tesis rotavirus
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SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PR OCESO DE COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS
DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.
MARÍA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERIA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el título de:
MICROBIOLÓGAS INDUSTRIALES Y MICROBIOLÓGAS AGRÍCOLA S Y
VETERINARIAS
MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ. Directora
MARÍA FERNANDA GUTIERREZ. Codirectora
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERAS DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Y MICROBIOLOGÍ A AGRÍCOLA
Y VETERINARIA
Bogotá, D.C.
Diciembre de 2007
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma
y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PR OCESO DE COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS
DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.
MARÍA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERÍA
APROBADO
__________________________ ___________________________
MARIA MERCEDES MARTINEZ M ARÍA FERNANDA GUTIERREZ
MICROBIÓLOGA MSc. BACTERIÓLOGA Ph D.
Directora Codirectora
___________________ __________________________
Dra. ADRIANA MATIZ Dr. JOSÉ SALVADOR MONTAÑA
Jurado Jurado
SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PR OCESO DE
COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.
MARIA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERIA
APROBADO
______________________ ______________________
ANGELA UMAÑA MUÑOZ JANETH ARIAS P ALACIOS
BIOLOGA M. Phil BACTERIÓLOGA MSc.
Decana Académica Directora de Carrera
AGRADECIMIENTOS
• A la Empresa Bioagrícola del Llano por la oportunidad de realizar este proyecto.
• A la Dra. María Mercedes Martínez por su dirección, paciencia, apoyo y
oportunidades que nos brindó para complementar los conocimientos en la
realización de este trabajo.
• A la Dra. Carolina Galindo por su apoyo y colaboración en la realización de este
trabajo.
• A la Dra. María Fernanda Gutiérrez por su oportuna colaboración.
• A Orlando Torres por su valiosa asesoría.
• A Miguel Pinzón por su contribución en el análisis estadístico.
A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible
llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ahí.llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ahí.llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ahí.llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ahí.
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MarielaMarielaMarielaMariela
Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis
dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, por las palabras de fuerzpor las palabras de fuerzpor las palabras de fuerzpor las palabras de fuerza en los momentos difíciles. a en los momentos difíciles. a en los momentos difíciles. a en los momentos difíciles.
María del Pilar María del Pilar María del Pilar María del Pilar
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN 1
2. MARCO TEÓRICO 3
2.1 Rotavirus 3
2.1.1 Morfología y Estructura 3
2.1.2 Taxonomia y clasificación 6
2.1.3 Replicación Viral 6
2.1.4 Epidemiología 7
2.1.5 Morbilidad y Mortalidad 8
2.1.6 Dinámica Viral en el Medio Ambiente 9
2.1.7 Métodos para la detección en lodos y compost 12
2.1.8 Métodos de detección 15
2.2 Efecto de las Condiciones Medioambientales Sobre la Partícula Viral 18
2.2.1 Adsorción Viral a Partículas Sólidas 19
2.2.2 Virus en el suelo 19
2.2.3 Temperatura 21
2.2.4 pH 22
2.2.5 Radiación Solar 22
2.2.6 Compuestos químicos 23
2.3 COMPOSTAJE 24
2.3.1 Etapas del proceso de compostaje según la temperatura 25
2.3.2 Factores que condicionan el proceso de compostaje 27
2.3.3 Calidad de Materias Primas 32
2.3.4 Patógenos en Compost 34
2.3.5 Control de calidad del producto final 35
3. Formulación del problema y justificación 40
4. Objetivos 41
4.1 Objetivo General 41
4.2 Objetivos específicos 41
5. MATERIALES Y MÉTODOS 42
5.1. Preparación de inóculo acelerador 42
5.2 Seguimiento de las Pilas y Muestreo 43
5.3 Análisis Fisicoquímico de las muestras de compostaje 44
5.4 Estandarización del proceso de extracción y concentración de virus a partir de
muestras de compostaje
45
5.5 Montaje del control positivo y negativo del comñpost 46
5.6 Detección de rotavirus por Inmunocromatografía (ICT) 46
5.7 Detección de rotavirus por ELISA. 47
5.8 Modelo estadístico 48
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50
6.1. Preparación de inóculo acelerador 50
6.2 Seguimiento de las Pilas y Muestreo 51
6.3 Análisis Fisicoquímico del compost 54
6.4 Estandarización del proceso de extracción y concentración 59
6.5 Montaje del control positivo y negativo del comñpost 59
6.6 Detección de rotavirus por Inmunocromatografía (ICT) y ELISA 62
7. CONCLUSIONES 70
8. RECOMENDACIONES 71
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72
10. ANEXOS 90
LISTA DE TABLAS TABLA TITULO PAG.
1 Propiedades de las proteínas constituyentes del rotavirus 5
2 Número de casos de la enfermedad causada por rotavirus en
niños menores de 5 años a nivel mundial
9
3 Virus en lodos y residuos sólidos urbanos 12
4 Comparación de dos métodos de recuperación de virus en lodos 14
5 Tiempo de supervivencia de virus en el suelo 20
6 Dosis requeridas de luz UV para la inactivación de virus 23
7 Principales características de algunos materiales orgánicos 28
8 Microorganismos patógenos asociados a compost 34
9 Patógenos que se pueden encontrar en el contenido ruminal 34
10 Indicadores microbiológicos de calidad de compost. 36
11 Clasificación de biosólidos según la EPA 37
12 Parámetros microbiológicos en la legislación europea 38
13 Composición de las pilas evaluadas. 43
14 Concentración microbiana inicial del inóculo acelerador 50
15 Actividad enzimática del inóculo mixto 51
16 Parámetros físico químicos de las pilas de compostaje 54
17 Proporción de muestras positivas en el primer proceso de
compostaje por los dos metodos de detección (ELISA e ICT), pH y
temperatura promedio
61
18 Detección de rotavirus por ELISA e ICT para las materias primas 62
LISTA DE FIGURAS
FIGURA TITULO PAG.
1
Estructura del rotavirus 4
2 Método de inmunocromatografía 17
3 Determinación de temperatura 44
4 Determinación de pH 44
5 Componentes de inmunocromatografía 46
6 Control positivo de la prueba. 47
7 Comportamiento de temperatura durante el proceso de
compostaje.
52
8 Comportamiento de pH durante el proceso de compostaje 52
9 Porcentaje de humedad, nitrógeno orgánico, potasio, magnesio
y calcio total de las pilas de compostaje del primer proceso y
segundo proceso
56
10 Determinación colorimétrica de la presencia de rotavirus 60
RESUMEN
Con el fin de realizar el seguimiento de la presencia de rotavirus en muestras de compost, se
realizó el diseño una técnica de extracción y concentración viral a partir de la matiz
acompañada de una detección de rotavirus mediante ELISA e Inmunocromatografía (ICT).
Para ello, se realizaron dos procesos de compostaje a partir de residuos sólidos urbanos
(RSU) del relleno sanitario Don Juanito, de la ciudad de Villavicencio con diferentes
porcentajes de podas, contenido ruminal, residuos de plaza y cascarilla de arroz.
En el montaje de las pilas se aplicó un inoculo mixto termofílico con una actividad amilolítica
y proteolítica cuantificada a nivel de laboratorio arrojando resultados de 276UA y 246UP
respectivamente y una concentración microbiana inicial de 1023UFC/ml. Durante los
procesos de compostaje que se obtuvo en 56 días se logró una temperatura máxima de 68.9
ºC y pH 8.86 y características fisicoquímicas adecuadas según la NTC 5167.
En cuanto al seguimiento de la presencia de rotavirus en el proceso de compostaje se
modificó la técnica cualitativa usada por Ahmed y Sorensen, 1995 y Lewis y Metcalf, 1988
para la extracción y concentración de partículas virales. Consecutivamente se llevó a cabo
la detección de rotavirus donde se encontraron muestras positivas para la primera, segunda,
quinta y octava semana del primer proceso de compostaje mediante ELISA y para la
primera, segunda y quinta semana mediante Inmunocromatografía (ICT). La muestra de
contenido ruminal del primer proceso de compostaje resulto positiva para rotavirus mediante
los dos test de detección a diferencia de las otras materias primas. En el segundo proceso
de compostaje las materias primas y las muestras del proceso fueron negativas para
rotavirus.
En conclusión, es evidente el efecto directo de la temperatura y del pH sobre las partículas
de rotavirus, sin embargo a pesar de encontrar este agente en las materias primas
destinadas a la producción de compost y ocasionalmente en el producto final factores como
la heterogeneidad del material analizado, el limite de detección de los métodos de
diagnostico existentes y sobre todo las características del rotavirus, no permiten considerarlo
como un indicador de eficiencia en un proceso de estabilización de materia orgánica como
es el compostaje.
ABSTRACT
In order to monitoring Rotavirus presence in compost samples, it was designed an extraction
technique and viral concentration starting from the matrix accompanied by a rotavirus
detection by means of ELISA and Inmunocromatography (ICT). For it, was carried out two
compostaje processes starting from urban solid residuals (RSU) of the sanitary filler Don
Juanito, of the city of Villavicencio with different percentages of prunings, ruminal content,
square residuals and husk of rice. In the assembly of the piles it was applied an mixed
termofilic inoculant with an amilolityc and proteolityc activity quantified at laboratory throwing
results of 276UA and 246UP respectively and population's recounts to an initial concentration
of 1023UFC/ml. During the composting processes that were obtained in 56 days with maxim
temperature of 68.6 Cº, pH value of 8.86.and physiochemical characteristics according with
NTC 5167.
As qualitative detection technique of the rotavirus presence in the composting process was
used Ahmed and Sorensen, 1995 test and Lewis and Metcalf, 1988 method, for the
extraction and concentration of viral particles was modified. Consecutively it was carried out
the rotavirus detection where they were positive samples for the first one, second, fifth and
eighth week of the first composting process by means of ELISA and for the first one, second
and fifth week by means of Inmunocromatography (ICT). The ruminal content sample of the
first composting process was positive for rotavirus by means of the two detection test
contrary to the other raw material. In the second composting process the raw material and
the samples of the process were negative for rotavirus.
In conclusion, is evident the direct temperature and pH effect and on rotavirus particles.
However, despite this agent is found in raw materials used to produce compost and
occasionally in the final product; factors such as heterogeneity of the analyzed material,
detection limit of existing diagnostic methods and especially the characteristics of rotavirus,
not allowed to consider it as an efficiency indicator in a stabilization process of organic matter
such as composting.
1. INTRODUCCIÓN
Bioagrícola del Llano SA EPSP, es una empresa dedicada a la investigación para el
aprovechamiento integral de la fracción orgánica de los residuos sólidos mediante
alternativas como el compostaje. Este mecanismo facilita el control sobre el proceso de
biodegradación de materia orgánica obteniendo abono orgánico conocido como compost de
buena calidad fisicoquímica y microbiológica que se reincorpora al medio ambiente.
La calidad biológica de este producto está determinada por la ausencia de microorganismos
fitopatógenos como Fusarium sp, Phytophtora sp, Sclerotinia sp, Salmonella sp,
enterobacterias, fagos somáticos y huevos de helminto los cuales permiten verificar su
inocuidad al momento de ser utilizado, evidenciando así la total eliminación de los patógenos
presentes.
Sin embargo, pese a cumplir la normatividad nacional con relación a la búsqueda de
microorganismos patógenos establecida por el ICONTEC, 2004, se consideró necesario
ampliar el rango de estos organismos y evaluar otros grupos microbianos para garantizar la
inocuidad del producto, en especial cuando se aplique en cultivos de consumo directo.
Desde el punto de vista de salud pública, los virus entéricos son uno de los grupos de
organismos patógenos más críticos, debido a que la dosis mínima infecciosa es muy baja,
son muy resistentes a los sistemas de desinfección y su detección a nivel de laboratorio es
costosa. Además, el Rotavirus causa pérdidas económicas por estar asociado a altos
índices de morbilidad y mortalidad, haciendo que los costos por prevención y tratamiento
sean de varios millones de dólares a nivel mundial. En cuanto a las campañas de
prevención gubernamentales contra Rotavirus, el país invierte aproximadamente 80.000
millones de pesos al año en el sostenimiento del esquema oficial de vacunación que incluye
a este virus. Por lo general tanto en Colombia como en otros países, la detección de virus
entéricos en abonos orgánicos no es llevada a cabo debido a la dificultad y elevados costos
de las técnicas existentes, además de la creencia de que no están en los abonos. Dentro de
los virus entéricos, se encuentran principalmente Rotavirus grupo A, Norovirus, Enterovirus,
Astrovirus y Poliovirus. Los Rotavirus pueden encontrarse en los residuos compostables
provenientes de animales y también en aquellos que han sido manipulados por el hombre
siendo el principal agente etiológico causante de diarrea. Por las razones anteriormente
mencionadas, usualmente la detección de estos organismos está sujeta a la búsqueda de
indicadores virales de contaminación fecal los cuales incluyen colifagos somáticos, fagos F-
específicos y los bacteriófagos que infectan Bacteroides fragilis en lugar de la búsqueda de
patógenos. Estos presentan tamaño, estructura y supervivencia similar a la de los virus
entéricos pero las técnicas para su identificación son más rápidas, sencillas y económicas.
A nivel mundial el Rotavirus ha sido el causante de 608.400 muertes en menores de 5 años
y de un 39% de las hospitalizaciones por diarreas, en el caso particular de América se han
producido 15.000 muertes en menores de 5 años y 75.000 hospitalizaciones por enfermedad
diarreica aguda (EDA) (De Oliveira, 2006).
Los procesos de manejo de residuos sólidos que involucran altas temperaturas favorecen la
eliminación de patógenos ya que en estos la generación de compuestos químicos como el
amonio y ácidos orgánicos causan la variación del pH logrando la desestabilización de
agentes virales. Sin embargo luego de la ampliación de estos procesos es posible detectar la
presencia de genomas virales siendo esta una evidencia de la resistencia viral en virus como
el Rotavirus y el Virus de Hepatitis A.
Dentro de los métodos tradicionalmente utilizados para demostrar la presencia de Rotavirus
en muestras ambientales se encuentran kits comerciales basados en reacciones antígeno
anticuerpo como los métodos de ELISA e inmunocromatografía, con un límite de detección
aproximado de 4.105 partículas/mL. Sin embargo las mayores desventajas de estas técnicas
son el no reconocimiento de partículas virales infectivas como también las variaciones
observadas en sensibilidad y especificidad relacionadas con factores inherentes al
procesamiento de las muestras.
Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de Rotavirus durante el
proceso de compostaje mediante la extracción y concentración del agente viral utilizando la
técnica de elusión – concentración y posterior detección a través de la prueba de ELISA
(Pathfinder Rotavirus kit test) e inmunocromatografía ICT.
2. MARCO TEORICO
2.1 ROTAVIRUS
2.1.1 Morfología y estructura
El Rotavirus presenta simetría icosaédrica, con un diámetro medio de 75 nm y no poseen
envoltura lipídica. Su genoma está formado por once segmentos de RNA de doble cadena
rodeado por tres capas proteicas concéntricas que se denominan cápside interna o core,
cápside intermedia y cápside externa (Figura 1) (Chanock y Kapikian, 2001).
El core o cápside interna esta constituida por sesenta dímeros de proteínas VP2 (102 kda)
VP1 y VP3 unidas al RNA viral de doble cadena (Chanock y Kapikian, 2001). La capa
intermedia esta constituida por 260 unidades de la proteína trimérica VP6 mientras que la
capa externa contiene dos proteínas VP7 y VP4 (Desselberg y Gray, 2000).
Existen tres tipos de partículas virales con diferentes características estructurales; la
partícula completa, que contiene las tres capas proteicas, llamada TLP (Triple-Layered
Particle), la cual es infecciosa ya que la presencia de la capa externa formada por las
proteínas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su célula huésped; la partícula que
contiene dos capas proteicas o DLP (Doble-Layered Particle); no infecciosa, pero
transcripcionalmente activa y las partículas que contienen una sola capa de proteínas, o
nucleocápsides, que tienen la actividad de replicar el genoma viral (Estes et al., 2001).
Figura 1. Estructura del Rotavirus
Fuente: Estes, 2001
El genoma del Rotavirus contiene once segmentos de dsRNA de cadena doble con un peso
molecular que oscila en un rango de 2 x 105 y 20.2 x 104 Daltons con un tamaño de 0.6 a 3.3
Kilopares de bases. Los segmentos de RNA viral están numerados según la velocidad de
migración que presentan en gel de poliacrilamida (Chanock y Kapikian, 2001).
El genoma evoluciona ya sea por mutación puntual o por reorganización de los segmentos
entre diferentes cepas. Este último mecanismo consiste en el intercambio de segmentos
genómicos entre dos cepas al infectar una misma célula; los virus resultantes podrán
entonces contener segmentos derivados de ambas cepas parentales (Jaimes et al.,2000)
El genoma de Rotavirus codifica para proteínas estructurales que se encuentran en las
partículas virales y proteínas no estructurales que se encuentran en células infectadas pero
no en partículas maduras. La nomenclatura de las proteínas virales designa las proteínas
estructurales como VP seguido por un número; van de VP1 a VP8, siendo VP1 la proteína
de mayor peso molecular. Las proteínas no estructurales se denominan NSP y van de 1-6.
Un resumen de las diferentes proteínas del Rotavirus esta en la tabla 1.
Tabla 1. Propiedades de las proteínas constituyentes del Rotavirus
Segmento
del Genoma
Proteína Localización en
partículas
virales
No. De
moléculas
por virión
Características y función
1 VP1 Core interna 12 RNA polimerasa, unión al ssRNA, unión
a VP3
2 VP2 Core interna 120 Unión al dsRNA, requerida para la
actividad replicasa de VP1
3 VP3 Core interna 12 Guanililtransferasa, metiltransferasa,
unión a ssRNA, unión con VP1
4 VP4 Cápside externa 120 Hemaglutinina, antígeno neutralizante,
potenciación infectividad por proteasa,
virulencia, putativa región de fusión,
adherencia a la célula, induce
protección
5 NSP1 No estructural Básica, anillo de zinc, unión al ssRNA
6 VP6 Cápside interna 780 Hidrofóbica, trimérica, antígeno de
subgrupo
7 NSP3 No estructural Ácida, dimérica, unión extremo 3, del
mRNA viral, inhibe traducción del
huésped
8 NSP2 No estructural Básica, oligomérica, unión al ssRNA,
NTPasa
9 VP7 Cápside externa 780 Glicoproteína integrada en la
membrana del RER, trmérica, antígeno
neutralizante, 2 regiones hidrofóbicas
NH2 terminales, induce protección
10 NSP4 No estructural Glicoproteína transmembranal RER,
participa en morfogénesis, induce
protección
11 NSP5 No estructural Básica, fosfoproteína, unión al ssRNA,
proteína quinasa, interacción con NSP2
Fuente: (Jaimes et al., 2000)
2.1.2 Taxonomía y clasificación
El género Rotavirus hace parte de la familia viral Reoviridae, la cual se divide en seis
géneros Orthoreovirus, Colitivirus, Orbivirus, Fijivirus, Cypovirus y Rotavirus. El nombre de
Rotavirus proviene de la raíz latina rota que significa rueda, debido a la apariencia redonda
de las partículas virales al ser visualizadas por tinción negativa en un microscopio
electrónico. Este género está dividido en siete grupos serológicos (A a la G). Los grupos A, B
y C infectan a los humanos y los grupos restantes infectan especies animales (Ramig, 2004).
Hasta ahora, se han clasificado en 14 serotipos-G con base a la glicoproteína VP7 y en 11
serotipos-P con base a la proteína VP4 (Chanock y Kapikian, 2001).
2.1.3 Replicación viral
El Rotavirus inicia su ciclo de infección uniéndose a un receptor localizado en la superficie
celular. Luego de la unión al receptor, el virus penetra al interior de la célula y pierde la capa
externa, con lo cual se activa la transcripción. La replicación se lleva a cabo en el citoplasma
de la célula hospedera. La partícula completa, que contiene las tres capas proteicas, es
también llamada TLP; esta es la partícula infecciosa ya que la presencia de la capa externa
formada por las proteínas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su célula huésped; la
partícula que contiene dos capas proteicas o DLP no es infecciosa, pero es
transcripcionalmente activa. Luego de la unión a un receptor celular ocurren los siguientes
pasos en un transcurso de tiempo de 14 horas aproximadamente
1. Adsorción de las proteínas externas del virión VP4 y VP7 a un receptor celular.
2. Penetración directa o por endocitosis.
3. La capa externa es removida como parte del proceso de entrada y permite activar la
transcripción.
4. Producción de mRNA en el citoplasma por DLPs
5. Una vez el mRNA emerge de las DLPs, el RNA de polaridad positiva es sintetizado por
la RNA polimerasa viral.
6. Simultáneamente el mRNA es usado como molde para la traducción de 6 proteínas
virales estructurales y 5 proteínas no estructurales.
7. Ensamblaje de la capa que contiene VP1, VP2, VP3 y 11 segmentos de RNAss,
formación de agregados de DLPs en una estructura electrodensa llamada viroplasma.
8. Maduración de los DLPs a TLPs:
a. Glicosilación de VP7 en el retículo endoplasmático rugoso (RER), NSP4
actúa como un receptor intracelular para DLPs.
b. Envoltura transitoria de las partículas en el RER que contienen VP4 y VP7
c. Remoción de la envoltura
9. Liberación de partículas infecciosas por lisis celular (Desselberg y Gray, 2000)
In vivo, el Rotavirus presenta un tropismo celular específico; la infección viral sólo se lleva a
cabo en los enterocitos diferenciados de las vellosidades del intestino delgado. In vitro, la
infección por Rotavirus está restringida a líneas celulares epiteliales de origen renal como las
MA104 de riñón de mono, e intestinal como las células de cáncer de colon, CaCo-2 (Estes et
al., 2001).
2.1.4 Epidemiología
Dentro de la etiología viral, el Rotavirus constituye la causa más frecuente de diarrea, siendo
su frecuencia entre el 70-80% de los casos de EDA enfermedad diarreica aguda en niños
de países desarrollados. Su distribución geográfica es universal y pueden ser más
frecuentes en las regiones socioeconómicas más pobres (Cáceres et al., 2006).
Tanto en los países desarrollados como en los países en vía de desarrollo casi todos los
niños han sido infectados por Rotavirus en los primeros años de vida. Las primeras
infecciones después de los tres meses de edad son generalmente sintomáticas y la
incidencia de la diarrea disminuye hacia los 2 o 3 años de edad. La incidencia de Rotavirus
en niños en países en vía de desarrollo ha sido definida por estudios prospectivos de
cohortes y varía entre 0,07 y 0,8 episodios por niño por año (Bresee et al., 1999)
En los países desarrollados, los Rotavirus constituyen el agente único más frecuente de
diarrea en los niños menores de 2 años que necesitan asistencia médica, concentrándose el
mayor número de casos entre los 3-12 meses de edad, con un claro predominio en los
meses invernales.
De igual forma el Rotavirus es la causa más frecuente de hospitalización y deshidratación
por EDA de niños en países en vías de desarrollo, afectando aproximadamente al 50% de
los ingresos y causando la muerte por deshidratación en el 0,75% de los niños menores de 2
años afectados. Se estima que aproximadamente 600.000 casos de EDA existen en el
mundo cada año (Ciarlet et al., 2002).
En países desarrollados la diarrea por Rotavirus es principalmente una enfermedad que se
presenta en el invierno con muy pocos cuadros fuera de este pico estacionario; mientras que
en los países en vía de desarrollo la enfermedad ocurre durante todo el año sin variaciones
según las estaciones, aunque puede presentarse picos en los meses fríos o secos o en el
invierno (Bresee, et al., 1999). En Colombia, según Cáceres, et al., 2006 el Rotavirus se
presenta con una variación biestacional, con un primer pico en los meses entre Febrero y
Mayo y un segundo pico entre Septiembre y Noviembre manteniéndose estable los meses
restantes, principalmente en las ciudades de Facatativa, Bogotá, Medellín, Manizales,
Cartagena y Quibdó donde se han hecho estudios de prevalencia para enfermedad
diarreica aguda (EDA).
La principal fuente de este agente viral son las heces de personas y animales infectados, la
liberación de Rotavirus del tracto intestinal de un individuo infectado se produce antes de
manifestar la diarrea e incluso cuando la diarrea ha cesado, de hecho se ha documentado la
excreción de virus sin presentar diarrea. Las heces fecales suelen contener 108-1010
partículas virales por mililitro, y la dosis infecciosa es de 10-100 partículas virales (Rzezutka
y Cook, 2004; OPS, 2007). El virus puede ser transmitido por vía fecal oral, por agua,
alimentos contaminados, persona a persona y probablemente por secreciones respiratorias
aunque este último hallazgo es circunstancial.
Con los conocimientos actuales y con las técnicas presentes se dispone de un mejor
diagnóstico de los agentes etiológicos de las diarreas infantiles. En la actualidad, el agente
viral más frecuentemente encontrado en niños menores de cinco años con gastroenteritis
aguda son los Rotavirus grupo A, causantes del 25 al 65% de gastroenteritis graves
infantiles. El segundo agente encontrado son Calicivirus (7-22%), y el tercer lugar se lo
disputan Astrovirus y Adenovirus, con un 2-9% y 2-6% respectivamente (Simpson et al.,
2003)
2.1.5 Morbilidad y Mortalidad
A partir de datos del Banco Mundial se calcula que cada año los Rotavirus causan
aproximadamente 111 millones de episodios de gastroenteirtis que requieren sólo atención
en casa, 25 millones que requieren la visita clínica, 2 millones que requieren hospitalización
y entre 352.000 y 592.000 defunciones en niños menores de 5 años (Tabla 2). Así, casi cada
niño menor de 5 años tendrá un episodio de gastroenteritis causada por Rotavirus, 1 de
cada 5 necesitará visita médica, 1 de cada 65 será hospitalizado y, aproximadamente, 1 de
cada 293 morirá (Parashar et al., 2003).
La incidencia de la enfermedad causada por Rotavirus es similar en países industrializados y
en países en vías de desarrollo. Sin embargo, los niños de los países en vías de desarrollo
mueren con más frecuencia, posiblemente por un cúmulo de factores cómo un peor acceso
a la terapia de rehidratación y una mayor prevalencia de desnutrición. Se ha calculado que
1.205 niños mueren cada día debido a una gastroenteritis causada por Rotavirus y que el
82% de estas muertes ocurren en los países más pobres (Wilhelmi et al., 2003)
Tabla 2. Número de casos de la enfermedad causada por Rotavirus en niños menores de 5
años a nivel mundial
Países en vías de
desarrollo
Países
industrializados
Total
Atención en casa 104.280.000 7.122.000 111.402.000
Atención clínica 23.233.000 1.781.000 25.017.000
Atención
hospitalaria
1.920.000 223.000 2.143.000
Fuente: Parashar et al., 2003
2.1.6 Dinámica viral en el medio ambiente
Las vías de transmisión de los virus en el medio son muy diversas, por esta razón ha
provocado una creciente alarma al comprobarse que la población está expuesta a una gran
variedad de posibilidades para adquirir una infección. Las distintas vías de transmisión
incluyen (Kittigul et al., 2001):
• Ingestión de agua contaminada
• La infección directa por virus de los agricultores y de sus contactos
• Ingestión de moluscos bivalvos o mariscos crudos que hayan crecido en aguas
que reciben aporte de aguas residuales
• Ingestión de vegetales que se han regado con aguas insuficientemente tratadas
o que se han cultivado en terrenos abonados con lodos de depuradora que
contenían virus infecciosos
• Contaminación por virus de las fuentes de agua potable como resultado de la
escorrentía de la fracción de agua que corre por la superficie o de la infiltración a
las aguas profundas
• Contacto con aguas de baño que han recibido aporte de aguas contaminadas
• Contacto con aerosoles generados a partir de aguas contaminadas
Los virus entéricos humanos, ingresan a los ambientes acuáticos a través de las descargas
de aguas contaminadas con heces, se han detectado concentraciones significativas de virus
en las aguas vertidas al ambiente y en los biosólidos generados en plantas de tratamiento de
agua residual (Graffo et al.,1993; Hurst,1997) y, a pesar de que se considera que hay una
reducción importante de la concentración de virus, se ha estimado, a partir de los 100.000
enterovirus por litro frecuentemente detectados en el agua residual, que en una población de
300.000 habitantes pueden liberarse al medio ambiente cantidades de 109 partículas víricas
en 24 horas en aguas residuales tratadas (Schwatzbrod, 1995, OMS, 1979)
Los virus entéricos en agua pueden permanecer estables durante meses o incluso más
tiempo si están asociados a sólidos y pueden acumularse en sedimentos donde persistirán
durante más tiempo y desde donde pueden resuspenderse en la columna de agua por
diversos procesos naturales como lluvias fuertes, o por procesos artificiales, facilitando la
diseminación viral (Rzezutka y Cock, 2004). De igual forma estos microorganismos han
demostrado ser más estables en el ambiente que los indicadores bacterianos comúnmente
utilizados para evaluar la contaminación fecal (Bosch et al., 2006). La asociación de
bacteriófagos y virus animales con sólidos, tiene un efecto protector resultando en la
resistencia a la inactivación por cloro en tratamientos de agua y un aumento de la
sobrevivencia del virus en esta. Esto se debe a que los sedimentos no actúan solo como
depósitos de virus entéricos sino que estos pueden desprenderse de los sólidos y llegar a la
columna de agua por degradación de los sedimentos o lluvias (Chalapati, et al,. 1984).
Los virus pueden sobrevivir durante varios meses en el medio, pueden resistir los procesos
de tratamiento convencionales del agua, incluso la cloración con un nivel de supervivencia
superior al de las bacterias, pudiendo así encontrarse lejos de la fuente original de
contaminación, constituyendo un riesgo potencial de nuevas infecciones (OMS, 1979.,
Schwartzbrod, 1995).
En los sistemas de producción agrícola los virus se encuentran asociados a los alimentos de
consumo directo irrigados con aguas contaminadas y también aquellos cultivos donde se
realiza fertilización orgánica con compost, lodos de plantas de tratamiento de aguas y
biosólidos. Los virus pueden ser transferidos a las superficies de vegetales y permanecer allí
por varios días luego de la aplicación de abono o del efluente contaminado con partículas
virales principalmente en las hojas de cultivos de tomate, pimentón y col de brucelas
(Raezuka y Cock, 2004). Se considera que en los vegetales con superficies húmedas como
la lechuga y el apio la supervivencia viral se incrementa convirtiendo a estos alimentos en
una fuente de transmisión viral; la lechuga es el mejor vehiculo para la trasmisión de
Rotavirus SA -11 de igual forma este virus puede sobrevivir a temperatura de refrigeración
luego de la inoculación directa sobre el alimento (Bosch et al., 2006, Seymour y Appleton,
2001).
La supervivencia de virus en vegetales de consumo directo está influenciada por parámetros
como temperatura, exposición a la radiación, humedad tipo de virus y tipo de vegetal. De
igual forma la conservación de los vegetales a 4°C impide la inactivación viral e incrementa
el tiempo de supervivencia de partículas virales (Schwartzbrod, 1995).
Los residuos orgánicos que se producen a partir de la actividad agrícola, industrial y
doméstica generalmente son sometidos a procesos de estabilización con el fin de mejorar
sus condiciones fisicoquímicas y biológicas como también para permitir el aprovechamiento
y reincorporación de estos al ecosistema como ocurre con la producción de abonos
orgánicos.
Las partículas virales presentes en materiales como excrementos, aguas residuales,
desechos domiciliarios, etc., no son completamente destruidos luego de tratamientos como
digestión anaerobia, digestión aerobia y compostaje; y su supervivencia en lodos, compost,
biosólidos dependerá de las características propias de cada material y condiciones externas
como pH, temperatura, humedad, presencia de iones y sólidos.
En el caso de lodos provenientes de plantas de tratamiento la supervivencia viral es mayor
en aquellos resultantes del proceso de digestión aerobia que en los procedentes de
procesos de digestión anaerobia, debido a la formación de flóculos y puntos muertos donde
se refuerza la adhesión viral a los sólidos aumentando la retención viral una vez son
aplicados al suelo (Lucena et al., 2005; Bitton et al., 1984)
Una vez los lodos y biosólidos han sido aplicados al suelo se crean aerosoles que favorecen
la dispersión de agentes bacterianos y virales. Según, Gerba et al., 2004 debido a la baja
concentración de enterovirus (1-2 UFP/g) los aerosoles virales no constituyen un problema
significativo, sin embargo se han encontrado la presencia de poliovirus, reovirus, echovirus y
coxsackievirus B cien metros después del punto de aplicación del biosólido siendo los
reovirus los indicadores potenciales de presencia de aerosoles de virus entéricos (Carducci
et al., 2000).
Se espera que en el producto final del proceso de compostaje a partir de biosólidos no se
encuentren partículas virales viables ya que el principal factor que contribuye a la eliminación
de este tipo de patógenos es la temperatura y su interacción con las sustancias que se
producen durante el desarrollo del proceso. Normalmente los virus entéricos pueden ser
encontrados en la primera fase del proceso pero el rango de temperatura entre (55 – 70°C)
permite la reducción de 3 unidades logarítmicas en la concentración viral por ruptura de la
cápside y liberación del ácido nucleico. La supervivencia de virus puede presentarse por un
manejo inadecuado de temperatura, contaminación del área y utensilios utilizados durante el
proceso y también por la distribución heterogénea de los materiales (Guardabassi et al,
2003; Monphoeho et al., 2004).
2.1.7 Métodos Para la Detección de Virus en Lodos y Compost
En ocasiones los virus se encuentran en el suelo y en sistemas de tratamiento de residuos
sólidos en rangos variables según la clase de virus, causando diferentes patologías al
hombre (Tabla 3) y con un patrón de distribución heterogéneo debido a la distribución
irregular de la materia orgánica y de los componentes coloidales del suelo.
Tabla 3. Virus en lodos y residuos sólidos urbanos
Virus Enfermedad causada
Poliovirus Poliomielitis
Coxsackivirus Meningistis, neumonía y hepatitis
Echovirus Meningitis, encefalitis y paralisis
Hepatitis A Hepatitis infecciosa
Rotavirus Gastroenteritis
Calicivirus humano Gastroenteritis
Hepatitis E Hepatitis
Astrovirus Gastroenteritis
Adenovirus Infecciones del tracto respiratorio y gastroenteritis
Fuente: (Gerba y Smith, 2005; Van Soelen,2007)
En relación a los virus, el lodo crudo puede contener más de 100 especies diferentes de
virus patógenos para humanos. Varios autores han examinado el lodo crudo en países
desarrollados en diferentes áreas geográficas, demostrando que el número de virus
entéricos puede variar desde 1000 hasta más de 50000 unidades formadoras de placa por
litro (UFP/L). Los virus de la Hepatitis A y los Calicivirus son los de mayor preocupación,
pero no se han desarrollado métodos estandarizados para su aislamiento y detección. Estos
parásitos intracelulares son más resistentes a los procesos de desinfección que los
organismos coliformes. Por lo tanto, los indicadores tradicionales de contaminación
bacteriana no evalúan de manera eficiente la presencia o ausencia de virus (Guzmán y
Campos, 2002)
Lo anterior hace necesario el desarrollo de métodos de concentración y constituye uno de
los problemas principales de la virología ambiental. Safferman, 1989, describió un
procedimiento para la presencia de virus asociados a sólidos (lodos, suelos, sedimentos y
otros). Su diseño implica la elusión del virus directamente del sólido. Estas muestras son
evaluadas en cultivo celular por virus formadores de placa. El método que describe la
EPA/625/R-92/013 (1999), detecta virus cultivables totales los cuales incluyen
principalmente el grupo de los enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus) y el grupo
de los Reovirus.
Aunque la fracción de virus asociada con la porción líquida usualmente es menor, esta
fracción puede variar considerablemente en los diferentes tipos de lodos. Con el fin, de
corregir esta variación la EPA recomienda tratar la muestra de forma tal que los virus
presentes en el líquido se unan a los sólidos (mezclando la suspensión con AlCl3*6H2O,
0.05M), luego se eluyen los virus de los sólidos (extracto de carne 10%, pH 7),
posteriormente se filtra la muestra por tamices de 47mm de diámetro y 3.0, 0.45 y 0.25
micras de diámetro de poro y se concentran para su identificación. El ensayo permite
localizar el crecimiento de los virus por la unión de partículas virales infecciosas a la
monocapa de células. Las lesiones de las células muertas (placas) se visualizan con una
coloración vital que colorea solo células vivas. El número de placas circulares no coloreadas
(UFP) es proporcional a la cantidad de partículas infecciosas inoculadas.
Los métodos recomendados para la extracción de virus en lodos son el método de vaso
(Glass method) el cual consiste en la adición de extracto de carne pH 9, seguido de una
sonicación, centrifugación, precipitación viral usando Na2HPO4 y cultivo celular para la
enumeración de los virus y el método de la EPA con AlCl3. Según Lichtenberg, 1988 ambos
métodos poseen problemas inherentes como se muestra en la tabla 4, pero ambos son
recomendados como métodos estándar para la recuperación de virus entéricos en lodos.
Tabla 4. Comparación de dos métodos de recuperación de virus en lodos
Factor Método de vaso EPA /625/R-92/013
Volumen final de muestra
para el ensayo de
detección
Pequeño (aprox. 10ml) 50 a 100ml
Equipo especial o inusual
de laboratorio requerido
Sonicador Ninguno inusual
Contaminación bacteriana
o fúngica de la muestra a
analizar
No usual Frecuente
Facilidad para procesar un
alto número de muestras
simultáneamente
Difícil Fácil
Volumen de muestra 800ml 300ml
Problemas operacionales Formación de espuma en el
extracto de carne
Dificultad en el proceso de
filtración, especialmente en
el caso de lodos primarios.
Fuente: (Lichtenberg, 1988)
El método basado en infectividad en cultivo celular junto con el método de detección
molecular con PCR seguido de la hibridización de ácidos nucleícos son las técnicas más
utilizadas para la detección de enterovirus en muestras ambientales (Monpoeho, et al.,
2001). Estas muestras, en especial el lodo urbano, contienen numerosos compuestos
orgánicos e inorgánicos (ácidos húmicos, polifenoles, metales pesados) que son tóxicos y
causan lisis en cultivos celulares (Hurst y Goyke, 1983). Además estos compuestos pueden
formar complejos con los ácidos nucleícos e inhibir las enzimas de amplificación,
disminuyendo la efectividad de la PCR (Graff, et al., 1993)
La mayor parte de los métodos de recuperación de virus aprovechan las propiedades de los
virus como macromoléculas proteicas. Los virus se comportan en el medio como un coloide
hidrófilo en el que la carga eléctrica neta varía en función del pH y de la fuerza iónica del
medio. Tienen, además, la capacidad de adsorberse sobre partículas en suspensión o
soportes de cualquier tipo.
Un buen método de concentración debe ser simple, rápido y económico. Debe proporcionar
altas tasas de recuperación y ser aplicable a la recuperación de diferentes virus. El
concentrado viral obtenido debe estar libre de posibles sustancias tóxicas o inhibidoras
presentes en las muestras para que pueda ser utilizado en los procesos de detección
subsiguientes. La metodología debe escogerse en función de factores geográficos y
climáticos, tipo de residuo, ya que las variaciones en sus características físico-químicas y en
la cantidad de materia orgánica afectan a la capacidad de agregación de los virus, así como
a la eficiencia de algunos métodos; y tipo de virus, ya que ciertos métodos podrían provocar
su inactivación (Mignotte et al., 1999).
Como se ha visto anteriormente la mayoría de literatura existente se refiere a la recuperación
de agentes virales a partir de lodos y suelo más no a compost, sin embargo estos métodos
pueden ser utilizados para la extracción viral en este tipo de matriz.
2.1.8 Métodos de detección
El diagnóstico de laboratorio de Rotavirus está basado fundamentalmente en su detección
en las heces, se emplean variadas técnicas tales como son la microscopia electrónica (ME),
la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), la aglutinación por látex, el ELISA, la
hibridación de ácidos nucleícos, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) entre otras
(Ribas et al., 1996)
La ventaja de la ME frente a las otras técnicas radica en la posibilidad de visualizar
directamente las partículas infecciosas aisladas de las muestras. Sin embargo, la
microscopia electrónica no permite hacer una diferenciación entre los grupos de Rotavirus
involucrados y la identificación de los virus mediante la visualización del ojo humano requiere
profesionales altamente capacitados y con gran experiencia, motivo por el cual éste es un
método limitado como herramienta diagnóstica (Riverón et al., 1989)
Las partículas virales de Rotavirus son detectadas por microscopía electrónica (ME) siempre
y cuando se encuentran en elevadas concentraciones en las heces, lo que con frecuencia
ocurre en las personas infectadas que presentan sintomatología, aunque se estima que se
requiere del orden de 106 partículas víricas por gramo de muestra para poder ser
observadas. La inmunomicroscopía electrónica, utilizando antisueros o anticuerpos
monoclonales, incrementa la sensibilidad de la ME, y además sirve para demostrar la
agregación de partículas víricas por los anticuerpos específicos, una de las observaciones
consideradas como demostrativas del papel patógeno de los distintos virus. Estas técnicas
continúan siendo de gran utilidad en el diagnóstico de las gastroenteritis víricas, siempre, por
supuesto, que se pueda disponer de un microscopio electrónico y de personal entrenado. La
gran ventaja de la microscopía electrónica respecto a otras técnicas diagnósticas es que
permite encontrar cualquier virus, sin que el procedimiento limite la identidad del agente
detectado, como sucede con las técnicas inmunológicas o moleculares. La mayoría de los
virus son reconocibles por su morfología, y algunos virus se diagnostican principalmente por
este procedimiento (Torovirus, Coronavirus). Por microscopía electrónica se detectan,
además, virus que en muchos laboratorios no se investigan por otras técnicas (Rotavirus de
grupos B y C, Calicivirus, etc.) (Buesa et al., 2007)
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se fundamenta en la separación
electroforética de los segmentos del RNA del virión. Por otro lado, el inmunoensayo
enzimático es el método más utilizado para confirmar la presencia de Rotavirus porque es
altamente sensible y no requiere equipos especializados. Los ensayos de ELISA para
Rotavirus utilizan anticuerpos (policlonales o monoclonales) en un inmunoensayo tipo
sándwich de fase sólida para detectar el antígeno específico de grupo (Kapikian y Chanock,
1996).
Un estudio realizado por Dahling et al., 1990 mostró que kits comerciales pueden ser usados
como pruebas presuntivas para demostrar la presencia de Rotavirus en muestras
ambientales. En el caso de los inmunoensayos las variaciones observadas en sensibilidad y
especificidad se relacionan aparentemente con factores tales como manejo de la muestra
(transporte, conservación, tiempo entre colección y procesamiento), calidad de los
anticuerpos de captura, presencia en la muestra de enzimas que degradan proteínas o
ácidos nucleícos (Rivera, 1995).
Estudios realizados con anterioridad, demuestran la gran sensibilidad del Kit de ELISA frente
a las técnicas de aglutinación en látex y la electroforesis de ARN. Sin embargo estas
técnicas son más específicas que ELISA (Rivera, 1995)
La inmunocromatografía es un inmunoensayo que en la actualidad es ampliamente utilizado
en la detección rápida de diversos antígenos; de igual forma se convierte en una de las
técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y
rapidez. En el diagnóstico de enfermedades virales se ha trabajado en pruebas de cassette
inmunocromatográficas para el Virus de la influenza A y B, Virus respiratorio Sincitial,
Adenovirus, Norovirus y Rotavirus y otros patógenos como Corynebacterium diphtheriae,
Mycobacterium tuberculosis, Triticum aestivum, Tenia solium entre otros (Crespo, 2000;
Skerritt y Heywood, 2000, De frutos et al., 2004)
Esta técnica permite visualizar la reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación de oro
coloidal u otra sustancia indicadora del conjugado en zonas específicas del papel de
nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos de captura (Skerritt y Heywood, 2000).
En primer lugar la muestra se pone en contacto con la zona del conjugado formado por un
anticuerpo específico contra uno de los epítopes del antígeno a detectar y un reactivo de
detección. Si la muestra contiene el antígeno a detectar, éste se unirá al conjugado
formando un complejo y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa, en caso contrario
migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.
La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítope
del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del
antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestra positiva). Si la
muestra no contenía el antígeno no hay captura y la línea quedara transparente en el caso
de una muestra negativa (De Frutos et al., 2004).
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección.
Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que
no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha
funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas (Fig. 2).
Figura 2. Método de inmunocromatografía.
Fuente: Martín, 2004
Los métodos inmunológicos detectan solamente Rotavirus del grupo A, ya que por el
momento no existen métodos comercializados para detectar Rotavirus de grupos B y C. En
este caso particular el diagnóstico de las infecciones por Rotavirus se realiza habitualmente
detectando la existencia de antígeno vírico en muestras de heces, con frecuencia la proteína
VP6 (James et al., 1998).
El desarrollo de las técnicas moleculares ha permitido la detección e identificación de bajas
concentraciones de virus en muestras de diversos orígenes, proporcionando sensibilidad y
especificidad. Estas técnicas detectan la presencia de RNA vírico, bien poniendo de
manifiesto segmentos de RNA bicatenario mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE), o bien amplificando por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Monpoeho et
al., 2004; Coll, 1993).
El desarrollo de la tecnología molecular ha provisto sensibilidad, especificidad y rápida
detección viral. El PCR se utiliza para detectar niveles de acido nucleico que están presentes
en un número bajo de copias en las muestras ambientales (Soule et al., 2000). El PCR no
determina el estado infeccioso de un organismo solo puede determinar la presencia o
ausencia de secuencias de RNA o DNA especificas del patógeno. Una gran desventaja es la
sensibilidad de la polimerasa a la presencia de inhibidores los cuales pueden ser
concentrados con el virus (Gratacap-Cavallier et al., 2000)
Aunque las técnicas anteriormente mencionadas son novedosas y específicas, el principal
problema que resulta de la aplicación de las técnicas de amplificación genómica en
estudios ambientales, es la presencia de sustancias de diferente naturaleza química
capaces de inhibir la acción de las enzimas utilizados en la reacción (Wilson, 1997).
Las expectativas están enfocadas al desarrollo de técnicas sensibles, específicas y de alta
reproducibilidad para la detección temprana de agentes virales que involucren un riesgo
para la comunidad, el trabajador y el medio ambiente.
2.2 EFECTO DE LAS CONDICIONES MEDIOAMBIENTALES SOB RE LA PARTÍCULA
VIRAL
La reutilización de lodos y compost para la agricultura implica un riesgo potencial para la
salud pública debido a los virus y otros organismos patógenos provenientes de industrias,
hospitales e individuos afectados, que puedan estar presentes en los biosólidos y ser
potenciales contaminantes del ambiente, del hombre y de los animales.
La única característica que hace a un virus infectivo es la capacidad de producir una
progenie. Por consiguiente el efecto de las condiciones medioambientales sobre la partícula
viral implica la variedad de factores físicos y químicos que afectan su infectividad entre otras
características propias de estos agentes.
La tasa de sobrevivencia de virus es una consideración importante en el tratamiento de
residuos sólidos municipales, domésticos y animales la cual no ha sido evaluada
adecuadamente. Numerosos estudios de campo y a nivel de laboratorio han establecido que
la retención y la sobrevivencia de los virus están influenciadas por factores como el tipo de
material, pH, presencia de materia orgánica disuelta, concentración total de sólidos
disueltos, cationes polivalentes y orgánicos y características de la partícula viral como su
punto isoeléctrico e hidrofobicidad (Williamson et al., 2005; Schwatzbrod, 1995, OMS, 1979).
2.2.1 Adsorción viral a partículas sólidas
Los virus entéricos tienen una mayor estabilidad cuando están adheridos a partículas
sólidas, por lo tanto se espera que se concentren en lodos, residuos orgánicos, sedimentos y
suelos donde su permanencia en el tiempo será mayor, aunque presentan diferencias con
respecto a la eficacia de adhesión, los sólidos a los cuales se adsorben y las condiciones
que favorecen el proceso (Lucena et al., 2005).
La adsorción viral a sólidos se debe a la naturaleza anfótera de las proteínas virales
externas que permiten establecer interacciones electrostáticas especialmente de tipo
hidrofóbico. Estas interacciones son las responsables de la adsorción de partículas virales a
superficies sólidas y en la interfase aire – agua. Las superficies virales pueden tener
dominios hidrófilos e hidrófobos. La parte hidrófoba de una partícula viral depende de cómo
estén sus dominios equilibrados y orientados en la superficie (Thompson et al., 1998).
El riesgo de contaminación de aguas subterráneas a partir de biosólidos puede estar
asociado principalmente con el virus, debido a su tamaño relativamente pequeño y a la
adsorción variable a las partículas del suelo (Chauret et al., 1999).
2.2.2 Virus en el suelo
La supervivencia y destino de los virus entéricos en el suelo es una consideración importante
debido a los riesgos potenciales para el humano y los animales. Esta supervivencia se
encuentra influenciada por factores como el tipo de suelo, las características químicas del
agua de riego, el pH, y las concentraciones de sólidos totales disueltos, cationes
polivalentes y orgánicos (Sobsey, et al., 1980).
La textura del suelo determina la retención y transporte de las partículas virales en el
ecosistema suelo. Los suelos arcillosos pueden retener mayor cantidad de agua que los
suelos arenosos, no obstante el fenómeno de evaporación de agua ocurre a mayor
velocidad en las arcillas debido al alto contenido mineral. Lo mismo ocurre con la
concentración de partículas virales ante la reducción del contenido de agua disponible en el
suelo para la actividad biológica (Straub et al., 1992). El fenómeno de adsorción viral a las
fracciones de materia orgánica y arcilla también determina la viabilidad de los virus en el
suelo protegiendo a los viriones de la acción de enzimas líticas como nucleasas y de otros
factores antagónicos propios de este ecosistema (Sylvia et al., 2005).
Algunos virus están adaptados para persistir en el suelo por varios años siendo importante la
cantidad relativa de arcilla y materiales húmicos presentes que pueden mejorar la
supervivencia viral. Por lo tanto, al incrementar la cantidad de arcilla y materia orgánica en
un suelo la cantidad de virus presentes puede ser mayor (Straub et al., 1992). La presencia
de materia orgánica es un factor determinante en el transporte y retención de virus en
medios porosos ya que inhibe la transferencia de partículas virales y promueve interacciones
hidrofóbicas entre estas y la superficie granular del suelo (Zhuang y Jin, 2003). En el caso de
los virus entéricos humanos entre los que se encuentra el Rotavirus, están adaptados para
sobrevivir en el suelo por días o meses (Sylvia et al., 2005., Guardabassi et al., 2003).
Los virus presentes en aguas contaminadas, lodos y compost pueden pasar a través del
suelo, alcanzar y contaminar aguas subterráneas. El fenómeno de migración viral se hace
más intenso en temporada de lluvia o por irrigación excesiva de los cultivos de suelo, de
igual forma debido a que la supervivencia de los virus en el suelo está determinada por
diversos factores su tiempo de permanencia en este ecosistema varia de 11 a 180 días
(Tabla 5).
Tabla 5. Tiempo de supervivencia de virus en el suelo
Agente viral Tipo de suelo y tiempo de supervivenci a
Poliovirus 91 días en suelos arenosos y condiciones húmedas; 180 días en suelos
arenosos saturados y compost
Hepatitis A 91 días en suelos arenosos y condiciones húmedas
Coxsackievirus
A
180 días en suelos arenosos saturados y compostaje
Coxsackievirus
B
180 días en suelos arenosos saturados y compostaje
Echovirus 3-33 semanas dependiendo de las condiciones del suelo
Fuente: (Schwartzbrod, 1995)
Keswick y Gerba (1980) evaluaron los factores que controlan la supervivencia de los virus y
pudieron comprobar que la desactivación era mucho más rápida cerca de la superficie del
perfil del suelo Esto se debería a los efectos dañinos los microorganismos aeróbicos del
suelo, a la evaporacíón y a las elevadas temperaruras en las zonas próximas a la superficie.
Así, la supervivencia de los virus aumentaría según el grado de penetración de los suelos.
2.2.3 Temperatura
La temperatura es uno de los factores más importantes que determinan la supervivencia del
virus y su persistencia. Esta persistencia puede ser afectada por temperaturas elevadas por
medio de varios mecanismos como denaturación de la proteína de la cápside, daño del RNA
e influencia microbiana o actividad enzimática (León et al., 2005). Algunos estudios han
indicado, que una de las razones para la inactivación viral a temperaturas altas es el daño en
las proteínas del virus, mientras en temperaturas bajas cercanas a la congelaciónlos virus
persisten por periodos más largos. Yeager y 0'Brien (1979) constataron que el período de
supervivencia del virus de polio dependía de la temperatura: en suelos saturados y a una
temperatura de 37°C, los virus sobrevivían cerca de 12 días; al reducirse la temperatura a
22°C el lapso de supervivencia alcanzaba 92 días, l legando hasta 180 días cuando la
temperatura era de 4°C.
Las temperaturas más bajas generalmente refuerzan la supervivencia del virus y la mayoría
de estos pueden permanecer en temperaturas de congelación manteniendo su infectividad
por periodos largos de tiempo (Sobsey y Meschke, 2003).
La temperatura está implicada en la destrucción de Rotavirus fuera de la célula hospedera,
la inactivación a altas temperaturas produce daños principalmente en la porción proteica del
virión (Ashley y Ward, 1978). Un ejemplo de esto es el compostaje, el cual es un proceso de
estabilización dependiente del calor, y las temperaturas alcanzadas durante el tratamiento
(55 – 70°C) parecen ser suficientemente altas para eliminar los microorganismos entéricos
siendo capaces de disminuir la cantidad viral entre 3 y 4 unidades logarítmicas.
Se ha demostrado que el Rotavirus es capaz de ser infectivo, después de ser mantenido 7-9
meses a temperatura ambiente (18-20°C), en heces (R amos et al., 1998). La deshidratación
también juega un rol importante en la inactivación viral por ruptura de la cápside del virus y la
remoción del ácido nucleico (Monpoeho et al., 2004)
Con la temperatura interactúan otros factores como el contenido de humedad del material a
compostar y la presencia de sustancias químicas. Los virus son menos sensibles a la
inactivación por calor en ambientes con humedad reducida. La disminución en el contenido
de humedad de lodos por evaporación reduce significativamente las tasas de inactivación
por calor de Enterovirus y Reovirus (Ashley y Ward, 1978).
Aunque 60°C puede ser la temperatura adecuada para la denaturación de proteínas y
conducir a la inactivación de la cepa viral, las poblaciones de Rotavirus son heterogéneas y
pueden incluir viriones termorresistentes (Ciartlet et al., 2002).
2.2.4 pH
El pH del suelo, además de seleccionar los organismos adaptados a vivir en un pH
concreto, determina la carga neta de sustancias anfóteras y condiciona la adsorción de los
organismos al complejo adsorbente del suelo. A valores de pH menores a cinco los virus se
adsorben como cationes a las partículas coloidales cargadas en el suelo, cuando el pH
supera este valor la carga eléctrica viral se hace menos positiva y la adsorción se reduce.
Generalmente el proceso de adherencia se incrementa cuando el pH decrece y aumenta la
salinidad de la solución de suelo (Sobsey y Meschke, 2003).
Las partículas de Rotavirus son estables en un rango de pH de 5 a 9, en general no son
sensibles al ácido y por lo tanto pueden sobrevivir con valores de pH entre 3 y 5. En
contraste la exposición a valores elevados de pH puede resultar en la inactivación viral por
pérdida de proteínas (Ciartlet et al., 2002).
2.2.5 Radiación solar
El principal factor inactivador en sistemas a cielo abierto es la radiación solar. Según
Campos, 2003 la radiación solar es un factor inactivador relevante, sin dejar de lado que la
inactivación natural se produce como la suma de varios factores (predación por protozoos,
estrés osmótico, adsorción a partículas y deficiencias de nutrientes).
En un estudio realizado por Gerba, et al., 2002 se determinaron las dosis de radiación
ultravioleta para inactivar virus entéricos hasta en tres unidades logarítmicas, y se encontró
que los virus con dsDNA (DNA de doble cadena) son más resistentes en comparación con
otros virus a la inactivación por rayos UV (Tabla 6).
Tabla 6. Dosis requeridas de luz UV para la inactivación de virus
Virus 90% 99% 99.9% 99.99%
Echovirus 8 16.5 25 33
Coxsackievirus 9.5 18 27 36
Poliovirus 8 15.5 23 31
Adenovirus 40 78 119 160
Fuente: (Gerba, et al., 2002)
La inactivación se presenta como un fenómeno integrado, debido a fenómenos de foto-
oxidación generados por la radiación solar, materia orgánica y catalizada por el oxígeno.
Además esta influenciada por el color tal como ocurre en los residuos urbanos y en el caso
de aguas por su turbidez que permite la absorción de la radiación solar (Knight, 1975). Este
fenómeno unido a fluctuaciones del pH, induce cambios conformacionales de la cápside de
las partículas virales alterando su infectividad.
La luz ultravioleta causa la inactivación viral sin ocasionar la ruptura de las cadenas de
polinucleótidos sino por modificaciones en las mismas tales como formación de enlaces
covalentes en los residuos de timina en el DNA viral o en los residuos de uracilo en el caso
del RNA formando dímeros de nucleótidos en ambas cadenas, formación de derivados de 5
– hidroxi, 6 – hidroxi en las moléculas de pirimidinas, lo cual es de suma importancia en la
inactivación de virus (Knight, 1975).
2.2.6 Compuestos químicos
Los principales agentes químicos que inactivan virus incluyen enzimas como fosfolipasas y
proteasas, proteínas denaturantes, agentes oxidantes, ácidos y bases y agentes que afectan
los grupos amino primarios como el formaldehido y el ácido nitroso (Sobsey, 1986).
La concentración y el tipo de sales presentes en el ambiente también influyen sobre el
transporte y sobrevivencia de virus entéricos. Los cationes, en especial aquellos que son
multivalentes como el calcio (Ca2+) y el magnesio (Mg2+) tienen la capacidad de formar
Exposición UV (mW/cm 2) necesaria para inactivación viral
puentes entre las superficies sólidas y los virus mejorando significativamente la adsorción.
De igual forma determinan el número de sitios disponibles para el enlace como también el
número de puentes que pueden ser formados entre estas dos superficies (Bitton y Harvey,
1992; Simoni et al., 2000).
La materia orgánica disuelta disminuye la adsorción viral ya que compite por los sitios de
unión sobre el material particulado debido a la similitud de las cargas eléctricas entre este
material y los virus (Williamson et al., 2005).
2.3 COMPOSTAJE
El compostaje es una técnica utilizada desde hace mucho tiempo en la agricultura,
consistente en el apilamiento de diferentes tipos de residuos tales como residuos urbanos,
restos de cosecha, excrementos animales entre otros, con el fin de obtener un producto
aprovechable para el suelo.
Uno de los principales objetivos del proceso es estabilizar la materia orgánica presente en
los residuos orgánicos que comprenden una amplia gama de diferentes materiales, desde
los mas sencillos como las proteínas, grasas y azucares, hasta los mas complejos y
recalcitrantes como celulosa, hemicelulosa y lignina (Avendaño, 2003).
Inicialmente, la materia orgánica seleccionada es atacada por microorganismos
descomponedores cuyo crecimiento exotérmico eleva la temperatura de la masa hasta los
75°C. En esta fase se seleccionan microorganismos t ermófilos y aerobios debido a los
sucesivos volteos de la masa en la zona de fermentación. Durante esta primera fase
termófila con una duración aproximada de 15 días (varía de acuerdo con los residuos) se
espera que los patógenos, larvas de insectos y semillas de malezas sean eliminados,
garantizando de esta forma sanitariamente el producto final obtenido (Sylvia et al., 2005). La
eliminación total de los patógenos concluye con la acción antibiótica generada por
numerosos hongos y actinomycetes aerobios (Avendaño, 2003). Finalmente, el producto
comienza la fase de maduración hasta que se obtiene un producto estable de color oscuro.
Además de la temperatura, la reducción de patógenos en el compostaje es posible también
por competencia con otros organismos más adaptados al ambiente en el compost. Aunque
durante el proceso de compostaje se alcanza una alta temperatura, en ocasiones esto no
garantiza la eliminación total de los patógenos presentes tales como huevos de helminto y
Salmonella sp y estructuras reproductivas de hongos. Adicionalmente luego de una
desinfección del compost existe el riesgo de reaparición o multiplicación de patógenos; este
riesgo es drásticamente reducido si el material a compostar es tratado aeróbica o
anaeróbicamente antes de ser incorporado al proceso (Bjorklund et al., 2003).
Los residuos orgánicos ocupan en el mundo un lugar prioritario ya que constituyen
entre el 30 y el 65 % de los residuos domiciliarios y más del 85% de los residuos
considerados agrícolas (Sztern y Pravia, 1999). Es por esta razón que la tendencia actual es
la reducción sustancial del volumen de los residuos cuya fracción orgánica será la materia
prima de los procesos de compostaje.
Actualmente, el uso de inoculantes termofílicos es una alternativa viable en el tratamiento
de residuos vegetales y residuos sólidos orgánicos. La gran estabilidad que presentan las
enzimas de estos microorganismos frente a temperaturas extremas, garantiza una capacidad
de degradación mayor que la obtenida por géneros microbianos mesófilos. La utilización de
inoculantes biológicos a partir de microorganismos mesófilos y termófilos ha traído grandes
beneficios en compostación de residuos agrícolas, domésticos, industriales y hospitalarios.
Así lo demuestran experiencias realizadas en varias zonas del país, obteniendo un
rendimiento óptimo en la tasa de degradación de cada tipo de residuos a tratar, sin alterar de
modo alguno la calidad del producto final; por el contrario, se logra la producción de un
compost con alto contenido en elementos como nitrógeno, fósforo y potasio, que ayudan a
incrementar la viabilidad de los suelos (Moreno, 2001).
2.3.1 Etapas del proceso de compostaje según la te mperatura
La temperatura es un factor importante en el proceso de compostaje, refleja la actividad
biológica de los microorganismos, siendo una de las condiciones ambientales determinante
de la rapidez con la cual los materiales son metabolizados. Es fundamental en la maduración
del compost, ya que el aumento de la temperatura durante el proceso refleja una actividad
microbiana óptima y un equilibrio entre la aireación, humedad y composición de la mezcla
(Labrador, 1996).
La retención y la continua generación de calor están influenciadas por las temperaturas
ambientales lo que se relaciona con el tamaño de la pila, contenido de agua y relación
Carbono/Nitrógeno de sus constituyentes, los de menor relación Carbono/Nitrógeno
alcanzan mayores temperaturas (Mathur, 1991).
Durante el proceso se pueden encontrar cuatro fases de gran importancia dependiendo de la
actividad metabólica de los microorganismos; la primera es la mesofílica, la segunda la
termofílica, la de enfriamiento y finalmente la de maduración (Trautmann y Olynciw, 1999;
Coyne, 2000)
Inicialmente los residuos se encuentran a temperatura ambiente (fase de latencia), pero una
vez superado el tiempo de adaptación de los microorganismos al medio, estos crecen y la
temperatura sube considerablemente alcanzando a los pocos días los 40°C, esta primera
fase se denomina mesofílica, actúan especialmente bacterias mesófilas, las cuales degradan
el material de fácil descomposición produciendo ácidos orgánicos que hacen bajar el pH
(Kent, 1991, Páez et al., 2000, Alfaro et al., 2001, España y Barreto, 2002).
La temperatura sigue subiendo hasta alcanzar valores comprendidos entre 60-70°C (fase
termofílica), aquí la microflora mesófila es sustituida por la termófila y el material más difícil
de descomponer comienza a ser degradado. Si existen condiciones óptimas de humedad y
ventilación se producen visibles emanaciones de vapor de agua. Estos microorganismos
transforman el nitrógeno en amoniaco y el pH del medio se hace alcalino, a los 60°C los
hongos termófilos cesan su actividad y aparecen bacterias esporógenas y actinomicetos
(Avendaño, 2003, Beffa et al., 1996, Arnedo et al., 2002, Nakamura et al., 2004). Además se
produce una disminución del carbono presente en el material, provocando el descenso de la
relación C/N ya que se degradan sustancias como celulosa y lignina (Forgarty y Tuovinen,
1991) también en esta fase la mayoría de los microorganismos patógenos, parásitos,
fitotoxinas y semillas de malas hierbas son destruidos (Avendaño, 2003, Arnedo et al., 2002,
Dávila et al., 2002).
La temperatura máxima en la fase termofílica no debe superar los 70°C, la configuración
geométrica de las pilas es un factor importante que afecta el comportamiento de la
temperatura, si esta es inadecuada se pueden alcanzar temperaturas demasiados altas,
siendo necesario reducir las dimensiones para permitir la pérdida de calor y controlar la
evolución de la temperatura (Madrid y Castellanos, 1997). El manejo de la temperatura
requiere cuidado y control, ya que así como la alta temperatura es capaz de sanitizar
patógenos, también puede terminar con la flora benéfica, las enzimas responsables de la
degradación se desnaturalizan y se convierten en no funcionales, provocando que los
microorganismos no puedan nutrirse de manera adecuada (Graves, 2000)
El CO2 se produce en volúmenes importantes que difunden desde el centro a la superficie de
la pila. Este gas, juega un papel fundamental en el control de larvas de insectos, dado que
concentraciones altas de CO2 resultan letales para las larvas (Graves, 2000).
La etapa de maduración o de estabilización, se encuentra marcada por una baja tasa de
actividad microbiana, al agotarse los sustratos se produce una caída gradual de la
temperatura, la cual es igual a la del medio ambiente, lo que indica el término de la
elaboración del compost. (Avendaño, 2003, Arnedo et al., 2002).
Durante esta etapa los productos resultantes de la etapa termofílica del compostaje se
estabilizan, lo que involucra una descomposición más avanzada de ácidos orgánicos, una
disminución de los compuestos resistentes y la formación de compuestos húmicos. Se debe
continuar con un manejo apropiado de la humedad y oxígeno para mantener la actividad
microbiana (Graves, 2000).
2.3.2 Factores que condicionan el proceso de compos taje
• Relación Carbono / Nitrógeno (C/N)
La relación C/N, expresa las unidades de Carbono por unidades de Nitrógeno que contiene
un material. El Carbono es una fuente de energía para los microorganismos y el Nitrógeno
es un elemento necesario para la síntesis proteica. Una relación adecuada entre estos dos
nutrientes, favorecerá un buen crecimiento y reproducción.
La proporción C/N es considerada crítica en la determinación del grado de descomposición y
debe ser establecida con base al carbono disponible. En general, una relación de 30:1 es
considerada ideal, pues altas proporciones tienden a retardar el proceso de descomposición,
mientras que proporciones menores a 25:1 pueden generar problemas de olores. Cuando el
nitrógeno se encuentra en exceso, este se pierde como amoniaco gaseoso causando olores
indeseables en el mismo compost, ya que hay una producción de cadaverina y putrescina
causantes de este fenómeno por desaminación, en contraste al haber poco nitrógeno se
reduce la población microbiana y al mismo tiempo la velocidad de compostaje (Avendaño,
2003; Sztern y Pravia, 1999).
El compost final debe tener una relación de C:N 15 a 20:1 (EPA, 1995). Mientras la
compostación ocurre, la concentración (C/N) decrece gradualmente de 30:1 a 10:1-15:1 para
la terminación de los productos del compostaje. Esto se debe a que en cada tiempo en que
la materia orgánica es consumida por los microorganismos, dos terceras partes del carbono
son desprendidas como dióxido de carbono y la tercera parte restante es incorporada junto
con el nitrógeno en las células microbianas lo que refleja la descomposición de la materia
orgánica y su estabilización (Trautmann y Olynciw, 1999; Jürgen et al., 1992).
Los residuos de origen vegetal presentan por lo general una relación C/N elevada. Las
plantas y montes contienen más nitrógeno cuando son jóvenes y menos en su madurez. A
diferencia de los residuos de origen animal que comúnmente presentan una baja relación
C/N (Tabla 7).
Tabla 7. Principales características de algunos materiales orgánicos
Material %N C:N Humedad % Estiércol Vacuno 1.5 – 4.2 11 – 30 67 – 87 Residuos de origen animal Contenido ruminal 9.6 85.8 Plaza 1.9 – 2.9 14 – 16 69 Residuos Municipales Cascarilla de arroz 1.9 – 6.2 Cortes de pasto 2.0 – 6.0 9 – 25 - Hojas 0.5 – 1.3 40 – 80 -
Residuos vegetales
Cortes de poda 1.5 25 - 30 20 – 30
Fuente: (Avendaño, 2003, Ministerio de Minas y Energía, 1990, Falla – Cabrera, 1995)
• Oxígeno
El compostaje es considerado un proceso aeróbico, por lo cual requiere oxigeno. Las
condiciones anaerobias con deficiencias de oxígeno pueden producir olores. La
descomposición puede ocurrir bajo ambas condiciones aerobia y anaerobia, sin embargo la
descomposición aeróbica ocurre mucho más rápido.
El oxígeno es esencial para el metabolismo y la respiración de los microorganismos
aerobios, para oxidar las moléculas orgánicas presentes en los residuos, por lo tanto es un
parámetro a controlar. La aireación tiene varios objetivos, mezclar los materiales, evitar
compactación, crear nuevas superficies de ataque para los microorganismos, aportar el
oxígeno suficiente y permitir al máximo la evacuación del dióxido de carbono producido.
(Avendaño, 2003)
La concentración de oxígeno depende de la textura, humedad del material a compostar,
frecuencia de volteo y tasas de utilización, y suministro si se controlan estos factores se
favorecerá la proliferación de bacterias, hongos y actinomycetes disminuyendo así la
presencia de microorganismos anaerobios (Páez et al., 2000). Entre el 10 y el 15 % en
concentración de oxígeno es considerado adecuado, aunque una concentración del 5%
puede ser suficiente. Si la concentración de oxigeno es más alta, puede afectar
negativamente el proceso de compostaje causando problemas como la remoción del calor y
el enfriamiento de la pila, también puede promover el exceso de evaporación, lo cual hace
más lento el proceso (EPA, 1995).
La pila de compost debe tener suficientes espacios vacíos para permitir el libre movimiento
del aire, el ingreso del oxígeno que viene de la atmósfera y la liberación del dióxido de
carbono y otros gases. En algunas operaciones de compost, el aire puede ser inyectado
mecánicamente o empujado hacia las pilas para mantener los niveles adecuados de
oxígeno. En otras situaciones la pila es volteada frecuentemente para exponer los
microorganismos a la atmósfera y también para crear más espacios vacíos en la pila.
La aireación es la forma más rápida y económica de garantizar el flujo de oxigeno, de la
misma manera, la forma de la pila es importante para una lograr una buena aireación porque
de ella depende el flujo de oxigeno hacia el interior de la masa. El volteo además intenta que
todas las zonas de la pila tengan una temperatura uniforme favoreciendo la descomposición
y elimina malos olores (Martínez-Almela et al., 2001; EPA, 1995; Dávila et al., 2002)
• Humedad
Debido al carácter aeróbico del proceso de compostaje, exige una relación entre la
estructura de los materiales que van a transformarse y la humedad, ya que un exceso de
agua puede desplazar el aire necesario para la actividad microbiana, dando paso a una
descomposición anaeróbica (EPA, 1995).
Los microorganismos requieren agua para la formación de biomasa. Se necesita una
humedad alta al iniciar el proceso cuando la actividad es más intensa y un poco menos a
medida que se avanza en la descomposición. Se busca inicialmente de 30 – 70% de
humedad y ello se alcanza con la humedad propia de la mezcla o añadiendo agua. En los
procesos donde se hacen volteos para reactivar el proceso, se acostumbra rehumedecer y
entonces la temperatura se eleva de nuevo. Para aprovechar el agua de descomposición del
proceso se propone el compostaje solarizado que consiste en tapar la pila con un plástico
que permita aireación y de paso evita el lavado de nutrientes en pilas colocadas a la
intemperie (Gómez, 2002).
Porcentajes de humedad superiores a los valores indicados producirían un
desplazamiento del aire entre las partículas de la materia orgánica, con lo que el medio se
vería anaerobio, favoreciendo los metabolismos fermentativos y las respiraciones
anaeróbicas. Si la humedad se sitúa en valores inferiores al 10%, desciende la actividad
biológica general y el proceso se vuelve extremadamente lento (Galindo et al., 2005).
El contenido en humedad de los desechos orgánicos crudos es muy variable, tal es el caso
de la excretas y estiércoles, donde el contenido en humedad está relacionado con la dieta.
Si la humedad inicial de los residuos crudos es superior a un 50%, se debe buscar la
forma de que el material pierda humedad, antes de conformar las pilas
El contenido de humedad en el caso de los residuos vegetales (tallos, fibras, cutículas,
cáscaras, bagazos, rastrojos, restos de podas, frutas) es relativo dependiendo de varios
factores como: características de las especies cultivadas, ciclo del cultivo, tiempo de
exposición a los factores climáticos y manejo (Sztern y Pravia, 1999).
• pH
El compostaje puede desarrollarse dentro de un amplio rango de pH (3–11), se consideran
óptimos los valores de pH comprendidos entre 5 y 8. Las bacterias prefieren un medio casi
neutro, mientras que los hongos se desarrollan mejor en medios ligeramente ácidos (Graves,
2000).
El pH afecta la cantidad de nutrientes disponibles para los microorganismos, la solubilidad
de metales pesados y en la actividad metabólica de la población microbiana. El pH puede
ser ajustado con cal y azufre si es necesario disminuir o aumentar la acidez. Durante el
proceso se produce dióxido de carbono, el cual, cuando se combina con agua produce ácido
carbónico. El ácido carbónico puede reducir el pH del compost. A medida que el proceso de
compostaje progresa, la variación del pH final depende del tipo específico del material usado
y las condiciones de operación (EPA, 1995).
• Tamaño de partícula
El tamaño de partícula del material a compostar es decisivo. A medida que se desarrollan las
fases del compostaje, se presenta un proceso natural de reducción del tamaño, debido a que
las partículas más pequeñas usualmente tienen mayor área superficial facilitando la
actividad microbiana y por consiguiente una rápida descomposición. Sin embargo, si todas
las partículas son picadas finamente, se aglomeran y disminuyen los espacios vacíos,
dificultando la circulación del aire y la respiración de los microorganismos (EPA, 1995).
El tamaño de las partículas promueve la difusión de oxígeno. La mezcla de diferentes
tamaños de partículas permite la aireación y puede ser efectiva en el establecimiento y
mantenimiento de un contenido apropiado de humedad para el compostaje. La cascarilla de
arroz, la viruta de madera y trozos de cartón son agentes espumantes comunes (Sylvia et
al., 2005). El tamaño ideal es de 2 a 5 cm.
2.3.3 Calidad de Materias Primas
El manejo de residuos orgánicos ha adquirido especial importancia, principalmente para la
producción de abonos orgánicos con el objetivo de suplementar los nutrientes que las
plantas son capaces de obtener por sí mismas.
En virtud de la aplicación de estos productos en sistemas de cultivo dedicados al consumo
humano y teniendo en cuenta la presencia de materiales orgánicos de origen animal, es
importante realizar un seguimiento de parámetros químicos y biológicos que permitan
evaluar la estabilidad e inocuidad del producto final. Lo anterior atendiendo a lo estipulado
por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) y el Instituto Colombiano de Normas
Técnicas y Certificación (ICONTEC), quienes establecen que todo producto cuyo origen
declarado sea materia orgánica fresca debe ser sometido a procesos de transformación que
aseguren su estabilización agronómica tales como: compostaje o fermentación. (Barreto,
2003).
Dentro del proceso de compostaje pueden utilizarse material vegetal como la cascarilla de
arroz, producto residual resultante del procesamiento del grano de arroz, el cual constituye
aproximadamente un 21% de la cosecha de arroz. Esta posee características químicas,
físicas, energéticas y bromatológicas que dificultan en algunas ocasiones su manejo y
aprovechamiento (Arbeláez, 2001).
La cascarilla de arroz se ha convertido en un problema ambiental significativo, puesto que se
generan volúmenes inmanejables de este subproducto (en Colombia anualmente se genera
alrededor de 288.398 toneladas de cascarilla de arroz) para los cuales existe una demanda
insuficiente de su aprovechamiento (Ministerio de minas y energía, 1990). Es un residuo de
difícil biodegradación debido a su alto contenido de celulosa (37.2 43.4% en peso) y cuya
relación C/N es de 113 – 1120 (Ministerio de Minas y Energía, 1990; Rodríguez, 2000).
Dentro del compostaje este material permite neutralizar el exceso de humedad y una
adecuada descomposición de los residuos al tener un bajo contenido de agua.
Adicionalmente mejora la estructura física del producto final, facilitando la aireación,
absorción de la humedad de la filtración de nutrientes en el suelo, favorece el incremento de
la actividad macro y microbiológica del abono y puede alcanzar, en muchos casos, hasta
una tercera parte del total de los componentes de los abonos orgánicos (Rodríguez, 2000).
Los residuos de plaza son residuos orgánicos provenientes de actividades agropecuarias
mientras que las podas son generadas en parques y áreas verdes. En general, los
materiales que son verdes y húmedos (cortes de pasto, residuos de frutas y verduras)
poseen alta concentración de nitrógeno y los que son leñosos y secos (hojas de otoño,
virutas de madera, aserrín, papel, entre otros) una alta concentración de carbono.
Dentro de los materiales de origen animal puede mencionarse el contenido ruminal; uno de
los contaminantes con mayor impacto ambiental ya que produce una alta carga orgánica en
fosas sépticas, basureros municipales y aguas residuales. Es un producto obtenido de la
matanza en los mataderos y representa el alimento ingerido por los animales poligástricos
que es desechado al momento del sacrificio (Uicab-Brito et al., 2003).
Es una mezcla de material no digerido de consistencia blanda, de color amarillo verdoso y
un olor característico muy intenso cuando está fresca, además posee gran cantidad de flora
microbiana y productos de la fermentación ruminal (Cadavid, 2001). De igual forma su
composición química es poco variable, debido a que la alimentación de los bovinos es
básicamente de pasto y ciertas combinaciones con melazas, por lo que se encontraría alta
concentración de celulosa, hemicelulosa, lignina y un bajo contenido en grasas, proteína y
ceras.
2.3.4 Patógenos en compost
En el compostaje se pueden encontrar gran variedad de patógenos, los cuales son
eliminados a una temperatura promedio entre 55 y 65ºC en intervalos de tiempo que van de
24 horas a tres días (Negro et al., 2003).
Uno de los factores más importantes que afectan los microorganismos entéricos
inactivándolos es la temperatura (Sesay et al., 1998). Entre los patógenos más importantes
que representan un riesgo para animales y humanos se encuentran Salmonella sp y E. coli,
los cuales son eliminados en las pilas de compost a una temperatura de 60°C durante 3
semanas fácilmente cuando hay una aireación suficiente. Sin embargo, la uniformidad de la
preparación del abono no ha sido bien investigada o documentada en las aplicaciones
prácticas. Además, investigaciones preliminares demuestran que el recrecimiento de
poblaciones indetectables es posible si los residuos no han sido transformados
completamente en abono (Droffner y Brinton, 1995).
Nuevos organismos patógenos han despertado el interés en el campo de los abonos
orgánicos y lodos incluyendo bacterias como E. coli O157:H7, Listeria sp y Helicobacter;
virus como Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Hepatitis A y Rotavirus y parásitos como
Cryptosporidium, Cyclospora, Toxoplasma, Microsporidia y Giardia. La presencia y
persistencia de los patógenos anteriormente mencionados depende de regímenes de
tratamiento, incluyendo su supervivencia en el suelo y en los cultivos luego de la aplicación
de los residuos tratados (Gerba y Smith, 2005). Por esta razón, se hace necesario la
estandarización y validación de los métodos microbiológicos para su detección.
Se han detectado en plantas de compostaje elevadas concentraciones ambientales, en
forma de bioaerosoles, de esporas fúngicas, bacterias gram negativas, actinomicetos
termófilos y endotoxinas, por lo que la principal vía de exposición es la inhalatoria.
Los distintos estudios ambientales realizados muestran que las concentraciones de hongos
halladas en distintas partes del proceso varían entre 105 y 107 UFC (unidades formadoras de
colonias) por m3; las concentraciones de bacterias Gram negativas que se han determinado
en la mayoría de estudios superan las 104 UFC/m3; en cuanto a actinomicetos termófilos, se
han determinado concentraciones entre 105 y 108 UFC/m3. Las concentraciones de
endotoxinas en aire se hallan en la mayoría de estudios alrededor de 30-40 ng/m3 aunque en
algún caso se han superado los 3000 ng/m3 (Alonso et al., 2007)
La destrucción de patógenos durante la fase termófilica permite la obtención de un abono
orgánico no contaminante. En la Tabla 8 se muestra la temperatura y el tiempo necesarios
para la destrucción de algunos patógenos y parásitos más comunes que pueden estar
presentes en el residuo a compostar (Negro et al., 2003). Además, los patógenos no se
destruyen solamente por la temperatura, sino también por la competencia de nutrientes y las
interacciones antagónicas microbianas (Ministerio del Medio Ambiente, 1999).
Es importante hacer una prueba de calidad al compost final pues todo fertilizante o
acondicionador orgánico de origen no pedogenético, deberá demostrar ausencia Salmonella
sp en el producto final y menos de 100 UFC/g de enterobacterias totales. Además, si alguna
de las materias primas es de origen vegetal, deberán estar exentos de fitopatógenos de los
géneros Fusarium sp, Botrytis sp, Rhizoctonia sp, Phytophtora sp y huevos de helminto
(ICONTEC, 2004).
Tabla 8. Microorganismos patógenos asociados a compost
Microorganismo Géneros Temperatura y tiempo
de exposición
Virus Rotavirus, Parvovirus, Adenovirus, Hepatitis
A, Poliovirus, Echovirus, Coxsachivirus,
Calicivirus, Astrovirus
Umbral más alto que
otros microorganismos
Bacterias Salmonella, sp, Shigella sp, Mycobacterium
tuberculosis, Vibrio cholerae, Escherichia
coli, Yersinia enterocolitica, Clostridium
perfringens, Clostridium botulinum, Listeria
monocytogenes
55 – 60°C durante una
hora de exposición
Hongos Candida sp, Aspergillus fumigatus 55 – 70°C durante una
hora de exposición
Protozoarios Entamoeba sp, Giardia lamblia, Balantidium
coli, Criptosporidium parvum
Umbral más alto que
otros microorganismos
Helmintos Ascaris lumbricoides, Ancylostoma sp,
Trichuris trichura, Tenia saginata
Mueren en menos de una
hora a temperaturas
superiores a 55º C.
Fuente: (Los Autores, 2007, Adaptado de Muñoz, 2005)
Por otro lado, los patógenos que se encuentran en los excrementos de los rumiantes
utilizados como materia prima de compostaje, sobreviven en el medio ambiente según
características propias del suelo, temperatura y humedad, estos pueden sobrevivir en el
suelo por un año o más (Tabla 9).
Los bacteriófagos que han sido aislados del fluido ruminal infectan bacterias como:
Streptococcus durans, Streptococcus bovis, Serratia sp, Bifidobacterium ruminale,
Methanobrevibacter sp y Fusobacterium necrophorum. Adicionalmente se han encontrado
fagos parásitos obligados de Streptococcus bovis similares a fagos lambda de Escherichia
coli (Bauchop y Klieve, 1988).
Tabla 9. Patógenos que se pueden encontrar en el contenido ruminal
Patógenos Supervivencia en suelo Supervivencia en pastos
Listeria sp. 2 semanas – 4 años 128 días
Escherichia coli 1 mes – 1 año 99 días
Cryptosporidium parvum 1 mes – 1 año 30 días
Salmonella sp. 2 semanas – 1 mes 63 días
Campylobacter sp. 1 mes -
Fuente: (Crohn et al., 2007)
Finalmente es tradicional el uso del proceso de compostaje para la estabilización de
excrementos animales como porquinaza, caprinaza y gallinaza considerados como
subproductos de explotación porcina, caprina y avícola respectivamente donde es de vital
importancia la identificación de microorganismos propios de cada uno de estos materiales y
que representen un riesgo para humanos y animales.
2.3.5 Control de calidad del producto final
El compost es un producto reconocido para su uso en agricultura y jardinería como fuente de
materia orgánica, nutrientes y oligoelementos de liberación lenta. Usualmente se utilizan
parámetros físico-químicos y microbiológicos como índices o requerimientos de calidad del
compost.
Una vez el proceso de compostaje ha finalizado se espera llegar a obtener índices
específicos para garantizar la calidad de un abono orgánico, definido como un producto
sólido obtenido a partir de la estabilización de residuos sólidos urbanos o mezcla de los
anteriores que contiene materia orgánica como carbono orgánico (ICONTEC, 2004).
Los análisis químicos y físico-químicos más comunes incluyen pH, conductividad eléctrica,
amonio, C y N total o solubles en agua, capacidad de intercambio catiónico y ácidos grasos
volátiles. En el caso de los parámetros microbiológicos, son utilizados como medida de
garantía higiénica y sanitaria para el uso del compost y para verificar la eficiencia del
proceso de compostaje. Se basan en la elección de una serie de microorganismos con
carácter de “indicador” y “test”, habiéndose determinado con carácter previo una correlación
entre la presencia y concentración de los mismos con el conjunto o la mayoría de las
especies patógenas (Fernández et al., 2004).
Dentro de los parámetros que en Colombia se requieren para la determinación de este
producto se incluyen pérdidas por volatilización (ND), contenido de cenizas (máx. 60%),
contenido de humedad (máx. 35%), contenido de carbono oxidable total (min. 15%),
capacidad de intercambio catiónico (min. 30meq/100g), pH (<4 y >9), densidad (máx.
0.6g/cm3), conductividad eléctrica ds/m (ND), capacidad de retención de humedad (su propio
peso), relación C/N (ND) y N, P, K (< 1%) (ICONTEC, 2004).
Los abonos orgánicos incorporados, que han sido parte de la materia orgánica presente,
son uno de los factores más importantes para determinar la productividad del suelo en
forma sostenible, convirtiéndose en el factor principal a ser considerado cuando se plantea
un manejo ecológico del suelo; es por esto que se recomienda un análisis de
caracterización, que permita conocer los componentes fisicoquímicos y sanitarios del
producto, mostrando los elementos de calidad que permitan su uso a nivel agroindustrial. En
la tabla 10 se especifican los parámetros físicos, químicos y microbiológicos que debe tener
el producto compostado según las diferentes normativas nacionales e internacionales.
La normatividad existente para definir la calidad de abonos orgánicos en el país no incluye
dentro de sus parámetros microbiológicos la búsqueda y detección de virus entéricos. Por tal
razón y teniendo en cuenta la normatividad de la Agencia de Protección Ambiental EPA
1999, es de vital importancia ampliar el rango de patógenos que deben ser identificados
dentro de las enmiendas orgánicas y acondicionadores de suelo; entre ellos virus entéricos.
Tabla 10. Indicadores microbiológicos de calidad de compost.
PARAMETRO ICONTEC ICA CHILE Coliformes fecales
- Ausencia < 1000 NMP/g de compost Base Seca
Estreptococos fecales - - -
Enterobacterias totales < 100 Salmonella s.p Ausencia Ausencia Ausencia
Huevos de helminto
viables
- - Ausencia
Virus MS-2 - - Densidad máxima < 1 UFP/4g de compost
Base Seca Listeria monocytogenes - - Ausencia
Clostridium perfringens - - 103 /g de compost
Fuente: (ICONTEC NTC 5167 2004; Norma Chilena de calidad de compost NCh2880. 2003)
En consecuencia a los vacíos existentes en la normatividad colombiana, la mayoría de las
veces se hace necesario acudir a las normas extranjeras para garantizar altos estándares de
calidad en el producto final, tal como ocurre con los biosólidos generados a partir de las
plantas de tratamiento de aguas residuales. Los biosólidos han sido utilizados como
enmienda orgánica debido a la alta cantidad de nutrientes y materia orgánica contribuyendo
así a la fertilidad del suelo y reduciendo la necesidad de uso de nutrientes inorgánicos. Sin
embargo, su aplicación está limitada por la presencia de metales pesados, sustancias
tóxicas y microorganismos patógenos, los cuales están regulados por la Norma 503 de la
Agencia de Protección Ambiental (EPA, 1999).
Cuando en el proceso de compostaje se recurre al uso de biosólidos, la clasificación del
compost se hace según su calidad en clase A y clase B. El compost clase A es un producto
de alta calidad que no presenta restricciones de uso ya que ha sido sometido a un proceso
de humificación y a una temperatura de 55° a 65°C e n un espacio de tiempo de 24 horas a 3
días eliminando los patógenos pero no los microorganismos necesarios y benéficos. Por otro
lado el compost clase B es un producto de nivel intermedio de calidad y presenta algunas
restricciones de aplicación, además este compost requiere ser mezclado con otros
elementos adecuados a diferencia del compost clase A. Cualquiera de las clases de
compost mencionadas anteriormente deberá cumplir con los parámetros microbiológicos
estipulados en la Norma Chilena NCh 2880.
Según la Norma 503 de la Agencia de Protección Ambiental (EPA) de 1999, “Estándares
para la aplicación y disposición de lodos de aguas residuales”, define dos tipos de biosólidos
con respecto a la reducción de agentes patógenos. Clase A y clase B según el grado de
tratamiento que los lodos hayan recibido (Tabla 11).
Tabla 11. Clasificación de biosólidos según la EPA.
Norma EPA 503
Estándares para la Aplicación y Disposición de Lod os de Aguas Residuales
BIOSOLIDO CLASE A
Parámetros Unidades Limites
Coliformes fecales NMP/g de peso seco 1000
Salmonella sp NMP/4g de peso seco 3
Virus entéricos UFP/4g de peso seco <1
Huevos de helminto Huevos viables/ 4g de peso seco <1
BIOSOLIDO CLASE B
Parámetros Unidades Limites
Coliformes fecales NMP o UFC/g de peso seco < 2 x 106
Virus entéricos UFP/4g de peso seco >1
Huevos de helminto Huevos viables/ 4g de peso seco 106
NMP: número más probable
UFC: unidad formadora de colonia
UFP: unidad formadora de placa
Fuente: EPA, 1999
En el caso de Europa las limitaciones microbiológicas para el uso agrícola de productos
orgánicos incluyen indicadores microbiológicos como E. coli, Salmonella sp, y otros
microorganismos tales como Clostridium perfringens, Campylobacter sp, Yersinia sp y
Listeria sp (Tabla 12).
Tabla 12. Parámetros microbiológicos en la legislación europea
Fuente: (Los Autores, 2007. Adaptado de Guardabassi et al., 2003; Gómez y Estrada de Luis, 2005)
Dentro del control de calidad de bioabonos contemplado en la legislación francesa se tiene
en cuenta el conteo de partículas de enterovirus en cultivo celular al igual que la necesidad
de la validación de métodos para su detección en este tipo de materiales. A pesar de los
vacíos existentes dentro de la legislación de abonos orgánicos, con la aparición de
patógenos emergentes se ha hecho evidente la necesidad de ampliar el rango de
patógenos.
En el año 2001 la comisión de expertos de la USEPA y USDA en el tema de “Agentes
infecciosos emergentes y aspectos relacionados con abonos animales, biosólidos y
subproductos”, identificaron la necesidad de desarrollo, validación y estandarización de
Salmonella Coliformes
fecales
E.coli Clostridium
perfringens
Otros
Austria Ausencia - - - Campylobacter
Yersinia
Listeria
España Ausencia en
25 g
- < 1*103 Ausencia en 1 g -
Italia Ausencia en
25 g
< 1*103 - - -
Ecoetiqueta
UE
Decisión
Comisión
94/923/CE 14
Nov
Ausencia en
25 g
- < 1.000
UFC/g
- -
UE 2 Draft
D. Biolog
Waste
Ausencia en
50 g
- - Ausencia en 1 g -
métodos microbiológicos para la detección de patógenos emergentes como
Cryptosporidium, Cyclospora, Toxoplasma, Virus de la Hepatitis, Poliovirus, Adenovirus y
Rotavirus (Gerba y Smith, 2006).
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
El compost como producto de la oxidación de la fracción orgánica de los residuos ha sido
tradicionalmente evaluado en su calidad desde el punto de vista físico y químico y
únicamente tiene importancia, por lo menos en Colombia, la Salmonella sp. como patógeno
humano. Esta característica hace que la presencia de otros patógenos bacterianos o virales,
en especial aquellos presentes en materias primas de origen animal, puedan dar lugar a la
contaminación de los productos de consumo directo y/o de las fuentes de aguas, por lo que
su aplicación constituye un peligro para la salud pública y una amenaza para el medio
ambiente por la exposición a microorganismos patógenos que esto representa. La presencia
de contaminantes patógenos en el compost puede ser considerado un riesgo ocupacional y
reduce drásticamente el valor del compost obtenido, llegando a imposibilitar su uso en
agricultura.
Debido a su amplia distribución en el medio ambiente y a su supervivencia en lodos,
sedimentos y biosólidos en comparación con otros patógenos como Salmonella sp,
Escherichia coli y coliformes, la detección de virus entéricos debe tenerse en cuenta en el
control de calidad de los bioinsumos. No obstante actualmente esta práctica no es llevada a
cabo, en consecuencia de los costos elevados, su alto nivel de dilución y a la dificultad de
las técnicas para la detección viral a partir de lodos, biosólidos y compost.
El Rotavirus es el principal agente etiológico de diarreas en niños menores de cinco años a
nivel mundial principalmente en países subdesarrollados. Este virus ocasiona cada año
millones de episodios de gastroenteritis e igualmente afecta a especies animales de
importancia económica para el hombre. El impacto económico y de salubridad que ocasiona
el Rotavirus se manifiesta de manera clara en los sistemas agrícolas de consumo directo
como frutas y hortalizas donde el uso de abonos contaminados, podría acarrear problemas
de salud en los consumidores finales, siendo necesaria su identificación y eliminación de las
posibles fuentes de contaminación. Gran parte de los patógenos presentes en los
materiales que se utilizan para compostaje son eliminados durante el proceso como
resultado de complejas interacciones microbianas y principalmente por el aumento de
temperatura; los virus y hongos suelen ser más resistentes a elevadas temperaturas que las
bacterias como el caso del Virus de la Hepatitis A, Poliovirus y Rotavirus.
Finalmente es de vital importancia la detección de virus entéricos que causen enfermedad
tanto en hombres como en animales a través de pruebas comerciales y métodos sencillos y
reproducibles que permitan su extracción y concentración.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Realizar el seguimiento de la presencia de Rotavirus en un proceso de compostaje realizado
a partir de residuos orgánicos domiciliarios y contenido ruminal
4.2 Objetivos específicos
• Preparar pilas de compost a partir de la fracción orgánica de los residuos domiciliarios y
contenido ruminal y realizar el seguimiento del pH y temperatura
• Estandarizar el método de extracción y concentración viral en matriz compost y materias
primas.
• Determinar la presencia de Rotavirus en las materias primas, proceso y producto final
mediante prueba de ELISA e inmunocromatografía (ICT) comparando los dos métodos
de detección viral.
5. MATERIALES Y METODOS
El proceso de compostaje fue realizado en el relleno sanitario “Don Juanito” en la ciudad de
Villavicencio manejado por la empresa Bioagrícola del Llano S.A. E.P.S.P. por medio de
ensayos in vivo en nueve pilas de compostaje elaboradas a partir de residuos sólidos
urbanos (RSU)
5.1 Preparación de inóculo termofílico y montaje de las pilas de compostaje
Para el montaje de las pilas de compostaje fue necesaria la producción de un inóculo
termofílico mixto usado tradicionalmente para obtener en la empresa Bioagrícola del Llano,
un abono orgánico de buena calidad y nutrientes en menor tiempo con características
apropiadas para la aplicación en campo. El inoculante fue producido a partir de la
reconstitución del banco de cepas amilolíticas y proteolíticas, obtenidas y evaluadas en el
estudio realizado por Galindo et al (2005) provenientes del Laboratorio de Biotecnología
Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana.
Para la reconstitución de las cepas se prepararon 100 ml de caldo leche para cada una de
las cepas proteolíticas y 100 ml para las cepas amilolíticas teniendoa en cuenta las cepas
que comparten actividad. Posteriormente se tomaron dos viales de cada cepa y se
reconstituyeron en 100 ml del caldo correspondiente.
Una vez las cepas fueron reconstituidas, se llevaron 100mL de inóculo (10%) a 900 mL de
caldo almidón – leche 1%(p/v) incubando por 48 horas a 55ºC (Anexo 1). A continuación, se
determinó la biomasa inicial en UFC/ml en agar almidón y leche y se determinó la actividad
proteolítica y amilolítica cuantitativamente mediante las técnicas de ácido tricloroacético y
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) (Anexo 2 y 3). Una unidad amilolítica se define
como la enzima capaz de liberar 1 µmol de glucosa por minuto por litro (UA/min.L) mientras
que una unidad proteolítica se define como la enzima capaz de liberar 1µmol de tirosina por
minuto por litro (Pedroza et al., 2004).
Por otro lado, el montaje de las pilas se realizó utilizando dos tratamientos con 50% y 60%
de residuos de plaza, podas, contenido ruminal y cascarilla de arroz (Tabla 13). Los
tratamientos se eligieron atendiendo las solicitudes del relleno sanitario. El tamaño de las
pilas fue de aproximadamente 2m de base x 1.5m de altura x 6m de largo; y un peso total
de cuatro toneladas.
Tabla 13. Composición de las pilas evaluadas.
Réplicas Tipo de residuos Porcentaje
(%)
Toneladas
Plazas 50 2 Podas 20 0.8
Contenido ruminal 20 0.8
P1, P2, P3
Cascarilla de arroz 10 0.4
Plazas 60 2.4 Podas 10 0.4
Contenido ruminal 20 0.8
P1, P2, P3
Cascarilla de arroz 10 0.4
Fuente: (Autores, 2007)
Se construyeron nueve pilas evaluadas de manera independiente, tres de ellas con el 50%
de residuos de plaza y las otras seis con 60% de residuos de plaza. El montaje de las
primeras seis pilas fue llevado a cabo en el mes de noviembre de 2006; mientras que las
últimas tres pilas de compostaje fueron montadas en el mes de junio de 2007 en las zonas
destinadas al compostaje de materia orgánica, con pisos y estructuras metálicas con
cubiertas de cloruro de polivinilo para evitar la interferencia de las condiciones atmosféricas
sobre el proceso. Para la inoculación de las pilas se empleó el inóculo termofílico acelerador.
5.2 Seguimiento de las pilas y muestreo
Se tomó una muestra de 500g compuesta de 5 submuestras puntuales tomadas de
diferentes secciones de cada pila con un tubo de PVC de 70 cm de largo x 3” de diámetro.
Para ello, se retiró la poda que cubre las pilas, quedando descubierta una parte del compost.
Las muestras obtenidas fueron transportadas en bolsas sellopack dentro de una nevera de
icopor a 4°C.
Las muestras fueron tomadas desde el día cero incluyendo cada materia prima, cada ocho
días (52 días totales del proceso), para un total de 52 muestras en el caso del primer
proceso de compostaje y 28 muestras en el caso del segundo compostaje. Finalmente, las
muestras fueron conservadas a una temperatura de -10°C, en un congelador del laboratorio
de Microbiología ambiental de la Pontificia Universidad Javeriana durante seis meses hasta
su procesamiento.
Con el fin de registrar las temperaturas durante el proceso, en cada pila de compostaje se
determinó la temperatura aleatoriamente en 5 puntos diferentes utilizando un termómetro de
punzón de 70cm de largo con receptor digital de datos (Galindo et al., 2005) (Figura 3) . Ésta
se midió internamente enterrando el termómetro completamente en la pila de compost. La
medición fue realizada semanalmente durante un período de dos meses (ocho semanas).
Figura 3. Determinación de temperatura
Por otro lado, el pH fue determinado mediante el método de pasta de saturación, según
ICONTEC, 2004 que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila, completando 500g.
Posteriormente se Agregaron 500mL de agua destilada y la muestra fue homogenizada y
sedimentada durante 5 minutos tomando el valor de pH sobre el extracto líquido superficial
(Figura 4)
Figura 4. Determinación de pH
5.3 Análisis físico químico de las muestras de comp ostaje
Para los análisis fisicoquímicos se enviaron 500g de las muestras de la octava semana del
primero y segundo proceso de compostaje a AGRILAB LTDA. Allí, se llevaron a cabo las
pruebas correspondientes de carbono total, nitrógeno orgánico, el porcentaje de humedad, y
la concentración de otros elementos importantes como el fosforo, el hierro, el azufre y el
potasio.
5.4 Estandarización del proceso de extracción y con centración de virus a partir de
muestras de compostaje
La técnica utilizada para la extracción del agente viral, fue la técnica de elusión descrita por
Ahmed y Sorensen (1995) y modificada para este trabajo. Para tal fin se diluyeron 5g de
compost y materia prima en 30 ml de extracto de carne al 10% (pH 9) (Anexo 6) los cuales
fueron sometidos a vortex diez veces durante 1 minuto.
Después se realizó un proceso de sonicación en hielo a 37 Hz durante cinco minutos en
intervalos de un minuto. Este proceso consiste en la aplicación de ultrasonido a una
suspensión. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares en este caso
particular del tejido vegetal y animal proveniente de residuos de plaza y contenido ruminal
respectivamente. La sonicación fue llevada a cabo en frio para evitar el sobrecalentamiento
de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas virales.
Seguido a esto las diluciones en los tubos falcon se agitaron en shaker durante 5 minutos a
500 rpm. La suspensión resultante fue centrifugada durante 1 h, 4ºC a 5000g, con el fin de
eliminar los desechos del compost y recuperar las partículas virales suspendidas. El pH del
sobrenadante obtenido fue ajustado a 7.2 con HCl 1M.
La técnica utilizada para la concentración de la partícula viral fue la descrita por Lewis y
Metcalf 1988 y modificada por Mignotte et al., 1999. El polietilenglicol es una molécula de
alto peso molecular que en solución forma dos fases inmiscibles una acuosa y otra
polimérica, en cuyos poros son retenidas las partículas virales mediante enlaces covalentes
(Kittigul, 2001; Lewis y Metcalf 1988). Al sobrenadante obtenido en el paso anterior se
adicionó polietilenglicol 6000 (PEG 6000) en buffer fosfato 7.2 hasta una concentración final
de 8% p/v. La mezcla anterior fue llevada a agitación en shaker 1.5 – 2 horas a 4ºC 150 –
200 rpm, y conservada a 4ºC durante toda la noche. Posteriormente, fue centrifugada a
5000 x g por 90 minutos a 4ºC. El pellet fue suspendido en 2.5 ml de buffer fosfato 7.2
(Anexo 6).
5.5 Montaje del control positivo y negativo del co mpost
Con el fin de verificar la eficiencia del proceso de estandarización de extracción y
concentración viral, se llevo a cabo el montaje de un control positivo y negativo del compost.
Inicialmente 10g de compost de la octava semana del primer proceso de compostaje, fueron
esterilizados en autoclave durante 15 minutos, 15psi a 121°C. En el caso del control positivo,
se utilizo 1ml de materia fecal positiva para rotavirus por PCR suministrado por el Instituto
Nacional de Salud y diluido en 2 mililitros de buffer fosfato pH 7.2. Posterior a esta dilución,
se adicionó una alícuota de 1ml a 5g de compost estéril y se incubó durante 1hora a 37°C. El
control negativo fueron 5g de compost sin adición de materia fecal ni otra sustancia.
Los dos controles fueron sometidos al proceso de extracción y concentración descritos en
los numerales 5.3 y 5.4 y posteriormente se determinó la presencia de rotavirus mediante la
prueba de ELISA e ICT.
5.6 Detección de Rotavirus por inmunocromatografía (ICT)
A partir de las muestras de los dos procesos de compostaje llevados a cabo en la empresa
Bioagricola del Llano en los meses de Noviembre-Diciembre de 2006 y Junio-Julio de 2007
(Figura 5), se tomaron 150 ul de la solución obtenida en el proceso de concentración y
extracción viral y se transfirieron al frasco R2 del dispositivo ICT que contiene el tampón de
dilución. Posterior a esto, se homogenizo vigorosamente y se rompió el embudo del frasco
R2 con la muestra diluida, manteniendo este frasco en posición vertical se depositaron dos a
tres gotas en el pocillo de la muestra (S) evitando la formación de burbujas. La lectura se
realizo diez minutos después de haber depositado la muestra y solo en aquellos dispositivos
donde apareció la línea de control (C).
Figura 5. Componentes de inmunocromatografía.
Para la interpretación de los resultados, la muestra es positiva para Rotavirus si hay
presencia de una línea azul en R y aparece la línea de control (Figura 6).
Figura 6. Control positivo de la prueba. Se observa la línea azul, la cual indica la presencia
de Rotavirus y la línea roja del control, la cual indica la validez de la prueba
5.7 Detección de Rotavirus por ELISA
El kit de macro ELISA PATHFINDER ROTAVIRUS (BIORAD, 2006). Este sistema de
detección directa de antígenos, es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas cualitativo
para la identificación del antígeno de Rotavirus humano.
Las partículas virales presentes en la muestra de compost se unen a los anticuerpos
policlonales anti - Rotavirus que tapizan el tubo de ELISA. Un anticuerpo monoclonal
conjugado a peroxidasa soluble unido al Rotavirus añadido al tubo se une al antígeno vírico.
El anticuerpo monoclonal es específico del antígeno del Rotavirus común especificado por el
sexto gen vírico (VP6). El control positivo de la prueba será compost inoculado con Rotavirus
y el control negativo será compost estéril sin inocular.
Un sustrato de peroxidasa añadido produce un color azul si el virus está en la muestra. La
observación de color azul indica muestra positiva para el antígeno de Rotavirus; las
muestras que no presenten color azul son negativas para el antígeno en cuestión (Biorad,
2006).
Una vez la determinación colorimétrica fue realizada se detuvo la reacción añadiendo ácido
sulfúrico 1N y las absorbancias fueron leídas en espectrofotómetro a 450 nm; utilizando
como blanco agua destilada. Posterior a esto se calculó el valor de corte y la zona gris.
El valor de corte se define como el valor de Absorbancia del control negativo más 0.075 con
el cual se hace posible el cálculo de la zona gris, la cual se defina como +/- 10% del valor de
corte.
Un valor de absorbancia igual o superior al valor de corte superior de la zona gris son
muestras positivas para el antígeno de Rotavirus en la muestra de compost. De igual forma
un valor de absorbancia inferior o igual al valor de corte inferior de la zona gris son muestras
negativas para el antígeno de Rotavirus.
5.8 Modelo estadístico
Se determinó la presencia de Rotavirus durante el primer proceso de compostaje. Para ello
se evaluaron estadísticamente los resultados obtenidos con el kit de ELISA e
inmunocromatografía haciendo una correlación entre la proporción de muestras positivas por
semana en cada uno de los ensayos, el pH y la temperatura. Además se llevo a cabo una
comparación entre los dos test de detección y entre los procesos de compostaje en cuanto a
diferencias en composición de las pilas en relación con la presencia del virus.
El test Shapiro – Wilk permitió observar la distribución no normal de los datos y por
consiguiente se realizó una prueba de Mann-Whitney, con el fin de identificar diferencias
entre ELISA e inmunocromatografía como pruebas de detección de Rotavirus. Posterior a
esto, con el objetivo de hallar diferencias entre tratamientos en cuanto a composición y su
relación con el número de muestras positivas de Rotavirus se llevo a cabo un test de
Kruskal-Wallis.
Las pruebas anteriormente mencionadas fueron llevadas a cabo en el programa estadístico
Past program y en Excel. Las hipótesis propuestas fueron:
Efecto de la temperatura y pH
• Ho: La temperatura y el pH tienen efecto sobre la proporción de muestras positivas para
Rotavirus.
• Hi: La temperatura y el pH no tienen efecto sobre la proporción de muestras positivas
para Rotavirus.
Comparación entre las dos técnicas para detección v iral
Ho: La proporción de muestras positivas por ELISA es igual a la proporción de muestras
positivas por inmunocromatografía en las pilas del primer proceso de compostaje
Ha: La proporción de muestras positivas por ELISA difiere de la proporción de muestras
positivas por inmunocromatografía en las pilas del primer proceso de compostaje
Diferencias entre los tratamientos en número de mue stras positivas de Rotavirus
debido a la composición de las pilas
H0: La proporción de muestras positivas en las pilas con 50% de residuos de plaza es igual a
la proporción de muestras positivas en las pilas con 60% de residuos de plaza, mediante la
técnica de inmunocromatografía
Hi: La proporción de muestras positivas en las pilas con 50% de residuos de plaza difiere a la
proporción de muestras positivas en las pilas con 60% de residuos de plaza, mediante la
técnica de inmunocromatografía
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Preparación del inóculo acelerador
Al determinar la concentración microbiana inicial del inóculo mixto, se encontró una
población de 1021 UFC/mL para las cepas amilolíticas y 1023 UFC/mL para las cepas
proteolíticas (Tabla 14). Lo anterior permitió una mayor degradación durante el proceso de
compostaje a medida que la población aumentaba. Esto permitió considerar, que la
población proteolítica se expresó en mayor proporción que la amilolitica; debido a que los
residuos nitrogenados son más accesibles por su composición sencilla y de fácil
degradación permitiendo el aumento de la población con capacidad proteolítica en todos los
tratamientos.
Tabla 14. Concentración microbiana inicial del inóculo acelerador
Fuente: (Autores, 2007)
En simultaneo se realizó la técnica de DNS con el fin de evaluar cuantitativamente la
actividad enzimática amilolítica medida en concentración de azúcares reductores, arrojando
un valor de 276 UA considerado más alto en relación a los valores de 118.8 UA, 114.5 UA Y
172.69 UA obtenidos en estudios anteriores (Galindo et al., 2005, Rodríguez et al., 2007;
Granados et al., 2007). Las amilasas producidas por los microorganismos del inóculo se
encargan de la hidrólisis de compuestos amiláceos presentes en los residuos de plaza,
podas y cascarilla de arroz; la actividad enzimática observada fue debido a la alta
producción de enzimas durante el tiempo de fermentación.
La evaluación de la actividad proteolítica permitió demostrar la producción de proteasas
como enzimas responsables de la degradación de compuestos proteicos, los cuales son
hidrolizados hasta aminoácidos libres. La determinación fue realizada mediante la técnica
del ácido tricloroacético, arrojando un valor de 246 UP, considerado óptimo en relación al
valor de 101.3 UP, 98.5 UP y 157.38 UP obtenidos en estudios anteriores (Tabla 15). La
expresión enzimática observada se debió a la producción de grandes cantidades de enzimas
durante el tiempo de fermentación del inóculo mixto como también a la presencia de un
número mayor de cepas con actividad enzimática sobre sustratos proteicos que para este
caso estuvieron representados por el contenido ruminal.
Tabla 15. Actividad enzimática del inóculo mixto
Cepas amilolíticas 10 21 UFC/ml
Cepas proteolíticas 1023 UFC/ml
Actividad amilolítica
cuantitativa
276 UA
Actividad proteolítica
cuantitativa
246 UP
1 UA se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un µmol de glucosa por minuto por litro.
1 UP se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un µmol de tirosina por minuto por litro.
Fuente: (Autores, 2007)
Al correlacionar los valores de actividad enzimática amilolítica y proteolítica con el recuento
de población del inoculante permite inferir la adaptación de los microorganismos del inóculo
y por ende una degradación más rápida y eficiente de los residuos orgánicos presentes en
las pilas logrando el objetivo principal del compostaje como tratamiento biológico de residuos
al oxidar el contenido orgánico, en este caso el sustrato de los microorganismos.
Es importante anotar que las alta actividad enzimática del inóculo producido en comparación
con las obtenidas en estudios anteriores puede ser debido a la alta densidad de población
microbiana presente en el inóculo descartando errores experimentales en las
determinaciones correspondientes.
6.2 Seguimiento de las pilas y muestreo
La temperatura de las pilas con 50% de residuos de plaza al inicio del proceso fue de
38.5°C, siendo la más baja en comparación con las p ilas de 60% de contenido de residuos
de plaza, lo cual es un indicativo de una fase mesofílica más prolongada (Figura 7). Lo
anterior es consecuencia de que una de las pilas no fue inoculada el día de su montaje sino
que su degradación se dio por la flora microbiana natural de los residuos retardando la
mineralización de los componentes. Sin embargo, en el transcurso del tiempo hasta la
semana ocho las pilas de 50% de residuos de plaza conservaron temperaturas más altas
respecto a las otras pilas y adicionalmente una etapa termofílica de mayor rango térmico que
inició a partir de la segunda semana (temperatura superior a 40°C) con una duración de 52
días. Lo anterior en consecuencia a que la proporción de material celulósico representado en
podas fue mayor contribuyendo a la retención de calor en la pila. Al ser las podas un material
de mayor porosidad permite la entrada de oxígeno y por ende aumenta el metabolismo
microbiano aerobio de carácter exotérmico.
Comportamiento de Temperatura
3035404550556065707580
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (Semanas)
Tem
peratura °C
50% Residuos plazaDS ± 10,33
60% Residuos plaza(1 Proceso) DS ± 5,86
60% Residuos plaza(2 Proceso) DS ± 4,93
Figura 7. Comportamiento de temperatura durante el proceso de compostaje.
Tanto en el en el primer proceso como en segundo proceso de compostaje no hubo un
descenso significativo del pH (Figura 8). Lo anterior debido a la aplicación de cal directa a
los residuos de plaza en cantidad suficiente para neutralizar los ácidos producidos durante la
descomposición, excepto en la fase mesofílica de las pilas control durante la cual se da la
mayor producción de ácidos orgánicos. Para este caso el valor mínimo de pH fue de 5,62;
valor que a pesar de ser ácido es tendiente a la neutralidad ya que el material fermentable
produce una reacción alcalina debido a la formación de amonio resultante de la degradación
de proteínas y aminoácidos por procesos de amonificación como desaminación oxidativa y
la descomposición de otros residuos nitrogenados como la urea (Comando, 2006).
Figura 8. Comportamiento de pH durante el proceso de compostaje.
Tanto en el las pilas del primer y segundo compostaje con un contenido de residuos de
plaza del 60% no fue evidente la fase mesofílica del compostaje teniendo como
temperaturas de inicio 50.6 y 47.6°C respectivament e (Figura 7), sin descenso de pH por los
factores anteriormente mencionados. Lo anterior indica una baja supervivencia de los
microorganismos mesofilos. Estas temperaturas favorecieron la activación de
microorganismos termofilícos propios del inóculo con la ulterior expresión de la actividad
enzimática, la degradación de los residuos y el aumento súbito de la temperatura (Rueda et
al., 2001). La temperatura y el pH varían según el perfil de los residuos a compostar
(Tchobanoglous et al., 1996). La ausencia de una fase mesofílica en los tratamientos con
60% de residuos de plaza se debe a que la proporción de residuos de plazas fue mayor que
en las otras pilas que contenían 50% de este tipo de residuo. Los residuos de plaza poseen
fuentes sencillas de azúcares y proteínas accesibles tanto para los microorganismos del
inóculo como para la flora microbiana nativa del residuo.
Al término del proceso se observó que el compost no alcanzó su fase de estabilización y/o
maduración, pues hasta la semana ocho las temperaturas fueron características de una
etapa termofílica aunque en la semana seis la temperatura descendió 10°C en promedio. De
esto se infiere, que en este proceso de compostaje fueron predominantes microorganismos
termófilos entre bacterias esporoformadoras y actinomycetes termofílicos encargados de
degradar la celulosa, almidón y proteínas. Además, también se puede concluir que por el
alto contenido de residuos de plaza (ricos en carbono) en la semana ocho aún se
encontraban remanentes de este tipo sin degradar y por esta razón la temperatura no
decreció. Lo anterior coincide con la alta actividad amilolítica del inoculo utilizado indicando
actividad microbiana aún a esta temperatura.
La relación existente entre el pH y la temperatura del proceso es confirmada con el
coeficiente de correlación para las pilas del primer proceso de compostaje con valores de
0.90 y 0.45 respectivamente, los cuales indican una correlación positiva entre los dos
parámetros (Anexo 6). Para las variables de temperatura y pH el valor de desviación
estándar de las pilas correspondientes al 50% de residuos de plaza fue mayor (DS ±10.31; ±
1.14) con respecto a las pilas con un 60% de residuos de plaza; debido a la fase mesofílica
que se presentó en la primera semana de proceso. Lo anterior refleja que la adición de una
menor cantidad de material orgánico en las pilas tiene un efecto directo sobre el desarrollo
de la flora microbiana responsable de la biodegradación y por ende sobre el aumento de
temperatura que debe presentarse ante la adición del inóculo acelerador. Los valores de
desviación estándar de las pilas del 60% de residuos de plaza tanto del primer como del
segundo proceso son menores respecto al promedio de los datos confirmando que la adición
de un porcentaje mayor de materia orgánica promueve la multiplicación de los
microorganismos con actividad enzimática específica para este tipo de residuos y por ende
el inicio temprano de la fase termofílica.
6.3Análisis físico químico del compost
En el análisis de resultados se evaluaron los parámetros de humedad, nitrógeno orgánico,
fósforo, calcio, magnesio y potasio en las pilas del primer y segundo compostaje. Estos
parámetros fueron comparados con los valores establecidos según Gómez, 2000 y la
ICONTEC, 2004 (Tabla 16).
Tabla 16. Parámetros físico químicos de las pilas de compostaje.
Parametro 50% residuos
de plaza
60% residuos de plaza
(1 proceso)
60% residuos de plaza
(2 proceso)
Valor establecido
Humedad % 48,6 49,3 42 Máximo 35%
ICONTEC, 2004
Nitrogeno
total %
2,83 2,42 1,62 ND (2-3% Gómez,
2000)
Fosforo
P2O5%
1,55 1,46 1,03 ND (1% Gómez,
2000)
Calcio CaO% 4,08 5,71 3,31 ND (6% Gómez,
2000)
Magnesio
MgO%
1,14 1,87 1,04 ND (0.6% Gómez,
2000)
Potasio K 2O% 2,77 2,54 2,01 ND (0.5% Gómez
2000)
Fuente: ICONTEC, 2004., Gómez, 2000 y Autores, 2007.
Las pilas de compostaje del primer y segundo proceso exceden el porcentaje de humedad
establecido por el ICONTEC para su venta (35%) (Tabla 16). Esto se debe a que en épocas
lluviosas y donde la temperatura ambiente es menor no se favorece la perdida de humedad
por evaporación de agua, sin embargo, no se descarta que las diferencias entre de los
materiales de soporte hayan tenido efecto sobre la humedad. Pues en el momento del
montaje de las pilas tanto como la cascarilla de arroz como las podas estaban húmedas
debido también al fenómeno invernal.
Por otro lado, el nitrógeno total esta constituido por nitrógeno orgánico e inorgánico. El
porcentaje de nitrógeno orgánico, el cual constituye la mayor parte del elemento en el suelo
supera el 98%, por esta razón es posible asumir el nitrógeno total como nitrógeno orgánico.
Un abono orgánico de buena calidad posee entre el 2 y el 3% de nitrógeno orgánico
(Gómez, 2000) (Tabla 16). Por esta razón, se puede inferir que todas las pilas del primer y
segundo proceso de compostaje tienen un porcentaje óptimo de nitrógeno orgánico. Solo las
pilas del segundo proceso tienen un promedio de 1.62%, el cual es muy cercano a 2.
De igual forma, el analisis fisico quimico incluye la concentración de macronutrientes de
interes en el compost como fosforo, potasio, magnesio y calcio (Figura 9) Según Gómez,
2000 el porcentaje de fosforo debe ser 1% (Tabla 16) y en el compostaje se encontraron
valores superiores. El fosforo, luego del nitrógeno, es el macronutriente que en mayor
medida limita el rendimiento de los cultivos agrícolas. Interviene en numerosos procesos
bioquímicos a nivel celular y se lo considera un nutriente esencial para las plantas (Berardo,
1999).Por otro lado, el valor de potasio en el compost debe ser del 1%. En las pilas del
primer compostaje se observaron valores superiores a 1%, mientras que en las pilas del
segundo compostaje se observo el valor sugerido por Gómez, 2000. El potasio interviene
fisiológicamente en los siguientes procesos: síntesis de azúcar y almidón, traslado de
azucares, síntesis de proteínas en interviene en la estimulación enzimática (Rodríguez,
1992). No hay excesos de potasio que produzcan toxicidad en la planta, puesto que serían
necesarias cantidades muy grandes de abono. Los abonos potásicos no tienen efecto sobre
el pH del suelo, pero niveles excesivos de potasio inhiben la rapidez con la que el Calcio,
Magnesio y Manganeso puedan ser absorbidas por la planta (Lazcano-Ferrat y Herrera,
2007)
El magnesio tiene una dinamica muy compleja en el suelo y de modo general se puede
lixiviar más fácilmente que el calcio, por lo que si proviene de abonos orgánicos tiene menos
peligro de pérdida. En los tejidos vegetales el contenido de magnesio es mayor que el calcio
(Gómez, 2000). Según Gómez, 2000 el magnesio en las pilas de compostaje no debe
sobrepasar el 0,6% (Tabla 16) y las pilas de compostaje del primer y segundo proceso
superan este valor. Sin embargo, el porcentaje de potasio de las pilas del segundo
compostaje es el mas cercano al valor establecido (Figura 9). Fisiológicamente, el magnesio
forma parte de la clorofila interviniendo en los proceso fotosinteticos de la planta (Lazcano-
Ferrat y Herrera, 2007). El exceso de desplaza otros cationes, calcio y potasio (Ca, K) sobre
todo, y provoca la compactación de los suelos, que a menudo tienen tendencia a perder su
cohesión y a convertirse en cenagosos. Además el exceso de magnesio frena la absorción
del nitrógeno (Porta, et al., 1994)
El porcentaje sugerido para calcio en compostaje es de 6% según Gómez, 2000 (Tabla
16).En este caso, las pilas del segundo proceso de compostaje tuvieron un porcentaje bajo
en comparación con las del primer proceso (Figura 9). El calcio, además de ser un elemento
esencial para las plantas vasculares, juega un papel importante en la estructura del suelo.
Se encuentra muy bien vinculado a partes estructurales de los tejidos vegetales, por lo que
es de mediana disponibilidad, vinculado entonces a la fracción soluble de los recursos
orgánicos (Rodriguez, et al., 2006)
% Humedad % Nitrógeno orgánico
50%
res
i
60%
res
i
60%
res
i20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
% H
umed
ad
50%
res
i
60%
res
i
60%
res
i0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
% n
itróg
eno
orgá
nico
% Fósforo % Potasio
Desviación Estándar 17,5 15,6 17,3 P: 0.84
Desviación Estándar 0,08 0,17 0,81 P: 0.056
50%
resi
60%
resi
60%
resi
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
% f
ósfo
ro
50%
resi
60%
resi
60%
resi
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
2,8
3,2
3,6
4
% p
ota
sio
% Calcio
% Magnesio % Calcio
50%
res
i
60%
res
i
60%
res
i
1,2
1,8
2,4
3
3,6
4,2
4,8
5,4
6
6,6
% c
alci
o
50%
res
i
60%
res
i
60%
res
i0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
% m
agne
sio
Figura 9. Porcentaje de humedad, nitrógeno orgánico, potasio, magnesio y calcio total de las pilas de
compostaje del primer proceso y segundo proceso
Finalmente, al calcular las desviaciones estándar para cada tratamiento, se observó como
generalidad que los datos pertenecientes al tratamiento con 60% de residuos de plaza en el
segundo proceso de compostaje, poseen datos extremos en todos los parámetros físico
químicos. Es decir, los valores para cada parámetro en el segundo proceso se encontraron
más alejados de la media aritmética en comparación con los datos del primer compostaje
(Figura 9). Al llevar a cabo un ANOVA con el fin de comparar los tratamientos evaluados
(Anexo 6), se observo que existen diferencias estadísticamente significativas en el
contenido de nitrógeno orgánico entre las pilas del primer y segundo compostaje
probablemente por pérdidas por volatilización (Rodriguez et al., 2006). Sin embargo, este
parámetro no fue medido al momento del procesamiento de la muestra. Eghball et al. 1997
refieren que el 92 % de las perdidas de nitrógeno se deben a la volatilización del amoníaco.
Desviación Estándar 0,09 0,10 0,61 P: 0,24
Desviación Estándar 0,31 0,45 0,92 P: 0.36
Desviación Estándar 0,42 1,14 2,06 P: 0.17
Desviación Estándar 0,19 0,53 0,59 P: 0.15
El ascenso del pH, las elevadas temperaturas y la deshidratación de la masa de residuos
ocurridas hacia el final del proceso, favorecieron estas perdidas (Atallah et al., 1995)
Por otro lado, los tratamientos no tuvieron diferencias estadísticamente significativas en
cuanto a porcentaje de humedad, fósforo, calcio, magnesio y potasio (Anexo 6) a diferencia
del estudio de Rodríguez et al., 2007 donde se encontraron diferencias significativas en el
fósforo, nitrógeno total, humedad y potasio en pilas con el 55% de residuos de plaza y
fósforo, potasio y nitrógeno en pilas con el 50% de residuos de plaza.
6.4 Estandarización del método de extracción-concen tración
Para la detección de Rotavirus por la técnica de ELISA e inmucromatografía primero fue
necesario llevar a cabo un proceso de extracción y concentración viral. Primero se tomaron
5 gramos de cada pila de compostaje para llevar a cabo la evaluación individual de cada una
de ellas. Esta cantidad de muestra no se considera representativa teniendo en cuenta el
tamaño de las pilas. Según Lichtenberg, 1988 el tamaño de muestra para la extracción de
virus en muestras de lodos municipales y sedimentos debe ser de 300 a 800ml y para la
recuperación de virus a partir de suelo recomienda 50g de muestra.
En la extracción de las partículas virales se utilizó extracto de carne al 10%, las proteínas del
extracto de carne van a ocupar el sitio de unión de los virus, por lo que posteriormente en el
proceso de concentración los virus no quedan unidos al compost y se obtiene una mayor
cantidad de estos en el sedimento. En una serie de experimentos comparativos llevados a
cabo por Landry et al., 1978 usando agua contaminada con poliovirus tipo 1, la elución con
extracto de carne fue superior al proceso de elución llevado a cabo con glicina con
porcentajes de recuperación entre 60 y 91%; mientras que el porcentaje de recuperación con
glicina fue de 35%.
El extracto de carne juega un papel importante en la elusión de virus mediante interacciones
hidrofóbicas con sustancias orgánicas; es una molécula orgánica de gran tamaño capaz de
romper las interacciones entre partículas virales y superficies de la muestra. De igual forma
el pH alcalino (9) aumenta la repulsión electrostática entre los virus y superficies mediante la
deprotonización de los sitios ionizables de ambos. (Williamson et al., 2003; Lucena et al.,
1999).
En el estudio de Ahmed y Sorensen, 1999 donde se evalúan diferentes técnicas de
extracción y concentración viral en lodos demuestran que las técnicas donde se logra la
mayor recuperación viral son aquellas donde se utiliza el extracto de carne en diferentes
concentraciones en cada una de ellas (10, 7, 3%) demostrando que este compuesto
contribuye a la recuperación de agentes virales. Posterior a la adición de extracto de carne
a pH alcalino, se llevó a cabo vortex y una sonicación en frio la cual ayuda a la elusión viral,
al rompimiento de floculos, partículas y células presentes en la muestra (Lichtenberg, 1988).
Después, se llevó a cabo una centrifugación a 4°C c on el fin de clarificar la solución que
contiene el virus eluido por sedimentación de las partículas presentes en la muestra, como
restos de podas y materia prima del compostaje.
Posterior al proceso de extracción se llevó a cabo la concentración viral de las muestras
usando polietilenglicol 6000 (PEG 6000). El polietilenglicol es químicamente inerte, no tóxico,
soluble en agua y con capacidad de precipitar proteínas; este compuesto actúa como una
“esponja inerte” que excluye proteínas de un solvente, incrementando su concentración
hasta que excede la solubilidad causando la precipitación proteica (Lewis y Metcalf, 1988).
Las proteínas más cargadas o hidrofóbicas son más fáciles de precipitar en comparación a
las de menor carga con lo cual se puede inferir que las proteínas de mayor tamaño pueden
ser precipitadas a bajas concentraciones de polietilenglicol. La proteína VP6 detectada por
las pruebas comerciales de ELISA e ICT, es altamente hidrofóbica (Rodríguez, 2005), y el
polietilenglicol la precipita con facilidad concentrándola en el sedimento. Esta técnica ha
sido ampliamente utilizada para la recuperación de agentes virales a partir de aguas, ostras,
sedimentos, lodos y biosólidos (Belguith et al., 2006; Ahmed y Sorensen, 1999; Lewis y
Metcalf, 1988). El polietilenglicol en concentraciones por encima del 8%, concentra la
mayoría de virus infecciosos en la fase del sedimento y solo una pequeña cantidad de virus
biológicamente activos quedan en el sobrenadante (Sarmiento et al., 1999).
Se puede inferir, que el proceso de extracción y concentración fueron efectivos puesto que
se detecto Rotavirus mediante la prueba de ELISA e ICT posteriormente
6.5 Montaje del control positivo y negativo del com post
Posterior al proceso de extracción y concentración llevado a cabo con los controles, se
determinaron las absorbancias del control negativo y positivo en la prueba de ELISA
encontrándose una absorbancia de 1.653 la cual es mayor al límite superior de la zona gris
(0.15) indicando un resultado positivo para rotavirus; mientras que el control negativo arrojo
un valor de 0.05, el cual es menor al límite inferior de la zona gris (0.13), sugiriendo que el
compost sin inocular fue negativo para rotavirus. De igual forma, en la prueba de ICT, el
control positivo del compost fue positivo para rotavirus y el control negativo fue negativo
para rotavirus.
De lo anterior, se deduce que el método de extracción descrito por Ahmed y Sorensen, 1995
y el método de concentración descrito por Lewis y Metcalf, 1988 y modificado para nuestro
estudio, son métodos con los cuales se logra la recuperación de rotavirus a partir de
muestras de compost. Además, el montaje del control positivo y negativo del compost, le da
validez a los resultados obtenidos por ELISA e ICT ya que fueron usados como puntos de
comparación en los resultados del primer proceso de compostaje
6.6 Detección de Rotavirus por Inmunocromatografía y ELISA
Para la detección de Rotavirus en las muestras de compostaje analizadas se utilizó una
técnica de análisis inmunoenzimático (PATHFINDERTM Rotavirus BIORAD) con anticuerpos
monoclonales que detectaron determinantes antigénicos (VP6) del Rotavirus del grupo A. Se
ha reportado que esta prueba detecta aproximadamente 105 partículas virales/ml (Nusetti, et
al., 2001). Este dato es importante teniendo en cuenta que se sabe que la dosis mínima
infecciosa de Rotavirus reportada es de 102 partículas virales/ml (Richards, 1999; Beuret et
al., 2002; Lodder y Roda Husman, 2005). El kit de ELISA detecta aproximadamente 105
partículas/g; por lo que no se puede asegurar que las muestras analizadas estaban libres de
estos patógenos; ya que el Rotavirus pudo estar presente en concentraciones bajas,
menores de 105 partículas virales/g.
El análisis de virus entéricos en el compost se realizó buscando la presencia de Rotavirus
del grupo A, que de acuerdo a la literatura, es el virus entérico de mayor prevalencia a nivel
mundial y que ataca tanto hombres como animales. El hecho de que muchos de los
antígenos de neutralización de las cepas de rotavirus humanos del grupo A se hayan
encontrado también en animales y la posibilidad de que algunas cepas de rotavirus de
origen animal puedan infectar humanos y viceversa ha hecho que se considere a la
transmisión interespecie y la subsecuente reasociación de segmentos genómicos una de las
fuerzas impulsoras de la evolución de estos virus. La infección de humanos a partir de
animales sería un evento más bien raro aunque en algunas zonas geográficas restringidas,
cepas originadas de la reasociación humano-animal pueden ser muy prevalentes como las
humano-bovino de la India y las humano-cerdo de Brasil (Gouvea, 1994).
Este es el virus entérico que más fácilmente se determina con pruebas comerciales. Para la
detección viral se utilizó un kit de ELISA (PATHFINDERTM Rotavirus BIORAD), que al
detectar las partículas virales producía un color azul en caso de que el anticuerpo
reaccionara con la proteína VP6 presente en la cápside viral siendo esta una evaluación
colorimétrica cualitativa de la presencia de Rotavirus (Figura 9).
Figura 10. Determinación colorimétrica de la presencia de Rotavirus. (a) resultado positivo (b) resultado
negativo
Durante la primera semana del primer proceso de compostaje se obtuvo un 100% de
muestras positivas en las pilas con 50 y 60% de residuos de plaza, indicando que la
temperatura y el pH en esta semana no son suficientes para la destrucción viral (Tabla 17).
En el caso de las pilas con 50% de residuos de plaza, la temperatura alcanzada de 38.5°C y
el pH de 5.6 no tienen un efecto significativo sobre las partículas de Rotavirus, ya que este
agente puede retener su infectividad hasta siete meses a temperatura ambiente (Morris et
al., 1975) y su supervivencia a pH ácido y neutro es mayor que a pH alcalino teniendo en
cuenta las características de las partículas virales. Las condiciones óptimas para el
compostaje están dadas por niveles de pH de 5.5- 8.0 y contenidos de humedad entre el 40
y 60% (Avendaño, 2003). Estos factores ambientales juegan un papel secundario en la
inactivación viral durante el compostaje ya que las condiciones anteriormente mencionadas
no son perjudiciales para los virus entéricos. Teniendo en cuenta lo anterior, el pH y el
contenido de humedad pueden afectar la supervivencia viral solo al influenciar la
multiplicación y subsiguiente actividad metabólica de las bacterias y hongos nativos del
compostaje que al degradar material proteináceo producen amonio. El amonio en altas
concentraciones puede afectar la viabilidad viral incrementando el pH durante el proceso de
estabilización orgánica (Guardabassi et al., 2003). Para las pilas con 50% de residuos de
plaza existe una correlación negativa entre la presencia viral y el pH con coeficientes de
correlación de -0.88 y -0.96 para la prueba de ELISA e Inmunocromatografía
respectivamente (Anexo 6). Lo anterior indica que un aumento de pH causa un descenso en
la presencia viral. De igual forma sucede en el caso de las pilas con 60% de residuos de
plaza durante el primer proceso; donde se presentan coeficientes de correlación de -0.63 y -
0.32 que indican una correlación débilmente negativa en comparación con las anteriores.
Tabla 17. Proporción de muestras positivas en el primer proceso de compostaje por los dos
metodos de detección (ELISA e ICT), pH y temperatura promedio
Semana
1
Semana
2
Semana
3
Semana
4
Semana
5
Semana
8
ELISA 6/6* 1/6 0/6 0/6 1/6 3/6
Inmunocromatografía 6/6 1/6 0/6 0/6 1/6 0/6
Temperatura °C 44.5 60.6 67.2 65.5 67.3 58.2
pH 6.46 7.25 7.9 8.15 8.08 8.22
*Número de muestras positivas/Número de muestras analizadas
Además de la temperatura y el pH, la actividad microbiana del compostaje puede ser un
factor importante en la inactivación viral. Como resultado de la presencia de compuestos
orgánicos nitrogenados durante el proceso de biodegradación; la flora microbiana del
compostaje libera enzimas proteolíticas que en determinado momento pueden alcanzar las
cápsides virales compuestas por proteínas y por ende son susceptibles a esta acción
enzimática. Desafortunadamente no hay datos sobre la susceptibilidad de las proteínas
virales a las condiciones prevalentes en las pilas de compost, sin embargo según Van
Soelen, 2007 los virus pueden convertirse en una fuente proteica para bacterias.
Durante las seis semanas siguientes de compostaje el pH fue tendiente a la alcalinidad en
un rango entre 7.8 – 8.8. En este rango los iones NH4+ liberan un protón causando la
volatilización de amonio. La combinación de los altos valores de pH y la producción de
amonio reducen los títulos virales de poliovirus y Rotavirus en al menos cuatro unidades
logarítmicas (Monphoeho et al., 2004; Ahmed y Sorensen, 1995). La inactivación por amonio
a pH mayores a 8 causa la fragmentación del RNA como fue demostrado por Monphoeho et
al., 2004 quien sugiere que el mecanismo de acción del amonio está limitado a la proteólisis
de la cápside viral y su infiltración en el genoma, sin descartar la acción otras sustancias
capaces de degradar el RNA. De igual forma a pH ácido hay un aumento en el fenómeno de
adsorción viral por la presencia de cationes monovalentes o divalentes (Sobsey et al., 1980).
La inactivación de virus durante el proceso de compostaje está determinada por una
combinación de factores químicos, físicos y biológicos. La causa más importante de
inactivación viral es el calor generado durante la fase termofílica de compostaje (Monphoeho
et al., 2004) y en menor grado la inactivación se debe a degradación microbiana y
producción de amonio. Los mecanismos anteriores interactúan de manera simultánea
durante el compostaje; atribuyendo así la inactivación viral a una relación sinérgica entre
ellos, más que a una acción individual de cada mecanismo (Guardabassi et al., 2003).
Es importante anotar que esta prueba de ELISA no es cuantitativa, motivo por el cual se
informa positivo o negativo, sin embargo, su lectura se realiza en unidades de absorbancia.
Al examinar los resultados, los controles positivos sobrepasan las 1.5 unidades, la semana 1
los valores están entre 1 y 1.5 unidades y para la semana 4 los valores ya están cercanos al
punto de corte, lo cual hace sospechar de una disminución progresiva de la cantidad de
partículas virales (Anexo 7).
En el montaje de las pilas fue necesaria la adición de cal (CaOH2) con el fin de contrarrestar
la acidificación excesiva del material compostar. El agregar este compuesto mantiene el pH
en un rango de neutro a alcalino y pudo tener un efecto virucida tal como se reporta en el
estudio de Mohaibes et al., 2004 quien plantea la adición de hidróxido de calcio como un
método de eliminación de patógenos.
La concentración de calcio es directamente proporcional a la tasa de inactivación de virus; el
tratamiento con cal reduce el número de microorganismos y partículas virales ya que se une
al material sólido facilitando la floculación y sedimentación sumado al aumento de pH
(Hansen et al., 2007). Por lo tanto se infiere en los lixiviados que se generan a partir de las
pilas de compostaje en el relleno sanitario se pueden encontrar virus entéricos. De igual
forma este mismo autor sugiere el uso de la estabilización con cal para la reducción de
adenovirus tipo 5, Rotavirus Wa y bacteriófagos en lodos y en el biosólido resultante. Sin
embargo, según el estudio de Parreño en el 2003 el Rotavirus mantiene su infecciosidad
durante meses en ambientes húmedos, a temperaturas entre los 4 y 20°C y en presencia de
iones calcio que estabilizan su capside externa.
Para ambos métodos de detección hay una correlación negativa entre la presencia viral y la
temperatura, es decir, estos dos últimos son inversamente proporcionales. En el caso de las
pilas control los coeficientes de correlación son de -0.98 y -0.96 para la prueba de ELISA e
Inmunocromatografía respectivamente. Lo anterior también ocurre en las pilas del 60% de
residuos de plaza en el primer proceso donde los coeficientes de correlación son de -0.66 y -
0.90 expresando una mayor correlación en contraste con la correlación con el parámetro de
pH (Anexo 6). Esto establece la existencia de un efecto directo de la temperatura y del pH
aunque en menor proporción de este último sobre la presencia de Rotavirus en el proceso
de compostaje.
Se ha demostrado que temperaturas de 50°C simuladas en equipos de pasteurización, son
suficientes para reducir un titulo viral de Rotavirus (1.4×107 PFU/ml) en una unidad
logarítmica, el valor D (tiempo de reducción decimal) a esta temperatura es de 8 minutos
(Mahony et al., 2000). Esto explica la positividad de las muestras tomadas a esta
temperatura sumado a la existencia de compuestos que protegen las partículas virales. Un
grupo de componentes presentes en los lodos y que son concentrados por desecación son
los detergentes los cuales han mostrado proteger los virus entéricos del calor. Sin embargo,
el compostaje causa una reducción considerable en la concentración de detergentes
provenientes de la materia orgánica luego de varias semanas de proceso (Ward y Ashley,
1978; Monphoeho et al., 2005).
En el rango de temperatura mesofílica otro factor que contribuye a la supervivencia viral es la
adsorción de las partículas virales a los sólidos. Los compuestos orgánicos solubles
compiten con los virus por los sitios de unión en las superficies minerales, mejorando el
movimiento de las partículas virales (Chu et al., 2003).
En la segunda semana del primer proceso de compostaje solo se obtuvo un 17% de
positividad para Rotavirus siendo este un indicativo de que los procesos físicos y químicos
propios del compostaje tienen efecto sobre la viabilidad viral. A partir de esta semana es
evidente un aumento de la temperatura con valores de 58.13°C para las pilas con 50% de
residuos de plaza y 63.03°C para las pilas del prim er compostaje con 60% de residuos de
plaza mostrando una reducción del 93% en las muestras positivas. Posteriormente en las
semanas 3 y 4 la totalidad de las muestras fueron negativas, lo cual indica que el proceso
logró la denaturación de la proteína de la cápside afectando la viabilidad de las partículas
virales.
La destrucción viral dentro del compostaje pudo presentarse por la producción de sustancias
como ácidos y fitotoxinas resultado de la actividad microbiana que eliminan una parte de las
poblaciones de patógenos o bien por la acción de enzimas proteolíticas liberadas por los
microorganismos que actúan sobre la cápside viral durante la degradación de los residuos
(Turner, 2001; Guardabassi et al., 2003).
En la semana 5 y 8 reaparecen muestras positivas (Tabla 16) lo cual sugiere la
contaminación del compost por herramientas de trabajo en el proceso de los volteos
manuales, ya que al ser las últimas semanas del proceso donde la temperatura se ha
mantenido por encima de los 50°C la probabilidad de detectar Rotavirus es baja. Sin
embargo, la ubicación de la zona de compostaje dentro del relleno sanitario favorece el
descenso de las aguas lluvias que provienen de la zona de acumulación de los residuos
municipales como también la formación de aerosoles dentro de la misma.
En el relleno sanitario de Bioagrícola del Llano EPSP se lleva a cabo la recepción de toda
clase de residuos. En caso de precipitación la lluvia se infiltra en el relleno sanitario
arrastrando consigo las partículas virales entre otros microorganismos; en ocasiones se
presentaron zonas inundadas cerca de la zona de compostaje siendo estas posibles
contaminantes de las pilas de compost. Los patógenos como los virus entéricos pueden
persistir en el agua, no crecen ni se proliferan en ella pero pueden acumularse en
sedimentos, que después se movilizan cuando la corriente de agua aumenta (Gratacab,
2000).
Igualmente dentro del relleno sanitario y como consecuencia de la acumulación de basuras
es posible que se hayan generado bioaerosoles los cuales en determinado momento
pudieron contribuir a la aparición de muestras positivas. De manera general los hongos y los
virus son más resistentes a la inactivación que las bacterias y que el contenido lipídico de los
virus tiende a ser más estable en condiciones de baja humedad relativa (Brooks et al., 2004)
sumado a que pueden asociarse al material particulado según el lugar de origen ; por lo
tanto se puede afirmar que el Rotavirus puede utilizarse como indicador de generación de
aerosoles ya que los reovirus han sido constantemente hallados constituyéndose así como
posibles indicadores de los virus entéricos aerozolizables (Carducci et al., 2000).
Debido a su capacidad de adsorción a materiales porosos y no porosos, las herramientas de
trabajo utilizadas para los volteos manuales de las pilas de compost pueden ser un medio de
transporte de partículas virales siendo está otra posible causa de las muestras positivas
encontradas en las últimas semanas del proceso.
En cuanto a la comparación de muestras positivas en las pilas del primer proceso de
compostaje; según la probabilidad (0.5318; p=0.05) no existen diferencias estadísticamente
significativas entre los porcentajes de residuos de plaza utilizados en cada uno de ellos.
(Anexo 6).
En las materias primas utilizadas en el primer proceso de compostaje, el rumen fue positivo
para Rotavirus a diferencia de las otras materias primas utilizadas (Tabla 18) esto puede ser
atribuido a la naturaleza de los componentes del contenido ruminal. Este residuo está
compuesto en su mayoría por materia orgánica y en menor proporción fue posible observar
restos de tejido en los cuales el Rotavirus puede adsorberse a las células y permanecer allí
sin replicarse pero manteniendo su viabilidad. De igual manera pueden sobrevivir fuera de
las células mediante fenómenos de adsorción a sólidos; los virus no pueden multiplicarse
fuera de una célula huésped (enterocitos) pero son capaces de permanecer por largos
periodos de tiempo si no se aplica un proceso de estabilización adecuado a este tipo de
residuos. El Rotavirus puede sobrevivir en residuos de origen animal a temperatura
ambiente por más de seis meses (Constantini et al., 2005).
Tabla 18. Detección de Rotavirus por ELISA e ICT para las materias primas
MATERIAS
PRIMAS
Cascarilla de
arroz
Podas Contenido
Ruminal
Residuos de
Plaza
ELISA Negativo Negativo Positivo Negativo
ICT Negativo Negativo Positivo Negativo
Fuente: Autores, 2007
Rotavirus bovino grupo A fue identificado, caracterizado y confirmado como agente causal
de diarreas en terneros, por primera vez, por Mebus et al., 1969. Actualmente se lo
considera el principal agente patógeno productor de diarreas en terneros menores de tres
semanas de vida, en todo el mundo. Respecto de los otros grupos, se ha reportado la
circulación de Rotavirus grupo B y C en bovinos de Japón y Estados Unidos Rotavirus grupo
B ha sido detectado en terneros y esporádicamente asociado con diarrea neonatal pero se
encuentra especialmente involucrado en brotes de diarrea epizoótica en ganado adulto y
finalmente Rotavirus grupo C fue aislado a partir de un caso de diarrea en bovinos adultos
en Japón. Según lo anterior las probabilidades de encontrar Rotavirus en contenido ruminal
son mayores que las probabilidades de encontrar el virus en residuos de plaza porque los
animales enfermos excretan grandes cantidades de Rotavirus (del orden de 108-1010
partículas infecciosas/ml) en sus heces sobreviviendo en estos excrementos y medio
ambiente durante largos periodos de tiempo gracias a mecanismos anteriormente
mencionados. Se ha comunicado mayor prevalencia del grupo A en los bovinos en donde
pueden causar desde infecciones asintomáticas hasta cuadros de diarrea con pérdida
abundante de líquido y desbalance electrolítico. La diferente presentación se atribuye a la
variación en la virulencia de las cepas, edad de los animales, estado inmunológico, dosis
infectante, estrés ambiental, así como infecciones asociadas (Valdivia et al., 2000)
Otro factor a tener en cuenta es el almacenamiento y conservación de las materias primas;
Pesaro et al., 1995 afirma que es posible obtener una reducción en la carga viral mediante el
almacenamiento de materias primas animales siempre y cuando se recurra a un tiempo de
almacenamiento prolongado. Esto especialmente para virus no envueltos como picornavirus,
adenovirus, parvovirus y Rotavirus, siendo este último más resistente a la inactivación por
almacenamiento de materias primas animales explicando así la aparición de Rotavirus en el
contenido ruminal utilizado en el primer proceso de compostaje. El almacenamiento del
rumen, se lleva a cabo en Bioagrícola del Llano en un contenedor donde permanece por un
tiempo máximo de 15 días, el cual no es considerado un tiempo de almacenamiento
suficiente para obtener una reducción en la carga viral.
Por el contrario no se encontró Rotavirus en otras materias primas como son los residuos de
plaza, cascarilla de arroz y podas siendo esto un indicativo de que las materias primas de
origen vegetal no aportan carga viral al proceso de compostaje como si lo hacen las
materias primas de origen animal.
Teniendo en cuenta los resultados estadísticos (p: 0,6889 para el 50% de residuos de plaza
y p: 0,7488 para el 60% de residuos de plaza con un p: 0.05) se afirma que no existen
diferencias estadísticamente significativas al utilizar la técnica de ELISA o de
inmunocromatografía para la detección de Rotavirus en matriz compost. Sin embargo, para
el caso de la inmunocromatografía hubo muestras negativas que por ELISA fueron positivas
como es el caso de la semana ocho y de una muestra de la semana dos del primer proceso
de compostaje. Esto se debe a que los ciclos de congelación/descongelación son
indeseables considerando que disminuyen la viabilidad del virus. Según Regional Meeting
for the Americas Assesses Progress Against Rotavirus en el 2004, las muestras
sospechosas para Rotavirus deben ser transportadas al laboratorio entre 4 y 8°C y
mantenerlas en este rango de temperatura si la muestra va a ser procesada en un lapso de
siete días a partir de la toma de la muestra. Si el laboratorio va a llevar a cabo, los test de
detección dentro de los dos primeros meses a partir de la recolección, es recomendable
guardar las muestras a -20°C. Pero si las muestras van a ser procesadas después de dos
meses, estas deben ser conservadas a una temperatura de -70°C con el fin de que el virus
no pierda su viabilidad. En este caso, las muestras fueron conservadas a -10°C durante
aproximadamente seis meses, además se llevaron a cabo dos ciclos de
congelación/descongelación porque la prueba de ELISA y la inmunocromatografía no se
realizaron de manera simultanea. La temperatura de transporte de las muestras fue la
correcta, pero la conservación hizo que el virus perdiera su viabilidad y por esta razón las
muestras positivas para ELISA fueron negativas en inmunocromatografía haciendo así más
confiable los resultados obtenidos por la técnica de ELISA. Sumado a que el valor calculado
por Biomerieux S.A para el límite de detección de la prueba de ICT es de 4.105 partículas/mL
de Rotavirus siendo este valor similar al exponente reportado para la técnica de ELISA la
cual fue utilizada por Crehalet et al., 2007 como método de referencia para determinar la
sensibilidad y la especificidad de este método. Esto confirma que no existen diferencias en el
uso de una técnica u otra para la detección de Rotavirus utilizando como matriz compost y
que la prueba de ELISA puede ser utilizada como confirmatoria para la detección de este
agente viral.
Por otro lado, hubo una muestra de la semana dos en el primer proceso de compostaje, que
fue positiva por inmunocromatografía pero no por ELISA, sin embargo el resultado fue
dudoso por la poca pigmentación rosada de la línea de Rotavirus y al repetir la prueba para
confirmar el resultado fue negativo. Esto se debe a contaminación de las herramientas de
trabajo y no a una deficiencia en la especificidad de la prueba. En un estudio llevado a cabo
por Marugán et al., 2006, la detección de Rotavirus por la técnica de ICT en heces, tuvo una
sensibilidad de 89.3% y una especificidad de 100% usando RT-PCR (reacción en cadena de
la polimerasa- transcriptasa reversa) como estándar de referencia. Por esta razón se
considera que el falso positivo observado en el procesamiento de las muestras no pudo
haberse debido a interferencias y reacciones cruzadas de la ICT. La técnica de ELISA es
muy sensible para determinar Rotavirus, aunque requiere un mayor tiempo de
procesamiento de la muestra, un laboratorio más equipado y un personal más entrenado.
Mientras que la inmunocromatografía es rápida, fácil de realizar e interpretar, constituyendo
una técnica accesible para los laboratorios de todo tipo de complejidad (Cuffia et al., 2006).
Actualmente la inmunocromatografía es un método tan utilizado como el ELISA, confirmado
a través de estudios comparativos realizados por otros autores como Wilhelmi et al., 2001.
Es posible que en los muestreos, la muestra sometida a los ensayos (5 gramos por pila), no
contuviera virus, lo cual no excluye que este estuviera en otros lugares del compost teniendo
una distribución desigual del virus en la muestra. Esta variabilidad puede ser atribuida a la
estructura heterogénea de la matriz utilizada y a la no homogeneidad en la distribución de
los microorganismos dentro del compost los virus entéricos infectivos presentes a
concentraciones que van desde 2 a 16 mpncu/g al inicio del compostaje (Comando, 2006).
Con respecto al segundo proceso de compostaje, todas las muestras incluyendo las
materias primas fueron negativas para Rotavirus mediante la técnica de
inmunocromatografía. Posiblemente para el caso del segundo proceso de compostaje, la
presencia de Rotavirus se encontraba en una concentración más baja de 104 partículas
virales/g, la cual es la concentración mínima a la cual los test de ELISA e ICT detectan el
agente viral. También la ausencia de virus en las pilas de compostaje, pudo deberse a las
practicas culturales adoptadas por la empresa después de los resultados positivos del primer
proceso de compostaje, consistentes en la limpieza de las herramientas de trabajo.
Se han estudiado varios grupos de bacteriófagos de bacterias entéricas (colifagos
somáticos, colifagos F-específicos, fagos de Bacteroides fragilis) y de virus de origen
humano (enterovirus y adenovirus humanos) (Puig et al., 1994). Todos ellos presentan
buenas posibilidades pero también inconvenientes para realizar su función como indicador.
Los enterovirus no son excretados de forma regular por la población, y en ausencia de
brotes la mayoría de los enterovirus presentes en el ambiente son poliovirus de origen
vacunal, para los cuales se administra una vacuna oral a edades muy tempranas. Los virus
que se multiplican en el intestino se excretan en las heces y se eliminan en los pañales que
son tratados como residuos sólidos considerados como material no apto para compostar
(Roben, 2002).
Por otro lado, la recuperación de virus a partir de lodos y biosólidos es difícil debido a la
asociación de los viriones a los componentes de estas matrices (Hansen et al., 2007) y las
técnicas de extracción, concentración y detección son costosas en comparación a otras
técnicas para organismos indicadores de contaminación fecal. Las características que debe
cumplir un organismo para poder ser utilizado como indicador fueron descritas por Berg en
1978, entre las cuales se incluye el costo de la metodología para su detección y
cuantificación, la especificidad del test de detección y además afirma que el organismo
indicador no ha de ser patógeno ni comportar riesgo alguno para la salud humana. Además,
para detectar y enumerar virus en muestras ambientales se utiliza cultivo celular o PCR, esta
ultima no determina infectividad y usualmente los números de virus son demasiado bajos
para seguir el desarrollo de procesos de desinfección, potabilización, depuración, entre otros
(Pina, 2000). Por lo anterior, el Rotavirus no debe considerarse como un indicador de la
eficiencia de un proceso de estabilización de materia orgánica como lo es el compostaje.
7.CONCLUSIONES
• Se confirmó que el uso de un inoculante termofílico con actividad amilolítica y
proteolítica incrementa la tasa de degradación de los residuos orgánicos presentes
en las pilas de compostaje obteniendo un abono orgánico según los estándares
establecidos.
• El uso de extracto de carne y polietilenglicol 6000 en las técnicas de extracción y
concentración viral permite la recuperación y detección de partículas de Rotavirus A
por ELISA e inmunocromatografía utilizando como matriz compost.
• Existe una relación inversamente proporcional entre la presencia viral y los
parámetros de temperatura y pH del compostaje ya que temperaturas en el rango de
termofília y valores de pH alcalino causan la inactivación viral, siendo más marcado el
efecto de la temperatura que del pH sobre Rotavirus A.
• Las temperaturas de mesofília y el pH ácido dentro del proceso de compostaje no
tienen efecto sobre las partículas virales de Rotavirus A.
• Las materias primas de origen animal utilizadas dentro del proceso de compostaje
aportan carga viral al proceso en comparación con materias primas de origen vegetal.
• El Rotavirus A no debe considerarse como un indicador de eficiencia de un proceso
de compostaje.
• La presencia de rotavirus en el primer proceso de compostaje no es un indicativo de
la infectividad de las partículas detectadas mediante ELISA e ICT
8. RECOMENDACIONES
• Se sugiere evaluar métodos de esterilización para obtener un control positivo libre de
antígenos.
• Es necesario estudiar la disminución de títulos virales durante el proceso de
compostaje.
• El uso de métodos de detección que determinen la infectividad de las partículas de
rotavirus como el cultivo celular.
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10. ANEXOS
ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO
• Caldo leche al 1% (p/v):
Leche en polvo descremada suplementada con calcio 10g/L, extracto de levadura 2.5 g/L,
peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio 0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5 g/L, fosfato
monobásico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibásico de potasio 0.1 g/L,, pH final 7.0 +/- 0.2.
Autoclavar a 7Lb de presión por 7 minutos. (Pedroza et al., 2004).
• Caldo almidón al 1% (p/v):
Almidón 10 g/L, extracto de levadura 2.5 g/L, peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio
0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5 g/L, fosfato monobásico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibásico de
potasio 0.1 g/L, pH final 7.0 +/- 0.2. Autoclavar a 7Lb de presión por 7 minutos. (Pedroza et
al., 2004).
• Caldo almidón/leche al 1% (p/v):
Leche en polvo descremada suplementada con calcio 5 g/L, almidón 5 g/L, extracto de
levadura 2.5 g/L, peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio 0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5
g/L, fosfato monobásico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibásico de potasio 0.1 g/L, pH final 7.0
+/- 0.2. Autoclavar a 7Lb de presión por 7 minutos. (Pedroza et al., 2004)
ANEXO 2. PROTOCOLO ÁCIDO TRICLOROACÉTICO
1. Preparación de buffer fosfato 0.1M
Preparar cada fosfato por separado de la siguiente manera: pesar 14.2g de Na2HPO4,
disolver en 200mL de agua destilada y pese 12g de NaH2PO4, disolver en 200mL de agua
destilada, mezclar posteriormente, ajustar pH 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000mL con agua
destilada en balón umétrico.
2. Preparación de solución de caseína hidrolizada
Pesar 10g de caseína para 1000mL de Buffer fosfato 0.1M, disolver en baño termostatado a
37ºC durante 1 hora.
3. Preparación del ácido tricloroacético
Pesar 15g de ácido tricloroacético y disolverlo en 100mL de agua destilada.
4. Protocolo de estandarización de la técnica del á cido tricloroacético
Preparación de la solución stock de tirosina 100µmol/mL
• Pesar 0.01g de tirosina en balanza analítica, 0.0052g de NaH2PO4 y 0.0022g de
Na2HPO4.
• Disolver en agua destilada los anteriores compuestos hasta obtener 50mL.
• Enrasar hasta 100mL con agua destilada.
• La soluciones de concentración mas baja (de 10 en 10 hasta 100) se preparan de
acuerdo a la aplicación de la formula V1C1 = V2C2, teniendo en cuenta que el volumen
final de cada una es de 3 ml.
Tabla 1. Preparación de soluciones de tirosina
CONCENTRACIONES SOLUCIÓN STOCK DE TIROSINA
(mL)
AGUA DESTILADA
(mL)
10 0.3 2.7
20 0.6 2.4
30 0.9 2.1
40 1.2 1.8
50 1.5 1.5
60 1.8 1.2
70 2.1 0.9
80 2.4 0.6
90 2.7 0.3
100 3.0 0
Fuente: (Galindo et al., 2005).
Como blanco de la prueba se utiliza una solución que contiene 1mL de solución de caseína
1% (p/v), 1mL de TCA (ácido tricloroacético) y 1mL de Buffer fosfato 0.1M; posteriormente la
mezcla se centrífuga a 5000rpm por 5 minutos. La prueba se lee a 280nm en
espectrofotómetro de luz U.V (Galindo et al., 2005).
ANEXO 3. CURVA PATRÓN DE TIROSINA (ATC)
Se elaboraron tres replicas de la misma solución stock de tirosina con el fin de obtener datos
significativos.
Tabla 1. Curva patron de tirosina
Promedio de las tres réplicas
Concentración (g/L) Absorbancia (280nm)
10 0,3483
20 0,4670
30 0,5320
40 0,6227
50 0,7320
60 0,8310
70 0,9080
Fuente: Autores, 2007
Fuente: Autores, 2007
ANEXO 4. PROTOCOLO TÉCNICA DEL ÁCIDO DINITROSALISÍL ICO (DNS)
(Miller et al., 1959)
1. Actividad Amilolítica
• Preparación del ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS)
Depositar en un beaker de 250mL, 50mL de agua destilada, adicione 1.6g de hidróxido
de sodio y disolver mediante agitación continua en plancha magnética a temperatura
ambiente. Posteriormente adicionar lentamente 43.8g de tartrato de sodio y potasio
hasta que se disuelva por completo. Recubrir el vaso de precipitado con papel aluminio y
agregar lentamente el DNS (1g). Completar con agua destilada hasta 100mL en un
balón aforado. Deje en agitación toda la noche en un frasco oscuro (Miller, et, al 1959).
• Preparación de la solución stock de glucosa 2g/l
Pesar 2g de glucosa anhidra en balanza y disolver en 500mL de agua destilada
utilizando balón umétrico de 1000mL, homogenizar y completar hasta 1000mL con agua.
La solución stock se puede alícuotar y congelar a -20ºC (Miller, et, al 1959).
• Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5 – 2g/l
Empleando la formula de V1C1 = V2C2. Se preparan seis soluciones que tengan un umen
final de 2mL
Tabla 1. Preparación de las soluciones de glucosa
Concentración g/L Solución concentrada de glucosa en mL Agua destilada mL
0.5 0.5 1.5
0.7 0.7 1.3
1 1 1
1.5 1.5 0.5
1.7 1.7 0.3
2 2 0
Fuente: (Miller et al., 1959)
A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas deposite 0.25 mL de
cada una en tubos de 13 x 100 mm y siga el protocolo descrito de la tabla 2.
Tabla 2. Curva de calibración de Glucosa
CONCENTRACIÓN g/L REACTIVO BLANCO
0 ½ 1 1/2 2 4 6 ..
Glucosa (mL) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua (mL) 0.25 - - - - - -
Reactivo DNS (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en hielo
Agua 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Proteja los tubos de luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a 540 nm contra blanco
DNS
Fuente: (Miller et al., 1959)
2. Preparación de almidón al 1% (p/v) en Buffer fosfato 0.1M
Pesar 1g de almidón hidrosoluble y disolverlo lentamente en 50mL de Buffer fosfato 0.1M,
caliente la solución en horno microondas por 1 minuto, ajustar el pH 7.0 +/- 2.0 y enrasar a
100mL con Buffer fosfato 0.1M, en balón volumétrico.
2.1 Reacción Enzimática de Almidón al 1% (p/v) en buffer fosfato O.1M
Tomar 3mL del extracto crudo correspondiente a las horas de fermentación a determinar, y
realizar el protocolo presenta en la (tabla 3).
Tabla 3. Reacción enzimática con almidón al 1% p/v en buffer fosfato 0.1M
REACTIVO REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 3
Almidón al 1% p/v Buffer fosfato 0.1M 1mL 1mL 1mL
Extracto crudo 1mL 1mL 1mL
Incubar las muestras por 30 minutos a 37º C. Frenar la reacción depositando los tubos en hielo por 5min
Centrifugar por 10min a 5000rpm para separar el almidón no hidrolizado por la enzima
Fuente: (Miller et al., 1959)
A partir del sobrenadante tomar 0.250mL de cada hora de fermentación y se transferirá a los
tubos que contienen 0.250mL de DNS. Continuar con el protocolo que se describe en la
(tabla 4) (Miller et al., 1959).
Tabla 4. Actividad Amilolítica cuantitativa
CONCENTRACIÓN g/L REACTIVO BLANCO
0 ½ 1 1/2 2 4 6 ..
Sobrenadante de la técnica
enzimática (mL) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua (mL) 0.25 - - - - - -
Reactivo DNS (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en hielo
Agua 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Proteja los tubos de luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a 540 nm contra blanco
DNS
Fuente: (Miller et al., 1959)
Una vez obtenidas los valores de las absorbancias por la técnica anteriormente mencionada,
se halla la concentración de azucares reductores en g/l. con el resultado anterior se realiza
una relación estequiométrica para determinar en µmol la cantidad de enzima por el tiempo
de incubación empleado para obtener la reacción enzimática. Finalmente se define la unidad
amilolítica que es la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un µmol de glucosa por
minuto (UA/min), bajo condiciones constantes de la prueba (Miller et al., 1959).
ANEXO 5. CURVA PATRÓN DE GLUCOSA PARA DETERMIANCIÓ N DE AZÚCARES
REDUCTORES (DNS)
Se elaboraron tres replicas de la misma solución stock de glucosa con el fin de obtener
datos significativos.
Tabla 1. Curva patron de glucosa
Promedio de las tres réplicas Concentración
(g/L) Absorbancia (540nm)
0,5 0,237
0,7 0,292
1 0,526
1,5 0,642
1,7 0,804
2 0,94
Fuente: Autores, 2007
Fuente: Autores, 2007
ANEXO 6. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DEL COMPOST OBTENID O
Tabla 1. Análisis Fisicoquímico del primer proceso de compostaje
Control: 50% residuos de plaza; T: 60% residuos de plaza
(AGRILAB LTDA, 2007).
Tabla 2. Análisis físico químico del segundo proceso de compostaje
ANEXO 7. PREPARACIÓN DE EXTRACTO DE CARNE AL 10% Y BUFFER FOSFATO 7.2
Extracto De Carne Al 10% (p/v)
Extracto de carne en polvo 10g/100ml, hidrogeno fosfato de sodio heptahidratado Na2HPO4
– 7H2O 1.34g/100 ml y ácido cítrico 0.12 g/100 ml. pH final 9. Disolver por agitación
magnética y autoclavar la solución por 15 minutos a 121°C, 15 psi (Ahmed y Sorensen,
1995)
Buffer fosfato 7.2
Dihidrógeno fosfato de Sodio NaH2PO4 H2O 2 g/L, hidrogeno fosfato de sodio Na2HPO4 13
g/L, cloruro de sodio NaCl 87g/L (Ahmed y Sorensen, 1995).
ANEXO 8. PRUEBAS ESTADISTICAS
• Mann- Whitney: Comparación entre el método de ELISA e inmunocromatografía
Tabla 1. Pilas con 50% de residuos de plaza
Elisa 6 datos
Inmunocromatografía 6 datos
P 0,7488
T=Ub 15,5
Tabla 2. Pilas con 60% de residuos de plaza
Elisa 6 datos
Inmunocromatografía 6 datos
P 0,6889
T=Ub 15
• Kruskal –Wallis: Efecto de las diferencias en compo sición entre las pilas de
compostaje en la proporción de muestras positivas p ara Rotavirus
Tabla 3. Comparación de las proporciones de resultados positivos para Rotavirus mediante
Inmunocromatografía del primero y segundo proceso de compostaje P: 0,5318.
50% residuos
de plaza
60% residuos de
plaza (1 proceso)
60% residuos de
plaza (2 proceso)
50% residuos de
plaza
0,9362 0,3785
60% residuos de
plaza (1 proceso)
1 0,3785
60% residuos de
plaza (2 proceso)
1 1
• Coeficiente de correlación presencia de Rotavirus-p H-temperatura de las pilas
evaluadas con ELISA.
Tabla 4. Coeficiente de correlación para pilas con 50% de residuos de plaza.
Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,883777363 1
Temperatura -0,985109606 0,90791727 1
Tabla 5. Coeficiente de correlación para pilas con 60% de residuos de plaza.
Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,321326124 1
Temperatura -0,905644004 0,4586235 1
• Coeficiente de correlación presencia de Rotavirus-p H-temperatura de las pilas
evaluadas con ICT
Tabla 6. Coeficiente de correlación para pilas con 50% de residuos de plaza.
Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,969563896 1
Temperatura -0,965422928 0,907917271 1
Tabla 7. Coeficiente de correlación para pilas con 60% de residuos de plaza.
Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,633937916 1
Temperatura -0,663599839 0,4586235 1
ANOVA Análisis físico químico
Tabla 8. ANOVA Porcentaje de humedad
Origen de las
variaciones Suma de cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor
crítico
para F
Entre grupos 97,2066667 2 0,17083439 0,84692136
5,143
25285
Dentro de los
grupos 1707,03333 6
Total 1804,24 8
Tabla 9. ANOVA Porcentaje de nitrógeno orgánico
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 2,28302222 2 4,83281588 0,05618366 5,14325285
Dentro de los
grupos 1,4172 6
Total 3,70022222 8
Tabla 10. ANOVA Porcentaje de fósforo
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 0,47615556 2 1,77375828 0,24818898 5,14325285
Dentro de los
grupos 0,80533333 6
Total 1,28148889 8
Tabla 11. ANOVA Porcentaje de potasio
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 0,91606667 2 1,18808543 0,36755063 5,14325285
Dentro de los
grupos 2,31313333 6
Total 3,2292 8
Tabla 12. ANOVA Porcentaje de calcio
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
Libertad F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 9,0098 2 2,34280415 0,17703372 5,14325285
Dentro de los
grupos 11,5372 6
Total 20,547 8
Tabla 13. ANOVA Porcentaje de magnesio
Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
Libertad F Probabilidad
Valor crítico
para F
Entre grupos 1,21108889 2 2,64173534 0,15035769 5,14325285
Dentro de los
grupos 1,37533333 6
Total 2,58642222 8
ANEXO 9
Tabla 1. Absorbancias de la prueba de ELISA para el primer proceso de compostaje
50% RP* 50% RP 50%RP 60% RP 60% RP 60% RP
SEMANA 1 1,259 1,346 1,273 1,527 1,483 0,534
SEMANA 2 0,087 0,046 0,496 0,001 0,001 0,001
SEMANA 3 0,001 0,005 0,001 0,009 0,001 0,001
SEMANA 4 0,001 0,001 0,041 0,075 0,093 0,092
SEMANA 5 0,086 0,061 0,006 0,074 0,187 0,08
SEMANA 6
SEMANA 7
SEMANA 8 0,067 0,208 0,064 0,027 0,149 0,207
*RP: residuos de plaza. Las absorbancias resaltadas en amarillo son consideradas
positivas para Rotavirus.