Öröklött thrombophiliákÖröklött thrombophiliáklaboratóriumi diagnosztikájalaboratóriumi diagnosztikája

Bereczky ZsuzsannaDEOEC, Klinikai Kutató Központ

Mi utal thrombophiliára?Mi utal thrombophiliára?

1/ Mélyvénás thrombosis relatíve fiatal korban (<50-55 év)

2/ Recurrens thrombosis3/ Thrombosis szokatlan helyen

(nem alsó végtagon)4/ Familiáris előfordulás

(öröklött thrombophilia)

Öröklött thrombophiliák okaiÖröklött thrombophiliák okaiAz inhibitor rendszer deficienciájaAntitrombin III deficienciaAntitrombin III deficienciaHeparin kofaktor II deficiencia?Az inaktivátor rendszer deficienciájaProtein C, Protein S deficienciaFokozott faktor szint vagy abnormális faktorokAktivált protein C resisztencia (FV Leiden)Protrombin 20210A allélDysfibrinogenaemia thrombosissalMagas FVIII, FIX, FXI szint ?Csökkent fibrinolítikus aktivitás Plazminogén deficiencia, FXII hiány?Egyéb Homocystinuria (hyperhomocysteinaemia)

APC rezisztencia - FV Leiden

Egyéb ismert

Ismeretlen

A vénás thrombosisokra való fokozott hajlamA vénás thrombosisokra való fokozott hajlamgenetikai okainak relatív gyakoriságagenetikai okainak relatív gyakorisága

AT III, protein C, protein S def.

Protrombin 20210 A allél

40%35%

10%

10% 5%

1965. Egeberg et al.Öröklődés: AD (II/HBS: AR)Gyakoriság: 1:2000-5000 (1:250-500)Thrombophiliák hátterében : 3-5%Thrombosis kockázat: 8-10x (LETS)Referencia taromány: 75-120%Plazma szint heterozig.: 30%-70%Tünetek (heterozigóták): MVT, PE, MeVT, CVT

(ált. pubertas kor után)Homozigóta nincs: letális mutációk(I. típus és súlyos II. típus)

Antitrombin III deficienciaAntitrombin III deficiencia

Öröklött antitrombin III hiány Öröklött antitrombin III hiány típusaitípusai

I. Típus: Alacsony antitrombin aktivitás és antigénOkai: >80 mutáció (nagy deléciók, kisebb deléciók ésinszerciók, egy nukleotid szubsztitúció)

II. Típus: Abnormális antitrombin variánsRS, az aktív centrumra gyakorolt hatásHBS, a heparin kötő helyre gyakorolt hatás

(kisebb a VTE kockázat)PE, pleiotróp (multiplex) hatás: kevés, abnormál

AT szintézise (402-429 a.savak)

II. típusú AT deficienciát okozó pontmutációkII. típusú AT deficienciát okozó pontmutációk

Bauer K A. 2003

Diagnózis: funkcionális (általában kromogén) teszt

Klasszifikáció: antigén meghatározás

1 típus: csökkent aktivitás és antigén2 típus: abnormális molekula-

csökkent aktivitás, normál antigén

Antitrombin IIIAntitrombin IIIdeficiencia diagnosztikájadeficiencia diagnosztikája

AT III meghatározásAT III meghatározásI. Funkcionális tesztek

1. Alvadási tesztekmódosított trombin idő meghatározás

(defibrinált plazma, heparin kofaktor II és FDP zavar)2. Kromogén tesztek

Antitrombin aktivitás meghatározásAnti-faktor Xa teszt

Heparin jelenlétében: “heparin kofaktor aktivitás”Heparin hiányában: “progresszív aktivitás”II. Antigén meghatározás

Turbidimetria, nefelometria (ELISA, RIA, radiális immundiffúzió)III. Heparin kötés vizsgálata: 2DCIE

Heparin kofaktor aktivitás meghatározásHeparin kofaktor aktivitás meghatározáskromogén szubsztráttalkromogén szubsztráttal

Heparin + AT III Heparin - AT III komplex

trombin (feleslegben) Heparin - AT III + —————————

FXa (feleslegben)

Heparin - AT III - trombin + trombin (maradék) ————————————————————— Heparin - AT III - FXa + FXa (maradék)

trombinR-pNA ———— R-COOH + pNA

FXaRtr CBZ-Gly-Pro-Arg Rxa: Bz-IIe-Glu-Gly-Arg

Ajánlás: FIIa alapú teszt esetén bovin trombin használata (HCFII!)de inkább FXa alapú teszt

Öröklött antitrombin III hiány Öröklött antitrombin III hiány típusaitípusai

Típus Antigén Heparin kofaktor Progresszív Heparinaktivitás aktivitás affinitás*

Ia NormálIb CsökkentIIa Normál CsökkentIIb Normál Normál v.

emelkedettIIc# Normál Normál Csökkent

* Heparin kötő teszttel meghatározva# IIc típusú heterozigóták: nincs (kisebb) fokozott thrombosis rizkó, öröklődésmenet AR

Fiziológiás/pathológiás állapotokFiziológiás/pathológiás állapotokmelyek befolyásolják az AT III szintetmelyek befolyásolják az AT III szintet

újszülött kor, koraszülöttek

terhesség 3. trimeszter, preeclampsia

OAC, ösztrogén terápia

májbetegség

fehérje vesztő állapotok (enteropathiák, nephrosis)

heparin terápia (15-30%)- fokozott clearance

L-Aszparagináz terápia (ALL)

DIC, MVT, PE

1981. Griffin et al.Öröklődés: AD/ARGyakoriság: 1:16,000/1:300Thrombophiliák hátterében: 3-5%Thrombosis kockázat: 7x (LETS)Referencia tartomány: 70-140%Plazma szint

heterozigótákban: 14%-70%Tünetek heterozigótákban MVT, PE, MeVT, CVT

(AD forma): kumarin necrosisHomozigótákban < 5%, Neonatalis purpura

(AD forma): fulminans, CVT

Protein C deficienciaProtein C deficiencia

Protein C meghatározásProtein C meghatározás

I. Funkcionális teszt1. Alvadási teszt2. Kromogén teszt

II. Antigén meghatározásELISA

Abszorpciós technikák: időigényes, PC kinyerés nem 100% (des--karboxi formánál különösen nem jó) Protac: Agkistrodon contortrix mérge, Ca2+- független, plazma proteázoknem inaktiváljákAjánlás: alvadási teszt jobb szűrőteszt

Protein C alvadási tesztProtein C alvadási teszt

Beteg plazma hígítás Kontroll plazma hígítás

Protein C deficiens plazmaAPTI reagens (PL + aktivátor)

Protac

Inkubáció 240 sec, 37oC-on

Alvadás indítása: 25 mM CaCl2-vel

Protein C hiány típusaiProtein C hiány típusai

I. Normál PC molekula csökkent szintézisePC antigén, PC aktivitás

II. Kóros PC molekulaa. PC antigén normál,

PC aktivitás alvadás, kromogénb. PC antigén normál,

PC aktivitás alvadás, kromogén norm(a PS és PL kötés zavara- Gla-domén mutációk)

Fiziológiás/pathológiás állapotokFiziológiás/pathológiás állapotokmelyek befolyásolják a PC szintetmelyek befolyásolják a PC szintet

újszülöttkor, koraszülöttekmájbetegség

sepsis, DIC, akut thrombosis, PEARDS

postoperativ állapotokkemoterapeutikumok

OACkumarin terápia!!!

terhesség, ösztrogének, nephrosis, ISZBheparin (poibrén)

magas titerű LA (APTI reagens)

1984, Comp et al.

Öröklésmenet: ADGyakoriság: 1:16,000A thrombophilia oka: 3-5% Plazma szint 30%-65% totál

heterozigótákban: 15%-50% szabadA heterozigóták tünetei: MVT (szokatlan lokal.),

PE, Sync. necr.arteriás thrombosisokthrombophlebitis

Homozigóták: < 5%, MVT, PE neonatalis purpura fulminans

Protein S deficienciaProtein S deficiencia

Protein S hiány típusaiProtein S hiány típusaiI. Normál PS molekula csökkent szintézisecsökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

II. Kóros PS molekulanormál szabad (és totál) PS antigéncsökkent PS aktivitás

Protein S meghatározás lehetőségeiProtein S meghatározás lehetőségei

I. Antigén meghatározás1. Totál PS

(ELISA, immunturbidimetria)2. Szabad PS

(ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria)

II. Funkcionális teszt - szabad PS aktivitását

méri

Szabad protein S antigén Szabad protein S antigén meghatározásmeghatározás

1/ Két dimenziós immunelektroforézis2/ C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG

precipitációval, a felülúszóban maradószabad PS meghatározása ELISA-val

3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA

4/ Ligand kötő assayELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnaka szabad PS megkötésére

5/ Immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitesttel

Protein S funkcionális teszt-Protein S funkcionális teszt-APC kofaktor funkcióAPC kofaktor funkció

Beteg plazmahígítás

Referencia/Kontroll plazma hígítás

Protein S deficiens plazmaAPTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV

(Faktor Va)Aktivált Protein C

240 sec inkubáció 37oC-on

25 mM CaCl2

Az alvadási idő megnyúlás mértéke arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.

A protein S deficiencia diagnosztikáját A protein S deficiencia diagnosztikáját nehezítő tényezőknehezítő tényezők

1. Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák:FVIII, LA, FV Leiden (II. típus!), heparin

2. PS szintet befolyásoló tényezők:PS csökkenés deficiencia nélkül

3. Szerzett PS deficienciák

4. Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás)A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás)tényezőktényezők

nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás,oralis anticoncipiensek (a C4bBP is), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet)

1 nap

FT

1 nap

PT

1 hó

FT

1 hó

PT

6 hó

FT

6 hó

PT

felnőtt

36

(24-48)

26

(14-38)

63

(48-78)

56

(22-90)

87

(71-103)

82

(44-120)

92

(60-124)

életkor

PS szint (%)Andrew, 1987, 1988, 1992 FT: érett úsz., PT: koraszülött

GyulladásGyulladásC4bBPC4bBP

Szerzett PS Szerzett PS deficienciadeficiencia

SLESLE

MM, tu.MM, tu.L-aszparaginázL-aszparagináz

KumarinKumarinterápia,terápia,

K-vitamin def.K-vitamin def.

májbetegségmájbetegség

DIC,DIC,Akut thrombosisAkut thrombosisAPSAPS

Varicella,Varicella,HIVHIV

NephrosisNephrosisC4bBP>C4bBP>PS:AgPS:Ag

Öröklött PS deficiencia genetikai Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikájadiagnosztikája

A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPSkorrelál (II. típus nagyon ritka)Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes,pszeudo-génpszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes,a deficiencia hátterében nem mindig található meg amutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottalnagyobb gén defektusok azonosítása)Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak lePROS1 adatbázisPolimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T,alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen-fokozott affinitás C4bBP-hez

Protein S gén-exon 9Protein S gén-exon 9aattatttta gtgtattaca gatgatacat tagtaaccaaacaaa/gaatg/acatgacctcacacaaacatta agcaataacc tg/atgcattttgattttcttg tt/agtttattt ggtttcttttattccaggtt gtttcagtgt gccttcccttgaaccttgac acaa/cagtatg aattactttacttgg/acg/agag cagtttg/tcaggggttgtttt atatttaaaa tttcg/atttgc cagaaatcagcaggtgagga accaataccaatgataattt ctagaggtta agcagataag gA

B

Protein S mutációs adatbázisProtein S mutációs adatbáziswww.isth.orgwww.isth.org

Mutáció típusa Előfordulási gyakoriság

Nukleotid szubsztitúció 80%

Misszensz mutáció 60%

Nonszensz mutáció 23%

Splice site mutáció 17%

Inszerciók/deléciók 20%

Nagy deléciók <1%

Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-aII. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

Arg506

Aktivácó: limitált proteolízis trombinnal

A1 A2 B A3 C2C1

Arg709 Arg1018 Arg1545

Ca2+

Inaktiváció: proteolítikus hasítás aktivált Protein C-vel (első hasítási hely Arg 506-nál)

A1 A2 A3 C2C1

A faktor V aktivációja és inaktivációjaA faktor V aktivációja és inaktivációja

Arg306 Arg679

APC rezisztencia: 1993. DahlbackAz APC rezisztencia kimutatása:funkcionális alvadási teszt

A Leiden mutáció kimutatása:molekuláris genetikai módszerek

Az öröklött APC rezisztenciáért szinte kizárólag a Leiden mutáció a felelős. Thrombosis kockázata heterozigótákban: 5-7x

homozigótákban: 80xFVL+OAC: 35x

Az APC rezisztencia funkcionális Az APC rezisztencia funkcionális meghatározásának elvemeghatározásának elve

A plazmához hozzáadott aktivált protein C (APC)proteolítikusan degradálja az aktív V-ös és VIII-as faktorokat, ami az e két faktort (vagy egyiket) magában foglaló alvadási tesztben alvadási idő megnyúlást eredményez. Ha az V-ös (esetleg VIII-as) faktor APC által történő degradációja lassúbb a faktorban bekövetkezett kóros strukturális változás miatt, APC rezisztenciáról beszélünk. Ez esetben az alvadási idő APC hatására történő megnyúlása lényegesen kisebb.II. generációs tesztek! (FVIII, LA, heparin, kumarinok)

+APC –APCElőhígított plazma * 0,10 ml 0,10 mlAPTI reagen s (1.) 0,10 ml 0,10 ml

37°C -on 5 percig inkubá ljukKalcium klorid oldat(4.)

- 0,10 ml

APC munkao ldat 0,10 ml -

*1:5 hígítás FV hiányos plazmával

REA-clot APC-R (V.)

aktivált Protein C rezisztencia meghatározásá ra

in vitro DIAGNOSZTIKAI REAGENS KÉSZLET

Cikkszám: 45620-2 -99-80 Kiszerelés: 20/40 vizsgálathoz

APC-R = APTI APC+CaCl2

APTI CaCl2

Referencia tartomány: ≥ 2.0

Leiden mutációra vad típusú, heterozigóta Leiden mutációra vad típusú, heterozigóta és homozigóta betegek és homozigóta betegek

REA-clot APC-R (V.) teszttel mért APC rátáiREA-clot APC-R (V.) teszttel mért APC rátái

Vad típusn=48

Heterozigótan=9

Homozigótan=2

AP

C r

áta

Olvadáspont analízisOlvadáspont analízis (FV Leiden) (FV Leiden)

vad típusvad típusheterozigótaheterozigótahomozigótahomozigóta

40 45 50 55 60 65 70 75-1

0

1

2

3

4

5

6

hômérséklet (°C)

-dF

/dT

Faktor V Leiden mutáció hordozás gyakorisága

Magyarország:~10%(K-Mo.:9,2%, Ny-Mo.:6,2%)Magyarország:~10%(K-Mo.:9,2%, Ny-Mo.:6,2%)

UK: 3%

Hollandia: 3%Franciaország: 3.5%Németország: 7%Spanyolország: 3%Törökország: 10%Görögország: 10%Svédország: 10%

Finnország: 3%

Hordozása 1.8-4.1-szeres relatív kockázatot jelent mélyvénás thrombosisra.A familiáris thrombophiliák kb. 10%-áért felelős.Egyéb thrombophiliás állapotokban hordozása tovább fokozza a thromboembolia kockázatát.

Mutáció: a protrombin gén 3’ át nem íródó szekvenciájában guanin-adenin csere. Következmény: szignifikáns plazma protrombin szint emelkedés magasabb transzlációs efficiencia vagy stabilabb mRNS képződése révén.Karrier frekvencia: K-Mo.: 4,4%, Ny-Mo.: 3,8%

Protrombin 20210A allélProtrombin 20210A allél

Thrombophilia szűrés - ajánlásokThrombophilia szűrés - ajánlások1.1. Egyértelműen ajánlott:Egyértelműen ajánlott:rekurrens VTE, 50 éves kor előtt jelentkező VTE, nyilvánvaló kiváltó tényező hiányában kialakult VTE bármely életkorbanszokatlan lokalizációban jelentkező VTEVTE terhességben, puerperiumban, OAC, vagy hormonpótló terápiában

2.2. Megfontolandó:Megfontolandó:50 év alatti dohányos nők AMI50 év alatti dohányos nők AMI50 év felettiek ismert kiváltó tényező jelenlétében kialakult VTE (nincs tu)50 év felettiek ismert kiváltó tényező jelenlétében kialakult VTE (nincs tu)terhességi komplikációk (pl. preeclamsia)terhességi komplikációk (pl. preeclamsia)tünetmentes családtagok (főleg nők)tünetmentes családtagok (főleg nők)

3.3. Nem ajánlott:Nem ajánlott:általános populációs szűrőtesztkéntprenatalis tesztként, tünetmentes gyermekek szűréséreartériás thrombosisokban (vannak kivételek, pl. fiatal betegek atherosclerosis nélkül)OAC, hormonpótlás előtt (teljes panel) Aiach M, Emmerich J. 2006

Thrombophilia szűréseThrombophilia szűréseParaméter Módszer

APC rezisztencia II. generációs funkcionális teszt

FII 20210A molekuláris genetikai vizsgálat

Antitrombin III heparin kofaktor aktivitás

Protein C funkcionális alvadási teszt

Protein S funkcionális alvadási teszt+szabad PS ag

Dysfibrinogenaemia TI, fibrinogén (funkc.+immun.)

Homocisztein éhgyomri

APS LA + AP antitestek

Vizsgálat időzítése: kerüljük az akut thrombosisban, kumarin terápiaalatt, nagy dózisú heparin terápia alatt, újszülött korban, terhességbentörténő kivizsgálást.