SECUENCIACIÓN MASIVA DE ADN

Next Generation Sequencing (NGS)

Las nuevas tecnologías de secuenciación (NextGeneration Sequencing-NGS), son una poderosaherramienta para estudios de genómica estructural yfuncional, siendo capaces de secuenciar organismoscompletos en cosa de horas.

Cyclic Reversible Termination (CRT).

“Terminación reversible cíclica”

METODO

Este método usa terminadores reversibles en un método cíclico que incluye la incorporación de nucleótidos, la captura de fluorescencia y la ruptura:

• La DNA polimerasa unida al témplate con el primer, incorpora (por complementariedad de bases) un solo nucleótido marcado con fluorescencia.

• Después de la incorporación, se lavan los nucleótidos no incorporados y se lee la fluorescencia (reflexión interna total de fluorescencia o TIRF) mediante láseres para determinar la identidad del nucleótido incorporado.

• Sigue un paso de ruptura para eliminar el grupo terminador.

• La clave de este método es el terminador reversible, del cual hay dos tipos: bloqueado o sin bloquear en el extremo 3'.

Fig. 6a. Terminadores reversibles bloqueados en el extremo 3'

Fig. 6b. Terminadores reversibles sin bloquear en el extremo 3'

La detección puede ser mediante un solo color (todos los nucleótidos marcados con el mismo fluoróforo) o mediante 4 colores (cada nucleótido marcado con un fluoróforo diferente) tal y como se muestra a continuación:

Fig. 7a. Método CRT de 4 colores.

Fig. 7b. Método CRT de un solo color.

La secuenciación Ion Torrent

La secuenciación por Ion Torrent es un método de secuenciaciónde ADN basado en la detección de protones liberados durantela polimerización del ADN. Por lo tanto, este método se guía a través delas polimerizaciones que se llevan a cabo en las cadenas simples de ADNen estudio.

Este tipo de secuenciación difiere de los demás tipos en que no usannucleótidos modificados y que la detección no se realiza vía óptica, sinopor detección de pH.

Todo empezó hace unos 36 años, cuando el bioquímico inglés FrederickSanger desarrolló la primera técnica de secuenciamiento de ADN. Elprocedimiento al cual posteriormente llamaron Método de Sanger erasumamente complejo, ya que requería del uso de nucleótidos marcadoscon fósforo radiactivo (P-32), nucleótidos desoxigenados (ddNTPs),cuatro reacciones en paralelo y un gel de electroforesis muy largo.

Con los secuenciadores basados en el método de Sanger se secuenció elgenoma humano por el año 2003, el cual costó unos $3,000 millones.

Luego vinieron los primeros secuenciadores porsíntesis, los cuales se basan en la lectura de lasecuencia de ADN a partir de la síntesis de lahebra complementaria gracias a la acción de unaADN polimerasa. Entre ellas tenemoslos pirosecuenciadores, los cuales se basan en ladetección de luminiscencia emitida durante lareacción de síntesis del ADN y la tecnología SOLiD,que se basa también en la detección defluorescencia emitida durante una reacciónde ligación de ADN.

Ion Torrent™ Secuenciación por semiconductores

Personal Genome Machine (PGM)

∆pH ∆V

El equipo secuenció los genomas completos de cinco secuencias anotada en elGenBank:

3 E. ColiV. FischeriR. Palustris

También se demostró su utilidad al secuenciar el genoma:

E. Coli O104:H4

2 horasChip – $99 Ion Personal Genome Machine (PGM) -$50,000

Causó brote infeccioso en

Alemania

1000 casos50 muertes

REFERENCIA

• http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Secuenciacion_Masiva&opc=tecnicas&idap=79#3

• http://www.lifetechnologies.com/mx/es/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-technology.html