شماره پایان نامه : 2732

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی مازندران

دانشکده پزشکی ساری

گروه آموزشی میکروب شناسی و ویروس شناسی

مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد میکروب شناسی پزشکی

عنوان:

مقایسه ی MAMA PCRبا SSCP PCR جهت بررسی مقاومت کروموزومی(یا موتاسیون نقطه ای) علیه سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید در اشرشیا کلای وکلبسیلا پنومونیه

استاد راهنما:

دکتر محمد اهنجان (دانشیارمیکروب شناسی)

استاد مشاور:

دکتر علیرضا رفیعی(استادایمونولوژی)

دانشجو:

بهنام هاشمی

شهریور1395 شماره ثبت:1825

خلاصه فارسی

مقدمه و هدف : افزایش تعداد مقاومت به کوئینولونها در باکتری های اشرشیا کلای و کلبسیلا پنومونیه های جدا شده از ایران علت اصلی نگرانی ها است. موتاسیون در ژن gyrA , parC منجر به تغییر اسید های امیته و مقاومت به فلئوروکینولون ها در باکتری های اشرشیاکلای و کلبسیلا پنومونیه می باشد.هدف ما از این مطالعه تشخیص جهش های قابل توجه از ایزوله های جدا شده به روش MAMA PCR می باشد.

مواد و روشها :ایزوله های جدا شده جمع آوری و تست حساسیت آنتی بیوتیکی معمول به روش دیسک دیفیوژن آگار انجام شد. مقاومت فلوروکینولون با استفاده از آزمون MIC به روش E-test تایید شد. ما از روش MAMA PCR برای تشخیص جهش در ژن هایser83 - asp87) gyrA( و parC(ser80 - glu84) استفاده شد .نتایج بدست امده از روش MAMA PCR برای تایید به طور راندوم تعیین توالی گردید.

یافته ها : از 103 ایزوله جدا شده، 65 نمونه(2/63درصد) اشرشیا کلای و 38 نمونه (8/36 درصد) کلبسیلا پنومونیه بودند.ایزوله های جدا شده با روش MAMA PCR بررسی شدند.در همه نمونه های اشرشیا کلای مقاوم به سیپروفلوکساسین حداقل یک موتاسیون مشاهده گردید.همچنین در همه نمونه های کلبسیلا مقاوم به سیپروفلوکساسین حداقل یک موتاسیون و در 7 نمونه در هر 4 نقطه موتاسیون مشاهده گردید.در حالی که در 5 نمونه حساس به سیپروفلوکساسین هیچ موتاسیونی دیده نشد.

نتیجه: نتایج نشان داد که جهش در gyrA و PARC ارتباط نزدیکی با مقاومت کینولونها دارد. افزایش شیوع مقاومت کینولونها در میان باکتری E.coli و K.penumune جدا شده از ایران نشان می دهد نیاز به برنامه های کنترل عفونت می باشد

کلید واژها: اشرشیا کلای - کلبسیلاپنومونیه- کینولون ها - ماما پی سی ار - مقاومت آنتی بیوتیکی

مقدمه

بیان مساله

اشرشیا کلای وکلبسیلا پنومونیه از اعضای خوانواده ی انترو باکتریاسه می باشد که جزء پاتوژن های فرصت طلب و از عوامل شایع عفونت های بیمارستانی می باشد.اشرشیا کلای اولین پاتوژن کلیدی در عفونت های بیمارستانی می باشد که شایع ترین عامل ایجاد کنند ه عفونت های مجاری ادراری کسب شده از جامعه هم می باشد[1]. بعد از اشرشیا کلای، کلبسیلا شایعترین عامل ایجاد کننده ی عفونت های ادراری در بیماران با سیستم ایمنی تضعیف شده و دارای کاتتر می باشد[2]. عفونت های بیمارستانی ناشی از این باکتری ها اغلب به طور موفقیت امیزی با انتی بیوتیک هایی چون کینو لون ها و بتا لاکتام ها درمان می شوند[1]. از این رو مقاومت انتی بیوتیکی در میان پاتوژن های بیمارستانی دلیل اکثر نگرانی ها است[3-5].کینولون ها از عوامل انتی بیوتیکی وسیع الطیف اند که به طور وسیعی در موارد بالینی استفاده می شود، مقاومت به کینولون ها به طور محسوس در حال افزایش است به طوری که در چین بیش از 50 در صد سویه های بالینی اشرشیا کلای به سیپروفلوکساسین مقاوم شده اند[6].کینولون ها سیستم همانند سازی را هدف قرار میدهند و مکانیسم اثرکینولون ها روی انزیم های DNA ژیراز و توپوایزومراز IVاست[7].اما در دهه ی اخیر مقاومت به فلوروکینولون ها هم از شایع ترین و غیر قابل کنترل ترین عوامل به شمار می اید[8] ..مکانیسم مقاومت کینولون ها به دو صورت کروموزومی و پلاسمیدی گزارش شده است[9].مقاومت کروموزومی شامل 1) انباشتگی موتاسیون در انزیم های هدف کینولون، DNA ژیراز(gyr A,B ) و یا توپوایزومرازIV (parC parE ).2)موتاسیون در ژن پمپ های موجود در باکتری که موجب انباشتگی دارو در داخل باکتری می شود[10]. در این میان موتاسیون در ژن هایparE و gyr B از اهمیت کمتری برخوردار اند[11].موتاسیون در ژن gyrA باعث تغییر Asp-87 وSer-83 گشته و در parC باعث تغییرSer-80 و Glu-84 می گردد[9, 11, 12]. مقاومت علیه فلوروکوئینولون ها از طریق مختلف صورت می گیرد ولی مقاومت سطح بالا توسط موتاسیون کروموزومی روی ژن های parC,gyrA رخ می دهد, همچنین مقاومت به سایر انتی بیوتیک ها همراه فلوروکئینولون ها نیز به طور معمول در اثر موتاسیون کروموزومی کهDNA ژیراز را کد می کند رخ می دهد و کمتر پلاسمید هایی که مقاومت سطح پایین را حمل می کنند عامل این مقاومت ها میباشد[8].اغلب مقاومت های کوئینولون در نمونه های کلینیکی و همچنین اغلب موتاسیون ها در موارد ازمایشگاهی در نتیجه ی موتاسیون در ژن های کروموزومی می باشد[13].به همین دلیل در این مطالعه روی مکانیسم مقاومت از طریق جهش در ژن های کروموزومی بیشتر متمرکز می شویم.موتاسیون کروموزومی ایجاد شده, پروتئین های هدف(DNA ژیراز که به وسیله یgyrAکد می شود وتوپوایزومراز IV که به وسیله ی parC,parE کد می شود) را تغییر می دهند که این پروتئین ها برای همانندسازی و رونویسی ضروری می باشند[14]..به همین دلیل ژن های parC,gyrA را جهت مطالعه در این تحقیق انتخاب کردیم.روشهای مختلفی جهت ردیابی جهش استفاده شده است ، از جمله گرادیانت ژل الکتروفورز دناتوره کننده ، توالی یابی DNA و fluorogenic PCR assay، که این روش ها زمان بر ونیازمند مراحل مختلف و اغلب نیازمند تجهیزات گران بها می باشد که مطالعات روتین را محدود می کند.mis-matched amplification mutatation assy (MAMA PCR) یک تکنیک با حساسیت بالا، اسان و یک نوع PCR سریع می باشد که جهت ردیابی موتاسیون نقطه ای استفاده می شود.که اولین بار توسط Zirnsten تشریح شده است[15].MAMA PCR جهت ردیابی تغییر نوکلئوتیدی 257 C به Tبدون نیاز به توالی یابی DNA استفاده شده است.به طور منطقی در این روش برای رد یابی موتاسیون از پرایمرهای اختصاصی برای توالی DNA تغییر یافته که موجب مقاومت می شود استفاده می شود.که موجب تولید زیاد محصول PCR در ایزوله های مقاوم می شود.به طور تجربی تغییر در انتهای ﹶ3در gyrA کارایی امپلیفیکاسیون را در حدود 70% کاهش می دهد.با این وجود محصول PCR همچنان تولید خواهد شد.استفاده پرایمر سوم کنترل ماما، جهت از بین بردن جهش ایجاد شده و برای ادامه ی امپیلیکاسیون می باشد[16]. روش (SSCP PCR) که بر اساس تکفیک الکتروفورزی، اختلافات تطبیقی در ردیف DNAاست، در سال 1989 توسط اوریتا و همکاران معرفی شد.این روش راحت و نسبتا سریع برای نمونه هایی است که احتمالا دارای موتاسیون هستند. معمولا SSCPبا قطعههای بین 100 تا 300 جفت بازی که به وسیله PCRایجاد میشود به خوبی عمل میکند.اشرشیا کلای و کلبسیلا از شایع ترین عوامل ایجاد کننده ی عفونت ادراری در کشور می باشد. از طرفی مقاومت انتی بیوتیکی در میان پاتوژن های بیمارستانی (اشرشیا و کلبسیلا ) خیلی نگران کننده است 0کینولون ها که سیستم همانند سازی را هدف قرار می دهند و مکانیسم عملشان روی انزیم DNA جیراز و توپوایزومراز IV می باشد.همچنین مقاومت پاتوژن ها به کینولون ها به طور محسوس در حال افزایش است. ما در این مطالعه به دنبال علت اصلی مقاومت به کینولون ها که میتواند ناشی از تغییر در جایگاه هدف (تغییر در زیر واحد A ،DNA جیراز ) و یا از طریق تغییر در زیر واحد parC که انزیم توپوایزومراز IV را کد می کند، باشیم. حال اگر در ژن های gyrAکه انزیم توپوایزومرازII و parC که انزیم توپوایزومراز IV را بیان می کند موتاسیون رخ دهد محصول تولید نخواهد شدو در نتیجه موجب مقاومت به کینولون ها خواهد شد.ما در این مطالعه از مقایسه ی دو تکنیک برای تشخیص جهش درژن های ParC , gyrA در باکتری اشرشیا کلای و کلبسیلا استفاده خواهیم کرد. متداول ترین روش برای تشخیص موتاسیون سکویسینگ می باشد ولی به دلیل هزینه بر بودن زیاد دنبال روش های جایگزین در این مطالعه شدیم.به همین خاطر ما در این مطالعه از دو تکنیک متفاوت برای تشخیص موتاسیون استفاده کردیم که کدام روش برای تشخیص موتاسیون مناسب است. گلد استاندارد ما در این مطالعه سکویسینگ می باشد و بهترین کار برای اینکه به نتیجه ی بهتری برسیم این است که تمام نمونه هایی که ژن مقاومت را دارند تعیین توالی کنیم. و بعد از انجام مراحل کار نتایج بدست امده را نسبت به استاندارد طلایی مقایسه کنیم و در این صورت می توانیم با قطعیت بگوییم که کدام روش بهتر است .ولی این کار خیلی هزینه بر می باشد و بدلیل این کمبود بودجه ی دانشگاه امکان پذیر نمی باشد .لذا ما در این مطالعه بعد از انجام مراحل با هر دو پی سی ار به طور راندوم 10 نمونه را به سکویسینگ می فرستیم و نتایج بدست امده را با هم مقایسه خواهیم کرد.

خانواده انتروباکتریاسه

انتروباکتریاسهها[footnoteRef:1] یا باکتریهای رودهای یکی از گستردهترین و مهمترین خانوادههای باکتریایی محسوب میگردند که در روده انسان و حیوانات زندگی میکنند.در این خانواده، طیف وسیعی از باکتریها وجود دارد که برخی از اعضای خانواده، جزء باکتریهای بسیار پاتوژن محسوب شده و در طول تاریخ بشر ثبت شدهاند نظیر یرسینیا پستیس عامل طاعون، سالمونلاتایفی عامل حصبه. [1: 1 Enterobacteriaceae]

برخی از باکتریهای این خانواده، پاتوژنهای واقعی رودهای محسوب شده و موجب ایجاد اسهال و عوارض رودهای دیگر میگردند. اشریشیا و یرسینیا، به عنوان پاتوژنهای رودهای محسوب میشوند ولی سویهها یا سروتیپهای اندکی از آنها دارای فاکتورهای ویرولانس بوده و قادر به کلونیزاسیون، تولید انتروتوکسین و عفونت دستگاه گوارشی میباشند.بسیاری از اعضای انتروباکتریاسه قادر به ایجاد عفونتهای خارج رودهای بوده و از این نظر حائز اهمیت میباشند و برخی در ارتباط با بیماریهای مزمنی نظیر آرتریت میباشند. برخی اعضای گروه نیز، پاتوژنهای گیاهی و حیوانی میباشند، برخی وابسته به میزبان بوده و غیرقابل کشت میباشند. برخی سخترشد و یا کندرشد میباشند و برخی اعضا نیز ساپروفیت خاک محسوب میشوند.

میکروارگانیسمهای متعلق به این خانواده، به صورت باسیلهای گرم منفی کوچک بوده و فاقد اسپور میباشند. از نظر تحرک، اکثر اعضا دارای فلاژل پریتریش بوده و متحرک میباشند. در اکثر اعضای خانواده، آنتیژن [footnoteRef:2]eca وجود دارد، هوازی و بیهوازی اختیاریاند و بنابراین، قادر به انجام هردو متابولیسم تنفسی و تخمیری میباشند. قادر به تخمیر اکثر قندها بوده و در اغلب موارد، بر اثر تخمیر قندها، گاز تولید مینمایند. تمامی اعضای خانواده، تخمیر گلوکز مثبت، احیای نیترات به نیتریت مثبت، کاتالاز مثبت، اکسیداز و آلژینات منفیاند و محتوای سیتوزین-گوانین موجود در DNA آنها، 50-39% میباشد [17]. [2: 1 Enterobacterial common antigen]

طبقه بندي خانواده انتروبکترياسه بر اساس کتاب Bergey سال 2002 به صورت زير ميباشد:

Phylum BX II: Proteobacteriacea

Class III: Gamma Proteobacteria

Order X II: Enterobacteriales

Family I: Enterobacteriaceae

اشریشیا کلی

اشریشیا جنس تیپیک خانواده انتروباکتریاسه بوده و گونه تیپیک آن، اشریشیا کلی میباشد[18]. اشریشیا کلی متعلق به شاخه پروتئوباکتریها بوده[19] و جدا از اهمیت آن در سلامتی و ایجاد بیماری، پزشکی و میکروبشناسی، از اهمیت فوقالعادهای در امر پیشبرد پژوهشهای مولکولی قرن 20و 21 برخوردار بوده است[20]. تحت شرایط بهینه، سرعت رشد و تقسیم سلولی این باکتریها بسیار بالاست و هر سلول در عرض بیست دقیقه به دو سلول تقسیم میشود[21]. در واقع، به دلیل سهلرشد بودن و سرعت بالای این باکتریها در تقسیم سلولی، کاندیدی مناسب برای مطالعات ژنتیکی، فیزیولوژیکی، متابولیسم، مقاومت آنتیبیوتیکی، اکولوژی، اپیدمیولوژی و واکسن به شمار میآیند[17].

در سال 1885 یک پزشک متخصص آلمانی به نام تئودور اشریش،اشریشیا کلی را به عنوان میکروارگانیسم غالب در فلور نرمال روده افراد سالم معرفی نمود و آن را با عبارت Bacterium coli commune نامگذاری نمود؛ بدین معنی که شایعترین باکتری روده افراد میباشند. باکتری اشریشیا کلی یک باکتری میلهای گرم منفی بوده و تحت شرایط هوازی و بیهوازی (بیهوازی اختیاری) رشد مینماید[20]. این باکتری بر روی محیطهای ساده به خوبی رشد کرده، متحرک است، دارای فلاژلهای پریتریش بوده، تخمیرکننده لاکتوز میباشد، بر روی محیط ائوزین–متیلنبلو آگار (EMB) درخشندگی سبز ایجاد کرده و دارای فعالیت لیزیندکربوکسیلازی میباشد. همچنین استات را به عنوان تنها منبع کربن مصرف کرده و با هیدرولیز تریپتوفان تولید اندول مینماید[22].

اشریشیا کلی به عنوان فلور نرمال دستگاه گوارش پستانداران و پرندگان بوده و بر اساس صفات آنتیژنی نظیر آنتیژن سوماتیک (O)، آنتیژن کپسولی (K)، آنتیژن فیمبریهای (F) و آنتیژن فلاژل (H) که در شکل 1-1 به صورت شماتیک نشان داده شده است،به 150 تا 200 سروتیپ طبقهبندی میگردد[22].

شکل 11 ویژگیهای ساختاری اشریشیا کلی

در حالت کلی میتوان سویههای مختلف اشریشیا کلی را در سه دسته اصلی قرار داد:

1- انواع کومانسال[footnoteRef:3]:برای میزبان خود بیماریزا نبوده و از اعضای فلور طبیعی روده محسوب میگردند. [3: 1Commensal]

2- انواع پاتوژن یا بیماریزا[footnoteRef:4]: فاکتورهای ویرولانس را کسب نموده و قادر به ایجاد بیماری در میزبان خود میباشند. [4: 2Pathogen]

3- انواع بالقوه پاتوژن[footnoteRef:5]: با وجود کسب فاکتورهای ویرولانس، بیماریزا نبوده اما از پتانسیل بیماریزایی برخوردارند[22, 23]. [5: 3Potentially pathogenic]

انواع کومانسال اشریشیا کلی

اشریشیا کلی، میکروارگانیسم اختیاری دستگاه گوارش انسان و سایر حیوانات خونگرم است[24]. و به طور معمول، 40 ساعت پس از تولد در دستگاه گوارش نوزاد کلونیزه میشود. زیستگاه طبیعی انواع کومانسال اشريشيا کلي، لایه مخاطی کلون پستانداران بوده و تا زمانی که عناصر ژنتیکی کدکننده فاکتورهای بیماریزایی را کسب نکرده باشند (شکل 1-2)، به صورت همزیست باقی میمانند[25].

اشريشيا کلي و ساير باکتریهاي فلور رودهاي جانوران، اغلب يک رابطة همزيستي با میزبانهاي خود دارند و به ندرت موجب بروز بیماری در میزبان خود میگردند؛ مگر اینکه میزبان دچار نقص سیستم ایمنی بوده و یا سدهای محافظتی موجود در آنها دستخوش تغییراتی شده باشد. باکتریهای کومانسال اغلب از مواد غذايي بدن میزبان بهره میبرند و در مقابل، در محافظت میزبان در برابر باکتریهای پاتوژنهای دیگر به واسطه جلوگیری از کلونیزاسیون آنها و همچنین در تولید مواد مغذی نظیر ویتامینها و تنظيم سيستم ايمني و نقش دارند. علیرغم اطلاعات وسیعی که در زمینه ژنتیک و فیزیولوژی این باکتری وجود دارد؛ مکانیسم دقیق نحوه همزیستی و رقابت آن با سایر باکتریها کاملا مشخص نشده است اما یکی از نظریات موجود بر این عقیده است که احتمالا توانایی اشريشيا کلي در مصرف گلوکونات موجود در کلون بسیار بیشتر از توانایی سایر باکتریهای مقیم در کلون بوده و این امر موجب میگردد کلون به عنوان آشیانه[footnoteRef:6] بسیار مناسب برای اشريشيا کلي به شمار آید. برخي سويههاي اشريشيا کلي که به عنوان سويههاي بیماریزای اشریشیا کلی میباشند، از زیستگاه طبیعی خود خارج شده و توانايي ايجاد بيماري در میزبان را کسب میکنند(26-27).به این دسته از سویهها، اشريشياکلي بیماریزاي خارج رودهاي ([footnoteRef:7]ExPEC) اطلاقشده و شامل سويههاي اشريشيا کلي مرتبط با مننژيت و اشريشيا کلي مولد عفونت دستگاه ادراری میباشند[26]. [6: 1niche] [7: 2 Extraintestinal Pathogenic Escherishiacoli]

بر اساس اطلاعات موجود، احتمال میرود که فشارهای انتخابی و تکاملی وارد شده به زیستگاه سویههای کومانسال و اکتساب فاکتورهای ژنتیکی متحرک از جمله اینتگرونها، ترانسپوزونها، جزایر پاتوژنیسیته و فاژها میتواند در بروز سویههای بیماریزا و سویههای مقاوم به آنتیبیوتیک نقش داشته باشند[21]. میکروارگانیسمهای متشکل از انواع پاتوژن و غیرپاتوژن باید توان مقاومت در برابر محدودیتهای محیطی را داشته باشند تا امکان بقا و تکثیر داشته باشند و بتوانند به طور موفقیتآمیزی در آشیانهای اکولوژیکی به رقابت بپردازند[27, 28]. انواع کومانسال اشريشيا کليبا کسب شاخصهای ویرولانس مختلف و ایجاد ترکیبات مختلف از فاکتورهای کسبشده در سویههای مختلف، نسبت به زیستگاه خود سازگاری کسب نمودهاند و این عامل موجب شده که توانایی آنها در ایجاد بیماری گسترش یابد. از میان نوترکیبیهای مختلف در فاکتورهای ویرولانس، تنها مواردی که ترکیب فاکتورهای ویرولانس آنها موفقیتآمیز بوده باشد، در باکتریها تثبیت میگردد و موجب تبدیل شدن آنها به اصطلاحا "پاتوتایپها"ی ایجادکننده بیماری میگردد [21, 29]. نتایج تحقیقات مختلف حاکی از آن است که احتمالا انواع پاتوژن اشريشياکلياز سویههای کومانسال روده و متعاقب کسب فاکتورهای ویرولانس مختلف که اکثرا بر روی جزایر پاتوژنیسیته واقع شدهاند، ایجاد شده باشند[30]. در واقع، میتوان به جزایر به دید فسیلهای ژنتیکی نگاه کرد که به یک مرحله خاصی از تکامل پاتوژنها تعلق دارند و انتقال آنها تاثیر عمیقی در تکامل باکتریهای پاتوژن و همچنین سازگاری آنها در طی فرایندهای عفونی حاد داشته است. بدین ترتیب آنالیز جزایر پاتوژنیسیته، دریچه جدیدی را به سمت اطلاع از نحوه تکامل باکتریهای پاتوژن میگشاید و با اصول تکاملی پروکاریوتها در ارتباط است[27].

انواع پاتوژن اشریشیا کلی

علیرغم اینکه اشریشیا کلی به عنوان باکتری کومانسال بدن انسان و حیواناتمختلف مطرح است، اما سویههای پاتوژن (بیماریزا) قابلیت ایجاد بیماریهای کشنده در انسان، پستانداران و پرندگان را دارند. بیماریزایی مرتبط با آنها در انسان به واسطه مسیر مدفوعی-دهانی بوده و میتواند مشکلات بهداشت عمومی جدی را در کشورهای درحال توسعه موجب گردد[29, 31].

سویههای پاتوژن اشریشیا کلی شامل دو گروه پاتوژنهای رودهای مولد اسهال که بیشترین موارد عفونتهای رودهای ایجاد شده توسط آنها در کودکان دیده میشود و سویههای اشریشیا کلیخارج رودهای عامل عفونتهای دستگاه ادراری، مننژیت و سپتیسمی در انسان و حیوانات مختلف میباشند[21](21). به طور کلی سه سندرم بالینی متفاوت توسط پاتوتایپهای مختلف اشریشیا کلی ایجاد میشود: بیماریهای رودهای- اسهالی، عفونتهای دستگاه ادراری، سپسیس و مننژیت[22, 32].

به سویههای مولد بیماریهای رودهای و اسهال به اختصار، DEC اطلاق میگردد.

سویههای مولد عفونتهای خارجرودهای را در حالت کلی ExPEC مینامند که خود در دو دسته باکتریهای مولد عفونتهای ادراری و همچنین باکتریهای مولد مننژیت و سپتیسمی طبقهبندی میگردند[21, 33].

در پاتوتیپهای مختلف DEC، مکانیسمهای متنوعی به منظور استقرار عفونت در میزبان توسعه یافته است و هر یک از پاتوتیپها از پتانسیل بیماریزایی متفاوتی برخوردارند. بر پایه خصوصیات بیماریزایی و فنوتیپی، میتوان سویههای DEC را در شش پاتوتیپ مختلف گروه بندی نمود[34] :

شماره پایان نامه : 2733

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی مازندران

دانشکده پزشکی ساری

گروه آموزشی بیوشیمی، بیوفیزیک و ژنتیک

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی

عنوان:

کلونینگ و بیان فیوژن پروتئین Anti CD22-single-chain fv-Apoptin درمیزبان اشرشیا کلی

اساتید راهنما:

دکتر وحید خلج (دانشیار بیوتکنولوژی پزشکی)

دکتر مهریار زرگری( دانشیار بیوشیمی بالینی)

دانشجو:

درسا خراسانی زاده

آذر 1395 شماره ثبت:1841

خلاصه فارسی

تا به امروز داروهای مختلف و متنوع بسیاری در زمینه سرطان کشف شده است که هدف بیشتراین داروها نیز کاهش عوارض جانبی می باشند،. یکی ازاین سری داروها ایمونوتوکسین ها هستند.ایمونوتوکسین ها تشکیل شده اند از قطعه ای از آنتی بادی که به یک توکسین متصل گشته است. بخش آنتی بادی باعث ورود پروتئین به سلول و بخش توکسین موجب از بین رفتن آن می گردد.آنتی بادی مونوکلونال, CD22،CD22را هدف قرار می دهدکه از بیشترین آنتی ژن های درون سلول رونده در سطح لنفوسیت های B می باشد و به همین دلیل نیز به عنوان یکی از مولکول های کاندیدایمونوتراپی در بدخیمی هایی با منشا B.cell انتخاب شده است. در این پایان نامه پروتئینی با دو عملکرد را تهیه کردیم که به صورت antiCd22-scfv-apoptin طراحی شده و انتظار داریم قادر به انجام هر دو عمل اتصال اختصاصی به سلول و کشتن آن از طریق فیوژ آپوپتین "مولکول القاکننده اختصاصی آپوپتوز در تومور سل ها"به انتهای انسانی شده باشد. ژن antiCD22-scfv-apoptin با موفقیت بداخل وکتورPET28a کلون گردید. فیوژن پروتئین در باکتری اشرشیا کلی بیان گردید و همچنین تست هایSDS-PAGE و وسترن بلات صحت بیان پروتئین نوترکیب را مورد تائید قرار دادند. مطالعات بیشتری مبنی بر فعال بودن پروتئین نوترکیب و سپس ارزیابی اثر ضد سرطانی این پروتئین نوترکیب در دست اقدام می باشد.

مقدمه

سرطان

سرطان مهمترین عامل مرگ ومیر در کشورهای توسعه یافته می باشد.(1) سرطان مجموعه ای است از 277 نوع بیماری که در آن تعدادی از سلول ها به طور بی رویه رشد و تکثیر می نمایند و به مرورنیز باعث از بین رفتن سلولهای نرمال اطرافشان می شوند.بر اساس گزارش انجمن سرطان آمریکا در سال 2015، 1.658.370 مورد جدید سرطان ثبت شده که از این تعداد%35.5 فوت شده اند.در ایران طبق مطالعات انجام گرفته در چندین استان، سرطان بعد از بیماری های قلبی و عروقی مقام دوم مرگ و میررا در بین عوامل غیر جرحی به خود اختصاص می دهد.(2)

تا چندی پیش در پروسه درمانی بیماری های سرطانی، تنها از سه طریق متداول جراحی،اشعه درمانی و شیمی درمانی استفاده می شد، اما درطی 25 سال گذشته روش ایمونوتراپی(بکارگیری سیستم ایمنی در درمان بیماریها از جمله سرطان) نیز به روش های درمانی پیشین اضافه گردیده است.(3)

آنتی بادی

آنتی بادیها برای اولین بار در سال 1880 توصیف شدند و در آن زمان کاربردی در درمان سرطان نداشتند.در سالهای اخیر آنتی بادیهای مونوکلونال و ترکیبات وابسته، نظیر کونژوگه ها، فیوژنها و قطعات حاصل از آنها، بخش اعظم پروتئینهای نوترکیب دارویی را تشکیل می دهند که تحت مطالعات بالینی هستند.(4) اولین باردر سال 1975 Kohler $ Milstein با استفاده از تکنولوژی هیبریدوما(ترکیب سلول های سرطانی میلوما کشت داده شده با سلول های لنفوسیت B سالم دریافت شده از موش ) موفق به تولید آنتی بادی های مونوکلونال شدند.(5) از آن زمان تا به امروزاز این دسته ترکیبات، نه تنها به عنوان ابزاری جهت انجام تحقیقات بنیادی بلکه به طور گسترده ای در تشخیص و درمان بسیاری از بیماریها استفاده می شود. اولین آنتی بادی مونوکلونال به نام OKT3 در سال 1986، بیش از یک دهه پس از کشف تکنولوژی هیبریدوما به منظور درمان رد پیوند توسط FDA(اداره موادغذایی و دارویی آمریکا) مورد تائید قرار گرفت.(6) (7)در سال 1997،FDA کاربرد اولین آنتی بادی مونوکلونال ضد تومور به نام Rituximab(Anti CD20) را، جهت درمان نوعی از سرطان هماتولوژیک (لنفوم بورکیت ) تائید نمود. امروزه با تحولات گسترده ای که در زمینه مهندسی ژنتیک رخ داده است، روند تولید آنتی بادی های مونوکلونال با سرعت بیشتری پیش می رود به طوریکه تا به امروز FDA کاربرد بیش از 28 نوع آنتی بادی مونوکلونال را تائید کرده است.(8)

درسال های اخیر،قطعات نوترکیب حاصل از آنتی بادی های مونوکلونال نظیرFab,(Fab)2,scfv و یا سایر گونه های مهندسی شده،در مصارف بالینی جایگزین آنتی بادی های کامل شده وکاربرد گسترده ای در تشخیص و درمان سرطان، بیماری های اتوایمیون و عفونی پیدا کرده اند که علت این مسئله را می توان در موارد زیر جویا شد.(9)

کارایی درمانی یک آنتی بادی ، جدا از ویژگی اتصال و فعالیت عملکردی ، تا حد زیادی به ویژگی های فارماکوکینیتیکی و توزیع زیستی آن نیز وابسته است برای مثال در بافت های توموری به دلیل اختلالاتی که در سیستم عروق خونی و لنفاوی ایجاد می شود، فشار هیدروستاتیک افزایش می یابد و در نتیجه توانای آنتی بادی برای انتشار از عروق به درون تومور کاهش می یابد، بنابراین یک آنتی بادی کامل با جرم مولکولی 150 کیلو دالتون نفوذ بسیار ضعیفی بدرون تومورهای سرطانی خواهد داشت. Schlom(10) و همکارانش در سال 1992 نفوذ بافتی فرم های آنتی بادی را با یکدیگر مقایسه کردند و نشان دادند که scfv بیشترین نفوذ را به نسبت سایر فرم ها دارد.(11) همچنین وجود ناحیه Fcدرآنتی بادی های کامل و اتصالشان به رسپتور های FcRn سرعت کلیرانس آن رااز جریان خون به شدت کاهش داده و در نتیجه توزیع زیستی آنرا تحت تاثیر قرار می دهد.از طرفی دیگردر مورد آنتی بادی های حامل(آنتی بادی های حمل کننده دارو،توکسین و...) وجود ناحیه Fc موجب فعال سازی نامناسب سلول های دارای رسپتور Fc و در نتیجه افزایش فاگوسیتوز ذره حامل دارو،آزادسازی سیتوکینها ومحصولات سمی وبروز اثرات توکسیک مربوطه خواهد شد. فرم کامل آنتی بادی بدلیل ماندگاری طولانی درجریان خون،گزینه مناسبی جهت رادیوتراپی و تصویربرداری اشعه ای نمی باشد چرا که به علت دوام زیاد در خون، سایر ارگان های نرمال و حساس نظیر مغزاستخوان و سلول های طبیعی دارای رسپتورهای Fc را نیزتحت تاثیر قرار خواهد داد.(12)

بنابراین در داروسازی هدفمند که تنها به ویژگی اتصال آنتی ژن به آنتی بادی نیازمندیم و وجود ناحیه Fc در آنتی بادی کامل موجب بروز پاسخ های التهابی نابجا خواهد شد،استفاده از قطعات آنتی بادی با ایمونوژنیسیتی کمتر ترجیح دارد،که دراین بین scfv یکی از معروفترین و متداولترین قطعات حاصل از آنتی بادی است.

Scfv (Single Chaine Fragment Variable)

Scfv (single chain fragment variable) با وزن مولکولی بین 26 تا 28 کیلو دالتون،از یک ناحیه متغیر زنجیره سنگین و یک ناحیه متغیر زنجیره سبک تشکیل شده است ( این نواحی متغیربه هر دو صورت VH-VL وVL-VH به یکدیگر متصل می شوند) که توسط یک لینکر به هم متصل شده اند. لینکر یک زنجیره پپتیدی هیدروفیل و قابل انعطاف است که تعداد اسید آمینه های آن از 10 تا 25 عدد متغیر است.طول لینکر و اسید آمینه های تشکیل دهنده آن در بهبود کارایی فولدینگ این پروتئین بسیار حیاتی است .لینکر های متداول معمولا nm3.5 طول دارند ولازم است که دارای رزیدوهای هیدروفیلیک همراه با توالی SerوGly، جهت انعطاف پذیری باشند.رایجترین لینکرمورد استفادهGly4Ser)3) می باشد.(13)

اولین قطعه scfv در سال 1988 توسط HustonوBird وهمکارانشان،از یک رده سلولی هیبریدومای موشی تهیه شد.(14) هنگامیکه scfv از ژن های ناحیه متغیر آنتی بادی،ازیک لاین سلولی هیبریدوما تهیه می شود همواره کاهشی در افینیتی scfv نسبت به آنتی بادی اصلی مشاهده می شود.این میزان افت افینیتی نتیجه کاهش در ظرفیت اتصال(تعداد جایگاه اتصال) می باشد.بنابراین انجام پروسه های بلوغ افینیتی به منطور بهبود تمایل اتصال به آنتی ژن و در نتیجه کاهش دوزهای مصرفی از آنتی بادی درمانی و کاهش توکسیسیتی از ضروری ترین مهندسی های صورت گرفته برscfv محسوب می شود. به منظور بلوغ افینیتی،کتابخانه های ژنی بزرگی از نواحی متغیر موتاسیون یافته ایجاد می شود و در مرحله بعد گونه های با افینیتی بالاتر با روش های مختلف نمایش ژنی نظیر نمایش فاژی-ریبوزومی و یا مخمری انتخاب می شوند.

این کتابخانه های بزرگ ژنی از طریق موتاسیون رندوم CDR ، Chain shuffling، error prone PCR وDNA shuffling ایجاد می شود.

علاوه بر موارد ذکر شده در بالاسهولت تولید scfv نسبت به آنتی بادی کامل و عدم نیاز به سیستم های بیانی پیچیده نظیر سلول های mammalian، از دیگر مزایای کاربرد scfv نسبت به آنتی بادی کامل محسوب می شوند.(15) همه عوامل به اضافه مقرون به صرفه بودن تولید این دسته از ترکیبات،سبب گردیده تا استراتژی تولید scfv به یکی از مهمترین مهندسی های انجام شده بر آنتی بادی تبدیل شود.

در دهه اخیر درمان اختصاصی سلول های توموری به منظور جلوگیری از بروزعوارض ناشی از شیمی درمانی بر روی سلول های سالم بدن مورد توجه زیادی قرار گرفته است. اگرچه که شیمی درمانی همچنان در بسیاری از انواع سرطان ها به عنوان درمان انتخابی شناخته شده است اما امید بر آن است که در آینده ای نزدیک درمان هدفمند جایگزین شیمی درمانی گردد.یکی ازمهمترین رویکرد ها در جهت افزایش اختصاصیت درمان سلولهای تومور،شناسایی اهداف درمانی است که میزان آنها در سلول های بدخیم با سلول های نرمال متفاوت است،از جمله این اهداف می توان به آنتی ژنهای اختصاصی سطح سلول ها اشاره کرد که در مواردبدخیمی افزایش بیان داشته و از این جهت قابل تمیز دادن از سلول های نرمال می باشند.

CD22

CD22 یک آنتی ژن اختصاصی لنفوسیت B است با وزن KDa135 که درمرحله ای از تمایزکه بیان IgD برسطح B cell آغاز می گردد، پس از ناپدید شدن شاخص CD10 درسطح لنفوسیت های B ظاهر می گردد. این آنتی ژن یک سیالوگلیکوپروتئین غشایی نوع I است که به صورت ترانس ممبرن در سطح غشا سلولی قرار دارد.این پروتئین متعلق به خانواده Sialic acid-binding immunoglubolin-like lectin(siglecs)،که شامل مجموعه ای از رسپتورهای چسبنده درسطح سلول های خونی است،می باشد.CD22 متشکل از هفت ناحیه خارج سلولی شبه ایمونوگلوبولینی،یک ناحیه ترانس ممبران و یک دم سیتوپلاسمی 141 آمینواسیدی است.ناحیه داخل سلولی CD22 حاوی 6 تیروزین است که سه تا از آنها متعلق به توالی های ITIM می باشد.اگرچه که CD22 یک لکتین سطحی متصل شونده به اسید سیالیک محسوب می شود اما لیگاند طبیعی آن به خوبی شناخته نشده و در ارتباط با عملکرد این پروتئین هنوز اطلاعات دقیقی در دسترس نمی باشد با این حال شواهدی مبنی برنقش تنظیمی این پروتئین از طریق رسپتورهای سلول B(BCR) درعملکرد صحیح و کنترل حیات سلولی لنفوسیت B وجود دارد.(16)

بیان این مارکر سطح سلولی در NHL(Non-Hodgkin’s Lymphoma، hairy cell leukemia،%80 از موارد(DLBCL) diffuse large B cell lymphoma و%70 از موارد follicle center cell lymphoma افزایش می یابد.

بسیاری از بیماران مبتلا به لوکمیا به درمانهای اولیه با داروهای شیمی درمانی پاسخ مثبت می دهند اما عود بیماری بسیار رایج است، علاوه بر اینکه کارایی شیمی درمانی نیز به واسطه توکسیسیته آن محدود می باشد.(17)

با استفاده از آنتی بادی بر علیه مارکرCD22 درمان بیماران مبتلا به لوکمیا با عوارض کمتروموفقیت بیشتر انجام می شود.

CD22 بر لنفوسیتهای ناحیه فولیکول (اولیه و ثانویه) و سلولهای ناحیه حاشیه ای (marginal) بیان می شود. اما زمانیکه لنفوسیتها به دنبال ورود به مرکز زایگر(germinal center) فعال شوند، سطح بیان آن کاهش می یابد. بنابراین از آنجایی که سلولهای پیش ساز لنفوسیت B و پلاسما سل CD22 - هستند، با کمک آنتی بادی بر علیه مارکر CD22 می توان سلولهای لنفومیایی یا لوکمیایی CD22 + را هدف قرار داد، بدون اینکه سلولهای پیش ساز تحت تأثیر قرار گیرند و تولید آنتی بادی توسط پلاسماسل ها مختل شود.(18) برخی از آنتی بادی های درمانی پس از اتصال به آنتی ژن سطحی، داخل سلول می شوند (Internalizing)، این دسته از آنتی بادی ها نسبت به آنتی بادی های متصل شونده به مارکرهای Non-internalizing، گزینه مناسب تری جهت دارو رسانی هدفمند می باشند، چرا که داخل شدن کونژوگه ها جهت ارائه توکسین ها، داروها، آنزیم ها و سایر عوامل توکسیک یک ضرورت اساسی محسوب می شود. CD22 یک آنتی ژن internalizing با نیمه عمر پایه 8 ساعت است که به دنبال اتصال به لیگاند یا آنتی بادی نیمه عمر آن به کمتر از 1 ساعت کاهش می یابد. CD22 یک پروتئین ترانس ممبران است که از سلول ترشح نمی شود. این ویژگی یکی از مهمترین مزایای CD22 بر CD20 محسوب می شود؛ چرا که از این طریق از اتصال منبع عظیمی از آنتی ژنها در پلاسما به آنتی بادی، بدون هیچ اثر درمانی، اجتناب می شود و بخش اصلی آنتی بادی مصرف شده به سلول هدف متصل می شود.

علاوه بر این، عدم تشکیل کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی در پلاسما، سبب مهار راه اندازی آبشار سیستم کمپلمان و آسیب به سلولهای غیر هدف می گردد.(19)

یکی از مهمترین زمینه های تحقیقاتی در زمینه تولید ملکولهای کونژوگه با آنتی بادیها، تولید ایمنوتوکسین ها می باشد. ایمنوتوکسین ها ملکول های دو جزئی هستند که شامل یک جزء اتصالی (آنتی بادی و قطعات آنتی بادی) و جزء عملکردی که معمولا یک توکسین باکتریایی(توکسین باکتری سودوموناس آئروژینوزا وکورینه باکتریوم دیفتریه) و یا توکسین گیاهی(ریسین) است. می باشند. از دیگر پروتئین ها که توکسین نمی باشد ولی می توان بصورت کونژوگه با آنتی بادی ها و یا قطعات آنتی بادی ها استفاده کرد آپوپتین است که این پروتئین با القای آپوپتوز باعث مرگ سلولی می شود.تاکنون مطالعات مختلفی روی خاصیت ضد سرطانی این مولکول انجام شده است وهمچنین تحقیقاتی بر روی انواع روش های ورود آپوپتین، چه به صورت توالی DNA پلاسمیدی و چه به صورت پروتئین به داخل سلول سرطانی شده صورت گرفته است.(20)

آپوپتین

آپوپتین یک پروتئین القاء کننده آپوپتوزمی باشد که اولین بار در سال 1991 درCAV (Chicken Anemia Virus) شناسایی شد.

CAV یک Single minus stranded circular DNA virus است که باعث ایجاد آنمی شدید در مرغ های جوان (در دوره تخم گذاری) می شود. این ویروس سلولهای هماتوپوئتیک مغز استخوان و پیش سازهای T-Cell در تیموس را هدف قرار می دهد. ژنوم CAV یک RNA پلی سسیترونی تولید می کند که منجر به تولید سه پروتئین می شود:

شماره پایان نامه : 2734

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی مازندران

دانشکده پزشکی ساری

گروه آموزشی بیوشیمی-بیوفیزیک و ژنتیک

مرکز تحقیقات ژنتیک ایمنی

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد بیوشیمی بالینی

عنوان:

مقایسه ی نتایج روش های سنجش گلیکوژن با و بدون هموژناسیون در کبد و عضله

استاد راهنما:

دکتر مهدی رسولی(استاد بیوشیمی بالینی)

دانشجو:

نسترن مجیبی

دی ماه 1395 شماره ثبت: 2058

خلاصه فارسی

مقایسه ی نتایج روش های سنجش گلیکوژن با و بدون هموژناسیون در کبد و عضله

زمینه: استخراج گلیکوژن از بافت توسط اسید پرکلریک سرد به دو صورت با هموژناسیون و بدون هموژناسیون انجام می گیرد.در این مطالعه سه روش استخراج گلیکوژن از کبد در دو حالت گرسنگی-سیری و عضله رت در دو حالت استراحت-فعالیت بدنی با یکدیگر مقایسه شدند.این سه روش استخراج عبارتند از روش هموژناسیون،روش تفکیک گلیکوژن کل و روش بدون هموژناسیون.

روش کار: دو گروه پنج تایی رت نر در دو حالت استراحت،45 دقیقه فعالیت بدنی و دو گروه پنج تایی دیگر در دو حالت سیری، 15 ساعت گرسنگی قرار داده شدند.گلیکوژن عضله و کبد آنها توسط سه روش مذکور استخراج و اندازه گیری شد.

نتایج: نتایج حاصل از استخراج گلیکوژن به روش هموژناسیون نشان می دهد که پس از 15 ساعت گرسنگی،مقدار گلیکوژن کل کبد بطور معنی داری کاهش یافته (36.4 1.9 vs. 27.7 2.5, P=0.01) همچنین کاهش معنی داری در فراکسیونASG (گلیکوژن محلول در اسید) مشاهده شد32.0 1.1 vs. 22.7 2.5, P=0.01)) درحالیکه درفراکسیون AIG (گلیکوژن نامحلول در اسید) تغییر معنی داری دیده نشد (4.9 0.9 vs. 4.6 0.3, P=0.7). نتایج حاصل از استخراج به روش تفکیک گلیکوژن کل مشابه روش هموژناسیون بود. اما نتایج حاصل از استخراج به روش بدون هموژناسیون نشان دهنده ی کاهش معنی دار در هردو فراکسیون ASG 24.4 2.6 vs. 16.7 0.4, P<0.05)) وAIG (8.7 0.8 vs. 7.1 0.3, P=0.06) می باشد.

نتایج حاصل از استخراج گلیکوژن به روش هموژناسیون نشان می دهد که پس از 45 دقیقه فعالیت بدنی، مقدار گلیکوژن کل عضله بطور معنی داری کاهش یافته( (1.92 0.09 vs. 1.20 0.08, P<0.001علاوه براین، فراکسیون ASG بطور معنی داری کاهش یافت (1.38 0.06 vs. 0.70 0.15, P=0.01).درحالیکه در فراکسیون AIG تغییر معنی داری دیده نشد (0.57 0.06 vs. 0.48 0.14, P=0.36).

نتایج حاصل ازروش تفکیک گلیکوژن کل نیز مشابه روش هموژناسیون بود اما در روش بدون هموژناسیون تغییرات هر دو فراکسیونASG (0.68 0.10 vs. 0.42 0.14, P<0.05) و (AIG (1.33 0.05 vs. 0.66 0.18, P<0.01 معنی دار بود.

نتیجه گیری: نتایج حاصل از دو روش استخراج با هموژناسیون و تفکیک گلیکوژن کل مشابه یکدیگر و متفاوت با روش بدون هموژناسیون می باشد.در عضله فراکسیون asg بخش زیادی از گلیکوژن کل را تشکیل داده و فرم متابولیکی فعال گلیکوژن می باشد.اشکال روش بدون هموژناسیون در عدم وجود استخراج دوباره است که موجب از دست رفتن بخشی از فراکسیون asg می گردد.

مقدمه

مقدمه

گلوکز- گلیکوژن

مونوساکاریدها به عنوان ساده ترین شکل کربوهیدرات ها، آلدئید یا کتون هایی با دو یا چند گروه هیدوکسیل هستند، مونوساکاریدهای شش کربنه گلوکز و فروکتوز پنج گروه هیدروکسیل دارند. اتم های کربنی که به آنها گروههای هیدروکسیل اتصال می یابند، اغلب مراکز کایرالی هستند که منجر به ایجاد ایزومرهای فضایی قندی متعدد موجود در طبیعت می شوند. منوساکاریدها ترکیبات جامد کریستالی بی رنگی هستند که به راحتی در آب حل می شوند ولی در حلال های غیرقطبی نامحلول می باشند. اسکلت منوساکاریدهای معمول را زنجیرهای کربنی غیرمنشعبی تشکیل می دهند که تمامی اتم های آن دارای پیوند یگانه هستند. درشکل زنجیر باز، یکی از اتمهای کربن با پیوند دوگانه به یک اتم اکسیژن اتصال یافته و ایجاد یک گروه کربونیل می کند. سایر اتمهای کربن دارای یک گروه هیدروکسیل می باشند. در صورتی که این گروه کربونیل در انتهای زنجیر کربنی باشد منوساکارید یک آلدوز و در صورتی که در موقعیت دیگری قرار داشته باشد، قند یک کتوز خواهد بود. گلوکز یک آلدوز می باشد. در بسیاری از موجودات زنده، گلوکز اضافی برای ذخیره سازی به اشکال مختلفی تبدیل می شود. گلیکوژن مهمترین فرم ذخیره انرژی در مهره داران می باشد. در مهره داران گلیکوژن اساسا در کبد و عضله یافت می شود. گلیکوژن ممکن است تا ۱۰% وزن کبد و ۱-۲% وزن عضلات را تشکیل دهد. اگر همین مقدار زیاد گلوکز در داخل سیتوزول یک سلول کبدی حل می شد، غلظت آن به 4 M رسیده و اثر قابل توجهی بر فشار اسموتیک سلولی می گذاشت. گلوکز در هنگام ذخیره سازی به صورت یک پلیمر بلند (گلیکوژن) در می آید. در واقع گلیکوژن یک پلیمر منشعب شده گلوکزی می باشد. ذره اصلی گلیکوژن، ذرهβ، حدود 21 nm قطر دارد و حاوی ۴۲۰۰-۵۵۰۰ ریشه گلوکز با حدود ۲۰۰۰ انتهای غیر احیا کننده می باشد(1, 2). گلیکوژن کبدی به عنوان یک ماکرومولکول با وزن مولکولی بالا شهرت یافته است. گلیکوژن در حقیقت از نظر ساختار و متابولیکی هتروژن است و از نظر جایگاه سلولی در سیتوزول و لیزوزوم قرار دارد (گلیکوژن در داخل گرانولهای سیتوزولی بزرگی ذخیره می شود). دو فرم گلیکوژن از نظر محتوای پروتئینی و وزن مولکولی با هم فرق دارند(3).

عملکرد و نقش گلیکوژن

گلیکوژن ذخیره فوری انرژی در بیشتر بافت ها به ویژه کبد، عضله اسکلتی و سیستم عصبی است. محتوای گلیکوژن عضله و مغز به مراتب کمتر از کبد است. به طوری که غلظت گلیکوژن در کبد، عضله و مغز به ترتیب ۱:۱:۱۰۰ گزارش شده است. محتوای گلیکوژن بافت کبد تابع وضعیت تغذیه ای، حالت هورمونی و متابولیک و شرایط مختلف فیزیولوژیک است. غلظت گلیکوژن در سلول کبد رت ناشتا حدود 1-5 mg/g liver یا 0.1%-0.5% گزارش شده است، ولی با صرف غذا سریعا با سرعت 10 mg/g liver.h افزایش می یابد(4). گلیکوژن کبدی یک ذخیره گلوکز برای سایر بافت ها در هنگام عدم دسترسی به گلوکز غذایی می باشد. این منبع به خصوص برای سلول های عصبی مغز مهم می باشد که نمی توانند از اسید چرب به عنوان سوخت استفاده کنند. گلیکوژن کبدی می تواند ظرف ۱۲ تا ۲۴ ساعت تخلیه شود. گلیکوژن عضلانی یک منبع سریع انرژی برای متابولیسم هوازی یا بی هوازی است. با فعالیت شدید، گلیکوژن عضلانی می تواند ظرف یکساعت به اتمام برسد(5).

به خاطر حجم بیشتر عضلات بدن، محتوای گلیکوژن عضلات در کل سه تا چهار برابر کبد است. گلیکوژن در عضله به عنوان یک منبع گلوکز برای فعالیت عضله محسوب می شود، در صورتیکه در کبد گلیکوژن در تنظیم سطح گلوکز خون با افزایش سریع گلوکز بعد از صرف غذا و آزاد شدن آن بین وعده های غذایی ایفای نقش می کند. علاوه بر آن گلیکوژن در قلب، بافت چربی، جفت و گلبول قرمز به مقدار کم یافت میشود(5, 6) .

ساختمان گلیکوژن

برای اولین بار فیزیولوژیست فرانسوی Claude Bernard موفق به شناسایی ماده ای شبیه نشاسته در کبد و عضله اسکلتی شد. او این ماده را گلیکوژن، به معنای سازنده ی قند، نامید. از نظر ساختار، گلیکوژن مانند آمیلوپکتین در نشاسته، دارای گلوکزهایی با پیوند α1,4 گلیکوزیدی در زنجیره اصلی و α1,6 گلیکوزیدی در محل انشعاب می باشد (شکل 1-1). از تفاوت های ساختاری گلیکوژن با نشاسته میتوان به تعداد انشعابات بیشتر در گلیکوژن اشاره کرد .تعداد این انشعابات در گلیکوژن تقریبا یکی به ازای هر ده گلوکزمی باشد.(7)

گلیکوژن کبد و عضله دارای سه سطح ساختاری می باشد:

1.واحد های گلوکزی که با پیوند 4 α 1 بصورت خطی به یکدیگر متصلند.

2.زنجیره های خطی که در محل انشعاب با پیوند α 1 6 ، ذره ی بسیار منشعب β را به قطر تقریبی20 nm ایجاد می کنند.

3.از اجتماع این ذرات β، ذره ی بزرگتری به نام α به قطر تقریبی 200 nm ایجاد می شود(8) (شکل 1-2)

شکل 11: نمای شماتیک از اتصالات گلوکز در ساختار گلیکوژن

شکل 12: میکروگراف الکترونی از ساختار ذرات آلفا و بتا گلیکوژن عضله اسکلتی رت، در میکروسکوپ الکترونی

تئوری مدل ساختاری گلیکوژن

مدل فرضی گلیکوژن توسط GoldSmith در سال۱۹۸۲ پیشنهاد شد. بر مبنای این مدل، مولکول گلیکوژن بر روی یک هسته پروتئینی به همراه تقریبا ۴۲۰۰ - ۵۵۰۰ زنجیره گلوکزی با طول متوسط۱۲ - ۱۴ واحد گلوکز در هر زنجیره ساخته شده است و تعداد زنجیره ها در هر لایه با ضریب۲ افزایش می یابد(9, 10). این پلیمر کروی شکل به قطر تقریبی21 nm می باشد. در این مولکول زنجیره های گلوکوزیدی ممکن است شاخه دار یا بدون شاخه باشند که به صورت۱۲ لایه هم مرکز بر روی یکدیگر قرار گرفته اند. زنجیره های شاخه دار بیشتر در لایه های داخلی و زنجیره های بدون شاخه در لایه های خارجی قرار گرفته اند (شکل 1-3) .

بعد از۱۲ لایه، تراکم سطحی زنجیره ها افزایش یافته و شاخه سازی به طور خودکار (خود- محدودکننده) متوقف می شود. مزیت ساختار شاخه دار گلیکوژن نسبت به ساختار بی شاخه در چند نکته بیان می شود : ساختار شاخه دار دارای ساختار متراکم تری است و به علت افزایش تعداد انتهاها که جایگاه فعال سنتاز و فسفریلاز محسوب می شوند، سرعت سنتز و تجزیه گلیکوژن افزایش مى یابد. به علاوه تعداد شاخه های گلیکوژن با میزان حلالیت آن مرتبط است و باعث افزایش حلالیت می شود (11).

(الف) (ب)

شکل 13: الف: مدل فرضی گلیکوژن توسطGoldSmith

ب: نمای شماتیک از ساختار لایه ای گلیکوژن

گلیکوژنین

هسته ی پروتئینی گلیکوژن که گلیکوژنین نام دارد در سال 1985 در کمپلکس آنزیمی گلیکوژن سنتازعضله اسکلتی خرگوش شناسایی شد. این کمپلکس آنزیمی دارای دو زیرواحد 86 kD و 38 kD به نسبت مولی 1:1 می باشد. به کمک کروماتوگرافی زیرواحد کوچک از زیرواحد کاتالیتیک 86 kD جدا شد. تعیین توالی پپتیدهای زیرواحد 38 kDنشان داد که این مولکول، همان گلیکوژنین است که به عنوان پرایمر در سنتز دنوو (از ابتدا) گلیکوژن نقش دارد (12).

گلیکوژنین نه تنها به عنوان پایه پروتئینی در ساختار گلیکوژن بلکه به عنوان یک آنزیم با توانایی اتوگلیکوزیلاسیون شناخته شده و در گروه هگزوسیل ترانسفرازها طبقه بندی می گردد. هر مولکول گلیکوژن حاوی یک پروتئین گلیکوژنین است (13).

در عدم حضور گلیکوژن،گلیکوژنین و گلیکوژن سنتاز بصورت یک کمپلکس پروتئینی درکنار هم قرار می گیرند. سپس گلیکوژنین با فعالیت اتوگلیکوزیلاسیونی خود یک ریشه گلوکز را به این کمپلکس متصل می کند این باعث فعال شدن خاصیت اتوکاتالیزوری این مولکول می گردد. با عملکرد اتوکاتالیزوری گلیکوژنین، یک اولیگوساکارید بوجود می آید که به عنوان پرایمر سنتز گلیکوژن وارد عمل می شود. طول اولیگوساکارید ایجاد شده به عنوان پرایمر در عملکرد آنزیم گلیکوژن سنتاز مهم است. طول این اولیگوساکارید 7-8 ریشه گلوکز می باشد (14-16) (شکل 1-4).

شکل 14: اتصال اولین گلوکز به گلیکوژنین طی فرایند self-glycosilating، اتصال ۷گلوکز بعدی با فعالیت اتوکاتالیک این مولکول رخ می دهد.

ویژگی های گلیکوژنین

گلیکوژنین یک مولکول خود- گلیکوزیله کننده است و به عنوان پرایمر با فعالیت گلیکوزیل ترانسفرازی در سنتز گلیکوژن نقش دارد. مقدار گلیکوژنین، مقدار ذخیره گلیکوژن سلولی را تحت تاثیر قرار می دهد. گلیکوژنین توانایی گلیکوزیله کردن خود و دیگر مولکول ها و همچنین توانایی هیدرولیز واحدهای UDP-Glucose را دارد. این توانایی مستقل از فرایند اتوگلیکوزیلاسیون این مولکول می باشد و پس از اتمام عمل پرایمری همچنان پتانسیل کاتالیتیکی خود را حفظ می کند (17, 18).

روند اتوگلیکوزیلاسیون گلیکوژنین

طی مطالعاتی که در سالهای ۱۹۸۷ تا ۱۹۹۰ انجام شد مشخص شد که گلیکوژنین با فعالیت اتوکاتالیتیک خود یک پرایمر الیگوساکاریدی ۷-۱۱ واحد گلوکزی می سازد که به عنوان یک سوبسترا برای گلیکوژن سنتاز عمل می کند. گلیکوژنین اولین گلوگز را از انتهای احیاکننده آن به گروه۱ -هیدروکسی تیروزین پروتئین با فعالیتself-glycosilating و گلوکزهای بعدی را با فعالیت اتوکاتالیک خود متصل می کند .هر مولکول گلیکوژن حاوی یک پروتئین گلیکوژنین است (19). فعالیت گلیکوژنین که معیاری برای اندازه گیری توانایی گلیکوزیلاسیون پروتئین است، با انتقال گلوکز نشاندار از UDP- 14Glucose به عصاره عضلانی بعد ازSDS-PAGE و رادیواتوگرافی شناسایی شد. فعالیت اتو-گلیکوزیلاسیون گلیکوژنین با Mn²+ تحریک می شود و نیاز بهUDP-Glu به عنوان سوبسترا دارد (17).

سنتز و متابولیسم گلیکوژن

سنتز گلیکوژن توسط گلیکوژن سنتاز صورت می گیرد. گلیکوژن سنتاز قادر به سنتز یک زنجیرگلیکوژن جدید از ابتدا نمی باشد. این آنزیم نیازبه یک پرایمر دارد. پروتئین گلیکوژنین هم به عنوان پرایمر که برروی آن زنجیرهای جدید همایش می یابند و هم به عنوان آنزیم کاتالیزکننده همایش آنها عمل می کند. اولین مرحله در سنتز یک مولکول جدید گلیکوژن، اتصال کووالان یک ریشه گلوکز به Tyr194 گلیکوژنین است که توسط فعالیت گلیکوزیل ترانسفرازی این پروتئین کاتالیز می گردد. با افزودن متوالی هفت ریشه دیگرگلوکز که از UDP-گلوکز مشتق می شوند، این زنجیر نو ظهور امتداد می یابد. سپس آنزیم گلیکوژن سنتاز از واحدهای UDP-گلوکز برای طویل شدن زنجیره گلوکزی استفاده می کند. زمانیکه طول زنجیره به حدود 11 واحد گلوکزی افزایش یافت، آنزیم شاخه ساز زنجیری بطول 7 واحد گلوکز را جدا کرده و یک انشعاب ایجاد می کند. سپس با فعالیت بیشتر گلیکوژن سنتاز ساختار گلیکوژن کامل می گردد (20). طبق مدل ارائه شده توسط Smythe و Cohen ابتدا Tyr-194 گلیکوژنین گلیکوزیله شده و به گلیکوژنین اجازه اتوگلیکوزیلاسیون را میدهد.سپس گلیکوژن سنتاز و گلیکوژنین به نسبت مولی 1:1 با هم یک کمپلکس پروتئینی تشکیل می دهند. تشکیل این کمپلکس برای سنتز گلیکوژن ضروری است. هرچه مولکول گلیکوژن بزرگتر می شود، گلیکوژنین و گلیکوژن سنتاز بطور فیزیکی از هم جدا می شوند(19) (شکل1-5).

شماره پایان نامه : 2735

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی مازندران

دانشکده پزشکی ساری

گروه آموزشی ایمونولوژی

مرکز تحقیقات بیولوژی سلو لی و مولکولی

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد رشته ایمونولوژی

عنوان :

تاثیر عصاره هیدرو الکلی زنجبیل بر بیان ژن سایتوکاینهایIL17,IL4 و IFN-در کشت سلولهای تکهستهای خون محیطی(PBMCs) بیماران مبتلا به آسم آلرژیک

استاد راهنما :

دکتر علیرضا رفیعی (استاد ایمونولوژی پزشکی)

استاد مشاور:

دکتر جواد غفاری (استاد آسم و آلرژی و نقص ایمنی)

دانشجو:

میثم آقاجانی درونکلا

بهمن 1395 شماره ثبت

خلاصه فارسی

مقدمه: آسم یک اختلال مزمن التهابی مجاری هوایی است که با علائمی ازقبیل سرفه، خس خس، تنگی نفس، احساس فشار در قفسه سینه، افزایش ترشح موکوس و تغییرشکل در مجاری هوایی و افزایش پاسخ دهی مجاری هوایی (AHR) مشخص میشود. لنفوسیتهایTCD4+ که به دستجات مختلفی نظیر سلولهای Th17,Th2و Th1تقسیم میشوند. نقش مرکزی در شروع و پیشرفت این بیماری دارند. سایتوکاینهایی که توسط این سلولها ترشح میشوند، ازجمله Th2 نظیرIL-4 و IL-13 نقش مهمی در پیشرفت آسم دارند. از آنجایی که اثرات ضد التهابی زنجبیل طی مطالعاتی مشخص شده و همچنین در پاتوفیزیولوژی آسم نقش پاسخهای Th2 و همچنین Th1 و Th17 به اثبات رسیده است، لذا بررسی نحوه تاثیر زنجبیل بر روی این پاسخ ها میتواند در معرفی درمان های جایگزین برای آسم موثر باشد. لذا هدف از این تحقیق ارزیابی تاثیر عصاره آبی و متانولی زنجبیل بر میزان بیان ژن سایتوکاینهایIL17 ,IL4 ,IFN-γکه بترتیب سایتوکاینهای عمده تولید شده توسط Th2 ,Th1و Th17میباشند، در محیط کشت سلولهای PBMC بیماران مبتلا به آسم و مقایسه آن با افراد سالم بوده است.

روش اجرا: در این مطالعه مورد-شاهدی، 24بیمار مبتلا به آسم آلرژیک و 10 فرد سالم که با گروه مورد همسان سازی شده بودند مورد مطالعه قرار گرفتند. پس از خونگیری سلولهای تک هستهای خون محیطی جدا گردید، 1 میلیون سلول به همراه غلظت مناسب از عصاره زنجبیل که درتست MTT مشخص شده است به مدت 72 ساعت در انکوباتور ºC 37 که حاوی 5 درصد CO2 بود در پلیت های 24 خانه ای کشت سلول کشت دادیم و پس از طی مدت زمان مذکور سلولها و سوپرناتانت کشتسلولی را جمعآوری کرده، RNA سلولها استخراج، cDNA سنتز شد و با استفاده از Real-time PCR(Real-time Polymerase chain reaction) بیان ژنهای مربوطه مورد بررسی قرارگرفته و سطح سایتوکاین نیز با استفاده از تکنیک الایزا اندازهگیری شد.

نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد عصاره هیدروالکلی زنجبیل از یک طرف منجر به کاهش معنی دار بیان ژنIL4 شده (0.01P=) و از طرف دیگر باعث افزایش بیان IFN-γ میشود که از نظر آماری معنی دار نبود (0.129P=). در سطح پروتئین نیز کاهش سطح IL4 و افزایش سطح IFN-γ را شاهد بودیم که از نظر آماری معنی دار نبود (0.175P=),(0.187P=). علاوه بر این کاهش بیان ژن و سطح پروتئینی سایتوکاین IL17 در اثر مجاورت با زنجبیل در بیماران آسمی و نه در گروه شاهد نشان داده شد (0.038P=),(0.055P=).

نتیجهگیری: با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه به نظر میرسد عصاره زنجبیل موجب تنظیم تعادل میان پاسخهایTh1 و Th2 شده و همچنین موجب سرکوب پاسخهایTh17میشود. بدین ترتیب زنجبیل باعث کنترل شدت پاسخهای ایمنی دربیماران مبتلا به آسم آلرژیک شده و از این طریق با کاهش التهاب موجب بهبودی علائم بالینی ناشی از این بیماری میشود. با این اوصاف امید است بتوان در آینده ای نزدیک از زنجبیل بعنوان یک چشم انداز تازه برای درمان بیماران مبتلا به آسم آلرژیک استفاده کرد.

مقدمه

آسم آلرژیک بیماری التهابی مزمن مجاری هوایی میباشد که معمولا با درجات مختلفی از التهاب, افزایش حساسیت, تنگی برونش و تغییرات مجاری هوایی مشخص می گردد (1-2). بیش از چهار نوع واکنش افزایش حساسیت وجود دارد که نوع اول آن در ارتباط با بروز آسم و آلرژی از اهمیت بیشتری برخوردار است. در افزایش حساسیت نوع اول که افزایش حساسیت فوری نیز نامیده میشود بدنبال تماس بدن با آنتی ژنهای حساسیت زا (آلرژن ها)، لنفوسیتهایB آنتی بادی اختصاصی از نوع IgE[footnoteRef:8] بر علیه ماده آلرژن می سازند که این آنتی بادی از طریق قسمت Fc[footnoteRef:9] خود به سلولهای ائوزینوفیل، بازوفیل و ماست سل متصل شده و به اصطلاح آنها را حساس میکند. در صورتیکه بدن برای بار دوم با همان آلرژن برخورد نماید، آنتی ژن سبب اتصال متقاطع آنتی بادی های چسبیده به این سلول ها میشود ,سلول ها فعال می گردند تا به سرعت انواع مختلف میانجی ها را آزاد نمایند. این میانجی ها در مجموع سبب افزایش نفوذپذیری رگ ها, گشادی رگ ها ,انقباض عضله صاف برونش, هجوم سلولهای دفاعی بدن و بدنبال آن التهاب موضعی میشود (3). فاکتورهای محیطی همچون آلرژن ها، ویروس ها و تماسهای شغلی میتوانند باعث تغییر سیر بیماری شوند. در کشورهای صنعتی و توسعه یافته کاهش تماس با عوامل عفونی در دوران کودکی با افزایش آسم آلرژیک در بزرگسالی ارتباط نسبتا مستقیم دارد (فرضیه بهداشت) (4). مکانیسم های ایمونولوژیک آسم در سال 1986 ابتدا در موش و سپس در انسان کشف شدند. در انسان انواع متفاوتی ازTCD4+ وجود دارد که از مهم ترین آن ها میتوان بهTh2 ,Th1وTh17 اشاره کرد که تفاوت اصلی بین این گروه ها، در سایتوکاینهای تولید شده توسط آن ها میباشد (5-6). با ورود آنتی ژن و تحریک رسپتورهای سطح سلولهایT، این سلول ها میتوانند به سمت Th1 و Th2 و یا Th17 تمایز پیدا کنند در نتیجه این سلول ها نقش مهمی در ایمنی اکتسابی ایفا میکنند. سلولهای Th1 با تولید IFN-γ در مبارزه علیه پاتوژنهای داخل سلولی و Th2 با تولید اینترلوکین های 4، 5 و13 درمبارزه با پاتوژنهایی نظیر کرم های انگلی و همچنین دربیماریهای آلرژیک اهمیت دارند (7). همچنین سلولهایTh17 با ترشح IL17 نقش مهم حفاظتی در برابر عفونت ها و بیماریهای التهابی مزمن دارند (8). [8: Immunoglobulin E] [9: Fragment crystallizable]

آسم

تعریف آسم

ﮐلمه “آسم” برگرفته از زبان یونانی و به معنای تنگی نفس میباشد (9). آسم بیماری التهابی مزمن راههای هوایی بوده که منجر به افزایش پاسخدهی راههای هوایی[footnoteRef:10](AHR) و انسداد برگشت پذیر راههای هوایی میشود (10). مجاری هوایی در افراد مبتلا به آسم دچار التهاب، تورم و حساسیت شده و به برخی از مواد استنشاقی واکنش شدیدی نشان میدهند. با بروز واکنش، عضلات اطراف مجاری منقبض شده و راههای هوایی متورم و باریکتر میشود که باعث نفوذ کمتر هوا به داخل ریه ها میشوند. با شروع علائم سلولهای مجاری هوایی آغاز به ترشح موکوس میکنند. در نهایت این واکنش ها منجر به بروز بیماری آسم میشوند (11). [10: Airway Hyper Responsiveness]

آسم معمولا براساس علائم بالینی و با انجام تست اسپیرومتری تشخیص داده میشود (12). در شکل 1-1 نمایی از مجاری هوایی و ریه دیده میشود. شکل A-1 محل ریهها و مجاری هوایی را در بدن نشان میدهد، شکل B-1 سطح مقطع یک مجاری هوایی طبیعی را نشان میدهد و شکل C-1 مقطعی از مجاری هوایی در آسم را نشان میدهد (11).

1

شکل 11نمایی از ریه و مجاری هوایی انسان (11)

در یک تقسیم بندی کلی میتوان بیماری آسم را به دو قسمت آسم آلرژیک و آسم غیر آلرژیک تقسیم بندی کرد که البته این تقسیمبندی کاملی نبوده و ممکن است بعضی از افراد در هیچ کدام از این تقسیم بندیها نگنجند (10). در آسم غیر آلرژیک که اغلب با شروع تاخیری (شروع در بزرگسالی) شناخته میشود نتیجه تستهای پوستی از نظر حساسیت به آلرژنهای استنشاقی منفی است و غلظت سرمی IgE در این بیماران طبیعی است. در نوع دیگر آسم بنام آسم آلرژیک که بیشتر در سنین کودکی و نوجوانی دیده میشود زمینه حساسیت نقش مهمی در بروز بیماری دارد. این حساسیت ممکن است یک حساسیت فصلی باشد که با علایمی مانند عطسه، آبریزش بینی، خارش حلق، قرمزی و خارش چشم خود را نشان میدهد و یا به صورت یک حساسیت پوستی باشد. از لحاظ بالینی آسم آلرژیک بر اساس یافتههای اسپیرومتریک به سه دسته آسم خفیف[footnoteRef:11]، آسم متوسط[footnoteRef:12]و آسم شدید[footnoteRef:13]تقسیم میشوند. [11: persistent Mild] [12: Persistent Modrate] [13: Persistent Severe]

از سوی دیگر از لحاظ پاسخهای ایمونولوژیک آسم به دو دسته کلی Th2 High و Th2 Low تقسیم میشوند. بیشتر بیمارانی که در گروه اول قرار دارند به نوع خفیف تا متوسط آسم[footnoteRef:14] مبتلا هستند در حالیکه درصد ابتلا به موارد آسم شدید[footnoteRef:15] در بیماران متعلق به زیر گروه Th2low بیشتر میباشد (18). [14: (MMA) Mild-Modrate asthma] [15: Sever Asthma]

اپیدمیولوژی آسم

شیوع آسم در دهه گذشته افزایش چشمگیری یافته است بطوریکه حدود10درصد از مردم کشورهای توسعه یافته به آسم مبتلا میباشند (13). حدود 300 میلیون نفر در دنیا مبتلا به آسم هستند و هر ساله 250000 مورد مرگ و میر در اثر بیماری آسم اتفاق می افتد. بعلاوه میلیاردها دلار هزینه مراقبت و درمان این بیماری میشود (14). در مطالعهای که در سال 2010 در ایالات متحده انجام شده، حدود 7.18 میلیون انسان بالغ و حدود 7 میلیون کودک مبتلا به آسم گزارش شده است (15). شیوع آسم در افراد کمتر از 18 سال 8/5% در دختران و 8/8% در پسران را شامل شده است و در بالغین مذکر شایع تر است (16). در مطالعهای مشاهده شده که 39% افراد با تشخیص آسم سابقه خانوادگی آسم و 55% سابقه آلرژی در آنها وجود داشته است، و تنها 35% از بیماران قبلا آسم داشته اند و تحت درمان قرارگرفته اند (17). بر طبق آمارگیری که در سال 1386 صورت گرفت، میانگین شیوع آسم در ایران 13. 14% است که بالاتر از میانگین جهانی است(21).

پاتوفیزیولوژی آسم

آسم بیماری التهابی مزمن راههای هوایی میباشد. اشکال کلینیکی معمول در این بیماری شامل عطسه, سرفه, کوتاهی تنفس, گرفتگی سینه و خس خس آن میباشد (15). همانطور که اشاره کردیم از لحاظ ایمونولوژیک دو گروه مجزای Th2 Highو Th2 Low را میتوان برای بیماران مبتلا به آسم آلرژیک در نظر گرفت. بسیاری از افرادی که در گروه Th2 high از بیماری آسم قرار می گیرند افراد آتوپیک هستند بدین معنی که بطور کلی زمانیکه با آلرژنهای محیطی تماس پیدا کنند قادر به تولید IgE میباشند. در این افراد واکنش آلرژن_راژین در برونشیول های ریه اتفاق می افتد که در نهایت باعث ایجاد واکنش افزایش حساسیت وابسته به IgE میشود. واکنش آلرژیک نیازمند حساس شدن قبلی شخص به آلرژن مسئول ایجاد این واکنش میباشد. در این بیماران پاسخ IgE در نسوج لنفاوی دستگاه تنفسی متعاقب استنشاق آلرژن ها وجود دارد و وقتی علامت دار هستند که در مخاط و ترشحات بینی آنها تعداد ماست سل ها و بازوفیل ها افزایش یافته است. مولکول IgE از قسمت FC خود به سطح این سلولها اتصال یافته است و دقایقی بعد از این که بیمار در معرض آلرژنهای استنشاقی مانند گرده گیاهان قرار گرفت واکنش آنتی ژن و آنتی بادی اتفاق می افتد. آنتی ژن با قسمت Fab مولکول IgE برهمکنش نشان میدهد و در نتیجه واسطه هایی مانند هیستامین، پروستاگلاندین، لکوترین، فاکتور فعال کننده پلاکتی[footnoteRef:16](PAF) و سایر سایتوکاینها از ماست سل ها آزاد میشود که این مواد سبب گشادی عروق، تورم مخاط و تحریک گیرنده های خارش میشوند (20-21). همانطور که در شکل 1-2 مشاهده میشود برخورد اولیه با آلرژن موجب حساس شدن ماست سل ها میشود. برخورد مجدد با همان آلرژن موجب فعال شدن و در نتیجه خروج مدیاتور های آلرژیک از گرانول های ماست سل ها میشود. [16: Platelet Activator Factor]

شکل 12ترتیب واکنشهای آلرژیک مرتبط با سلولهای Th2 (20-21)

در راههای هوایی افراد مبتلا به آسم مرتبط با سلولهای Th2 التهاب ائوزینوفیلی غالب میباشد. این افراد درجات پایین تری از AHR را نشان داده و به درمان های رایج و معمول پاسخ میدهند (19). معمولترین این درمان ها استفاده از کورتیکواستروئیدهای استنشاقی[footnoteRef:17]و در موارد شدیدتر کورتیکواستروئیدهای خوراکی[footnoteRef:18] و یا کورتیکواستروئیدهای تزریقی میباشد. در مقابل بیمارانی که در زیرگروه Th2 Low تقسیم بندی میشوند درجات بیشتری از AHR و نقص در عملکرد ریه را نشان داده و بر خلاف انتظار به درمان های رایج بطور ضعیف پاسخ میدهند (18, 22). مکانیسم های ایجاد فنوتیپ Th2 Low بخوبی شناخته نشده است, اما همانطور که اشاره شد واکنشهایTh1وTh17 نقش مهمتری نسبت به پاسخهای Th2 در این بیماران ایفا میکنند. بطوری که التهاب ایجاد شده در برونش این بیماران بیشتر نوتروفیلیک میباشد. مطالعات انجام شده حاکی از آن است که درافراد مبتلا به آسم شدید که بیشتر در زیر گروه Th2 Low قرار می گیرند، کمپلکسی از پاسخهای ایمنی درگیر میباشند. در برخی از این بیماران یک التهاب نوتروفیلی-ائوزینوفیلی مشاهده شده که ناشی از فعالیتTh2/Th17میباشد. بطوریکه مارکرهای مربوط به فعالیت سلولهایTh2وTh17 در خون این بیماران مشاهده میشود (22-23). IL17 که یک سایتوکاین پیش التهابی کلیدی تولید شده توسط سلولهای Th17 میباشد بعنوان یک سایتوکاین موثر در ایجاد التهاب نوتروفیلیک, انقباض عضله صاف برونش و بدنبال آن تغییر شکل در راههای هوایی در این نوع آسم مطرح میباشد (24-26). با این وجود برخی از مطالعات دیگر نشان میدهند که نقص شدید در عملکرد طبیعی ریه ارتباط زیادی با IL17 ندارد (27). در حقیقت در این موارد IFN-γ مسوول ایجاد AHR و نقص شدید در عملکرد طبیعی ریه بوده, در حالیکه IL17 یک التهاب نوتروفیلی را در راههای هوایی پیش میبرد (27). شکل 1-3 نمای شماتیکی از واکنشهای ایمونولوژیک در بیماران مبتلا به آسم شدید را نشان میدهد (28). [17: Inhaled Cortico Steroid (ICS)] [18: Oral Cortico Steroid (OCS)]

شکل 13ترتیب رویداد ایمونولوژیک در بیماران مبتلا به آسم شدید (28)

علل آسم

فاکتورهای موثر در بیماری آسم شامل عوامل ژنتیکی, عوامل محیطی و فاکتورهای ارثی مرتبط با توالی DNA میباشد. این عوامل بر شدت آسم تاثیر می گذارند (29-32).

عوامل محیطی

از مهمترین عوامل محیطی که در ایجاد آسم نقش بسزایی دارند میتوان به آلرژ