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Carlos Ángel Gallardo C., Edgar Cano E., Gabriel Eduardo López G., Vanessa Blas V., Roxana Olvera R.,

Margarita Franco C., Rocío Ortiz B.

Las ficobiliproteínas de Spirulina maxima y Pseudanabaena tenuis protegen contra el daño hepático y el estrés

oxidativo ocasionado por el Hg2+

Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 41, núm. 2, abril-junio, 2010, pp. 30-35,

Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.

México

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Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas,

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Volumen 41 • Número 2 • Abril - Junio 2010

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Trabajo Científico

Las ficobiliproteínas de Spirulina maxima y Pseudanabaena tenuis protegen contra el daño

hepático y el estrés oxidativo ocasionado por el Hg2+

Phycobiliproteins from Spirulina maxima and Pseudanabaena tenuis protect against hepatic damage and oxidative stress caused by Hg2+

Carlos Ángel Gallardo C.1,2, Edgar Cano E.1, Gabriel Eduardo López G.1, Vanessa Blas V.1, Roxana Olvera R.4, Margarita Franco C.3, Rocío Ortiz B.1

1Lab. de Neurobiología. Departamento de Fisiología “Mauricio Russek Berman”, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN

2Academia de Biología. CECyT No. 6 “Miguel Othón de Mendizabal”, IPN3Lab. de Metabolismo I. Departamento de Fisiología “Mauricio Russek Berman”, ENCB, IPN

4Departamento de Botánica, ENCB, IPN

ResumenEl objetivo fue evaluar si las ficobiliproteínas de P. tenuis y S. maxima, protegen contra el daño hepático y estrés oxidativo que ocasiona el Hg2+. Se emplearon 42 ratones macho adultos, divididos en: 1) control; 2) amortiguador de fosfatos (AF) + 5 mg/Kg de HgCl

2 (ip); 3) AF + extracto proteico (EP) con 100 mg/kg de ficobiliproteínas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto proteico

con 100 mg/kg de ficobiliproteínas de Pseudanabena tenuis (ig). Los ratones se sacrificaron y se obtuvo el hígado. Se cuantificó la LP, EROS, la catalasa y la glutatión peroxidasa y se realizó el análisis histológico. Se encontró que las ficobiliproteínas de ambas cianobacterias evitan el incremento de EROS y LP, y aumenta la actividad de la CAT y protegen el tejido hepático.

AbstractThe aim of this work was to evaluate if phycobiliproteins of P. tenuis y S. maxima protect from the hepatic damage and oxidative stress caused by Hg2+. There were used 42 adult male mice, divided in: 1) control; 2) buffer phosphates (BP) + 5 mg/Kg of HgCl

2 (ip);

3) BP + protean extract (PE) with 100 mg/kg of Spirulina maxima phycobiliproteins (ig); 4) BP + protean extract with 100 mg/kg of Pseudanabena tenuis phycobiliproteins (ig). The mice were sacrificed and the liver was obtained. LP, ROS, catalase and glutathione peroxidase were quantified, and histological analysis was made. It was found that phycobiliproteins from two cyanobacterias avoid the increase of LP and ROS, and they induced a rise of catalase that protects hepatic tissue damage caused by Hg2+.

Palabras clave: ficobiliproteínas, protección hepática, mercurio y estrés oxidativo.

Keywords: phycobiliproteins, liver protection, mercuric ion and oxidative stress.

CorrespondenciaRocío Ortiz ButrónEscuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPNCarpio y Plan de Ayala, México D.F., C.P. 11340, MéxicoTel. (525) 729 6300 / 62348 Fax: (525) 729 6206e-mail: rocipn@yahoo.com.mx

Fecha de recepción: 21 de enero de 2010Fecha de recepción de modificaciones: 23 de marzo de 2010Fecha de aceptación: 11 de mayo de 2010

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IntroducciónEn la actualidad debido a la industrialización, los seres vivos están expuestos a la intoxicación por diferentes formas químicas de mercurio, este metal causa diferentes efectos tóxicos en un gran número de tejidos y órganos, ya que es de difícil eliminación y se bioacumula. El grado de toxicidad depende del tiempo de exposición, de la concentración del metal y de la forma química1. Particularmente, la forma inorgánica de este metal con valencia 2+ participa en la reacción de Fenton donde el ión mercúrico (Hg2+) reacciona con el peróxido de hidrógeno produciendo radical hidroxilo, ión hidróxido y la especie metálica se reduce, lo que provoca estrés oxidativo y daño celular2.

Los estudios de toxicidad en roedores han demostrado que el Hg2+ daña al hígado , ya que se presenta un aumento de la producción de especies reactivas del oxígeno (EROS) y peroxidación de lípidos (LP)3.

Por otro lado, se ha demostrado que la ingesta de cianobacterias del género Spirulina protege contra la citotoxidad inducida por Hg2+, CCl4, doxorrubicina, 4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina, entre otros4,5. El mecanismo protector de la ingesta de cianobacterias se debe a que contienen vitaminas, ácidos grasos polinsaturados, y otros fitoquímicos como las clorofilas y sus pigmentos accesorios llamados f icobiliproteínas 6. Particularmente en Spirulina se encontró que produce tres ficobiliproteínas, aloficocianina, la ficoeritrina y en particular más del 50% de sus ficobiliproteínas las constituyen el pigmento azul ficocianina.

De hecho, se ha demostrado que los extractos proteicos ricos en ficobiliproteínas de Spirulina tienen un poder antioxidante y citoprotector7, y estudios recientes han demostrado que el extracto proteico de Pseudanabena tenuis la cual es altamente productora de ficoeritrina, protege contra el daño renal que provoca el Hg2+8. Por lo mencionado anteriormente, fué de nuestro interés evaluar y comparar las diferentes proporciones de ficobiliproteínas de Spirulina maxima y de Pseudanabena tenuis ante el daño hepático provocado por el Hg2+.

Material y métodosObtención del extracto de ficobiliproteínasSe partió de la cepas Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis, que fueron proporcionadas por el laboratorio de Fisiología Vegetal del Departamento de Botánica de la ENCB. Dichas cepas fueron identificadas por la Dra. Roxana Olvera Ramírez, del departamento de Botánica de la ENCB.

Los cultivos se escalaron hasta tener cultivos de lote continuo de 20 L mantenidos en medio mineral a temperatura de 24 ±

2 °C, con flujo de aire continuo proporcionado por bombas de aire MAXIMA (Hagen) para 113.6 L, iluminación constante (180 μE / m2s) de lámparas de halógeno (luz blanca) con ciclo de luz-oscuridad 10:14 h, la luz enciendía a las 7:00 a.m.

Para obtener el extracto de ficobiliproteínas se recuperaron 10 gramos de biomasa por filtrado al alto vacío, posteriormente se colocó en regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 (RF), para darle 5 ciclos de congelación y descongelación. El extracto se centrifugó a 3000 rpm por 30 minutos y se colectó el sobrenadante para caracterizarlo por espectrofotometría9. El extracto proteico rico en ficobiliproteínas de Spirulina maxima, contenían 47 % de ficocianina, 37 % de aloficocianina y 16 % de ficoeritrina mientras que el de Pseudanabena tenuis contenía 2% de ficocianina, 9% de aloficocianina y 89% de ficoeritrina.

Tratamiento de los animalesSe emplearon 42 ratones macho de la cepa NIH que se encontraban en un peso de entre 25 y 30 gramos, los cuales se separaron aleatoriamente en cuatro grupos: 1) control que recibió una solución 100 mM de amortiguador de fosfatos (AF)(ig) + solución salina 0.9% (ip); 2) AF + 5 mg/Kg de HgCl2 (ip); 3) AF + extracto proteico (EP) que contenía 100 mg/kg de ficobiliproteinas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto proteico (EP) que contenía 100 mg/kg de ficobiliproteinas de Pseudanabena tenuis (ig).

La administración del EP o AF se realizó 30 min. antes de la administración de solución salina o HgCl2 y diariamente durante 5 días.

Los ratones se mantuvieron en cámaras de temperatura y humedad controlada, en cajas de acrílico de 40x40 con acceso libre a agua y alimento, después de 5 días de la administración del HgCl2 y/o solución salina, se sacrificaron por dislocación cervical. Inmediatamente después de haber realizado el sacrificio, se obtuvo el hígado, de cada animal. La mitad del hígado se empleó para cuantificar la peroxidación de lípidos, la formación de EROS, así como la actividad de enzimas antioxidantes (catalasa y glutatión peroxidasa). Mientras que la otra mitad del hígado se empleó para realizar el análisis histológico por la técnica de hematoxilina-eosina. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo a la normativa mexicana para la producción, cuidado y tratamiento de animales de laboratorio NOM-082-ZOO-1999.

Análisis bioquímicoTodos los hígados utilizados en las pruebas bioquímicas fueron homogenizados en 3 mL de regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4.

Evaluación de la peroxidación de lípidosCada muestra fue homogeneizada en 2.2 mL de solución salina 0.9 % para realizar la técnica descrita por Triss y

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Wilmore de 198410, la cual consiste en la determinación de los productos lipídicos de peroxidación que son capaces de generar fluorescencia. Para lo cual, se tomaron alícuotas de 1 mL de los homogeneizados de cada muestra y se les adicionó 4 mL de una mezcla de cloroformo-metanol (2:1 vol/vol), después se agitaron durante 30 segundos. Posteriormente, para permitir la separación de las fases acuosa y la orgánica, dichas muestras se mantuvieron a 4 ºC durante 30 minutos siempre protegidas de la luz. Transcurrido dicho tiempo, la fase acuosa (fase superior) fue aspirada y desechada con una bomba de vacío.

La fluorescencia de cada muestra se determinó con ayuda de un espectrofotómetro de f luorescencia Perkin-Elmer LS5, a longitudes de onda de 370 nm de excitación y 430 nm de emisión. La sensibilidad del aparato se ajustó a 140 unidades de fluorescencia con una solución de quinina a una concentración de 0.001 mg/mL. Los resultados se expresan como unidades relativas de fluorescencia (URF)/mg de proteína.

Cuantificación de las especies reactivas del oxígenoLas EROS se determinaron usando el diacetato de 2’,7’-diclorof luorescina (DCFH-DA), el cual es desesterificado por la presencia de peróxido de hidrógeno produciendo una molécula más oxidada (2 ,́7 -́diclorofluoresceína o DCF), la cual es capaz de fluorescer11. El DCF posee como propiedades una longitud de excitación a 488 nm y una longitud de emisión de fluorescencia máxima a los 525 nm. Para ello, se tomaron 10 μL del homogeneizado utilizado para la técnica de peroxidación de lípidos y se colocaron en 1950 μL de regulador TRIS:HEPES (18:1). La fracción diluida se incubó con 50 μL de DCFH-DA por 1 hora a 37º C en agitación constante. La reacción se detuvo colocando las muestras en hielo. Inmediatamente se comenzó la lectura de la fluorescencia en un espectrofotómetro Perkin-Elmer LS5, a longitudes de onda de 488 nm de excitación y 525 nm de emisión, los resultados se expresan como DCF formada/h/mg de proteínas totales.

Actividad de la Glutatión peroxidasa (GPX)La actividad de la GPX fue determinada por el método de Hafeman de 197412 modificado por Cano-Europa 200813 el cual se basa en medir en Glutatión reducido remanente que utiliza la enzima como cofactor. Se agregaron dieciséis mL del homogeneizado a 2 mL de regulador de fosfatos 100 mM que contenía EDTA 0.4 mM, Azida de sodio (NaN3) y 2 mM de GSH. La reacción se incubó a 37°C y posteriormente se agregó 1 mL de H2O2 1.25 mM. Se tomó una muestra a los 5 min y otra a los 10 min y se les agregó 1.2 mL de ácido metafosfórico al 1.6%. A la última mezcla se le realizó una dilución 1:2 con regulador de fosfatos 400 mM. Finalmente, se reveló la reacción agregando 250 μL de ácido 5.5-dinitrobis-2-nitrobenzoico y se leyó la absorbancia a 412 nm. Los resultados se muestran en μg de GSH consumido/mg de proteína/min.

Actividad de la CatalasaLa actividad de la catalasa fue medida por medio de la técnica de Aebi de 198414 la cual se basa en la desaparición del H2O2 a 240 nm. Se colocaron 5 μL de del homogenizado en 3 mL de regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 que contenía H2O2 30 mM. Se midió la absorbancia a los 15 y 30 segundos. Los datos se presentan como k/mg de proteínas.

Estudio histológicoLos hígados fueron fijados durante 12 horas, para posteriormente incluirlos en parafina. Se obtuvieron 8 cortes coronales de 7 μm de cada órgano y posteriormente fueron teñidos por la técnica de hematoxilina-eosina. El estudio microscópico se realizó a doble ciego, analizándose 20 secciones de tejido para cada uno de los órganos evaluados15.

Nota: Todos los reactivos empleados para las determinaciones de fluorescencia son marca SIGMA calidad grado HPLC. Mientras que aquellos utilizados en la determinación enzimática e histología son SIGMA calidad analítica.

Análisis estadísticoEn las gráficas de peroxidación de lípidos, las EROS y las actividades de la catalasa y la GPX se muestran como valores de la media ± el error estándar EE. Estas variables se analizaron utilizando un análisis de ANOVA de una vía, seguida de la prueba de Dunnett post hoc contra el control. Los valores de P< 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados y discusiónEl mercurio es un contaminante industrial, que produce una serie de alteraciones en tejidos tanto de plantas como animales. Uno de los órganos blanco de este metal es el hígado, donde induce daño tisular, principalmente cuando se encuentra en su forma catiónica de valencia 2+, en la que es absorbido y acumulado16. El objetivo de nuestra investigación fue demostrar, que los pigmentos accesorios llamados ficobiliproteínas de las cianobacterias Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis previenen el estrés oxidativo causado por mercurio, así como el daño celular. Nuestros resultados demostraron que las ficobiliproteínas independientemente de la cianobacteria que se trate mantienen la citoarquitectura normal del parénquima hepático (Figura 1) y evita que se eleven los marcadores de estrés oxidativo LP y EROS (Figura 2) por lo que se sugiere que todas las ficobiliproteínas tienen las mismas propiedades antioxidantes y citoprotectoras.

El mercurio en su forma Hg2+ causa estrés oxidativo porque tiene gran afinidad por las proteínas intracelulares que contienen grupos sulfidrilo16.

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Los conjugados de mercurio cambian el ambiente REDOX provocando que sea más oxidante. El ambiente oxidante promueve reacciones oxidativas entre las EROS y las biomoléculas, como los lípidos, los carbohidratos o los ácidos nucleicos17.

En este trabajo se demostró que el mercurio incrementa las concentraciones de lipoperóxidos y de EROS. El estado oxidado es incrementado porque el Hg2+ interfiere con la cadena respiratoria mitocondrial aumentando la producción de H2O2

18.

Por otra parte, se sabe que las cianobacterias del género Spirulina tienen potencial nutracéutico y farmacológico debido a sus componentes; entre ellos se encuentran algunos antioxidantes que previenen el daño celular en diferentes modelos toxicológicos sin embargo, estos estudios solo involucran este género, por lo tanto es importante explorar nuevas cianobacterias con diferente potencial farmacológico.

Hemos mostrado con este trabajo que las ficobiliproteínas de Spirulina maxima y las ficobiliproteínas, ricas en ficoeritrina de Pseudanabaena tenuis, son un potente antioxidante contra el estrés oxidativo causado por mercurio así como contra el daño celular en el hígado. En trabajos previos se encontró que la

Figura 1. Fotomicrografías del tejido hepático. a Grupo control. b Grupo tratado con Hg2+. c Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg + s.s. d Ficobiliproteinas de P tenuis 100mg/kg + ss. e Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg + Hg2+. f Ficobiliproteinas de P tenuis 100 mg/kg + Hg2+ . El tratamiento con Hg2+ ocasionó atrofia, pérdida de los cordones de hepatocitos, vasocongestión y pérdida de los núcleos. (Flechas en b). Las alteraciones histológicas no se presentaron en los grupos tratados con ficobiliproteínas de ambas cianobacterias (e y f).

Figura 2. Cuantificación de la peroxidación de lípidos (a), especies reactivas del oxígeno (b), y la actividades de las peroxidasas: catalasa (c) y GPX (d). Se representa la media ± EE. *P< vs. Control.

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dosis que mantiene un ambiente REDOX es la de 100mg/Kg de ficobiliproteínas y mantiene la citoarquietectura del riñón8, la cual también protege totalmente al hígado.

Se proponen tres mecanismos por los cuales las ficobiliproteinas ejercen un efecto protector, el primero involucra la reducción de marcadores oxidativos debido a su propia estructura química de tetrapirroles lineales ya que pueden actuar como potentes nucleófilos pudiendo neutralizar a las especias reactivas derivadas del oxígeno y nitrógeno evitando daño oxidativo. Esta hipótesis fue demostrada tanto in vitro19 como in vivo20.

El segundo mecanismo protector de las ficobiliproteínas pudiera deberse a sus propiedades quelantes, ya que se sabe que estos pigmentos son usados para concentrar metales pesados21. El tercer mecanismo involucra el incremento del sistema enzimático antioxidante. Este último puede observarse por el aumento de la actividad destoxificadora de la catalasa (Figura 2) que produce una disminución de la cantidad de H2O2. Es posible que los tetrapirroles lineales de las ficobiliproteínas mimeticen los efectos de dicha enzima8.

ConclusionesPodemos concluir que las ficobiliproteínas de las cianobacterias son potentes sustancias antioxidantes y hepatoprotectoras independientemente de la cianobacteria de la que provengan.

AgradecimientosEste estudio fue parcialmente f inanciado por el proyecto 20090485 SIP-IPN. O-B, R. es becaria EDI, COFFA y SNI. G-C, C.A. y L-G, G. E; B-V, V. son becarios CONACyT.

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