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Guglielmo PaganettoGianni Sacchetti

Biotecnologie delle piante officinali

Aracne editrice

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I edizione: settembre

Indice

Prefazione

Capitolo ICosa sono le biotecnologie applicate alle piante officinali

.. La specie vegetale, – .. La molecola, – .. La produzio-ne biotecnologica, – .. Le tecniche estrattive e analitiche, –.. Pianta medicinale o pianta officinale, – .. Alcune definizioni, –... Droga vegetale, – ... Fitocomplesso, – ... Principio attivo, – ... Elicitori, .

Capitolo III metaboliti secondari e le vie biogenetiche

.. Filogenesi dei metaboliti secondari, – .. La via dell’acido shi-kimico, – .. La via dell’acetato (malonato), – .. Biosintesi deicomposti fenolici, – .. Via dell’acetato (mevalonato), – .. Viebiogenetiche complesse (alcaloidi), – .. Tessuti secretori e strutturedi accumulo, .

Capitolo IIIRisposte al condizionamento ambientale nei vegetali

.. Gli ormoni, – ... Auxine, – ... Citochinine, – ... Gibbe-relline, – ... Etilene, – ... Acido abscissico, – .. Meccanismidi risposta all’ambiente biotico, – ... Difese chimiche costitutive eindotte, – ... Composti allelochimici e allelopatia, – .. Meccanismidi risposta all’ambiente abiotico, .

Capitolo IVColtura in vitro di cellule e tessuti di piante officinali

.. Colture in vitro di cellule vegetali, – ... L’espianto, – ... Alle-stimento della coltura di calli, – ... Il terreno di coltura, – ... Evo-luzione temporale della coltura, – ... Colture liquide in sospensione,

Indice

– ... Curva di crescita e studio della vitalità cellulare, – ... Colturedi protoplasti, – .. Colture in vitro di organi, – ... Colture diradici e di hairy roots, – ... Embriogenesi somatica, – ... Colturedi germogli e micropropagazione, .

Capitolo VIngegneria Genetica nelle Piante

.. Trasformazione genetica con agrobacterium tumefaciens, – ... Daiplasmiditi ai vettori di trasformazione delle cellule vegetali, – ... Bio-listica, – .. Le nuove piattaforme biotecnologiche vegetali: PlantMolecular Farming, – ... Espressione transgenica del dimero umanodell’apolipoproteina A–I Milano in semi di riso (Oryza sativa), – ... Pro-duzione di β–glucosidase in semi della pianta del tabacco (Nicotiana taba-cum), – ... Produzione di maltasi acida umana in semi di tabacco(Nicotiana tabacum), – ... Vaccini derivanti biotecnologicamente dallepiante, .

Capitolo VII processi estrattivi e la caratterizzazione molecolare nell’applica-zione biotecnologica alle piante officinali

.. Processi estrattivi, – ... Estrazione solido–liquido, – ... Estra-zione solido–liquido con fluidi supercritici, – .. Estrazione liquido–liquido, – ... Estrazione liquido–liquido per spostamento, – .. Estra-zione e separazione per distillazione, – ... Liquidi completamentemiscibili e distillazione semplice, – ... Liquidi completamente miscibilie ri–distillazione, – ... Liquidi immiscibili e distillazione in corrente divapore d’acqua, – .. Isolamento e caratterizzazione molecolare, – ... Le tecniche cromatografiche, – ... Classificazone delle tecnichecromatografiche in base allo stato fisico della fase mobile e del letto cromatografi-co, – ... Cromatografia planare (Thin Layer Chromatography, TLC), – ... Cromatografia liquida su colonna, – ... Gascromatografia, .

Capitolo VIIDal laboratorio alla produzione

.. Tipologie di bioreattori, – ... Bioreattore ad agitazione meccanica(Stirred Tank Reactors), – ... Bioreattore pneumatici (Airlift reac-tors), – ... Bioreattori a letto fisso o a letto fluidizzato, – ... Bio-reattori per colture in larga scala di hairy roots, – .. Le variabili cheinfluenzano la produttività di sistemi biotecnologici, – ... L’espian-to, – ... Terreno di coltura, – ... Gli zuccheri, – ... I nitra-ti, – ... I fosfati, – ... Precursori biosintetici dei principi attivi,

Indice

– ... La luce, – ... Il pH, – ... La temperatura, – ... L’a-reazione, – ... L’elicitazione, – ... L’immobilizzazione, –... La selezione, .

Capitolo VIIIDalla tradizione erboristica alla produzione biotecnologica

.. Atropa belladonna, – ... Caratteristiche e proprietà, – ... Stra-tegie biotecnologiche, – .. Cannabis sativa, – ... Caratteristiche eproprietà, – ... Strategie biotecnologiche, – .. Papaver somnife-rum, – ... Caratteristiche e proprietà, – ... Strategie biotecnologi-che, – .. Digitalis purpurea, – ... Caratteristiche e proprietà, – ... Strategie biotecnologiche, .

Capitolo IXLa produzione biotecnologica di principi attivi per la terapia delcancro

.. Gli alcaloidi di Catarantus roseus, – ... La biosintesi e l’approcciobiotecnologico, – ... La produzione di alcaloidi da coltura di germoglidi Catharantus roseus, – .. La podofillotossina di Podophyllum pelta-tum, – ... I derivati della podofillotossina, – ... La produzione dipodofillotossina da coltura di Linum album, – .. Gli alcaloidi di Camp-totheca acuminata, – ... Biosintesi e produzione biotecnologica, – .. Ancora sul taxolo, – ... Colture di calli da Taxus spp, –.. Plant Molecular Farming e anticorpi monoclonali, .

Capitolo XDa artemisia annua all’artemisinina

.. La storia, – .. La molecola, biosintesi e meccanismo d’azio-ne, – .. Strategie biotecnologiche, – .. Impiego di bioreatto-ri, .

Bibliografia

Prefazione

Entro la tenera corteccia di questo fragile fio-re risiede un veleno e anche un potere me-dicamentoso; perchè se odorato, esso ralle-gra ogni senso col suo profumo; ma se è as-saporato, arresta tutti i sensi insieme con ilcuore.

W. S∗

Nella stesura di questo testo si sono voluti descrivere i correlati scien-tifici e concettuali che caratterizzano la botanica farmaceutica e lafarmacognosia applicata rispetto all’evoluzione delle moderne bio-tecnologie, sviluppate con specifica attinenza alle piante officinali. Losviluppo di colture in vitro di cellule vegetali e di piante completemodificate geneticamente ha assunto negli ultimi decenni un ruolodi prorompente e progressiva rilevanza. Con specifico riferimento alcontesto di quest’opera, le biotecnologie applicate alle piante officinalihanno trovato e trovano oggi grande propulsione nel miglioramentoagronomico delle coltivazioni attraverso un’attenta selezione in vitrodi linee cellulari, assecondando il moderno mercato dei prodotti er-boristici che vedono nelle coltivazioni tradizionali il maggiore canaledi approvvigionamento di droghe vegetali, nonché — e soprattutto— nel miglioramento qualitativo e quantitativo della produzione diprincipi attivi con finalità salutistiche e farmacologiche in contestiesclusivamente biotecnologici. Ciò attraverso il potenziamento dellabiomassa estrattiva e le strategie impiantistiche (bioreattori) che, dallascala laboratoristica, consentono il trasferimento a livello industrialeincrementando la produttività. La comprensione dei relati scientifi-ci che sottendono l’ampia e sempre prolifica letteratura in questocontesto richiede una rivisitazione alla luce delle nuove tecnologieed esigenze della moderna botanica farmaceutica, farmacognosia e

∗ W. S, Romeo e Giulietta,(atto , scena ).

Prefazione

produzione erboristica, attraverso la proposizione di nuovi modulididattici che possano essere di ausilio all’apprendimento e, soprattutto,di strumenti concettuali che costituiscano i fondamenti per compren-derne la continua evoluzione. A tal fine, dopo un primo capitolo in cuisi è cercato di qualificare questi correlati con l’esempio di un farmacoantitumorale la cui scoperta e sviluppo rappresentano un riferimentoparadigmatico, nei capitoli successivi vengono affrontate la biosintesidei metaboliti secondari, i fattori ecologici che ne condizionano laproduzione, l’allestimento e modifica genetica delle colture cellula-ri, le metodiche di estrazione e analisi fino alla produzione massivaed industriale in bioreattori. Gli ultimi tre capitoli riprendono alcuniesempi significativi della letteratura specialistica al fine di evidenzia-re i successi, i limiti e le potenzialità di sviluppo delle tecniche deicapitoli precedenti secondo l’attuale stato dell’arte. Con queste pre-messe, gli autori non hanno pertanto inteso fornire una trattazioneesaustiva su di una tematica così ampia ed in costante evoluzione, maauspicano di essere stati efficaci, oltre che nel coadiuvare il lettorenell’apprendimento dei fondamenti, anche nell’orientarlo verso uncorretto atteggiamento metodologico, utilizzando gli strumenti con-cettuali qui appresi come viatico intellettuale alla comprensione delladinamicità scientifica di questa disciplina.

Capitolo I

Cosa sono le biotecnologie applicatealle piante officinali

La lezione del taxolo

Il Taxolo è un principio attivo antitumorale molto efficace presentein commercio dai primi anni novanta (Fig. .). Oggi, a più di an-ni dalle prime ricerche, è approvato nell’ambito della pratica clinicadi paesi per il trattamento del tumore alla mammella, all’ovaioe al polmone. Ai fini della presente trattazione il taxolo costituisceun riferimento paradigmatico per familiarizzare con la terminolo-gia, l’approccio metodologico e tecnico finalizzato all’inquadramentodella disciplina che vogliamo descrivere. Per far questo seguiamo lastoria per sommi capi di questa molecola così da introdurre le varietematiche che svilupperemo nei prossimi capitoli.

Nel il National Cancer Institute avviò un programma che pre-vedeva l’analisi di . specie botaniche nelle quali fosse possibileidentificare un principio attivo efficace nella terapia dei tumori []. Trai reperti entrati nel protocollo di verifica era presente la corteccia diun albero proveniente dalla costa californiana del Pacifico, noto dainativi del luogo come albero dello yew o “medico della foresta”, scien-tificamente Taxus brevifolia. Questi riferimenti etnobotanici avevanoindotto i ricercatori ad inserire questa specie nella ricerca al fine diottenere un fitocomplesso, estratto dalla corteccia, che sarebbe poistato caratterizzato dal punto di vista della composizione chimica edelle proprietà farmacologiche.

Due ricercatori del Research Triangle Institute in North Carolina,Monroe Wall e M.C. Wani, testarono le molecole ottenute dal fi-tocomplesso su linee cellulari tumorali pervenendo ad attribuire nel al composto , poi denominato taxolo, un’indubbia efficacia nelcontrastarne la crescita e la propagazione.

Biotecnologie delle piante officinali

Ci vollero quasi dieci anni per confermare questa evidenza e perchiarire il meccanismo d’azione del taxolo nei confronti delle cellulein rapida divisione ed in particolare per le cellule tumorali. Il meritova a Susan Horwitz dell’Albert Einstein College of Medicine di New Yorkche dimostrò come questa molecola impedisca la depolimerizzazionedella tubulina impedendo così la formazione del fuso mitotico. Potècosì cominciare il lungo lavoro preliminare di ottimizzazione della resaproduttiva che doveva fornire i quantitativi necessari alla sperimenta-zione clinica alla quale si approdò solo nel . In quell’anno, infatti, siriuscì ad ottenere un quantitativo sufficiente di molecola pura da som-ministrare ai pazienti come principio attivo. Il maggior problema erarappresentato dall’estrema esiguità della concentrazione percentualedi taxolo nei fitocomplessi, e dalla difficoltà di estrazione e purificazio-ne della singola molecola. L’impiego della corteccia dell’albero del yewrichiedeva quantitativi così elevati di materiale da rischiare l’estinzionedella specie. La concentrazione di taxolo nella pianta adulta è infattiestremamente ridotta tanto che la resa di estrazione — estremamentescarsa — richiederebbe circa – kg di materiale vegetale fresco daestrarre per ottenere un solo grammo di principio attivo. L’idealesarebbe stato sintetizzare completamente la molecola in laboratorio

Figura .. Struttura chimica del taxolo.

. Cosa sono le biotecnologie applicate alle piante officinali

con procedure efficaci e resa industriale. L’estrema complessità dellastruttura molecolare richiese altri dieci anni di tentativi per realizzarela sintesi chimica ab initio, ma con una resa decisamente carente a finicommerciali []. Questa sconfitta della chimica di sintesi rispetto allaproduzione del taxolo ha determinato la spinta propulsiva della ricercaverso lo sviluppo delle biotecnologie, con particolare riferimento allaloro applicazione rispetto alle piante officinali. L’utilizzo delle straor-dinarie capacità biosintetiche della cellula vegetale, lo sfruttamentodelle cellule vegetali come laboratorio di produzione di principi attiviè stata la chiave di volta che — attraverso la lezione del taxolo — hadeterminato lo sviluppo e la crescita vertiginosa di questo straordi-nario quanto complesso strumento di produzione, oggi ancor più diieri indispensabile al progresso farmaceutico. Quindi, nonostante leoggettive difficoltà della sintesi chimica, grazie all’impiego di tecnichebiotecnologiche, di cui diremo in seguito dei tecnicismi nello specifico,nonché di procedure di semi–sintesi la produzione di taxolo raggiunselivelli sufficienti allo sfruttamento industriale alla fine degli anni ottan-ta del secolo scorso. A partire dal , iniziarono pertanto ad essereconcesse dalle varie agenzie governative del farmaco le autorizzazionialla commercializzazione e all’applicazione clinica del taxolo. Nel la Food and Drug Administration americana (FDA) lo autorizza per trat-tare il cancro ovarico, nel l’autorizzazione americana viene estesadall’Agenzia Europea di Controllo sui Medicinali (EMEA) all’Europa.Dal in poi l’uso viene esteso al trattamento del cancro polmonaree mammario.

Ogni singola fase del lungo iter che conduce dalla pianta all’impiegoclinico richiede l’applicazione di procedure e metodologie speciali-stiche a partire dalla caratterizzazione tassonomica del vegetale diestrazione fino all’impiego sull’uomo.

.. La specie vegetale

Il Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae), nota comunemente come Tassodel Pacifico, ma anche come albero della morte oltre che come medicodella foresta, è un piccolo albero dioico, di – metri di altezza, conchioma conica, larga ed irregolare. Il sistema radicale è profondo ediffuso, il tronco è irregolare ed ha diametro superiore al metro, cor-

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teccia sottile, liscia con scaglie allungate, di colorazione rosso–bruna,rami sottili, gemme scalari acute, giallastre. Le foglie sono lineari,strette e leggermente appiattite, molli e pieghevoli e distribuite sudue file []. La descrizione di dettaglio delle caratteristiche mor-fo–anatomiche della pianta potrebbe configurarsi, a prima vista, comepedante ed eccessiva (Fig. .) ma, di fatto, l’attenta analisi di ogniparticolare è un presupposto indispensabile alla qualificazione sicuradella specie vegetale, inquadrandosi nella necessità di circoscrivere inmodo rigoroso sia l’identità del soggetto botanico rispetto alla speciedi effettiva utilità farmaceutica sia l’estrema variabilità delle compo-nenti fitochimiche che dovranno rispettare parametri coerenti conl’efficacia e la sicurezza d’uso terapeutico.

Già la stessa specie può, infatti, presentare in diversi esemplaridistribuiti in areali anche relativamente vicini peculiarità chimicheproduttive sensibilmente differenziate come espressione del metabo-lismo secondario rispetto alla intrinseca resiliente capacità adattativaad ambienti e condizioni differenti delle specie vegetali. A maggiorragione, se consideriamo il “cugino” europeo del Taxus brevifolia, ilTaxus baccata, specie affine originaria dell’Africa del Nord e dell’Asia,che vegeta spontaneo nelle zone montuose della regione mediterra-nea prediligendo zone umide e ombrose. La specie arborea T. baccata,

Figura .. Il Taxus brevifolia è un piccolo albero dioico, di – metri di altezza,con chioma conica larga ed irregolare. Il sistema radicale è profondo e diffuso, iltronco è irregolare e ha diametro superiore al metro, corteccia sottile, liscia conscaglie allungate, rosso–bruna, rami sottili, gemme scalari acute, giallastre.

. Cosa sono le biotecnologie applicate alle piante officinali

sempreverde, viene coltivata come pianta ornamentale di incredibilelongevità, dotata di una chioma ricca di foglie aghiformi verdi scure,di una durissima corteccia rossiccia e di frutti dalla forma di bacche,chiamati arilli, e può raggiungere i – metri di altezza.

Il nome comune tasso deriva dal greco taxon che significa “freccia”.L’appellativo di albero della morte gli veniva forse attribuito dall’im-piego nella fabbricazione di dardi velenosi, o forse dalla sua tossicità,che potrebbe rendere conto della biosintesi del taxolo. Un’altra inter-pretazione ha origini espressamente europee, scozzesi in particolare,dal momento che veniva utilizzato e lavorato il legno dei rami adultiper fabbricare archi di incredibile potenza, in grado di lanciare frec-ce molto più lontano rispetto agli archi dei vicini inglesi, per questospesso sconfitti in battaglia.

Già nel il chimico italiano Domenico Amato isolò dal Taxusbaccata un alcaloide o, meglio, un’ammina alcaloidea, che caratterizzòtramite svariate reazioni riconoscitive, ma purtroppo non pervennealla definizione della struttura, né continuò a studiarlo. Tuttavia restail dubbio che egli sia stato il primo chimico a isolare questa sostanza,pur non avendone descritto gli effetti tossici.

A questo punto, il lettore avrà compreso come l’azione terapeu-tica del taxolo si esplichi come azione tossica sulle cellule tumorali,dunque sorge spontaneo il quesito sul motivo del processo coevolu-tivo che accompagna la selezione di piante tossiche nei confronti delregno animale ed in particolare dei mammiferi. La produzione deltaxolo comporta per la pianta un dispendio energetico non trascura-bile a fronte della sintesi di una molecola non necessaria al trofismoorganico. Il taxolo è infatti un metabolita secondario, con questo ter-mine ci si riferisce a metaboliti che, a differenza dei metaboliti primari(proteine, zuccheri, lipidi e acidi nucleici), non svolgono un ruolofondamentale nelle funzioni vitali di base della cellula come divisione,crescita, differenziamento, riproduzione. Essi servono primariamentealla pianta nel complesso e non alla singola cellula, agiscono comesegnali chimici nell’interazione della pianta con l’ambiente biotico(microorganismi, piante animali) e costituiscono una risposta a fattoristressogeni di natura abiotica (temperatura, UV, carenza di acqua, e/odi nutrienti, fattori climatici in genere).

Molti metaboliti secondari agiscono da deterrenti, specifici o aspe-cifici, nei confronti di animali erbivori, microrganismi e virus. Alcune

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piante sono in grado di produrre composti con funzione antibiotica,antimicotica, antivirale, o, come nel caso del taxolo, embriotossica oteratogena. L’effetto embriotossico consente alla pianta un controlloindiretto sulla popolazione dei predatori. Anche l’azione embriotossicaè esito di un processo coevolutivo: le cellule neoplastiche acquisisconomolte delle caratteristiche tipiche delle cellule indifferenziate embrio-nali, soprattutto per quanto riguarda i meccanismi di difesa, ciò rendeconto della specificità nei confronti delle cellule tumorali.

.. La molecola

Il taxolo può essere classificato in base alla struttura molecolare trale ammine alcaloidee, ma anche come diterpenoide alcaloideo. Co-me vedremo, i metaboliti secondari possono essere genericamenteraggruppati secondo tre classificazioni di massima come terpeni, com-posti fenolici, ed alcaloidi. Ciascuna di queste tre grandi famiglie chi-miche di metaboliti secondari si declinerà naturalmente in tipologiepiù specifiche che tratteremo di volta in volta che le argomentazionisi svilupperanno rispetto a specifici principi attivi da specifiche specieofficinali. Una definizione soddisfacente di alcaloidi fa riferimento aduna caratteristica strutturale ricorrente: contengono infatti uno o piùatomi d’azoto all’interno di un anello eterociclico che, in ragione del-l’assetto elettronico spaiato nell’orbitale più esterno, possono conferirealla molecola proprietà basiche (alcaloide = simile alle basi). Quandol’azoto non è eterociclico non si potrebbe parlare a rigore di alcaloidiper cui si preferisce identificare la molecola come protoalcaloide oammina alcaloidea, ed è proprio questo il caso del taxolo (Fig. .). Ma,in considerazione della biosintesi molecolare, lo si può fare rientraretra le molecole molto simili ai terpeni (in particolare ai diterpeni);molto simili, ma non caratterizzabili propriamente come diterpeni inquanto l’atomo di azoto non consente una sua piena identificazionein questa classe di composti, da cui la identificazione come diterpe-noide. In altre parole, il taxolo non è propriamente un alcaloide, maprotoalcaloide, e allo stesso tempo non è propriamente un terpene,bensì un terpenoide.