MC1R)27,28,29,30; las mutaciones en los oncogenes
como el oncogén viral del sarcoma murino RAF homólogo B1 (BRAF)31 y el oncogén
viral RAS de neuroblastoma (NRAS)31,32; la sobreexpresión del oncogén viral del
timoma murino AKT homólogo 3 (AKT3)33; las deleciones de los supresores
tumorales como el inhibidor de cinasas dependiente de ciclinas 2A (CdkN2A)34,
la fosfatasa lipídica PTEN33,35, el APAF-136, el p5337 y el LKB138; y además, la
amplificación de otros genes como la ciclina D139 y el factor de transcripción
asociado a la microftalmia (MITF)40 (Tabla 1I (Introducción)).
Tabla 1I/ Alteraciones genéticas en melanoma maligno
Tipos de genes Gen Frecuencia (%)/ alteración en melanoma
Referencias
Oncogenes BRAF 50-70 % /mutado 31
NRAS 15-30 % /mutado 31,32
AKT3 Sobreexpresado 33
Supresores tumorales
CDKN2A 30-70 % /delecionado, mutado o silenciado
34
PTEN 5-20 % /delecionado o mutado 33,35
APAF-1 40 %/ silenciado 36
p53 10 % /pérdida o mutado 37
Stk11 (LKB1) 10 % /mutado 38
Otros Ciclina D1 6-44 % /amplificado 39
MC1R polimorfismos 27,28,29,30 MITF 10-16 % /amplificado 40
El resultado de numerosas investigaciones en los últimos años, indican que la
vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK y la vía de señalización PI3K/AKT son las
vías de señalización más importantes en el desarrollo y mantenimiento del
melanoma. Estas vías de señalización son reguladoras claves en la
proliferación del melanoma. De este modo, la vía de RAS/RAF/MEK/ERK se
encuentra hiperactivada en un 90 % de los melanomas humanos presentando
mutaciones en el oncogén BRAF con un 50-70 %, o en NRAS con un 15-30 %, y la
vía de PI3K/AKT se encuentra hiperactivada por la pérdida del supresor
tumoral PTEN con un 5-20 % (Tabla 1I). Sorprendentemente, una única mutación
en estas vías de señalización no es suficiente para promover el desarrollo
34
del melanoma, pero la combinación de mutaciones en ambas vías de señalización
promueve la melanomagénesis32,17,41.
Además, destacar que el factor de transcripción asociado a la microftalmia
(MITF), considerado por ser un regulador clave en la biología del melanocito,
se encuentra amplificado con una frecuencia de un 16 % de los melanomas
humanos40.
Receptor de la melanocortina de tipo 1 (MC1R)
El riesgo de melanoma se modula por alteraciones en los patrones de
pigmentación de la piel, debido a alteraciones genéticas que pueden tener una
función en la formación del melanoma y por exposición a la radiación UV.
Dentro de las alteraciones más comunes en los patrones de pigmentación de la
piel se ecuentran los polimorfismos del MC1R y las amplificaciones en MITF.
MC1R es un regulador clave en la diferenciación, proliferación y pigmentación
del melanocito. MC1R es un receptor con 7 dominios transmembrana acoplado a
la proteína G (GPCR) que se expresa en los melanocitos epidérmicos. MSH-α es
el ligando del MC1R, responsable de estimular la formación de AMPc a través
de la vía del MC1R. Concretamente, MSH-α se une al MC1R que estimula al AC,
induciendo la producción de AMPc42, y los altos niveles de AMPc fosforilan y
activan a la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB). CREB
activa transcripcionalmente a varios genes, incluyendo a MITF43,44, que activa
transcripcionalmente a un grupo de genes que catalizan la conversión de la
tirosina (Tyr) en melanina45.
La región que codifica por el MC1R humano es altamente polimórfica, y se
conocen tres variantes del MC1R, MC1R R151C, R160W y D294H asociadas al
aumento del riesgo de melanoma debido a una sensibilidad a los efectos
citotóxicos de la radiación UV, como es el aumento de la generación de los
radicales de oxígeno27,28,29,30. Adicionalmente, estudios epidemiológicos muestran
una correlación entre la presencia de las variantes de MC1R, y de los genes
CdkN2A y BRAF, comúnmente mutados en melanoma46,47,27,48.
CdkN2A (p16INK4a i p14ARF)
El locus CdkN2A se asocia fuertemente al desarrollo del melanoma. Los
melanomas familiares presentan mutaciones germinales de CdkN2A con una
frecuencia del 30-70 % 34 (Tabla 1I).
El gen CdkN2A codifica dos supresores tumorales p16INK4a y p14ARF (49). El supresor
tumoral p16INK4a inhibe la actividad cinasa de la proteína cinasa dependiente
de ciclina 4/6 (CDK4 y CDK6, respectivamente), uniéndose y secuestrando a
CDK4 y CDK6, y previniendo así la fosforilación de la proteína del
Retinoblastoma (pRb)50 que tiene como resultado la inhibición de la progresión
del ciclo celular. El supresor tumoral p14ARF estabiliza a p53 mediante la
35
inhibición de la degradación por HDM2, ligasa E3 de ubicuitinas específica
para p5351,52,53,54.
En el melanoma familiar, el gen CdkN2A generalmente se encuentra mutado
alterando únicamente al supresor tumoral p16INK4a, o ambos supresores tumorales
p16INK4a y p14ARF. Además, este gen también se encuentra mutado en muchos
melanomas esporádicos. La inactivación de p16INK4a por mutaciones puntuales,
deleciones, metilación del promotor o por silenciamiento transcripcional
promueve la liberación de CDK4 y CDK6 que se unen a ciclina D1 y a pRb, donde
pRb fosforilada por CDK4 y CDK6 libera el factor de transcripción E2F
promoviendo la transición de la fase G1 a la fase de síntesis (S) del ciclo
celular (Fig.3I). Así, la vía de señalización p16INK4a/pRb es un regulador
clave de la senescencia del melanocito, y en consecuencia, la inactivación de
esta vía conduce a la progresión del ciclo celular contribuyendo en el
proceso de melanomagénesis.
PTEN
La pérdida del supresor tumoral PTEN se detecta aproximadamente entre un 5-20
% de las lesiones melanocíticas33,35 (Tabla 1I). PTEN es una fosfatasa lipídica
que inhibe la activación de AKT por PI3K (Fig.3I). El gen PTEN reside en la
región del cromosoma 10q, una área cromosómica comúnmente delecionada en
melanoma, siendo PTEN una de las dianas somáticas más alteradas de la vía de
PI3K/AKT. La pérdida de PTEN conduce a la hiperactivación de la vía de PI3K
afectando a procesos biológicos importantes como son la supervivencia
celular, proliferación, crecimiento (como aumento de la masa celular) y
motilidad.
En el melanoma las deleciones en PTEN pueden ser concomitantes a mutaciones
en BRAF, pero no con mutaciones en NRAS55.
RAS
El oncogén RAS activa las vías de señalización RAF/MEK/ERK y PI3K/AKT, ambas
vías son efectoras de RAS e importantes en el desarrollo del melanoma
(Fig.3I). La activación mutacional del oncogén RAS se asocia entre un 15-30 %
al melanoma humano (Tabla 1I), y además, destacar que las mutaciones en NRAS
y BRAF son mutuamente excluyentes en el melanoma56. Las mutaciones en el gen
RAS se producen más frecuentemente en la isoforma NRAS. Concretamente, la
mutación más predominante en NRAS es la sustitución de una glutamina (Q) por
una leucina (L) en la posición 61 (NRASQ61L)31.
BRAF
Las mutaciones somáticas en el gen BRAF prevalecen en el melanoma. BRAF es el
principal componente más comúnmente mutado de la vía RAS/RAF/MEK/ERK, con una
36
frecuencia entre el 50-70 % de los melanomas cutáneos (Tabla 1I). La mutación
más observada en BRAF es la sustitución de la valina (V) por un ácido
glutámico (E) en la posición 600 (BRAFV600E)31.
BRAFV600E activa constitutivamente la señalización de ERK, responsable de la
estimulación de la proliferación y de la supervivencia, y esencialmente del
crecimiento tumoral y del mantenimento de las funciones biológicas celulares57
(Fig.3I). Paradójicamente, el efecto oncogénico de BRAFV600E es insuficiente en
melanocitos para la conversión plenamente maligna, ya que la expresión del
mutante BRAFV600E en melanocitos normales promueve senescencia58,59, y el modelo
murino condicional para la expresión específica de BRAFV600E en melanonitos
propuesto por Dankort y sus colaboradores desarrolla hiperplasias
melanocíticas benignas41. Por el contrario, la expresión de BRAFV600E combinada
con el silenciamiento del supresor tumoral PTEN desarrola melanomas con una
penetrancia del 100 %, y con metástasis observadas en nódulos linfáticos y
pulmón41.
En función de las áreas expuestas a la radiación solar, existen claras
diferencias genéticas entre los distintos tipos de melanoma. Concretamente,
en los melanomas sin daño crónico inducido por la radiación solar poseen
frecuentemente mutaciones en el gen BRAF asociadas a la pérdida de PTEN, o
únicamente mutaciones en NRAS. Además, los melanomas que presentan mutaciones
en BRAF tienen un número menor de copias del supresor tumoral PTEN respecto
los melanomas con mutaciones en NRAS56. Mientras que los melanomas con daño
crónico inducido por la radiación solar tienen raramente mutaciones en el gen
BRAF y frecuentemente muestran un aumento del número de copias de la ciclina
D1.
LKB1/Stk11
El gen LKB1 se localiza en el cromosoma 19p13.3. Codifica para una proteína
con actividad serina/treonina (Ser/Thr) cinasa y además, es un supresor de
tumores asociado al desarrollo de distintos tipos de cánceres humanos.
Concretamente, en el melanoma maligno cutáneo esporádico se ha detectado
mutaciones somáticas del gen LKB1/STK11 con una frecuencia del 10 %60,61,38
(Tabla 1I). En el melanoma primario y en el nevus melanocítico benigno, se
encuentra con una baja frecuencia la pérdida de heterozigosidad del cromosoma
19p, sugiriendo que podría ser LKB1 un gen relevante en el desarrollo y
progresión del melanoma maligno.
Factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF)
MITF tiene una función clave en el melanoma humano. Es uno de los genes más
importantes para la pigmentación, el crecimiento y la supervivencia del
melanocito, la transcripción de factores de diferenciación, y de numerosas
37
enzimas de pigmentación 45. MITF se expresa en muchos melanomas humanos, y es
un gen diana y un marcador de diagnóstico para esta enfermedad.
Existe una gran controversia acerca del mecanismo tumorigénico de MITF. Por
un lado, en líneas celulares de melanoma los niveles de expresión de MITF son
significativamente bajos, donde el aumento de los niveles de expresión de
MITF reduce la proliferación celular del melanoma e incluso en presencia del
oncogén BRAF62. De este modo, estos niveles altos de expresión de MITF reducen
la tumorigenicidad de la célula de melanoma63, predisponiendo la parada del
ciclo celular y la diferenciación a través del control de los reguladores del
ciclo celular como son p16INK4a, CDK2 y p21Cip (45). Por otro lado, y de manera
crítica los bajos niveles de MITF también promueven apoptosis y parada del
ciclo celular.
Estudios recientes muestran que MITF coopera con BRAFV600E en la
inmortalización de los melanocitos normales mediante la expresión de
distintas proteínas, como la transcriptasa reversa de la telomerasa (TERT),
el mutante dominante negativo de p53 (p53DD) o la proteína cinasa CDK4
activada40. Así, se ha observando que entre un 10-16 % de los melanomas
malignos mutados en BRAF presentan amplificaciones de MITF, y contrariamente,
el 84-90 % restante de los melanomas malignos mutantes en BRAF se
caracterizan por una degradación de MITF mediada por la hiperactivación de
ERK.
Vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK
La vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK regula las decisiones del destino
celular por debajo de receptores tirosina cinasa (RTK), citocinas y
receptores GPCR (Fig.3I). En melanocitos, esta vía de señalización se
encuentra activada por factores de crecimiento como el factor de célula madre
(SCF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el HGF64.
Individualmente estos factores de crecimiento inducen una activación
transitoria de ERK, promoviendo un efecto mitogénico modesto. Así, la
desregulación de esta vía es clave para la proliferación celular del
melanoma, ya que un 90 % de los melanomas humanos presentan una
hiperactivación de ERK.
En el melanoma, la activación de ERK se puede producir por diferentes causas
que incluyen la producción autocrina de los factores de crecimiento65,
raramente por mutaciones activantes del receptor del factor de crecimiento
como c-Kit66 o alteraciones mutacionales en los componentes de la vía de ERK.
El componente más comúnmente mutado de esta vía es BRAF, mutado en la
posición 600 (V600E)31. BRAFV600E estimula constitutivamente la señalización de
ERK, estimulando la proliferación y supervivencia; promoviendo el crecimiento
38
tumoral; y el mantenimento de funciones esenciales57. Paradójicamente, el
efecto oncogénico de BRAFV600E es insuficiente para la conversión plenamente
maligna en melanocitos, ya que BRAFV600E induce senescencia58,59, lo que le ha
dado el atributo de oncogén inductor de senescencia celular (OIS).
Así, en la progresión del melanoma maligno el oncogén BRAFV600E se encuentra
asociado al silenciamiento de uno o más genes supresores de tumores, siendo
los más comunes PTEN o CdkN2A40,67,17,68. En referencia a este suceso,
recientemente se ha descrito que BRAFV600E coopera con la pérdida de PTEN para
la inducción del melanoma metastático41. Además, existen otros genes que
cooperan y se encuentran por debajo de BRAFV600E, como son MITF62,69, BRN-2,
ciclina D170, p16INK4a (71,58), metaloproteínasa de matriz enzimática para el
mantenimiento tumoral (MMP-1)72 y sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS)69.
Como se ha mencionado anteriormente, otro mecanismo frecuentemente asociado a
la activación de la vía de RAS/RAF/MEK/ERK son las mutaciones activantes en
NRAS. Donde se ha demostrado que el oncogén RAS que estimula las vías de
señalización que controlan la superivencia celular, la proliferación y la
diferenciación, puede inducir el melanoma en ratones deficientes en p16INK4a.
De manera que RAS tiene una función relevante en el mantenimiento tumoral73,74.
Además, a diferencia de los tumores BRAFV600E, el oncogén RAS presenta más
opciones de supervivencia celular porqué activa a múltiples efectores de
distintas vías de señalización como ERK y PI3K67 (Fig.3I).
Vía de señalización PI3K/AKT/PKB
La vía de señalización PI3K regula multitud de respuestas biológicas
celulares como la supervivencia celular75,76, la proliferación celular77,78,79, el
crecimiento celular80, el ciclo celular, la migración celular y la invasión de
la matriz extracelular81,82. Por este motivo, esta vía se encuentra alterada en
una gran variedad de cánceres83. Concretamente, se ha detectado la
hiperactivación de la vía de PI3K en una cierta proporción de melanomas,
donde un 3 % de las lesiones melanocíticas metastáticas poseen mutaciones en
PI3K84; y un 5-20 % de los melanomas avanzados presentan la pérdida de función
del supresor tumoral PTEN, responsable de la hiperactivación de la vía de
PI3K35. Además, se ha observado que AKT3 se encuentra sobreexpresado entre un
43-60 % de los melanomas esporádicos33.
Curiosamente, en el melanoma no coinciden las mutaciones en NRAS y BRAF, o en
NRAS y PTEN, ya que son mutuamente excluyentes debido a que NRAS debido a que
se encuentra por encima de la vía de señalización de los componentes BRAF y
PI3K (Fig.3I). Así, la presencia del oncogén NRAS con mutaciones adicionales
en BRAF o en PTEN son innecesarias, ya que BRAF y PI3K siempre se
encontrarían activadas por el oncogén NRAS (Fig.3I).
39
Figura 3I/ Vías de señalización diana en melanoma
Esquema de las vías de señalización claves en melanoma. En la parte superior de la figura
se encuentran los fármacos que se han desarrollado para el tratamiento del melanoma y las
dianas para las diversas vías de señalización más importantes implicadas en el melanoma
maligno.
No obstante, las mutaciones en BRAF y PTEN son coincidentes en más de un 20 %
de los casos32, donde la activación de ambas vías, la vía de señalización de
BRAF y de PI3K, cooperan para la estimulación de la proliferación (Fig.3I).
En experimentos in vitro donde reproducen el melanoma en cultivos
tridimensionales, se requiere la inhibición de las vías de señalización de
ERK y de PI3K para la supresión del crecimiento celular, demostrando que
estas dos vías de señalización son muy importantes en la melanomagénesis85. De
acuerdo a este modelo, se observa que el oncogén transformante de melanocitos
RAS es más eficente respecto el oncogén BRAF67, debido a que el oncogén RAS se
encuentra activando la vía de RAF/MEK/ERK y la vía de PI3K/AKT (Fig.3I).
Curiosamente, las mutaciones en BRAF son más frecuentes en melanoma respecto
las mutaciones en NRAS. Este hecho probablemente refleja otras presiones
genéticas y biológicas que se desconocen que favorecen la progresión del
melanoma con mutaciones prevalentes en BRAF respecto mutaciones en NRAS.
40
Otras vías de señalización
Las alteraciones genéticas más importantes en melanoma que contribuyen a la
reducción de la apoptosis incluyen mutaciones en NRAS y BRAF; a la pérdida de
PTEN; a la sobreexpresión de AKT3, de limfoma 2 /leucemia de células B (BCL-
2), del factor nuclear κB (NF-κB); y a la activación de β-catenina. De este
modo, no sorprende que algunas de estas vías de señalización promuevan el
crecimiento, ya que existe una coordinación simultánea de las vías de
proliferación y de supervivencia celular con el crecimiento celular (Fig.3I).
Tratamiento del melanoma
El melanoma es una enfermedad extremadamente agresiva con un elevado
potencial metastático y con una resistencia notable a agentes citotóxicos.
Consecuentemente, las células de melanoma tienen bajos niveles de apoptosis
espontánea in vivo frente a otros tipos de células tumorales, y son
relativamente resistentes a la inducción de apoptosis inducida por fármacos
in vitro86.
Esta resistencia a la apoptosis en melanoma coincide con el hecho que
aproximadamente un 70 % de los melanomas presentan mutaciones en BRAF.
Preferentemente, en melanoma se encuentra el mutante BRAFV600E, responsable de
la activación de manera constitutiva de la vía MEK/ERK y de la inhibición de
la apoptosis mediante la regulación de los miembros de la familia BH3 a
través de la activación dependiente de ERK87.
Muchos fármacos quimioterapéuticos se utilizan para la inducción de apoptosis
en células malignas. Pero en melanoma la resistencia a la apoptosis
desencadena una resistencia farmacológica86, y por este motivo actualmente
existe una gran barrera para el tratamiento del melanoma debido a esta
extraordinaria resistencia a la quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia.
La mayoría de los protocolos terapéuticos aprovados para el melanoma maligno
se reducen a terapias adyuvantes postoperatorias. El interferón alpha (IFN-α)
es una de las inmunoterapias adyuvantes utilizada más común, aunque su
eficacia es cuestionable. La dacarbazina (DTIC) es una referencia como agente
quimioterapéutico para el tratamiento del melanoma avanzado, y fármacos como
la carmustina (BiCNU), paclitaxel (Taxol), temozolomida y cisplatino se usan
como agentes únicos con actividad en cánceres metastáticos88.
Desafortunadamente, todas estas terapias son ineficaces, contribuyendo poco
en la supervivencia del paciente, y por lo tanto, la identificación de nuevas
vías de señalización centrales en la iniciación y progresión del melanoma es
una nueva área excitante de investigación para el tratamiento del melanoma.
41
Así, conocer y entender la biología del melanoma da la oportunidad de
desarrollar terapias dirigidas.
Dianas terapéuticas
Las dianas tumorales más atractivas son aquellas que hacen a la célula
cancerígena dependiente de la progresión tumoral. De manera que esta
dependencia muchas veces recae en la adicción de la célula tumoral al
oncogén, debido a que le da una fuerte hiperactivación de la vía de
señalización respecto a la célula normal. Así, debido a la fuerte dependencia
de les células cancerígenas a los oncogenes, éstas presentan una mayor
sensibilidad a la inhibición de los oncogenes frente las células normales
(Fig.3I). Sin embargo, no todos los oncogenes pueden ser dianas tratables,
pero las enzimas como las cinasas, las proteasas y las fosfatasas son
altamente estudiadas, porqué éstas poseen un dominio catalítico con profundos
bolsillos, susceptible de ser inhibido catalíticamente (Fig.3I). Los fármacos
se diseñan contra este dominio catalítico, de manera que la unión selectiva
al dominio catalítico inhibe la actividad enzimática del oncogén. Por este
motivo, las cinasas NRAS y BRAF son dianas terapéuticas validadas en melanoma
y tienen un notable interés. Los primeros fármacos utilizados en clínica
dirigidos contra la vía de señalización de RAS, fueron los inhibidores
farnesil transferasa de RAS, diseñados para bloquear una modificación
postraduccional esencial en RAS89. Aunque estos fármacos no resultaron muy
específicos, éstos se pudieron combinar con cisplatino, mejorando su
eficacia90.
Posteriormente, se generó el inhibidor multicinasa sorafenib o BAY 43-9006
(Nexavar, Bayer Pharmaceuticals Corporation, West Haven, CT, USA) que
inicialmente fue desarrollado como inhibidor de las cinasas de Ser/Thr de RAF
(CRAF y BRAF)91. Pero resultados de distintos estudios in vitro mostraron que
el inhibidor sorafenib tiene como dianas BRAF, CRAF y receptores de tirosina
cinasa del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y del factor de
crecimiento que deriva de plaquetas (PDGF)91. Sorafenib previene el
crecimiento tumoral mediante la combinación de dos actividades antitumorales,
la inhibición de la proliferación celular tumoral y de la angiogénesis
tumoral. Así, sorafenib ejerce un efecto farmacológico dual que sugirió en el
año 2006 que este componente podría ser potencialmente efectivo en un amplio
rango de cánceres, especialmente en aquéllos que estuviesen vascularizados.
Como monoterapia, sorafenib muestra una modesta actividad contra el melanoma,
donde su IC50 en humanos es de aproximadamente 5µM92, siendo inefectiva en
pacientes con melanoma. En ensayos farmacocinéticos monoterapéuticos del
42
sorafenib muestran una IC50 por encima de 5µM92. Sin embargo, la combinación
con carboplatina y paclitaxel presenta un resultado más esperanzador93.
Aunque BRAF sea el centro para el desarrollo de fármacos de RAF, otras
isoformas de RAF no pueden ser obviadas, ya que BRAF activa a CRAF en células
de mamífero94; y pese a que CRAF no se requiere para la activación de MEK en
la presencia del mutante BRAFV600E, éste se requiere para la proliferación
celular57. Además, cuando en el melanoma se encuentran mutaciones activantes
en RAS, el responsable de la activación de MEK es CRAF y no BRAF17. Por lo
tanto, estos hechos sugieren que los fármacos para los diversos RAF
(panspecific Raf drugs) podrían ser mejores agentes antimelanoma respecto los
fármacos específicos para BRAF.
Posteriormente, se iniciaron ensayos clínicos con el inhibidor BRAF CHIR-265
para el melanoma cutáneo. En la actualidad, existen distintos inhibidores de
segunda generación de BRAF como son RAF265 (Novartis)95, XL281
(Exelixis/Bristol Myers Squibb)96, AZ628 (AstraZeneca)97, SB-590885
(GlaxoSmithkline) y PLX-4720 (Plexxikon/Roche)98.
Un nuevo fármaco para el tratamiento del melanoma metastático es el PLX-4032
de estructura análoga a PLX-4720 (Plexxikon Inc and Hoffman-La Roche Ltd). Es
un inhibidor selectivo de la cinasa mutada BRAF, desarrollado para el
tratamiento de los cánceres con mutaciones activantes en BRAF, concretamente
para el mutante BRAFV600E, inhibiendo así a BRAFV600E con una IC50 de 13nM98. En la
actualidad, PLX-4032 se utiliza en investigaciones clínicas de fase II y fase
III, siendo uno de los fármacos para el tratamiento de melanoma con más
expectativas99,100,101,102.
Una alternativa a estos fármacos son los que tienen como diana a MEK1/2, como
PD0325901 y AZD6244, responsables de la inhibición in vitro de la
proliferación, de la formación de colonias en agar y de la invasión en
matrigel de células de melanoma humanas mutantes en BRAFV600E. Y estos fármacos
son efectivos in vivo contra el melanoma mutante BRAFV600E de ratones
xenografts103. Además, las células de melanoma BRAF mutantes son más sensibles
a los inhibidores de MEK respecto las células de melanoma RAS mutantes104. Por
lo tanto, las células mutantes en BRAF son más adictivas a la señalización de
MEK, respondiendo mejor a la inhibición de MEK respecto las células mutantes
en RAS. Los fármacos AZD6244 y PD0325901 fueron testados en ensayos clínicos
en pacientes con melanoma avanzado105,106,107.
En referencia a la inhibición de esta vía de señalización, también se utilizó
la toxina letal del ántrax para la degradación selectiva e inactivación de
MEK1 y MEK2108, la cuál fue testada en ensayos clínicos.
43
Otra vía de señalización diana importante para el tratamiento del melanoma es
la vía de PI3K, que tiene como agentes diana las proteínas PKB, AKT y otros
componentes por debajo de la vía de señalización de PI3K, como la diana de
mamífero rapamicina (mTOR). Los inhibidores de mTOR como CCI-779 o RAD001 son
los más avanzados, ya que inhiben mTOR, PTEN, y PI3K/AKT. Así, la correcta
combinación de inhibidores de mTOR con otras dianas terapéuticas podría ser
muy beneficiosa en determinados pacientes, debido a que ambas vías de
señalización RAS/ERK y PI3K/AKT contribuyen en la supervivencia celular del
melanoma. Por este motivo, es interesante la combinación de los fármacos anti
RAS/ERK y anti PI3K/PKB con fármacos que induzcan apoptosis, como los
fármacos anti NF-κB o BCL-2 como señales de supervivencia.
La pérdida de función de p16INK4a en multitud de melanomas, aseñalan CDK4 y
CDK6 como otras dianas potencialmente terapéuticas. Los inhibidores pan CDKs
como los flavopiridol son ámpliamente inactivos y no hay ninguna evidencia de
la actividad clínica en el melanoma maligno, pero éstos podrían ser efectivos
en algunos pacientes, porqué la inhibición de las CDKs preferencialmente
suprime la expresión del ARNm de proteínas antiapoptóticas. Así, la
combinación de estos fármacos con otros agentes terapéuticos podrían ser una
oportunidad para tratar el melanoma.
Otras aproximaciones serían el uso de agentes diana que se encuentran en
diversas vías de señalización. Como la chaperona o proteína de choque
caliente 90 (Hsp90) que regula el plegamiento y la función de nuevas
proteínas sintetizadas, como por ejemplo de muchas proteínas cinasa como
CRAF, BRAF, CDK4 y CDK6. La inhibición de la Hsp90 por la anisomicina
benzoquinona (17AAG) causa la degradación de las proteínas que requieren la
presencia de Hsp90 para su estabilidad y/o función, a través de la
señalización al proteasoma dependiente de la ubicuitinización.
Sorprendentemente, la inhibición de la Hsp90 no promueve altos niveles de
toxicidad, ya que debido a que la Hsp90 es una chaperona que regula a
muchísimas proteínas, se esperaba una alta toxicidad. De manera importante,
el mutante BRAFV600E respecto a BRAF salvaje (wt) parece ser más sensible a la
inhibición de la Hsp90 por 17AAG, pero 17AAG también es diana de las
proteínas BRAF y CRAF wt que se encuentran por debajo del oncogén RAS109,110.
Así, 17AAG como diana de muchas proteínas de distintas vías de señalización,
es un tratamiento que no aumenta la sensibilidad en las células de melanoma
mutantes para BRAF. Y de manera semejante, la inhibición del proteasoma
mediante PS-341 demostró una mínima actividad del fármaco contra el melanoma
in vitro e in vivo111.
44
Así, mejorar el entendimiento de la biología del melanoma es ahora una nueva
y excitante aproximación terapéutica.
BRAF
Generalidades del gen BRAF
BRAF (del inglés v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) es una
proteína cinasa citoplasmática específica de residuos Ser y Thr, y es uno de
los miembros de la familia de proteínas cinasa RAF (v-raf murine sarcoma
viral oncogene). La familia RAF consta de tres miembros, ARAF, BRAF y CRAF112.
Es uno de los componentes de cinasas reguladas por señales extracelulares
(ERK) de la vía de señalización mitogen-activated protein kinase
(MAPK)113,114,57. Los productos genéticos de RAF son los efectores de RAS, los
cuales participan en la vía de señalización de las MAPK y conectan las
señales extracelulares con la regulación transcripcional. Las proteínas RAF
(MAPKKKs) se reclutan en la membrana plasmática, y las cinasas RAF son
activadas por una serie de fosforilaciones y defosforilaciones. Las proteínas
RAF activas fosforilan y activan a MEK1 y MEK2 (MAPKKs), las cuales
fosforilan y activan seguidamente a ERK1 y ERK2 (MAPKs). Finalmente, éstas
fosforilan diversas dianas citoplasmáticas y nucleares, incluyendo los
factores de transcripción Ets-1, c-Jun y c-Myc. Así, estos múltiples pasos en
la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK proporcionan un mecanismo de
amplificación de señal.
BRAF respecto ARAF y CRAF, en lugar de presentar residuos Tyr en la posición
448 y 449, codifica por residuos de ácido aspártico (D448 y D449,
respectivamente), mimetizando tirosinas fosforiladas. Así, la activación de
BRAF requiere pocos pasos de fosforilación. De manera relevante, BRAF es la
única proteína de la familia RAF que se encuentra frecuentemente mutada en
cáncer, probablemente debido a que la activación constitutiva de BRAF
requiere pocos sucesos mutacionales.
BRAF se encuentra mutado en multitud de tumores humanos, incluyendo el
melanoma con un 70 %, el cáncer de colon, de tiroides, de carcinoma de ovario
y algunos sarcomas con un porcentaje menor31,115, datos que estimulan el estudio
intensivo de este gen. A lo largo de estos últimos 8 años, se han
identificado en la proteína BRAF 35 aminoácidos diana mutados en melanoma116.
El aminoácido mutante diana más predominante en BRAF, que representa un 95 %
de todas las mutaciones de BRAF en melanoma, es la valina en posición 600. La
mutación en el aminoácido valina consiste por el cambio de la timina por una
alanina en la posición nucleotídica 1799, resultado de la sustitución del
residuo valina (V) por un glutamato (E) en la posición aminoacídica 600 de la
45
proteína BRAF (BRAFV600E). Se cree que esta mutación mimetiza la fosforilación
de los residuos T599/S602 que se encuentran flanqueando la posición 600,
causando así la activación constitutiva de BRAF.
BRAF mutante en tumores malignos y benignos
BRAF es un oncogén que dependiendo del contexto celular puede actuar como un
clásico oncogén inductor de senescencia celular. De modo que por un lado
BRAFV600E mutante puede actuar como oncogén promoviendo una fuerte
proliferación celular, y por otro lado como OIS promoviendo la parada del
ciclo celular.
El oncogén BRAFV600E se puede encontrar en distintos tipos de melanomas junto
con la adquisición de mutaciones adicionales en otros genes117. Concretamente,
en un 50-70 % de los casos de melanoma cutáneo son BRAFV600E mutante, donde
BRAFV600E es responsable de la estimulación constitutiva de la vía de
señalización RAF/MEK/ERK, de la proliferación independiente de factores de
crecimiento y de la transformación de los melanocitos normales en inmortales.
También se puede encontrar BRAFV600E en un 82 % de los nevus benignos118,
lesiones melanocíticas benignas que permanecen inalterables a lo largo del
tiempo. De esta manera, en los nevus benignos BRAFV600E se comporta como un OIS
debido a la exposición continua de la activación de la señalización
RAF/MEK/ERK, sugiriendo que la mutación única en BRAF es insuficiente para la
transformación oncogénica maligna.
Así, mientras BRAFV600E estimula la proliferación celular en melanoma, en
melanocitos induce senescencia.
BRAF y melanoma
En melanocitos el factor transcripcional MITF se encuentra por debajo del
control de señales dependientes de BRAF para la producción de melanina en
respuesta a MSH-α, y además, los niveles de MITF se encuentran
significativamente disminuídos en los melanocitos respecto las células de
melanoma.
Así, en melanocitos normales BRAF puede ser activado por la vía de AMPc,
teniendo un papel clave en la proliferación y diferenciación del melanocito,
ya que el AMPc activa la vía de ERK a través de la vía dependiente de RAS y
de BRAF. De manera que por un lado, la vía de AMPc a través de PKA promueve
la fosforilación dependiente de CRAF, causando la incapacidad de unión de RAS
con CRAF y la inactivación de CRAF, y por otro lado, la vía de AMPc induce la
activación de BRAF. Como consecuencia, probablemente los melanocitos normales
utilizan preferentemente BRAF como principal efector de RAS, y de manera
46
similar en células de melanoma se encuentran frecuentemente mutaciones en
BRAF y no en CRAF. De este modo, mutaciones en RAS excluyen mutaciones en
BRAF, pero no en CRAF.
Senescencia y BRAF
La senescencia es el mecanismo clave de protección celular contra el cáncer,
provocando la parada irreversible de la proliferación celular debido a una
proliferación extensa, una activación oncogénica o por algún tipo de estrés
celular119,120.
Las células tumorales presentan una proliferación celular aberrante y no
entran en estado de senescencia, debido a la inactivación de las vías de
señalización claves como son las vías de los supresores tumorales p16INK4a/pRb
y p53.
Intrigantemente, BRAF se encuentra mutado por encima del 80 % de los nevus
benignos118, y aunque muchos de los nevus permanezcan indolentes durante
décadas pueden progresar raramente en melanoma. Sin embargo, BRAF se
encuentra frecuentemente mutado en los melanomas cutáneos malignos, indicando
que la molécula BRAF se comporta como un OIS en los nevus benignos, y como
oncogén en el melanoma cutáneo maligno, paradoja desarrollada anteriormente.
Se conoce que BRAFV600E induce la expresión del supresor tumoral p16INK4a
induciendo senescencia en melanocitos primarios humanos in vitro71,58, y por
el contrario, en ratones deficientes del p16INK4a el efecto oncogénico de
BRAFV600E es esencial para la transformación de los melanocitos llegando a la
inducción del melanoma maligno74.
Así, estos estudios sugieren que la pérdida del p16INK4a contribuye en la
transformación del melanocito normal al melanocito mutante en BRAFV600E o
célula de melanoma. Por lo tanto, para la progresión del melanoma se requiere
la inactivación de la vía p16INK4a y pRb, ya que la adquisición de las
mutaciones en NRAS o BRAF promueven una hiperproliferación y una consecuente
senescencia mediada por el supresor tumoral p16INK4a.
Vía de señalización RAF/MEK/ERK como señalización de supervivencia
tumoral
La vía de transducción de señales RAF/MEK/ERK és una vía evolutivamente
conservada que estimula la supervivencia celular, y la proliferación celular
mediante la coordinación del crecimiento celular y de la división celular. De
manera relevante, un 30 % de los cánceres humanos tienen alterada la vía de
RAF/MEK/ERK, donde la activación constitutiva de uno de los componentes de la
vía de señalización de ERK media la estimulación de la proliferación celular
47
y la protección frente la apoptosis o muerte celular, controlando la
actividad y la abundancia de los miembros de la familia BCL-2 para promover
la supervivencia celular.
La familia BCL-2 consta de proteínas proapoptóticas y de proteínas
prosupervivencia. Las proteínas proapoptóticas se subdividen en dos
subfamilias, la subfamilia de las proteínas BAX o BAK; y la subfamilia de
BAD, BIK/NBK, BID, BIM/BOD y BMF. Las proteínas proapoptóticas BCL-2
presentan únicamente un dominio BH3, y éstas se encuentran formando complejos
con las proteínas prosupervivencia, reflejo de la regulación en respuesta al
estrés energético o a las señales de supervivencia celular.
Las proteínas prosupervivencia son las BCL-2, BCL-xL, y MCL-1, que presentan
un dominio BH1-3 que puede unirse al dominio BH3 de la otra familia de
proteínas proapoptóticas. Frecuentemente, la expresión de las proteínas
prosupervivencia BCL-2 se encuentra elevada en tumores, y en tumores
asociados a una pobre prognosis y resistencia terapéutica121.
De manera importante, la señalización de ERK regula las proteínas BCL-2 para
promover la supervivencia. Pues la activación de ERK puede reprimir los
niveles del ARNm de BIM122, puede fosforilar a FOXO3A, e inducir su degradación
por el proteasoma123; y consecuentemente reprimir la transcripción de la
proteína proapoptótica BIM. Más recientemente, se ha demostrado que la
activación de ERK puede inhibir la unión de la forma extra larga de BIM a
miembros de la familia de prosupervivencia BCL-2, como son BCL-xL y MCL-1124,124.
También la activación de ERK puede promover la ubicuitinización y la
degradación de la proteína proapoptótica BAD por el proteasoma, mediante la
fosforilación de BAD en la Ser 112 de manera dependiente de p90RSK (RSK)125. Los
factores de crecimiento que utilizan la vía de ERK estabilizan y aumentan la
expresión de las distintas proteínas BCL-2 de supervivencia, siendo
notablemente las proteínas BCL-2, BCL-xL y MCL-1126. Las proteínas de la
familia BCL-2 tienen un lugar de unión a CREB en la región reguladora 5', y
pueden ser fosforidas por RSK o MSK, cinasas dependientes de ERK, que
fosforilan y activan a CREB127.
De manera adicional, la expresión de los mutantes HRAS, MEK2, PI3K o PKB
protegen a la célula del proceso de anoikis mediante una reducción en los
niveles de ARNm de BMF128.
Así, el oncogén BRAF aumenta la resistencia a apoptosis inducida por agentes
quimioterapéuticos, promoviendo la fosforilación e inactivación dependiente
de ERK de las proteínas proapoptóticas BAD y BIM. En coherencia con estos
hechos, la inhibición del oncogén BRAF provoca la estabilización de BIM y la
48
defosforilación de BAD, que tiene como resultado la inducción de la
apoptosis. En cambio, la inhibición de la vía de PI3K no promueve una
acumulación dramática de las proteínas proapoptóticas BIM y BAD, ni una
activación de BIM, ni una defosforilación de BAD. De esta manera, se sugiere
que la activación constitutiva de ERK como resultado de mutaciones en la vía
de RAS/RAF/MEK/ERK, modifica directamente la señalización de muerte celular a
través de la fosforilación e inactivación de BAD y BIM, respectivamente129.
LKB1/STK11
Generalidades del gen LKB1/STK11
LKB1/Stk11 es una cinasa de tipo B1 de residuos Ser/Thr del hígado, conocida
como una proteína supresora de tumores, donde su pérdida o alteración fue
asociada originalmente al síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), enfermedad
hereditaria de carácter autosómico dominante130,131. LKB1 es uno de los genes
más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos como en
cáncer de pulmón132, de cérvix133, de piel38, de mama, de páncreas, de próstata y
de ovario. Concretamente, entre un 15-35 % de los casos de cáncer de pulmón
humano esporádico presentan lesiones en LKB1, particularmente en múltiples
subtipos de carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)132. Además,
recientemente se han encontrado mutaciones somáticas en un 20 % de los
carcinomas de cérvix133 y mutaciones somáticas en un 10 % de los melanomas
malignos cutáneos esporádicos38.
LKB1 se localiza en el brazo pequeño del cromosoma 19, concretamente en la
región 19p13.3134. Su estructura génica consta de 10 exones, donde 9 de ellos
son codificantes, pudiéndose encontrar dos variantes por splicing
diferencial. Las dos proteínas son productos del mismo gen LKB1, cuyas
diferencias residen en la secuencia aminoacídica del extremo carboxi terminal
de la proteína LKB1. La isoforma pequeña es LKB1s, producto de los exones del
1 al 8 y del exón 9a, isoforma de 48KDa. La otra isoforma es más larga,
nombrada LKB1L, producto de los exones del 1 al 8 y del exón 9b, isoforma de
50KDa135.
Así, LKB1L humano consta de 433 residuos aminoacídicos, y en ratón de 436. En
el extremo N-terminal posee un dominio regulador (residuos del 1 al 48) y una
señal de localización nuclear entre los residuos 38-43. Es una proteína con
actividad cinasa en residuos Ser/Thr, cuyo dominio catalítico se situa entre
los residuos 49-309, y su dominio regulador en el extremo C-terminal entre
los residuos 310-436 (Fig.4I).
49
Complejo LKB1:STRAD:MO25
En su forma activa, LKB1 se encuentra formando un complejo con dos proteínas,
la pseudocinasa adaptadora relacionada con STE20 (STRADα o STRADβ) y la
proteína adaptadora de ratón 25 (MO25α o MO25β). Este complejo
heterotrimérico le confiere a LKB1 la actividad catalítica y la translocación
del núcleo al citoplasma. En los complejos, estas tres moléculas
LKB1:STRAD:MO25 se encuentran presentes en cantidades equimolares
semejantes136.
LKB1 se une a STRADα a través del dominio catalítico, donde la interacción
promueve la actividad catalítica cinasa in vivo de LKB1 y la translocación de
LKB1 del núcleo al citoplasma137.
MO25α se une al complejo LKB1:STRAD a través de STRAD, y tiene una función
muy importante en la estabilización del complejo al citoplasma celular,
promoviendo la actividad catalítica de LKB1.
LKB1 se localiza en el núcleo y en el citoplasma. De manera que LKB1 posee
una señal de localización nuclear (NLS) muy conservada, donde la mutación o
carencia de la NLS provoca la incapacidad de entrada de LKB1 al núcleo y la
completa función de LKB1 como supresor tumoral138,139, sugiriendo que la
Figura 4I/ Representación esquemática de la estructura primaria de LKB1, de la
organización de las secuencias codificantes del gen y de sus dominios
funcionales, y de los lugares de modificación postraduccional de la proteína
LKB1 de Mus musculus
En rojo se representa los lugares de autofosforilación, en gris los lugares de
fosforilación por otras cinasas y en verde la farnesilación de la cisteína 433 (C433).
50
localización citoplasmática de LKB1 es importante para su función como
supresor tumoral140.
LKB1 como multicinasa
LKB1 es una máster cinasa localizada en el centro del dendograma del cinoma
humano141, que en su forma activa forma el complejo LKB1:STRAD:MO25, y es capaz
de fosforilar y activar a otras cinasas o proteínas.
La búsqueda de sustratos de LKB1 que median su función como supresor tumoral
permitió identificar a la proteína cinasa activada por 5'-AMP (AMPK) como
sustrato directo de LKB1143,144,145. AMPK es un heterotrímero, compuesto por una
subunidad catalítica (AMPKα) y dos subunidades reguladoras (AMPKβ y AMPKγ).
AMPK se activa cuando los niveles intracelulares de ATP disminuyen y los
niveles intracelulares de AMP aumentan, debido a una privación de nutrientes
o hipoxia146,147,148. Análisis bioquímicos y genéticos en distintas especies
(Drosophila melanogaster, Mus musculus...) mostraron que LKB1 es la cinasa
que fosforila a AMPKα y que activa el T-loop en condiciones de estrés
energético143,149. LKB1 fosforila directamente y activa a AMPK, un sensor del
metabolismo central que regula el metabolismo de los lípidos, del colesterol
y de la glucosa en tejidos metabólicos especializados, como el tejido
hepático, adiposo y muscular. Así, AMPK coordina las actividades celulares
anabólicas y catabólicas en células normales y en células
transformantes150,151,152.
Figura 5I/ Representación
gráfica de una parte del
dendograma del cinoma humano
LKB1 se localiza en el centro del
dendograma del cinoma humano. LKB1
fosforila y activa a AMPK (AMPKα1
y AMPKα2) y puede fosforilar el T-
loop de todos los miembros de la
subfamilia AMPK (NUAK1, NUAK2,
BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK,
MARK1, MARK2/3 i MARK4)142. Representados en color los
sustratos para LKB1, en gris los
que no son sustratos para LKB1.
51
LKB1 como cinasa de residuos Ser/Thr fosforila a AMPKα en el residuo Thr 172,
en consecuencia activa a AMPK en respuesta a las alteraciones en los niveles
energéticos intracelulares y en la disponibilidad de nutrientes, controlando
el crecimiento celular y el metabolismo celular.
Adicionalmente, LKB1 es capaz de fosforilar y activar a 13 cinasas de la
subfamilia de la proteína cinasa AMPK, un total de 12 cinasas humanas NUAK1,
NUAK2, BRSK1, BRSK2, QIK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4 y MELK,
relacionadas con AMPK142 (Fig.5I). De manera singular, 4 de las 14 cinasas son
miembros de la familia de proteínas asociadas a microtúbulos (microtubule-
associated protein, MAP) y de la familia de las cinasas microtubule affinity-
regulating kinase (MARK), requiriéndose en los estadios tempranos
embrionarios, y siendo claves en el establecimiento de la polaridad celular153.
LKB1 como supresor tumoral
Primeramente, LKB1 fue descrito como supresor tumoral, ya que es uno de los
genes más frecuentemente mutados en distintos tipos de cánceres esporádicos.
Además, se observó que la sobreexpresión de la proteína LKB1WT en líneas
celulares que no expresan endógenamente LKB1, como son la línea celular de
melanoma humano G361 y la línea celular de cáncer de cérvix humana HeLa,
tienen como resultado la parada del ciclo celular en la fase G1154.
En estos últimos años, los estudios de LKB1 muestran que participa en nuevas
vías de señalización que podrían enlazar el metabolismo celular con el
control del crecimiento celular y en la polaridad celular. Así, LKB1 y AMPK
controlan el crecimiento celular y el metabolismo celular, y ambas proteínas
tienen funciones conservadas en la polaridad celular, donde la disrupción de
estos procesos están implicados en la carcinogénesis. De manera relevante, en
todas las células el requerimiento fundamental es el acoplamiento de la
disponibilidad de nutrientes con las señales extracelulares, y que únicamente
los factores de crecimiento estimulan la proliferación si los nutrientes son
suficientes para garantizar la división celular, procesos donde LKB1
participa. Así, LKB1 podría ser el nuevo enlace directo que conectara el
metabolismo celular con el cáncer.
En relación a su capacidad como supresor tumoral, otros estudios muestran que
los mutantes inactivos para el dominio catalítico de LKB1, mutantes aislados
a partir de los pacientes con PJS, se localizan única y exclusivamente al
compartimiento nuclear y son incapaces de inhibir la proliferación celular.
Por lo tanto, se asume que la actividad catalítica intrínseca de la cinasa de
Ser/Thr de LKB1 se requiere para el bloqueo de la división celular.
52
Asimismo, LKB1 tiene una función clave en el desarrollo embrionario temprano
en mamíferos. Así, los ratones que carecen de las dos copias de alelos LKB1 o
LKB1-/- son inviables a partir del 8,5-11 días del embrión, debido a la
deficiencia en la vasculogénesis, en el desarrollo de la placenta, en el
cerramiento del tubo neural y entre otras155. Pero de manera importante, un
estudio realizado en ratones con una única copia del alelo LKB1 (LKB1+/-)
muestra que estos ratones a las 45 semanas de edad desarrollan pólipos en el
tracto gastrointestinal, donde los análisis histológicos revelan que los
pólipos gastrointestinales son remarcablemente semejantes a los de los
pacientes con PJS156,157,158,159. Además, estos ratones LKB1+/- que desarrollan
pólipos muestran una pérdida del alelo de LKB1WT (159), sugiriendo que la pérdida
total de LKB1 se requiere para la formación del pólipo, siendo éste un
supresor tumoral.
Modificaciones postraduccionales de LKB1
LKB1 se fosforila en 8 residuos (Fig.4I), y la fosforilación de estos
residuos no tienen efecto sobre la actividad catalítica cinasa de LKB1. El
residuo Ser 428 de LKB1 humano (LKB1S428) se fosforila en respuesta a elevados
niveles de AMPc a través de la cinasa PKA160,161, en respuesta al EGF a través
de la cinasa p90RSK (162), o por PKCζ163,164.
La mutación de la Ser 428 por una alanina en LKB1 (LKB1S428A), mutación que
impide la fosforilación de este residuo, tiene como consecuencia la supresión
de la proliferación celular en ser sobreexpresado este mutante en la línea
celular G361. Resultados que sugieren que la fosforilación de la Ser 428 es
esencial para la inhibición de la proliferación celular en la línea celular
G361 que no expresa LKB1 endógeno originariamente160. Por el contrario, las
mutaciones en la Ser 31 y 325, y la Thr 366 de LKB1 no tienen ningún efecto
sobre la capacidad de suprimir la proliferación celular en G361161.
De manera singular, la fosforilación del residuo Thr 366 es diana única en
las células expuestas a la radiación ionizante y a la radiación UV. La
irradiación induce el daño al ADN, y por consiguiente provoca la activación
de la cinasa Mutante-Ataxia-Telangiectasia (ATM) responsable de la
fosforilación in vivo de la T366 de LKB1138. Además, se conoce que en respuesta
al daño al ADN por irradiación, LKB1 se une en el dominio N-terminal de unión
a sustratos de la proteína ATM165.
LKB1 presenta una secuencia aminoacídica consenso para la prenilación. Esta
secuencia está conservada en Xenopus y Drosophila, pero no en Caenorhaditis
elegans. Esta forma de prenilación se farnesila y raramente se
geranilgeranilila. La fosforilación del residuo S431 murino/S428 humano por
53
PKA, y la prenilación de la cisteína 433 de LKB1 son esenciales para la
regulación de la polaridad celular166.
Funciones de LKB1
LKB1 es una cinasa multifunción con un potencial ilimitado orquestando la
actividad celular. De esta manera, LKB1 tiene un papel clave en el
metabolismo energético intracelular, regulando la respuesta a estrés
metabólico y la proliferación celular a través de la vía LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2/mTORC1167,168,169. Además, como ya se ha indicado, LKB1 es importante en la
inducción de la polaridad celular170, teniendo una función central en la
polarización de las células epiteliales171, y en el control del ciclo celular,
mediando la parada del ciclo celular en G1 por inducción de la expresión de
p21 dependientemente de p53140.
Sensor del metabolismo energético
LKB1 es una cinasa multifunción implicada en el metabolismo celular y en la
proliferación celular a través de la regulación de la cinasa de estrés
metabólico AMPK. De este modo, LKB1 como sensor del metabolismo energético
regula la vía de estrés y de proliferación LKB1/AMPK a través de la
fosforilación del acetil coenzima A carboxilasa (ACC) y de los supresores
tumorales, como son Tuberous Sclerosis 2 (TSC2) y p53167,168,169.
El descubrimiento de LKB1 como cinasa reguladora de AMPK, fue un dato
relevante que enlazó dos procesos íntimamente relacionados, la tumorogénesis
y la regulación del metabolismo energético. Conexión sugerida por Otto
Warburg9, aproximadamente hace unos 60 años.
Durante el estrés metabólico energético el índice de AMP/ATP intracelular
aumenta, y estos cambios se detectan mediante el sensor LKB1, que en
respuesta a estrés energético se activa la vía de estrés LKB1/AMPK
disminuyendo el consumo de energía celular para la inhibición de las vías
anabólicas como la síntesis proteica, y aumentando la producción de energía
por la activación de las vías catabólicas como la glucólisis y la oxidación
de ácidos grasos. La AMPK puede ser fosforilada y activada por LKB1143,144,145 y
por la proteína Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase kinases
(CaMKKs)172,173,174, existiendo distintas vías de señalización alternativas que
pueden activar a AMPK.
LKB1 fosforila y activa directamente al residuo Thr 172 que se encuentra en
la región T-loop de la subunidad catalítica α de AMPK, esta modificación es
absolutamente esencial para la actividad catalítica de AMPK142. Así, el aumento
de los niveles celulares de AMP activan al sensor energético LKB1, que activa
a la cinasa AMPK que inhibe directamente a mTORC1 a través de la
54
fosforilación de Raptor175. También se ha descrito que altos niveles celulares
de AMP activan a AMPK, responsable de la fosforilación de los sustratos
TSC1/TSC2 que inhiben a Rheb y por último a mTORC1176,177,167. TSC1/TSC2 y Rheb
tienen una función importante en la activación de la vía de mTORC1,
activación que sucede debido a la pérdida de los supresores tumorales PTEN,
NF1, LKB1 o p53. Concretamente, TSC2 inhibe indirectamente a mTORC1 a través
de la regulación de las pequeñas GTPasas Ras homologue enriched in brain
(RHEB), ya que la pérdida de TSC1 o TSC2 promueve la hiperactivación de
mTORC1178. Así, la vía de mTORC1 regula el crecimiento celular incluyendo la
síntesis proteica, la biogénesis ribosomal, la angiogénesis y la autofagia a
través de los efectores por debajo de mTORC1. Los efectores por debajo de
mTORC1 son el regulador de traducción de proteína de tipo 1 de unión al
factor de iniciación de traducción eucariota 4E (4EBP1), y la cinasa 1
ribosomal S6 (S6K1) que contribuyen en la regulación de la traducción de
proteínas dependiente de mTORC1179. También podemos encontrar que mTORC1
controla la traducción de reguladores del crecimiento celular como la Ciclina
D1, el Factor Inducible de Hipoxia 1 alpha (HIF1α) y de Myc, que a su vez
promueven procesos como la progresión del ciclo celular, crecimiento celular
y angiogénesis180. De este modo, no es sorprendente encontrar en líneas
celulares de melanoma la activación de la vía de mTORC1181.
Control de la polarización celular
LKB1 es un regulador de polaridad celular conservado evolutivamente.
Primeramente, LKB1 fue descrito en la regulación de la polaridad en
Caenorhabditis elegans, conocido como PAR-4. En distintos estudios
describieron que PAR-4 se requiere para las divisiones asimétricas que
promueven la formación del eje anteroposterior del embrión primerizo. En
Drosophila melanogaster, LKB1 se identificó como un mutante de deleción donde
su carencia, pérdida de la localización posterior del ARNm materno de LKB1,
afecta al desarrollo del eje anteroposterior, mostrando defectos en la
polarización del citoesqueleto de microtúbulos. La capacidad de LKB1 como
regulador de la polaridad celular se encuentra conservada en células de
mamífero, como las células neuronales y las células epiteliales pancreáticas.
Esta capacidad se encuentra mediada por la translocación de LKB1 del núcleo
al citoplasma a través de STRAD, de esta manera, puede inducir polaridad
celular en células intestinales no polarizadas mediante la remodelación del
citoesqueleto de actina, la relocalización de la catenina p120 y la zona
occludens 1 a la formación de complejos de unión, y la clasificación de las
proteínas de superficie de los dominios apicales a los basolaterales171.
Además, LKB1 se requiere en la migración neuronal y en la posición del
centrosoma182.
55
Control del ciclo celular
LKB1 se encuentra implicado en el control del ciclo celular, mediando la
parada del ciclo celular en la fase G1 por inducción de la expresión de p21,
resultado de la asociación de LKB1 al promotor p21 de manera dependiente de
p53140. Contrariamente, otros estudios a partir del análisis del mutante para
el dominio catalítico de LKB1 que se caracteriza por encontrarse
exclusivamente en el núcleo e incapaz de ser relocalizado al citoplasma,
demostraron que el mutante para el dominio catalítico de LKB1 promueve la
expresión de proteínas necesarias para la transición del ciclo celular, como
son pRb, Ciclina E, y Ciclina A2, y además LKB1 media la parada en G1
independientemente de p21 y/o p53183.
Otros trabajos documentan que LKB1 suprime el crecimiento tumoral debido a la
asociación de LKB1 con Brahma/SWI2-related gene 1 (BRG1), una asociación
necesaria para la inducción de la parada del ciclo celular184.
MODELOS DE MELANOMA MURINOS
En esta última década, la secuenciación del genoma humano ha permitido
acelerar la investigación biomédica, su análisis genómico ha sido una
explosión de conocimiento en la biología y en la genética molecular del
melanoma, con la identificación de nuevas dianas y vías de señalización
críticas en la iniciación y en la progresión de esta enfermedad. Sin embargo,
en la actualidad el melanoma cutáneo es uno de los cánceres humanos que
presenta un elevado potencial metastático y una notable resistencia a agentes
terapéuticos86. Datos que indican que la excelente selección de los oncogenes
y de las vías claves que intervienen en el desarrollo y progresión del
melanoma es extremamente importante para el éxito de las aproximaciones
terapéuticas.
Actualmente, la ingeniería genética aplicada en modelos animales ha permitido
entender mejor el desarrollo y progresión tumoral in vivo. Así, el diseño de
un excelente modelo de melanoma cutáneo maligno murino es clave para permitir
el test experimental directo de las distintas hipótesis para la búsqueda de
nuevas dianas moleculares y de exitosas aproximaciones terapéuticas.
El modelo ideal de melanoma murino debería recapitular la etiología de la
radiación UV, la histopatología y la cronología de los distintos estadios de
la progresión del melanoma cutáneo maligno humano, y mimetizar la genética
del melanoma humano a través de manipulaciones genéticas e inmunológicas.
Mayoritariamente, los modelos de melanoma de ratón existentes presentan
grandes dificultades para inducir el melanoma (Tabla 1A (Anexo)), típicamente
estos modelos desarrollan melanomas dérmicos y no muestran una similitud
56
histopatológica de los estadios de la progresión del melanoma humano (Tabla
1A). Esto es debido a que desafortunadamente, la piel del ratón en neonatos y
en adultos presenta una localización y distribución de los melanocitos que no
coincide con la piel humana185,186. Además, los melanocitos murinos son
altamente resistentes a la inducción del melanoma por radiación UV, y que
curiosamente, la mayoría de los modelos de melanoma que son capaces de
iniciar el melanoma se caracterizan por el uso de carcinógenos químicos o por
la combinación de estos con radiación UV187,188,189,190,191. Por ejemplo, el modelo
de ratón deficiente en p16INK4a es altamente susceptible a la inducción del
melanoma dérmico metastático mediante el carcinógeno químico DMBA192. El modelo
condicional de ratón de BRAFV600E inducible y PTEN deficiente es capaz de
recapitular los aspectos clave patofisiológicos del melanoma humano mediante
la administración tópica del carcinógeno 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), un
componente no medioambiental41. Y la no administración de 4-HT en este modelo
murino, no muestra ningún tipo de lesión por encima de los 18 meses de edad41
(Tabla 1A).
Únicamente, el modelo de melanoma cutáneo maligno murino manipulado
genéticamente, mediante la sobreexpresión del HGF, muestra que a partir de
una única dosis de radiación UV en neonatos, y no en adultos, es necesaria y
suficiente para inducir tumores con una elevada incidencia y siendo
reminiscente al melanoma humano193. Este modelo de melanoma cutáneo maligno
murino se caracteriza por ser transgénico para el gen HGF, sobreexpresión que
consiste con la presencia del promotor del gen de la metalotioneína que
fuerza la sobreexpresión del HGF, siendo el HGF el ligando para el receptor
c-Met responsable de la activación de RAS/MEK/ERK y de PI3K/AKT, vías de
señalización claves en el desarrollo y progresión del melanoma.
Concretamente, el modelo de melanoma murino transgénico para el HGF es
inducido por una única dosis de 9,58KJ/m2 (UV-A,320-400nm, 3,31KJ/m2; UV-B
280-320nm, 6,24KJ/m2; UV-C 250-280nm, 0,03KJ/m2) que corresponde a una dosis
de luz natural solar de medio verano en una latitud media193.
Este modelo murino transgénico para el HGF destaca por presentar una piel muy
semejante a la piel humana, con una distribución de los melanocitos en la
dermis, en la epidermis y en la zona de unión entre la epidermis y la dermis.
El modelo murino transgénico para el HGF sin ser irradiado desarrolla
espontáneamente un melanoma dérmico metastático en la vejez194,195, mientras que
la radiación UV en estado adulto (a las 6 semanas de edad) provoca la
formación de un neoplasma cutáneo no melanocítico no tumorogénico193. Con
importancia, el modelo transgénico para el HGF inducido por radiación UV
neonatal (a los 3,5 días de edad) genera un melanoma cutáneo maligno murino
con una relativa elevada penetrancia (Tabla 1A). El melanoma cutáneo maligno
57
murino inducido por radiación UV neonatal es capaz de recapitular
histopatológica y cronológicamente todos los estadios de la progresión del
melanoma maligno cutáneo humano. Además, los análisis moleculares de los
melanomas murinos originados en este modelo transgénico para el HGF inducido
por radiación UV neonatal, indican que como en el melanoma humano, se
encuentran bucles de la señalización autocrina del receptor tirosina cinasa
c-Met, frecuentemente se encuentra la pérdida del gen supresor tumoral
p16INK4a, mientras que raramente se encuentran mutaciones en p53193.
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El melanoma cutáneo es uno de los cánceres de piel más letal, su incidencia
ha aumentado de manera alarmante en la población occidental en los últimos 30
años, siendo la tercera causa de malignidad más frecuente en humanos11. En
relación al aumento de la incidencia del melanoma cutáneo, datos
epidemiológicos retrospectivos indican una coincidencia en el aumento de la
incidencia del melanoma cutáneo con el aumento de la intensidad y de la
exposición intermitente de la piel a la radiación ultravioleta.
El melanoma es una enfermedad biológica y genéticamente compleja que presenta
un elevado potencial metastático y una notable resistencia a agentes
terapéuticos86, representando el cáncer de piel más mortal. Así, el
entendimiento profundo del desarrollo y de la progresión del melanoma
facilitaría el avance de nuevas estrategias terapéuticas.
Las vías de señalización de RAS/RAF/MEK/ERK y de PI3K/AKT son claves para el
desarrollo y mantenimiento del melanoma, y además, datos epidemiológicos
apuntan que la radiación ultravioleta (UV) es un factor de riesgo asociado a
la adquisición del melanoma cutáneo. De modo que decidimos investigar el
potencial de interacción de la señalización del receptor tirosina cinasa c-
Met inducido por el Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) que activa las
vías de señalización RAS/ERK y PI3K. Investigación que se desarrolló mediante
el modelo animal murino de melanoma cutáneo maligno transgénico para el HGF
inducido por radiación UV neonatal, modelo que combina los factores genéticos
y medioambientales implicados en el melanoma193. Además, este modelo es único,
ya que en respuesta a la radiación ultravioleta en neonatos desarrolla un
melanoma cutáneo maligno que es capaz de recapitular histopatológica y
cronológicamente todos los estadios de la progresión del melanoma maligno
cutáneo humano193.
Así, en base a estos antecedentes, los objetivos que se plantean son los
siguientes:
Identificación de nuevas moléculas implicadas en la señalización del HGF/c-
Met a partir de un modelo de melanoma cutáneo maligno murino transgénico para
el HGF e inducido por radiación UV neonatal.
Estudio de los mecanismos moleculares de los candidatos identificados.
Análisis de la función biológica de las moléculas implicadas en
melanomagénesis.
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El melanoma cutáneo es uno de los cánceres humanos más letal y presenta una
extrema dificultad en su tratamiento, debido a que se trata de una enfermedad
genéticamente compleja que presenta un elevado potencial metastático y una
notable resistencia a los agentes terapéuticos86.
La incidencia del melanoma cutáneo ha aumentado en los últimos 30 años de
manera alarmante en la población occidental12, siendo la sexta causa de
malignidad más frecuente en humanos11. En relación al aumento de la incidencia
del melanoma cutáneo, datos epidemiológicos retrospectivos indican una
coincidencia en el aumento de la incidencia del melanoma cutáneo con el
aumento de la intensidad y de la exposición intermitente de la piel a la
radiación ultravioleta (UV)23.
De manera que el entendimiento profundo de la biología y de la progresión del
melanoma, así como el descubrimiento de nuevas moléculas implicadas en
melanomagénesis, es sumamente relevante para el desarrollo de nuevas
estrategias terapéuticas efectivas.
Identificación de fosfoproteínas implicadas en la señalización del
Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) mediante el análisis
proteómico DIGE y MALDI TOF/TOF
El modelo animal de melanoma maligno basado en el modelo murino transgénico
para el HGF e inducido por radiación UV, pone de manifiesto que la
sobreexpresión del HGF junto al daño en el ácido desoxiribonucleico (ADN) por
radiación UV dispone de las condiciones propicias para el desarrollo y la
progresión del melanoma cutáneo maligno. Proponemos que para la
identificación de nuevas moléculas implicadas en el desarrollo y en la
progresión del melanoma, sería una excelente oportunidad analizar la
señalización especifíca del HGF/c-Met en este modelo murino de melanoma
maligno cutáneo, que incluye las modificaciones genéticas en el ADN
producidas por la radiación UV como componente medioambiental. Así, para
entender la contribución específica de la señalización del HGF/c-Met,
utilizamos líneas celulares primarias de melanoma murinas, denominadas 37-31E
y 37-31T, aisladas a partir de lesiones neoplásicas en ratones transgénicos
para el HGF e irradiados con UV.
Para la identificación de nuevas moléculas implicadas en la señalización del
HGF/c-Met en las líneas celulares de melanoma maligno cutáneo 37-31E y 37-
31T, analizamos los complejos de fosfoproteínas inducidos directamente por el
HGF a tiempos cortos (10 minutos) mediante el análisis proteómico de
electroferesis bidimensional diferencial cuantitativa en gel con tinción
fluorescente (DIGE, Fluorescence 2-D Difference In Gel Electrophoresis)
asociado a la posterior identificación de las fosfoproteínas por
67
espectometría de masas MALDI-TOF/TOF. Para la validación de la especificidad
de la señalización del HGF/c-Met utilizamos el inhibidor específico del
receptor c-Met (PHA-665752).
De esta manera, mediante la purificación de fosfoproteínas por cromatografía
de afinidad aislamos los complejos fosfoproteicos de los extractos totales de
las líneas celulares 37-31E y 37-31T sometidas a distintas condiciones
experimentales: condición control, células no tratadas en ausencia de suero,
para evitar así que los distintos componentes del suero como las hormonas y
los factores de crecimiento modulen las distintas vías de señalización de
estudio; condición HGF, células tratadas con el HGF durante un periodo de 10
minutos en ausencia de suero; y condición HGF+PHA-665752, células pretratadas
con el inhibidor del receptor c-Met (PHA-665752) en ausencia de suero, y
seguidamente tratadas con el HGF durante 10 minutos, como control de
especificidad de la señal por el HGF. Posteriormente, una pequeña parte de
los extractos de fosfoproteínas fueron destinados para la validación por
Western Blot (WB), y el resto fueron analizados por DIGE mediante un gel
bidimensional.
En el análisis proteómico por DIGE se analizaron diferentes geles para
eliminar posibles interferencias del fluoróforo con la muestra, donde se
realizó la combinación de las distintas muestras o condiciones experimentales
con los distintos tipos de marcaje fluorescente (Fluorescent Cyanine dyes,
Cy2, Cy3, o Cy5). Así, el primer gel contuvo el marcaje de Cy3 para la
condición control (control 1), Cy5 para la condición HGF y Cy2 para la
mezcla de las tres condiciones experimentales (pool de las tres condiciones
experimentales: control, HGF, y HGF+PHA-665752); el segundo gel contuvo el
marcaje de Cy3 para la condición HGF, Cy5 para la condición HGF+PHA-665752
(control 2), y Cy2 para la mezcla de las tres condiciones experimentales
(Fig.1A (Anexo)). Obtuvimos 150 puntos diferenciales equivalentes a
fosfoproteínas, o a proteínas acomplejadas a fosfoproteínas que aparecieron
en respuesta al HGF. De las 150 proteínas representadas diferencialmente,
identificamos 56 proteínas por espectometría de masas (MALDI-TOF/TOF)
(Fig.2A).
Seguidamente, validamos la respuesta al HGF y los distintos candidatos
identificados por MALDI TOF/TOF mediante el WB de los extractos de
fosfoproteínas (Fig.1R (Resultados)). Así, para validar la señalización en
respuesta al HGF analizamos por WB las proteínas diana conocidas por debajo
de la señalización del HGF, como por ejemplo, las proteínas c-Abl o ERK1/2, y
como control de carga utilizamos la tinción de proteínas con la solución
Ponceau S. Además, también realizamos como control de carga la detección de
proteínas que forman parte de los complejos fosfoproteicos pero que no se
68
modifican en respuesta a la señalización por el HGF, como por ejemplo, la
proteína de choque térmico HSP86. Una vez validadas las distintas condiciones
experimentales, a continuación, validamos algunas de las nuevas proteínas
identificadas, como la tropomiosina de tipo 1 (TPM1) que en respuesta al
estímulo del factor de crecimiento mostraron un aumento en sus niveles de
fosforilación (Fig.1R). En especial, nos llamó la atención una de las
proteínas identificadas en el análisis proteómico, la proteína MO25α.
MO25α junto con STRAD forma un tricomplejo con la cinasa de residuos
serina/treonina (Ser/Thr), conocida como LKB1. LKB1 posee actividad supresora
de tumores, está implicada en el control del ciclo celular y de la
polarización celular, y actúa como sensor del metabolismo energético. LKB1 se
fosforila en el residuo Ser 428 humano/Ser 431 murino (LKB1S428/Lkb1S431,
respectivamente) en respuesta al factor de crecimiento epidérmico (EGF)160 y
al promotor tumoral de éster-forbol (TPA) a través de la vía de señalización
RAS/ERK/p90RSK (160). Además, este residuo está implicado en la respuesta a
forskolin a través de PKA196, y en respuesta a metformin (fármaco
antidiabético, 1,1-Dimethylbiguanide hydrochloride) a través de PKCζ163. De
manera que, el posible papel de LKB1 en la señalización mediada por el HGF es
del todo desconocido. Por este motivo, decidimos investigar la función de
LKB1 en respuesta al tratamiento con el HGF.
El tratamiento de la línea celular murina 37-31E con el HGF promueve un
aumento en la fosforilación del residuo Ser 431 de Lkb1. Concretamente,
observamos una modulación específica del residuo Ser 431 de Lkb1 en respuesta
al HGF, ya que el inhibidor específico del receptor c-Met (PHA-665752) abolió
por completo la inducción de la fosforilación de Lkb1S431 (Fig.1R).
Figura 1R/ Validación de los candidatos
identificados por MALDI TOF/TOF implicados en la
señalización del HGF/c-Met
Análisis de fosfoproteínas por WB para validar los
nuevos candidatos implicados en la vía del HGF/c-Met. WB de los extractos de fosfoproteínas (5 µg) aislados de
los complejos formados en las distintas condiciones
experimentales: células 37-31E privadas de suero durante
un periodo de 2 h y 30 min (condición Control); células
tratadas con el HGF a una concentración final Cf=40
ng/ml durante 10 min tras la privación de suero (HGF);
células pretratadas sin suero y con el inhibidor
selectivo para el receptor c-Met (PHA-665752, Cf=0,2µM)
durante 2 h y 30 min y seguidamente tratadas durante 10
min con el HGF (Cf=40 ng/ml) (HGF+PHA). El WB muestra
los niveles detectados de las fosfoproteínas indicadas,
y la tinción con Ponceau verifica la carga proteica.
69
Estos datos mostraron evidencias que identifican a LKB1 como una nueva
molécula implicada en la señalización del HGF, siendo Lkb1 fosforilada en el
residuo Ser 431 en respuesta al estímulo por el HGF.
El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de
la vía de señalización RAS/RAF/MEK/ERK/p90RSK
Estudios previos realizados por Sapkota y sus colaboradores, indican que la
vía de señalización de RAS inducida por EGF/TPA promueve la modificación del
residuo Ser 428 de LKB1160, y dado que las principales vías de señalización
inducidas por el HGF son las vías de señalización RAS/ERK, PI3K/AKT, CRK-RAP
y RAC-PAK, analizamos la inducción de la fosforilación del residuo Ser 428 de
LKB1 en respuesta al HGF en varias líneas celulares de melanoma murinas y
humanas, tanto de genotipo salvaje como de genotipo mutante para la vía de
RAS. Así, utilizamos las siguientes líneas celulares de melanoma murinas 37-
31E, 37-31T y B16F1, y humana MeWo, todas ellas de genotipo salvaje para la
vía de RAS (BRAFWT y NRASWT de tipo salvaje o wild type); y las líneas
celulares de melanoma humanas UACC903, A375 y SkMel28 de genotipo mutante
para la vía de RAS (BRAFV600E), una de las mutaciones más predominantes en
melanoma.
Para elucidar en cuál de estas vías y en cuál de los eslabones de la cascada
de señalización se encuentra implicada la fosforilación de LKB1S428 en
respuesta al HGF, utilizamos los inhibidores específicos de MEK1/2 (U0126),
de PI3K (LY294002) y de SRC (PP1). El experimento consistió en el
pretratamiento de las células con los distintos inhibidores específicos
indicados bajo la condición de un medio sin suero y posteriormente, en la
inducción de la vía de señalización HGF/c-Met mediante el HGF.
En la figura 2R (A) se muestra que la fosforilación de Lkb1S431 fue abolida por
el pretratamiento con el inhibidor específico de MEK1/2, mientras que no se
observó ningún efecto de los niveles de fosforilación de Lkb1S431 en presencia
del inhibidor de PI3K, ni del inhibidor SRC. La inducción de la fosforilación
de LKB1 en el residuo Ser 431/428 por el tratamiento del HGF fue observada en
las distintas líneas celulares de melanoma murinas y humanas, respectivamente
(Fig. 2R (B)).
70
Además, los experimentos de inducción de la vía de señalización HGF/c-Met a
lo largo del tiempo en la línea celular 37-31E y B6F1, mostraron que p90RSK se
fosforiló en los residuos Thr359 y Ser363, y que ERK1/2 se fosforiló en los
residuos Thr202 y Tyr204 en respuesta al HGF, donde el perfil de
fosforilación a lo largo del tiempo de p90RSK (T359/S363) y ERK1/2T202/Y204
correlacionó con el perfil de fosforilación de LKB1S428 (Fig.3R).
Figura 2R/ El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de la
vía de señalización de RAS/MEK/ERK e independientemente de la línea celular
(A) Allí donde se indica, las células 37-31E se pretrataron durante 2 h y 30 min con los
inhibidores específicos de MEK1/2 (U0126, Cf=10 µM), de PI3K (LY294002, Cf=5 µM) y de Src
(PP1, Cf= 5µM) en un medio sin suero. Seguidamente, tras los 5 min de tratamiento con el HGF
a una Cf= 40ng/ml, las células se lisaron. Los 30 µg de lisados proteicos totales de las
distintas condiciones experimentales fueron analizados por SDS-PAGE. El WB muestra los
niveles de p-LKB1S428, p-ERK1/2T202/Y204, LKB1 y ERK2. (B) Nuevamente, se realizó el mismo
experimento anterior en las distintas líneas celulares murinas 37-31E y 37-31T, y humanas
MeWo y SkMel28.
71
El análisis en la línea celular de melanoma murina 37-31E con el inhibidor de
MEK1/2 (U0126) a distintos tiempos mostró que la fosforilación de Lkb1S431 fue
dependiente de la fosforilación de Erk1/2, ya que la total inhibición de
Mek1/2 suprimió la fosforilación de Erk1/2T202/Y204, p90RSK (T359/S363) y Lkb1S431
(Fig.4R).
Estos resultados indicaron la existencia de la activación de una o varias
fosfatasas implicadas en la defosforilación de LKB1 tras la inducción de la
vía del HGF/c-Met por el HGF, y seguida de la inhibición de la vía de
RAS/MEK/ERK a través del inhibidor específico de MEK1/2.
Por este motivo, investigamos que tipo de fosfatasas estan implicadas en este
proceso, para ello realizamos un tratamiento inicial con los inhibidores de
fosfatasas de residuos Ser/Thr como el fluoruro de sodio (inhibidor clásico
Figura 3R/ El perfil de fosforilación LKB1S428 en respuesta al HGF a lo largo del
tiempo correlaciona con el perfil de fosforilación de p90RSK (T359/S363) y de
ERK1/2T202/Y204
Estudio del perfil de fosforilación de Lkb1S431 a lo largo del tiempo en respuesta al HGF en
las líneas celulares de melanoma murinas 37-31E y B16F1. Las células fueron privadas de
suero durante 2 h y 30 min, y seguidamente estimuladas con el HGF (Cf= 40 ng/ml) en los
periodos de tiempo indicados. El WB muestra los niveles de p-LKB1S428, p-ERK1/2T202/Y204, p-p90RSK
(T359/S363), y la detección de LKB1 y ERK2 verifican la carga proteica del experimento.
Figura 4R/ La inhibición total de MEK1/2
suprime los niveles de fosforilación de
ERK1/2, p90RSK y LKB1
Las células murinas 37-31E tras la privación de
suero durante 2 h y 30 min, se trataron con el
HGF (Cf=40 ng/ml) durante 5 min, y seguidamente,
allí donde se indica, se trataron con el
inhibidor de MEK1/2 (U0126, Cf=10 µM) a distintos
periodos de tiempo. Los lisados celulares totales
se analizaron por SDS-PAGE. El análisis de WB
muestra los niveles p-LKB1S428, p-ERK1/2T202/Y204, p-
p90RSK (T359/S363), LKB1 y ERK2.
72
de fosfatasas de residuos Ser/Thr, NaF), el inhibidor específico de las
fosfatasas de tipo 1 y 2A, (denominadas PP1 y PP2A, respectivamente) como es
el ácido okadaico (OA), y el cóctel de inhibidores de fosfatasas de residuos
Tyr. Seguidamente al pretratamiento con los inhibidores de fosfatasas, las
células se trataron con el HGF para inducir la fosforilación de LKB1 y
posteriormente, se adicionó el inhibidor de MEK1/2 para observar el efecto
del tratamiento de la inhibición de las fosfatasas y averiguar la familia de
fosfatasas que se encuentran implicadas en el proceso de defosforilación de
LKB1S428 en respuesta al HGF/c-Met.
En la figura 5R, mostramos que la defosforilación de la Ser 431 de Lkb1
murina se bloqueó totalmente por parte de los inhibidores de fosfatasas de
residuos Ser/Thr, y no se observó ningún tipo de efecto en la adición del
cóctel del inhibidor de Tyr, ni con el OA, como inhibidor de las fosfatasas
de tipo PP1 y PP2A. Es decir, estos resultados sugirieron que las fosfatasas
que intervienen en la defosforilación del residuo Ser 431 de Lkb1 son
fosfatasas de residuos Ser/Thr, pero no corresponden a las fosfatasas PP1 y
PP2A.
Figura 5R/ La defosforilación del residuo Ser431 de Lkb1 está mediada por
fosfatasas de residuos Ser/Thr
Test de inhibición de los distintos candidatos de fosfatasas activadas posteriormente al
estímulo del HGF e implicadas en la defosforilación de Lkb1S431. Allí donde se indica, las
células 37-31E en ausencia de suero se pretrataron durante 2 horas y 30 minutos con el
fluoruro de sodio (NaF) (a las concentraciones finales de 10 y 20 nM), con el cóctel de
inhibidores de fosfatasas de residuos Tyr (CI) (1:2 y 1:1, diluciones indicadas por el
fabricante), y del ácido okadaico (OA) (gradiente creciente de concentración de 15 nM a 300
nM). Seguidamente las células se trataron con el HGF (Cf=40 ng/ml) durante 5 minutos, tiempo
al que se adicionó el inhibidor de MEK1/2 (U0126, Cf=10 µM). Finalmente, transcurridas 2
horas después del estímulo con el HGF se retiraron y lisaron todas las distintas
condiciones experimentales. 30 µg de lisado proteico total para cada condición experimental
se analizó en un gel del 15 % de poliacrilamida. El WB muestra los niveles de p-LKB1S428, p-
ERK1/2T202/Y204, y los niveles de la proteína total LKB1 como control de carga proteica.
73
Para confirmar la participación de p90RSK en la fosforilación de LKB1S428,
utilizamos el inhibidor específico de p90RSK (BI-D1870). Las células murinas
37-31E fueron pretratadas con el inhibidor específico de p90RSK en ausencia de
suero y posteriormente, inducidas por el HGF.
En la línea celular de melanoma 37-31E, el tratamiento con el inhibidor BI-
D1870 suprimió parcialmente, casi por completo, la fosforilación de Lkb1S431
mediada por el HGF (Fig.6R).
La activación observada de ERK1/2, indicada por el incremento de los niveles
de fosforilación de p-ERK1/2T202/Y204, y el aumento de los niveles de p-CREBS133
mediante MSK1 bajo el tratamiento con el inhibidor BI-D1870 (Fig.6R),
concuerda con la sugerencia de la existencia de un negative-feedback loop de
p90RSK que regula ERK1/2 descrito por otros autores162.
En conjunto, estos resultados sugirieron que LKB1 se fosforila en el residuo
Ser 428 dependientemente de la vía de señalización RAS/MEK/ERK/p90RSK e
independientemente de la línea celular en respuesta al estímulo con el HGF.
Además, la observación de una abolición total de los niveles de p-LKB1
mediante el inhibidor de MEK1/2 y una inhibición parcial de los niveles de p-
LKB1 por el tratamiento del inhibidor de p90RSK, indicaron que la fosforilación
de la Ser 428 de LKB1 presenta una dependencia total de RAS-MEK-ERK1/2 y una
dependencia parcial de p90RSK. Resultados que sugieren que la población de p-
LKB1 se fosforila por RAS/MEK y por RAS/MEK/ERK/p90RSK.
Señalar también que posteriormente a la inducción de la fosforilación de
LKB1S428 por el HGF, parece ser que los miembros de la familia de fosfatasas de
residuos Ser/Thr median la defosforilación del residuo Ser 428 de LKB1,
excluyendo a las fosfatasas PP1 y PP2A.
Figura 6R/ La inhibición total de p90RSK suprime
parcialmente los niveles de fosforilación de
Lkb1S431
Allí donde se indica, las células 37-31E se pretrataron
con el inhibidor de MEK1/2 (U0126, Cf=10µM) o de p90RSK (BI-
D1870, Cf=10µM) en ausencia de suero durante 2 horas y 30
minutos. Tras el tratamiento con el HGF (Cf=40ng/ml)
durante 5 minutos, las células se lisaron. Los 30 µg de
lisados proteicos totales se analizaron por SDS-PAGE. El
WB muestra los niveles de p-LKB1S428, p-ERK1/2T202/Y204, p-
CREBS133, LKB1 y ERK2 en las diferentes condiciones
experimentales.
74
LKB1S428 se fosforila en respuesta a diferentes factores de
crecimiento y se encuentra constitutivamente fosforilada en líneas
celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E y en muestras tumorales
Seguidamente, investigamos si la modificación postraduccional de LKB1 es
específica del HGF, o si por el contrario sería extensiva a diversos factores
de crecimiento relacionados en la patología tumoral. De este modo, testamos
en las distintas líneas celulares de melanoma humanas y murinas, diversos
factores de crecimiento para examinar su señalización a través de LKB1.
En la figura 7R, presentamos distintas líneas celulares de melanoma humanas y
murinas representativas en respuesta al HGF, al EGF y al factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF2) como factores de crecimiento implicados en
el desarrollo del melanoma; a otros ligandos implicados en otros tipos de
cánceres como el factor de crecimiento similar a la insulina de tipo 1 (IGF-
1), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor alpha de
necrosis tumoral (TNF-α) y la herregulina; y por último al promotor tumoral
TPA, que fueron capaces de inducir la fosforilación de LKB1S428
dependientemente del tipo celular (Fig.7R).
En todos los casos, la activación de ERK1/2 correlacionó con la fosforilación
de p90RSK, que promovió la fosforilación de LKB1S428 (Fig.7R).
La regulación aberrante de la vía de señalización RAS/MEK/ERK representa uno
de los marcadores claves en cáncer de colon197,198, de endometrio199, de
tiroides200,201,202, gástrico203, y en melanoma31,204. Así, considerando que
Figura 7R/ El residuo Ser431 murino/Ser428 humano de LKB1 se fosforila en
respuesta a distintos factores de crecimiento
Muestra representativa de las líneas celulares de melanoma murinas y humanas en respuesta
al HGF (a una Cf=40ng/ml), al EGF (100 ng/ml), a la Herregulina (50ng/ml), al FGF2
(50ng/ml), al IGF-1 (50ng/ml), al PDGF (20mM), al TNF-α (40ng/ml), al TPA (200nM) y a la
Insulina (100nM) durante 10 minutos, tras la privación de suero durante 2 horas y 30
minutos. El WB de los 30 µg de lisado proteico total muestra los niveles de p-LKB1S428, p-
ERK1/2T202/Y204, p-p90RSK (T359/S363), y los niveles de ERK1/2 verifican la carga proteica.
75
aproximadamente un 70 % de los melanomas cutáneos humanos contienen
mutaciones activantes en BRAF (BRAFV600E), determinamos el estado de
fosforilación de LKB1S428 en distintas líneas celulares de melanoma humanas
mutantes en BRAFV600E sometiéndolas en un medio en ausencia de suero o en
presencia de suero (referenciado como medio completo).
Las líneas celulares de melanoma humanas mutantes en BRAFV600E, como las
SkMel28, A375 y UACC903, mostraron una fosforilación constitutiva del residuo
Ser 428 de LKB1. No obstante, la línea celular de melanoma humana MeWo que
posee los alelos wt del gen BRAF presentó bajos niveles constitutivos de
fosforilación de LKB1S428 (Fig.8R).
Sobre la base de estos resultados, también se podría esperar la exhibición de
altos niveles de fosforilación de LKB1S428 en muestras tumorales con una
desregulación de la vía de los receptores tirosina cinasa (receptor tyrosine
kinase, RTK) y/o con una hiperactivación de la vía mitogénica mediada por
RAS.
De esta manera, analizamos el estado de fosforilación de LKB1S428 en muestras
de tumores espontáneos procedentes de ratones transgénicos para el HGF e
inducidos por radiación UV y en tumores de xenógrafos. Observándose así, que
altos niveles de fosforilación de LKB1S428 correlacionaron con altos niveles de
Figura 8R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E muestran una
fosforilación constitutiva de la Ser428 de LKB1
Análisis de los niveles de fosforilación de la Ser428 de LKB1 en distintas líneas celulares
de melanoma BRAFWT y mutantes en BRAFV600E. (A) Las distintas líneas celulares de genotipo
salvaje (MeWo) o mutantes en BRAFV600E (A375, UACC903 y SkMel28) fueron privadas de suero
durante 2 horas y 30 minutos, referenciado en la figura como MSS, y crecidas bajo un medio
completo en presencia de suero, referenciado como MC. Análisis por SDS-PAGE de los 30 µg de
lisado proteico total e inmunoblot con los anticuerpos específicos indicados. (B) En la
tabla adyacente se muestra el estado mutacional de los oncogenes NRAS y BRAF de las
distintas líneas celulares de melanoma utilizadas.
76
fosforilación de ERK1/2 en los tumores melanocíticos malignos murinos. Como
control de la activación de la vía de señalización del HGF, se eligió la
línea celular de melanoma 37-31E procedente de los ratones transgénicos para
el HGF, (datos previos) conocida por presentar altos niveles de p-LKB1S428 y de
p-ERK1/2 (Fig.9R).
Figura 9R/ Correlación positiva entre los niveles de fosforilación de LKB1 y
ERK1/2 en muestras tumorales murinas
(A) Análisis de los niveles de fosforilación de LKB1S428 en los extractos proteicos de las
distintas muestras tumorales procedentes de ratones transgénicos para el HGF e inducidos
por radiación UV (muestras tumorales referenciadas del 1 al 7); y de tumores de xenógrafos
(muestras tumorales 8 y 9). Como control de la activación de la vía del HGF, analizamos los
lisados totales de la células 37-31E (L.T). Los 60 µg de extractos proteicos totales de
tumores murinos son analizados por WB mediante los anticuerpos específicos p-LKB1S428, p-
ERK1/2T202/Y204, LKB1 y ERK1/2. (B) Representación gráfica de la cuantificación densitométrica
normalizada de los niveles de proteína de p-LKB1 con LKB1 total y de p-EKR1/2T202/Y204 con
ERK1/2 total detectados por WB.
77
Adicionalmente, analizamos muestras tumorales humanas que presentan una
desregulación de la actividad en los RTK. Concretamente, el estudio se
realizó en muestras tumorales de mama humanas con amplificaciones en el
receptor de tipo 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Human
Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2), caracterizándose por ser tumores
potencialmente agresivos y malignos denominados HER-2 positivos (HER-2 +),
frente a las muestras tumorales de mama sin amplificaciones en HER-2, tumores
denominados HER-2 negativos (HER-2 -). También, analizamos muestras de
carcinoma endometrial de distintos estadios tumorales (estadios IA y IC)
respecto tejido endometrial no tumoral del paciente.
Los tumores de mama HER-2 + presentaron altos niveles de la proteína LKB1 y
altos niveles de fosforilación de la Ser 428 de LKB1 (p-LKB1S428) respecto los
tumores de mama HER-2 -, niveles proteicos cuantificados por análisis
densitométrico y normalizado en la representación gráfica de la Figura 10R
(B).
Figura 10R/ Los tumores de mama HER-2 positivos presentan elevados niveles de
fosforilación de la Ser428 de LKB1 respecto los tumores HER-2 negativos
78
(A) Análisis del estado de fosforilación de la Ser428 de LKB1 de 14 muestras tumorales de
cáncer de mama HER-2 + (referenciadas numéricamente con el 110, 198, 201, 203, 206, 213,
240, 249, 255, 256, 260, 300, 312 y 325) y 7 muestras tumorales de cáncer de mama HER-2 –
(referenciadas con el 207, 208, 210, 301, 305, 309 y 335). El WB muestra los niveles p-
LKB1S428, LKB1, HER-2 y GAPDH detectados en extractos proteicos totales (60 µg) procedentes
de las distintas muestras tumorales. (B) Representación gráfica de los niveles de
fosforilación de las distintas proteínas detectadas por WB mediante la cuantificación por
análisis densitométrico y normalizado por los respectivos niveles proteicos totales.
En tumores de carcinoma endometrial de fases avanzadas (IA y IC) se
detectaron altos niveles de la proteína LKB1 que correlacionaron con altos
niveles de p-LKB1S428 frente al tejido normal del mismo paciente (Fig.11R).
De manera relevante, estos datos indican la existencia de una interconexión
entre la vía de RAS/ERK y LKB1, donde LKB1 estaría implicado en alguna de las
Figura 11R/ Las muestras tumorales de carcinoma endometrial respecto las
muestras normales del paciente presentan elevados niveles de fosforilación de la
Ser428 de LKB1
(A) Ánalisis por WB de los extractos proteicos totales (60 µg) procedentes de las distintas
muestras tumorales de 4 pacientes con carcinoma endometrial de fases invasivas (T) y sus
respectivas muestras normales (N). WB de los anticuerpos específicos p-LKB1S428, LKB1 y
GAPDH. (B) Cuantificación densitométrica y representación gráfica de los niveles de
proteína p-LKB1 y LKB1 de las distintas muestras tumorales de carcinoma endometrial
detectadas por WB.
79
respuestas inducidas por la activación de la vía de señalización RAS/ERK.
Consecuentemente, estos datos ponen de manifiesto que LKB1 estaría mediando
parte de los efectos oncogénicos de BRAFV600E.
Las células de melanoma mutantes en BRAFV600E tienen alterada la
respuesta a estrés metabólico
Las células de melanoma son especialmente resistentes a distintos tipos de
estrés. LKB1 es una cinasa de residuos Ser/Thr que se encuentra por encima de
AMPK, y fosforila a AMPKα en el residuo Thr 172 en respuesta a estrés
metabólico, controlando la síntesis proteica a través de la vía de mTORC1.
Considerando que la fosforilación de LKB1S428 como una lectura de la
interacción entre la vía de RAS y LKB1, la fosforilación constitutiva de
LKB1S428 en células mutantes en BRAF podría significar una posible
interconexión entre la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 y
la vía de señalización de RAS activada por el efecto oncogénico de BRAFV600E.
De esta manera, investigamos la activación de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
en las diferentes líneas celulares mutantes en BRAFV600E bajo condiciones de
estrés energético, y así desvelar la posible contribución de la señalización
de BRAFV600E en el control del metabolismo tumoral.
Para testar esta hipótesis, diseñamos un experimento donde examinamos la
activación de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 en las líneas celulares de
melanoma BRAFWT y las mutantes en BRAFV600E en respuesta a estrés energético e
inhibiendo la vía de señalización de RAS. Así, sometimos a las células
mutantes en BRAFV600E a estrés energético (medio con baja concentración de
glucosa y sin suero) y a la inhibición del efecto oncogénico de BRAF mediante
el uso del inhibidor específico de MEK1/2 (U0126).
Las líneas celulares UACC903, SkMel28 y A375 mostraron una respuesta muy
limitada a estrés energético indicada por la ténue inducción de los niveles
de p-AMPKαT172 (Fig.12R), siendo los niveles de p-AMPKαT172 muy semejantes en
presencia de altas o bajas concentraciones de glucosa. Bajo condiciones de
estrés energético todas las líneas celulares mutantes en BRAFV600E conservaron
una actividad considerable de mTORC1 como indican los niveles de
fosforilación de la proteína ribosomal S6, indicada como p-S6S235/S236 (Fig.12R).
Por el contrario, la abolición de la actividad de BRAFV600E mediante el
tratamiento con el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) en condiciones de
estrés energético, reconstituyó la activación de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2 en respuesta a bajas concentraciones de glucosa, produciéndose un
aumento de los niveles de p-AMPKαT172 y una completa anulación de la actividad
de mTOR como indican los inexistentes niveles de fosforilación de la proteína
ribosomal S6 (Fig.12R).
80
Figura 12R/ Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E presentan una
mínima respuesta a estrés energético, y la anulación del efecto oncogénico de
BRAF mediante el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) recupera la respuesta a
estrés energético
Las líneas celulares de melanoma UACC903, A375 y SkMel28 se sometieron a distintas
condiciones experimentales: medio con alta concentración de glucosa (4500mg/L) y sin suero,
referenciado en la figura con las siglas A.G.; medio con baja concentración de glucosa
(1000mg/L) y sin suero, referenciado como B.G.; y medio con baja concentración de glucosa,
sin suero, más la adición del inhibidor (U0126, Cf=10µM). Todos los tratamientos se
realizaron durante un periodo de 4 horas, tiempo previamente testado para la óptima
activación de la vía de estrés energético LKB1-AMPK. La línea celular de melanoma 37-31E de
genotipo salvaje para BRAFWT, se utilizó como control de la adecuada respuesta a estrés
energético y del efecto del inhibidor U0126 a la activación de AMPKα. Análisis y detección
por WB de los 30 µg de lisados proteicos totales de las distintas condiciones
experimentales, a través de los anticuerpos p-LKB1S428, LKB1, p-AMPKαT172, AMPKα, p-
ERK1/2T202/Y204, ERK2 y p-S6RS235/S236.
Adicionalmente, para mostrar la especificidad del inhibidor de MEK1/2
(U0126), realizamos un gradiente creciente de concentraciones del inhibidor
U0126 de 1µM hasta 10µM en las distintas líneas celulares mutantes en BRAF en
ausencia de suero y de alta concentración de glucosa. Bajo estas condiciones
el inhibidor de MEK1/2 (U0126) no produjo ningún efecto sobre la activación
de AMPKα, activación medida por los niveles de p-AMPKαT172 que fueron
inalterables a lo largo del gradiente de concentraciones del inhibidor U0126
(Fig.3A). Es importante señalar también que según Dokladda y sus
colaboradores, los inhibidores (U0126 y PD98058) son capaces de inducir la
fosforilación de la Thr 172 de AMPKα cuando las células se someten en un
medio de baja concentración de glucosa y suplementado con el 10% de suero205,
datos que corroboran nuestros resultados.
81
Por el contrario, en la línea celular de melanoma 37-31E (BRAFWT) que se
caracteriza por no tener mutaciones activantes en la vía de RAS, no mostró el
efecto del aumento de los niveles de p-AMPKαT172 tras la adición del inhibidor
específico de MEK1/2 (U0126) en condiciones de estrés energético, demostrando
que la inhibición del componente MEK1/2 no tiene ningún efecto inespecífico
en la activación de AMPKα (Fig.12R).
Seguidamente para confirmar la restauración de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E mediante la anulación
del efecto oncogénico de BRAFV600E bajo estrés energético, mimetizamos el
estrés energético por medio de un fármaco activador de AMPK, como 5-
Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside (AICAR). AICAR es un fármaco que
estimula la activación de la vía de estrés AMPK/TSC1-TSC2 mediante un
mecanismo que parece ser debido por la inhibición de la defosforilación de
AMPKα, permitiendo así el aumento de la fosforilación del residuo Thr 172 de
AMPKα(206,207,208).
La adición de AICAR en las distintas líneas celulares de melanoma BRAFV600E
(SkMel28 y UACC903) aumentó ligeramente los niveles de fosforilación de AMPK
bajo la condición de un medio completo. El tratamiento con el inhibidor U0126
junto con el AICAR bajo la condición de un medio completo resultó un claro
incremento de los niveles de p-AMPKαT172 (Fig.13R).
Para demostrar la participación de BRAFV600E en el proceso de desconexión de la
vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2, diseñamos dos aproximaciones
experimentales. Por un lado, realizamos la inhibición farmacológica de BRAF a
Figura 13R/ La inhibición del efecto
oncogénico de BRAF en las líneas
celulares de melanoma BRAFV600E aumenta
la respuesta a estrés energético por
AICAR
Análisis por WB de la respuesta al
tratamiento por AICAR, y del efecto del
inhibidor U0126 bajo el tratamiento con
AICAR. Allí donde se indica las líneas
celulares de melanoma UACC903 y SkMel28 se
sometieron al tratamiento con AICAR (Cf=1mM)
y del inhibidor U0126 (Cf=10µM) durante 4
horas en un medio de alta concentración de
glucosa (4500mg/L) y suplementado con suero
(medio completo). El WB muestra los niveles
de p-LKB1S428, LKB1, p-AMPKαT172, AMPKα, p-
ERK1/2T202/Y204, ERK1/2, GAPDH y p-ACCS79.
82
través de otro tipo de inhibidor de la vía de señalización mitogénica de
RAS/RAF/MEK/ERK, en este caso mediante el uso del inhibidor multicinasa
sorafenib o BAY 43-9006 (Nexavar, Bayer Pharmaceuticals Corporation).
Concretamente, sorafenib inhibe a diversas cinasas, entre ellas CRAF, BRAF,
VEGFR-2, PDGFRβ, CKIT y la cinasa FLT391. Notablemente, la inhibición de la
señalización de BRAFV600E mediante el inhibidor sorafenib restauró la
activación de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en respuesta a estrés metabólico,
indicado por un aumento significativo de los niveles de p-AMPKαT172 en las
distintas líneas celulares de melanoma mutantes BRAFV600E (UACC903, A375 y
SkMel28). También, observamos que el tratamiento con sorafenib en ausencia de
glucosa y de suero redujo los niveles de la proteína total ERK1/2 por un
mecanismo desconocido (Fig.14R (A)).
Figura 14R/ La inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E mediante el
tratamiento con sorafenib o el silenciamiento génico de BRAF restaura la vía de
estrés energético en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E
(A) Investigación de la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E mediante el inhibidor
sorafenib. Las líneas celulares de melanoma UACC903, A375 y SkMel28 se sometieron a
distintas condiciones experimentales: medio con baja concentración de glucosa (1000mg/L) y
sin suero, indicado en la figura como B.G. durante un periodo de 4 horas; medio con baja
concentración de glucosa y sin suero, más la adición del EGF (Cf=50ng/ml) durante 4 horas; y
medio con baja concentración de glucosa, sin suero, más la adición del inhibidor sorafenib
(Cf=30µM) durante 4 horas. El WB muestra los niveles de p-LKB1S428, LKB1, p-AMPKαT172, AMPKα,
p-ERK1/2T202/Y204, ERK2 y p-CREBS133. (B) Estudio de la supresión de BRAF en células mutantes en
BRAFV600E bajo estrés energético. Mediante el uso del siRNA, generamos el silenciamiento
génico de BRAF transitorio para la supresión del efecto oncogénico de BRAFV600E. La línea
celular SkMel28 se transfectó con el siRNA BRAF y el siRNA Control, 72 horas
postransfección se trataron las células tratadas con el siRNA BRAF/Control durante 4 horas
bajo distintas condiciones experimentales: medio con alta concentración de glucosa y sin
suero (A.G.), y medio con baja concentración de glucosa y sin suero (B.G.). Inmunoblot con
los anticuerpos específicos p-AMPKαT172, AMPKα, p-ERK1/2T202/Y204, BRAF y GAPDH.
83
Por otro lado, como segunda aproximación experimental, diseñamos un
experimento para demostrar genéticamente la participación de BRAF en el
proceso de restauración de la vía de estrés energético mediante el uso de un
pequeño ARN de interferencia (siRNA, small interference ribonucleic acid)
contra BRAF. En la línea celular de melanoma SkMel28, el silenciamiento
génico de BRAF mediante el uso del siRNA contra BRAF bajo estrés energético
condujo a un aumento de los niveles de p-AMPKαT172. Los niveles de p-AMPKαT172
fueron significativamente más elevados bajo la condición de baja
concentración de glucosa respecto a las otras condiciones experimentales,
como AICAR (Fig.14R (B)).
Resultados que indicaron que la anulación del efecto oncogénico de BRAF
mediado por el siRNA de BRAF en respuesta a estrés energético permite la
reconstitución de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2.
Seguidamente, testamos si la inhibición de p90RSK mediaría el mismo efecto de
reconstitución de la vía de LKB1/AMPK en respuesta a estrés energético bajo
el efecto oncogénico de BRAF, así como se observa de manera similar con el
inhibidor de BRAF (sorafenib) y de MEK1/2 (U0126), o con el silenciamiento de
la expresión génica de BRAF. De este modo, en las distintas líneas celulares
de melanoma BRAFV600E bajo estrés energético se trataron en ausencia o
presencia del inhibidor de p90RSK (BI-D1870), y del EGF para asegurar la
activación de la vía de señalizacion de RAS. Observamos que el tratamiento de
las células con el inhibidor BI-D1870 no revirtió la activación de la vía de
LKB1/AMPK en respuesta a estrés energético como indican los bajos niveles de
p-AMPKαT172 (Fig.15R). Además, de acuerdo a resultados publicados con
anterioridad por Sapkota, el tratamiento con BI-D1870 indujo la fosforilación
de ERK1/2 y de CREBS133 mediada por el negative-feedback loop de p90RSK que
reguló a ERK1/2 (162).
Estos datos sugirieron que el efecto oncogénico de BRAF que media la
fosforilación de LKB1S428 por p90RSK, no es suficiente para explicar la
respuesta de reconstitución del sistema LKB1/AMPK bajo estrés energético. Sin
embargo, previamente observamos que la inhibición de BRAF o MEK1/2 bajo
estrés energético es suficiente para la restauración de la vía
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAF.
Así, estos datos sugirieron la existencia de mecanismos alternativos de
modulación de LKB1 que a juzgar por los resultados previos serían
probablemente mediados por ERK1/2.
84
Figura 15R/ La inhibición de p90RSK en las líneas celulares de melanoma BRAFV600E no
restaura la vía de estrés energético
Estudio del efecto de la inhibición de p90RSK BI-D1870 en respuesta a estrés energético y
nuevamente análisis por WB de la respuesta a estrés energético en las células de melanoma.
Las líneas celulares de melanoma humanas UACC903, A375 y SkMel28 se sometieron a las
siguientes condiciones experimentales: medio con baja concentración de glucosa (1000mg/L) y
sin suero, indicado como B.G. durante un periodo de 4 horas; medio con baja concentración
de glucosa, sin suero, más la adición del EGF (Cf=50ng/ml) durante 4 horas; y medio con baja
concentración de glucosa, sin suero, más la adición del inhibidor BI-D1870 (Cf=10µM) durante
4 horas. En el WB mostramos la detección de los niveles proteicos mediante los anticuerpos
específicos p-LKB1S428, LKB1, p-AMPKαT172, AMPKα, p-ERK1/2T202/Y204, ERK1/2 y p-CREBS133.
De manera que, en cojunto, estos resultados muestran claramente que las
células de melanoma mutadas en BRAF tienen una respuesta limitada al estrés
metabólico. Además, de manera relevante, la resistencia observada a estrés
energético en las células de melanoma BRAFV600E parece ser anulada bajo la
supresión del efecto oncogénico de BRAF (mediante inhibidores de la vía de
RAS o por el uso del siRNA de BRAF), ya que la inhibición de la señalización
de RAS bajo estrés energético es capaz de reconstituir la vía de señalización
de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2. No obstante, el tratamiento con el
inhibidor de BI-D1870 indica que la inhibición de la fosforilación de LKB1S428
no es suficiente para reconstituir la vía de señalización LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2, sugiriendo la existencia de mecanismos adicionales probablemente
mediados por ERK1/2.
El tratamiento con factores de crecimiento induce el desacoplamiento
del complejo LKB1-AMPKα
La actividad cinasa del supresor tumoral LKB1 no se encuentra relacionada con
su estado de fosforilación209. De este modo, la modificación o modificaciones
en su estado de fosforilación estaría probablemente condicionando la
85
interacción de LKB1 con otras moléculas y/o a su localización celular,
contribuyendo así a los distintos procesos biológicos en los que se ha visto
implicada. Uno de estos procesos biológicos en que se encuentra implicada la
cinasa LKB1, es en el control del metabolismo celular a través de la cascada
de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1144,210,142. De manera que en relación al estímulo de
estrés metabólico que activa la vía de AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 por LKB1, AMPK
se activa por LKB1 bajo condiciones pobres en nutrientes, y se inactiva bajo
condiciones ricas en nutrientes. En términos generales, la respuesta
mitogénica inducida por un factor de crecimiento coordina simultáneamente el
crecimiento y la división celular, a través de la activación de la vía de
señalización mTOR. De modo que mTOR tiene un patrón de activación inverso a
AMPK, debido a que AMPK inhibe mTORC1 a través de la fosforilación de TSC2 y
de raptor167,211,210,212 en respuesta a estrés metabólico.
Por consiguiente, dado que la activación de la vía de RAS (por BRAFV600E)
limita la respuesta a estrés energético, analizamos la posibilidad de si la
activación de la vía de señalización de RAS promovería la disociación del
complejo LKB1-AMPKα, impidiendo la activación de AMPK por estrés metabólico,
estableciendo así un mecanismo que podría asegurar el crecimiento y división
celular debido al estímulo mitogénico y la resistencia a las condiciones de
estrés energético.
Además, señalar que datos previos que obtuvimos en células de melanoma
murinas y humanas silenciadas de manera estable para LKB1, se consiguió una
supresión génica correspondiente a un 95-98 % de LKB1. Este silenciamento
estable de LKB1 en líneas celulares de melanoma humanas y murinas se realizó
mediante la infección estable lentiviral del plásmido pLKO.1-puro shRNA LKB1
murino y humano, respectivamente. De manera que en las células knock down de
LKB1 que únicamente expresaban entre un 5-2 % de LKB1, observamos que tan
sólo una pequeña fracción de LKB1 era suficiente para observar una inducción
de la fosforilación de LKB1S428 en respuesta a factores de crecimiento
(Fig.4A).
Estos resultados sugirieron que solamente una pequeña población de LKB1 es
suficiente para intervenir en respuesta a factores de crecimiento, e
indicando así la relevancia de este mecanismo en la respuesta mitogénica y a
factores de crecimiento.
Así, dado el limitado número de moléculas de LKB1 implicadas en respuesta al
estímulo mitogénico, el siguiente diseño experimental para el análisis de los
complejos de LKB1-AMPKα, consistió en el diseño y generación de los vectores
de expresión en células de mamífero de las proteínas totales LKB1 y AMPKα
fusionadas con un dominio o etiqueta Flag y GST en el extremo N-terminal,
86
respectivamente, que nos permitió una óptima inmunoprecipitación de los
complejos LKB1-AMPKα.
Para investigar el mecanismo propuesto de asociación y disociación de los
complejos de LKB1-AMPKα, transfectamos las células HEK293T con Flag-LKB1WT y
GST-AMPKαWT, y 48 horas postransfección tratamos con el EGF para promover la
activación de la vía mitogénica de RAS. Tras la inmunoprecipitación de los
complejos de Flag-LKB1WT testamos la presencia de GST-AMPKαWT en los
inmunocomplejos. Los datos indican que una fracción de AMPKα se encuentra
constitutivamente unida a LKB1 (Fig.16R). De manera relevante, el tratamiento
de las células con el factor de crecimiento indujo la disociación de los
complejos LKB1-AMPKα. Además, este efecto fue totalmente independiente de la
actividad cinasa de LKB1, ya que la transfección con el Flag-LKB1KD, mutante
que se caracteriza por la inactividad de la cinasa (kinase dead, KD), y con
el GST-AMPKαWT reproduce exactamente los mismos resultados que con la
inmunoprecipitación de Flag-LKB1WT y de GST-AMPKαWT (Fig.16R).
Estos datos sugirieron que la estimulación con el factor de crecimiento
promueve la disociación de LKB1-AMPKα y que este efecto se correlaciona con
el estado de activación de la vía de RAS/MEK/ERK/p90RSK/LKB1 tras el estímulo
del Factor de Crecimiento (EGF).
Figura 16R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα
Análisis de los complejos de LKB1 en respuesta a la activación de la vía de RAS por el
estímulo del EGF en HEK293T. La línea celular HEK293T fue transfectada con Flag-LKB1WT/Flag-
LKB1KD y GST-AMPKαWT (proteínas etiquetadas por un Flag y un GST en el N-terminal,
respectivamente). 48 horas postransfección, las células fueron tratadas con el EGF
(Cf=50ng/ml). Tras la inmunoprecipitación (IP) de los complejos de Flag-LKB1WT/Flag-LKB1KD a
partir de 800 µg de proteína total, los complejos se resolvieron por SDS-PAGE, y se analizó
87
por WB la presencia de GST-AMPKαWT y de p-LKB1S428 en los inmunocomplejos. El WB muestra los
lisados proteicos totales (30 µg) como control de los niveles de transfección (anti-Flag y
anti-GST), así como la respuesta al factor de crecimiento (p-ERK1/2T202/Y204 y ERK2).
A continuación, decidimos examinar la función del residuo Ser 428 Homo
sapiens/431 Mus musculus de LKB1 en relación al efecto de disociación de
LKB1-AMPKα. Transfectamos las células HEK-293T con las distintas
construcciones: Flag-LKB1WT; Flag-LKB1S431A, mutante que impide la fosforilación
de la Ser 431; Flag-LKB1S431D, mutante que mimetiza la fosforilación
constitutiva de la Ser 431; y Flag-LKB1KD, mutante que tiene anulada la
actividad cinasa. Cada una de estas construcciones mutantes de LKB1 fueron
cotransfectadas junto con el GST-AMPKαWT, y repetimos el experimento anterior.
De nuevo, cuando transfectamos LKB1WT y LKB1KD junto con GST-AMPKαWT bajo las
condiciones del estímulo con el EGF observamos la disociación del complejo
LKB1-AMPKα (Fig.17R). No obstante, AMPKα no formó complejo con ninguno de los
mutantes para el residuo de la Ser 428 de LKB1 (Flag-LKB1S431A ni con Flag-
LKB1S431D), sugiriendo que este residuo de LKB1 podría estar implicado en la
unión o estabilidad de los complejos LKB1-AMPKα (Fig.17R).
Además, estos datos indicaron que aunque la estimulación del factor de
crecimiento indujo la fosforilación de LKB1S428 y la disociación de AMPK de los
complejos de LKB1-AMPKα, la participación de otros residuos de LKB1 o
mecanismos bioquímicos simultáneos no podrían ser excluídos.
En relación a la posible implicación del residuo Ser 428 humano de LKB1 en la
unión o estabilidad de los complejos de LKB1-AMPKα, y sabiendo que la
posición de la Ser 428 se encuentra concretamente en el C-terminal de la
cinasa LKB1, se diseñaron y generaron los distintos mutantes con deleciones
en el extremo C-terminal de LKB1, y se investigó la implicación del dominio
C-terminal de LKB1 en la unión a AMPKα.
Las células HEK293T fueron transfectadas con las distintas construcciones de
LKB1 delecionado en el C-terminal, como Flag-LKB1Δ416-436/Flag-LKB1Δ323-436 junto
con el GST-AMPKαWT bajo las condiciones de un medio completo, donde se observó
que en la deleción del aminoácido 323 al 436 correspondiente al C-terminal de
LKB1 fue suficiente para observar una pérdida de la unión del complejo de
LKB1 a AMPKα (Fig.18R).
88
Figura 17R/ El EGF induce la disociación del complejo LKB1-AMPKα
independientemente de la actividad catalítica de LKB1 y dependientemente de la
integridad del residuo Ser428 de LKB1
Estudio de los complejos de LKB1 en respuesta a la activación de la vía de RAS por el
estímulo del EGF en la línea celular HEK293T. (A) Las células HEK293T fueron transfectadas con Flag-LKB1WT/Flag-LKB1KD/Flag-LKB1S431A/Flag-LKB1S431D y GST-AMPKαWT. 48 horas postransfección,
las células fueron tratadas con el EGF (Cf=50ng/ml). Tras la inmunoprecipitación (IP) de los
complejos de Flag-LKB1WT/Flag-LKB1KD/Flag-LKB1S431A/Flag-LKB1S431D a partir de 800 µg de proteína
total, analizamos por WB la presencia de GST-AMPKαWT en los inmunocomplejos. Los niveles
proteicos mostrados en el WB de los inmunocomplejos de las IP-Flag y de los 30 µg de lisados
proteicos totales, se detectaron con los anticuerpos específicos p-LKB1S428, Flag, GST, y β-
actina. (B) Representación gráfica de los niveles de GST-AMPKα y Flag-LKB1 detectados por
WB, cuantificados por densitometría y normalizados por los niveles de Anti-Flag (LKB1).
89
Figura 18R/ AMPKα se une directamente o indirectamente al dominio C-terminal de
LKB1
(A) Investigamos la localización del dominio de unión de LKB1 a AMPK en la línea celular HEK293T. Las células HEK293T fueron transfectadas con Flag-LKB1WT/Flag-LKB1Δ416-436/Flag-
LKB1Δ323-436 y GST-AMPKαWT. 48 horas postransfección, las células fueron lisadas. Tras la
inmunoprecipitación (IP) de los complejos de Flag-LKB1WT/Flag-LKB1Δ416-436/Flag-LKB1Δ323-436 a
partir de 800 µg de proteína total, analizamos por WB la presencia de GST-AMPKαWT en los
inmunocomplejos. El WB muestra los niveles de Flag-LKB1 y GST-AMPKα. (B) Diagrama
ilustrativo de la estructura proteica de LKB1 y de los mutantes por deleciones en el C-
terminal de LKB1. Los números de las construcciones mutantes por deleción de LKB1
corresponden a los aminoácidos de la proteína cinasa LKB1.
Estos resultados indicaron que la región del dominio regulador C-terminal
aproximadamente entre el aminoácido 323 al 436 de LKB1 es necesaria para la
unión directa o indirecta de AMPKα a estos complejos.
En conjunto, estos resultados muestran evidencias que soportaron que el
tratamiento con el factor de crecimiento EGF media el desacoplamiento de los
complejos LKB1-AMPKα de manera independiente de la actividad cinasa de LKB1.
Por el contrario, los mutantes Flag-LKB1S431A y Flag-LKB1S431D no forman complejo
con GST-AMPKα, sugiriendo que este residuo podría estar implicado en la unión
o estabilidad de los complejos LKB1-AMPKα. Además, en relación a estos
90
resultados observamos que AMPKα se uniría directamente o indirectamente al
dominio regulador C-terminal aproximadamente entre el aminoácido 323 y 436 de
LKB1, región donde se encuentra la serina 431. Por lo que aunque la
estimulación con el factor de crecimiento induce la fosforilación de LKB1S428,
mecanismos adicionales podrían promover la disociación de LKB1-AMPKα de
manera dependiente de la señalización de RAS apoyando el posible mecanismo
propuesto anteriormente y posiblemente mediado por ERK1/2.
El efecto oncogénico de BRAFV600E induce el desacoplamiento del
complejo LKB1-AMPKα
Basándonos en estos datos, sugerimos que la respuesta limitada al estrés
metabólico de las células de melanoma mutantes en BRAF estaría causada por la
disociación constitutiva de los complejos LKB1-AMPKα. De este modo, la
inhibición de la señalización de RAS/MEK/ERK mediante el inhibidor de MEK1/2
(U0126) podría permitir la reconexión de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1.
Para confirmar esta hipótesis, realizamos la inmunoprecipitación de LKB1
endógeno en las células de melanoma mutantes en BRAFV600E y examinamos la
asociación de LKB1 a AMPKα bajo condiciones de baja concentración de glucosa
con la presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0126).
Las células de melanoma UACC903 y A375 mostraron en la inmunoprecipitación de
LKB1 endógeno un aumento del número de moléculas de AMPKα asociadas a los
complejos de LKB1 cuando la vía de señalización de BRAF fue bloqueada con el
inhibidor específico U0126 en respuesta a estrés metabólico (Fig.19R (A)).
Así, la reasociación del complejo LKB1-AMPKα fue asociada a un aumento de los
niveles de fosforilación de AMPKαT172 en respuesta al tratamiento con el
inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) en condiciones de baja concentración
de glucosa.
Resultados similares fueron obtenidos cuando se inmunoprecipitó p-AMPKαT172 de
la línea celular de melanoma SkMel28 en las mismas condiciones anteriores. La
inhibición de la señalización de BRAFV600E con el inhibidor U0126 en
condiciones de baja concentración de glucosa resultó en un aumento de los
niveles de p-AMPKαT172, mientras que en las condiciones con elevada
concentración de glucosa en presencia o ausencia del inhibidor U0126 no se
produjo ninguna variación de los niveles de p-AMPKαT172, confirmando el
mecanismo sugerido anteriormente (Fig.19R (B)).
91
Adicionalmente, reconstituímos el sistema molecular de la vía de estrés
energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 y del efecto oncogénico de BRAFV600E en
la línea celular HeLa que no expresa LKB1 endógeno. De este modo, se
investigó la formación de los complejos bajo estrés metabólico en células
transfectadas transitoriamente con Flag-LKB1WT y GST-AMPKαWT en presencia o
ausencia del oncogén myc-BRAFV600E, y tras la inhibición de la señalización de
BRAFV600E mediante el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126).
Observamos que en la inmunoprecipitación de Flag-LKB1WT en la condición
experimental donde se sobreexpresa transitoriamente los plásmidos Flag-LKB1WT,
GST-AMPKα y myc-BRAFV600E, tan sólo la expresión del oncogén BRAFV600E indujo la
disociación del complejo LKB1-AMPKα en respuesta a estrés energético. Por el
contrario, la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E por el inhibidor
específico de MEK1/2 (U0126) en respuesta a estrés energético revirtió
totalmente la disociación del complejo LKB1-AMPKα con un incremento del
Figura 19R/ La inhibición de la señalización de BRAFV600E reasocia los complejos
de LKB1-AMPKα en respuesta a estrés energético
Estudio de los inmunocomplejos de LKB1 endógeno en respuesta a la restauración de la vía de
LKB1/AMPK por el estímulo del estrés energético y la anulación del efecto oncogénico de
BRAFV600E en las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E (UACC903, A375 y SkMel28).
Las distintas líneas celulares de melanoma se sometieron a las siguientes condiciones
experimentales: medio con alta concentración de glucosa (4500mg/L) y sin suero
(referenciado en la figura como A.G.); medio con baja concentración de glucosa (1000mg/L) y
sin suero (B.G.); y medio con baja concentración de glucosa, sin suero, más la adición del
inhibidor de MEK1/2 (U0126, Cf=10µM). Todos los tratamientos se realizaron durante un
periodo de 4 horas. Tras el tratamiento y lisis celular se realizaron las
inmunoprecipitaciones (IP) con los 800 µg de lisado proteico total. (A) IP de LKB1 endógeno
en las UACC903 y A375 y (B) IP de p-AMPKαT172 endógeno en las SkMel28. Los inmunocomplejos se
resolvieron por SDS-PAGE y se analizó por WB la presencia de AMPKα o LKB1 por WB. El WB
muestra los niveles de las proteínas LKB1, AMPKα y p-AMPKαT172. Como control proteico se
adicionaron los lisados totales (L.T.).
92
número de moléculas de AMPKα unidas a LKB1 respecto a la condición de
expresión del oncogén BRAFV600E (Fig.20R).
Figura 20R/ El efecto oncogénico de BRAFV600E induce la disociación del complejo
LKB1-AMPKα
Reconstitución del efecto oncogénico de BRAFV600E en el mecanismo molecular de respuesta a
estrés energético en la línea celular HeLa. Las células fueron transfectadas con Flag-
LKB1WT/GST-AMPKαWT/myc-BRAFV600E con las combinaciones experimentales siguientes: vector vacío
(pLPCX), Flag-LKB1 y GST-AMPKαWT; Flag-LKB1, GST-AMPKαWT y myc-BRAFV600E. 48 horas
postransfección, las distintas combinaciones de transfección celular se trataron durante un
periodo de 2 horas y 30 minutos bajo un medio sin suero con la presencia o ausencia del
inhibidor específico de MEK1/2 (U0126, 10µM). Tras la IP de los complejos de Flag-LKB1WT a
partir de 800 µg de lisado proteico total, analizamos por WB la presencia de GST-AMPKαWT en
los inmunocomplejos. Como control de la transfección, los lisados totales fueron analizados
por WB que muestra los niveles de Flag-LKB1, GST-AMPKα, myc-BRAFV600E, ERK1/2, p-ERK y GAPDH.
La representación gráfica muestra la cuantificación densitométrica de los niveles de GST-
AMPKα y Flag-LKB1 detectados por WB, representada por el índice de AMPKα/LKB1.
Así, la activación de la vía de RAS por el efecto oncogénico de BRAFV600E media
el desacoplamiento de los complejos LKB1-AMPKα. De este modo, la inhibición
de la vía de RAS a través del inhibidor específico de MEK1/2 en células que
tienen BRAFV600E causa la reasociación de los complejos LKB1-AMPKα permitiendo
así el restablecimiento de la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 en
respuesta a estrés energético.
93
La reconstitución de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 por la
inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E en condiciones de estrés
energético induce apoptosis
Según el mecanismo aceptado, la elevación de los niveles del AMP intracelular
como consecuencia del estrés metabólico conduce a la activación de LKB1, que
a su vez activaría a AMPK regulando la apoptosis en respuesta a estrés
energético144. Adicionalmente, se ha establecido que el oncogén BRAFV600E protege
frente la apoptosis mediante la regulación de las proteínas miembros de la
subfamilia BH3129. De manera que la inhibición de la señalización de BRAF
durante periodos largos de tiempo entre 24-48 horas en células de melanoma
mutantes en BRAFV600E promueve la apoptosis a través de la regulación de la
subfamilia de proteínas BH3129,213.
Así, investigamos la respuesta de supervivencia de las líneas celulares de
melanoma mutantes (BRAFV600E) en condiciones de estrés energético, tras la
inhibición de la señalización de BRAFV600E lo que permitiría la restauración de
la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 en respuesta a estrés
metabólico. De este modo, las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAF,
UACC903 y A375 fueron sometidas a condiciones normales y a condiciones de
estrés metabólico durante un máximo de 12 horas en la presencia o ausencia
del inhibidor específico de MEK1/2 (U0126). A continuación, se cuantificó la
viabilidad celular mediante la exclusión por tinción nuclear (Guava ViaCount)
y la apoptosis por la doble tinción de Anexina V e Ioduro de Propidio
(propidium iodide, PI). Las líneas celulares UACC903 y A375 mostraron cierto
grado de apoptosis espontánea bajo condiciones normales de crecimiento: 5,71
% y 3,27 % respectivamente (Fig.21R (A)). La inhibición de la señalización
del oncogén BRAFV600E mediante la adición del inhibidor de MEK1/2 (U0126)
durante 12 horas en medio con elevada concentración de glucosa, no promovió
ningún incremento en el índice basal de apoptosis, 5,38 % (UACC903) y 2,7 %
(A375). El sometimiento de las líneas celulares a condiciones de estrés
energético durante 12 horas produjo un ligero aumento en el número de células
dobles positivas para Anexina V/PI respecto al número observado en las
condiciones normales de crecimiento: 1,27 veces más en las células UAC903 y
2,35 veces más en las células A375. Sin embargo, la restitución de la
señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 debido al acoplamiento de LKB1-AMPKα
conseguido por la inhibición de la señalización de BRAF con el inhibidor
U0126 en bajas concentraciones de glucosa, resultó un aumento considerable
del número de células apoptóticas pasando de un 5,38 % en condiciones
normales de crecimiento hasta un 32,45 % en las células UACC903, y de un
incremento de un 2,7 % a un 20,66 % en las células A375, correspondiéndose
con un incremento en el número de células apoptóticas UACC903 y A375 de 5,7
veces y 6,4 veces más, respectivamente (Fig.21R (A)).
94
Figura 21R/ La restauración de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en las células de
melanoma BRAFV600E por la inhibición del efecto oncogénico de BRAFV600E induce
apoptosis en condiciones de estrés energético
(A) Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E (UACC903 y A375) se sometieron
durante un periodo de 12 horas a distintas condiciones experimentales: medio con alta
concentración de glucosa (4500mg/L) y sin suero (A.G.) en presencia o ausencia del
inhibidor de MEK1/2 (U0216, 10µM), y medio con baja concentración de glucosa (1000mg/L)
(B.G.) y sin suero en presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0126, 10µM). Tras el
tratamiento, las células fueron teñidas con EGFP-Annexin V y con ioduro de propidio (PI), y
analizadas por citometría de flujo (FACSCalibur). Los histogramas muestran el resultado
adquirido por el análisis por FACS. (B) Representación gráfica de los porcentajes de
viabilidad y de muerte obtenidos en el análisis de exclusión por tinción nuclear (Guava
ViaCount) con las mismas condiciones experimentales citadas en la figura 21R A.
Además, mediante el método de exclusión por tinción nuclear (Guava ViaCount)
se obtuvieron resultados semejantes (Fig.21R (B)). De manera que en las
líneas celulares de melanoma BRAFV600E (UACC903 y A375) nuevamente presentaron
resistencia al estrés energético, indicado por un mínimo incremento en el
porcentaje de células muertas de un 0,15 % a un 4,4 % en las UACC903, y del
0,65 % al 4,94 % en las A375 (Fig.21R (B)). Así, estos resultados
corroboraron los datos previamente mostrados, donde las células de melanoma
95
mutantes en BRAFV600E (UACC903 y A375) en respuesta a estrés energético
mostraron un mínimo aumento de los niveles de p-AMPKαT172, y un débil aumento
del porcentaje de las células apoptóticas bajo estrés energético. No
obstante, ambas líneas celulares de melanoma presentaron un aumento
significativo del porcentaje de células muertas en condiciones de estrés
energético tras la inhibición de MEK1/2 durante un periodo de tratamiento de
12 horas. Concretamente, las células UACC903 pasaron de un 4,4 % de muerte
celular en respuesta a condiciones de baja concentración de glucosa a un 32,5
% de muerte celular en respuesta a condiciones de baja concentración de
glucosa e inhibición de la vía de RAS mediante el U0126. De nuevo también
testamos en ambas líneas celulares de melanoma los posibles efectos de
citotoxicidad del inhibidor de MEK1/2 (U0126) durante un tratamiento de 12
horas, y observamos tan sólo un incremento del 0,65 % al 1,8 % de muerte
celular debido a la adición del inhibidor U0126 en las A375 (Fig.21R (B)).
Estos resultados se correlacionaron con el estado molecular de las vías
implicadas en el tratamiento a lo largo del tiempo. Como se ha mostrado
anteriormente, la inhibición de la fosforilación de ERK1/2 resultó la
disminución de los niveles de p-LKB1 y la reconstitución de la señalización
de LKB1/AMPK, asociado a un aumento de los niveles de p-AMPKαT172 en respuesta
a estrés energético (Fig.12R).
En relación a estos sucesos, mostramos que la vía de señalización
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 fue capaz de sensibilizarse después de 4 horas de
tratamiento con el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) en condiciones de
estrés energético, indicado por un aumento de los niveles de p-AMPKαT172
(Fig.22R). Cabe destacar que, el aumento en el número de células apoptóticas
no correlacionó con la estabilización de p53. Por lo contrario, los niveles
de p53 fueron menores tras el tratamiento con el inhibidor U0126 bajo estrés
energético a las 4 y 12 horas de tratamiento, sugiriendo la participación de
BRAFV600E en la estabilización de p53, y de un mecanismo apoptótico
independiente de p53 (Fig.22R).
96
Para establecer un enlace causal a la inhibición de la señalización de BRAF,
a la reactivación de la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2, y al aumento del
número de células muertas, realizamos el silenciamiento o disminución de la
expresión de los genes AMPKα1 y AMPKα2 (knocking-down de AMPKα1 y AMPKα2) en la
línea celular UACC903. Así, investigamos la implicación de AMPKα en el
restablecimiento de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 y en la
capacidad de activación de la apoptosis bajo condiciones de estrés energético
metabólico. Así, analizamos la viabilidad celular mediante el método de
exclusión por tinción nuclear (Guava ViaCount) en los knocking-down
transitorios de AMPK bajo estrés energético e inhibición de la vía de RAS.
Como se muestra en la figura 23R A, la inhibición de la señalización de
BRAFV600E bajo condiciones de estrés energético en las células con el siRNA
control resultó un elevado nivel de p-AMPKαT172 junto con un aumento en el
número de células muertas. No obstante, el silenciamiento génico de AMPKα
mediante el siRNA contra AMPKα1 y AMPKα2 en las células de melanoma mutantes
en BRAFV600E, no produjo un aumento de los niveles de p-AMPKαT172 ni un aumento
del número de células muertas en las mismas condiciones (Fig.23R (A y B)).
Figura 22R/ Las células de melanoma BRAFV600E se sensibilizan a estrés energético
a partir de las 4 horas de tratamiento por inhibición del efecto oncogénico de
BRAFV600E presentando un mecanismo apoptótico independiente de p53
Las distintas líneas celulares de melanoma se sometieron en periodos de tratamiento de 4 y
12 horas allí donde se indica bajo las distintas condiciones experimentales: medio con alta
concentración de glucosa (4500mg/L) y sin suero, referenciado en la figura como A.G.; medio
con baja concentración de glucosa (1000mg/L) y sin suero (B.G.); y medio con baja
concentración de glucosa, sin suero, más la adición del inhibidor de MEK1/2 (U0126,
Cf=10µM). El análisis por WB muestra los niveles de las proteínas p-AMPKαT172, AMPKα, p-
LKB1S428, LKB1, p-ERK1/2T202/Y204, ERK 2 y p53 bajo las condiciones indicadas a diferentes
tiempos.
97
De manera que el efecto del siRNA de AMPKα (silenciamiento de AMPKα) no
permitió la activación de la vía de estrés LKB1/AMPK/TSC1-TSC2, ni la
activación de la vía apoptótica mediada por AMPK.
Estos datos sugirieron que la inhibición de la señalización del oncogén
BRAFV600E bajo estrés energético sensibiliza a las células a apoptosis mediante
la activación de la vía LKB1/AMPK/TSC1-TSC2.
Figura 23R/ AMPK (AMPKα1 y AMPKα2) se encuentra implicado en la restauración de
la vía de estrés energético y en la activación de la apoptosis bajo estrés
energético
Generamos el silenciamiento génico (knocking down) transitorio de AMPK para desvelar la
implicación de AMPK en la restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 y
en la activación de la apoptosis en respuesta a una baja concentración de glucosa. La línea celular UACC903 se transfectó con el ARN de interferencia (siRNA) AMPKα1 y AMPKα2, y el
siRNA Control. 72 horas postransfección, las células knocking-down se sometieron durante 4
horas bajo las distintas condiciones experimentales siguientes: medio con baja
concentración de glucosa y sin suero (B.G.) en ausencia o presencia del inhibidor de MEK1/2
(U0126, 10µM). (A) Análisis por WB de las distintas condiciones experimentales con los
anticuerpos específicos p-AMPKαT172, AMPKα, p-ERK1/2T202/Y204 y GAPDH. (B) Representación gráfica
de la inducción de muerte celular obtenida en el análisis de exclusión por tinción nuclear
(Guava ViaCount) en células sometidas a las mismas condiciones experimentales citadas en la
figura 23R A.
98
La apoptosis inducida por estrés metabólico tras la inactivación del
oncogén BRAFV600E está mediada por miembros de la subfamilia BH3
Como se ha mencionado previamente, el efecto oncogénico de BRAFV600E suprime la
apoptosis mediante proteínas de la subfamilia BH3129. Por este motivo,
investigamos la participación de algunos de los miembros pertenecientes a la
familia BH3 en respuesta a una elevada concentración de glucosa y a una baja
concentración de glucosa en presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2
U0126 durante periodos tempranos de 4 horas y 12 horas.
En condiciones de elevada concentración de glucosa la adición del inhibidor
U0126 durante un periodo de tratamiento de 12 horas causó una leve
disminución de los niveles de p-BADS112 y de la proteína antiapoptótica MCL-1,
junto con un ligero aumento en la cantidad de la proteína proapoptótica BIMEL
(Fig.24R). De manera relevante, cuando la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
se restituyó mediante la inhibición del efecto oncogénico BRAFV600E en
condiciones de baja concentración de glucosa durante un periodo de
tratamiento corto de 4 horas, el aumento del número de células muertas
correlacionó con una fuerte respuesta bioquímica incluyendo la completa
defosforilación de BADS112, la estabilización de la isoforma no fosforilada de
BIMEL y la drástica desaparición de MCL-1 (Fig.24R).
Figura 24R/ Miembros de la subfamilia BH3 median la apoptosis inducida por la
inactivación del efecto oncogénico de BRAFV600E bajo estrés metabólico
Estudio del mecanismo molecular apoptótico de los miembros de la familia BCL-2 en respuesta
a estrés energético y su restauración en células de melanoma BRAFV600E mutantes. Las líneas
celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E (UACC903 y A375) se sometieron durante un periodo
de 12 h (figura de la izquierda) de 4 h (figura de la derecha) a distintas condiciones
experimentales: medio con alta concentración de glucosa (4500mg/L) y suplementado con suero
(A.G. MC); medio con alta concentración de glucosa (4500mg/L) y sin suero (A.G. MSS) en
presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0216, 10µM); medio con baja concentración de
glucosa (1000mg/L) (B.G.) y sin suero en presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2
(U0126, 10µM) (4 h de tratamiento). Tras el tratamiento, las células fueron lisadas y
analizadas por SDS-PAGE. El WB muestra los niveles de BIM, p-BADS112, MCL-1 y GAPDH.
99
Estos resultados indicaron que en un contexto celular BRAFV600E mutante, la
reactivación de la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 bajo
condiciones de estrés energético junto con la inhibición del efecto
oncogénico de BRAFV600E en periodos de tiempo cortos, promueve una pronunciada
respuesta a apoptosis mediante proteínas proapoptóticas de la subfamilia BH3
como es la defosforilación de BADS112, estabilización de BIMEL, y la regulación
a la baja de la proteína antiapoptótica MCL-1.
La inhibición de la vía de RAS/MEK/ERK bajo estrés energético
restaura la respuesta a estrés energético en células de melanoma
mutantes en NRASQ61R
Se sabe que las mutaciones en BRAF se encuentran con un índice superior al 80
% en los melanomas cutáneos31,214, y en un porcentaje inferior (15-20 %) de
melanomas pero significativo se encuentran mutaciones somáticas en NRAS31,32.
Greene et al215 describen que la frecuencia de las mutaciones en BRAF y en NRAS
fueron del 40 % en melanomas in situ, y de un 79,3 % en melanomas invasivos.
Así, las mutaciones en BRAF y en NRAS se encontraron con una frecuencia
mutacional de un 55,2 % en los melanomas invasivos en fase de crecimiento
radial (RGP), y con un mayor porcentaje (75,9 %) en los melanomas invasivos
en fase de crecimiento vertical (VGP).
Por consiguiente, decidimos testar el estrés metabólico, la supervivencia y
la apoptosis en las líneas celulares de melanoma mutantes en NRASQ61R, y
nuevamente en las BRAFV600E, en respuesta a bajas concentraciones de glucosa y
en combinación con el tratamiento con los inhibidores de la vía de RAS, como
el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) o el inhibidor multicinasa
sorafenib. Así, investigamos la inducción de la apoptosis mediada por la
restauración de la vía de LKB/AMPK tras la inhibición de la vía de
señalización RAS/ERK bajo estrés energético inducido por bajas
concentraciones de glucosa en las líneas celulares de melanoma mutantes en
BRAFV600E y en extensión a las células de melanoma mutantes en NRASQ61R.
Las líneas celulares de melanoma BRAFV600E (UACC903) y NRASQ61R (SkMel103 y
SkMel147) fueron tratadas a bajas concentraciones de glucosa, y con la
presencia o ausencia del inhibidor U0126 o del inhibidor sorafenib. Como se
indica en la figura 25R, las líneas celulares mutantes en BRAFV600E y en NRASQ61R
presentaron una restitución de la vía de estrés energético indicado por un
claro aumento de los niveles de p-AMPKαT172 tras la inhibición de la vía de RAS
mediante los inhibidores U0126 o sorafenib bajo estrés energético (Fig.25R).
100
Figura 25R/ La inhibición del efecto oncogénico de NRASQ61R permite la
restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E (UACC903) y en NRASQ61R (SkMel147 y
SkMel103) se sometieron durante un periodo de 4 h a distintas condiciones experimentales:
medio con alta concentración de glucosa (4500mg/L) (A.G.) y sin suero en presencia o
ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0216, 10µM) y de sorafenib (10µM); medio con baja
concentración de glucosa (1000mg/L) (B.G.) y sin suero en presencia o ausencia del
inhibidor de MEK1/2 (U0126, 10µM) y de sorafenib (10µM). Tras el tratamiento, las células
fueron lisadas y analizadas por SDS-PAGE. El WB muestra los niveles de p-AMPKαT172, AMPKα, p-
ERK1/2 y ERK1/2.
También, el tratamiento con el inhibidor específico de MEK1/2 en las
distintas líneas celulares mutantes en NRASQ61R (SkMel103 y SkMel147) bajo
condiciones de crecimiento de medio completo suprimió totalmente los niveles
de p-ERK1/2, no obstante, el tratamiento con sorafenib no fue efectivo de
acuerdo a los niveles de activación de p-ERK1/2, donde observamos los mismos
niveles de p-ERK1/2 que en la condición control (Fig.25R). Aunque actualmente
desconocemos el mecanismo, de manera significativa en las células mutantes en
NRASQ61R, y no las mutantes en BRAFV600E, presentaron un claro aumento de los
niveles de p-ERK1/2 en respuesta a estrés metabólico. Además, las células
mutantes NRASQ61R bajo estrés metabólico en combinación con la inhibición del
efecto oncogénico a través del inhibidor específico U0126, el inhibidor U0126
101
no fue capaz de abolir totalmente la activación de ERK1/2, sin embargo, el
tratamiento con el inhibidor sorafenib abolió completamente los niveles de p-
ERK1/2 (Fig.25R).
Seguidamente, analizamos por WB la participación de algunos de los miembros
pertenecientes a la subfamilia BH3 en la respuesta apoptótica en las
condiciones de una elevada concentración de glucosa y de una baja
concentración de glucosa en presencia o ausencia del inhibidor específico de
MEK1/2 (U0126) o sorafenib durante periodos de tratamiento cortos de 4 horas
en las líneas celulares mutantes en NRASQ61R y NRASWT.
En ambos genotipos mutantes en respuesta a estrés energético observamos bajos
niveles de p-BADS112, molécula proapoptótica clave en la iniciación de muerte
celular. Con importancia, en la línea celular de melanoma mutante en NRASQ61R
(SkMel103), la inhibición del efecto oncogénico de RAS por el inhibidor U0126
o sorafenib en respuesta a estrés energético promovió la completa abolición
de los niveles de p-BADS112, condiciones donde se restituye la vía de LKB1/AMPK
(Fig.26R).
Figura 26R/ La sensibilización a la apoptosis en células de melanoma mutantes en
NRASQ61R está mediada por la restauración de la vía de estrés energético
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2
La línea celular de melanoma (UACC1097) y en NRASQ61R (SkMel103) se sometieron durante un
periodo de 4 horas a distintas condiciones experimentales: medio con alta concentración de
glucosa (4500mg/L) (A.G.) y sin suero en presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2
(U0216, 10µM) y de sorafenib (10µM); medio con baja concentración de glucosa (1000mg/L)
(B.G.) y sin suero en presencia o ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0126, 10µM) y de
sorafenib (10µM). El WB muestra los niveles de p-AMPKαT172, AMPKα, p-ERK1/2, ERK1/2 y p-
BADS112.
Estos datos indicaron que las líneas celulares mutantes en NRASQ61R también se
sensibilizan a estrés metabólico a través de la restauración de la vía de
102
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediante la inhibición del efecto oncogénico de RAS.
Además, la restauración de la vía de estrés metabólico en las células de
melanoma mutantes en NRASQ61R induce apoptosis a través de la proteína
proapoptótica de la subfamilia BH3 como indica la defosforilación de p-BADS112
(Fig.26R).
Así, observamos que el comportamiento general en las líneas celulares
mutantes en BRAFV600E o NRASQ61R en condiciones de baja concentración de glucosa
tras la inhibición del efecto onocogénico de BRAFV600E o NRASQ61R induce un claro
aumento de los niveles de p-AMPKαT172 y una abolición total de los niveles de
p-ERK1/2 por el inhibidor sorafenib, donde parece indicar una reconexión de
la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/mTORC1 independientemente de las
mutaciones en BRAFV600E o NRASQ61R (Fig.25R y 26R).
Agonistas de AMPK como posibles terapias en cáncer
El tratamiento con metformina/phenformin tras la inhibición del
efecto oncogénico de RAS en células de melanoma mutantes en BRAFV600E
y en NRASQ61R restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e induce
apoptosis
La metformina es uno de los fármacos más ampliamente utilizados en diabetes
de tipo 2, denominada en el ámbito comercial farmacéutico Glucophage. La
metformina es responsable de la disminución de la gluconeogénesis hepática216
mediante la inhibición parcial de la fosforilación oxidativa, alterando el
índice de ATP/AMP217. El aumento de los niveles celulares de AMP activan a la
cinasa AMPK que inhibe la gluconeogénesis hepática promoviendo la
fosforilación de mTORC2 y bloqueando su translocación nuclear, y la
transcripción de los genes implicados en la gluconeogénesis218. Este mecanismo
de acción farmacológica, responsable de alterar el índice de ATP/AMP y como
consecuencia generar bajos niveles de glucosa y de insulina, explica el
efecto terapéutico de la metformina en la diabetes de tipo 2219. Siendo este
mecanismo, una evidencia donde el AMPK puede actuar como un supresor tumoral.
Además, recientemente se ha descrito que la metformina además de ejercer un
efecto en diabetes, también tiene un papel importante como fármaco
antitumoral. Hirsch y sus colaboradores descubrieron que la metformina es
selectivamente tóxica para las células madre tumorales, añadiendo a este
fármaco otro interés, concretamente la propiedad antineoplásica220.
Debido a que la metformina es responsable del aumento de los niveles de AMP
activando así a AMPK, ésta podría mimetizar parcialmente los efectos
producidos por el estrés metabólico producido por una baja concentración de
103
glucosa. Por este motivo, investigamos el efecto de la combinación de la
metformina junto con los inhibidores de la vía de RAS/ERK como U0126 y
sorafenib en las líneas celulares de melanoma que presentan mutaciones en
BRAFV600E y en NRASQ61R.
Las líneas celulares de melanoma UACC903 y SkMel28 (BRAFV600E mutantes),
SkMel103 y SkMel147 (NRASQ61R mutantes) fueron tratadas a distintas dosis de
metformina durante 4 horas con la presencia o ausencia del inhibidor
específico de MEK1/2 (U0126) en un medio con alta concentración de glucosa
(4500mg/L) y con el 10 % de suero (medio completo). Las líneas celulares
mutantes en BRAFV600E (SkMel28) o en NRASQ61R (SkMel103) presentaron una débil
respuesta a metformina indicado por el mínimo aumento de los niveles de p-
AMPKαT172. De manera significativa, la combinación de metformina (con ambas
dosis de 0,5 y 1mM) con el inhibidor específico de MEK1/2 (10µM), condujo a
la restitución de la vía de estrés energético indicado por el aumento de los
niveles de p-AMPKαT172 (Fig. 27R).
Estos resultados sugirieron que la reconexión de la vía LKB1/AMPK en
respuesta al estrés energético mediado por el fármaco metformina tras la
inhibición del efecto oncogénico de BRAF o de NRAS es aplicable tanto en
tumores con mutaciones en BRAF como NRAS.
Figura 27R/ Restauración de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en
respuesta a metformina e inhibición de la vía de RAS
La línea celular de melanoma BRAFV600E (SkMel28) y en NRASQ61R (SkMel103) se sometieron durante
un periodo de 4 horas a distintas condiciones experimentales: medio con alta concentración
de glucosa (4500mg/L) (A.G.) y con el 10 % de suero (medio completo) en presencia o
ausencia del inhibidor de MEK1/2 (U0216, 10µM); medio completo en presencia o ausencia de
distintas concentraciones de metformina en combinación con el inhibidor de MEK1/2 (U0126,
10µM). El WB muestra los niveles de p-AMPKαT172, AMPKα, MCL-1 y GAPDH.
104
Seguidamente, analizamos marcadores claves de muerte celular en la
restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediada por
el fármaco metformina tras la inhibición de la vía de RAS en las líneas
celulares mutantes en BRAFV600E y en NRASQ61R.
Las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E y en NRASQ61R en respuesta
al cotratamiento con metformina y con el inhibidor específico de MEK1/2
(U0126) mostraron una respuesta similar a la anteriormente descrita respecto
a la inducción de apoptosis, reflejada por los bajos niveles de la proteína
antiapoptótica MCL-1 que correlacionó con los altos niveles de p-AMPKαT172
(Fig. 27R).
En relación a estos resultados, investigamos la toxicidad de la restauración
de la vía de estrés metabólico en distintas líneas celulares BRAFV600E y NRASQ61R
mediante el ensayo de formación de colonias.
Observamos que las líneas celulares mutantes en BRAFV600E respecto las mutantes
en NRASQ61R son claramente más resistentes a los fármacos metformina y
phenformin, observándose en la línea celular mutante en BRAFV600E un mayor
número de colonias en el monotratamiento de metformina o phenformin respecto
la mutante en NRASQ61R (Fig.28R (A) y (B), respectivamente). Además de observar
significativamente más colonias en la línea celular mutante en BRAF respecto
la mutante en NRAS, la línea celular de melanoma mutante en BRAFV600E (SkMel28)
fue tratada a una dosis de metformina 20 veces mayor respecto la línea
celular mutante en NRASQ61R (SkMel147) (dosis de metformina de 5mM y 10Mm en
las SkMel28; y de 0,25 mM y 0,5 mM en las SkMel147); y a una dosis de
phenformin 10 veces mayor respecto la línea celular mutante en NRASQ61R (dosis
de phenformin de 100 µM y 200 µM en las SkMel28; y de 10 µM y 20 µM en las
SkMel147). Además, es importante señalar que en las líneas celulares de
melanoma mutantes en NRASQ61R, tratadas con metformina a una dosis 20 veces
menor respecto las mutantes BRAFV600E, presentaron un comportamiento
significativamente más sensible al tratamiento que combina los fármacos
metformina y sorafenib (Fig.28R (B)) frente las líneas celulares mutantes en
BRAFV600E (Fig.28R (A)).
El comportamiento general en ambos genotipos mutantes (BRAF y NRAS), fue una
mayor citotoxicidad y un menor número de colonias en los tratamientos donde
se combina metformina/phenformin con el inhibidor sorafenib (Fig.28R (A) y
28R (B), respectivamente).
105
Figura 28R/ Citotoxicidad en las líneas celulares de melanoma humanas BRAFV600E y
NRASQ61R en respuesta a metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS
Ensayo de citotoxicidad de metformina/phenformin en combinación con el inhibidor sorafenib
en las distintas líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E y NRASQ61R. Las líneas
celulares de melanoma BRAFV600E (SkMel28) (28R (A)) y NRASQ61R (SkMel147) (28R (B)) se
sometieron durante un periodo de 16 días a distintos tratamientos: medio con alta
concentración de glucosa (4500mg/L) (A.G.) y al 10 % de suero (medio completo) en presencia
o ausencia del inhibidor sorafenib (5 µM/10µM); medio completo, en presencia o ausencia de
distintas concentraciones de metformina y phenformin; y la combinación del inhibidor
sorafenib con metformina y phenformin. Las dosis de tratamiento de metformina indicadas para las líneas celulares de melanoma mutantes en NRASQ61R son de 250 y 500 µM (28R (B)), una
dosis 20 veces menor respecto las mutantes en BRAFV600E de 5000 y 10000 µM de metformina
(28R (A)). Y para el tratamiento con phenformin, las dosis para las mutantes en NRASQ61R fue
10 veces menor respecto las mutantes en BRAFV600E.
106
Además, las líneas celulares de melanoma humanas NRASQ61R en la restauración de
la vía de estrés metabólico mediado por el cotratamiento de
metformina/phenformin junto con sorafenib parece mostrar un efecto sinérgico
citotóxico presentado por ambos fármacos respecto al monotratamiento (Fig.28R
(B)).
Resultados que indican que de manera independiente de la mutación en BRAFV600E
o en NRASQ61R existe una mayor efectividad citotóxica al cotratamiento con los
fármacos metformina/phenformin y sorafenib respecto al monotratamiento de
estos fármacos. Además, las líneas celulares de melanoma humanas mutantes en
NRASQ61R presentan de manera significativa una mayor sensibilidad citotóxica
(20 veces más) en respuesta al cotratamiento de metformina/phenformin y
sorafenib respecto las mutantes en BRAFV600E.
El tratamiento con metformin/phenformin tras la inhibición del
efecto oncogénico de RAS restaura la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 e
induce apoptosis en células de melanoma mutantes en NRASQ61K u otras
mutaciones derivadas de pacientes
Seguidamente, investigamos si la respuesta observada en las líneas celulares
de melanoma mutantes en NRASQ61K sería extrapolable a células derivadas de
pacientes. Para ello, establecimos cultivos primarios de pacientes con
melanoma cutáneo maligno, que se secuenciaron para diferentes mutaciones
relevantes incluyendo mutaciones en KRAS, NRAS y BRAF. A continuación, se
realizó el estudio molecular y de citoxicidad en las líneas celulares
metastáticas de melanoma NRASWT/NRASQ61K derivadas de pacientes (MSKM8 NRASWT,
MMLN9 y 10 NRASQ61K).
El monotratamiento con metformina y phenformin en las líneas celulares de
melanoma derivadas de pacientes sensibilizó débilmente al estrés energético
indicado por un leve aumento de los niveles de p-AMPKαT172 (Fig. 29R).
Sin embargo, estas líneas celulares de melanoma (MSKM8 NRASWT, MMLN9 y 10
NRASQ61K) tras la inhibición de la vía de señalización RAS/ERK mediante el
inhibidor sorafenib en respuesta a metformina o bajo estrés energético (medio
con baja concentración de glucosa) confirmó el mecanismo descrito
anteriormente, indicado por un claro aumento de los niveles de p-AMPKαT172
(Fig.29R).
107
Figura 29R/ Restauración de la vía de estrés energético en células de melanoma
NRASQ61K/WT derivadas de pacientes mediante el tratamiento que combina la
metformina/phenformin junto la inhibición de la vía de RAS
Las líneas celulares humanas de melanoma de pacientes NRASWT (MSKM8) y en NRASQ61K (MMLN-10 y
9) de pacientes se sometieron durante 4 horas a distintas condiciones experimentales: medio
con alta concentración de glucosa (4500mg/L) (A.G.) y sin suero en presencia o ausencia del
inhibidor sorafenib (10µM); medio B.G., sin suero y en presencia o ausencia del inhibidor
sorafenib; y medio A.G., sin suero, metformina y en presencia o ausencia del inhibidor
sorafenib.
A continuación, investigamos en estas células de melanoma NRASQ61R/WT mediante
el ensayo de formación de colonias, la efectividad citotóxica de la
inhibición de la señalización de la vía de RAS junto con el tratamiento con
metformina/phenformin.
Figura 30R/ Restauración de la vía de estrés energético en las líneas celulares
de melanoma derivadas de pacientes mutantes en NRASQ61K en respuesta a
metformina/phenformin e inhibición de la vía de RAS
Ensayo de citotoxicidad de metformina/phenformin en combinación con el inhibidor sorafenib
y el inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) en las distintas líneas celulares de melanoma
mutantes en NRASQ61K derivadas de pacientes. Las líneas celulares humanas de melanoma NRASWT
(MSKM8 (A)) y en NRASQ61K (MMLN9 (B)) derivadas de pacientes se sometieron durante
aproximadamente 18 días a distintas condiciones experimentales: medio con alta
concentración de glucosa (4500mg/L) (A.G.) y sin suero en presencia o ausencia del
inhibidor sorafenib (10µM)/metformina (500µM o 1000µM).
108
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Así, estos resultados mostraron que en las líneas celulares de melanoma
derivadas de pacientes con una alta actividad de la vía de RAS, la inhibición
del efecto oncogénico de RAS en condiciones de estrés metabólico mediante
metformina/phenformin, induce la restauración de la vía de estrés metabólico
LKB1/AMPK indicada por un claro aumento de los niveles de p-AMPKαT172. Además,
el ensayo de formación de colonias en las distintas líneas celulares de
melanoma derivadas de pacientes presentaron una mayor respuesta citotóxica en
respuesta al tratamiento que combina metformina/phenformin junto con
inhibidores U0126 o sorafenib.
De manera que estos resultados sugirieron que el cotratamiento que combina
fármacos activadores de AMPK (metformina) e inhibidores de la vía de RAS
(inhibidor multicinasa sorafenib) podría ser una nueva terapia efectiva en
melanoma.
110
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El entendimiento de los mecanismos moleculares y bioquímicos que contribuyen
al desarrollo y progresión del melanoma es crítico para una exitosa
intervención terapéutica. Por este motivo, centramos nuestros esfuerzos en
elucidar las bases moleculares de la biología del melanoma utilizando el
modelo de melanoma cutáneo murino transgénico para el Factor de Crecimiento
de Hepatocitos (HGF) inducido por radiación ultravioleta (UV) que recapitula
cronológicamente e histopatológicamente todos los estadios del melanoma
humano221,193. Dado que la contribución de la señalización constitutiva del HGF
junto con la radiación UV promueven el desarrollo y progresión del melanoma,
investigamos la contribución de la señalización del HGF/c-Met, utilizando el
modelo de melanoma cutáneo maligno murino transgénico para el HGF e inducido
por UV. En células de melanoma neoplásicas aisladas de tumores espontáneos
provenientes del modelo murino, identificamos la cinasa LKB1 de residuos
serina/treonina, conocida por su papel como sensor del metabolismo
energético, como una de las fosfoproteínas implicadas en respuesta al
tratamiento con el HGF.
De manera relevante, el residuo serina 428 de LKB1 está fosforilado
constitutivamente en células de melanoma humanas mutadas en BRAFV600E o NRASQ61R
sugiriendo la conexión entre la vía de señalización de RAS y LKB1. La
activación de la vía de RAS en melanoma humano es fundamental para el
mantenimiento tumoral contribuyendo a la desregulación de la proliferación
celular y aumentando la supervivencia celular.
En la actualidad, uno de los objetivos centrales de la investigación en
cáncer es la identificación de genes mutados que se encuentran implicados en
oncogénesis («cancer genes»). Recientemente, los estudios genómicos de los
patrones de mutaciones somáticas de los genomas de los tumores humanos, se
focalizan en el estudio de la familia de proteínas cinasa, ya que el dominio
de la proteína cinasa es el que más frecuentemente se encuentra mutado entre
los genes implicados en el desarrollo del cáncer. Curiosamente, las proteínas
cinasa BRAF y LKB1/STK11 se encuentran, respectivamente, en el segundo y
decimosexto lugar del ranking de todas las proteínas cinasas mutadas en
cáncer (en términos de presiones selectivas en genes específicos)222. Datos
que indican que ambas proteínas tienen un papel clave en cáncer.
Sin embargo, una de las cuestiones sin contestar es qué mecanismo de conexión
existe entre LKB1 y la vía de señalización de RAS, y cómo las células
tumorales adquieren resistencia al estrés metabólico, donde el fenómeno de
transformación metabólica es clave en la supervivencia y en la progresión de
la enfermedad. De manera que la identificación de las alteraciones
metabólicas claves en cáncer podría proporcionar nuevas estrategias
terapéuticas a dianas específicas en células tumorales malignas.
114
Nuestros resultados indican que el mecanismo de conexión existente entre LKB1
y la vía de señalización de RAS confiere resistencia al estrés metabólico en
las células de melanoma mutadas en el oncogén BRAFV600E o NRASQ61R. Esta
respuesta limitada a estrés metabólico se debe al desacoplamiento de los
complejos LKB1-AMPKα que impiden la activación de la vía de estrés metabólico
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1, y permiten la activación de la vía de mTORC1
asegurando la síntesis proteica. De manera que el desacoplamiento del
complejo LKB1-AMPKα es el mecanismo que desconecta la señalización del sensor
energético, de la señalización mitogénica para el control del crecimiento
celular a través de la activación de la vía de mTORC1 en respuesta a
condiciones de baja energía.
Figura 1D/ Modelo de restauración del metabolismo «normal» en melanoma.
Restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 por la
inhibición de la vía de RAS en condiciones de estrés energético induce apoptosis
La restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en ambos genotipos
mutantes en BRAFV600E o en NRASQ61R por la inhibición de la vía de RAS/RAF/MEK/ERK
115
(U0126/sorafenib) en condiciones de estrés energético (baja concentración de
glucosa/metformina) induce apoptosis a través de los miembros de la subfamilia BH3 en las
células de melanoma mutantes en BRAF o NRAS. En color vías de señalización o moléculas activas, sin color vías de señalización o moléculas
inactivas.
Además, a nivel terapéutico la inhibición de la señalización oncogénica de
BRAFV600E o NRASQ61R en condiciones de estrés metabólico (baja concentración de
glucosa o activadores de AMPK) promueve la asociación de los complejos LKB1-
AMPKα, y resulta un aumento de la apoptosis a través de la regulación de la
subfamilia de proteínas BH3 (como BIM y BAD) (Fig.1D (Discusión)).
116
La aproximación experimental para el descubrimiento de nuevas moléculas
implicadas en la señalización del HGF en células de melanoma, nos permitió la
identificación de LKB1 mediante el análisis proteómico (DIGE) en respuesta a
la activación de c-Met por el HGF. De manera que LKB1 se fosforila en el
residuo Ser 431 Mus musculus / Ser 428 Homo sapiens en respuesta al estímulo
del HGF a través de la vía de señalización de RAS/ERK. Este resultado, está
en concordancia con trabajos previos que describen la fosforilación de LKB1S428
de manera dependiente de p90RSK y de PKA en respuesta al estímulo con el
EGF/TPA y forskolin, respectivamente160,161. Más aún, los experimentos knock
down para LKB1, las células que presentan un silenciamiento de LKB1 entre un
95-99 % son capaces de responder al estímulo por parte del factor de
crecimiento, sugiriendo que una pequeña población de LKB1 es suficiente para
participar en la respuesta mitogénica, e indicando que se trata de una
función relevante en la respuesta mitogénica inducida por factores de
crecimiento.
Muchos tipos de cánceres presentan una señalización aberrante de receptores
tirosina cinasa (RTKs), bucles autocrinos de factores de crecimiento, o
mutaciones activantes en la señalización de RAS (como NRASQ61R, NRASQ61K,
BRAFV600E, entre otras), donde el mantenimiento de la señalización
proliferativa es clave en el desarrollo tumoral8. Además, en la última década
se ha revisado el concepto del «metabolismo tumoral» descrito por Otto
Warburg9.
Recientemente, en las últimas revisiones de Hanahan y Weinberg8, añaden la
adquisición del metabolismo energético celular aberrante como alteración
esencial en tumorogénesis. De este modo, las células tumorales adquieren la
capacidad de una señalización proliferativa crónica y sostenida, que regula
la progresión del ciclo celular, el crecimiento celular, la supervivencia
celular y el metabolismo energético celular. Así, las células tumorales son
adictas al efecto de Warburg (glucólisis aeróbica), fenómeno que garantiza
una continua proliferación y crecimiento celular, donde la privación de
nutrientes en células tumorales activaría una respuesta autofágica, que
podría tener como resultado la muerte de la célula tumoral. Por este motivo
el desarrollo de una terapia contra el cáncer destinada al metabolismo
prometería nuevas clases de fármacos antineoplásicos exitosos.
Los resultados de este trabajo indican que LKB1 estaría mediando parte de los
efectos oncogénicos de RAS o BRAF. De acuerdo con esto, LKB1S428 se encuentra
constitutivamente fosforilada en líneas celulares humanas de melanoma que
presentan la mutación activante en BRAFV600E, sugiriendo la conexión entre la
vía de señalización de RAS y el sensor del metabolismo energético celular
LKB1. Además, LKB1S431 también está constitutivamente fosforilada en los
117
tumores murinos que tienen desregulada la actividad tirosina cinasa o con un
aumento de la señalización mitogénica. Este hecho también se hace patente en
los tumores humanos de mama HER-2 positivos (amplificaciones en HER-2) y en
los carcinomas endometriales de fases avanzadas, donde encontramos niveles
elevados de fosforilación de LKB1S428, datos que sugieren la participación
directa de LKB1 en la biología del tumor (Fig.2D).
Figura 2D/ Modelo de la señalización oncogénica de BRAFV600E, NRASQ61R, u otras
alteraciones en la actividad de los receptores tirosina cinasa en cáncer
LKB1S428 parece estar constitutivamente fosforilada en líneas celulares humanas de melanoma
que presentan la mutación activante en BRAFV600E, en los tumores murinos que tienen
desregulado la actividad del receptor tirosina cinasa o con un aumento de la señalización
mitogénica, y también, en los tumores humanos de mama HER-2 positivos (amplificaciones en
HER-2) y en carcinomas endometriales de fases avanzadas. En color vías de señalización o moléculas activas, sin color vías de señalización o moléculas
inactivas.
118
Esta desregulación en la señalización de LKB1 en melanoma se correlaciona con
el hallazgo descrito por Rowan y sus colaboradores en 1999, que establece que
el 12% de las muestras de melanoma analizadas muestran mutaciones somáticas
en LKB1, sugiriendo que LKB1 contribuye en la tumorogénesis en una pequeña
fracción (12%) de melanomas malignos61.
En los últimos 5 años, se ha incrementado de manera significativa el
conocimiento en las funciones biológicas de LKB1, como el metabolismo
energético223,144, polaridad celular, división celular224,223 y regulación
transcripcional223.
Una de les cuestiones fundamentales en la biología tumoral que permanecen sin
contestar es cómo las células tumorales adquieren resistencia al estrés
energético. En relación a esta cuestión, nuestros resultados demuestran que
las líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E y NRASQ61R poseen una
limitada sensibilidad en respuesta a condiciones de baja energía, indicada
por un inexistente aumento de los niveles de p-AMPKαT172 que señala la no
activación de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-TSC2, junto con una
insignificante bajada de los niveles de fosforilación de la proteína
ribosomal S6 (p-S6R) que señala un claro mantenimiento de la activación de la
señalización de mTORC1 (Figura 3D). De manera que los resultados también
indican que la activación de la vía de RAS, frecuentemente alterada en
melanoma debido a mutaciones activantes en BRAFV600E, es responsable de la
activación de mTORC1, implicando a mTORC1 como un nuevo efector de la vía de
RAS. En este sentido, el trabajo de Karbowniczek y sus colaboradores
demuestra que no es sorprendente encontrar la vía de mTORC1 activa en células
de melanoma181, hechos que correlacionan con nuestros hallazgos (Fig.2D).
Así, nuestros datos están apoyados por evidencias bioquímicas que demuestran
que la inactivación de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1
conduce a la proliferación celular y crecimiento celular principalmente por
la activación de la señalización de mTORC1. De manera relevante, nuestros
datos muestran que la activación de la vía de RAS mediante factores de
crecimiento o mutaciones activantes en los componentes de la vía, promueve la
disociación del complejo LKB1-AMPKα, disociación que impide así la posible
fosforilación de AMPKαT172 por parte de LKB1, y por consiguiente la
inactivación de la vía de LKB1/AMPK en respuesta a estrés energético225
(Fig.3D).
119
Figura 3D/ Modelo de regulación negativa de la actividad de la vía de
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 mediado por la señalización oncogénica de BRAFV600E o NRASQ61R
Modelo de resistencia al estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 debido al efecto
oncogénico de BRAFV600E o NRASQ61R. La actividad oncogénica de BRAFV600E/NRASQ61R regula
negativamente la vía de estrés metabólico en células de melanoma con ambos genotipos
mutantes (BRAFV600E o NRASQ61R). El mecanismo bioquímico de desconexión de la vía de estrés
metabólico es a través del desacoplamiento de los complejos LKB1-AMPKα, protegiendo a la
célula frente apoptosis por la actividad oncogénica y por la incapacidad de activación de
AMPK a estrés energético. En color vías de señalización o moléculas activas, sin color vías de señalización o moléculas
inactivas.
Estos resultados implicaban la existencia de un mecanismo bioquímico que
condicionase la activación de la vía de señalización LKB1/AMPK en respuesta a
estrés metabólico. De acuerdo al mecanismo, la inhibición de la señalización
de la vía de RAS mediante el uso de inhibidores específicos de MEK1/2, RAF o
el uso de siRNA contra BRAF en condiciones de estrés energético permite la
120
restitución de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 conduciendo a un incremento de
los niveles de p-AMPKαT172 (Fig.1D).
Así, en relación a la resistencia al estrés energético y la sostenida
activación de mTORC1 observada en las células de melanoma mutantes en
BRAFV600E, mostramos que las moléculas de LKB1 se encuentran disociadas de
AMPKα de manera constitutiva debido a la actividad oncogénica de BRAFV600E,
incluso aunque las células se sometan bajo condiciones de estrés energético,
LKB1 se encuentra desacoplado de AMPKα (Fig.3D). Sin embargo, las células de
melanoma mutantes en BRAFV600E tras la inhibición del efecto oncogénico de
BRAFV600E en respuesta a estrés energético presentan un aumento significativo
de moléculas de AMPKα unidas a LKB1, y una respuesta clara a estrés
energético indicado por los altos niveles de p-AMPKαT172 (225).
Hasta la fecha la conexión entre la señalización de RAS y LKB1 ha estado
limitada por la fosforilación de LKB1S428 a través de p90RSK, donde la
participación del residuo Ser 428 de LKB1 en la inhibición del crecimiento,
polaridad celular y la activación de las cinasas por debajo de LKB1 (AMPK,
BRSK1/2 y entre otras) es controvertida226,163,227,228,229.
Nuestros resultados con los mutantes para el residuo Ser 428 de LKB1 y los
mutantes con deleciones en el extremo C-terminal de LKB1 (región donde se
localiza la Ser428) contemplan la participación de este residuo (LKB1S428) en
la disociación de los complejos de LKB1-AMPKα mediada por factores de
crecimiento aunque los resultados no son concluyentes, y se requiere una
mayor búsqueda para elucidar la completa función de este residuo. Así, estos
datos indican que la modulación de LKB1S428 no es suficiente para mediar el
efecto observado de disociación de los complejos de LKB1-AMPKα, sugiriendo la
existencia de mecanismos bioquímicos adicionales por ERK1/2 que podrían
justificar la disociacion de los complejos a través de la señalización de RAS
(Fig.3D). De hecho simultáneamente a la publicación de nuestros resultados,
Zheng y sus colaboradores, demostraron que la fosforilación de LKB1 en la Ser
325 mediada por ERK1/2 y en la Ser 428 mediada por p90RSK es crítica para la
regulación de la activación de AMPK por LKB1, donde la mutación de la Ser 325
y de la Ser 428 de LKB1 por una alanina promueve la asociación de LKB1-
AMPKα230.
Otra posible interpretación de nuestros resultados, además de conferir
resistencia al estrés metabólico, podría ser que en respuesta a un estímulo
mitogénico la disociación de los complejos LKB1-AMPKα permitiera la anulación
de posibles mecanismos que pudieran interferir con la síntesis proteica
mediada por mTORC1. De esa manera, la activación de la señalización de
121
RAS/RAF/MEK/ERK coordinaría los mecanismos bioquímicos de crecimiento celular
y de división celular para asegurar la proliferación celular. Así, la
desregulación del eje LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 debido a la disociación de
los complejos de LKB1-AMPKα en células con mutaciones activantes en la vía de
RAS supondría una clara ventaja en la proliferación celular y un aumento
significativo de la restistencia a condiciones de estrés energético celular.
Este mecanismo adquiere especial relevancia si se tiene en cuenta que en
respuesta a señales mitogénicas todas las células «normales» aseguran la
proliferación celular únicamente cuando los nutrientes son abundantes para
garantizar una exitosa división y crecimiento celular (Fig.2D).
Se sabe que la activación de AMPKα por LKB1 en condiciones de estrés
energético estimula la captación de glucosa y la oxidación de ácidos grasos
para aumentar la producción de ATP, e inhibe la síntesis proteica y protege a
las células frente la apoptosis144. Sorprendentemente, la inhibición de la
señalización de RAS/ERK en líneas celulares de melanoma mutantes en BRAF
sujetas a un estrés metabólico desencadena un aumento del número de células
muertas (Fig.1D). De manera relevante, nuestros experimentos de
silenciamiento de AMPKα (knock down de AMPKα1 y AMPKα2) sugieren una relación
causal con la inhibición de la señalización oncogénica de BRAF. De manera que
el efecto del siRNA de AMPKα no permite la activación de la vía de estrés
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 ni la activación de la vía apoptótica mediada por AMPK en
condiciones de estrés energético mediante una baja concentración de glucosa.
Sin embargo, la presencia de AMPKα (siRNA control) en condiciones de estrés
metabólico tras la inhibición de la señalización de RAS, permite la
restitución de la vía de señalización de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2 y tiene como resultado la muerte celular inducida por AMPK y por la
pérdida del efecto oncogénico de BRAF129,213. Hecho que acorde con Inoki y sus
colaboradores231, existen evidencias genéticas y bioquímicas que indican que la
inactivación de la vía de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 conduce a la proliferación y
crecimiento celular principalmente por la activación de la señalización de
mTORC1.
En relación a esta interconexión entre la señalización oncogénica BRAF y la
señalización de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2, se ha descrito que la
activación de la señalización de AMPK por la administración de metformin,
phenformin o A-769662 en ratones PTEN+/- permite una reducción tumoral
significativa, demostrando que LKB1 se requiere como activador de AMPK para
inhibir la señalización de mTORC1, teniendo como resultado la inhibición del
crecimiento celular en células deficientes en PTEN232. También, y en
concordancia a estos resultados, la activación farmacológica de AMPK resulta
122
ser citotóxica en muchas células tumorales in vitro233,234 y en modelos murinos
xenógrafos, in vivo233,232,220.
Además, metformina como fármaco que induce estrés energético a través de la
activación de AMPK, se relacionó curiosamente en cáncer en el año 2005 por
Evans y sus colaboradores, donde indicaron que metformina podría ser un
tratamiento beneficioso en la prevención de ciertos tipos de cáncer, ya que
el uso de metformina en pacientes con Diabetes de Tipo 2 redujo el riesgo de
cáncer235. En estos últimos 5 años, se encuentran estudios que indican
metformina como una nueva opción en el tratamiento del tumor, donde
metformina activa AMPK en células tumorales, teniendo así una actividad
antitumoral en distintos tipos de cáncer, como en cáncer de mama220,236, 237,
colon238,239, endometrio240, próstata233,241, glioma242 y melanoma243. De modo que
recientemente estudios epidemiológicos evidencian que metformina es
responsable de reducir el riesgo de cáncer244 y actúa como agente que ejerce
efectos antitumorales promoviendo una respuesta celular a estrés metabólico.
Cabe resaltar que en nuestro modelo, el aumento del índice de apoptosis no
correlaciona con la estabilización de p53, indicando que este mecanismo
apoptótico es independiente de p53 y que la señalización oncogénica de
BRAFV600E podría estar participando en la estabilización de p53. Estos
resultados correlacionan con la estabilización de p53 mediada por ERK1/2 bajo
condiciones de estrés genotóxico245,246.
En relación al mecanismo molecular involucrado en la respuesta apoptótica,
publicaciones recientes muestran que el oncogén BRAF puede suprimir apoptosis
a través de las proteínas diana de la subfamilia BH3 como son las proteínas
proapoptóticas BAD y BIM129,213. Los resultados que presentamos indican que la
inhibición de la señalización oncogénica de BRAFV600E a las 12 horas promueve
una leve defosforilación de BAD y una estabilización de BIMEL, probablemente
debido a la inhibición de la fosforilación de BAD dependiente de ERK1/2 y la
inhibición de la degradación de BIM mediada por el proteasoma247. La
restauración de la señalización de LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1 bajo estrés
energético mediante la inhibición de la señalización de BRAF promueve un
efecto más pronunciado que incluye una mayor defosforilación de BAD, un
acúmulo de la forma BIMEL, y una drástica inhibición en la expresión de la
proteína antiapoptótica MCL-1225 (Fig.1D). Esta disminución en los niveles de
expresión de la proteína MCL-1 podría tener especial relevancia en nuestro
modelo, dado que se conoce que MCL-1 es una proteína antiapoptótica
importante en melanoma248,249.
123
En conjunto, este mecanismo revela una posible forma de intervención
terapéutica que promovería una mayor apoptosis en células tumorales frente a
las terapias actuales existentes. Esta estrategia consistiría en la
combinación de la inhibición de la vía de RAS/ERK y la activación de la vía
de estrés energético celular LKB1/AMPK/TSC1-TSC2/mTORC1. De manera que este
tratamiento podría ser particularmente relevante en tumores que tienen una
desregulación de la vía de RAS.
Los resultados presentados, indican que las distintas líneas celulares de
melanoma con ambos genotipos mutantes (NRAS o BRAF), así como en líneas
celulares de melanoma metastáticas derivadas de pacientes, muestran cierta
sensibilidad al monotratamiento de los fármacos activadores de AMPK
(metformina/phenformin), y una citoxicidad selectiva al monotratamiento con
el inhibidor sorafenib, datos que coinciden con la decepcionante respuesta
del sorafenib en pacientes con melanoma cutáneo metastático debido a su
inaceptable toxicidad250. No obstante, el tratamiento que combina sorafenib
junto con metformina, induce una mayor citotoxicidad respecto el
monotratamiento con metformina/phenformin o sorafenib en las líneas celulares
con ambos genotipos mutantes (BRAFV600E o NRASQ61R) y en las de melanoma
metastático que derivan de pacientes con mutaciones en NRASQ61K. Es interesante
señalar también que la restauración de la vía de estrés metabólico
LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 y la citotoxicidad observada con el tratamiento que
combina la metformina junto con el inhibidor específico de MEK1/2 o RAF, fue
más débil que la observada en condiciones de baja concentración de glucosa e
inhibición de la vía de RAS.
Aunque se necesita una investigación preclínica in vivo más profunda en el
uso de esta combinación farmacológica propuesta, estos datos sugieren que el
uso de fármacos dirigidos a modificar la respuesta metabólica junto con
moléculas inhibidoras de la vía de RAS podría ser particularmente eficaz en
células tumorales con alteraciones genéticas activantes de esta vía.
Así, nuestros resultados revelan que la reactivación del metabolismo «normal»
en el tumor podría resensibilizar a las células tumorales, y ser finalmente
más favorables a otras intervenciones o combinaciones terapéuticas.
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El HGF induce la fosforilación de LKB1S428 de manera dependiente de la vía de
señalización RAS/RAF/MEK/ERK/p90RSK
LKB1S428 se fosforila en respuesta a diferentes factores de crecimiento y se
encuentra constitutivamente fosforilada en líneas celulares de melanoma y en
muestras tumorales con señalización aberrante en la vía de RAS incluídos los
tumores mutantes en BRAFV600E
Las células de melanoma mutantes en BRAFV600E son resistentes al estrés
metabólico inducido por bajas concentraciones de glucosa
La activación de la vía de RAS por factores de crecimiento o por mutaciones
activantes en componentes de esta vía (BRAFV600E o NRASQ61R) induce el
desacoplamiento del complejo LKB1-AMPKα
La resistencia al estrés energético inducido por el efecto oncogénico de
BRAFV600E está mediado por la disociación del complejo LKB1-AMPKα y la
desconexión de la vía de estrés metabólico celular
La restauración de la vía de estrés metabólico LKB1/AMPK/TSC1-TSC2 en ambos
genotipos mutantes en BRAFV600E y NRASQ61R por la inhibición de la vía de RAS/ERK
en condiciones de estrés energético induce apoptosis a través de los miembros
de la subfamilia BH3
La combinación de activadores de AMPK junto con la inhibición del efecto
oncogénico de RAS o RAF induce citotoxicidad en células de melanoma mutantes
en BRAFV600E y NRASQ61R, y en células metastáticas de melanoma mutantes en NRASQ61K
derivadas de pacientes
Estos resultados sugieren el establecimiento de una nueva terapia con
potencial clínico para todos los cánceres con un metabolismo aberrante
tumoral, que permite la reactivación del metabolismo «normal» a través de la
combinación de la inhibición de las vías de señalización adictivas en el
tumor, y de la activación de la vía de estrés energético LKB1/AMPK/TSC1-
TSC2/mTORC1
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Plásmidos
Algunos de los plásmidos utilizados en el presente trabajo fueron cedidos por
distintos investigadores mencionados en el siguiente párrafo; el resto fueron
generados siguiendo distintos pasos experimentales detalladamente descritos
en el subapartado de Plásmidos bajo el nombre de Generación de plásmidos.
Los vectores de expresión en mamíferos de la proteína LKB1 salvaje (wild
type, wt) y sus mutantes, denominados pCMV5-Flag-LKB1wt, pCMV5-Flag-LKB1KD,
pCMV5-Flag-LKB1S431A y pCMV5-Flag-LKB1S431D, fueron cedidos por Dario R. Alessi
(Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, College of Life
Sciences, University of Dundee). El vector de expresión en mamíferos pEBG-2T-
GST-AMPKα fue obtenido por Jose Miguel Lizcano de Vega (Universitat Autònoma
de Barcelona). El vector de expresión en mamíferos retroviral pLPCX-myc-
BRAFV600E fue generado en el laboratorio por Carlos de Torre Minguela (Institut
de Recerca Hospital Universitari Vall d'Hebron).
Generación de plásmidos
Los distintos plásmidos fueron generados mediante el clonaje del gen de
interés en su vector correspondiente siguiendo los siguientes pasos básicos:
el diseño de los cebadores para la amplificación del gen de interés, la
amplificación del gen de interés mediante la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR), la digestión del producto de amplificación por PCR y del
vector de expresión de interés con las enzimas de restricción óptimas para
permitir el clonaje, la purificación de las distintas digestiones para la
ligación del gen de interés o inserto con el vector de expresión, la
transformación de la reacción de ligación en células bacterianas competentes,
la identificación de las colonias bacterianas que contengan el vector de
expresión para el gen de interés, y finalmente, verificación por
secuenciación de la nueva construcción plasmídica.
Diseño de los cebadores
El diseño óptimo de los cebadores permite la amplificación del gen diana, y
la inserción del gen diana al vector de expresión. De este modo, los
cebadores se encuentran sujetos a las características del vector de expresión
y del gen que se desea clonar. Para cada una de las construcciones generadas
corresponden unos cebadores que se encuentran referenciados en la Tabla 2A
(Anexo), donde se detalla la secuencia de los cebadores específicos
diseñados.
Así, para el diseño de los cebadores se tubieron en cuenta las
características del vector y del inserto, siendo determinantes el sitio de
multi clonaje (multicloning site, MCS) del vector de expresión, región del
vector donde se encuentran las distintas secuencias diana de las enzimas de
restricción que permiten la inserción del gen que se desea expresar; y las
133
dianas de restricción que se encuentran en el ácido desoxiribonucleico
complementario (ADNc) del gen. Los cebadores diseñados se flanquearon con las
dianas de restricción elegidas en el extremo 5' (5') y en el extremo 3' (3')
para permitir el clonaje del gen en el vector. Concretamente, los cebadores
consistieron en: un cebador con sentido 5' a 3' (denominado Forward o sense)
que contiene 4 nucleótidos (GCCC) en el extremo 5' de la secuencia diana de
restricción elegida para asegurar el correcto corte de la enzima de
restricción, seguido de la secuencia kozac (CCACCATG), secuencia consenso
donde tiene lugar la iniciación para la traducción proteica, y finalmente,
siguieron 18 nucleótidos dentro de la secuencia codificante (CDS) del gen de
interés; y un cebador con sentido 3' a 5' (denominado Reverse o antisense)
que contiene 18 nucleótidos del extremo carboxi terminal de la CDS del gen,
seguido de la diana de restricción elegida, y finalmente, la adición de 4
nucleótidos para la correcta digestión de la enzima de restricción. En el
caso de generar deleciones en el extremo carboxi terminal de la proteína se
sustituyó el último aminoácido por un codón de terminación (denominado STOP).
Amplificación del gen de interés
La obtención de la secuencia diana se realizó mediante la PCR de los
fragmentos del ADNc del gen de interés. De esta manera, para la PCR se
requirieron los siguientes reactivos: 10 ng del ADN molde, 2 % de DMSO, 1X de
tampón de la polimerasa de alta fidelidad, 250 µM de dNTPs para la
amplificación de un fragmento con un tamaño menor de 10 Kb, 0,25 µM del
cebador Forward y 0,25 µM del cebador Reverse, 2,5 unidades por reacción de
PfU Ultra II fusion HS DNA polymerase (2,5U/µl) (Stratagene) y agua
destilada y desionizada autoclavada (ddH2O, distilled and deionized water)
hasta un volumen total de 50µl. La PCR para la amplificación de los
fragmentos con cebadores de temperatura media de fusión (Tm) entre 80-90ºC
tubieron las siguientes características para los parámetros de temperatura y
de ciclos: 5 minutos a 95ºC para la desnaturalización de las cadenas de ADN;
8 ciclos con un gradiente creciente de temperatura de 1ºC por ciclo que
consistió en: 1 minuto a 95ºC, 45 segundos a 60ºC (temperatura de
alineamiento, temperatura por debajo de la Tm) que en cada ciclo aumentó 1ºC
por ciclo, 3 minutos a 68ºC para la extensión del fragmento (tiempo para la
elongación de 1,5Kb); seguidos de 20 ciclos para la obtención de un elevado
número de copias del ADN diana: 1 minuto a 95ºC, 45 segundos a 68ºC, 3
minutos a 68ºC, y seguidamente, después de los 20 ciclos se realizó un paso
de 10 minutos a 68ºC para terminar la elongación de los posibles fragmentos
que hayan quedado sintetizados parcialmente, y finalmente la reacción puede
permanecer a 4ºC. Así, los parámetros de temperatura, tiempo y número de
ciclos para la amplificación del ADN diana fueron introducidos en un
termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) diseñado
134
específicamente para la amplificación de ácidos nucleicos con una elevada
especificidad, sensibilidad y rapidez.
Para validar el producto amplificado por PCR, una pequeña parte de la
reacción se testó en un gel de agarosa al 1 % y teñido con bromuro de etidio,
donde se comprobó el tamaño del producto de PCR en un transiluminador de
radiación ultravioleta.
Purificación del producto de la PCR y de la digestión enzimática
Los productos de la PCR, así como los fragmentos purificados de las
diferentes digestiones se purificaron mediante el kit QIAquick Gel Extraction
kit (QIAGEN) que permitió la extracción del ADN de 70 pb hasta 10 Kb de un
gel de agarosa, pudiendo procesar hasta 400 mg de agarosa en una columna.
Este proceso de extracción consiste en la purificación de fragmentos de ADN
que proceden de reacciones enzimáticas de un gel de agarosa, mediante la
selección de la banda del gel de agarosa que contiene el producto de la PCR
de interés soluble. Se realizó el proceso experimental indicado por el kit
QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Seguidamente, el vector de interés y el
inserto purificado fueron digeridos mediante una digestión doble enzimática
durante 4 horas con las enzimas de restricción adecuadas a una temperatura
óptima determinada por la enzima de restricción. Tras ser digeridas fueron
purificadas mediante la extracción del ADN del gel de agarosa para maximizar
la eficiencia de los procesos de defosforilación y de ligación.
Defosforilación
En el caso de obtener extremos romos en la digestión del vector, se realizó
la defosforilación del vector para evitar la recircularización del vector, y
así mejorar la eficiencia de ligación con el inserto. El proceso de
defosforilación se realizó mediante la enzima alkaline phosphatase, shrimp
(Roche), que cataliza la defosforilación de los extremos 5' fosfato del ADN y
del ácido ribonucleico (ARN). La reacción de defosforilación consistió con el
tampón 1X de defosforilación, 1 unidad de la enzima fosfatasa, y el vector de
interés (en el caso de obtener extremos romos en el vector e inserto, ambos
se defosforilan), y ddH2O hasta un volumen final de 50 µl, que se incubó
durante un mínimo de 10 minutos a una temperatura de 37ºC. A continuación, se
purificó el ADN mediante el kit QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), y se
procedió a la ligación.
Ligación
La ligación consiste en que la enzima ligasa, denominada T4DNA ligase
(Invitrogen), cataliza la formación de enlaces fosfodiéster con la presencia
de ATP entre las cadenas dobles de ADN con extremos 3' hidroxi y 5' fosfato.
Los reactivos para la ligación fueron el tampón para la enzima ligasa, 1
unidad de la ligasa, y una relación 1:1 y 1:3 del vector e inserto
respectivamente, teniendo en cuenta en esta relación el tamaño de los
135
distintos fragmentos, y finalmente, en cada muestra se adicionó ddH2O hasta un
volumen final de 10 µl. Reacciones que se incubaron durante toda la noche a
16ºC.
Transformación bacteriana
Posteriormente, se transformaron las E.coli JM110 competentes o DH5α de
E.coli competentes por choque térmico a 42ºC con las distintas reacciones de
ligación.
La cepa E.coli JM110 es deficiente para dos metilasas, Dam y Dcm. De este
modo, el ADN plasmídico puede ser digerido por las enzimas de restricción
sensibles a la metilación, ya que las secuencias diana GATC, y CCAGG y CCTGG
no se encuentran metiladas por la enzima Dam y Dcm, respectivamente.
La cepa DH5α de E.coli competente es rec A1 y end A1 mutantes que aumenta la
estabilidad del inserto y mejora la calidad del ADN plasmídico en las
minipreps y maxipreps, y además es productora de un elevado número de copias
de ADN plasmídico.
Para testar las distintas colonias que han sido transformadas con el ADN
plasmídico procedente de la ligación, se realizó simultáneamente el test de
las distintas colonias mediante la PCR. Test que se realizó mediante la
amplificación de un fragmento del inserto de interés de la nueva
construcción, y además la inoculación de una miniprep de cada una de las
colonias testadas por PCR para poder evaluar el patrón de bandas por
digestión enzimática del nuevo plásmido generado. Finalmente, la colonia que
presentó una banda correspondiente a la amplificación del fragmento de
interés y un patrón de bandas por digestión correcto fue seleccionada para
realizar una maxiprep, y así, obtener un elevado número de copias del nuevo
ADN plasmídico.
Maxipreps
Para la purificación de plásmidos de elevada copia se utilizó NucleoBond
Xtra plasmid purification (Maxi) (MACHEREY-NAGEL), que consistió en la
inoculación de una única colonia E.coli DH5α transformante con el plásmido de
interés en 6 ml de medio Terrific Broth (TB) con sales y con el antibiótico
de resistencia correspondiente (gen de resistencia al antibiótico que
contiene el plásmido). Seguidamente, el inóculo se incubó durante 8 horas a
37ºC, y posteriormente se diluyó el pre-inóculo en 300 ml de medio TB con
sales y con el antibiótico correspondiente que se incubó a 37ºC durante 12-16
horas. Tras la obtención del cultivo de bacterias, que ha producido un número
elevado de copias de ADN plasmídico, se procedió a los pasos indicados por el
NucleoBond Xtra plasmid purification (Maxi). Finalmente, se reconstituyó el
ADN plasmídico con 500 µl de ddH2O y se cuantificó mediante el equipo
NanoDropTM (Thermo Scientific).
136
Secuenciación del gen de interés clonado en el vector correspondiente
Finalmente, la nueva construcción plasmídica se verificó por secuenciación.
De este modo, para descartar posibles mutaciones introducidas por la enzima
ADN polimerasa en el proceso de amplificación del gen de interés, y para
testar el correcto clonaje del gen en el vector de expresión, se realizó la
secuenciación del gen para verificar la autenticidad de la nueva construcción
plasmídica.
El proceso de secuenciación se realizó mediante el kit BigDye Terminator v1.1
Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems), requiriendo para la reacción de
secuenciación entre 500-1000 ng de ADN plasmídico en un volumen final de
2,8µl en ddH2O, 1,25 µM de cebador específico (pudiendo ser un cebador
universal, que hibrida con el vector plásmidico como M13 Forward, M13
Reverse, T3, T7..., o un cebador para el gen de interés), y 2µl de BigDye
Terminator v.1.1. La reacción de secuenciación tubo las siguientes
características para los parámetros de temperatura, tiempos y ciclos: 95ºC
durante 2 minutos; 30 ciclos a 95ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5
segundos y 60ºC durante 4 minutos; y finalmente 4ºC hasta el infinito.
En la Tabla 3A se encuentra el listado de los plásmidos generados y sus
características.
Generación de plásmidos mutantes
Los plásmidos con mutaciones puntuales en un aminoácido de interés, como son
pLPCX-LKB1S431A, pLPCX-GST-Flag-LKB1S431A, pLNCX2-LKB1S431A, pLPCX-GST-Flag-LKB1S325A,
pLPCX-GST-Flag-LKB1S325A S431A, referenciados en la Tabla 3A, se generaron
mediante el QuikChange II site-directed mutagenesis kit (Stratagene). Es un
método que permite la mutación dirigida in vitro a partir de un plásmido de
doble cadena de ADN, y elimina la necesidad del subclonaje. Los pasos básicos
son: el diseño de los cebadores que contienen la mutación deseada (Tabla 2A),
la síntesis del plásmido mutante, la digestión del ADN molde, y la
transformación del ADN de nueva síntesis con la mutación de interés.
La síntesis del plásmido mutante se realizó mediante un termociclador donde
se realizó la desnaturalización del ADN molde, la hibridación de los
cebadores que contienen la mutación del gen de interés con el ADN molde de
doble cadena, y la extensión desde los cebadores con la enzima polimerasa de
ADN de alta fidelidad. A continuación, se realizó la digestión del ADN molde
mediante la enzima endonucleasa DpnI, responsable de la digestión de los
sitios metilados de secuencia 5'-GmATC-3' que contiene la cadena de ADN
molde, ya que ha sido metilada por la bacteria transformante E.coli. De este
modo, se puede discriminar las nuevas cadenas de ADN sintetizadas que
contienen la mutación, de las cadenas de ADN molde. Y finalmente, se realizó
137
la transformación del ADN de nueva síntesis mutante en células competentes
DH5α E.coli.
Para la síntesis del ADN mutante se requirió los siguientes reactivos para la
reacción de mutagénesis: 10 ng del ADN molde (pLPCX-GST-Flag-LKB1WT), 1 µl de
DMSO al 100%, 5 µl de tampón de reacción 10x (reaction buffer del kit), 1 µl
de dNTP mix del Kit para la amplificación de un plásmido de 7,8 kb, 125 ng
del cebador Forward y 125 ng del cebador Reverse, 1 µl de PfU Ultra HF DNA
polymerase (2,5 U/µl) (Stratagene) y ddH2O autoclavada hasta un volumen total
de 50 µl. La síntesis de la nueva cadena ADN plasmídico mutante se realizó
utilizando los siguientes parámetros de temperatura y de ciclos: 5 minutos a
95ºC para la desnaturalización de las cadenas de ADN; 8 ciclos con un
gradiente creciente de temperatura de 1ºC por ciclo: 1 minuto a 95ºC, 45
segundos a 60ºC (temperatura de alineamiento, temperatura por debajo de la
Tm) que en cada ciclo aumentó 1ºC por ciclo, 14 minutos a 68ºC para la
extensión del ADN plasmídico; y 8 ciclos para la obtención de un número de
copias del ADN diana con el cambio de aminoácido adecuado, 1 minuto a 95ºC,
45 segundos a 68ºC, 14 minutos a 68ºC, seguidamente, después de los 20 ciclos
se realizó un paso de 10 minutos a 68ºC, para terminar la elongación de los
posibles fragmentos que hayan quedado sintetizados parcialmente, y
finalmente, la reacción puede permanecer a 4ºC. Así, los parámetros de
temperatura, tiempo y número de ciclos para la amplificación del ADN diana
fueron introducidos en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied
Biosystems).
Para validar el producto sintetizado, se testó una pequeña parte de la
reacción mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y teñido con
bromuro de etidio. Y en caso de visualizar la banda adecuada se procedió a la
digestión durante 1 hora a 37ºC con la endonucleasa DpnI, para la degradación
del ADN molde que no contiene la mutación de interés, y la transformación del
ADN plasmídico de nueva síntesis con la mutación de interés en E.coli
competentes.
Generación de los plásmidos shRNA
Justamente, el estudio del silenciamiento génico del Lkb1 a través del small
hairpin ribonucleic acid o shRNA se desarrolló mediante el sistema de
expresión bajo el promotor H1 de la polimerasa del ARN de tipo III que
permite la transfección celular, y el sistema de expresión viral retroviral
que permite la integración estable celular. Concretamente, el proceso
consistió en la generación del siRNA (small interfering ribonucleic acid)
contra el gen Lkb1, la expresión de la pequeña horquilla, el clonaje en el
vector pSuper, y seguidamente el clonaje al pRetrosuper. Para el óptimo
silenciamiento del gen se diseñó los cebadores del ARN de interferencia
138
(ARNi, interference RNA o RNAi) del Lkb1 a partir de la página de Ambion THE
RNA COMPANY www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html, que nos permitió
buscar la secuencia diana óptima para el silenciamiento génico de Lkb1. Se
utilizó la CDS del ARN mensajero (ARNm) de Lkb1 para encontrar las distintas
secuencias dianas óptimas para el silenciamiento génico. Seguidamente,
mediante un BLAST de las secuencias obtenidas se comprovó la especificidad de
éstas, y de esa manera, se eligió la secuencia que sería específica para el
silenciamiento del gen de estudio y no para otros posibles genes de la misma
especie, y así, evitar una posible inespecificidad de la supresión del gen
que se estudia. Una vez se seleccionó el siRNA de Lkb1 óptimo, se utilizó
como herramienta de diseño y de cálculo el cebador del shRNA de Lkb1 a través
de Ambion THE RNA COMPANY, sitio web
www.ambion.com/techlib/misc/psilencer_converter.html, con la entrada correcta
del shRNA (small hairpin ribonucleic acid) de secuencia CTCAAGAGA,
responsable de formar la pequeña horquilla, y finalmente, se eligió el vector
de clonaje pSuper. En este caso para el clonaje del siRNA al pSuper, se
flanqueó el shRNA de Lkb1 con las dianas de restricción BamHI (5') y HindIII
(3') para el clonaje con BglII (compatible con BamHI) y HindIII al vector
pSuper. La secuencia de los oligonucleótidos Top strand y Bottom strand se
encuentran en la tabla anexada (Tabla 2A).
Tras la purificación de los oligonucleótidos, se generaron las horquillas
pequeñas del RNAi mediante el alineamiento de los oligonucleótidos, y se
fosforiló los oligonucleótidos para conseguir las condiciones óptimas para el
subclonaje con el vector pSuper. Posteriormente, a partir del pSuper-iARN-
Lkb1 se realizó el clonaje del inserto con el promotor H1 seguido del siRNA
de Lkb1 al vector pRetrosuper donde se utilizó las dianas de restricción
BglII para pRetrosuper (5') /BamHI para pSuper (5') y XhoI (3') para ambas
construcciones.
Cultivos celulares
Líneas celulares
Las líneas celulares murinas de melanoma utilizadas fueron las B16-F1, 37-31
E1A y 37-31 T2 que se mantuvieron con el medio DMEM suplementado con 4,5 g/l
de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO),
y los antibióticos estreptomicina y penicilina a una concentración final de
100 µg/ml, y para las líneas celulares 37-31 E1A se adicionó 0,005 µg/ml del
factor de crecimiento epidérmico o EGF (Invitrogen), y 4 µg/ml insulina
recombinante humana (GIBCO). Las líneas celulares humanas de melanoma UACC
1097, UACC 2973, UACC 903, Melan-a, Melan BRAFV600E y Melan Hras se cultivaron
con el medio RPMI 1640 con 25 mM d'HEPES y L-glutamina (GIBCO), al 10 % de
139
FBS, 100 µg/ml estreptomicina y penicilina; la línea celular A375 fue
cultivada con el medio DMEM suplementado con 4,5 g/l de glucosa y L-glutamina
(ATCC), al 10 % de FBS, y 100 µg/ml estreptomicina y penicilina; las líneas
celulares humanas de melanoma MeWo y SkMel28 fueron cultivadas con el medio
especial Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC), el 10 % de FBS, y 100 µg/ml
estreptomicina y penicilina. Las líneas celulares humanas de melanoma A375,
SkMel103 y SkMel147 se mantuvieron con el medio DMEM suplementado con 4,5 g/l
de glucosa y L-glutamina (ATCC), el 10 % de FBS, y 100 µg/ml estreptomicina y
penicilina. Las líneas celulares humanas de melanoma derivadas de pacientes
MSKM8, MMLN9 y MMLN10 se mantuvieron con el medio DMEM suplementado con 4,5
g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), el 20 % de FBS, y 100 µg/ml
estreptomicina y penicilina. Las líneas embrionarias de riñón humano HEK293T
y HEK293GP, y la línea celular de adenocarcinoma de cérvix humana HeLa
(Henrietta Lacks) se mantuvieron con el medio DMEM suplementado con 4,5 g/l
de glucosa y L-glutamina (ATCC), el 10 % de FBS, y 100 µg/ml estreptomicina y
penicilina.
Todas las líneas celulares permanecieron bajo las condiciones de 37ºC y al 5
% de CO2.
En el anexo (Tabla 4A), se encuentra una tabla resumen de las distintas
líneas celulares utilizadas donde se especifica las características del medio
de crecimiento, y de las condiciones de transfección.
Congelación
La congelación de células permite reducir el riesgo de cambios genéticos y
morfológicos de la línea celular, trabajar con el número de pase óptimo de la
línea celular, reducir el riesgo de contaminaciones por hongos, bacterias u
otros, y además almacenar la línea celular durante unos meses a una
temperatura de -80ºC mediante un congelador eléctrico o de -195,8ºC mediante
nitrógeno en fase líquida. La crioprotección es clave en la congelación de
líneas celulares eucariotas, proceso que se realiza mediante un
crioprotector, como el Dimetilo Sulfóxido (Dimethyl Sulfoxide, DMSO).
Para el proceso de congelación, aproximadamente 2·106 de células se
centrifugaron a 1000g durante 5 minutos, y se resuspendieron en 1 ml de FBS
al 10 % de DMSO, se almacenaron en un tubo crioprotector de 1 ml (Nunc), e
inmediatamente se depositaron en un contenedor de congelación, denominado
«Mr. Frosty», Cryo 1ºC Freezing Container (NALGNE LABWARE), y se trasladó en
un congelador eléctrico a -80ºC durante 8 horas.
Tripsinización
La mayoría de las células crecen formando una monocapa de células y se
adhieren en la superficie de la placa, estableciendo distintas adhesiones o
140
conexiones entre célula y sustrato o superficie de la placa, y uniones
intracelulares. El proceso de tripsinización es un proceso de disociación
celular mediante una enzima proteolítica, como por ejemplo la tripsina. La
tripsina es una enzima que permite la disociación de las uniones que se
establecen entre células, y la obtención de células individualizadas en
suspensión, siendo la tripsinización un proceso de digestión proteica.
El proceso de tripsinización consistió en los siguientes pasos, las células
previamente a la tripsinización fueron lavadas con PBS estéril,
posteriormente se añadió tripsina a las células, 0,5 % Trypsin-EDTA 1X
(GIBCO), durante un máximo de 3-5 minutos a 37ºC, siendo un tiempo crucial,
ya que exceder este periodo de incubación puede dañar seriamente a las
proteínas intracelulares. Tras la tripsinización, se diluyó la tripsina que
contiene las células individualizadas en suspensión con el medio completo
(que contiene FBS), y se recuperaron y se centrifugaron a 1000 g durante 5
minutos, y seguidamente, se resuspendieron con medio completo nuevo y se
realizaron las diluciones correspondientes en función de la línea celular
para una siembra óptima.
Muestras tumorales
Las muestras de tumores melanocíticos malignos murinos fueron cedidas por el
Laboratory of Cancer Biology and Genetics dirigido por Glenn Merlino (NCI,
Bethesda). Concretamente, 7 muestras de tumores espontáneos procedentes de
ratones transgénicos para el HGF e inducidos por radiación UV, y 2 muestras
de tumores de xenógrafos.
Las muestras de cáncer de mama HER-2 positivas (14 muestras) y HER-2
negativas (7 muestras) fueron cedidas por el Laboratorio de Terapèutica
Experimental dirigido por Josep Manel Baselga (VHIO, Barcelona).
Las muestras de carcinoma endometrial de distintos estadios tumorales
(estadios IA y IC) y de tejido endometrial no tumoral de 4 pacientes fueron
un regalo del Laboratorio d'Oncologia Ginecològica dirigido por el Dr. Jaume
Reventós (VHIR, Barcelona).
Reactivos y anticuerpos
Inhibidores, factores de crecimiento y fármacos
Se usaron los siguientes inhibidores, indicando a continuación el producto y
la concentración final del tratamiento: el inhibidor selectivo del dominio
cinasa para el receptor c-Met, PHA-665752 a 0,2 µM (Pfizer); el inhibidor de
MEK1/2, U0126 a 10 µM (#9903, Cell Signaling); el inhibidor de PI3K/AKT, LY-
294002 a 5 µM (#9901, Cell Signaling); el inhibidor de Src, PP1 a 5 µM (R&D
141
Systems) ; el inhibidor multicinasa (teniendo como dianas BRAF, CRAF, y los
receptores tirosina cinasa para el VEGF y PDGF) BAY 43-9006 o Sorafenib
(Nexavar) a 10 µM (Bayer Pharmaceuticals Corporation); el inhibidor de p90RSK,
BI-D1870 a 10 µM (The University of Dundee, Scotland); el inhibidor de
fosfatasas fluoruro de sodio (NaF); el inhibidor de fosfatasas ácido okadaico
(OA); y el cóctel de inhibidores de fosfatasas phosphatase inhibitor cocktail
2 (P5726, SIGMA-ALDRICH).
Los factores de crecimiento y otros reactivos utilizados fueron el Factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF) a una concentració final de 40ng/ml (H9661,
SIGMA-ALDRICH), el EGF a 100 ng/ml (13247-051, Invitrogen), la Insulina a 100
nM (12585-014, GIBCO), el Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) a
50ng/ml (PHG0024, Invitrogen), el Promotor Tumoral de éster-forbol (TPA) a
200 nM, el Factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1) a 50ng/ml (PHG9074,
Invitrogen), el Factor de crecimiento que deriva de plaquetas (PDGF) a 20mM
(PHG0041, Invitrogen), el Factor alpha de Necrosis Tumoral (TNF-α) a 40ng/ml
(PHC3011, Invitrogen), la Herregulina a 50 ng/ml.
Y los fármacos fueron el 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide ribonucleoside AICAR
a 1mM (A9978, SIGMA); la metformin en un rango de concentraciones en función
de la línea celular de 0,25 mM a 10 mM (D5035, SIGMA), la phenformin en un
rango de concentraciones en función de la línea celular de 0,001 mM a 0,5 mM
(P7045, SIGMA).
Privación de glucosa mediante el Medio DMEM low glucose (1X) 1000 mg/ml L D-
glucose (31885-023, GIBCO).
Anticuerpos para Western Blot
Los anticuerpos primarios para Western Blot (WB) utilizados fueron (Tabla
5A): phospho-p90RSK(Thr359/Ser363) #9344, phospho-p44/42 Map Kinase
(Thr202/Tyr204) #9101, phopho-MEK1/2 (Ser217/221) #9121, phospho-AMPKα
(Thr172) (40H9) #2535, phospho-LKB1 (Ser428) #3051, phospho-LKB1 (Ser334)
#3055, phospho-Akt (Ser473) #9271, phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236)
#2211, phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) #3661, phospho-Bad (Ser112)
#9296, Bad #9292, Bim #2819, DYKDDDDK Tag Antibody #2368 todos ellos
utilizados a una dilución de 1:1000 de Cell Signaling Technology. LKB1 (Ley
37D/G6):sc-32245 a 1:450, ERK2 (C-14):sc-154 a 1:2000, Raf-B (F-7):sc-5284 a
1:200, 14-3-3β (K-19):sc-629 a 1:500, c-Myc (N-262):sc-764 a 1:150, p53 (FL-
393):sc-6243 a 1:200, Bcl-2 (100):sc-509 a 1:200 de Santa Cruz
Biotechnology,INC. Rabbit Anti-CREB (Phospho-Ser133) Polyclonal antibody a
1:1000, Rabbit Anti-Bad (Phospho-Ser112) Polyclonal Antibody a 1:1000 de
GenScript Corporation. Anti-G3PDH (G3PDH o GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase) Rabbit Polyclonal Antibody #2275-PC-100 a 1:5000 de Trevigen.
Mcl-1 a 1:150 de DAKO.
142
Los anticuerpos secundarios para WB fueron: Anti-mouse/rabbit IgG
(Horseradish peroxidase linked whole antibody (from sheep)) (GE Healthcare
Life) a 1:10000. Anti-goat IgG-HRP (sc-2020) (Santa Cruz Biotechnology,INC) a
1:5000.
Anticuerpos para Inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación (IP) para LKB1 mediante el anticuerpo LKB1 (27D10)
rabbit (#3050, Cell Signaling Technology), para p-AMPKα Thr172 mediante
phospho-AMPKα (Thr172) (40H9) (#2535 Cell Signaling Technology), para GST-
AMPKα mediante GST-BindTM Resin (Novagen), para Flag-LKB1 mediante Anti-FLAG
M2 Affinity Gel (SIGMA).
Los anticuerpos se encuentran referenciados en el anexo en formato de tabla
(Tabla 5A).
Transfección, infección retroviral y lentiviral
Transfección transitoria de plásmidos
La transfección transitoria se realizó mediante liposomas, un método que
permite la transfección del ADN en células eucariotas mediante una
formulación de distintos lípidos. A partir de un medio sin antibióticos y sin
suero se prepara el complejo con una relación óptima de ADN y de
lipofectamina o de lipofectamina 2000 (LipofectamineTM /LipofectamineTM 2000
Transfection Reagent, Invitrogen), que variará en función de la línea celular
y del tipo de ácido nucleico a transfectar (Tabla 4A). Y finalmente, se
adiciona la mezcla de transfección en células que se encuentren con una
densidad de un 60 % de confluencia durante 8-12 horas.
El procedimiento de transfección estándar utilizado para una línea celular en
una placa de 100 mm consistió en que el día anterior a la transfección se
sembró 1,6·106 de células por placa de 100 mm. Para la preparación de los
complejos de transfección se diluyeron 6 µg de ADN para la transfección de un
único plásmido (o de un máximo de 10 µg de ADN en la cotransfeccción de dos
plásmidos) en 500 µl de medio sin suero y sin antibióticos. Por otro lado, se
diluyeron 12 µl de lipofectamina en 500 µl de medio sin suero y sin
antibióticos, mezclas que se incubaron durante 5 minutos a temperatura
ambiente, tiempo necesario para la formación de liposomas. Seguidamente, se
combinó gota a gota delicadamente la mezcla de ADN con la mezcla de
lipofectamina que se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente.
Finalmente, se adicionó la mezcla de transfección en la placa de células que
presentan una densidad de un 60 % de confluencia celular y con un volumen
final de 4 ml de medio sin suero y sin antibióticos, y se incubó durante 8-12
horas a 37ºC. Posteriormente, se retiró el medio de transfección, y se
143
suplementó el medio con suero y antibióticos. Finalmente, después de 48 horas
de la transfección se realizaron los tratamientos fijados en cada caso.
Transfección transitoria del siRNA
Para la transfección transitoria del siRNA se utilizaron los siguientes
siRNA: Scramble siRNA, ON-TARGETplus SMARTpool L-003460-00-005, Human BRAF
que contiene 4 siRNA para BRAF, ON-TARGETplus SMARTpool L-005027-00-005, Human
PRKAA1 que contiene 4 siRNA para AMPKα1, ON-TARGETplus SMARTpool L-005361-00-
005, Human PRKAA2 que contiene 4 siRNA para AMPKα2 procedentes de Thermo
Scientific Dharmacon. 24 horas antes de la transfección se sembraron 80000
células en placas de 6 pocillos. Seguidamente, se transfectaron entre 50-
100nM de siRNA mediante lipofectamina 2000 que presenta la propiedad de
transfectar ADN y ARN, mezcla que se incubó durante 12 horas. Los
experimentos se realizaron 72 horas después de la transfección, tiempo óptimo
donde se observó la bajada de expresión génica de interés.
Infección retroviral
La generación de retrovirus se realizó a través de la transfección del
plásmido retroviral pRetrosuper-GFP-H1-shRNA LKB1, y del pVSV-G
(glicoproteïna G, proteína viral que media la entrada a la célula) con
lipofectamina en una placa con una densidad del 60 % de confluencia de la
línea celular empaquetadora de virus HEK293GP, que contiene los genes gag y
pol. 48 horas postransfección, se filtró el medio procedente de las HEK-293GP
transfectadas a través de un filtro de PVDF, Low Protein Binding Durapore
(PVDF) Membrane for clarification of Aqueous Solutions (Millex-HV, Millipore)
de 45 µm de diámetro y se suplementó con 4 µg/ml de polibreno (Polybrene,
1,5-dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide, hexadimethrine
bromide, SIGMA). El medio condicionado conteniendo las partículas
retrovirales se añadió en la línea celular de mamífero elegida que debe
encontrarse en fase exponencial de crecimiento. 24 horas postinfección se
reinfectaron, y finalmente, 48 horas de la reinfección se seleccionaron en
función del contenido de selección de la construcción retroviral, sea
mediante el gen de resistencia a un determinado antibiótico, o del gen de
selección por la emisión de la proteína de fluorescencia verde o GFP que fue
detectada por el citómetro de flujo.
Infección lentiviral
La generación de lentivirus se realizó a partir de la línea celular HEK-293T
que se transfectó con los plásmidos pMDLg.RRE, pRSV.REV, pVSV-G, y pLKO.1-
puro shRNA LKB1 murino NM_011492 o humano NM_000455 (MISSIONTM shRNA Bacterial
Glycerol Stock, SIGMA) en una relación de 1,4/ 3,5/ 2/ 3,4, respectivamente,
144
y con lipofectamina (LipofectamineTM transfection reagent, Invitrogen) durante
12 horas, y seguidamente, se retiró el medio de transfección. 24 horas post
transfección, el medio viral de las HEK-293T se filtró con un filtro de PVDF
de 45 µm de diámetro, se suplementó con polibreno y se adicionó a la línea
celular de mamífero. 48 horas post infección se realizó una segunda
infección. La eficiencia de infección lentiviral fue mayor respecto la
infección retroviral, debido a que los lentivirus tienen capacidad de
integrarse en células de mamífero que no se encuentran en división celular,
de este modo, durante la infección de la línea celular de mamífero no se
requiere que las células se encuentren en fase exponencial.
Purificación de fosfoproteínas
Mediante el Phosphoprotein Purification Kit (QIAGEN) se realiza la
purificación de fosfoproteínas para el posterior análisis proteómico.
Es un método diseñado para la purificación específica de complejos de
proteínas fosforiladas procedentes de lisados celulares, que consiste en la
unión altamente específica en una columna de purificación de fosfoproteínas
de las proteínas que tienen un grupo fosfato sobre alguno de los aminoácidos.
Aquellas proteínas sin un grupo fosfato no se unen en la columna y pueden ser
encontradas en la fracción que pasa a través de la columna.
La lisis celular se realiza con un tampón de lisis que contiene un detergente
zwitterionic denominado CHAPS a una concentración de 0,25 %. Además, para la
resolución óptima de los complejos de proteína-ADN, se añade en el lisado la
benzonasa, una enzima endonucleasa que degrada todas las formas de ADN y ARN,
y además previene la degradación proteolítica de las proteínas en el lisado;
y se añade un cóctel de inhibidores de proteasas (Complete Protease Inhibitor
Cocktail Tablets, ROCHE).
El proceso experimental se detalla seguidamente, debido a que consiste en un
proceso con unas características distintas a los otros kits. El procedimiento
consistió en la adición de 875 µl de solución de CHAPS con 35ml de tampón de
lisis de fosfoproteínas, y 75 µl de solución de CHAPS en 3ml de tampón de
elución de fosfoproteínas a una concentración final de CHAPS de 0,25 %, en
ambos tampones. Se adicionó 1 pastilla de inhibidores de proteasas y 10 µl de
solución madre de benzonasa en 5ml de tampón de lisis de fosfoproteínas que
contiene el CHAPS al 0,25 %. Se escrapearon las placas p150 mm con el tampón
de lisis a una temperatura de 4ºC, y se incubó durante 30 minutos, volteando
las distintas muestras cada 10 minutos. Posteriormente, se centrifugó el
lisado celular a 10000 g a 4ºC durante 30 minutos. Durante el proceso de
centrifugación, se prepararon y se equilibraron las columnas mediante el
tampón de lisis de fosfoproteínas que contiene el 0,25 % de CHAPS, de esta
145
manera se permite que el tampón fluya a través de la columna. Seguidamente,
se determinó la concentración proteica del sobrenadante, y a continuación se
cogió el volumen correspondiente para 2,5 mg de proteína total, y se ajustó a
una concentración proteica de 0,1 mg/ml añadiendo el tampón de lisis de
fosfoproteínas que contiene 0,25% de CHAPS hasta un volumen final de 25 ml de
lisado. 12,5 ml del lisado al 0,1 mg/ml de proteína se añadió en la columna
equilibrada, y una vez fluyó el volumen de lisado a través de la columna, se
añadió los 12,5 ml restantes. Precisamente, durante el paso del lisado a
través de la columna sucede la unión específica de las proteínas fosforiladas
en la columna. Finalmente, se almacenó la fracción que fluye a través de la
columna para el análisis de proteínas no fosforiladas del lisado de interés,
y antes de la elución de la columna se realizó un lavado de la columna con 6
ml de tampón de lisis con el CHAPS. Para obtener la fracción de elución de la
columna que contiene las proteínas fosforiladas se añadió 500 µl del tampón
de elución de fosfoproteínas que contiene el 0,25 % de CHAPS. Y se repitió
este mismo paso, obteniendo 1 ml de proteínas fosforiladas purificadas del
lisado celular de interés.
Para el análisis proteómico y la detección proteica se determinó la
concentración proteica de las fracciones eluídas. Ocasionalmente, si la
concentración proteica que resulta es baja, las fosfoproteínas se concentran
mediante el uso de concentradores denominados microcon de tipo YM-3,
MICROCON Centrifugal Filter Devices (MILLIPORE), que se caracterizan por
tener una membrana de 3000 NMWL (NMWL, nominal molecular weight limit in
daltons (proteins)), y permite el paso de las proteínas menores de 3000 Da a
través de la membrana, y de este modo, obtener las proteínas de un peso
superior a 3 KDa.
Análisis proteómico: DIGE y MALDI TOF/TOF
El análisis proteómico mediante Electroforesis Bidimensional Diferencial
cuantitativa con tinción fluorescente (DIGE, Fluorescence 2-D Difference In
Gel Electrophoresis) se basa por el marcaje con diferentes fluoróforos,
permitiendo la cuantificación precisa de diferencias entre muestras separadas
simultáneamente en un mismo gel bidimensional. Método realizado en el
Servicio de Proteómica de l'Institut de Recerca de la Vall d'Hebron
dirigido por el Dr. Francesc Canals.
En este caso, en los diferentes geles se realizó la combinación de las
distintas condiciones experimentales con los distintos tipos de marcaje
fluorescente (Fluorescent Cyanine dyes, Cy2, Cy3 o Cy5) para eliminar
posibles interferencias del fluoróforo con la muestra. Los distintos
fluoróforos Cy2, Cy3 o Cy5, se caracterizan por diferentes valores de
146
longitud de onda de excitación y de emisión. Correspondiéndole al tinte
fluorescente azul Cy2, un pico de longitud de onda aproximado de excitación y
de emisión de 492 nm, y de 510 nm; al fluoróforo Cy3, de 550 nm, y de 570 nm;
y al fluoróforo Cy5, de 650 nm, y de 670 nm, respectivamente.
Las condiciones experimentales fueron la condición control (control 1), medio
sin suero durante 2 horas y 30 minutos; la condición HGF, medio sin suero
durante 2 horas y 30 minutos, y finalmente el tratamiento con el HGF durante
10 minutos; y la condición HGF+PHA-665752 (control 2), el pretratamiento
durante 2 horas y 30 minutos con el medio sin suero y el inhibidor del
receptor c-Met conocido como PHA-665752, y finalmente el tratamiento con el
HGF durante 10 minutos. Así, el primer gel contuvo el marcaje de Cy3 para la
condición control (control 1), Cy5 para la condición HGF, y Cy2 para la
mezcla de las tres condiciones (pool de las tres condiciones experimentales:
control (control 1), HGF, y HGF+PHA-665752 (control 2)); el segundo gel
contuvo el marcaje de Cy3 para la condición HGF, Cy5 para la condición
HGF+PHA (control 2), y Cy2 para la mezcla de las tres muestras (pool de las
tres condiciones experimentales). Se obtuvieron n puntos diferenciales
equivalentes a fosfoproteínas o proteínas complejadas a fosfoproteínas que
aparecieron en respuesta al HGF, de estas fosfoproteínas diferenciales se
identificaron n fosfoproteínas por espectometría de masas MALDI-TOF/TOF,
método que consistió en el corte de la banda de interés del gel bidimensional
diferencial (DIGE), la digestión de la muestra y la adquisición del espectro
o huella peptídica e identifiación por búsqueda frente a la base de datos.
Inmunoprecipitación y Western Blot
Para la extracción de proteínas de las distintas condiciones experimentales,
se procedió a la lisis celular mediante el tampón de lisis celular que
consitió con el tampón M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (PIERCE) o
con el tampón RIPA (0,5% NP-40, 0,5 mM EGTA, 150 mM NaCl y 50 mM Tris-HCl
pH=7,4), y la adición de inhibidores de fosfatasas como el fluoruro de sodio
(NaF) a 50 mM, y el ortovanadato sódico (Na3VaO4) a 1 mM, y finalmente, la
adición de un comprimido que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas
(Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets, ROCHE). Seguidamente, para el
correcto análisis de Western-Blot (WB) o inmunoprecipitación (IP) se
cuantificó los extractos proteicos mediante BCATM Protein Assay Kit (PIERCE,
Thermo Scientific).
Inmunoprecipitación
En la IP de una proteína determinada se requirió entre 1-3 µg del anti-
proteïna o anticuerpo de interés en un volumen final de 800 µl de extracto
147
proteico con una cantidad mínima de 1mg de proteína total. El lisado con el
anticuerpo se incubó durante toda la noche a 4ºC en rotación, y
posteriormente, se adicionó entre 20-30 µl de la resina Protein A/G Plus-
Agarose (Immunoprecipitation Reagent:sc-2003, Santa Cruz Biotechnology)
durante 1 hora a 4ºC en rotación. Finalmente, se realizó 3 lavados con el
tampón de lisis celular a 4ºC. En el caso de una IP contra el epítopo Flag se
utilizó 20-30 µl de la resina Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIGMA) durante toda
la noche a 4ºC en rotación, y finalmente, se realizó 3 lavados con el tampón
de lisis celular.
Western Blot
Para el análisis de Western Blot se utilizó entre 30-80 µg de lisado celular.
Previamente a la inmunodetección proteica, se desnaturalizaron los extractos
proteicos, procedentes de una IP o extractos proteicos totales, bajo la
condición de 100ºC durante 5 minutos con el tampón de carga de proteína
denominado Laemmli, que consta de 0,5 M de TrisHCl pH=6,8, 4,4 % de SDS, 20 %
de glicerol, 0,005 % de azul de bromofenol y el 2 % de β-mercaptoetanol.
Seguidamente, se procedió a la separación de las proteínas mediante la
electroforesis en geles del 10-15 % de poliacrilamida, porcentajes de
poliacrilamida que variarán en función de las proteínas a analizar. La
electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato (SDS-PAGE) se
realizó a 140V durante unos 80 minutos, y tras la resolución de las distintas
proteínas fueron transferidas en membranas de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) (Immobilon-P Transfer Membranes, MILLIPORE) a 110 V durante 90 minutos
con el aparato de transferencia (BIO-RAD Laboratories). Posteriormente, se
bloqueó la membrana con TBS 1X-0,1 % Tween (TBST) al 5 % de leche (Blotto,
non-fat dry milk sc-2325, Santa Cruz Biotechnology), se lavó con TBST, y se
incubó con el anticuerpo primario deseado en TBST al 5 % de albúmina sérica
bovina (BSA) durante 1 hora en agitación suave a temperatura ambiente, o a
4ºC durante toda la noche. Seguidamente, la membrana se lavó con 15 ml de
TBST (3 lavados de 10 minutos), y se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente con el anticuerpo secundario acoplado a la peroxidasa
correspondiente diluído en TBST al 5 % de leche. El anticuerpo secundario
inmuno reacciona con el anticuerpo primario utilizado, y las distintas
opciones de anticuerpo secundario pueden ser de ratón, conejo, cabra... en
función de la especie donde se haya generado el anticuerpo primario.
Seguidamente, se lavó 3 veces con TBST durante 10 minutos, y finalmente, las
bandas fueron detectadas mediante la adición del sustrato de la peroxidasa,
siendo el sustrato, el peróxido de higrógeno que se encuentra en el reactivo
ECLTM Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Life), donde la
incubación de la membrana fue de 2 minutos a temperatura ambiente. El
148
revelado, se efectuó por autorradiografía (FUJI MEDICAL X-RAY film 18x24,
FUJIFILM), y se visualizó la señal de quimioluminiscencia en periodos de
incubación de 10 segundos hasta 5 minutos, periodo que varió en función de la
intensidad de quimioluminiscencia.
A continuación, para las subsiguientes inmunodetecciones de otras proteínas
de interés en la misma membrana se realizó la incubación durante 1 hora a
temperatura ambiente con la solución de stripping de composición Tris-HCl
50mM a pH=2,0, donde la acidez de este tampón permite extraer los distintos
anticuerpos conjugados que se adhieren en la membrana de PVDF en las
distintas incubaciones del anticuerpo primario y secundario. De esta manera,
la solución tamponada de stripping permite extraer los anticuerpos conjugados
sin alterar los antígenos de las distintas proteínas, y así evitar inmuno
reacciones cruzadas en las posteriores incubaciones. Finalmente, para la
verificación de las cantidades de proteína cargada en la membrana se realizó
la tinción con solución de Ponceau S, 0,1% de Ponceau S (w/v) y 5,0 % de
ácido acético (w/v), tinción negativa que se une a los grupos amino cargados
positivamente de la proteína, detectando las proteínas con un límite de 250
nanogramos de proteína en las membranas de PVDF, nitrocelulosa y de acetato
de celulosa.
Ensayo de viabilidad celular y apoptosis
El método Guava ViaCount Reagent (Guava Technologies) permite el contaje de
las células viables y no viables en suspensiones celulares de una gran
variedad de líneas celulares de mamífero. Este método permite diferenciar las
células viables de les muertas mediante la permeabilidad diferencial del
reactivo ViaCount reagent en unirse al ADN de las células muertas. Annexin V-
EGFP Apoptosis Detection Kit (Cat.No. L00288 de GenScript Corporation) es un
ensayo de apoptosis que consiste en la detección y tinción de la
fosfatidilserina mediante el anticuerpo contra la proteína de fluorescencia
verde o EGFP fusionado con la Anexina V, método basado en que muchas
fosfatidilserinas se translocan de la cara interna a la cara externa de la
membrana celular durante los estadios tempranos de la apoptosis.
Para el ensayo de viabilidad celular y de apoptosis, 12 horas antes del
tratamiento se sembró un número concreto y fijo de células por pocillo en
placas de 6 pocillos, siendo un número de células fijado dependientemente de
la línea celular y del tratamiento que se desarrolle. Además, se realizaron
triplicados para cada condición experimental. Después de la siembra, se
realizó el tratamiento correspondiente, y el análisis del tiempo cero, donde
se analizó en el ensayo de viabilidad celular el porcentaje de células
viables y muertas de la línea celular de estudio, y en el ensayo de apoptosis
149
se analizó los distintos estadios de apoptosis basales que caracterizan a la
línea celular de interés (siempre se recoge el medio de la placa, para
analizar todas las células que pueden desadherirse de la placa por el proceso
experimental o tratamiento). El proceso experimental para los ensayos de
viabilidad y de apoptosis celular consistió en la recuperación del medio de
cada uno de los pocillos, medio que puede contener células proapoptóticas,
células muertas y otros cuerpos que se hayan despegado de la superficie del
pocillo. Posteriormente, se tripsinizó tras un lavado con PBS 1X estéril de
cada uno de los pocillos, y seguidamente se adicionó 500 µl de tripsina en
cada pocillo. Se recuperaron las células tripsinizadas de cada uno de los
pocillos, y se centrifugaron las células procedentes del medio inicial y las
células procedentes de la tripsinización a 1000 g durante 5 minutos.
Seguidamente, se lavaron las células con PBS estéril y se centrifugaron a
1000 g durante 5 minutos, pasos en común para ambas técnicas.
A continuación, para el ensayo de viabilidad celular, el precipitado de
células se resuspendió en 1 ml de medio completo, y a continuación en 360 µl
de ViaCount Reagent se diluyó 40 µl de las células resuspendidas en 1ml, y se
incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. A
continuación, se analizaron las muestras mediante la aplicación del Guava
ViaCount, donde se establecieron los distintos parámetros para la línea
celular y entre otros factores. La adquisición de los distintos datos se
realizó a través de dos dot plots, la viabilidad (PM1) y las células
nucleadas (PM2). Siendo PM1 un marcador que permite teñir el contenido del
núcleo o ADN, y PM2 un marcador que permite discriminar las células de los
cuerpos residuales que puedan contener ADN.
Para el ensayo de apoptosis celular, el precipitado de células se resuspendió
con 500 µl de tampón de unión del Binding Buffer kit, posteriormente se
añadió 5 µl de Anexina V-EGFP, Annexin V-EGFP kit, y 5 µl de Ioduro de
Propidio, Propidium Iodide (PI) kit, y se incubó durante 15 minutos a
temperatura ambiente y protegido de la luz. Finalmente, se analizó en el
citómetro de flujo utilizando un detector de señal FITC, normalmente FL1 para
la emisión del EGFP, y un detector de señal de phycoerythrin, normalmente FL2
para la tinción con PI.
Ensayo de formación de colonias
El ensayo clonogénico de células es un ensayo de supervivencia celular in
vitro basado en la capacidad de células aisladas de formar colonias. Este
método permite determinar la muerte de células en división después de un
tratamiento, e incluso se utiliza para determinar la eficacia de agentes
citotóxicos.
150
Únicamente una fracción de células sembradas se adhieren en la superficie de
la placa y producen colonias, para ello se sembró un número apropiado y fijo
de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, realizando triplicados
para cada condición experimental. Después de 24 horas de la siembra, momento
donde la fracción de células se encuentra adherida en la placa, se inició el
tratamiento correspondiente. Finalmente, después de 2-4 semanas de
tratamiento, momento donde observamos las distintas formaciones de clones de
células, se procedió a la fijación de las células con formaldehido al 4 %
durante 20 minutos, seguidamente, se lavaron 2 veces con PBS 1X, se tiñeron
con cristal violeta (1 mg/l) durante 20 minutos, se lavaron 2 veces con ddH2O,
y finalmente, se contaron el número de colonias.
Análisis de imagen
La normaliazación de los WB donde las bandas corresponden a los anticuerpos
de fosfoproteínas se normalizó contra la proteína total fosforilada. Otras
proteínas se normalizaron contra el GAPDH.
Las bandas que corresponden a las muestras tumorales se cuantificaron
utilizando NIH1.6 Image software.
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172
173
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176
Figura 1A/ Esquema del procedimiento experimental de purificación de
fosfoproteínas y del análisis proteómico; e imagen del gel DIGE de los complejos
de fosfoproteínas purificados en respuesta al Factor de Crecimiento de
Hepatocitos (HGF)
(A) Esquema del procedimiento experimental de purificación de fosfoproteínas y del análisis
proteómico. (B) Análisis proteómico mediante la Electroforesis Bidimensional Diferencial
Cuantitativa en gel con tinción Fluorescente (DIGE) de los extractos fosfoproteicos
purificados en respuesta al HGF en la línea celular 37-31E. Así, el primer gel contuvo el
marcaje de Cy3 para la condición control (control 1), Cy5 para la condición HGF y Cy2 para
la mezcla de las tres condiciones experimentales (pool de las tres condiciones
experimentales: control, HGF, y HGF+PHA-665752); el segundo gel contuvo el marcaje de Cy3
para la condición HGF, Cy5 para la condición HGF+PHA-665752 (control 2), y Cy2 para la
mezcla de las tres condiciones experimentales. Figura 1A (B) corresponde a la imagen del
primer gel DIGE, donde se muestran las manchas o puntos equivalentes a las moléculas
implicadas en las distintas condiciones experimentales, marcadas por los fluoróforos (Cy3,
verde, o Cy5, rojo).
177
Figura 2A/ Listado de parte de los candidatos identificados implicados en la
señalización del HGF/c-Met por espectometría de masas (MALDI TOF/TOF)
Identificación Símbolo y nombre oficial
Peso molecular (KDa) Secuencia peptídica
Cab39 Mus musculus Calcium binding protein 39 Protein MO25 (Q8VDZ8)
39,843 KDa, 341 AA
QSLKLLGELLLDR HKLLSAEFLEQHYDR NLKRAAQQEA HEPLAKIILWSEQFYDFFR
Stmn1 Mus musculus Stathmin 1 (Q545B6) 17,274 KDa, 149 AA RASGQAFELISPRS
KDLEEIQKK
STUB1 or STIP1 homology and U-Box containing protein 1 Mus musculus (Q9WUD1)
34,090 KDa, 304 AA RLNFGDDIPSALRI
Taldo1 or transaldolase 1 Mus musculus (Q93092) 37,387 KDa, 337 AA
KLFVFGAEILKK KLSSTWEGIQAGKE RILDWHVANTDKK RRLIELYKE
178
Figura 3A/ El inhibidor de MEK1/2 U0126 no tiene efecto sobre la activación de
AMPKα a las concentraciones de 1µM hasta 10µM
Test del efecto del inhibidor específico de MEK1/2 (U0126) sobre la activación de AMPKα en
las distintas líneas celulares de melanoma mutantes en BRAFV600E (UACC903, A375 y SkMel28).
Las líneas celulares de melanoma BRAFV600E bajo un medio con alta concentración de glucosa se
sometieron a un gradiente creciente de concentraciones de 1µM hasta 10µM del inhibidor
específico de MEK1/2 (U0126) durante un periodo de 4 horas. El análisis de WB muestra los
niveles de p-ERK1/2T202/Y204 como control de la efectividad del inhibidor U0126, p-AMPKαT172 como
residuo fosforilado que indica la consecuente activación de AMPKα, y las proteínas AMPKα y
ERK1/2 como control de carga proteica del experimento.
179
Figura 4A/ Las líneas celulares de melanoma murinas y humanas silenciadas de
manera estable para LKB1 muestran que tan sólo una pequeña población de LKB1 se
modifica en respuesta al HGF
Análisis de las líneas celulares de melanoma murinas y humanas silenciadas de manera
estable para LKB1. Las líneas celulares de melanoma 37-31T, B16F1 y Melan-a se infectaron
con los lentivirus que integran el plásmido pLKO.1-puro shRNA LKB1, y posteriormente se
seleccionaron de manera estable con el antibiótico puromicina. Después de establecer los
clones con el silenciamiento génico de LKB1, se pretataron bajo un medio con alta
concentración de glucosa (4500 mg/L) sin suero durante 2 h y 30 min, y seguidamente se
trataron con el HGF (Cf=40 ng/ml) durante un periodo de 5 minutos. El análisis de WB muestra
los niveles de LKB1, p-LKB1S428, y GAPDH como control de carga proteica del experimento.
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181
Lesión genética primaria
Lesión genética secundaria
Vías de señalización afectadas Carcinógeno Comentarios del melanoma
p16INK4a (Knock out,
KO)
No pRb DMBA Baja penetrancia
p16INK4a (KO) p19ARF(KO)
pRb, p53 No Melanoma no espontáneo
p16INK4a (KO) p19ARF(Het)
pRb, p53 DMBA Melanoma metastático en pulmon, hígado y bazo
p16INK4a (KO) p19ARF(KO) and HRASV12G
(Transgenic,Tg)
pRb, p53, MAPK No Elevada penetrancia; melanoma no metastático, melanoma inducible por doxiciclina
p16INK4a (KO) p19ARF(KO) and PTEN (Het)
pRb, p53, PI3K/AKT No Baja penetrancia; requiere la deficiencia en ambos genes INK4a/ARF y PTEN
p16INK4a (KO) HRASV12G (Tg) pRb, MAPK UV Única dosis de radiación UV eritematoso neonatal, no hay efectos del UV en la incidencia del melanoma
CDK4(R24C) (Knock in,
KI)
No pRb No Penetrancia baja
p53 (KO) HRASV12G (Tg) p53, MAPK DMBA/TPA No
Elevada penetrancia; melanoma no metastático Similar a INK4a/ARF KO, RAS Tg mice
SV40-T-Ag (Tg)
No pRb,p53 No UV
Baja penetrancia del melanoma cutáneo Lesión melanocítica de Graffed, única dosis de radiación UV neonatal, melanoma metastático
Tabla 1A/ Modelos murinos de melanoma
Tabla resumen de los modelos murinos de melanoma existentes en la actualidad.
En rojo figuran las vías de señalización mitogénicas claves en melanoma (MAPK y PI3K) y el agente medioambiental mutagénico como es la radiación ultravioleta (UV).
182
HRASV12G (Tg) No MAPK No Tumores de piel no espontáneos HRASV12G (Tg) p19ARF(KO)
MAPK,p53 DMBA/UV
UV
Induce melanoma, DMBA con mayores efectos que la radiación UV crónica en adultos Única dosis de radiación UV eritematosa neonatal, UV acelera melanomagénesis
HGF/SF (Tg) No Met (MAPK,PI3K…) No UV
UV
Baja penetrancia; melanoma dérmico Dosis crónica de radiación UV suberitematosa en adulto, no tiene efecto sobre la incidencia en melanoma Única dosis de radiación UV eritematosa neonatal, UV induce el desarrollo del melanoma, semejanza al melanoma humano, reproduce cronológica e histopatológicamente todos los estadios del desarrollo del melanoma cutáneo humano
HGF/SF (Tg) p16INK4a/p19ARF (KO)
Met (MAPK,PI3K…), pRb, p53
UV Única dosis de radiación UV eritematosa neonatal, INK4a/ARF coopera sinérgicamente con UV induciendo el melanoma de manera aditiva
RFP-RET (Tg) No MAPK,PI3K No UV
Melanoma espontáneo metastático Elevadas dosis de UV promueve el desarrollo del melanoma maligno
MIP-2 (Tg) p16INK4a +/- p19ARF +/-
CXCR2, pRb, p53 DMBA Dependiente de DMBA; baja penetrancia
NRASQ61K CDK4R24C/R24C MAPK, pRb UV Desarrollo del melanoma con un 100% de penetrancia, UV induce y acelera el desarrollo del melanoma
HRASV12G p16INK4a/p19ARF (KO)
PTEN+/-
MAPK, pRb, p53, PI3K Desarrollo del melanoma con un 75% penetrancia, con metástasis en pulmón y en nódulos linfáticos
BRAFV600E and PTEN (KO) (BRAFCA,
Tyr::CreER,PTENlox4-5)
No MAPK,PI3K 4-HT Desarrollo del melanoma con un 100% de penetrancia, con metástasis observada en nódulos linfáticos y pulmones
183
Tabla 2A/ Secuencias de los oligonucleótidos o cebadores utilizados para el
clonaje y para la mutagénesis dirigida
Nombre del plásmido
Secuencia del oligonucleótido específico diseñado (Forward y Reverse)
pLPCX-Flag-LKB1Δ416-436 Mus musculus
Forward: 5'-GCCCCTCGAGAGTGCCACCATGGACTACAAG-3’ Tm=80,8ºC
Reverse: 5'-GGGCGCGGCCGCTCAGGTGCCAGGTCGGCC-3’ Tm=93,9ºC
pLPCX-Flag-LKB1Δ323-436 Mus musculus
Forward: 5'-GCCCCTCGAGAGTGCCACCATGGACTACAAG-3’ Tm=80,8ºC
Reverse: 5’-GGGCGCGGCCGCTCATGGGATAGGTACGAC-3’ Tm=85,6ºC
pLPCX-Flag-LKB1Δ195-436 Mus musculus
Forward: 5'-GCCCCTCGAGAGTGCCACCATGGACTACAAG-3’ Tm=80,8ºC
Reverse: 5’-GGGCGCGGCCGCTCAGAGGTCGGAGATCTT-3’ Tm=86,76ºC
pLPCX-LKB1S431A Mus musculus
Forward: 5'-AAGATCCGCCGGCTCGCGGCCTGCAAGCAGCAGTGA-3’ Tm=90,80ºC Reverse: 5’-TCACTGCTGCTTGCAGGCCGCGAGCCGGCGGATCTT-3’ Tm=90,80ºC
pLPCX-Flag-LKB1S431A Mus musculus
Forward: 5'-AAGATCCGCCGGCTCGCGGCCTGCAAGCAGCAGTGA-3’ Tm=90,80ºC Reverse: 5’-TCACTGCTGCTTGCAGGCCGCGAGCCGGCGGATCTT-3’ Tm=90,80ºC
pLPCX-GST-Flag-LKB1S431A Mus musculus
Forward: 5'-AAGATCCGCCGGCTCGCGGCCTGCAAGCAGCAGTGA-3’ Tm=90,80ºC Reverse: 5’-TCACTGCTGCTTGCAGGCCGCGAGCCGGCGGATCTT-3’ Tm=90,80ºC
pLNCX2-LKB1S431A Mus musculus
Forward: 5'-AAGATCCGCCGGCTCGCGGCCTGCAAGCAGCAGTGA-3’ Tm=90,80ºC Reverse: 5’-TCACTGCTGCTTGCAGGCCGCGAGCCGGCGGATCTT-3’ Tm=90,80ºC
pLPCX-Flag-LKB1S431A Mus musculus
Forward: 5'-AAGATCCGCCGGCTCGCGGCCTGCAAGCAGCAGTGA-3’ Tm=90,80ºC Reverse: 5’-TCACTGCTGCTTGCAGGCCGCGAGCCGGCGGATCTT-3’ Tm=90,80ºC
pRetrosuper-EGFP-Luc
Forward: 5'-GCCCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’ Tm=84,56ºC Reverse: 5’-GCCCCATCGATTTACACGGCGATCTTTCCGCCCTT-3’ Tm=84,3ºC
pSuper-siRNA LKB1.tipo 1
Forward: 5’-GATCCGCCAATGGACTGGACACCTTCTCAAGAGAAAGG TGTCCAGTCCATTGGTTTTTTGGAAA-3’ Tm=94,3ºC Reverse: 5’-AGCTTTTCCAAAAAACCAATGGACTGGACACCTTTCTC TTGAGAAGGTGTCCAGTCCATTGGCG-3’ Tm=93,8ºC
pSuper-siRNA LKB1.tipo 2
Forward: 5’-GATCCGCGCCAAGCTCATCGGCAACTCAAGAGATTGCCG ATGAGCTTGGCGCTTTTTTGGAAA-3’ Tm=90,1ºC Reverse: 5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCGCCAAGCTCATCGGCAATCTCT TGAGTTGCCGATGAGCTTGGCGCG-3’ Tm=89,6ºC
184
Tabla 3A/ Características de los vectores plasmídicos generados
Se especifica el nombre del vector de expresión completo con la indicación del gen de
expresión (inserto) y del organismo que pertenece el gen, nombre del vector plasmídico y su
tamaño en Kb, nombre del inserto y su tamaño en Kb, y las dianas de restricción utilizadas
para el clonaje del gen (enzimas de restricción que flanquean al gen de interés).
Nombre del plásmido
Vector nombre/ tamaño
Inserto nombre/tamaño
Dianas de restricción
pLPCX-Flag-LKB1Δ416-436 Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta Flag, fusionada a LKB1 delecionado desdel aminoácido 416 hasta el 436/1,248Kb
XhoI (5’) y NotI (3’)
pLPCX-Flag-LKB1Δ323-436 Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta Flag, fusionada a LKB1 delecionado desdel aminoácido 323 hasta el 436/0,969Kb
XhoI (5’) y NotI (3’)
pLPCX-Flag-LKB1Δ195-436 Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta Flag, fusionada a LKB1 delecionado desdel aminoácido 195 hasta el 436/0,585Kb
XhoI (5’) y NotI (3’)
pLPCX-GST-Flag-LKB1WT
Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta GST y Flag fusionada a LKB1/1,311Kb
XhoI (5’) y EcoRI (3’)
pLPCX-LKB1WT Mus musculus
pLPCX/6,3Kb LKB1/1,311Kb HindIII (5’) y NotI (3’)
pLNCX2-LKB1WT Mus musculus
pLNCX2/ 6,1Kb
LKB1/1,311Kb HindIII (5’) y NotI (3’)
pcDNA3.1 V5/His -LKB1WT Mus musculus
pcDNA3.1 V5/His/ 5,5Kb
LKB1/1,311Kb HindIII (5’) y EcoRI (3’)
pTarget-LKB1WT Mus musculus
pTarget/ 5,5Kb
LKB1/1,311Kb HindIII(5’) y SalI (3’)
pLPCX-LKB1S431A Mus musculus
pLPCX/6,3Kb LKB1S431A/1,311Kb Quick change II site-directed mutagenesis kit
pLPCX-Flag-LKB1S431A Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta Flag fusionada a LKB1S431A/1,311Kb
EcoRI de extremos romos
pLPCX-GST-Flag-LKB1S431A Mus musculus
pLPCX/6,3Kb En el N-terminal del inserto la etiqueta GST y Flag fusionada a LKB1S431A/1,311Kb
Quick change II site-directed mutagenesis kit
pLNCX2-LKB1S431A Mus musculus
pLNCX2/ 6,1Kb
LKB1S431A/1,311Kb Quick change II site-directed mutagenesis kit
pLPCX-Flag-LKB1S431A Mus musculus
pLPCX/ 6,3Kb
En el N-terminal del inserto la etiqueta Flag fusionada a LKB1S431A/1,311Kb
EcoRI
185
pRetrosuper-EGFP-Luc
pRetrosuper HygroR/6,3Kb pRetrosuper/5,275Kb
EGFP-Luc/2,4Kb Nota: Vector plasmídico dónde se sustituye el gen de resistencia a higromicina por el inserto EGFP-Luc
Extremos romos HindIII (5’) y ClaI (3’) en pRetrosuper
pSuper-siRNA LKB1.tipo 1
pSuper/3,176Kb
siRNA LKB1.1/64pb o 0,064Kb BamHI (5’) y HindIII (3’)
pRetrosuper-EGFP-Luc-siRNA LKB1.tipo 1
pRetrosuper/5,275Kb ya que carece del gen de resistencia a higromicina
Promotor H1 (procediente del pSuper)+ siRNA LKB1.1/ 226pb+64pb=290pb=0,29Kb
BglII/BamHI (5’) y XhoI (3’)
pSuper-siRNA LKB1.tipo 2
pSuper/3,176Kb
siRNA LKB1.1/64pb o 0,064Kb BamHI (5’) y HindIII (3’)
pRetrosuper-EGFP-Luc-siRNA LKB1.tipo 2
pRetrosuper/5,275Kb ya que carece del gen de resistencia a higromicina
Promotor H1 (procediente del pSuper)+ siRNA LKB1.1/226pb+64pb=290pb o 0,29Kb
BglII/BamHI (5’) y XhoI (3’)
186
Tabla 4A/ Líneas celulares y sus características
Se especifica el nombre, origen y alteración genética de las líneas celulares utilizadas, el medio de cultivo para el mantenimiento y las condiciones de
transfección.
Designación Origen
Organismo/tipo celular y tejido
Medio de cultivo Alteración genética
Condiciones de transfección
reactivo/ cantidad de ADN por
placa de 100mm B16-F1 Mus musculus C57/BL6
/ melanoma maligno metastático a pulmón
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Lipofectamina 2000/ 8µg de ADN
37-31E1A Mus musculus transgénico para el HGF/SF / melanoma maligno inducido por radiación UV neonatal
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina, y se adiciona 0,005 µg/ml del factor de crecimiento epidérmico o EGF (Invitrogen), y 4µg/ml insulina recombinante humana (GIBCO)
Sobreexpresión del Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) y daño al ADN debido a la radiación ultravioleta
Lipofectamina 2000/ 8µg de ADN
37-31T2 Mus musculus transgénico para el HGF/SF / melanoma maligno inducido por radiación UV neonatal
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina, y se adiciona 0,005 µg/ml del factor de crecimiento epidérmico o EGF (Invitrogen), y 4µg/ml insulina recombinante humana (GIBCO)
Sobreexpresión del Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF) y daño al ADN debido a la radiación ultravioleta
Lipofectamina 2000/ 8µg de ADN
187
HeLa Homo sapiens, adulto (mujer de 31 años de edad, Henrietta Lacks) /línea celular de adenocarcinoma de cérvix
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Contiene la secuencia para el virus del papilloma humano 18 (HPV-18). No expresa endógenamente a LKB1/Stk11.
Lipofectamina 2000/ 6µg de ADN
HEK-293T Homo sapiens, feto / línea celular embrionaria de riñón
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Expresan un inusual receptor de membrana celular para la vitronectina
Lipofectamina/ 6µg de ADN
HEK-293T-GP Homo sapiens, feto / línea celular embrionaria de riñón
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Expresan un inusual receptor de membrana celular para la vitronectina
Lipofectamina/ 6µg de ADN
A375 Homo sapiens, adulto (mujer de 54 años de edad)/ melanoma maligno cutáneo
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Mutación activante en BRAFV600E, mutación puntual en p16
UACC903 Homo sapiens / melanoma maligno cutáneo
Medio RPMI 1640 amb 25mM d'HEPES y L-glutamina (GIBCO), al 10% de FBS y 100µg/ml de estreptomicina y penicilina
Mutación activante en BRAFV600E
SKMel28 Homo sapiens, adulto (hombre de 51 años de edad) /melanoma maligno cutáneo
Medio Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC), al 10 % de FBS, y 100µg/ml de estreptomicina y penicilina
Mutación activante en BRAFV600E, mutación puntual en p53
MeWo Homo sapiens / melanoma maligno cutáneo
Medio Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC), al 10 % de FBS, y 100µg/ml de estreptomicina y penicilina
Mutación puntual en p53
UACC2973 Homo sapiens, adulto Medio RPMI 1640 amb 25mM d'HEPES y L- Mutación puntual activante
188
(mujer de 54 años de edad) /melanoma maligno cutáneo
glutamina (GIBCO), al 10 % de FBS y 100µg/ml de estreptomicina y penicilina
en NRAS
UACC1097 Homo sapiens, mujer de 54 años de edad / melanoma maligno cutáneo
Medio RPMI 1640 amb 25mM d'HEPES y L-glutamina (GIBCO), al 10 % de FBS y 100µg/ml de estreptomicina y penicilina
Mutación puntual en p16
SkMel103 Homo sapiens/ melanoma maligno cutáneo
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Mutación puntual activante en NRASQ61R
SkMel147 Homo sapiens/ melanoma maligno cutáneo
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 10 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Mutación puntual activante en NRASQ61R
MSKM8 Homo sapiens/ melanoma maligno cutáneo metastástico de una invasión directa de la piel por un cáncer subyacente (conocida como letálides)
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 20 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Mutación puntual activante en NRASWT
MMLN9 / MMLN10
Homo sapiens/ melanoma maligno cutáneo metastático a nódulos linfáticos
Medio DMEM suplementado con 4,5g/l de glucosa y L-glutamina (ATCC), al 20 % de suero fetal bovino o FBS (GIBCO), y 100µg/ml de los antibióticos estreptomicina y penicilina
Mutación puntual activante en NRASQ61K
189
Tabla 5A/ Anticuerpos específicos para WB e inmunoprecipitación (IP)
Se especifica el nombre del anticuerpo, casa comercial y referencia, técnicas donde se
puede aplicar el anticuerpo, isotipo, y dilución empleada para la inmunodetección proteica
y periodo de incubación del anticuerpo.
Nombre del anticuerpo
Referencia/ casa
comercial
Aplicación Isotipo Dilución/tiempo de incubación
fosfo-p44/42 (Thr202/Tyr204)
#9101/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:3000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-MEK1/2 (Ser217/221)
#9121/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:2000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-p90RSK
(Thr359/Ser363) #9344/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-LKB1 (Ser428)
#3051/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-LKB1 (Ser334)
#3055/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-AMPKα (Thr172) (40H9)
#2535/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
AMPKα (23A3) #2603/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-Acetil-CoA Carboxylase (Ser79)
#3661/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
fosfo-AKT (Ser473)
#9271/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
fosfo-S6 ribosomal protein (Ser235/236)
#2211/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
fosfo-mTOR (Ser2448)
#2971/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
PTEN (26H9) #9556/Cell Signaling
WB IgG2b ratón
1:1000/1 hora a temperatura
190
Technology ambiente o durante toda la noche a 4ºC
fosfo-Bad (Ser112)
#9296/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
Bad #9292/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
Bim #2819/Cell Signaling Technology
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
DYKDDDDK Tag #2368/Cell Signaling Technology
WB,IP IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
LKB1 (Ley 37D/G6)
sc-32245/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG2b ratón 1:450/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
ERK2 (C-14) sc-154/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG conejo 1:2000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
ERK1/2 (K-23) sc-153/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG conejo 1:2000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
Raf-B (F-7) sc-5284/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG2a ratón
1:200/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
14-3-3β (K-19) sc-629/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG conejo 1:500/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
c-myc (N-262) sc-509/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG conejo 1:150/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
p53 (FL-393) sc-6243/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG conejo 1:200/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
p27 (F-8) sc-1641/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG2b ratón 1:200/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
Bcl-2 (100) sc-509/Santa Cruz Biotechnology, INC
WB IgG2b conejo
1:200/durante toda la noche a 4ºC
Fosfo-Bad A00295/ WB IgG conejo 1:1000/ durante
191
(Ser112) GenScript Corporation
toda la noche a 4ºC
Fosfo-Bad (Ser112)
#9296/Cell Signaling Technology
WB IgG2b ratón
1:1000/ durante toda la noche a 4ºC
c-myc A00704/ GenScript Corporation
WB IgG ratón 1:1000 (Cf=1µg/ml)/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
Flag A00013/ GenScript Corporation
WB IgG1 conejo
1:1000 (Co=1mg/ml, Cf=1µg/ml)/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
Flag M2 F1804/SIGMA WB IgG conejo 1:1000/1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC
Fosfo-CREB (Ser133)
A00267/ GenScript Corporation
WB IgG conejo 1:1000/durante toda la noche a 4ºC
G3PPDH #2275-PC-100/Trevigen
WB IgG conejo 1:5000/1 hora a temperatura ambiente
MCL-1 /DAKO WB IgG conejo 1:150/durante toda la noche a 4ºC
Phospho-AMPKα (Thr172) (40H9)
#2535/Cell Signaling Technology
IP IgG conejo 1:100/durante toda la noche a 4ºC
GST-BindTM resin 70541-3/Novagen IP 25 µl por muestra Flag M2 Affinity Gel
A2220/SIGMA IP 25 µl por muestra
LKB1 (27D10) #3050/Cell Signaling Technology
IP IgG conejo 1:100/durante toda la noche a 4ºC
LKB1 (T-22) sc-133742/Santa Cruz Biotechnology, INC
IP IgG conejo 1:100/durante toda la noche a 4ºC
Protein A/G PLUS-Agorose
sc-2003/Santa Cruz Biotechnology
IP IgG2a i IgG2b de ratón, IgA de conejo, IgG1, IgG2, IgG4 humano, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 de ratón, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c de rata, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 de humano
25 µl por muestra
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
«Esperar és també fer alguna cosa»
Cesare Pavese