PRACTICARIO MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Carrera: Ingeniería en Alimentos

Semestre: 4 semestre

Practicas de microbiología en Alimentos

Profesora : Martha Flores

Curso: Enero-Mayo 2007Práctica no. 1

RECUENTO DE ORGANISMOS MESÓFILOS AEROBIOS A PARTIR DE ALIMENTOS

INTRODUCCIÓNLa presencia y abundancia de organismos mesófilos aerobios en los alimentos

es importante ya dentro de este grupo encontramos microorganismos que causan enfermedades de origen alimentario, producen alteraciones en los alimentos, cuando éstos se conservan a temperaturas comprendidas entre 20 y 40°C limites de temperatura a los cuáles se desarrollan, además dentro de este grupo se encuentran microorganismos Psicotrópicos, que pueden desarrollar a temperaturas de refrigeración.

Dentro del grupo también encontramos bacterias que se usan para preparar derivados de la leche y otros alimentos fermentados.

El grupo comprende la mayoría de los hongos y levaduras de importancia en los alimentos y los siguientes géneros de bacterias que se aíslan de los mismos con frecuencia: Pseudomonas, Achromobacter, Chromobacterium, Brevibacterium, Providencia, Alcaligenes, Acinetobacter, vibrio, Bacillus, Listeria y las familias Micrococaceae Lactobacillaceae, lactococaceae, enterobactereaceae.

Las fuentes de contaminación que frecuentemente los aportan son: agua, tierra, polvo, aditivos, ingredientes, utensilios, equipo, manejadores de alimentos, fauna nociva y envase.

Su recuento en un alimento o en diversos productos biológicos persigue diversos objetivos:

a) Determinar la eficiencia de un proceso de limpieza y desinfección o de cualquier tratamiento que tienda a mejorar la calidad en base a reducir la carga microbiana.

b) Determinar la aceptabilidad de un producto en base a una norma.c) Determinar la vida de anaquel de un producto.d) Estimar el grado de peligrosidad de un producto involucrado en un brote de

intoxicación o infección de tipo alimentario.e) Determinar si un producto que va a preparase con microorganismos tiene la

cantidad adecuada para iniciar el cambio bioquímico esperado.f) Determinar las condiciones de trabajo dentro de un área de producción.

Para su recuento se utilizan las técnicas que efectúan la detección de microorganismos viables y dentro de éstos un grupo seleccionado de acuerdo a las condiciones ambientales, la composición del medio de cultivo, y otros señalamientos específicos del método empleado. Dentro de las técnicas tenemos la de vaciado en placa y la inoculación en superficie.

Cuenta de colonias por la técnica de vaciado en placa:En esta técnica el producto líquido o una suspensión si fuera sólido, se diluye de acuerdo con una progresión y cada dilución se inocula en cajas de petri, sobre cada una se vacía un medio de cultivo solidificable y se llevan a incubar en condiciones definidas, posteriormente se cuentan las colonias, calculándose el número presente en la muestra original, esta técnica se ve afectada por los parámetros siguientes:

a) La destreza del operador.b) La composición y efecto bactericida del diluyente.

c) El tiempo transcurrido desde la preparación de las diluciones y la adición del medio de cultivo.

d) El tiempo y la temperatura de incubación.e) La distribución desigual de los microorganismos de la muestra.f) Las condiciones de agitación de los frascos y tubos con el diluyente.g) La presencia de partículas de alimentos en las placas.h) El tamaño de la alícuota original.i) La opalescencia del medio de cultivo.j) La presencia de agentes antimicrobianos en el medio.k) La presencia de colonias extendidas en el medio de cultivo.l) Las condiciones de estress de algunos microorganismos debido a

tratamientos antimicrobianos aplicados.

Cuenta de colonias por inoculación en superficie:La cuenta de inoculación en superficie presenta las siguientes ventajas sobre la de vaciado en placa: economía en el material cuando se utiliza una sola gota, que permite realizar varias diluciones en una misma caja.Para su realización se deben preparar las placas previamente a su inoculación, la superficie de la placa debe encontrarse libre de humedad para evitar la confluencia. No se recomienda esta técnica en alimentos poco contaminados que tengan menos de 3.000 UFC/gr o ml.

MATERIAL POR EQUIPOBalanza granatariaEspátulaMechero FisherVarilla de vidrio1 botella con 90ml. de agua peptonada de fosfatos4 tubos conteniendo 9ml. de agua peptonada1 pipeta de 10ml. estériles4 pipetas de 2ml. estériles1 recipiente con alcohol 1 tapa de caja de petri5 cajas de petri estériles5 cajas de petri conteniendo aproximadamente 35ml. de medio de agar métodos estándar.1 matraz de 250ml. con tapón de algodón conteniendo 150ml. de agar métodos estándar.

TÉCNICATécnica por extensión de superficie

1. Pesar 10gr o ml. de alimento y adicionarles en 90ml. de agua peptonada.2. Realizar las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.3. Inocular 0.1 ml. de cada dilución en el centro de las placas.4. Extender el inóculo con una varilla en toda la superficie de la placa, pasando

la varilla repetidas veces.5. Al término de cada dilución mojar la varilla con alcohol y esterilizar a la flama.6. Dejar las cajas a temperatura ambiente durante 15 min. con la tapa hacia

arriba hasta que se sequen.7. Incubar las cajas a 35°C, durante 48 horas.8. Seleccionar aquellas cajas que muestran como máximo 300 UFC.9. Multiplicar el número de colonias por la inversa de la dilución y por 1010 ya

que se uso 0.1 ml. para obtener su contenido en 1ml.10. Informar el contenido de UFC/ml o gr.

Técnica por vaciado en placa1. Pesar 10gr. o ml. de alimento y adicionarlos a 90ml. de agua peptonada de

fosfatos. (dilución 10-1)2. Realizar las diluciones 10-2, 10-3 y10-4 en agua peptonada contenida en 4

tubos, con 9 ml.3. Colocar 1ml. de cada una de las diluciones en el centro de una caja petri.4. Adicionar aproximadamente 20ml. de agar métodos estándar, fundido y

enfriado a 45°C.5. Homogenizar y dejar solidificar el contenido en las cajas de petri.6. Incubar las cajas a 35°C durante 48 horas.7. Contar la cantidad de colonias en cajas que tengan no más de 30 y 300 UFC.8. Informar la cantidad de UFC/g o ml.

CUESTIONARIO1. Ventajas y desventajas de la técnica de inoculación en superficie.2. Ventajas y desventajas de la técnica de vaciado en placa.3. Cuando se utiliza una y cuando la otro.4. Definir que es un UFC.

Práctica no. 2RECUENTO DE ORGANISMOS COLIFORMES Y COLIFORMES

FECALES POR LA TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE

INTRODUCCIÓN

Esta técnica descansa en una base estadística, matemática inobjetable para expresa cuantitativamente el crecimiento microbiano en un material, la prueba consiste en inocular series de tubos con un medio de cultivo y algún dispositivo o indicador, que permita poner de manifiesto un microorganismo o un grupo particular de ellos con una característica metabólica definida. Un cierto número de tubos de siembra con volúmenes definidos de muestra, por ejemplo tres tubos de la dilución 10-1, tres tubos de la dilución 10-2 y tres tubos de la dilución 10-3, después de la incubación si la distribución de gérmenes es homogénea en la muestra original, es de esperarse un número de tubos positivos en proporción directa al contenido microbiano de la muestra. Para cada combinación e tubos positivos, con respecto a los inoculados existe un número que puede consultarse en las tablas de número más probable.

En la preparación de estas tablas se ha utilizado el calculó estadístico mediante formulas que conducen a los límites de confianza de 0.95 esto significa que de 100 estudios practicados 95 de ellos dan resultado dentro de tales límites.

La técnica de número más probable requiere de más materiales que los recuentos en placa, se considera en general que posee menor exactitud y precisión, sin embargo es incomparablemente más sensible, ya que pone de manifiesto un solo germen o unos cuantos, en un gran volumen de muestra, teóricamente litros. Por esa razón encuentra aplicación en el análisis de agua en donde la presencia de 2 organismos coliformes en 100ml. de agua ya reclama atención en un sistema de abastecimiento de agua.

Con frecuencia en la aplicación de la técnica de número más probable, para un grupo particular de microorganismos, el ensayo se extiende a dos o más estadios, en este caso la prueba presuntiva, en donde la presencia de tubos positivos puede deberse no solo a la actividad de los grupos microbianos en cuestión, sino a microorganismos que por acción sinérgica producen un comportamiento similar, por lo mismo se debe utilizar una serie más de tubos para confirmar la presencia del grupo microbiano en cuestión, utilizando un medio de cultivo de mayor selectividad.

Posteriormente los resultados de las combinaciones positivas de tubos se consultan en las tablas de número más probable.

Además el primer estadio sirve para reponer a los microorganismos que han sufrido daño subletal, por exposición a algún tratamiento físico o químico al que se haya sometido el alimento, por ejemplo la refrigeración, congelación, tratamiento con germicidas, lo que permite que en el estadio siguiente se desarrollen los microorganismos sin problemas en los medios selectivos.

La técnica se utiliza para el caso de alimentos en los que por el proceso térmico al que se someten, se espera que contengan pocos microorganismos y algunos de ellos con daño subletal por lo que por otro método no se puede poner de manifiesto su presencia.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICAa) Que el alumno realice el recuento de organismos coliformes por esta técnica.b) Que conozcan el fundamento de la técnica.c) Que interprete correctamente los resultados.

MÉTODOS EXPERIMENTALES EN RELACIÓN A LA TÉCNICAAlimentos a analizar:

Agua fresca, Hielo, Alimentos congelados, Ostiones, Alimentos deshidratados, Alimentos pasteurizados que a su vez contienen conservadores, Alimentos irradiados o tratados con óxido de etileno.

TÉCNICA PARA EL RECUENTOa) Pesar 10gr. o utilizar 10ml. de la muestra a analizar.b) Realizar las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3.c) Sembrar 3ml. de cada de las diluciones en cada uno de tres tubos

conteniendo, caldo lactosado con campana de Durham o caldo laurel Triptosa.d) Incubar los tubos durante 24 a 48hrs. a 35°C.e) Pagar 1ml. de cada uno de los tubos que presenten ácido y gas a tubos

conteniendo caldo lactosa bilis verde brillante o caldo EC.f) Incubar los tubos 24 a 48hrs. a 35°C.g) Seleccionar aquellos tubos que presenten ácido y gas.h) Consultar la combinación de tubos positivos ordenándola conforme a las

diluciones realizadas en orden decreciente, en las tablas de número más probable.

i) Informar el número más probable por gramo o mililitro.Este recuento corresponde a los coliformes totales.

RECUENTO DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALESj) tomar con un asa una alícuota y sembrar los contenidos de los tubos positivos

a tubos con caldo lactosa bilis verde brillante.k) Incubar los tubos a 45°C por 24 a 48hrs.l) Separar los tubos que presenten ácido y gas y leer en las tablas del número

más probable.

Este recuento corresponde a los coliformes fecales (Escherichia coli).Confirmar la presencia de Escherichia coli realizando las pruebas IMVC.Se puede realizar la identificación bioquímica de las colonias fermentadoras de la lactosa, confirmando la característica por el crecimiento en medio E.M.B, posteriormente realizando la identificación bioquímica por pruebas metabólicas de las cepas fermentadoras de la lactosa.

Los organismos coliformes son bacterias gram negativas no esporuladas que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso comprendido entre las 24 a 48hrs. de incubación.

La presencia de organismos coliformes en los alimentos se interpreta como que se realizaron prácticas sanitarias deficientes en la preparación de los mismos, ya que a diferencia del agua, estos organismos se multiplican en los mismos.

En las aguas frescas endulzadas se da la misma interpretación ya que permiten su multiplicación.El riesgo de la multiplicación de estos microorganismos nos implica el riesgo de la presencia de microorganismos patógenos presentes de asiento intestinal en algunos casos como en los ostiones que por sus hábitos de vida están en contacto con aguas contaminadas con material fecal en algunas ocasiones, en cambio en otros alimentos existe escasa relación entre los organismos coliformes y la Escherichia coli con la presencia de patógenos de asiento intestinal, por lo que en esos casos nos indican que nuestras condiciones de trabajo son incorrectas pudiendo alterarse más rápidamente los alimentos o el riesgo en sí de la presencia de cepas de Escherichia coli enteropatógena o entero toxigénico, o que debemos de corregir las condiciones de limpieza y desinfección de equipo, medio ambiente, así como la selección de materias primas adecuadas.

CUESTIONARIO1. Como se interpreta la presencia de organismos coliformes en el agua.2. En que medios de cultivo se pueden observar las características metabólicas

de IMVC y que importancia presentan en la identificación bioquímica de coliformes.

3. ¿A que bacterias se reconsidera como coniforme fecal y porque?4. ¿Por qué es importante determinar organismos coliformes fecales y en que

casos se aplica la prueba?

Práctica no. 3RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

INTRODUCCIÓNLa importancia de los hongos en los alimentos puede considerarse desde

diferentes puntos de vista.

a) Se utilizan en la fabricación de algunos alimentos (ejemplo Penicillium camemberti en el queso Camembert).

b) Producen alteraciones diversas por ejemplo Rhizopus nigricans en el pan.

c) Generan toxinas con notables efectos en los animales y el hombre (Aspergillus flavus produce alfatoxinas en los cereales.)

d) En algunos alimentos su número se asocia generalmente a prácticas sanitarias deficientes en la fabricación y almacenamiento de alimentos.

Por estas razones se han desarrollado en el laboratorio de microbiología de alimentos, una diversidad de medios de cultivo y técnicas para efectuar su aislamiento, recuento e identificación. Los recuentos pueden referirse a fragmentos del micelio de hongos que han desarrollado en el alimento, o alas colonias sobre placas de un medio apropiado. El primer caso puede usarse para conocer la calidad de la materia prima utilizada en la fabricación de un producto, habitualmente, de naturaleza vegetal y la presencia de sustancias inhibitorias e incluso la falta de viabilidad del hongo, carecen de la importancia. Cuando se desea en cambio conocer la concentración del microorganismo prepara una muestra bien para estimar el nivel de contaminación como indicador de prácticas anti-higienicas y es indispensable una cuenta viable.

Para este último fin se sigue una técnica similar a la descrita para el recuento de colonias por vaciado en placa.Algunas diferencias que observan los hongos con respecto a las bacterias en las técnicas de recuento en los alimentos, incluyen:

a) Una velocidad de crecimiento más lenta que las bacterias.b) La demanda de un ambiente aeróbico.c) La tendencia de algunas especies de desarrollar extensivamente sobre las

placas de cultivo.d) Una temperatura de crecimiento inferior a la de la mayoría de las bacterias

mesófilas de interés sanitario.e) La formación de colonias de tamaño mayor a las de las bacterias y limitadas a

la superficie del medio.f) Una tolerancia notable de la mayoría de las especies para desarrollar en un

medio de alta acidez (pH 3 a 4).g) L resistencia de los hongos y levaduras para desarrollar en medios con

antibióticos que resultan fuertemente inhibitorios para las bacterias.

Sin merma en la exactitud y precisión, se pueden realizar las mismas suspensiones y diluciones preparadas para el recuento de bacterias a partir del alimento.Incluso, así como para el recuento viable de bacterias se emplean las técnicas de vaciado en placa, extensión de superficie y NMP, se ha señalado recientemente, el éxito en su aplicación para el recuento de hongos. Los requerimientos nutricionales de los hongos en general no son muy especializados y estrictos; ; desarrollan con facilidad en casi todos los medios simples de laboratorio. Sin embargo, dada la lentitud en su crecimiento que demanda hasta de 5 días de incubación para evitar la interferencia de bacterias, suele adicionarse al medio de cultivo un agente selectivo; los más utilizados son antibióticos de amplio espectro contra bacterias (aureomicina, cloranfenicol) y la acidificación del medio con un ácido orgánico. Los datos reportados por algunos autores muestran que con estos artificios no suelen encontrarse una diferencia significativa en los recuentos al utilizar diferentes medios de cultivo:Agar-papa-dextrosa, agar malta, agar libre de azúcar, o agar cuenta estándar. Constituyendo la tierra el mayor reservorio de hongos al tomar contacto con los alimentos fácilmente se traduce en un incremento en la carga microbiana sobre todo de este grupo. Al ponerse esto de manifiesto en el laboratorio, se puede condenar al producto, cuando la cifra rebasa límites que previamente han demostrado son impropios de una fabricación higiénica. En general, simultáneamente con el recuento

de hongos puede realizarse el de las levaduras, ya que le medio de cultivo les proporciona también buenas condiciones para su multiplicación. Sin embargo, cuando se presenta un desarrollo excesivo de hongos, difícilmente puede efectuarse el recuento de las colonias de las levaduras. Si tal es el caso y existe la necesidad de practicar su recuento, lo recomendable es prepara doble serie de diluciones e incubar una a 35°C durante 24-48hrs. lo que permite desarrollar a las levaduras cuando los hongos aún no cubren las placas. Las colonias de levaduras pueden aparecer sobre la superficie o en el seno de la gelosa. En el primer caso son circulares y de diámetro mayor; en el seno del medio suelen aparecer estrelladas y algo más pequeñas.

Los alimentos en los que suele utilizarse el recuento de hongos para conocer acerca de sus antecedentes sanitarios son las salsas, harinas, especias, mantequilla, margarina, leche, huevo en polvo, verduras frescas y congeladas. Las levaduras tienen interés en las bebidas no alcohólicas embotellada, melazas o miles, salsas y ocasionalmente en algunos lácteos.Al contar las colonias de hongos en las placas se debe individualizar cada una debido a la confluencia ocasional en el desarrollo de colonias cuyo centro no existe o es difícilmente perceptible y puede haber cierta dificultad. Esta se elimina o disminuye cuando el recuento se realiza en las primeras 72 horas de incubación.

DESARROLLO1. Pesar 10gr. de muestra. Adicionarlas a 90ml. de agua peptonada.2. Licuar durante 30seg. a lata velocidad dejar reposar 10min.3. Transferir 1ml. a cada una de las 2 cajas petri estériles (dilución 1:10).

Adicionar 10ml. a un frasco con 90ml. de diluyente. Agitar. Inocular 1ml. de suspensión del segundo frasco (dilución 1:100) a cada una de dos cajas petri estériles y 0.1ml. a dos cajas de petri (dilución 1:1000) en el caso de muestra muy contaminadas.

4. Acidificar el medio de agar-papadextrosa con el ácido tartárico hasta pH 3.5 (aproximadamente 1.5ml. por 100 de medio, cuando aquel se encuentre fundido y enfriado a 45°C). Agregar a una serie de cajas 30.35ml. del medio. Dejar solidificar.

5. Incubar a 28°C durante 3 días y sin destapara, efectuar un recuento presuntivo de las colonias de hongos desarrollados, si éste ya se hiciera muy evidente sobre las placas. En este caso contrario prolongar hasta 5 días el desarrollo extensivo no permite el recuento de las colonias, reportar el número obtenido a los 3 días haciendo notar en el informe ese período de incubación.

6. Multiplicar la cifra obtenida, por la inversa de la dilución correspondiente y reportar las colonias de hongos por gramos de muestra.

7. Para la investigación de levaduras sembrar 1ml. de las diluciones 10-1 a 10-3

en cajas petri, adicionar Agar papa Dextrosa acidificado e incubar a 35°C durante 24hrs., contar en las placas las colonias de levaduras. Generalmente por la acidez del medio utilizado y en el breve periodo de incubación de 24hrs. existe mínima interferencia de bacterias, confirmar mediante frotis en casos dudosos.

8. Multiplicar la cifra obtenida por la inversa de la dilución correspondiente y reportar como las colonias de levaduras por grama de muestra.

Algunos hongos crecen mejor a 35°C y levaduras que lo hacen a 28°C, por lo mismo se realizan ambas cuentas considerando el desarrollo de ambos a los dos temperaturas de incubación.

CUESTIONARIO1. Describir la técnica de filtro de membrana para recuento de hongos y

levaduras. Indicando ventajas y limitaciones.

2. Describir la técnica de Petrifilm para ambos grupos indicando ventajas y limitaciones.

3. Importancia que presenta la realización del microcultivo a partir de muestras que provienen de alimentos.

BIBLIOGRAFÍAAmerican Public Health Association 2004 Recommended Methods for the Microbiological Examination of foods. American Public Health Association New York.

Práctica no. 4RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

INTRODUCCIÓNLa presencia de Staphylococcus aureus en alimentos y su multiplicación en los

mismos representan un riesgo potencial a la salud ya que muchas cepas de estos microorganismos tiene la capacidad de producir enterotoxinas que pueden provocar una intoxicación al ser ingeridas con los productos que son contaminados con ellas.La historia de estas enterotoxinas alimentarías se remota desde el año de 1884 en el que se descubrieron brotes consecutivos al consumo de carne y leche.No fue sino hasta el año de 1914, cuando apareció el primer brote bien demostrado en el que claramente se identifico Staphylococcus aureus como contaminante en los alimentos ingeridos.

En 1930 Dack demostró que el Staphylococcus aureus era capaz de producir una toxina especifica, que originaba un cuadro de gastroenteritis, y corresponde a Baber, mérito de haber presentado por vez primera un reporte completo de un brote de intoxicación alimentaría consecutivo al consumo de leche en el que el papel etiológico de Staphylococcus aureus quedo bien definido. A partir de entonces se han reportado numerosos brotes de intoxicación y continúa presentándose aun en países con elevado nivel de saneamiento. En estado Unidos por ejemplo en 1993 se consignaron 20 brotes con 1272 casos en 1994, 43 brotes con 1565 casos, y en 1995 45 brotes con 4067 casos. Total 108 brotes con 6904 casos. Obviamente la incidencia real es superior a las cifras anteriores, debido a una proporción importante aunque incierta, de casos no notificados. Hasta antes de 1968 el diagnostico de estos casos se realizaba clínicamente y no existían medios de laboratorio adecuados para confirmarlo en especimenes humanos y en alimentos sospechosos de haberlo producido. Desde un principio pudo advertirse que el alimento incriminado (de acuerdo con la investigación epidemiológica), contenía millones de estafilococos por gramo. Era evidente que el germen debía multiplicarse profusamente en el antes de alcanzar sintetizar una dosis suficiente de toxinas para producir un daño perceptible en las personas.Pero no bastaba esa proliferación; algunos alimentos con números elevados del microorganismo, carecían de efectos tóxicos, ya desde el trabajo de Dack en 1930, había quedado claro que se trataba de una intoxicación y no de una infección ya que administrando filtrados estériles del cultivo del germen a voluntarios humanos se reproducía la sintomatología típica de la intoxicación. Por mucho tiempo se utilizo el recuento de estafilococos en el alimento sospechoso como medio para fundamentar su papel como causa de un brote. Desde luego, si bien en muchos casos habia coincidencia clara entre los datos clínicos y epidemiológicos con el hallazgo de millones de Staphylococcus aureus por gramo del alimento sospechoso, el estudio de laboratorio continuaba siendo dolo una evidencia de apoyo diagnostico. Muchos casos ocurridos bajo circunstancias especiales no podrían ser resueltos por el simple recuento de microorganismos en el alimento. Por una parte, pronto se supo que la enterotoxina que este producía era termoestable; pudiendo darse el caso de haber sido generada en alta concentración y después de un tratamiento térmico más o menos enérgico ser destruidas las bacterias dejando activa la toxina. Por otra parte, la capacidad de producirla, es una facultad más bien limitada a pocas cepas; la existencia de un gran numero de Staphylococcus aureus en un alimento por si mismo no constituye un riesgo actual y en ausencia de enterotoxinas, en estacas ó mejoro cuando se encontró que prácticamente todas las cepas coagulasa positiva no eran enterotoxigenicas y existen incluso, si bien raras, cepas coagulasa negativas y productoras de enterotoxinas.Par la microbiología no es extraño el empleo de animales de laboratorio como un recurso para ensayar la virulencia de un microorganismo; la difteria, la tuberculosis, el tétanos, la gangrena, la brucelosis, y muchos otros padecimientos son causados en el hombre por microorganismos que de alguna manera también manifiestan su efecto virulento cuando se prueban en determinados animales.

Pero también se dan casos de enfermedades infecciosas o tóxicas chuzadas por microorganismos que exhiben una marcada especificad en cuanto a la susceptibilidad de los huéspedes, al menos dentro de márgenes de dosis. Entre los animales de laboratorio probados con los filtrados de cultivo de cepas enterotoxigenicas de S. aureus, solo el mono responde satisfactoriamente. Por algún tiempo se recurrió a este animal; pero la morbilidad del padecimiento es tal y el riesgo de inducir resistencia por repetición en los ensayos que obviamente no podía pensarse en su empleo como un medio para utilizarlo en la rutina de laboratorio.Dolman observó que el gato de 4 semanas responde con vómito a la administración intraperitonal de filtrados de cultivos de cepas enterotoxigenicas de S. aureus, pero

la respuesta pierde especificad cuando lo que se ensaya es un alimento y en general el problema práctico que se presenta es la demostración de la toxina justamente en el alimento.

Los primeros estudios, que al fin han conducido al diseño de métodos inmunológicos para este propósito, se iniciaron en 1965.Mediante concentraciones y parcial purificación de la toxina se han logrado obtener buenos antisueros y demostrar la existencia, a la fecha de 5 tipos antigénico A,B,C,D,E. La prueba de difusión en gel de Ouchterlony ha resultado especialmente útil y disponiendo de toxinas y antitoxinas de referencia, el ensayo es en la actualidad un hecho corriente en muchos laboratorios del mundo.

Diversos autores han desarrollado colateralmente, pruebas indirectas que señalan la presencia de S. aureus entre ellos están las pruebas de termonucleasa y coagulasa.

La prueba de la coagulasa, caracteriza a S. aureus, sin embargo, no siempre puede ser demostrada citándose además mutantes que pudieran dar la prueba negativa.

Se han encontrado cepas de Staphylococcus que dan negativa la prueba de coagulasa y son productoras de enterotoxinas, originándose así el estudio de otra prueba que ayudaría a la investigación de las cepas enterotoxigenicas, encontrándose una nucleasa termoestable que ha sido descrita como una enzima que se encuentra íntimamente relacionada con la multiplicación de cepas enterotoxigenicas de S. aureus.

Lachica et al, reportó que de251 cepas productoras de enterotoxinas de la Food Research. Institute Collection Wisconsin, el 95% son productoras de termonucleasas y el 93% son productoras de coagulasa.

Rayman et al, publicó que de 63 aislamientos de alimentos y personal involucrado en brotes de intoxicación alimentaría, 62 produjeron termonuclear, y 63 dieron positiva la prueba de la coagulasa, produciendo todos ellos enterotoxina, siendo 35producto s de enterotoxina A, 3 de enterotoxina B, 5 enterotoxina C, 20 enterotoxina D.

Se ha demostrado además la relación entre la enterotoxigenicidad y la capacidad de producir coagulasa y termonucleasa por lo que estas dos pruebas siguen siendo importantes apoyos para determinar el riesgo potencial de la presencia de enterotoxina en alimentos.

Tatini y col. trabajando con varias cepas diferentes de S. aureus y una variedad de alimentos, encontraron una estrecha relación entre la producción de la enterotoxina más comúnmente involucrada en brotes y la producción de termonucleasa. Ellos reportan que el 98.3% de las cepas enterotoxigenicas producen termonucleasa.

Estos resultados contrastan con los obtenidos por Amador, quien trabajando con cepas aisladas de productos carnicol encuentran una correlación entre la producción de termonucleasa y enterotoxina del 27.4% y entre coagulasa y enterotoxina del 24%.

Se ha publicado que el mayor número de brotes de intoxicación estafilococcica son causados principalmente por S. aureus productor de enterotoxinas tipo A comparados con cualquier otro tipo de enterotoxinas, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Reyes y Rodríguez en cepas aisladas de productos lácteos y manipuladores de alimentos, respectivamente, sin embargo para cepas aisladas de

productos cárnicos, Amador (1) encuentran una mayor frecuencia de cepas productoras de enterobacterias C y D.

Sin embargo el recuento de estafilococos en los alimentos, continúa siendo motivo de interés para el analista, fundamentalmente por tres propósitos:

1. Poner de manifiesto deficiencias en el manejo de algunos alimentos.2. En el control sanitario de los alimentos. Un número elevado de gérmenes

constituyen un riesgo potencial par la salud de la población que consume alimento.

3. Continua siendo utilizado el recuento como medio para reforzar un diagnostico clínico y epidemiológico de un brote en ausencia del ensayo inmunológico.

La presencia de S. aureus en los alimentos se reconoce en general como indicativo de manejo sanitario de los alimentos. Un número elevado de gérmenes constituye un riesgo potencial para la salud de la población que consume alimento.Continua siendo utilizado el recuento como medio para reforzar un diagnostico clínico y epidemiológico de un brote en ausencia del ensayo inmunológico.

La presencia de S. aureus en los alimentos se reconoce en general como indicativo de manejo sanitario deficiente. El germen causa procesos infecciosos en el hombre y en los animales y se aísla en individuos asintomático de nariz, faringe y piel. Aunque estas son las fuentes de contaminación más frecuente de S. aureus a los alimento, es posible también una contaminación indirecta a través del equipo y desde luego, alimentos provenientes de animales con ka infección; como germen llega a instalarse con cierta facilidad en las personas y es de esperarse un hallazgo más o menos compón en los alimentos. Sin embargo en aquellos que están sujetos a un tratamiento antibacteriano dada a susceptibilidad del microorganismo a los agentes físicos y químicos, deberán encontrarse libres de células viables de los estafilococos; los rellenos de crema para pastel, constituyen un ejemplo de estas situación. Aun en los casos en los que difícilmente puede evitarse la contaminación del germen, una refrigeración adecuada y oportuna constituye la medida más indicada para evitar la proliferación del germen y el eventual riesgo de producción de la toxina. El recuento de estafilococos en los alimentos tales como los quesos frescos, y la carne procesada, puede poner de manifiesto una deficiencia preservación del producto y suele utilizarse como límite, hasta 10000 microorganismos por gramo de alimento.Por estas razones, pueden encontrarse en la literatura numerosos reportes sobre el diseño y evaluación de medios de cultivo a los que se ha incorporado una variedad de agentes selectivos.

La mayoría de ellos recurren al empleo de telurito de potasio o a la incorporación de cloruro de sodio hasta 7.5 y 10%. Los medios de 110 y de Champman tan utilizados en bacteriología médica, tiene escaso valor en los alimentos debido principalmente a la abundante y variada flora competitiva que suele encontrarse en estos últimos.

Todos los medios propuestos y en uso como selectivos para S. aureus, de alguna manera interfieren también con el crecimiento de este germen. Como en el caso de la salmoneras el efecto se resiente aún más con células desvitalizadas que resultan de la variedad del tratamiento al que son sometidos los alimentos durante su procesado. La inhibición a su vez, puede ser revertida si se incorporan al medio algunas sustancias, o se aumenta su concentración como ocurre con la yema de huevo, el manitol y el extracto de levadura.

PROCEDIMIENTO PARA EL RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS

Preparación y dilución de la muestra.Pesar 10gr. de la muestra adicionar 100ml. de diluyente ponerlos en la licuadora y moler aproximadamente 30seg.Preparar diluciones decimales hasta la dilución 1:10,000 (10-4) y proseguir de acuerdo con la técnica de diluciones e inoculación en superficie.

METODO DE BAIRD PARKER1. Colocar .1ml. de cada dilución sobre una placa de agar y extenderla con una

varilla de vidrio en toda la superficie del medio.2. Incubar las placas invertidas a 35-37°C durante 24-48° horas. Después de 24

horas seleccionar las placas que muestren de 50 a 150 colonias aisladas, contar y marcar todas aquellas que parezcan negras y brillantes con o sin ligeros bordes blancos y rodeados por zona clara en el fondo del medio opaco. Incubar las placas 24 horas más e incubar en incluir en el cómputo las colonias nuevas que reúnan las características ya señaladas.

3. Seleccionar la caja que contenga entre 50-150 colonias típicas efectuar un frote y teñir con la técnica de Gram a algunas de las colonias escogidas y practicar las pruebas de fermentación de manitol en anaerobiosis, coagulasa y termonucleasa.

4. Efectuar la prueba de la fermentación de manitol en los medios de cultivo indicados.

5. Sembrar el número de colonias que se indican:Menos de 50 --------------------- 3 colonias por probar51-100 --------------------- 5 colonias por probar 101-150 --------------------- 7 colonias

Se sembraran en 5ml. de caldo infusión cerebro corazón la mitad del crecimiento se destinara para la técnica de coagulasa y otra para la técnica de la termonucleasa, incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.

PRUEBA DE COAGULASAa) A una serie de tubos agregar 2.5ml. de plasma de conejo.b) Incubar en baño maría a 35°C y observar a las 2 y 4 horas y los negativos

descartarlas hasta las 24 horas.c) Reportar positivas la prueba si hay formación de coagulo pequeño pero bien

constituido o una coagulación total de la mezcla.

Práctica no. 5INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA, SHIGELLA Y ARIZONA EN

ALIMENTOS

INTRODUCCIÓNLas incidencias de Salmonelosis a nivel mundial es muy alta. En nuestro país

desde 1969 ocupan las enteritis y otras enfermedades diarreicas el segundo lugar en causas de mortalidad notificándose para el año 2000 un total de 594,920 casos, con una mortalidad de 875.5 por cada 100 000 habitantes; como se puede apreciar por estos datos y ya que el grupo mas afectado es el comprendido de 0 a 4 años, se requiere que la vigilancia y el control epidemiológico de este tipo de enfermedades transmisibles sea muy eficaz lo cual demanda de un conocimiento exacto de la naturaleza del agente casual. Las normas y lineamientos para hacer efectivo ese control se fundan en datos de morbilidad y mortalidad en el espacio y en el tiempo, también es importante para el epidemiólogo disponer de información sobre la ecología del agente etiológico, esto es su hábitat natural, sus fuentes de aislamiento y su resistencia a las condiciones ambientales fuera de sus huéspedes naturales. En el caso de la salmonelosis el problema adquiere una complejidad especial en vista de que algunos de sus miembros son específicos para un huésped, en tanto que otros pueden infectar lo mismo a animales que al hombre.

Muchas especies animales funcionan como vectores, el germen es arrojado por las materias fecales y pueden contaminar los alimentos, aquí bajo condiciones favorables, se multiplican activamente. Es una fuente de contaminación a su vez

para animales y humanos. Las experiencias en todo el mundo a través del estudio de muchos brotes de infección alimentaría debidas l consumo de alimentos contaminados por Salmonella ha conducido al establecimiento de practicas higiénicas en el manejo de estos productos para mejorar su calidad sanitaria. Estas prácticas intentan:

a) Evitar la contaminación con este microorganismo.b) Impedir la multiplicación del microorganismo.c) Destruirlo.

Pero el trabajo en el campo del epidemiólogo durante el estudio de un brote junto con las técnicas en saneamiento para evitar la repetición del accidente, solo se desarrolla exitosamente si se dispone de un servicio de laboratorio que permita efectuar investigaciones y diagnósticos oportunos y confiables en una variedad de muestras: como pueden ser en especimenes humanos, para confirmar un diagnóstico clínico, o descubrir un portador del germen, así como en el equipo de una planta procesadora y en las materias primas para rastrear fuentes de contaminación y en los alimentos para determinar su calidad sanitaria ó su implicación como causa del brote.

Las técnicas para el aislamiento de la salmonella a partir de los alimentos constituyen un ejemplo muy ilustrativo de la flexibilidad fisiológica de las bacterias de la influencia que sobre esta tienen los diferentes tratamientos con los que la industria procesa los alimentos y la variedad de diseño que el microbiólogo puede llevar a efecto en las técnicas de laboratorio para poner de manifiesto contaminaciones aún minúsculas por microorganismos (a veces una bacteria en 500gr. de producto) y que con frecuencia se han visto seriamente lesionados en su viabilidad.

Tales técnicas tienen que resolver además, el problema de la interferencia de miles y millones de otras bacterias, ecológica y fisiológicamente, muy relacionadas con el microorganismo en cuestión.

Dentro de esta tarea, es evidente que la sensibilidad, ligada a la especificad, son las características claves en las técnicas de análisis a diferencia de la precisión y exactitud que son fundamentales en los recuentos de microorganismos en los alimentos.

Precisamente debido a esa flexibilidad de los microorganismos frente a las condiciones ambientales en las que llegan a verse involucrados, se pueden observar cambios notables en su comportamiento en los medios de laboratorio en términos que varían con la naturaleza de los tratamientos a los que se han sometido.

Es explicable pues, que no exista un solo método bien definido en todos sus puntos (como el recuento de bacterias mesofílicas aerobias) para el aislamiento de Salmonella a partir de alimentos.

Aunque microbiólogos y epidemiólogos están de acuerdo en que cualquiera de los aproximadamente 1500 serotipos conocidos de Salmonella deben de considerarse potencialmente patógenos para el hombre y por ello condenar cualquier alimento que la contenga, se sabe por otra parte, que la susceptibilidad a los agentes físicos y químicos muestran diferencias interesantes entre esos serotipos. También se conoce en muchos casos el daño que sufren estos microorganismos por acción del calor, la desecación, las radiaciones o la acidez excesiva al procesar los alimentos. Se ha ensayado y evaluado por ello, ele efecto de diversas sustancias y tratamientos para

permitir una recuperación de las salmonellas en los medios de cultivo, así como respuesta al efecto tóxico de las sustancias inhibidoras adicionadas a estos.

Asimismo, otros estudios han evaluado el tamaño de las alícuotas de alimento inoculado a los medios de cultivo, en la sensibilidad de las técnicas para el aislamiento del microorganismo. El resultado de todo esto ha sido la confección de una numerosa variedad de técnicas, algunas de ellas específicamente indicadas para un tipo particular de alimento.

Diversas variables han sido señaladas como factores que influyen en las técnicas de análisis, ellas son:

1. El tamaño del inóculo en la muestra.2. El tipo de medio de pre-enriquecimiento y de enriquecimiento.3. la composición química del alimento.4. tipo de densidad de la flora bacteriana asociada a las salmonellas.5. la temperatura y tiempo de incubación de los medios de enriquecimiento.6. El número de salmonellas presentes en el alimento y mejor aún, en la alícuota examinada.7. Los serotipos de Salmonella involucrados.8. El estado fisiológico y condiciones fisiológicas de las salmonellas. En general las técnicas son laboriosas, costosas, y se requiere de tiempo y personal bien adiestrado. Pero la importancia que para la salud pública constituyen estos microorganismos da lugar a que continúen ensayándose nuevas técnicas con el objetivo de hacerlas ´{as sensible, específicas, económicas y rápidas.

La metodología general incluye una sucesión de etapas:a) Pre-enriquecimiento o enriquecimiento no selectivo.b) Enriquecimiento en medios selectivos.c) Aislamiento en medios de agar selectivo.d) Identificación presuntiva mediante pruebas bioquímicas.e) Identificación semiológica.

En los laboratorios muy especializados se completa el estudio con la tipificaciónfágica para identificar a que grupo pertenece la Salmonella aislada.

El propósito del pre-enriquecimiento consiste en facilitar a las salmonellas presentes en el alimento una recuperación del estado en el que se encuentran como resultado de la exposición a condiciones traumatizantes durante el procesado de algunos alimentos (leche en polvo, harina de pescado, jamón, etc.)

Los medios de cultivo que para tal fin se utilizan no contienen en general sustancias inhibidores; la flora asociada no se ve por ello impedida para proliferar.

De ahí que el recurso del medio de pre-enriquecimiento debe manejarse cautelosamente para obtener sus beneficios en la recuperación de las salmoneras y evitar un sobre-desarrollo de la flora competitiva que estorbe su aislamiento.

En los alimentos crudos y en los levemente procesados (carnes crudas, ensaladas, etc.) el empleo del pre-enriquecimiento no es recomendable. Es necesario tomar en consideración que la salmoneras en los productos procesados pueden encontrarse no solo mermadas en su vitalidad, sino generalmente en escaso número. Entre los medios de pre-enriquecimiento recomendados están el agua peptonada (jamón cocido), el caldo lactosado (huevo en polvo) y el agua destilada (leche descremada).

Los medios de enriquecimiento pueden utilizarse s partir de pre-enriquecimiento, o directamente con el alimento; contienen sustancias inhibidoras y pretenden, por una parte de la multiplicación de las salmoneras y por otra impedir el desarrollo de la flora asociada. Este es al menos, el objetivo, pero diversos factores determinan el valor de cada uno de los medios conocidos en mayor o menor grado por ejemplo algunos medios pierden poder selectivo al ser adicionados del alimento.

Por esta razón se pueden encontrar en la literatura especificaciones para cada tipo de alimento en lo referente no solo al medio de enriquecimiento recomendado, sino a las condiciones en que debe ser utilizado como la concentración del inóculo, temperatura y tiempo reincubación. Así por ejemplo los investigadores recomiendan incubar los medios de enriquecimiento a 43°C y han logrado un aumento en el aislamiento de Salmonera; si el alimento contiene una porción importante de grasa (salchicha) la adición de un emulsificante como en el Tween 80 resulta favorable, aunque esto solo se aprecia con incubación a 35°C y no a 43°C, probablemente el efecto más notable en la eficiencia de los medios de enriquecimiento se encuentra en el tipo de alimento con que se inoculan; esto no es de extrañar, dada la complejidad de los productos sujetos al análisis, la cantidad de muestra inoculada y la naturaleza química del proceso inhibitorio por el cual funcionan estos medios de enriquecimiento. Es evidente que entre los componentes inhibidores del medio y las bacterias curren reacciones químicas que fácilmente llegan a ser inhibidas por determinados componentes del alimento.

Por ejemplo, se ha encontrado que el caldo-selenito-verde brillante impide la proliferación de bacterias como Proteus y Escherichia. Las cuales interfieren en el aislamiento de Salmonella, pero permite desarrollo abundante de ésta última, pero se observó que al inocular este medio con huevo el efecto selectivo se perdía notoriamente. Sin embargo puede demostrarse a continuación que la incorporación de sulfapiridina al medio, lo rehabilita en su capacidad para inhibir el desarrollo de aquellos microorganismos interferentes, en presencia de huevo.

Dos grupos de medios de enriquecimiento han sido utilizados con mayor frecuencia; el grupo del caldo tetrationato (bilis verde brillante o medio de Kauffman, caldo tetrationato verde brillante, caldo tetrationato sulfatiazol bilis verde brillante caldo tetrationato novobiocina) y el grupo de selenito (caldo selenito F, caldo selenito cistina, caldo selenito verde brillante y caldo selenito sulfa verde brillante).

Los medios del grupo tetrationato, contienen una fuente de nitrógeno orgánico a base de peptona, tristona extracto de carne o extracto de levadura, adicionado según el caso de sales biliares o novobiocina para inhibir a bacterias Gram (+) el verde brillante puede inhibir además de éstas a bacterias coliformes, el carbonato de calcio es ara regular el pH, neutralizando el ácido que se va generando y el tiosulfato de sodio que parcialmente pasa a tetrationato de sodio generando y el tiosulfato de sodio que parcialmente pasa a tetrationato de sodio (cuando se adiciona el yodo al inocular la muestra) tiene un efecto tóxico por reacción con los grupos sulfhídricos de las enzimas involucradas en la síntesis de la membrana y pared celular de las bacterias sensibles.

Los medios del grupo selenio, contiene una fuente de nitrógeno a base de tristona y peptona debiéndose al efecto toxico del selenito a dos posibles mecanismos: reacción con grupo sulfhídrico enzimático o formación de aminoácidos análogos en los que el selenito ha tomado el lugar del azufre. Contienen también lactosa y fosfatos los cuales tienen un efecto regulador del pH. La cistina favorece el desarrollo de las salmoneras en presencia del alimento involucrado.

Otros medios de enriquecimiento que también se usan con cierta frecuencia son el medio de Rappaport en el que los coliformes son inhibidores por el verde de malaquita, cuyo efecto nocivo sobre las salmoneras se contrarresta por la adición del cloruro de magnesio; el caldo GN de HJNA con citrato y desoxicolato de sodio como inhibidores de coliformes y bacterias Gram positivas y la incorporación de manitol para favorecer el desarrollo de Salmonella sobre Proteus.

En la práctica, la recomendación general consiste en el empleo de dos medios de enriquecimiento para cada muestra de alimento. Como consecuencia del empleo de los medios de enriquecimiento se obtiene después de la incubación una flora mixta en los caldos y a partir de ellos se procede al aislamiento de las Salmonellas, lo cual se realiza en medios sólidos los que mantiene un efecto inhibitorio sobre la flora asociada, estimulando la formación de colonias de Salmonera y finalmente comunican a estas características diferenciales respecto a las colonias de otros gérmenes. En atención a su fuerza selectiva, se pueden distinguir tres grupos: ligeramente selectivo (medios de Endo, Agar eosina azul de metileno y medio de MacConkey) moderadamente selectivos (Agar DCLS, Agar SS y Agar XDL o sea Agar Xilosa lisina desoxicolato) y fuertemente selectivos (Agar verde brillante y Agar sulfito de bismuto).

Idealmente a esta nivel de la técnica de aislamiento, las salmoneras deberían aparecer bien desarrolladas y en cultivo puro sobre las placas; esto no es, ni con mucho la regla. Otros géneros y mejor aún, ciertas cepas de esos géneros muy relacionados bioquímicamente sobre las mismas placas y otras, requieren confirmación a través de pruebas metabólicas.

Ciertas características les dan preferencia a uno u otro medio. La experiencia ha demostrado que la conducción mas correcta del análisis incluye el empleo de dos medios (uno moderado y otro fuertemente selectivo), para cada medio de enriquecimiento por muestra examinada. Cuando así se procede, el resultado muestra influencia mínima por la selección de uno u otro dentro de cada grupo. He aquí algunas de las características mas interesantes que deben conocerse de estos medios para su mejor manejo en el laboratorio:

MEDIO DE ENDO: El mas antiguo de los medios todavía en uso si bien con escasa preferencia. La fucsina agregada al medio base es decolorada por el sulfito de sodio (indicados de Andrade. Durante la fermentación de la lactosa, los grupos aldehídos liberados reaccionan con el sulfito liberando a la fucsina que comunica el color rojo característico a las colonias de bacterias fermentadoras de la lactosa. El propio colorante muestra acción inhibitoria contra las bacterias Gram positiva.

MEDIO DE MAC CONKEY: A la base peptonada se le adiciona sales biliares y cristal violeta como agentes inhibidores de las bacterias Gram positivas. El indicador es el rojo neutro, de manera que los fermentadores desarrollan color rosa. El medio no tiene un fuerte efecto inhibitorio sobre las bacterias Gram positivas que pueden formar colonias pequeñas rosadas o rojas este inconveniente se elimina incorporando cristal violeta al 1:1, 000,000.Agar desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa (DCLS). El desoxicolato de sodio rompe la integridad de la pared celular de las bacterias Gram positivas dando lugar a su lisis. El sistema indicador esta constituido por el rojo neutro, la lactosa y sacarosa estos últimos no atacados por la gran mayoría de las cepas de Salmonella las cepas de coliformes fermentan más rápidamente la lactosa que la sacarosa ocasionando coloración rosa, En cambio las salmonelas no producen colonias con color rosa, transparentes o cremas.

Agar Salmonella Shigella (SS). Este medio es una modificación del anterior en el cual la inhibición de los Gram positivos se logra con las sales biliares en lugar del desoxicolato y del verde brillante que además retarda el desarrollo de muchas cepas coliformes. Las colonias de fermentadores lentos de la lactosa y no fermentadores de tipo Proteus y Pseudomonas, forman colonias muy semejantes a la de Salmonella especialmente el primero con quién comparte en muchos casos incluso colonias negras debido a la producción de ácido sulfhídrico. En el medio la función del citrato férrico es la de una sal de ácido débil a partir del cual H2s formado lo desplaza para producir el sulfuro férrico negro. Las colonias rojas corresponden a las fermentadoras de la lactosa, por el vire del indicador rojo neutro incorporado al medio. El tiosulfato y el citrato de sodio contribuyen a darle selectividad. No obstante, se estima que alrededor del 60% de las colonias aparentemente de Salmonella, en este medio (y en las variedades de agar-desoxicolato) deben ser confirmados como tales mediante las pruebas bioquímicas subsecuentes.

MEDIO DE WILSO Y BLAIR ó AGAR SULFITO DE BISMUTO: Este es uno de los medios de cultivo de mayor predilección entre los bacteriólogos para el aislamiento de Salmonella. Es ampliamente utilizado en Europa, también es recomendado por casi todas las agencias norteamericanas interesadas en el problema a diferencia de los restantes medio, el sistema indicador no funciona a ase de la fermentación o no de la lactosa o de algún otro carbohidrato por si mismo. La flora Gram positiva es inhibida por el verde brillante y una inhibición de Gram negativas por ele efecto del sulfito de bismuto y el sulfito de sodio de acuerdo con la comunicación original de los autores. La combinación del sulfuro de fierro negro a partir H2S generado por las salmoneras en presencia de glucosa permite la aparición de colonias negras provenientes de cepas productoras de H2S.Algunos autores han señalado la obtención de falsas positivas en el medio y es de esperar su falta de sensibilidad para poner de manifiesto cepas de Salmonella no productoras de H2S (El medio fue propuesto por los autores para el aislamiento de una especie muy constante como generadora de H2S que es Salmonella Typha.

AGAR VERDE BRILLANTE: Al medio nutritivo básico se le adiciona verde brillante como inhibidor de la flora gram positivo y de algunos coliformes. El mecanismo indicador está formado por lactosa y sacarosa con el rojo de fenol como indicador.La incorporación de sulfapiridina hace aun más inhibitoria al medio, lo que según autores llega a perjudicar el aislamiento de un número de salmoneras; con o sin sulfas es también uno de los medios más recomendados.

AGAR XILOSA LACTOSA DESOXICOLATO (XLD): Aunque menos inhibitorio que los dos medios anteriores, este manifiesta aparentemente una sensibilidad mayor lo que desde este renglón, lo sitúa con ventajas. La inhibición de las bacterias gram positivas se debe al desoxicolato presente. El sistema indicador funciona a partir de 3 carbohidratos: Xilosa, Lactosa y Sacarosa. La descarboxilación de la lisina y la producción de H2S. La Xilosa es fácilmente utilizada por las salmonela, lo que provoca una acidificación del medio. Sin embargo, el descarboxilar a la lisina, las colonias de estos gérmenes elevan pH haciendo virar a rojo al indicador rojo de fenol; esta es la coloración típica de las colonias de Salmonella e el medio. Las bacterias fermentadoras de lactosa o sacarosa en el medio (el medio contiene 7.5 g) 1 de cada uno de estos azúcares) aun descarboxilado la lisina no llegaría a producir un vire alcalino del mismo.

No es difícil advertir que la variedad d e medios de cultivo diseñados para el aislamiento de la Salmonella contemplan un problema singular que surge de dos hechos: la eventual abundancia y variedad de la flora asociada y la eventual escasez

de células de Salmonella o la existencia de estas con inusual sensibilidad a los agentes inhibitorios.

La recomendación práctica de los expertos es en el sentido de utilizar para cada caldo de enriquecimiento al menos una placa de un medio fuertemente inhibitorio y otro medianamente inhibitorio.La selección de las colonias para confirmar la identificación presuntiva de las colonias de Salmonella desarrolladas en las placas se efectúan mediante la aplicación de pruebas bioquímicas en medios de cultivo que llevan incorporado un sistema sencillo o múltiple de indicadores y ningún elemento restrictivo para la multiplicación bacteriana,

Durante esta etapa se pretende conocer el perfil bioquímico de las cepas del género Salmonella. Se dice que la identificación al concluir estas pruebas es presuntiva debido a la existencia de cepas de la misma que se partan de los lineamientos típicos del genero y de cada cepa de otros géneros que pueden responder con las características propias de la Salmonella.

La oportunidad de que esto ocurra disminuye conforme se emplean más y más pruebas durante el proceso. Aun así, siempre existe el riesgo de estar frente a una cepa que no se conduce en alguna prueba en la forma que se reconoce típica de las Salmonella. Por ejemplo, después de ensayar miles de cepas de género se ha encontrado que 9.4% no producen H2S en medio de agar TSI, 5.4% son inmóviles, 0.3% no fermentan al manitol y 6% la xilosa; por otra parte un 0.8% fermentan la lactosa, 0.5% la sacarosa, 1.1% produce indol y 0.3% aunque tardíamente, llegan a desarrollar en presencia de cianuro.

El diagnóstico o identificación final de una Salmonella no se obtiene por unas cuantas pruebas bioquímicas; como tampoco deben identificarse sólo por aglutinación de un suero polivalente a partir de colonias más o menos típicas en las placas de los medios selectivos y diferenciales. Igualmente erróneo puede ser el desechar una cepa solo porque no responde a una prueba aislada reconocida como típica del género. El diagnóstico más confiaba que puede conseguirse es aquel que se fundamenta en una serie de pruebas bioquímicas positivas, según el ensayo de que se trate en cada caso, aunado de las pruebas de aglutinación con los antisueros de grupo.

Por los demás, es imperativo probar varias colonias típicas de cada placa inoculándolas a las serie de tubos con los medios que más adelante se mencionan. El bacteriólogo debe ser conciente en todo momento de que estas inoculaciones han de efectuarse a partir de un cultivo puro del microorganismo.

Por ello deberá seleccionar cuidadosamente, de preferencia bajo lente de aumento y con una adecuada iluminación aquellas colonias más sugestivas, si las hay típicas, y si no de las sospechas. Si alguna duda existiera, se procederá a su aislamiento en alguno de los medios selectivos ya comentados.

Las pruebas bioquímicas que se utilicen para la identificación presuntiva de la Salmonella no se han señalado en los diferentes manuales como obligatorios, ejecutándose correctamente, el bacteriólogo puede diseñar los medios de cultivo que en su experiencia o según su disponibilidad en el comercio se lo permitan. Se recurre en general a los siguientes: TSI Agar o el medio de Klinger para observar la fermentación de la glucosa y de la lactosa (y/o la sacarosa en el caso del TSI) y la producción de H2S; el medio SIM (para observar la movilidad, la producción de indol y la de H2S). El medio de Surraco para observar la fermentación de la sacarosa y la

hidrólisis de la urea, la fermentación del manitol en caldo manitol y la prueba para la lisina descarboxilasa en LIA agar.

El esquema preferido por los ingleses es inocular los medios de Pilles 1 para observar la producción de ureasa y la fermentación de la glucosa y del manitol y del Gillies 2 para la fermentación de sacarosa o salicina, la movilidad, la producción de H2S y la producción del indol.

Otras pruebas, como la capacidad para crecer en presencia del cianuro, la producción de acetil metil carbinol, el desarrollo en citrato, la licuación de la gelatina, la utilización del malonato y la descarboxilación de la ornitina; contribuyen a mejorar el diagnóstico.

Téngase presente que un microorganismo puede dar positiva una prueba al ensayarse sobre n medio de cultivo particular pero no en otro indicado para el mismos propósito; así mismo las temperaturas y tiempos de incubación pueden tener una influencia decisiva en el resultado; las lecturas deben efectuarse justo al final del período prescrito para cada una.

Las pruebas de aglutinación de las cepas representativamente identificadas como Salmonellas conducen al diagnóstico final del género, la especie y al serotipo. A partir del desarrollo en el medio de Kligler, TSI o de un cultivo en gelosa nutritiva, después de 24-48 horas de incubación, el microorganismo está en condiciones de someterse a la prueba.

La disponibilidad de sueros flagelares y somáticos para este fin suelen estar limitados a laboratorios especializados o de referencia. Para un laboratorio menos especializado el diagnóstico del género se puede dar razonablemente completo mediante al estudio bioquímico y a la aglutinación al menos con los sueros polivalentes. Es recomendable enviar las cepas así identificadas al Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia, para la confirmación del Serotipo involucrado. Tómese siempre en consideración la posibilidad de estar ante un alimento con más de un serotipo de Salmonella contaminante, lo que tiene significado cuando se suscita un problema epidemiológico consecutivo a su consumo.

Si el cultivo presuntivamente identificado como Salmonella se ha estudiado con un buen número de pruebas bioquímicas, puede confirmarse como Salmonella si se obtiene clara aglutinación con el antisuero somático polivalente. Es preferible en todo caso, disponer al menos de antisuero de grupo y Vi para reportar el grupo de la Salmonella involucrada.

Recientemente se le ha dado a Arizona la misma importancia epidemiológica que a Salmonella ya que ambas se les ha involucrado en problemas de Salud Pública cuando se han encontrado en diversos alimentos.

El género Arizona se encuentra formado por parte de la tribu Salmonelleae y como tiene un comportamiento bioquímico muy semejante al género Salmonella se piensa que algunas de las enfermedades atribuidas a Salmonella fueron ocasionados realmente por Arizona; por lo que en las pruebas de diferenciación bioquímica se recomienda que se incluya la prueba d utilización del malonato (Arizona de la prueba positiva) así como la de fermentación de la lactosa (el 61% de las cepas de Arizona dan la prueba positiva a las 48 horas de incubación) para la diferenciación de ambos géneros.

Al igual que Salmonella y Arizona al género Shigella se le ha involucrado en enfermedades transmitidas por alimentos, la enfermedad producidas por este microorganismo es de tipo infeccioso; esta bacteria afecta principalmente a niños pequeños que viven en condiciones higiénicas deplorables los cuales pertenecen generalmente a los estratos socioeconómicos más bajos ya que no cuenta con la facilidades para llevar a cabo las medadas higiénicas personales más elementales.

Los alimentos más frecuentemente involucrados en brotes de Shigelosis son ensaladas de verduras y purés de papa, los cuales fueron contaminados directamente por el contacto con materia fecal de las manos de los encargados de prepara estos alimentos.

El género Shigella lo forman bacterias gram negativas aerobias, no esporuladas e inmóviles; está constituida por cuatro especies:S.dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei

Se ha descrito en la literatura especializada que el género Shigella es inhibido fuertemente por la presencia de números elevados de otras bacterias (principalmente organismos coliformes) presentes en los alimentos, es muy sensible a pH ácido, es sensible a la presencia de conservadores en los alimentos (benzoato de sodio) así como a la congelación; por lo que se recomienda que los alimentos sospechosos de la presencia de Shigella se analicen lo más rápido posible y de no ser factible esto, refrigerarlos no más de 24 horas.

Los métodos usados para el aislamiento de Shigella no son tan sensible como los métodos para el aislamiento de Salmonella y/o Arizona lo que contribuye un verdadero reto para los microbiólogos encargados del control de calidad de productos alimenticios.

Par el asilamiento de Shigella partir de alimentos se recomienda un caldo de enriquecimiento, que el caldo GN (gram negativo), aunque también se recomienda sembrar directamente el alimento en medios de agar selectivo.

Tres tipo de medios e agar selectivo se han recomendado: uno de selectividad baja como el agar Mac Conkey, uno de alta selectividad (agar entérico de Hektoen) y el agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) el cuál es mediana selectividad.

Después de seleccionar las colonias adecuadas y someterlas a identificación bioquímica y serológica y comprobar la presencia de Shigella; su hallazgo indicará una contaminación reciente con materia fecal, probablemente proveniente de las manos de los manejadores de alimentos y dichos productos se califican como inadecuados para el consumo humano.

AISLAMIENTO DE SALMONELLA, ARIZONA Y OTRAS ENTEROBATERIAS A PARTIR DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTOMUESTRA (jamón, huevo en polvo, harina de pescado, helado, pescado congelado)

1. preparar la suspensión de la muestra en e caldo de preenriquecimiento de la siguiente manera:

2. Pesar 25gr. de la muestra adicionarlos a 225ml. de caldo lactosado, homogenizar, (en la licuadora si es necesario).

3. Incubar a 35°C durante 24 hora.

4. Incubar 1ml. denla muestra incubada en 10ml. de caldo selenito cistina y 1ml. en 10ml. de caldo tetrationato (adicionar 0.2ml. de una solución yodo-yoduro de potasio). Incubar a 35°C durante 18-24 horas.

5. Inocular a partir de los tubos una placa de Agar-verde-brillante, de agar sulfito de bismuto, Agar XLD, y una de agar Mac conkey o Agar EMB. Utilizar de 2 a 3 asadas para inocular cada placa y extender de manera, que puedan obtenerse colonias bien aisladas.

6. Incubar a 35°C durante 24 horas y observar cuidadosamente las colonias desarrolladas. En los diferentes medios las colonias características de Salmonella y Arizona presentan las siguientes características.

A) AGAR VERDE BRILLANTE: Transparentes u opacas de 0.5 hasta 1.5mm. de diámetro, incoloras, las colonias de coliformes activas fermentadoras de la sacarosa o lactosa presentan color rosa o rojizo por vire del rojo de fenol en medio ácido.

B) AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD): Las colonias de coliformes se encuentran rodeadas de halo amarillo y las de salmonela son de color violeta.

C) AGAR SULFITO DE BISMUTO: Las colonias son cafés, grisáceas o negras, algunas cepas de Salmonella y Arizona desarrollan con un color verde que es más característico en este medio de coliformes.

D) AGAR ENTERICO DE HEKTOEN: Son colonias verdes azules, algunas con centro negro y borde claros, las colonias de coliformes son de color salmón o naranja. Proteus puede producir colonias verde amarillentas.

E) AGAR MAC CONKEY: Son colonias incoloras y transparentes. Los coliformes precipitan en el medio las sales biliares originando colonias color rosa o verdosas.

F) AGAR SS: Son colonias incoloras negras o trasparentes; pueden tener el centro negro. Esta apariencia es compartida por algunos Proteus. Los coliformes producen colonias de color rosa.

7. Seleccionar colonias sospechosas de pertenecer al género Salmonella, Arizona y de otras enterobacterias.

8. Si no se observan colonias sugestivas del género o no hay desarrollo, proseguir la incubación 24 horas más.

9. Estar cierto de que las colonias se encuentran bien asiladas y recoger el inóculo con la punta de asa recta. De ser necesario inocular una placa de un medio enriquecido par obtener un claro asilamiento de las colonias. Inocular a partir de una colonia características provenientes del caldo selenito cistina y una colonia característica proveniente del caldo tetrationato en los medios de TSI y LIA.El medio de agar TSI (Hierro triple azúcar se utiliza para determinar la capacidad de un organismo para atacar los carbohidratos específicos incorporados en el medio basal de crecimiento (glucosa, lactosa y sacarosa) con o sin producción de gas, observando la producción de H2S.

Los cultivos se incuban a 35+ ó -2 °C de 18-24 horas.

Interpretación:Fermentación solamente de glucosa:

a) en el agar inclinado: reacción alcalina (color rojo).b) En el fondo: reacción ácida (color amarilla); si hay producción de H2S, se

produce un precipitado negro que puede enmascarar la acidez.

Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa:

a) En el agar inclinado: reacción ácida (color amarilla).b) En el fondo: reacción ácida (color amarilla).

En el medio de LIA (Agar de hierro Lisina) se utiliza para medir la capacidad enzimático de un organismo para descarboxilar este aminoácido y formar una amina dando por resultado una alcalinidad en el medio.

Interrelación:Prueba positiva: turbidez en el medio y un color púrpura.Prueba negativa: Un color amarillo claro brillante (solamente fermentación de glucosa.)

10. Destacar los cultivos que no de las reacciones típicas d Salmonella y/o Arizona en ambos medios, los cuales son el medio TSI una coloración roja en el agar inclinado (no fermentación de lactosa y sacarosa) y amarillo en el fondo, (fermentar de la glucosa), generalmente en negrece el medio (producción de H2S).El medio de agar hierro lisina (LIA): la reacción es típica cuando se obtiene un color púrpura en el agar inclinado y ennegrecimiento del medio por producción de H2S

11. Inocular los cultivos con reacciones típicas de Salmonella y/o Arizona en los medios adecuados par las siguientes pruebas bioquímicas: SIM, urea, malonato, rojo de metilo (RM), Voges Proskaver (VP), ONPG, citrato, lactosa, manitol y ornitina.

MEDIO DE SIMIncubar a 35+ ó -2°C durante 24 horas.Producción de H2S: Positiva si ennegrecimiento del medio.Producción de Indol: Agregar al tubo 0.2ml. de reactivo de Kovacs y agitar suavemente, un color rojo hace la prueba positiva.Movilidad: El microorganismo es móvil si se observa desarrollo (enturbiamiento) fuera de la picadura). Los microorganismos no móviles únicamente crecen a lo largo de la picadura.

Caldo Urea: con esta prueba se determina la capacidad de un microorganismo para romper la urea, formando dos moléculas de amonio por la acción de la enzima ureasa.Incubación: a 35+/-2°C de 24 a 48 horas.

Interpretación:Prueba positiva: un intenso color rosa-rojo en todo el cultivo.Prueba negativa: no cambio en el calor del medio (amarillo naranja)Caldo malonato: esta prueba es para determinar la capacidad de un organismo para utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, produciendo alcalinidad en el medio.

Incubación a 35+/-2°C de 24 a 48 horas.

Interpretación:Prueba positiva: un color azul brillante o azul de Prusia en el medio.Prueba negativa: no cambio de color en el medio (verde).

Caldo Rojo de Metilo (RM): esta prueba mide la capacidad de un organismo para producir y mantener como producto final un ácido estable a partir de la

fermentación de la glucosa; es una prueba cualitativa que nos mide la producción de ácido ( por medio de pH).

Incubación: a 30+/-5°C de 3 a 5 días.

Interpretación: adicionar el reactivo rojo de metilo (indicador de pH) al cultivo antes de leer la prueba.

Prueba positiva: si el cultivo es suficientemente ácido permite que el reactivo RM permanezca de color rojo (pH de 4.4) en la superficie del medio.Prueba negativa: un color amarillo en la superficie del medio (pH de 6.0).Reacción lenta: un color naranja nos indica que se debe continuar la incubación 4 días más y repetir la prueba.

Caldo Voges-Proskauer: esta prueba es para determinar la capacidad de algunos microorganismos para formar u producto final neutro, el acetil metil carbinol (acetina) a partir de la fermentación de la glucosa.

Incubación: a 35+/-2°C de 24 a 48 horas.

Interpretación:Antes de leer la prueba adicionar 0.6ml. de alga manitol y 0.2ml. de KOH al 40% es importante agitar vigorosamente el tubo después de adicionar los reactivos para que el O2 atmosférico pueda oxidar la acetoína y se obtenga el color característico de la reacción. Por lo menos deben pasar 15min. para proceder a leer la prueba.

Prueba positiva: color de rosa y roja la superficie del medio (acetoina presente).Prueba negativa: color amarillo en la superficie del medio (igual color que el reactivo).Un color café parecido al cobre se puede tomar, pero es debido a la acción de los reactivos cuando se mezclan.

Agar Citrato de Simmon’s: Esta prueba es para determinar si un organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su crecimiento. Produciendo alcalinidad en el medio.

Incubación: a 35°C de 24 a 48 horas (si la prueba es negativa en este tiempo incubar otros 3 días más).

Interpretación:Prueba positiva: crecimiento con un intenso color azul en el agar inclinado.Prueba negativa: no crecimiento y no cambia de color (verde).

Caldo ONPG: Esta prueba es para demostrar la presencia o ausencia de la enzima beta (B) galactosidasa, por medio de la utilización del compuesto orgánico orto-nitrofenil-B-D-galactopiranosido (ONPG).

Incubación: a 35°C de 18 a 24 horas.

Interpretación:Prueba positiva: color amarillo (este color es bastante estable y no desaparece si no se observa inmediatamente).Prueba negativa: no cambio de color en el medio (incoloro).

Caldo lisina: se incuba e interpreta de la misma forma que la LIA

Caldo lactosa y caldo manitol: las pruebas de fermentación (degradación) de carbohidratos se utilizan para determinar la capacidad de un organismo para degradar un carbohidrato específico incorporado a un medio basal.

Incubación: a 85°C de 18 a 24 horas.

Interpretación: si se quiere observar producción de gas introducir en los medios una campana de Durham.

Prueba positiva: a) Producción de ácido, anotar (A), pH de 6.8b) Color amarilloc) Producción de gas variable

1. Positivo para producción de gas, anotar (G).a) Aerogénica: CO2 + H2 están presentes.b) Cuando observamos burbujas en la campana de Durham, (una sola burbuja hace positiva la prueba). (AG) Cuando el microorganismo produzca ácido y gas.

2. Negativo para producción de gas.a) Anaerogénico.b) No se presentan burbujas dentro de la campana de Durham.

Anotar este microorganismo como productor únicamente de ácido (A).

Prueba negativa:a) Color rosa o rojob) Deben reincubarse.

Reacción lenta:a) un color anaranjado (si hay duda comparar con un tubo sin inocular)b) Deben reincubarse.

12. caracterizar los cultivos de acuerdo con el cuadro anexo.13. Aquellos cultivos que han sido identificados presuntivamente como miembro

del género Salmonella y/o Arizona deben ser confirmados por aglutinación con antisueros específicos.

14. Colocar con el asa sobre un portaobjetos limpio una porción del desarrollo del microorganismo sobre agar TSI, adicionar una asada de solución salina y preparar una suspensión homogénea. Agregar una asada del suero polivalente D, mezclar y mover inclinado de atrás a adelante el portaobjetos durante 60seg.

15. Observar con buena iluminación y fondo oscuro la formación de grumos como reacción positiva.

16. Incluir una suspensión control preparada en la misma forma, adicionada de suero fisiológico en lugar del antisuero. Par que el ensayo tenga validez no debe aparecer aglutinación en la segunda gota.

17. Idealmente deben hacerse tanto una aglutinación con los antisueros “O” polivalentes de Salmonella y Arizona y con antisuero “H” polivalente para Salmonella. El primero puede dar falsas reacciones positivas, debidas a bacterias de otros géneros pero que comparten con estás algunos antígenos somáticos. Habiéndose realizado una lista conveniente de pruebas bioquímicas, puede darse por confirmado el diagnóstico con la aglutinación con el antisuero “O”. El antisuero “H” es más específico para Salmonella, carácter que solo pierde ante miembros del género Arizona.

18. Reportar la presencia o ausencia de Salmonella y/o Arizona en 25gr. de muestra.

CuestionarioDescribir la técnica de aislamiento de salmonela por Petrifilm, indicando las ventajas y desventajas de la misma.

Práctica no. 6RECUENTO DE BACILLUS CEREUS A PARTIR DE ALIMENTOS

INTRODUCCIÓNBacillus cereus es un bacilo Gram positivo formado de esporas, es móvil,

aeróbico, pero es capaz de crecer anaerobicamente en medios complejos. La temperatura mínima de crecimiento es de 10 a 20°C la óptima de 30 a 35°C y la máxima es de 35 a 45°C. Crece en un rango de pH de 4.9 a 9.3 y en una actividad acuosa mínima de .95.

Este microorganismo se encuentra ampliamente distribuido en el suelo y en el polvo y aquellos alimentos se pongan en contacto con polvo o tierra pudiera contenerlo.

B. cereus se ha aislado de frutas, verduras, cereales, harina, almidones, productos para pastelería, sopas, especies, leche cruda y pasteurizada, cremas, budines, papas y salsas, entre otras.

El interés sanitario por este microorganismo se ha manifestado hasta hace unos pocos años en América, aunque en Europa y en Hungría es uno de los principales microorganismos causantes de gastroenteritis; en USA se han reportado pocos brotes y en nuestro país se carece de datos en cuanto a la frecuencia con que se aísla de los alimentos así como de si ha causado o no brotes de gastroenteritis, ya que la alta endemicidad de gastroenteritis producida por el mismo.

Los síntomas de la enfermedad son usualmente leves y se presentan de 2 a 6 horas después de haber consumido al alimento contaminado con un número elevado del microorganismo (106 a 109 UFC/g); el padecimiento tiene duración de 12 a 18 horas y se caracteriza por diarrea, náuseas y dolor abdominal, raramente vómito o fiebre.

Se ha visto que requiere de un número elevado de microorganismos viables para causar enfermedad, lo cual se favorece en sitios donde se preparan alimentos en grandes cantidades, donde dichos alimentos se cocinan en recipientes muy grandes que dificultan la refrigeración del producto o los alimento se recalientan por tiempos prolongados.

La metodología recomienda para el recuento de este microorganismo aprovecha dos características importantes:

1. B,, cereus produce en los medios de cultivo con yema de huevo un enzima que proporciona turbidez alrededor de la colona, esta enzima se le ha llamado factor yema de huevo lecitinasa fosfolipasa.

2. El microorganismo es resistente a la polimixina B.

Los dos medios de agar recomendados para el recuento de B. cereus son KG (Kim y Geopfert) y el medio de MYP, ambos se inoculan por superficie a partir de las diluciones del alimento y a partir de las colonias desarrolladas es necesario una confirmación por medio de pruebas bioquímicas como son la fermentación de algunos azúcares, así como las pruebas de reducción de nitratos, licuefacción de la gelatina, hidrólisis del almidón, la peptonización, con o sin coagulación de la leche tornasolada, así como la prueba de Voges Proskauer, entre otras.

Control.- las medidas de control para evitar el desarrollo de B. cereus son una adecuada preservación del alimento (por arriba de 55°C o por debajo de 100°C) de tal manera que se prevenga el desarrollo del microorganismo ya que como se había señalado se requiere de un numero elevado del microorganismo para causar la enfermedad.

ALGUNAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE B. CEREUS

Prueba Comportamientocatalasa +

movilidad + -reducción de nitratos + - hidrólisis de almidón + -

reacción de yema de huevo +V.P. +

liquefacción de gelatina +glucosa Asacarosa AGlicerol Asalicina Amanitol -

leche peptonada PeptonizaciónGelatina nutritiva +

Caldo nitrato +

A= producción de acido sin gas.C= del 10 al 50% de las cepas son +.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 10gr. de la neutra y colocarlos dentro de un vaso de licuadora estéril, agregando 90ml. de regulador de fosfatos y homogenizar durante 1 minuto.

2. Preparar las diluciones decimales hasta la dilución 1: 100 000 en tubos con 9ml. de regulador de fosfatos.

3. Incubar .1ml. de cada dilución sobre la superficie de las placas del medio KG ó MYP, y extender con varillas de vidrio.

4. Incubar a 30°C durante 24 horas.5. Seleccionar para el recuento las placas que contengan un numero de

colonias que permita observar con claridad los halos turbios característicos de este microorganismo.

6. Contar las colonias típicas de B. cereus las cuales son redondas con un halo denso de precipitación sobre el fondo rojo del medio.

7. Confirmar la presencia de este microorganismo de la siguiente manera.

a) Transferir de 5 a 10 colonias sospechosas de la placa seleccionada a un tubo de gelosa nutritiva incubar a 30°C durante 24 horas.

b) Preparar un frotis y teñirlo por la técnica de Gram observar la pureza del cultivo.

c) Preparar una suspensión del germen en solución salina y observar al microscopio para determinar su movilidad, del 50 al 90% de las cepas son móviles.

d) Si el cultivo esta puro y es móvil continuar con el estudio.e) Incubar tubos de fermentación con caldo glucosa, caldo sacarosa,

caldo glicerol, caldo silicina, caldo manitol, caldo nitrato, leche tornasoleada, gelatina nutritiva, gelosa almidón y V.P.

f) Incubar las pruebas bioquímicas a 30°C durante 24 horas.g) Comparar los resultados con los de la tabla que indica las

características de B. cereues.h) A partir de esto sacar el porcentaje de colonias d B. cereus presentes

en el alimento.i) Concluir en base a los resultados obtenidos.

Práctica no. 7LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS

INTRODUCCIÓNEs una bacteria no esporulada, gram positiva en forma de cocobacilo, tomando aspecto cocoide en algunos cultivos. Crece en condiciones de microaerofilica requiriendo atmósferas de 10% con CO2. Presenta crecimiento de 3 a 45°C con un óptimo entre 30 a 37°C. Se considera como una bacteria Psicotrofica. Desarrolla en un rango de pH de 5.0 a 9.6 pero sobrevive en alimentos con un pH fuera de estos

parámetros. En agar tristona sus colonias son azul verdosas cuando se iluminan por transiluminación y transmiten la luz. Su identificación se realiza en base a su morfología colonial en medios selectivos, la transiluminación, crecimiento en sembrilla, reacción de catalasa positivA, oxidasa negativa, fermentación de glucosa, +rehalosa y salicina. Hidrólisis de la esculena reacción negativa para H2S,

PARTE EXPERIMENTALPara su aislamiento a partir de alimentos generalmente se usa la técnica que se describe a continuación:

1. Pesar 25g. del alimento y suspenderlo en 225ml. de caldo UV enriquecido con sangre de carnero desfibrinada al 5% incubar a 30°C por 24 hrs. en atmósfera de CO2.

2. Pesar 25 ml. del cultivo anterior a 225ml. de caldo UV e incubar bajo las mismas condiciones.

3. A partir de este cultivo aislar por estría cruzada en 2 plcas de agar Mc. Bride y 3 placas de LPM agar. Incubar a 35°C en atmósfera de CO2.

4. Aislar las colonias transparentes y que por transiluminación produzcan colonias azuladas iridiscentes.

5. Sembrar estas colonias en agar sangre e incubar a 35°C en atmósfera de CO2

para determinar la presencia de B hemólisis.6. Realizar tinción de gram para observar cocobacilos gram positivos.7. Sembrar pruebas bioquímicas de:

Catalasa (+)UreasaOxidasaTSI A/ARMVP +/+NO3 –Manitol –Xilosa –Rhamnosa +CAM P con S. aureus (+)Esculina +Glucosa +Salicina +Crecimiento en paraguas en cultivo por punción de agar semi sólido, colonias translucidas.

Concluir en base a los resultados obtenidos.

CUESTIONARIO

1. Describir la composición de los medios de cultivo usados con la práctica.2. Describir la composición de dos medios de cultivo que sirvan para su

aislamiento no descritos en la práctica.3. Describir los métodos rápidos recomendados por APHA (US DA) para su

aislamiento.

Práctica no. 8AISLAMIENTO DEL GRUPO AEROMONAS

INTRODUCCIÓNAeromonas hidrófila es un miembro de la familia Vibrio Naceae. Aerobia facultativa, bacilo gram negativa, no esporulado, y que se aisla frecuentemente del medio ambiente: particularmente de agua y drenaje.

Se mueve por un flagelo polar. Utiliza la glucosa por vía fermentativa y oxidativa, la prueba de catalasa y oxidasa las presenta positivas. Produce amilasas, proteasas, fosfolipasas y DNAsa.

Se han descrito cuatro especies:

1. Aeromonas Hydrophila2. Aeromonas Sobria3. Aeromonas Covioe4. Aeromonas Salmonicida.

Se aisla de peces, anfibios y mamíferos de aguas marinas, salobres, aguas dulces de ríos y depósitos de agua potable. Se multiplica en aguas de drenaje.

Se ha aislado de aguas clorinadas y la asociación de temperaturas ambientales elevadas con su presencia en aguas y aguas de bajo contenido en cloro; en este caso el grado de contaminación ha sido elevado.

Se aisla frecuentemente de pescados y productos marinos. También se ha asilado de carnes de pollo, res, cerdo, carnero, productos lácteos y vegetales crudos conservados en refrigeración.

Aeromonas Hydrophila se ha aislado de casos de infecciones en heridas en humanos, septicemia, meningitis y en algunos casos implicados con pacientes inmunocomprometidos.

Puede causar gastroenteritis y trasmitirse a alimentos por portadores o aparentemente sanos.

Produce cuadros diarréicos parecidos al cólera o cuadros disentéricos. Generalmente este cuadro se presenta en inmunocomprometidos.

AISLAMIENTO DE AEROMONAS

1. Pesar 25 g del alimento y licuar con 225 ml de agua peptonada.2. Aislar por estría cruzada en agar SA o agar SA modificado. Incubar a 28ºC por

24 h. (sembrar por duplicado).3. Adicionar a las placas 5 ml de solución yodo lugol. Contar las colonias típicas

color amarillo o color miel en agar SA rodeadas de una zona clara por hidrólisis del almidón.

4. Las colonias sospechosas se deben aislar muy rápidamente ya que el lugol las mata.

5. Aislar las colonias en agar soya tripte caseína y en una caja de agar DNAsa. Incubar a 28ºC por 24 h.

6. Efectuar tinción de gram.7. Efectuar las reacciones bioquímicas que se señalan:

Prueba Aeromonas

Vibrio

Plesiomonas

Oxidasa + + +Gas de glucosa + - -Inositol (ácido) - - +Manitol (ácido) + + -Ornitina descarboxilasa - D +Na requerido para crecimiento - + -Amilasa + - -Gelatinasa + - -Lipasa + - -Crecimiento en agar tiosulfato citrato bilis

- + -

8. Concluir con base a los resultados obtenidos.

CUESTIONARIO

1) Describir otros medios usados para preenriquecimiento.Describir otros medios usados para su aislamiento

Práctica no. 9ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE CRUDA Y PASTEURIZADA.

INTRODUCCIÓNLa leche se define por el reglamento oficial mexicano como el producto

natural obtenido por la ordeña completa de uno o más animales sanos, con exclusión del producto obtenido quince días antes del parto y cinco días después del mismo.

La leche es una emulsión de materia grasa en forma globular y se considera como una suspensión de materias proteicas lactosa y sales minerales, a ellos se añaden otros componentes como lecitinas, vitaminas, enzimas, nucleótidos, gases disueltos, etc.

Par ser destinada al consumo público, la leche de cualquier especie debe provenir de animales sanos, bien alimentados y debe cumplir con las características siguientes:

a) ser pura, limpia, exenta de materias antisépticas, conservadores y neutralizantes.

b) Tener olor, calor y sabor normales.c) No coagular por ebullición.

d) No contener sangre ni pus.e) No contener sustancias extrañas a su composición natural.f) No contener sustancias radioactivas o en su caso no sobrepasar los

límites establecidos por la Secretaria de Salud.g) No contener agentes patógenos.

Dada su composición es un producto que se altera muy fácilmente ya que numerosos microorganismos pueden proliferar en ella, en especial aquellos que degradas la lactosa con producción de ácido o bacterias psicotrópicas que la alteran en condiciones de refrigeración. La leche no posee más que una débil protección natural, por lo que debe someterse a procesos de conservación para evitar la proliferación de bacterias que alteren o pongan en riesgo la salud del consumidor.

El consumo de luche cruda tiende a desaparecer del mercado en los países de alto grado de industrialización, aun cuando existen países y núcleos poblacionales en los que es usual su consumo, esta persistencia en su demanda plantea problemas técnicos especiales en cuanto a su control de calidad, por lo que existen una gran variedad de pruebas que permiten ejercer su control de calidad, tanto para consumo directo o par asegurar su calidad como materia prima para la producción de leches industrializadas o derivadas de la leche.

Así para ambos casos se recomienda realizar la cuenta de bacterias mesofílicas aerobias, este recuento se eleva proporcionalmente en el medida en que se descuidan las condiciones higiénicas se expone a diferentes fuentes de contaminación y/o se conserva a una temperatura superior a 10°C.

Las fuentes de contaminación pueden ver el equipo sucio, el polvo, la tierra, manipuladores, envases, la fauna y el uso de agua no potable. Es común que los recuentos elevados guarden relación con esta expansión seguida de conservación defectuosa.

Para consumo directo se recomienda que la media aritmética de las últimas seis cuentas no deben exceder de 2,000,000 de colonias/ml., ni contener más de 2,000,000 de leucocitos/ml. en cuenta directa.

Para su industrialización cunado se destine a la fabricación de leche pasteuriza la cuenta de bacterias mesofílicas aerobias, no debe exceder de 300 00 col/ml. lo mismo que el de leucocitos y para la fabricación de leche ultra pasteurizada extra el número de colonias y leucocitos debe ser inferior a 50,000.

Como pruebas rápidas para determinación de su aceptación en la industria se aplican las llamadas de plataforma que se realizan en el momento en que se recibe la leche las biológicas comprenden:

a) Prueba de frescura con alcohol.b) Prueba de reductasa.c) Cuenta microscópica directa.

a) La prueba de frescura con alcohol al 68/ se usa par detectar la presencia de leches acidificadas. Existe correlación entre prueba y la estabilidad de la suspensión coloidal, que el en el medio ácido el alcohol al deshidratar las proteínas favorece su precipitación.

b) La prueba de reductasa nos indica en base al tiempo de decoloración de un colorante indicador de la oxido reducción una medida del grado de contaminación de la leche, ya que existe una relación en estrecha entre la

actividad metabólica de los microorganismos y el descenso del potencial redox.En el caso del azul de metileno si este se transforma a leucoderivado en menos de 15 minutos en una leche muy contaminada y en uno de buena calidad tarda tres horas.La resarzurina vira el colorante del azul al rosa y luego al blanco en el curso de reducción.

c) Cuenta microscópica directa de bacterias y leucocitos.

Cuenta de bacterias:Esta técnica es poco precisa si se comprar con la cuenta estándar en placa, permite darse una idea sobre que grupos microbianos se encuentran presentes por campo y tener el conocimiento aproximado del contenido microbiano presente en leche cruda.

Se usa generalmente como prueba de plataforma para tener idea de la calidad de la leche que se va a comprar.

Presenta las ventajas de permitir realizar el estudio en menor tiempo con mayor economía, conservar la preparación para reestudiar la muestra, reportar en término numéricos la presencia de bacterias y leucocitos, no es afectada por la presencia de conservadores en el alimento.

Entre los inconvenientes que presenta tenemos:

a. Un pequeño volumen de leche que cuantifica grandes volúmenes (0.01 ml).b. No se puede distinguir entre microorganismos vivos y muertos.c. Cuando se tienen contenidos microbianos muy grandes o mínimos, el

recuento adolece en precisión.d. La deficiente coloración que presentan algunos microorganismos.

Aplicación al recuento de leucocitos

La leche normal presenta principalmente células epiteliales con una pequeña proporción de leucocitos, pero en la leche procedente de un animal con mastitis aumenta el contenido de leucocitos.

En una leche procedente de animales saos en el primer ordeño raramente se supera la cifra de 300,000 a 400,000/ml, cuando se recoge de la ubre suele ser inferior a 100,000-150,000/ml. La leche de vacas jóvenes presenta recuentos más bajos comparados con la de las vacas más viejas.

Con el establecimiento de procesos inflamatorios en la ubre, el recuento se eleva excediendo con frecuencia de 500,000/ml en la primera leche del ordeño y de 250,000/ml en leches recogidas de la ubre.

La presencia de 500,000 leucocitos se toma como la evidencia de una infección en la ubre.

Las normas para un recuento microbiano van de 5,000,000/ml para una leche de buena calidad a 30,000,000/ml para una de mala calidad.

La pasteurización se aplica a la leche con los propósitos de eliminar los microorganismos patógenos ya que no son termodúricos (con excepción de Listeira), baja la cuenta microbiana, aumentando la vida de anaquel del producto y la

eliminación de microorganismos antagonistas cuando se van a utilizar cultivos lácticos.

Las pruebas que se utilizan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada desde el punto de vista microbiológico son:

a. Prueba de la fosfatasa.b. Cuenta estándar de bacterias mesofílicas aerobias.c. Cuenta de organismos coliformes.

Prueba de la fosfatasaLa fosfatasa alcalina es una enzima que se encuentra presente en leche cruda, se trata de una metaloproteína que contiene zinc y está ligada a la materia grasa; desaparece por completo en la leche descremada y se concentra en la crema, se encuentra en el suero de la mantequilla después del batido.

Tal enzima se inactiva a las temperaturas de pasteurización si el proceso es adecuado, la resistencia al calor de la enzima es ligeramente superior a la de las bacterias patógenas que pueden existir en la leche.

Cuando se obtiene una prueba fosfatasa positiva en leche pasteurizada nos indica que el proceso no fue adecuado y que existe el riesgo de que la leche contenga bacterias patógenas, o que la leche no se pasteurizó o se mezcló leche cruda con pasteurizada.

La prueba consiste en valorar colorimétricamente el azul de indofenol que se forma por la reacción de la fosfatasa sobre el disodio fenil fosfato de lo que se libera fenol, que va a reaccionar con la 2,6 dicloroquinona cloroimida para formar azul de indofenol.

La fosfatasa de la leche de cabra no se inactiva con la pasteurización por lo que no se debe usar esta prueba.

Las muestras alteradas o que coagulan por ebullición no deben someterse a esta prueba ya que algunos microorganismos producen la enzima, lo mismo en el caso de la mantequilla y los quesos, ya que en especial los que contienen hongos y levaduras dan positiva la prueba.

Cuenta estándar de bacterias mesofílicas aerobiasCon la pasteurización se destruyen varios tipos de bacterias, que no soportan el tratamiento térmico quedando presentes algunos que integran el grupo de las

bacterias termodúricas que sobreviven a la pasteurización, dentro de éste grupo encontramos a las bacterias esporuladas, algunas integrantes de los géneros Streptococcus y Lactobacillus, Micrococcus y Microbacterium.

Su recuento se eleva proporcionalmente en la medida en que se descuidan las condiciones higiénicas, se expone a diferentes fuentes de contaminación y/o se conserva a una temperatura superior a los 100ºC.

Sus fuentes de contaminación pueden ser el agua de lavado, la tierra, el equipo sucio, los envases, los manipuladores y la fauna nociva. Es común que los recuentos elevados guarden relación con al exposición a estas fuentes, seguida de conservación defectuosa.

OBJETIVOS 1. Que el alumno ejecute las técnicas recomendadas para el control de calidad

de la leche cruda y pasteurizada.2. Que el alumno aprenda a interpretar adecuadamente los resultados obtenidos

a partid de estas técnicas.3. Que el alumno adquiera los conocimientos para poder efectuar el control de

las fuentes de contaminación que operan en una planta lechera.

TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS DE LECHE CRUDA Y PASTEURIZADA

Prueba de frescura con alcoholLa prueba sirve para determinar la facilidad con la que la leche se coagula al exponerla al calor.

La prueba consiste en mezclar 5 ml de leche con 5 ml de alcohol etílico al 68% en un tubo de ensaye. Si la leche se coagula o hay pequeñas partículas floculadas, la prueba es positiva y no resistiría altas temperaturas, la acidez puede que sea alta o hay un desbalance de sales, si la leche permanece normal la prueba es negativa.

Prueba de reducción del azul de metileno1) La leche contenida en el recipiente con cierre hermético se invertirá unas 25

veces con movimiento rotatorio rápido para mezclar completamente la crema con la leche.

2) Con pipeta de 10 ml tomar una muestra, 10 ml exactos y adicionarlos en el interior de un tubo de 10/150 con tapón de rosca estéril.

3) Adicionar 1 ml de azul de metileno.4) Cerrar asépticamente e invertir lentamente dos veces de tal manera que todo

el aire contenido en la columna ascienda por encima de la leche en un plazo de 5 min.

5) Incubar los tubos en un baño María a 37ºC. El nivel del agua del baño se debe mantener por encima del de la leche del tubo y la temperatura exactamente controlada.

6) El interior del baño debe encontrarse en la oscuridad completa.7) Para saber cuando ha comenzado la decoloración y cuando se ha completado

se empelará un tubo control utilizando leche esterilizada en el laboratorio.8) Hacer la lectura cada 15 min.9) La leche se define en diferentes categorías de acuerdo al tiempo de

reducción:9.1) Menos de 15 min; muy mala calidad y altamente contaminada.9.2) Entre 15 y 60 min; bastante contaminada.9.3) Entre 1 y 3 h; ligeramente contaminada.

9.4) Más de 3 h; poco contaminada y de calidad satisfactoria para la industria, ya que la microflora total es probablemente inferior a 1 millón de microorganismos/ml.

10)Preparar el azul de metileno adicionando 5 mg de azul de metileno en 100 ml de agua estéril.

Cuenta microscópica directa1. Medir el campo del microscopio con un portaobjetos micrométrico marcado en

divisiones de 0.1 y 0.01 mm. Leer hasta la tercera cifra decimal (enfocar con ocular y objetivo de inmersión).

2. Determinar el área del campo microscópico en un mm2 multiplicando el radio al cuadrado por 3.1416.

3. Convertir el área del campo microscópico que se encuentra en 1 cm2 (ya que se va a hacer lectura en 1 cm2 de leche), dividiendo entre 100 dicha área del campo expresado en mm2.

4. Como solo se extenderá 0.01 ml de leche sobre el área de 1 cm2 se multiplicará el número de campos por 100 para determinar el número de campos microscópicos/ml de leche.

5. Calcular el factor del microscopio con la siguiente fórmula:

La fórmula expresa el número de campos del microscopio que existen en 1 ml de muestra.

El número de campos examinados dependerá del factor del microscopio y del grado de contaminación de la muestra. A mayor factor del microscopio se deberán examinar mayor número de campos.

El cuadro siguiente puede servir de orientación para determinar el número de campos por observar en cada caso:

Diámetro del campo

30 a 300,000

300,000 a 3x106

Más de 3x106

0.206 30 20 100.178 40 20 100.160 50 20 100.146 60 30 16

TRABAJO DE LA MUESTRA:

A. Agitar la muestra hasta completar homogenizaciónB. Colocar la punta de la pipeta cerca del centro del área de 1 cmC. Extender la muestra sobre la superficie marcada por medio de un asa

doblada en ángulo recto.D. Dejar secar a temperatura ambiente durante 5 min.

Cuenta por ml

E. Sumergir el frotis en la solución colorante dentro del vaso de Koplin durante 2 min.

F. Escurrir y enjuagar con agua destilada a 37ºC por inmersión en tres ocasiones en un vaso de Koplin.

G. Observar al microscopio inicialmente a seco fuerte para apreciar la abundancia y tamaño de los grupos bacterianos y leucocitos presentes.

H. Con el objetivo de inmersión contar los grupos microbianos y/o leucocitos presentes.

I. Empezar a observar los frotes al centro del extremo izquierdo, examinar recorriendo hacia la derecha los tres primeros campos, en ángulo recto hacia arriba contar otros tres y proseguir en ángulo recto hacia arriba hasta alcanzar el borde superior. Iniciar el mismo proceso pero ahora de derecha a izquierda.

J. Asegurarse de que se a dejado el campo examinado y detener el microscopio para observar el siguiente.

LECTURA Y CÁLCULOS:

A. Cualquier microorganismo o grupo de microorganismo (aparentemente de la misma especia) separados por una distancia igual o mayor que el doble del diámetro de la célula más pequeña del grupo.

B. Los microorganismos de diferente morfología.C. Los diplococos, estreptococos y agrupaciones de bacilos.D. Los leucocitos por campo.

Obtener la media aritmética de los leucocitos o grupos microbianos contados y multiplicarla por el factor del microscopio para obtener el número de grupos microbianos por ml o g de muestra.

Cuenta estándar de bacterias mesofílicas aerobias1. Agitar vigorosamente el recipiente en que se encuentre la leche, invirtiéndolo

repetidas veces.2. Extraer 10 ml de leche y transferirlos a un frasco de dilución conteniendo 90

ml de regulador de fosfatos. Esto constituye la dilución 1:10.3. De la dilución 10-1 transferir 1 ml a un tubo con 9 ml de solución reguladora de

fosfatos para realizar la dilución 10-2.4. De la misma manera realizar las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5. 5. Inocular una serie de cajas de petri con 1 ml de las diluciones 10-1, 10-3 y 10-5.6. Adicionar aproximadamente 15 ml de agar cuenta estándar, manteniendo a

45ºC, homogenizar y dejar solidificarse. 7. Incubar las cajas a 37ºC-48 h.

Análisis de leche pasteurizadaAgitar vigorosamente cada recipiente de leche invirtiendo repetidas veces los envases hasta homogenizar el contenido.

Antes de abrir el recipiente de la muestra limpiar la tapa, y en le caso de envases de cartón tetrapak o plástico, limpiar el sitio de la abertura con un algodón estéril y alcohol al 70%.

Prueba de la fosfatasa alcalinaLa muestra de leche se examinará tan pronto como sea posible después de su llegada al laboratorio de análisis o se mantendrá a una temperatura entre 3 y 5ºC hasta que se examine. La muestra se elevará a temperatura ambiente antes de la determinación.

La prueba se realiza con reactivos comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuenta estándar de bacterias mesofílicas aerobias 1) Como en el caso de la leche cruda prepara las diluciones siguientes 10-1, 10-2 y

10-3.2) Inocular una serie de cajas petri con 1 ml de las diluciones anteriores y

adicionar aproximadamente 15 ml de agar cuenta estándar a una temperatura aproximada de 45ºC. Homogenizar y dejar solidificar.

3) Incubar las cajas a 37ºC-48 h.

Cuenta de organismo coniformes1. Inocular 1 ml de la muestra sin diluir en caja de petri.2. agregar aproximadamente 15 de rojo violeta bilis agar fundido y conservado a

45ºC.3. Dejar solidificar.4. Agregar 4 0 5 ml del medio y extenderlo como doble capa.5. Incubar las cajas a 37ºC-24 h.

Práctica no. 10ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS ENLATADOS

INTRODUCCIÓNPara conservar un alimento usando esterilización por calor se requiere usar un

recipiente herméticamente cerrado para protegerlo de la comunicación ulterior y someterlo durante el tiempo suficiente a la temperatura adecuada para destruir todos los microorganismos susceptibles de proliferar y alterarlos, así como desnaturalizar las enzimas presentes.

Estos alimentos no están estériles, ya que sobreviven esporas principalmente de microorganismo termofílicos resistentes al calor, que en la mayoría de los casos no son capaces de multiplicar se en ellos ya que su composición o las condiciones de almacenamiento no lo permiten.

Un alimento enlatado se considera alterado cuando su composición se ve afectada ya se por causas fisicoquímicas o microbiológicas.

En el primer caso tenemos que la alteración puede ser ocasionada por un vacío defectuoso, sobrellenado de la lata o formación de hidrógeno por reacción de los ácidos que componen el alimento con el metal del envase, este defecto usualmente se presenta cuando el barnizado y estañado defectuosos, la lata exhibe en este caso manchas más o menos extensa en su interior. Los alimentos expuestos a este tipo de alteración son los productos de chilería, jugo de tomate y frutas en distintas formas de presentación.

Las alteraciones por causas microbianas pueden ocasionarse con:a) Deformaciones por golpes o presión que pueden permitir la

formación de pequeñas aberturas en las latas por las que penetran los microorganismos.

b) Tratamiento térmico insuficiente.

c) Defectos en la engargolada que dejan puntos de continuidad por los que penetran los microorganismos.

d) Contaminación abundante del producto antes de envasar o su alteración previa antes del proceso.

La alteración microbiana depende de muchos factores interrelacionados como la carga específica correspondiente, la temperatura de crecimiento de los sobrevivientes, la temperatura a la que se almacena de alimento envasado, la composición del alimento y su acidez así como la tensión de oxígeno y las necesidades propias de oxígeno de los microorganismos; la presencia de aditivos como nitratos que pueden permitir el crecimiento de los aerobios en ausencia de oxígeno libre, la presencia de conservadores como ácido benzoico o cítrico que inhibe el desarrollo de algunos microorganismos.

Aun cuando la alteración de alimentos enlatados suele ser por bacterias esporuladas, a veces los responsables son levaduras o formas vegetativas bacterianas, cundo así ocurre puede ser que han penetrado a través de fugas en las latas o que el tratamiento térmico ha sido insuficiente.

Generalmente la presencia de flora mixta en un alimento enlatado se asocia a la contaminación posterior al proceso térmico efectuado por el agua de enfriamiento al penetrar por pequeños orificios. En este caso la alteración afecta a un número pequeño de unidades del lote.

Eventualmente en las alteraciones por esta causa puede aparecer un solo tipo de microorganismos que puede ser esporulado y crear confusión con el origen de la contaminación.

Las bacterias productoras de alteraciones den los alimentos enlatados pueden ser aerobios, anaerobios o facultativos y mesofílicas cuando su temperatura de crecimiento esta comprendida entre 20 y 45°C o termofílicas entre 37.8 a 82.2°C. Los termofílicos pueden ser facultativos cuando crecen bien a 55°C pero también lo hacen por debajo de 37.8°C.

Las bacterias termofílicas son más termoresistentes que las especies mesófilas, de ahí la tendencia de la industria conservera controlar las alteraciones debidas a estas bacterias por medio de otros sistemas distintos.

Se ha determinado que existe relación entre el tipo de contaminación microbiana y la acidez de los grupos siguientes:a) De baja acidez con pH de 5.6 o mayor, dentro de los que se encuentran los productos cárnicos, productos marinos, leche lácteos y algunos productos vegetales como el maíz, chícharo y fríjol.b) De acidez media con pH de 4.5 a 5.0 dentro de los que se encuentra mezclas de carne con vegetales, sopas, espagueti, vegetales como espinacas y betabel.c) Ácidos con pH comprendido entre 3.7 a 4.5 como tomates, peras, piña y guayabas.d) De alta acidez con pH de 3.7 o menor, comprendiendo aceitunas, uvas, jugos de cítricos, productos de chilería y encurtidos en vinagre como col fermentable.

La principal demarcación en la clasificación se hace en base al pH de 4.5.

Debajo de este punto el crecimiento de Clostridium botulinum es inhibido y los alimentos comprendidos a eso valores de pH no se someten a cocción bajo presión. En alimentos con pH por arriba de 4.5 se requiere de conocimiento en autoclave.

Los productos cocidos por ejemplo el jamón y tocino reciben un tratamiento térmico menor y que se combina la acción de las sales de curación y el tratamiento térmico para inhibir el crecimiento de Clostridium botulinum y otros anaerobios facultativos.

Entre los o esporulados se encuentran: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus leuconostoc y Microbacterium así como Micrococcus.

Los productores de ácido láctico se han encontrado en jugo de tomate subprocesado.

Las especies heterofermentativas pueden liberar bastante CO2 e hinchar las latas.

El género Leuconostoc puede producir filamentaciones en líquidos azucarados, se han descrito en piñas, duraznos y productos de tomate.

Las levaduras se pueden encontrar presente e productos subprocesados ya que son muy sensibles al tratamiento térmico. Entre los hongos encontramos las especies del género Byssochlamys (fulva, nívea) que producen abombamiento de las latas por presencia de CO2. Son hongos termoresistente ya que se requiere para destruirlos de tiempos de 62, 25 y 10min. a temperatura de 87.8, 90 y 92.2°C.

Especies termoresistentes de Penicillum se han aislado de frutas enlatadas con esclerocios muy resistentes al calor, destruyéndose a 35°C por 30min.

Se han encontrado especies de Aspergillus cuyas esporas sobreviven a temperaturas de 100°C por más de 60min.

La subdivisión entre alimentos ácidos y muy ácidos se hace con el propósito de diferenciar a a aquellos en los que crecen esporas ácido tolerante de aquellos en los que no lo hacen. Por ejemplo se ha reportado el crecimiento de Bacillus coagulans en jugo de tomate con pH comprendido entre 4.0 y 3.7.

En seguida se relaciona el pH de los alimentos enlatados con el tipo de alteraciones que se pueden presentar.

Así en los alimentos ácidos se pueden encontrar bacterias esporuladas y no esporuladas, hongos y levaduras. En la mayoría de los casos los microorganismos se controlan a temperaturas por debajo de 100°C.

Entre ellos encontramos al Bacillus coagulans que producen la alteración de agriado plano. Ya que hay conformación de ácido pero no de gas, por lo que la alteración se pone de manifiesto por cultivo de las latas.

Su habilidad a crecer en jugo de tomate depende del número de esporas presentes, la cantidad de oxígeno disponible y el pH del jugo.

En jugos de frutas se ha descrito la presencia de Clostridium pasteurianum que es una especie mesófila produciendo fermentación butírica que provoca abombamiento de las latas por el CO2 e hidrogeno producido.

Dentro de los bacilos mesófilos se han encontrado gaseosa en frutas enlatadas y jugos de tomate a pH 3.8 a 4.0 pudiendo sobrevivir al tratamiento térmico o penetrar por aberturas presentes en las latas.

En los productos de acidez medida y baja se encuentran alteraciones por gérmenes no esporulados por ejemplo Micrococcus y Streptococcus faecalis que se han reportado en pastas de carne o jamones en los que la penetración de calor en la lata es deficiente o se sujetan a temperaturas relativamente bajas por la presencia de sales curantes.Se reporta el agriado plano ocasionado por Bacillus Stearothermophilus o Bacillus coagulans, efectuando vegetales enlatados y carnes.

Estos microorganismos se consideran como termófilos, en el primer caso obligado y en el segundo facultativo. B pepo también es un termófilo obligado que puede producir tipo de alteraciones.Existen bacilos mesófilos que degradan carbohidratos con producción de ácido sin producción de gas.

Dentro de los bacilos que producen ácido y gas encontramos a Bacillus polymixa y macerans que producen alteraciones en espinacas, chíncharos y espárragos.

Bacillus cereus y Bacillus mesentericus producen reblandecimiento con sabor y olor desagradable en salmón, cangrejos ó camarones.

La alteración T.A. (Termófilo anaerobio no productor de H2S es producido por Clostridium termos accharolyticum forma ácido y gas a partir de carbohidratos.

Las latas se alteran frecuentemente si el enfriamiento es defectuoso y permanecen por un tiempo prolongado a temperaturas elevadas, generalmente las latas llegan a estallar. Generalmente sus esporas no forman colonias en aguas, su crecimiento se detecta en medios líquidos tales como caldo hígado o caldo tioglocolato a 55°C

Putrefacción sulfhídrica.- Es causada por Cl. Nigrificans se encuentra en alimentos de acidez media como chícharo y maíz enlatado. Sus esporas son menos resistentes que los del Flat sour o alteración T.A.

Las colonias formadas en las latas provocan ennegrecimiento del líquido y se observan granos de maíz de color gris,, puede haber olor a ácido sulfhídrico ya que este se libera y reacciona con el hierro de la lata provocando ennegrecimiento por la presencia de sulfuro ferroso.

En alimentos de acidez media pueden desarrollar Cl. Butyricum y Cl. Pasterianum y provocan la fermentación butírica.

Otras especies como Cl. Sporogenes, Cl. Putrefacción y Cl. botulinum son proteolíticos provocando putrefacción con producción de malos olores por presencia de H2S, mercaptanos, amonia, indol y escatol crecen mejor en alimentos de acidez baja tales como chícharos, pescados, maíz y pollo, pero raramente altera alimentos de acidez media, uno de estos microorganismos es Cl. botulinum pero en este caso es más frecuente su presencia en ambos tipo de alimentos.

En cuanto a la alteración que se puede hacer visible por deformación de las latas tenemos que cuando una lata no se encuentra alterada los extremos son planos o ligeramente cóncavos con un vacío parcial en el interior; si se presentan alteraciones en las que haya liberación de gas ya sea por causas químicas o microbiológicas se va a tener grados de deformación variable que se clasifican:

a) latas que presentan una ligera deformación en uno de los extremos, que al presionar cede dando aspectos normal (latas con deformación del (Grado I).

b) Latas con un extremo abombado que al presionarlo cede provocando abombamiento en el extremo opuesto (Grado II).

c) Ambos extremos con abombamiento cediendo a la presión de los dedos, regresando al estado abombado al dejar de presionar (Grado III).

d) La lata se encuentra abombada de los extremos y no cede el abombamiento a la presión de los dedos. En algunos casos se presenta el entallamiento del envase, provocándose escurrimiento hacía el exterior (Grado IV).

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA1. Que el alumno aprenda las técnicas recomendadas para realizar el control de

calidad de los alimentos enlatados.2. Que aprenda a interpretar los resultados obtenidos a partir de estas técnicas.3. Que éste capacitado para resolver los problemas causados por contaminación

microbiana que se presenten en las industrias conserveras.4. Que pueda inferir las causas de brote de infecciones o intoxicaciones

provocadas por consumo de alimentos enlatados.

PARTE EXPERIMENTAL

Cuando se va a analizar un alimento enlatado es necesario disponer de la información siguiente para registrarla en el diario del laboratorio:Tipo de alimento, marca de fabricación, planata productora, marca registrada,fecha de fabricación, número de latas fabricadas por lote, condiciones de procesado y almacenamiento.

Si hay alteración, el tiempo transcurrido desde la fabricación al desarrollo de la alteración.

Los pasos a seguir para el análisis son las siguientes:a) Observar si existe abombamiento, herrumbre, golpes, derrames.b) Quitar la etiqueta sin dejar residuos.c) Lavar la lata con agua y detergente, utilizando una esponja.d) Desinfectar la lata utilizando compuesto colorados a concentración de

200p.p.m., compuesto yodados a concentración de 100 p.p.m. o sales cuaternarios de amonio a una concentración de 1 ó 5000 p.p.m. durante 10 a 15min.

e) Escurrir y secar con gasa de algodón estéril.f) Si la lata está abombada se recomienda para abrirla que se coloquen sobre

una charola y se utilice un embudo de tallo corto colocándolo en una de las tapas, rodeado con algodón. Se debe introducir una pica hielos por el tallo de embudo para perforar la lata y evitar de esta forma proyecciones del alimento al escapar el gas. Posteriormente abrir la lata utilizando abrelatas estéril.

g) Si la lata no muestra alteración aparentemente se recomienda abrir en una forma normal.

h) Una vez abierta se deberán anotar las características siguientes:1. si existe o no alteración visible.

2. Aspecto del alimento: color, olor, consistencia, turbiedad, sedimento, gasificación.

i) Tomar de 1 a 4º. O ml. de la muestra con cucharilla, pipetas o abatelenguas estériles y sembrar en medio líquido dependiendo del pH del alimento.

j) Vaciar el contenido de la lata y observar si no existen daños en el barnizado, estañado o en las costuras.

Análisis de alimentos enlatados de acidez media y baja con pH de 4.5 o mayor.

I.- DETERMINACIÓN DE MESOFILICOS AEROBIOS Y TERMOFILICOS AEROBIOS.

Sembrar de 1 a 4g del alimento en un tubo conteniendo caldo púrpura del bromocreosol e incubar a 35°C +- 2°C durante 48 a 72horas para mesofílicos aerobios y para termofílicos aerobios de 55°C +- 2°C durante 48 a 72hrs.

La American Public Health Ass recomienda el medio PATRA el aislamiento de las bacterias que producen el agriado plano.

En el medio la producción de ácido por la fermentación de la dextrosa provoca el cambio de calor púrpura amarillo y turbiedad por el crecimiento microbiano.

El contenido de los tubos con crecimiento positivo se resiembra con tres asadas a cajas conteniendo agar púrpura de bromocresol dextrosa aislando por estría cruzada y se incuban a 35°C durante 48 a 72hrs. para bacterias termofílicas aerobias.

En este medio las colonias típicas productoras de agriado plano miden de 2 a 5mm. De diámetro, con centro opaco y se encuentran rodeados por una zona color amarilla clara.

II.- DETERMINACIÓN DE MESOFÍLICOS ANAEROBIOS Y TERMOFILICOS ANAEROBIOS.

Para mesofílicas y termofílicas anaerobias se usa como medio de enriquecimiento el caldo de hígado y para aislamiento en placas el agar anaeróbico de Bremen.

Sembrar de 1 a 4g del alimento en tubos conteniendo caldo de hígado que previamente se calentaron en baño maría a ebullición durante 20 minutos antes de utilizarlos.

Después de inocular, sellar con vaspar (vaselina y parafina al 50% o agar al 2%). Incubar a 35°C durante 48 a 72hrs. para termofílicos anaeróbicos.

Cuando hay crecimiento se observa turbiedad y desintegración del trozo de hígado.

Los tubos positivos se siembran en el agar anaeróbico de Brewer aislado por estrías. Las cajas se incuban en condiciones de anaerobiosis y el crecimiento se observa a las 48 a 72hrs a 35°C para mesofílicos y para termofílicos a 55°C.

DETERMINACIÓN DE ALIMENTOS ENLATADOS CON Ph MENOR DE 4.5

I.- Determinación de Hongos y levadurasSembrar de 1 a 4g del alimento enb tubos conteniendo caldo extracto de

malta incubar un tubo a 35 +- 2°C por 96 horas, y otros a 25°C por 7 días para investigación de levaduras y hongos, la reacción de las levaduras y por desarrollo micelíar en el caso de los hongos.

En el caso de desarrollo positivo parar cajas conteniendo agar extracto de malta para observar las características de las colonias e identificar.

II.- Mesofílicos y Termofílicos Aerobios del Género Bacillus.Sembrar de 1 a 4g del alimento en dos tubos conteniendo agar proteasa

peptona e incubar uno a 35°C durante 72 horas y otro a 55°C por hrs.En este medio desarrollar los bacilos del tipo coagulans, si se observa desarrollo en los medios, resembrar aislando por estría para observar colonias típicas en medio de agar proteasa peptona incubado a 55°C y a 35°C por 72hrs.Determinación de bacterias lácticas del género Lactobacillus y Streptococcus.Sembrar de 2 a 4g del alimento en caldo suero de naranja e incubar en condiciones de anaerobiosis a 35°C por 72hrs. Los tubos con crecimiento positivo (turbiedad) se resiembra en cajas conteniendo agar suero de naranja para observar colonias típicas y se incuban a 35°C por 72hrs.

II.- Determinación de mesofílicos y termofílicos anaerobios.Sembrar de 2 a 4g del alimento en dos tubos conteniendo caldo ácido sellarlos

con vapor o agar al 2% incubar un tubo a 35°C por 72hrs. y otro a 55°C por 48 a 72hrs.

INFORMEI. Seminario de laboratorio.

1. discutir sobre los resultados obtenidos comparándolos con las normas oficiales, concluyendo sobre la calidad de los alimentos analizados.

2. Buscar información sobre las clasificaciones de los alimentos enlatados de acuerdo al grado de abombamiento.

3. Relacionar los grupos microbianos descritos en la práctica con las fuentes de contaminación que los aportan.

4. Discutir sobre las medidas de control para evitar la presencia y la proliferación de estos grupos microbianos en los alimentos enlatados.

5. ¿Cómo se debe de efectuar el saneamiento de una planta enlatadora de alimentos ácidos con pH menor de 4.5?

II. Informe de la práctica por escrito

BIBLIOGRAFÍA1. American Public Health Ass. Compendium of Methods for the microbiological

examination of foods. Marvin L. Spech. Editor 1976. USA.2. Banlieu J. Técnica de la fabricación de Conservas Alimenticias 2ª edición.

Editorial sintes. 1962 España.3. Frazier, W.C. Food Microbiology 2ª ed. Mc. Graw Hill 1976. USA.4. Hersom A. and Hulland. Canned Foods. Gied.5. Lopez A. A Complete Course in Canning 9a. ed. The Canning. Trade. 1981.

Baltimore USA.6. Nicherson, TJ an AJ Sinskey. Microbiología de los alimentos y sus procesos de

elaboración. Editorial Acribia. Zaragoza España.7. Sharf J.M. Recomendad Methods for the Microbial Examination of foods.

American Public Health Ass. 1966 U.S.S.

Práctica no. 11BACTERIAS ESPORULADA PRODUCTORAS DE ACIDO

SULFHIDRICO

INTRODUCCIÓNLa alteración sulfhídrica se produce por una bacteria esporulada, termófila

facultativa, denominada Desulfotomaculum nigrificans, anteriormente se le denominaba Clostridium nigrificans. Se aisló por primera vez del lodo, tierra, aguas negras y Se productos agrícolas utilizando temperaturas de incubación de 35 y 55°C, los bacilos que desarrollaban a 55°C. presentaban forma ligeramente curveada con esporas, en tanto que los mesófilos eran curveados y sin esporas. Se demostró que pertenecían al mismo micro organismo, basándose en el metabolismo del sulfato, sistema citocromo, morfología y respuesta inmunológica.

Se demostró que no pertenecían al género Clostridium, ya que no concordaban ambas especies en la tasa de D.N.A., en el sistema citocromo, en el sistema reductor de los sulfatos, en la séptima edición del manual de Bergey (1957) se le denominaba como Clostridium nigrificans y en la octava como Desulfotomaculum nigrificans.

Este microorganismo se encuentra en la tierra, aguas, aguas negras, termales, azúcar, cereales, vegetales y sus derivados industrializados. En el caso del maíz enlatado las latas no se deforman con la presencia del gas, pero al abrirlas se presenta olor desagradable, con el contenido color negro, alteración el la superficie de los guisantes con manchas de color negro, partículas negras flotando, el ennegrecimiento se debe a la reacción del ácido sulfhídrico con el hierro de la lata dando coloración negruzca, cuando las latas no están barnizadas adecuadamente.

La alteración se presenta en chícharos, maíz, hongos y alimentos de origen vegetal. El microorganismo es ligeramente proteolítico, no es sacarolítico, degradan la cisterna produciendo ácido sulfhídrico. La temperatura máxima de crecimiento es a 65-70°C. dependiendo de la cepa, con un óptimo de 55c. y un mínimo de 30c.

El pH óptimo para el crecimiento oscila entre 7.2 y 7.4, no se presenta crecimiento a 5.8 o a 7.6, las esporas de este microorganismo sobreviven a 100°C por 8Hrs, de exposición a ph 7.0. Se ha reportado sobrevivencia de esporas en maíz procesado a 118c. por 70 min.

OBJETIVOQue el alumno realice las técnicas para el recuento y aislamiento de este germen.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimiento para analizar azúcar.

1.- Pesar 20 g. de azúcar en condiciones de esterilidad.2.- Adicionar el azúcar en un matraz Erlenmeyer de 500 o 250 ml. Y adicionar 100ml. De agua destilada estéril, agitar para disolver.3.- Someter a ebullición por 5 min., reemplazar el líquido evaporado con agua estéril y enfriar con agua corriente.4.- Distribuir 20ml. de la muestra en seis tubos colocando alícuotas de 3.3ml. por tubo conteniendo 10ml.de agar sulfito adicionado de citrato férrico, el medio se debe precalentar con anterioridad a 55c.5.- Agitar los tubos invirtiendo varias veces.6.- Solidificar rápidamente colocando los tubos en un baño de hielo.7.- Incubar a 50-55c. por 48 a 96 hrs.

Procedimiento para analizar almidones y harina.

1.- Pesar 20g. de harina o almidón en condiciones de esterilidad.2.- Adicionar la muestra a un matraz Erlenmeyer de 250ml. y añadir 100ml. de agua estéril, agitar intermitentemente hasta obtener una suspensión homogénea libre de grumos.3.- Dividir 20ml. de la muestra en 6 tubos colocados alícuotas de 3.3 ml. en cada uno de los tubos de agar sulfito y citrato férrico. El medio de cultivo deberá estar a 55c.4.- Calentar los tubos a 55°C en baño maría durante 15 min.5.- Enfriar rápidamente los tubos en un baño de hielo.6.- Incubar los tubos a 50-55c. por 72 a 96 Hrs.

RECUENTO DE COLONIAS

Las colonias del microorganismo aparecerán como áreas esféricas de color negro incluidas en el agar, cuando hay abundantes colonias se observan los tubos de color negro y en este caso hay que diluir.

Contar el total de colonias en todos los tubos a informar como número esporas por 10g. del ingrediente.

Interpretación.- Un estándar para bacterias productoras de sulfhídrico solo se aplica a ingredientes utilizados para la fabricación de enlatados de acidez media y baja.

Las esporas productoras de sulfhídrico deberán estar presentes en no más de 2 (40% ) de las cinco muestras probadas y ninguna muestra deberá presentar más de 5 esporas por 10g., esto equivale a 2 colonias en los tubos sembrados.

Práctica no. 12MIGROBIOLOGIA DE FRUTAS Y VERDURAS CRUDAS Y

CONGELADAS

Las frutas y verduras al crecer en el campo y estar expuestos al agua, aire, y la tierra, así como a exposición a abonos orgánicos y la acción de fauna nociva se contaminan de origen con microorganismos que posteriormente van a producirles alteración como productos crudos o industrializados, o pueden contener microorganismos patógenos al hombre que pueden producir daños a la salud.

Si la superficie de los vegetales crudos siempre existe una microflora saprofita que normalmente subsiste con pequeñas cantidades de carbohidratos, proteínas y sales inorgánicas disueltas en el agua de exudación de la epidermis de los mismos.

Otros factores de tomarse en cuenta son los implementos de cosecha, cajas, material de empaque, embarque a granel y estado de maduración.

Los vegetales crudos son los que presentan mayor grado de contaminación, sobre todo cuando crecen dentro o sobre la superficie de la tierra, como los tubérculos y las verduras de hoja que llegan a alcanzar cuentas hasta de 5X106UFC./g. influyendo el riego con aguas negras o aguas residuales tratadas y el grado de contaminación con tierra y abonos orgánicos.

Los vegetales que de ordinario presentan menor contaminación son los frutos de árboles y arbustos.

La flora predominante en los vegetales son las esporas de bacterias y hongos, la levaduras, corineformes, Agrobacterium, Arthrobacter, coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes, citrobacter, Klebsiella, Pectobacterium como parásito de los mismos.

Los enterococos que pueden vivir como flora saprofita de los mismo, lo mismo con Pseudomonas, Achromobacter, Chromobacterium, Alcalígenes que generalmente constituyen la flora saprofita de los mismos.

Como indicadores de calidad sanitaria se utilizan los mesófilos aerobios, coniformes, hongos, levaduras y enterococos, cuando se utilizan como materia prima para la industrialización de un producto.

Cuando las frutas y verduras se van a procesar se debe efectuar una inspección para determinar la calidad aparente de la materia prima, posteriormente se pasan a selección y limpieza.

La limpieza con agua puede remover de un 50 a un 94% de los microorganismos presentes en las superficies no dañadas cuando éstas no son rugosas ni presentan porosidades o grietas, generalmente para el lavado se recomienda utilizar un detergente y un germicida para desinfección, de preferencia compuestos como los yodófros que son detergentes y germicidas o los compuestos clorados o con cloro bromo para desinfección.

El escaldado es una operación que aparte de las funciones bioquímicas para las que se usa, sirve para eliminar a la mayoría de la flora vegetativa, la desventaja de este proceso es que permite la proliferación de esporas que utilizan los residuos vegetales contenidos en el agua, de ahí que para evita la proliferación de esporas termófilas sea conveniente cambiar seguido esta agua, de acuerdo con las determinaciones microbiológicas realizadas.

El proceso de congelación en sí elimina en muy baja proporción a los microorganismos, ya que generalmente es un proceso rápido que se efectúa para no dañar las células de los vegetales, durante el almacenamiento en este estado los que más resisten son los cocossesporas, Psudononáceas, ya que se ha determinado sobrevivencia de los mismos después de un año de almacenamiento, en el caso de los enterococos en concentraciones que van de 1X103 UFC/g.

Al descongelar se eliminan algunos microorganismos por la ruptura de estructuras celulares, pero la mayoría permanece viable y posteriormente prolifera más fácilmente al utilizar los líquidos intracelulares liberados por ruptura de las células, sobre todo en el caso de microorganismos psicrotróficos, ya que estos productos se conservan en refrigeración.

Las fuentes de contaminación que normalmente operan en estos productos son: el agua usada como ingrediente, la materia prima, el equipo, y en algunos casos el aire y polvo.

PARTE EXPERIMENTALMateria prima a utilizar.

Fresas congeladas.

Tres tipos distintos de verduras congeladas entre ellas de preferencia un tubérculo, elote y guisantes o mezcla de verduras.

Tomate.

Lechuga o berros o cilantro.

Guayabas o fresas.

TECNICA Para los vegetales frescos tomar 10g. y realizar las diluciones 10-1 a 10-5 efectuar la cuenta de bacterias mesófilas aerobias y psicrotróficas a partir de estas diluciones por la técnica de vaciado en placa.

De las tres primeras diluciones efectuar el recuento de hongos y levaduras por la misma técnica y la determinación de organismos coniformes fecales por N.M.P.

En el caso de frutas y verduras congeladas realizar las mismas diluciones y efectuar la cuenta de mesófilos aerobios y psicrotróficos como en el caso anterior.

Para enterococos realizar la siembra de las dos primeras diluciones por la técnica de vaciado en placa en medio de KF Streptococcus Agar.

Para coniformes fecales usar las tres primeras diluciones por la técnica de NMP.

Normas a utilizar para alimentos congelados.

Mesófilos aerobios 10,000 UFC/g.

Psicrotróficos 10,000 UFC/g.

Enterococos máximo 100 UFC/g.

Organismos coniformes fecales no se deben encontrar presentes.

BIBLIOGRAFIAAmerican Public Health Ass. Compendium of methods for the Mecrobilogical Examination of Foods. 1984. 2a Ed. Malvin L. Speck. A.P.H.A.

Benwart J. C. 1989. Basic Food Microbiology. 3a Ed. AVI publishing Company. INC. Westport Connecticut.

Jay J. M. 1980. Microbiología Moderna de los Alimentos. 4ª Ed. Acribia, Zaragoza España.

Práctica no. 13

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD SANITARIA DE CARNE Y DERIVADOS

INTRODUCCIÓN

Carne y derivadosSe considera como carne a todas las partes de los animales de sangre caliente destinada para el consumo humano, ya sean de formas frescas o preparadas.

La carne está constituida por tejidos tales como el muscular, epitelial, conectivo y el nervioso.

El tejido muscular estriado voluntario está formado por filamentos de actina, miosina y tropomiosina que son moléculas polimerizadas encargadas de la contracción muscular.

La mioglobina, la actina-miosina y el colágeno son los componentes más importantes en relación a la estructura y calidad de la carne, así como para su transformación industrial.

El tejido muscular de los animales vivos y sanos es estéril, los microorganismos se localizan en los nódulos linfáticos, cavidad intestinal, piel, pelo y pezuñas. Son abundantes en estos sitios con cuentas de 10-9 a 10-11 de bacterias mesofílicas aerobias/cm2, y que se llegan a encontrar en piel, pelo, pezuñas y lana; el contenido intestinal contiene millones de bacterias que no se diseminan hacia el interior gracias a los mecanismos de defensa, cuando el animal está vivo.

Después del sacrificio los mecanismos de defensa se abaten o detienen, lo cual propicia la multiplicación y diseminación de las bacterias por los tejidos. El 40% de los nódulos linfáticos contiene microorganismos y casi ¼ de éstos son cocos y aproximadamente un 50% bacterias esporuladas.

El cuchillo para desangrar es fuente de contaminación importante de bacterias que pasan de un animal u otro sucesivamente.

La piel es fuente importante que contamina la carne, en el caso del ganado vacuna estas bacterias pasan a la superficie de la carne por contacto directo o por el cuchillo o sierras empleados para cortar la piel.

En las condiciones de humedad y temperatura de las salas de matanza y faenado, las bacterias de las manos, las ropas de los trabajadores y mantas usadas para cubrir a la carne pueden pasar a la carne proliferando. Determinados utensilios tales como las sierras, bandas transportadoras, ganchos y cuchillos constituyen importantes fuentes de contaminación.El agua de escaldado tiene una temperatura adecuada para reducir el número de bacterias psicrotróficas y patógenas, pero no para las bacterias mesofílicas y termofílicas esporuladas que provienen de la tierra presente en piel, pelo, pezuñas, material fecal y sangre que tienden a multiplicarse por éste medio debido a los millones de microorganismos que se encuentran por ml en este tipo de agua.

Las carnes presentan una capa de grasa (tejido conjuntivo) que ofrece poca oportunidad de crecimiento bacteriano y su superficie es relativamente seca, en cambio los cortes y la carne picada o molida tiene una vida de almacén más corta, ya que por su superficie es más húmeda. La carne picada es un medio excelente para la multiplicación microbiana por la superficie expuesta.

Ya que la carne sale del rastro su grado de contaminación aumenta durante el transporte inadecuado, almacenamiento y manejo en las carnicerías.

Cuando la carne fresca se conserva a temperaturas cercanas a 0ºC, las alteraciones que tiene lugar son ocasionadas principalmente por microorganismos psicrotróficos principalmente del grupo Pseudomonas y Achromobacter que ocasionan limosidad y mal olor. Pueden crecer los lactobacilos o bien los hongos y levaduras. Estos microorganismos no causan daño a la salud humana, pero si disminuyen su vida de anaquel.

Entre las bacterias de importancia desde el punto de vista de salud pública que frecuentemente se diseminan por la carne, tenemos a Salmonella, Clostridium Perfringens y Staphylococcous Aureus, cuyo grado de contaminación se conserva durante el almacenamiento en refrigeración.

Esporas de Clostridium Botulinum, Brusella, Corynebacterium, Escherichia Coli enteropatógena, Mycobacterium y Leptospira pueden transmitirse al humano utilizando a la carne como vehículo de contaminación.

En el caso de carnes curadas o curadas y cocidas, las sales de curación como nitrito, el cloruro de sodio y nitrato, tienden a restringuir la flora contaminante a gram positivos que son realmente sal tolerantes, que incluyen bacterias del ácido láctico (Lactobacillus, Streptococcus, Micrococcus, Microbacterium, Leuconostoc) y miembros del género Bacillus y Levaduras.

Si el producto se procesa adecuadamente, esos microorganismos con excepción de los esporulados, se eliminan y quedan restringidos a la contaminación superficial representando contaminantes que se adquieren después del proceso térmico.

Bajo condiciones prolongadas de refrigeración, las bacterias de ácido láctico: Micrococcus, enterococos, bacilos y levaduras pueden crecer produciendo limosidad. Si el producto se almacena en envases impermeables éstos pueden estallar por la cantidad de CO2 producida.

Los productos metabólicos de las bacterias pueden combinarse con los pigmentos de la carne dando origen a las coloraciones verdosas o de color café.

Las carnes curadas no fermentadas presentan cuentas totales de 104 bacterias/g o menos, siempre y cuando se conserven adecuadamente.

En cuanto a los patógenos generalmente provienen del manejo inadecuado del producto por los obreros, éste es el caso de la presencia de Staphylococcus Aureus que a niveles bajos no causa problemas, pero cuando se almacena temperaturas entre 45-70ºC pueden proliferar al actuar las sales de curación como selectivas para su desarrollo.

En el caso de Salmonella y Escherichia Coli el cocimiento, los condimentos y las sales de curación influyen en su eliminación del producto, pero posteriormente durante su empaque o venta pueden contaminarse con estos microorganismos.

Para el control sanitario de la carne y sus derivados, el proyecto de las normas de la S.S. y la Dirección General de Normas, establece las siguientes normas microbiológicas para algunos productos.

Norma microbiológica para carne cruda:

Mesofílicos aerobios 1,000,000,000 UFC/gStaphylococcus Aureus 1,000 UFC/g Salmonella negativa en 25 g

Norma microbiológica para jamón cocido:

Mesofílicos aerobios 100,000 UFC/gStaphylococcus Aureus 1,000 UFC/g Salmonella negativa en 25 g

Norma microbiológica para queso de puerco:

Mesofílicos aerobios 1,000 UFC/gSalmonella negativa en 25 g

Norma microbiológica para chorizo:

Mesofílicos aerobios 2,500 UFC/gStaphylococcus Aureus 5,000 UFC/g Salmonella negativa en 25 g

La cuenta de bacterias mesófilas aerobias en el caso de la carne cruda tiene aplicación para:

a. Determinar su calidad cuando se usa como materia prima.b. Tener idea sobre las condiciones en que se efectúo su manejo, desde la matanza

hasta el momento de adquirirla. c. Cuando se sospecha en que fue la causante de un brote de toxiinfección

alimentaria para estimar su grado de peligrosidad con base al número de gérmenes potencialmente patógenos que contenga.

d. Estimar el grado de frescura o el posible tiempo de vida útil con base al número de microorganismos.

En cuanto a la presencia del género Salmonella se marca que debe ser negativa, ya que se considera que la salmonelosis es primordialmente una zoonosis, pero el ser humano puede ser afectado por la mayoría de los 1,500 serotipos conocidos del género, por lo que se pueden considerar potencialmente patógenos para el hombre y por ello se debe condenar el alimento que la contenga, ya que aún cuando se elimine por cocción, existe el riego de contaminación cruzada.

La presencia de Staphylococcus Aureus en carnes, nos indica que la contaminación puede provenir de la piel, pezuñas y plumas, asociada en algunos casos con lesiones presentes o a partir de la contaminación originada por los operarios que pueden tener lesiones en las manos y brazos a partir de secreciones nasales o saliva.

La piel normalmente alberga en los folículos pilosos al microorganismo.

Su determinación se hace con el objeto de investigar:

a. Si la carne que va a ser utilizada como ingrediente no contiene al germen en cantidades que puedan representar riesgo potencial a la salud por la presencia de enterotoxinas.

b. También nos sirve para determinar las condiciones sanitarias de manejo de la carne.

c. O bien para determinar las condiciones de almacenamiento de la carne.

En el caso de los derivados de la carne, la determinación de mesofílicos aerobios se puede realizar con los siguientes propósitos:

a. Determinar su calidad con base a una norma establecida.b. Poner de manifiesto deficiencias en su manejo durante la producciónc. Determinar la eficiencia de un proceso de desinfección o de cualquier tipo de

tratamiento que tienda a reducir la carga microbiana.d. Estimar el grado de peligrosidad de un alimento involucrado en un brote de

intoxicación alimentaria de acuerdo al número de gérmenes potencialmente patógenos que contenga.

e. Determinar el grado de frescura o el posible tiempo de vida de anaquel con base a la carga microbiana o a algún grupo en especial.

La determinación de la presencia de Salmonella se hace rutinariamente tomando en cuenta que ésta puede contaminar a partir de carne utilizada como ingrediente o a partir de los obreros enfermos o portadores, y aún cuando se someta a cocimiento el producto, sí es muy grande la contaminación inicial puede sobrevivir o sí la temperatura alcanzada en el centro del producto no fue la adecuada para eliminarla. Se puede presentar la contaminación cruzada del producto al ponerlo en contacto con equipo o utensilios contaminados a su vez, o por el manejo inadecuado de los operarios al empacarlo.

El recuento de Staphylococcus Aureus es de interés por los motivos siguientes:

a. Poner de manifiesto deficiencias en el manejo y almacenamiento del producto.b. Determinar el grado de peligrosidad del alimento por el contenido del germen.c. Como medio para reforzar un diagnóstico clínico y epidemiológico de un brote en

ausencia de ensayo inmunológico.

Cuando la carne fresca se ha almacenado en condiciones de refrigeración por varios días, los microorganismos que predominan como flora van a ser psicrotróficos, por lo que se recomienda que para tener idea del contenido microbiano y de las alteraciones que pudieran presentarse, se utilice el recuento de microorganismos psicrotróficos.

En el caso de derivados de la carne, se recomienda hacer recuento de hongos y levaduras cuando se presenta contaminación en forma rutinaria del producto terminado.

Cuando existen problemas causados por enverdecimiento, se recomienda el uso de medios de cultivo para determinar bacterias lácticas.

Clostridium Perfringens y Bacillus Cereus sólo se determinan en el caso de que se sospeche que la carne o derivados han sido causantes de un brote de intoxicación.

OBJETIVOS1. El alumno aprenderá el manejo adecuado de las técnicas utilizadas para el

análisis de la carne cruda y derivados.2. Conocerá el fundamento de éstas técnicas.

3. Interpretará adecuadamente los resultados.4. Aplicará las normas establecidas para el control microbiológico de la carne.5. Interferirá sobre cuáles son las fuentes de contaminación que aportan estos

microorganismos y cómo abatirlos.

MATERIAL Y MÉTODOSDado que la contaminación de la carne a menudo no es homogénea, es recomendable tomar una serie de muestras de diferentes partes y examinar el mayor número de muestras que sea posible.

Para las cuentas de microorganismos mesofílicos aerobios y psicrotróficos, a partir de la carne curda se recomienda usar 10 g de muestra con 90 ml de agua peptonada para la primera dilución, en el caso de la determinación de Salmonella usar 50 g y 450 ml de agua peptonada o caldo lactosado para el preenriquecimiento, y para el recuento de Staphylococcus Aureus se recomiendan 15 g de muestra y 135 g de diluyente.

ANÁLISIS DE CARNE

a) Carne molidab) Derivados de la carne

A. Recuento de bacteria mesófilas aerobias.

1. Pesar 10 g de muestra y resuspenderla en 90 ml de solución reguladora de fosfatos pH 7.2.

2. Homogenizar la muestra utilizando licuadora.3. A partir de éste estadio que representa la dilución 10-1 efectuar las diluciones:

10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9.4. Transferir 1 ml de cada una de las siguientes diluciones a cajas de petri de 10 -

1, 10-3, 10-5, 10-7, 10-9.5. Adicionar agar BHI fundido y enfriado a 45+2ºC en una cantidad aproximada

de 20 ml.6. Incubar a 35ºC durante 48 a 72 horas.7. Hacer el recuento con las cajas.

B. Recuento de microorganismos psicrotróficos

1. Pesar carne molida, 10 g de la muestra y resuspenderla en 90 ml de solución reguladora de fosfatos a pH 7.2.

2. Homogenizar la muestra utilizando la licuadora.3. A partir de este estadio que representa la dilución 10-1, efectuar hasta la

dilución 10-5.4. Transferir 1 ml de cada una de las siguientes diluciones: 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4 y

10-5.5. Adicionar agar BHI fundido y enfriarlo a 45+2ºC en una cantidad aproximada

de 20 ml.6. Incubar las cajas a 17ºC por 16 horas y a 7ºC por 3 días, o bien a 7ºC durante

10 días.7. Hacer la cuenta de colonias.

En el caso de la carne que se conservó durante varios días a baja temperatura, los recuentos de gérmenes mesófilos son de escaso valor a la hora de predecir la vida media del alimento conservado en refrigeración, ya que a temperaturas entre 1 y 5ºC

o más bajas, mueren muchos gérmenes psicrotróficos, por lo que de preferencia se debe incubar a la temperatura a la que se conservó el alimento.

Recuento de Staphylococcus Aureus

Carnes y derivados de la carne

1. Pesar 15 g de la muestra y adicionar 135 ml de regulador de fosfatos.2. Homogenizar en la licuadora aproximadamente a medio minuto.3. Preparar las siguientes diluciones: 10-1 10-2 10-3 utilizando tubos conteniendo 9

ml de solución reguladora de fosfatos.

METODO DE BAIRD PARKER

1. Colocar 0.1 ml. De cada dilución en placas conteniendo Agar Baird Parker y extenderla con varilla de vidrio en toda la superficie del medio.

2. Incubar las placas invertidas a 35º C 24 - 48 horas.3. A las 2 horas, seleccionar las cajas que tengan entre 50 y 150 colonias

aisladas, contar y marcar todas aquellas que sean brillantes con o sin ligero borde blanco y rodeado por una zona clara.

4. Incubar las cajas 24 horas más y seleccionar las colonias con esas características.

DETERMINACION DE LA PRESENCIA DEL GENERO SALMONELA

c) Carne crudad) Derivados de la carne

Para el caso de los derivados de la carne se usa preenriquecimiento no selectivo que se aplica cuando el alimento en estudios ha sufrido un proceso de calentamiento, o si su pH es bajo. Estos y otros tratamientos pueden determinar que las salmonelas presentes se encuentren en estado semilatente o “debilitado” y de esta manera se permite al usar estos medios de cultivo, que repongan del daño traumático subletal y comiencen el proceso de multiplicación normal sin estar expuestos a sustancias inhibidoras o selectivas que se encuentran en los medios selectivos.

Los medios utilizados para preenriquecimiento son: El caldo lactosado, el agua peptonada para pescado congelado y huevo en polvo.

El agua peptonada para derivados de la carne como el jamón cocido.

El agua adicionada de cristal violeta o verde brillante al 0.002% para el caso de leche en polvo.

Los medios selectivos de enriquecimiento se emplean en el análisis de los alimentos con el propósito de aumentar el contenido de Salmonella y de Arizona e inhibir otros microorganismos presentes en las muestras del alimento. Los alimentos no procesados, ingredientes o alimentos muy contaminados se trabajan directamente en estos medios sin utilizar preenriquecimiento.

Los alimentos que se someten a preenriquecimiento posteriormente se pasan a estos medios.

El tipo de medio de enriquecimiento posteriormente usado variaría de acuerdo al alimento, ya que los alimentos pueden interferir con la acción de algunos de estos

medios dad su composición química. P.Y. el huevo en el caso de Salmonella en las muestras.

La temperatura y el tiempo de incubación son importantes para aumentar el porciento de recuperación de la Salmonella en las muestras.

Así se recomienda la temperatura de 43º C y cuando se usa caldo selenito cistina máximo 18 horas de incubación, ya que después de este tiempo aumenta el contenido de coliformes que antagonizan a la Salmonella. Para el caldo tetratiano de Kauffman 24 horas máximo por la misma razón.

Dos tipos de medios se utilizan con este fin: el caldo selenito (F, cistina, verde brillante y sulfa verde brillante) y el caldo tetrationato (Kauffman verde brillante, novobiocina, con sulfatiazon y verde brillante).

Para aislar la Salmonella, se recomienda el uso de dos medios selectivos por muestra de alimento para efectuar el enriquecimiento.

Para aislar la salmonella a partir de estos medios se utilizan medios sólidos. Los medios sólidos en base a su selectividad se clasifican como:

a) De baja selectividad: Agar EMB, agar Mac Conckey.b) De selectividad moderada: Agar S.S. y agar XLD.c) Muy selctivos: Agar verde brillante y Agar Sulfito de Bismuto.

En los primeros medios de las cepas de Salmonella dan colonias incoloras o transparentes.

Del segundo grupo en el Agar S.S. se obtienen: colonias incoloras o ligeramente rosadas o transparentes que pueden tener el centro negro.

En el agar XLD se obtienen: colonias transparentes u opacas, incoloras, rosas o ligeramente rojizas.

En el agar verde brillante se tiene la siguiente morfología colonial: colonias transparentes u opacas de 0.5 a 1.5 mm. De diámetro, incoloras, rosas o ligeramente rojizas.

En la proximidad con las colonias dicoliformes se puede presentar coloración verdosa.

Las pruebas bioquímicas para su identificación presuntiva son:

Agar TSI (fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa, además de producción de H2S).

SIM (producción de H2S, movilidad y la producción de indol). El medio de Surraco (fermentación de sacarosa e hidrólisis de Caldo Manitol;

fermentación Manitol) Caldo VP (producción de acetil metil carbonil) Medio LIA (descarboxilación de lisina) Medio de Citrato de Simmons (utilización del Citrato como fuente de Carbono)

PROCEDIMIENTO

A. Pesar 25 g de carne (carne molida o chorizo)

a. En el caso de la primera resuspender 25 g en 225 ml de Caldo Selenito Cistina y 25 g en 225 de Caldo Tetrationato (5.0 ml de Yodo o Yoduro de Potasio).

b. Para el chorizo resuspender 25 g en 225 ml de agua peptonada. Para el Caldo Selenito incubar 18 horas a 35ºC. Para el Caldo Tetrationato 24 horas a 35ºC.

c. De la muestra conteniendo agua peptonada se transfiere 1 ml a Caldo Selenito Cistina y 1 ml al Caldo Tetrationato (con 0.2 ml de Yodo o Yoduro de Potasio en solución).

d. De los medios conteniendo Caldo Selenito Cistina y Caldo Tetrationato de Kauffman, pasar 3 asadas a cajas de agar Mc Conckey, agar S.S., agar verde brillante y agar SLD.

e. Aislar por estría.f. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas y observar morfología colonial.g. Escoger una colonia característica proveniente de la vía Selenito y otra de vía

Tetrationato.h. Incubar de acuerdo al tiempo incidado para cada medio.i. Los resultados obtenidos se consultarán en la tabla siguiente:

Características de Salmonella, Arizona y Shigella

Prueba Salmonella Arizona Shigella

Urea - - -Lisina descarboxilasa +

(alcalinidad)+

(alcalinidad)-

Lactosa, sacarosa y glucosa TSI

k/A k/A k/A

H2S en TSI +/- + -Malonato - + -

Indol - - - ó +Movilidad + + -

VP - - -Citrato de Simmons + + -

Manitol + + -

+ = el 90% o más dan positiva la prueba.- = el 90% o más dan negativa la prueba.V= del 10 al 89.9% de las cepas son positivas a las 48 horas.H = alcalinidadA = acidez