termoluminiscence
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Chlorofylová termoluminiscence listových terčíků
Martin JanoškaOstravská Univerzita v Ostravě
2008/2009
Experimentální metody studia fotosyntézy
Chlorophyll thermoluminescence of leaf discs: simple instruments and progress in signal interpretation open the way to
new ecophysiological indicators
Autor: Jean-Marc Ducruetz: Journal of Experimental Botany 2003
Výchozí článek:
Termoluminiscence:• dále jen TL• TL = tepelné vysvěcování • Luminiscence, která je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání energie (=
excitaci)
• Excitace však musí proběhnout za tak nízké teploty, aby excitované elektrony zůstaly „polapeny“ v záchytných centrech.
– Jakmile budou tato centra zcela zaplněna, zastavíme excitaci a počkáme až dozní fluorescence - jakákoliv emise světla
– Pak postupně zvyšujeme teplotu až dojdeme k teplotě, při které se elektrony uvolní ze záchytných center nacházejících se ve fotosystému II, a tak začne další emise světla – uvolněné elektrony rekombinují s ionizovanými aktivátory – vzniká termoluminiscence.
• Pomocí TL můžeme odhalit emisní pásy, které jsou mnohem více rozpoznatelné než při měřeních využívajících konstantní teplotu.
• Časový interval mezi excitací a tepelnou aktivací může být značně dlouhý.
Termoluminiscence – termoluminiscenční křivka:
• Graf závislosti intenzity luminiscence na teplotě při lineárním vzrůstu teploty – termoluminiscenční křivka– Její intenzita nejdříve stoupá, dokud roste pravděpodobnost
uvolnění elektronů, ale jakmile se zásoba „polapených“ elektronů vyčerpá klesne opět na nulu
– podle termoluminiscenční křivky a podle polohy maxima Tmax můžeme zjistit hloubku záchytných center
– Průběh termoluminiscenční křivky závisí na dvou parametrech:
» Frekvenčním faktoru s» Hloubce záchytného centra E
• Intenzita TL Bte charakterizuje rychlost úbytku elektronů na záchytných centrech dn/dt
Termoluminiscenční křivka
Obr.1: Termoluminiscenční křivka při lineárním vzestupu teploty T = b.t
Model Fotosystému II
• V 60 – tých letech byl pomocí fluorescence chlorofylu u luminiscence úspěšně vytvořen model PS II, který byl poté v 80 - tých letech podpořen výsledky TL.
• Nabité páry jsou uloženy jako:• Elektrony na primárním chinonickém akceptoru jako Qa
- (centra jsou uzavřena), a krom toho na sekundárním akceptoru jako Qb
- (centra otevřena)• Čtveřice + díry uspořádané jako S1
+, S2+, S3
+, S4+
komplex, z nichž pouze S2 a S3 jsou schopné se znovu smísit s Qa a Qb.
Signální analýzy• Teorie „rekombinace náboje“ byla poprvé vypracována
pro minerály Randallem a Wilkinsenem (1945)
• Předpokládali, že rekombinace fixních +/- nabitých párů se podrobí kinetice prvního řádu
• Teoretická simulace kinetiky prvního řádu se dobře hodí k nejdůležitější části B pásu indukované jednotlivými záblesky, které jen vytvářejí dvojici S2Qb
-, mimo okrajů při nízké a vysoké teplotě způsobené minoritními pásy.
• Simulace je nezbytná pro rozklad signálu termoluminiscence na elementární pásy.
• To se provádí upravením tří parametrů každého pásu; jde o Ea = aktivační energie, N = počet nabitých párů, N0 = počáteční koncentrace nabitých párů zjištěná měřícím systémem
Název Tm standart
(0C) Posun v Tm (0C) Původ
Pásy fotosystému II
(před iluminací)
A -15 Z+Qb-
Q 5 S2Qa-
B 35 28 S2Qb-
45 22 S3Qb-
AG 55 35 S2/S3Qb+e-
C D+Qa-
Oxidativní pásy
(nezávislé na iluminaci)
HTL1 65-85 aldehydy a H2O2
HTL2 120-140 lipid. Peroxidy
HTL3 více než 160 Zahřívání
Tabulka č.1: Pásy pozorované při luminiscenci listu, hodnoty Tm
korespondují se zahřívacím poměrem 0,50C/s.
Měření termoluminiscence
• Termoluminiscence je jednoznačně destruktivní technikou, i když do jisté míry neinvazivní
• Měření probíhá na čerstvých listových terčících, které nabízejí ještě lepší úroveň integrity než intaktní chloroplasty a protoplasty
• TL je speciální metodou, která poskytuje lepší rozlišení signálu z vyzařujících záchytných center na úkor tepelného zpracování vzorku
• Pokrok v termoelektrických Peltierových prvcích (jedna strana chladí, druhá hřeje) a lehkých kompaktních detektorech umožnily rozvoj jednoduchých, cenově dostupných a přenosných přístrojů.
• Jak se TL stává nástrojem rostlinné ekofyziologii, může se stát nutností důkladnější úprava listů mimo termoluminiscenční komory
Obr.2: Termoluminiscence (čáry) a fluorescence (tečky) listového terčíku z inbredního druhu kukuřice po 30 s excitaci červeným světlem. Zahřívací poměry: tlusté čáry nebo tečky – 0,5 0C/s; tenké čáry nebo tečky – 0,25 0C/s
Měření termoluminiscence
Obr.3: Přístroj pro měření termoluminiscence listu – verze s detektorem PMT (fotonásobič) blízko u vzorku a vodou chlazeném Peltierovým prvkem
LG - světlovod
FP – řídící jednotka
FB – Walzova žárovka
C – spojovací box
DAQ – A/D převodník
PMT - detektor
S - vzorek
EM - elektromagnet
PU – řídící jednotka
WI – přístup vody
TR – tepl. regulovatelný blok
WO – výstup vody
Měření termoluminiscence
Obr.4: Přístroj pro měření termoluminiscence listu – verze, kdy držák vzorku je držen bokem na jednom rameni světlovodu a se vzduchem chlazeným Peltierovým prvkem
P – Peltierova destička
R + F – ohřívač + fen
HRP – tepelně odolný plast
LG - světlovod
R – mosazný kruh
N2 – přívod dusíku
Klasické TL pásy in vivo• B pás (při 35 0C) je důležitý ve zdravém na tmu adaptovaném listu
podrobenému jednomu nebo několika jednoduchým zábleskům, ačkoliv minoritní pásy mohou být také detekovány: například Q pás na spodním okraji, AG nebo C pásy na horním okraji.
• Vzrůst Q pásu (Tm = 5 0C) obecně spojován s C pásem (Tm = 55 0C), což odráží poškození sekundárního chinonického akceptoru v PS II Qb, indukovaném například při fotoinhibici.
• Pás A se objeví v případě poškození kyslík vyvíjejícího komplexu.
• Kromě objevení nových stresem indukovaných pásů, může být charakterizace B pásu sama o sobě velmi informativní.
• Během působení fotoinhibitorů, se intenzita B pásu snižuje souběžně s hodnotou fluorescenčního parametru FV/FM, odrážející destrukci PS II center.
• Z experimentu bylo zjištěno, že u zmrazených listů je nejvyšší pík B pásu při 35 0C aniž by záleželo na počtu záblesků, kdežto u nezmrazených listů po jednom záblesku nejvyšší pík při 32 0C a po třech záblescích v blízkosti 28 0C.
Pásy vysoké teploty (HTL)
• Detekujeme je, když vzorek vystavíme velkému stresovému působení – rozmezí teplot zcela destruktivním pro PS II
• Mohou být pozorovány okolo 50 – 60 0C, a sice bez předchozího osvětlení
• Okolo roku 1990 byly objeveny v Moskvě u řas nebo listů vystavených oxidativnímu stresu TL pásy okolo teploty 60 0C, s hlavním pásem dokonce až při teplotě 130 0C
• Dále byly také objeveny pásy vyvolané oxidativním působením vrcholící při 75 0C
• Podobné pásy byly nalezeny i u tabáku ošetřeného houbovým elicitorem
• Konečně pás při 130 0C se objevil, když byl vzorek stlačen v suché „klasické“ termoluminiscenční atmosféře, kde kapalný dusík působil jako vysoušeč, a intenzita tohoto pásu byla korelována obsahem lipidových peroxidů – které se vytvořily během zahřívání
• Naproti tomu, když byly vzorky uchovávány ve vodním médiu o 100 0C, aby se zabránilo vysychání, jak se obvykle pří TL fotosyntetických studiích dělá, byl pozorován pouze pás při 75 0C
• Ostatní pásy poté byly pozorovány při 60 – 90 0C
• Pás při 130 0C může sloužit jako indikátor oxidativního stresu
Obr.5: HTL emise u listových terčíků špenátu nalepených na měděném plechu, zmrazených na 20 hodin při -20 0C, a pak hodinu rozmrzávajícpři pokojové teplotě. Sucho – terčík vysušen ve vakuu před TL bez skleněné destičky; Vlhko – nevysušený disk, TL probíhající bez skleněné desky nad vzorkem; Kontrolní vzorek – nemrznoucí, suché podmínky
Perspektivy termoluminiscence
• Mezi alternativní metody patří tzv. DLE (delayed light emission) – zpožděná světelná emise – jejíž lepším názvem by byls možná světlem modulovaná luminiscence– DLE produkuje zajímavé výsledky, jako je například teplota zlomu shodná
s tepelnou adaptací různých druhů rostlin nebo rozdíly v charakteristických teplotách mrazu , které rozdělují thylakoidy v různých druzích pšenice různících se mrazovou odolností
– DLE si zaslouží být označena jako metoda doplňující TL
• Experimenty na nezmrzlých listových terčících pomocí jednotlivých záblesků, nebo dalekým červeným světlem při přítomnosti specifických inhibitorů vedly k lepšímu porozumění in vivo TL signálů
• TL stejně jako fluorescence chlorofylu informuje nejen o stavu fotosystému II v listových pletivech, ale dává také náhled na energetický stav uvnitř chloroplastů
• Fotosyntetická TL a HTL může být využita v rámci ekofyziologického výzkumu
Využití termoluminiscence:
• Termoluminiscenční dozimetrie
Obrázek 6: Automatický měřící TLD systém Dosacus
Využití termoluminiscence:
• Historické datování stáří předmětů v archeologii
• Radioterapeutické metody ozařování• Studium fotosyntézy
Děkuji za pozornost!