»MLADI ZA NAPREDEK MARIBORA 2015«

32. srečanje

VPLIV ADITIVOV NA RAZVOJNI KROG GLIVE

SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE

Raziskovalno področje: BIOLOGIJA

Raziskovalna naloga

PROSTOR ZA NALEPKO

Maribor, januar 2015

2

»MLADI ZA NAPREDEK MARIBORA 2015«

32. srečanje

VPLIV ADITIVOV NA RAZVOJNI KROG GLIVE

SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE

Raziskovalno področje: BIOLOGIJA

Raziskovalna naloga

PROSTOR ZA NALEPKO

Maribor, januar 2015

3

KAZALO VSEBINE

ZAHVALA ................................................................................................................................................ 6

POVZETEK ............................................................................................................................................ 6

1. UVOD ............................................................................................................................................. 7

2. TEORETIČNI DEL ......................................................................................................................... 8

2.1 SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE ....................................................................................... 8

2.1.1 Splošno .................................................................................................................................... 8

2.1.2 Zgodovina in odkritje .............................................................................................................. 8

2.1.3 S. pombe kot model sistema in njene genske značilnosti ........................................................ 9

2.1.4 Razvojni krog ........................................................................................................................ 10

2.1.5 Razvojni krog S. pombe ......................................................................................................... 13

2.2 ADITIVI .................................................................................................................................... 17

2.2.1 Skupine aditivov .................................................................................................................... 18

2.3 LASTNOSTI IZBRANIH SNOVI ............................................................................................ 22

2.3.1 Natrijev nitrit ......................................................................................................................... 22

2.3.2 Amonijev sulfat ..................................................................................................................... 22

2.3.3 Kalijev bromat (KBrO3) ....................................................................................................... 23

2.3.4 Natrijev benzoat .................................................................................................................... 24

2.3.5 Citronska kislina .................................................................................................................... 25

3. METODOLOGIJA DELA ............................................................................................................ 27

3.1 NAČRT EKSPERIMENTA ...................................................................................................... 27

3.1.2 Hipoteze in napovedi ............................................................................................................. 27

3.1.3 Konstante in spremenljivke ................................................................................................... 27

3.2 IZVEDBA EKSPERIMENTA .................................................................................................. 29

3.2.1 Priprava gojišča ..................................................................................................................... 29

3.2.2 Priprava koncentracij aditivov ............................................................................................... 29

3.2.3 Potek dela .............................................................................................................................. 29

4. REZULTATI ................................................................................................................................. 35

Tabela 1: Slikovni prikaz mitotskih faz................................................................................................. 35

Tabela 2: Slikovni prikaz mejotskih faz ................................................................................................ 35

4.1 REZULTATI: NATRIJEV BENZOAT .................................................................................... 36

4

Graf 1: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim NATRIJEVIM BENZOATOM ......... 36

Tortni diagram 1.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini natrijevega benzoata

............................................................................................................................................................... 37

4.2 REZULTATI: AMONIJEV SULFAT ...................................................................................... 38

Graf 2: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim AMONIJEVIM SULFATOM ........... 38

Tortni diagram 2.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 2.2: Število celic v fazah

MEJOZE ................................................................................................................................................ 38

Tortni diagram 2.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini amonijevega sulfata

............................................................................................................................................................... 39

4.3 REZULTATI: NATRIJEV NITRIT .......................................................................................... 40

Graf 3: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim NATRIJEVIM NITRITOM .............. 40

Tortni diagram 3.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 3.2: Število celic v fazah

MEJOZE ................................................................................................................................................ 40

Tortni diagram 3.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini natrijevega nitrita .. 41

4.4 REZULTATI: KALIJEV BROMAT ........................................................................................ 42

Graf 4: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim KALIJEVIM BROMATOM ............. 42

Tortni diagram 4.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 4.2: Število celic v fazah

MEJOZE ................................................................................................................................................ 42

Tortni diagram 4.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini kalijevega bromata 43

4.5 REZULTATI: KONTROLA ..................................................................................................... 44

Tortni diagram 5.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 5.2: Število celic v fazah

MEJOZE ................................................................................................................................................ 44

Tortni diagram 5.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v kontrolni skupini .................. 45

4.6 MITOTSKI INDEKS ................................................................................................................ 46

Tabela 3: Vrednosti mitotskega indeksa................................................................................................ 46

Graf 6: Mitotski indeks celic S. pombe v gojiščih z raztopinami vseh aditivov .................................... 46

Tortni diagram 6: Vrednosti mitotskega indeksa v kontroli in po dodatku aditivov ............................. 47

4.7 MERJENJE ABSORPCIJE SVETLOBE S SPEKTROMETROM .......................................... 47

Tabela 4: Prosojnost gojišč z dodanimi aditivi ...................................................................................... 47

Graf 6: Prosojnost gojišč z dodanimi aditivi ......................................................................................... 48

5. INTERPRETACIJA IN RAZPRAVA .......................................................................................... 49

6. ZAKLJUČEK, SKLEPI ................................................................................................................ 52

7. PRILOGE ...................................................................................................................................... 53

5

Tabela 5: Povprečne dolžine celic (µm±0,1) S. pombe v mitotskem ciklu .......................................... 53

Tabela 6: Povprečne dolžine celic (µm±0,1) S. pombe v mejotskem ciklu........................................... 53

Tabela 7: Delež celic v fazi mitoze (%) ................................................................................................ 54

Tabela 8: Delež celic v fazi mejoze (%) ................................................................................................ 54

Tabela 9: Skupni delež celic (%) v MITOZI in MEJOZI ..................................................................... 55

8. VIRI IN LITERATURA ............................................................................................................... 56

KAZALO SLIK

Slika 1: Schizosaccharomyces pombe ........................................................................................ 7

Slika 2: Mitotski celični cikel ................................................................................................... 11

Slika 3: Mejoza I in II ............................................................................................................. 12

Slika 4: Celični cikel S. pombe................................................................................................. 13

Slika 5: Vegetativni cikel ......................................................................................................... 14

Slika 6: Celični cikel S. pombe (2) ........................................................................................... 15

Slika 8: Citokineza cepitvenih gliv kvasovk ............................................................................ 15

Slika 9: Nadzor rasti ................................................................................................................. 16

Slika 10: Kemijska struktura amonijevega sulfata ................................................................... 23

Slika 11: Natrijev benzoat ........................................................................................................ 24

Slika 12: Citronska kislina ....................................................................................................... 26

Slika 13: Celice S. pombe v gojišču z natrijevim benzoatom .................................................. 30

Slika 14: Celice S. pombe v gojišču z amonijevim sulfatom .................................................. 31

Slika 15: Celice S. pombe v gojišču z natrijevim nitritom ....................................................... 31

Slika 16: Celice S. pombe v gojišču s kalijevim bromatom ..................................................... 31

Slika 17: Celice S. pombe v gojišču s citronsko kislino ........................................................... 32

Slika 18: Celice S. pombe v gojišču brez aditivov (kontrola) .................................................. 32

Slika 19: Epruvete z YPD in aditiv ...................................................................................................... 33

Slika 20: Priprava na mikroskopiranje ................................................................................................. 33

Slika 21: Nikon Eclipse E800 .............................................................................................................. 34

Slika 22: Spektrometer .......................................................................................................................... 34

6

ZAHVALA

Iskrena zahvala gre mentorici, saj mi je omogočila pripravo raziskovalne naloge.

Zahvaljujem se ji za strokovno pomoč in podporo pri uresničevanju naloge. Brez njene

pomoči in dovzetnosti za raziskovanje bi težko uresničila izvedbo raziskovalne naloge.

POVZETEK

V raziskovalni nalogi sem proučila razvojni krog glive S. pombe. Za glivo je značilno, da ima

mitotski in mejotski ciklus in raste le s podaljšanjem ob polih celice. Gliva je zanimiva, saj

med razmnoževanjem tvori celice, ki se v posameznih stopnjah razmnoževanja razlikujejo po

velikosti in po količini dedne snovi, celice so lahko haploidne ali diploidne. Zanimalo me je,

ali različni aditivi, kot so: natrijev benzoat, amonijev sulfat, kalijev bromat, natrijev nitrit in

citronska kislina, vplivajo na razmerje med mejotskim in mitotskim ciklusom in na pojav

različnih tipov celic, ki so del obeh ciklov in ali se spreminja tudi njihova velikost. Proučevala

sem sev glive Schizosaccharomyces pombe ZIM 1778. Razvoj glive sem opazovala v

tekočem gojišču YPD brez aditivov in v tekočem gojišču z dodanimi aditivi. Pri raziskavi sem

želela ugotoviti, ali bi lahko glivo uporabili kot testni organizem za preverjanje kancerogenih

vplivov aditivov. Poleg tega vsebuje S. pombe 50 genov, ki se pojavljajo tudi v človekovem

genomu in skoraj polovica teh določa rakave bolezni. Z raziskavo smo potrdili, da aditivi

vplivajo na razvojna kroga glive, predvsem s podaljšanjem celic.

7

1. UVOD

V raziskovalni nalogi sem raziskovala vpliv aditivov, uporabljenih večinoma v prehrambni

industriji na razvojni krog glive Schizosaccharomyces pombe. Gliva je znana kot odličen

model sistema za opazovanje in raziskovanje, saj jo je zelo lahko vzrediti v laboratoriju in pod

mikroskopom opazovati njen celični cikel, saj raste le s podaljšanjem na polih celice.

Z eksperimenti pridobljene ugotovitve bom zaradi lastnosti genoma S. pombe lahko povezala

s vplivom preiskovanih snovi na človekovo zdravje.

V nadaljevanju bom predstavila predpostavke raziskave in predvidena nova spoznanja ter

predstavila dosedanje raziskave z rezultati s tega področja V jedru naloge bom opisala

lastnosti uporabljenih snovi in načrt eksperimenta. Podrobneje bom opisala hipoteze,

predstavila napovedi in opisala izvedbo eksperimenta. Dobljene rezultate bom organizirala in

ustrezno opremila z meritvami in ostalimi podatki. V razpravi bom podatke interpretirala in

jih povezala v logično celoto.

Slika 1: Schizosaccharomyces pombe

(https://tuebingen.mpg.de/typo3temp/pics/52b13aa786.jpg)

8

2. TEORETIČNI DEL

2.1 SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE

2.1.1 Splošno

Schizosaccharomyces pombe je prostoživeča cepitvena gliva kvasovka, ki spada med

enocelične evkarionte s paličasto oblikovani celicami. Vsebuje značilnosti večceličnih

evkariontov in spada v deblo imenovano Ascomycota, ki vsebuje veliko in raznovrstno

skupino gliv. Ascomycete ponavadi najdemo v drevesnih izločkih in zemlji okoli njih ter v

gnijočem sadju, kjer so odnosi večinoma simbiotski in saprofitski. Poleg tega pa jih je veliko

tudi rastlinskih patogenov.

S. pombe ob prisotnosti presežka sladkorja doživi anaerobno fermentacijo in lahko obenem

razgradi malinsko kislino, ki je prevladujoča organska kislina v vinu. Po tej značilnosti se

razlikuje od ostalih Saccharomyces vrst.

Gliva služi kot odličen model za preučevanje evkariontskih procesov in značilnosti, kot so

zgradba in funkcija centromera, citoskeleta, nadzor celičnega cikla in rekombinacija DNA. V

zvezi s celičnim ciklom kvasovke je bilo opravljenih že veliko raziskav in danes je znanega

precej o genski in molekulski strukturi S. pombe.

2.1.2 Zgodovina in odkritje

Leta 1893 jo je v prosenem pivu iz Vzhodne Afrike odkril in kasneje tudi izoliral Paul

Lindner. Ime glive 'pombe' pomeni v jeziku Svahili pivo. Od leta 1950 se gliva uporablja kot

raziskovalni in eksperimentalni model v celični in molekularni biologiji za preučevanje načel

genetike in celičnega cikla.

Leta 2002 je bilo na Sanger Institute objavljeno zaporedje genoma S. pombe in s tem je gliva

postala 6. evkariontski model organizma, katerega genom je v celoti znan. Izkazalo se je, da S.

pombe vsebuje nekaj genov, ki so homologni človeškim bolezenskim genom. Kasneje je gliva

postala pomembna pri študijah celičnih odzivov na poškodbe DNA in procesa replikacije

DNA.

Do danes je bilo izoliranih okoli 160 vrst te glive s celega sveta. S. pombe je prisotna v

9

obdelanem sadju (jabolka, grozdje), v različnih alkoholnih pijačah (brazilska Cachaça) in v

fermentiranem čaju Kombucha.

2.1.3 S. pombe kot model sistema in njene genske značilnosti

Gliva je znana kot model sistema za preučevanje osnovnih značilnosti in principov v

kompleksnejših organizmih (ljudje). Je enocelični evkariontski organizem, ki ni patogen in ga

je lahko vzgojiti. Cepitvena kvasovka vsebuje malo število genov, v primerjavi z genomi

drugih evkariontov.

Celice so dolge od 7 do 14 mikrometrov, njihov premer pa meri 3 do 4 mikrometre. Genom

vsebuje približno 14.1 milijona baznih parov in okoli 4979 S. pombe ima 3 kromosome in je

ponavadi haploidna z okoli 5000 introni1.

Gliva ima relativno velike regionalne centromere2, ki se pojavljajo tudi pri sesalcih. S

človeškimi kromosomi ima poleg centromerov skupen tudi heterokromatin3 in izvor

razmnoževanja.

Veliko genov, ki so pomembni za celično delitev in organizacijo znotraj celice v glivi

kvasovki, je prisotnih tudi v človeškem genomu. 50 genov S. pombe je izjemno podobnih ali

celo enakih človeškim genom, ki vsebujejo zapis za določene bolezni in skoraj polovica teh je

povezanih z rakavimi obolenji. Od tega je 12 genov, ki določajo bolezni v metabolizmu, 13

genov za nevrološke, 1 gen za srčne in 1 gen za nefrološke bolezni.

Gliva se uporablja tudi za opazovanje rasti in celične delitve, saj se gliva deli z medialno

cepitvijo, ki je zlahka vidna pod mikroskopom. Hitra rast in delitev jo naredi primerno za rast

in opazovanje v laboratoriju.

1 Intron: nekodirajoči deli DNA, ločujejo eksone, značilni so za evkarionte

2 centromer: mesto na kromosomu, na katerega se vežejo niti delitvenega vretena v času mitoze

3 heterokromatin je zelo kondenzirana kromosomska snov, ki vpliva na izražanje genov

10

2.1.4 Razvojni krog

Celice S. pombe rastejo le na polih celice (podaljšanje) in skozi rast ohranjajo svojo obliko.

Delijo se z medialno cepitvijo, pri kateri nastaneta dve enako dolgi hčerinski celici. Delitveni

cikel je hiter in traja 2 do 4 ure.

Glivne celice se delijo s procesoma mitoze in mejoze, ki ju bom tudi na splošno opisala.

MITOZA je celična delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki sta identični

materinski. Je nespolna ali vegetativna delitev in omogoča rast, razvoj, obnavljanje in

razmnoževanje. Mitozo delimo v več faz. Interfaza je stanje med dvema delitvama in jo

delimo na 3 stopnje. V prvi fazi imenovani G1 celica zraste na dvakratno velikost, saj poteka

pospešena sinteza proteinov. Nekatere celice po G1 preidejo v mirujočo fazo G0 in s tem

izstopijo iz celičnega cikla. Celice, ki s ciklom nadaljujejo, vstopijo v fazo S, imenovano tudi

fazo sinteze, kjer se DNA podvoji (semikonzervativno podvojevanje). Kmalu pride celica v

fazo G2, v kateri ne raste več in se začne pripravljati na mitozo. Interfaza je ponavadi faza, ki

traja najdlje.

Interfazi sledi profaza. V profazi poteka zgoščanje kromatina, ki oblikuje kromosome. Začne

se oblikovanje delitvenega vretena. Na vsakem kromosomu, ki je sestavljen iz dveh kromatid,

se nahaja centromer. Centromer drži skupaj 2 sestrski kromatidi. Jedrna ovojnica se razgradi

in pride do oblikovanja delitvenega vretena. Niti delitvenega vretena se primejo na del

centromera, ki se imenuje kinetohor. V metafazi se kromosomi postavijo v ekvatorialno

ravnino sredi celice. Centrosoma sta na nasprotnih polih celice in iz njiju se raztezajo niti

delitvenega vretena. Anafaza je najkrajša izmed faz, v kateri se sestrski kromatidi ločita in

potujeta na nasprotna pola celice. Ob koncu anafaze je na obeh polih enako število enakih

kromosomov. V telofazi se začne oblikovati jedrna ovojnica, kromosomi se podaljšajo in

ponovno se pojavi jedrce. Delitveno vreteno izgine, celica se podaljša in je pripravljena na

citokinezo. Citokineza pri živalskih celica predstavlja preščip (saj ni celične stene). Pri

rastlinah in ostali evkariontih s celično steno se oblikuje celična plošča. Ob koncu citokineze

se celica razdeli v dve identični hčerinski celici.

11

Slika 2: Mitotski celični cikel

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d8/General_cell_cycle.jpg)

MEJOZA je delitev spolnih celic, ki služi za razmnoževanje. Imenuje se tudi redukcijska

delitev, saj razpolovi število kromosomov v celici. Pri mitozi nastanejo 4 hčerinske celice ali

gamete, ki so za razliko od diploidnih (2n) materinskih celic, haploidne (n) in med seboj

različne po genskem zapisu. Torej, somatske ali telesne celice imajo 46 kromosomov, spolne

celice (jajčeca in semenčica) pa 23. Pomembno je, da so celice haploidne, saj materinske

celice prispevajo 50% genskih informacij pri razmnoževanju.

Pri mejozi sta potrebni dve delitvi DNA, zato delimo mejozo na dve stopnji, mejozo I in

mejozo II.

MEJOZA I: V profazi I postanejo kromosomi vidni. Homologna kromosoma mame in očeta

se združita. Nato pride do prekrižanja (crossing over), v katerem se materina DNA pomeša z

očetovo in zaradi naključnih mest stika med dvema kromatidama je omogočeno naključno

mešanje alelov, ki prispeva k unikatnosti organizma. V metafazi I se bivalenti (homologni

kromosomi) postavijo v ekvatorialno ravnino in pride do razpada jedrne ovojnice. V anafazi I

niti delitvenega vretena potegnejo kromosome na pola celice. V zadnji fazi mejoze I, telofazi I

delitveno vreteno razpade, pride do odvijanja kromosomov in nastanka nove jedrne ovojnice.

12

Sledi citokineza, ki razdeli celico v dve ločeni celici.

Rezultat mejoze I so celice s haploidnim številom kromosomov, vendar je vsak kromosom še

vedno sestavljen iz 2 sestrskih kromatid (podvojitev DNA pred mejozo I, v interfazi).

MEJOZA II: V mejozi II je pomembno, da pride do ločitve sestrskih kromatid.

Podobno se v profazi II kromosomi skrajšajo in zgostijo, da postanejo vidni in pride do

oblikovanja novega delitvenega vretena. V metafazi II pride do razgradnje jedrne ovojnice,

individualni kromosomi se postavijo v ekvatorialno ravnino v naključnem zaporedju. Niti

delitvenega vretena se povežejo z eno od sestrskih kromatid na centromerih. V anafazi II se

centromeri kromosomov razdelijo in vsaka od sestrskih kromatid postane samostojen

kromosom. Niti delitvenega vretena povlečejo kromatide na pola celice. V telofazi II se

kromosomi odvijajo in pride do oblikovanja nove jedrne ovojnice v vsaki od 4 haploidnih

celic, ki se pripravljajo na citokinezo.

Slika 3: Mejoza I in II (http://svet-biologije.com/wp-content/uploads/2014/07/mejozaa.jpg)

13

2.1.5 Razvojni krog S. pombe

S. pombe je enocelična gliva kvasovka, ki je znana po enostavni zgradbi genoma in zelo hitri

rasti.

Slika 4: Celični cikel S. pombe (http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/main4_files/stacks_image_88.png)

S. pombe ima dva razvojna življenjska cikla, vegetativnega ali mitotskega in mejotskega.

Pri glivi prevladuje mitotska delitev, ki je podobna tisti v večceličnih živalih. Ponavadi raste

in se množi v haploidni obliki, to pomeni, da vsaka celica vsebuje po eno kopijo vsakega

kromosoma.

Vegetativni cikel je prikazan na desni strani zgornje slike 4. Enako kot v zgornjem opisu

mitoze, je tudi tukaj najpomembnejši del podvojitev kromosomov, ki poteka v S fazi (sintezna

faza). Nato pride do ločitve kromosomov in delitve jedra ter ob koncu tudi celice s citokinezo.

Zanimivo je, da pride do ločitve celic v fazi S in G1 in ne takoj po mitozi. Z zgornje sheme

lahko razberemo da je pri S. pombe faza G2 še posebej dolga. Ostale faze, kot so G1, S

(podvojitev DNA) in M (mitotska faza) pa trajajo vsaka približno po 10% delitvenega časa.

14

Slika 5: Vegetativni cikel

Celice S. pombe pa se na pomanjkanje hranil odzovejo s prehodom v mejotski cikel, ki je

prikazan na levi strani slike 4. V neustreznih pogojih (pomanjkanje hranil, previsoka

temperatura) pa se celica združi z drugo celico, s katero tvorita diploidno zigoto in vstopita v

mejotsko delitev. Rezultat te delitve so 4 haploidne hčerinske celice ali asko spore, ki se

nahajajo v sporangiju. Ko se pogoji izboljšajo, začnejo spore kaliti in znova se pojavijo

haploidne celice. Mejoza deluje kot prilagoditev na neprimerne pogoje in celica s tem poskrbi

za popravo poškodb DNA (pride do rekombinacije).

Sposobnost S. pombe, da se lahko deli z mejotsko delitvijo in s tem izmenja ali ponovno

združi genske informacije, naredi glivo zelo močan in uporaben model genetskega sistema.

15

Slika 6: Celični cikel S. pombe (2)

(http://www.pha.jhu.edu/~ghzheng/old/webct/note7_3.files/17_004.jpg)

Slika 7: Interfaza S. pombe

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/66/Fission_yeast_cell_cycle_structure.jpg )

Slika 8: Citokineza cepitvenih gliv kvasovk

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c5/Fission_yeast_cytokinesis.jpg/600px-

Fission_yeast_cytokinesis.jpg)

Citokineza je pomemben del celičnega cikla, saj je zadnji proces celične delitve. Pri citokinezi

pride do oblikovanja delitvene brazde. Mutacije, ki se zgodijo v citokinezi lahko vplivajo na

motnje v razvoju celic, kot so smrt celic ali razvoj rakastih celic.

16

Nadzor velikosti celic S. pombe:

Slika 9: Nadzor rasti (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/05/Fission_yeast_cell_size.jpg)

Pri cepitvenih glivah kvasovka rast določa napredovanje skozi fazi G2 in M. Mutacija,

imenovana wee1, povzroča vstop zelo majhnih celic v mitozo. Posledica tega je krajša faza

G2 in podaljšana faza G1. Ta pojav nakazuje, da se napredovanje skozi začetno fazo

celičnega cikla odziva na celično rast. Celice mutanta wee1 so manjše kot divji tip celic,

vendar kljub temu je čas celičnega cikla enak pri obeh. Male celice rastejo počasnejše, kar

pomeni, da je celotna dodana masa na enoto časa manjša kot tista pri normalnih celicah.

Celice v pogojih z nižjimi vsebnosti hranil rastejo počasneje in potrebujejo več časa za

podvojitev in delitev. Slabši pogoji vplivajo torej na velikost celic. Celice v takšnih pogojih

napredujejo skozi celotni cikel z manjšo velikostjo. Če so celice izpostavljene visokim

temperaturam ali snovi, kot je vodikov peroksid, se število celičnih delitev in verjetnost

celične smrti povečata.

17

2.2 ADITIVI

Pri raziskovalni nalogi sem uporabljala aditive, ki jih bom kasneje podrobneje opisala. Prvi

odstavek 3. člena Pravilnika o aditivih za živila pravi: ''Aditiv je vsaka snov, ki se običajno ne

uporablja oziroma ne uživa kot živilo in ne predstavlja običajne, tipične sestavine živila, ne

glede na to, ali ima hranilno vrednost, se pa namensko dodaja živilu iz tehnoloških razlogov v

proizvodnji, predelavi, pripravi, obdelavi, pakiranju, transportu, hrambi in se zato nahaja v

živilu ali v stranskem proizvodu živila in s tem posredno ali neposredno postane sestavina

živila.'' (Uradni list RS, št. 43/2004, dne 26. 4. 2004).

Med aditive uvrščamo snovi, kot so hranila, sladkorni nadomestki, vsa sladila, antioksidante,

barvila, konzervanse, stabilizatorje in razne ojačevalce okusa. V Evropski uniji je registriranih

približno 1700 aditivov in 4500 arom, ki jih obravnajo posebej, čeprav spadajo med aditive.

Preden aditivi pridejo v uporabo, morajo biti opravljeni testi toksičnosti, ki so pogoj za izdajo

dovoljenja. Znano pa je, da rezultati testov niso popolnoma zanesljivi, zato dovoljenje za

uporabo teh velja le za določen čas. S testi toksičnosti pa je določen tudi dopustni dnevni vnos

(v nadaljevanju *ADI4) aditiva za odraslega človeka z maso 70 kilogramov. ADI določa, da

vsakodnevni vnos aditiva v času predvidene življenje dobe, ne bo ogrožal zdravja. Izražen je

v miligramih na kilogram telesne teže.

Znanstvene raziskave kažejo, da naj bi bila večina uporabljenih aditivov varna, kljub temu pa

se v prehrambni industriji velikokrat pojavljajo tudi taki aditivi, ki predstavljajo določeno

tveganje za zdravje uporabnikov.

V raziskovalni nalogi sem izbrala 5 aditivov iz različnih skupin in raziskala njihove lastnosti

in morebitne učinke na razvojni krog glive S. pombe. Zaradi lastnosti in genskega zapisa glive

lahko določena opažanja in ugotovitve prenesemo na področje človeka. Torej, raziskovane

snovi imajo podoben vpliv na človeške celice in posledično na človekovo zdravje.

4 ADI: Acceptable Daily Intake (dovoljen dnevni odmerek)

18

2.2.1 Skupine aditivov

Za boljše razumevanje bom podrobneje opisala posamezne skupine aditivov, ki sem jih

uporabljala pri raziskovanju, ostale bom samo omenila.

A. Dodatki za stabilizacijo:

KONZERVANSI- podaljšajo obstojnost živila

ANTIOKSIDANTI - podaljšajo obstojnost živila, preprečujejo kvarjenje živil zaradi

oksidacije

ZAŠČITNI PLINI - uporabljajo se pri pakiranju živila

EMULGATORJI - ohranjajo zmes dveh ali več faz, ki se sicer ne mešajo (npr. voda in

olje)

EMULGIRNE SOLI - spreminjajo beljakovine tako, da se razpršijo v siru

ZGOŠČEVALCI - povečajo viskoznost

ŽELIRNE SNOVI - tvorijo žele

STABILIZATORJI - stabilizirajo, ohranjajo ali okrepijo obstoječo barvo živila, ali

vzdržujejo fizikalno kemično stanje živila

B. Dodatki s senzoričnimi lastnostmi: barvila, sladila, ojačevalci arome

C. Dodatki pri predelavi živil in kot delovna pomagala: pH regulatorji, encimi, kulture,

mikroorganizmov, topila, nosilni plini, dodatki za bistrenje..

(VIR: Gordana Toth, uni.dipl.inž.živ.teh., Zavod za zdravstveno varstvo Murska Sobota)

KONZERVANSI so snovi, ki s preprečevanjem rasti mikroorganizmov (ki bi živilo

pokvarili), podaljšujejo rok uporabnosti živil. Poznamo približno 30 konzervansov,

največkrat pa so uporabljeni sulfiti in sulfati v izdelkih iz sadja in zelenjave ter v vinu,

nitriti in nitrati v mesnih in ribjih izdelkih, sirih ter sorbati in benzoati prav tako v

izdelkih iz sadja in zelenjave.

Mikroorganizmi, kot so bakterije, glive in kvasovke povzročajo spremembe v živilih,

19

zaradi katerih živilo ni več užitno. Na primer plesni, ki se pojavijo na živilih, lahko

proizvajajo strupene presnovke. Med najbolj znane spadajo Adlatoksini plesni

Aspergillus flavus, ki sodijo med zelo kancerogene snovi in lahko hkrati okvarijo tudi

jetra in živčevje.

Pogosto se uporablja več konzervansov hkrati, saj ni takega konzervansa, ki bi

učinkoval na vse mikroorganizme. Večina konzervansov prepreči delovanje kvasovk

in gliv, le benzojska kislina in njene soli pa varujejo živila tudi pred bakterijami.

Na embalaži živila mora biti jasno označeno in navedeno, kateri konzervansi so živilu

dodani.

Vrste konzervansov:

Ločimo konzervanse, katerih uporaba je dovoljena samo na površini živila in tiste, ki

jih dodajajo živilu samemu ter jih tudi zaužijemo. Delimo jih na naslednje skupine:

sorbinska kislina, benzojeva kislina, PHB-estri, žveplov dioksid in sulfiti, nitriti,

nitrati, propionska kislina, sorbinska kislina in sorbati.

Natančneje bom opisala skupino benzojevih kislin in benzoatov ter nitrite, saj sem v

raziskovalni nalogi uporabila konzervansa natrijev benzoat in natrijev nitrit.

Benzojeva kislina in benzoati:

Benzojeva kislina spada med konzervanse, ki lahko ogrožajo zdravje ljudi s

preobčutljivimi reakcijami na acetilsalicilno kislino (nahaja se tudi v aspirinu).

Mnogim se po zaužitju benzoatov na koži pojavijo posebni izpuščaji, imenovani tudi

koprivnica ali urtikarija. Na benzoate so občutljivi tudi astmatiki, ki se nanje odzovejo

z raznimi alergijami. Vsem alergikom se njihovo uživanje odsvetuje. Prav tako morajo

biti pozorni na živila, v katerih se benzojeva kislina pojavlja naravno (brusnice, maline,

ribez, slive, borovnice...).

Dejstvo je, da je mogoče benzojevo kislino nadomestiti z drugimi, zdravju

prijaznejšimi aditivi. Zakaj torej sploh tolerirati slabe strani uporabe tega aditiva?

20

Nitriti:

Nitriti so soli solitrne kisline, ki so v postopku razsoljevanja mesnih izdelkov

najučinkovitejša metoda za preprečevanje zastrupitev z živili. Kljub temu, da bi ob

ukinitvi razsoljevanja mesnih izdelkov poraslo število zastrupitev, ne smemo

spregledati posledičnega tveganja za zdravje. Najvišji dnevni odmerek nitritov, ki jih

sme človek uživati, ne da bi to ogrozilo njegovo zdravje, je 0,1 mg natrijevega nitrita

na kilogram telesne teže na dan. Z zaužitjem 50 mg presne gnjati, ki vsebuje 150 mg

ostankov nitrita na kilogram, 70 kg težek človek, dnevno mero zlahka preseže.

Poleg tega pa se pojavi tudi tveganje nastanka rakotvornih nitrozaminov, ki nastajajo

iz nitritov in biogenih aminov. Najbolj kancerogen je N-nitrozodimetilamin (NDMA),

ki se pojavlja v mesu. V izdelkih kot so pečenice in klobase za peko na žaru, uporaba

nitritnih soli ni dovoljena, saj se nevarne N-nitrozo spojine pojavljajo le pri visokih

temperaturah.

ANTIOKSIDANTI so snovi, ki imajo antioksidacijski učinek in jih najdemo v skoraj

vseh živilih. V prehrambni industriji jih dodajajo hrani, saj varujejo živila pred

vplivom kisika in s tem podaljšajo njihovo obstojnost. Če živilom ne bi dodajali

antioksidantov, bi ta izgubila veliko vitaminov A in C, maščoba bi postala žarka, sadje

in zelenjava pa bi se zaradi prisotnosti naravnega encima polifenoloksidaze razbarvala.

Vitamina C in A sta naravna antioksidanta, vendar se pri tehnološki pripravi živil, kot

je npr. postopek rafiniranja jedilnih olj, 15-40% tega učinka izgubi. Izgube na primer

vitaminov morajo nadomestiti z dodajanjem sintetičnih tokoferolov (=vitamin E) ali

preprečiti z dodajanjem antioksidantov.

Antioksidante bi lahko opredelili kot skupino konzervansov, ki preprečijo kvarjenje

maščob tako, da preden pride kisik iz zraka v stik s sestavinami živila, ga prestrežejo

in kemično vežejo nase. V nekaterih primerih pa lahko izboljšajo živilo, kljub že

obstoječi oksidaciji. Zavedati pa se je treba, da postanejo antioksidanti čez čas

neučinkoviti, saj preprečujejo kvarjenje le za določen čas. V živilih se uporablja več

antioksidantov hkrati, ki tako delujejo v zelo majhnih koncentracijah in se homogeno

porazdelijo po živilu. Tako so manj toksični in se pri obdelavi živila ne izničijo

povsem.

21

Znanih je 17 skupin antioksidantov, med najpogostejše naravne antioksidante pa

spadajo:

vitamin C ali askorbinska kislina (E 300),

citronska kislina (E 330),

vinska kislina (E334)

in drugi.

Večina antioksidantov, ki se dodajajo živilom je identičnih naravnim snovem, vendar

se večinoma pridelujejo umetno. Te snovi naj ne bi imele negativnih učinkov na

zdravje, saj so v večini primerov to naravne sestavine naših živil oziroma se lahko v

telesu med presnovo normalno pretvorijo.

Obstajajo pa tudi sintetični antioksidanti, ki nimajo z naravnimi sestavinami živil

nikakršne kemične sorodnosti. Umetni antioksidanti pa lahko ogrožajo zdravje in

povzročajo določene alergijske reakcije. Poskrbljeno mora biti, da je njihova uporaba

med industrijsko pripravo omejena na najnižjo možno količino in se dodajajo zgolj iz

zdravstvenih ali nekaterih ekonomskih razlogov. Na primer, hitro pokvarljive maščobe

lahko vsebujejo peroksid, ki predstavlja veliko tveganje zdravju.

Med najpogostejše sintetične antioksidante spadajo:

propil galat E 310

izoaskorbinska kislina E 315

natrijev izoaskorbat E 316

ŽIVILA:

juhe, omake za pečenko, globoko zamrznjeni in delno ocvrti izdelki iz

krompirja, prigrizki na osnovi žit, marcipan, prigrizki iz arašidov, žvečilni

gumi, arome…

22

2.3 LASTNOSTI IZBRANIH SNOVI

2.3.1 Natrijev nitrit

Natrijev nitrit je bel kristalen prah, ki je dobro topljiv v vodi in vpija vlago iz zraka (je

higroskopski). Njegova kemijska formula je NaNO2, skupaj s kisikom pa oksidira v NaNO3

(natrijev nitrat), ki je znan kot močna oksidacijska mešanica. Natrijev nitrit služi kot barvno

ustvarjalen (živilu daje zaželeno rdečo barvo) in kot varovalen dodatek v mesu in ribah,

preprečuje namreč rast bakterije Clostridium botulinum, ki povzroča botulizem5. Toplotna

obdelava teh živil namreč bakterije ne uniči. Toksin botulin je najmočnejši znani biološki

strup, saj je za človeka smrtonosni odmerek desetmilijoninka grama botulina.

Natrijev nitrit je v prehrambni industriji znan kot konzervans, saj podaljšuje obstojnost živil.

Dejstvo je, da brez dodatka tega aditiva nekaterim mesnim izdelkom, ki niso bili zoreni več

mesecev (t.j. kraški pršut), bi bilo tveganje za preživetje patogenih mikroorganizmov (npr.

salmonela, pseudomonade) večje.

V Evropski Uniji se natrijev nitrit uporablja samo v mešanici s soljo, ki lahko vsebuje največ

0,6% NaNO2. Kot vsi ostali aditivi se označuje s črko E, pod oznako E250.

Stranski učinki: Natrijev nitrit naj bi povzročal hiperaktivnost in imel nekatere druge stranske

učinke. Je tudi potencialno rakotvoren (povzroča raka na želodcu) in uporaba nitrita je v

nekaterih državah celo omejena.

Nitriti v mesu lahko med kuhanjem pod določenimi pogoji reagirajo z razgradnimi produkti

amonokislin in z njimi tvorijo nitrozamine6, ki so bolj znani kot rakotvorne snovi.

2.3.2 Amonijev sulfat

Amonijev sulfat je anorganska spojina s formulo (NH4)2SO4 in je sol dušika in žveplove

kisline. Vsebuje 21% dušika in 24% žvepla. Pogosto jo uporabljajo kot umetno gnojilo,

5 botulizem: bolezen zaradi okužbe z nevrotoksinom botulinom (proizvajajo ga bakterije Clostridium botulinum),

do okužbe pride zaradi nepravilno konzervirane hrane. Bolezen se kaže z ohromitvijo mišič po celotnem telesu,

tudi smrtonosno. 6 nitrozamini: kancerogene snovi, ki nastajajo endogeno v kislih pogojih v želodcu

23

preseneti pa dejstvo, da se v manjših količinah dodaja tudi kruhu, pecivu in drugim

pekovskim izdelkom. Ponavadi ga dodajajo za izboljšanje barve tovrstnih izdelkov, kemijske

spojine z dušikom pa se dodajajo tudi preveč kisli hrani za nevtraliziranje. Amonijev sulfat v

pekarstvu služi kot vir dušika, ki je pomemben za vzhajanje testa iz kvasa, saj deluje kot nek balzam

za testo. Najdemo ga tudi v ovojih za klobase in v proizvodnji pijač. Uporablja se pri izdelavi penine,

po novem pa tudi pri izdelavi piva z nizko vsebnostjo ogljikovih hidratov.

Kot aditiv (regulator kislosti) se navaja pod oznako E517 in ne velja za nevarnega. Kljub temu bom

preverila njegov vpliv na razvojni krog S. pombe.

Slika 10: Kemijska struktura amonijevega sulfata

(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/65/Ammonium_sulfate.png)

2.3.3 Kalijev bromat (KBrO3)

Kalijev bromat je kalijeva sol bromatne kisline HBrO3 in je pri sobni temperaturi v obliki

brezbarvnih kristalov. Kalijev bromat je tudi zelo močen oksidant in eden izmed aditivov, pod

oznako E924. Dodajali so ga v testo za kruh, saj je povečal delovanje glutena in posledično je

bil kruh bolj elastičen. Zaradi tega razloga so ga dodajali tudi v kruh z malo ali brez glutena.

Med peko naj bi se kalijev bromat porabil, vendar ga je včasih vseeno nekaj ostalo v kruhu.

Ob zaužitju je dokazano rakotvoren, povzroča namreč raka ščitnice in raka na ledvicah. Če se

ga zaužije oralno, deluje kot nevrotoksin in lahko povzroči izgubo sluha in nekatere kronične

bolezni.

Prisoten je v pitni vodi kot posledica uporabe ozona v pripravi vode, če ima ta naravno

prisotni bromidni ion. Nahaja se tudi v nekaterih plastenkah mineralne vode, v katerih ostane

kot stranski produkt dezinfekcije.

Od leta 1990 je v Evropi prepovedan, na Kitajskem od leta 2005, v ZDA pa je še zmeraj

dovoljen.

24

2.3.4 Natrijev benzoat

Natrijev benzoat je natrijeva sol benzojeve kisline in se v prehrambni industriji uporablja kot

konzervans z oznako E211. Je kemični konzervans, ki ga je U.S. Department of Health and

Human Services (DHHS) uvrstila na listo rakotvornih snovi. V Veliki Britaniji in ZDA spada

med prepovedane aditive, v Sloveniji je dovoljen in dostopen v vseh živilskih trgovinah.

Uporaba in živila, ki ga vsebujejo: Uporablja se za podaljšanje obstojnosti živil, za ohranjanje

okusa in vonja živila. Živilom pa se dodaja tudi zaradi privlačnejšega videza in regulacije

kislosti. Poleg tega se uporablja za konzerviranje brezalkoholnih gaziranih in alkoholnih pijač.

Prisoten je v zobnih pastah, razni kozmetiki in zdravilih ter ustnih vodicah. Živila, v katerih se

nahaja so naslednja: solatni prelivi, sadne solate, marmelade, želeji, mesni in mlečni izdelki,

vložene kisle kumarice…

Učinki: Natrijev benzoat naj bi povzročal hiperaktivnost pri otrocih in nekatere genske

spremembe. Natrijev benzoat lahko ob stiku z vitaminom C reagira in pride do procesa

dekarboksilacije, ki vodi do nastanka škodljivega benzena. Benzen je aromatična kemična

spojina, ki je rakotvorna. Ob daljši izpostavljenosti vpliva na zmanjšanje rdečih krvnih celic

(anemija) in prizadene delovanje imunskega sistema. Telo je bolj izpostavljeno okužbam in

velika je možnost levkemije.

Slika 11: Natrijev benzoat

(http://www.lamba.hr/lmb/wp-content/uploads/2011/05/natrijev_benzoat.png in http://www.lamba.hr/lmb/wp-content/uploads/2011/05/natrijev_benzoat.png)

25

2.3.5 Citronska kislina

Citronska kislina s formulo C6H8O7 je šibka organska kislina, ki jo vsebuje večina sadja

(največ je vsebujejo citrusi). Po sestavi je podobna vitaminu C in se uporablja kot naravni

konzervans, ki ga označujemo z E330.

Iz vidika biokemije je potrebno omeniti, da je citronska kislina vključena v tako imenovan

Krebsov cikel, ki poteka v vseh živih celicah. Cikel citronske kisline (=Krebsov cikel) je eden

najpomembnejših metabolnih procesov, pri katerem se sprošča energija in je nujno potreben

za proces dihanja. Ogljikovi hidrati oksidirajo v CO2 in H2O, pri tem pa se sprošča energija,

ki se nato shrani v molekulah ATP. Brez citronske kisline celice ne bi mogle opravljati tega

cikla.

Za kaj se uporablja in kje jo najdemo?

Citronsko kislino uporabljajo za obarvanje hrane in regulacijo pH v živilski industriji.

Uporablja se tudi kot aditiv in sicer kot aroma in konzervans v hrani in pijači, velikokrat se

pojavlja v brezalkoholnih pijačah.

Z natrijevim hidrogenkarbonatom se uporablja za izdelavo šumečih tablet, praškov in zrnc.

Vsebujejo jo tudi raztopine z antikoagulantnim7 delovanjem in pripravki, ki se uporabljajo

predvsem za raztapljanje ledvičnih kamnov. Citronska kislina lahko deluje tudi rahlo

odvajalno.

Citronska kislina je v velikih količinah prisotna predvsem v citrusih, ker pa je izolacija kisline

iz njih dokaj draga, jo pridelujejo s pomočjo bakterij in kvasovk.

Uporablja se kot sredstvo za povečanje kislosti v proizvodnji marmelad in piva. Preprečuje

kristalizacijo sladkorja, zato z njo stabilizirajo razne sladkarije in peciva. Znano je tudi, da

citronska kislina izboljša delovanje antioksidantov (askorbinska kislina) in preprečuje proces

rjavenja. Nahaja se tudi v naslednjih živilih: mozzarela, pakirano mleto mesto, zmrznjena

živila, sadni kompoti, želeji, marmelade, pekarski proizvodi, keksi, mlečni proizvodi,

majoneza, kreme, praški za puding, brezalkoholni osvežujoči napitki, instant čaj, gorčica…

7 antikoagulant: snov, ki preprečuje nastajanje krvnih strdkov

26

Slika 12: Citronska kislina

(http://oetker.blob.core.windows.net/format/1162891/636x380/0/Citronska-kislina.png in

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/sl/thumb/3/3c/Karbokisline_002.png/170px-Karbokisline_002.png)

27

3. METODOLOGIJA DELA

Za raziskovanje vplivov aditivov na razvojni krog S. pombe sem uporabila metodo

mikroskopiranja in merjenja gostote gojišča/prosojnosti gojišča s spektrometrom.

3.1 NAČRT EKSPERIMENTA

Po spoznanem teoretičnem ozadju (razvojni krog S. pombe, mejotska in mitotska delitev,

aditivi, lastnosti uporabljenih snovi..) sem izvedla eksperiment.

3.1.1 Raziskovalno vprašanje

Ali bodo dodani aditivi (natrijev benzoat, amonijev sulfat, kalijev bromat, natrijev nitrit in

citronska kislina) vplivali na razvojna kroga glive S. pombe (SEV: ZIM 1778 iz Zbirke

industrijskih mikroganizmov)?

Ali bi lahko na osnovi pojavljanja le posameznih celic razvojnega cikla S. pombe izdelali

biotest, s katerim bi preverjali škodljivost posameznih aditivov?

3.1.2 Hipoteze in napovedi

I. Aditivi bodo vplivali na razvojna kroga glive kvasovke S. pombe. Pojavljale se bodo

le določene celice razvojnega kroga, ki se bodo raziskovale po velikosti, glede na

kontrolo (t. j. gojišče brez aditivov).

3.1.3 Konstante in spremenljivke

A) KONSTANTE

i. temperatura

ii. sestava gojišča (YPD)

iii. čas izpostavljenosti glive aditivom

B) SPREMENLJIVKE

i. NEODVISNA: koncentracija aditivov

ii. ODVISNA: spremembe tipov in velikosti celic mitotskega in mejotskega cikla

28

3.1.4 Material in aditivi

Spodaj so naštete snovi, pripomočki in laboratorijska steklovina, ki sem jo potrebovala pri

eksperimentu.

kvasni ekstrakt

agar

glukoza

pepton

destilirana voda

kultura glive

Schizosaccharomyces pombe

(ZIM 1778 iz Zbirke

industrijskih mikroganizmov)

citronska kislina

natrijev benzoat

amonijev sulfat

kalijev bromat

natrijev nitrit

natrijev benzoat

rokavice

žlička

palčka

čaše

gorilnik

grelna plošča

epruvete

stojalo

zamaški za epruvete

erlenmajerica

petrijevka

cepilna zanka

tehtnica

merilni valj

avtomatska pipeta, pipeta

kapalka

krovna in objektna stekla

metilensko modrilo

alkoholni flomaster

mikroskop Nikon Eclipse E800

spektrometer SpectroVis Plus

29

3.2 IZVEDBA EKSPERIMENTA

3.2.1 Priprava gojišča

Najprej je bilo potrebno za glivo pripraviti primerno gojišče. Za pripravo osnovnega tekočega

gojišča YEPD ali YPD8 sem v 400 mL destilirane vode dodala 2 g kvasnega ekstrakta, 2 g

peptona, 4 g glukoze. Za pripravo trdega gojišča se dodata še 2 g agarja na 100 mL.

(Gojišče na 100 mL: 0,5 g kvasnega ekstrakta, 0,5 g peptona, 2 g glukoze).

3.2.2 Priprava koncentracij aditivov

Snovi sem s stekleno palčko premešala, čašo postavila na grelno ploščo in počakala, da zavre.

Medtem, ko se je gojišče ohlajalo, sem odtehtala aditive in jih dala v 50 mL čaše ter dolila

gojišče YPD. Koncentracije snovi sem določila glede na njihovo dodajanje prehrambnim

izdelkom. Podatke o koncentraciji natrijevega benzoata in citronske kisline sem razbrala z

vrečk, v katerih sta aditiva pakirana. Na 1 l tekočine se doda 1,5 g, citronske kisline,

natrijevega benzoata pa na 300 mL 20g. Za ostale aditive sem podatke našla na spletni strani,

kjer je zbran seznam vseh aditivov in količina, ki se dodaja določenih izdelkom.

(http://www.krenizdravo.com/prehrana/aditivi-u-hrani-e-brojevi-kompletan-popis) Podatke o

koncentraciji za amonijev sulfat, natrijev nitrit in kalijev bromat sem določila glede na to,

koliko se jih dodaja kruhu in ostalim pekarskim izdelkom.

1. čaša: 0, 075 g NATRIJEV BENZOAT + 50 mL YPD

2. čaša: 0,05 g AMONIJEV SULFAT + 50 mL YPD

3. čaša: 0,023 g NATRIJEV NITRIT + 50 mL YPD

4. čaša: 0,01 g KALIJEV BROMAT + 50 mL YPD

5. čaša: 3,33 g CITRONSKA KISLINA + 50 mL YPD

6. čaša: KONTROLA (50 mL YPD)

3.2.3 Potek dela

Pripravila sem 18 epruvet in 18 pokrovčkov ter jih razdelila na 6 skupin. Epruvete 1.1, 1.2 in

1.3 so vsebovale 10 mL gojišče z natrijevim benzoatom, 2.1, 2.2 in 2.3 gojišče z amonijevim

sulfatom, 3.1, 3.2 in 3.3 gojišče z natrijevim nitritom, 4.1, 4.2 in 4.3 gojišče s kalijevim

8 YEPD: yeast extract peptone dextrose

30

bromatom, 5.1, 5.2 in 5.3 gojišče s citronsko kislino in epruvete 6.1, 6.2 in 6.3 s kontrolo. Na

epruvete sem dala pokrovčke, jih dala v dve veliki časi in pokrila z aluminijasto folijo.

Nato je sledila sterilizacija. Pri tem postopku mi je pomagala laborantka. Sterilizacija z vlažno

toploto je potekala v avtoklavu, kjer se z vodno paro pri 121º C po približno 15 minutah

uničijo vsi morebitni živi organizmi.

Naslednji dan sem v tekoče gojišče nasadila glivo in čakala, da se ta razmnoži. Nasaditev sem

opravljala v sterilnem okolju. S cepilno zanko sem na sveža gojišča precepila kulturo glive S.

pombe ZIM 1778 iz Zbirke industrijskih mikroganizmov.

Po treh dneh sem začela z mikroskopiranjem. Mikroskopirala sem na Fakulteti za

naravoslovje in matematiko v Mariboru, na mikroskopu Nikon Eclipse E800. Za vsako

epruveto sem pripravila en preparat (skupaj 18 preparatov). S cepilno zanko sem na objektno

steklo nanesla gojišče z aditivi, dodala kapljico metilenskega modrila in pokrila s krovnim

steklom. Mikroskopirala sem na 100x povečavi in s pomočjo računalnika videno tudi

poslikala. Nato sem s programom ImageJ izmerila dolžino vseh celic in jih uvrstila v faze

mitotske ali mejotske delitve. ImageJ je program, ki si ga je možno brezplačno naložiti na

računalnik. Dostop do povezave za namestitev programa in vse ostale informacije sem našla

na spletni strani s spletnim naslovom: http://imagej.nih.gov/ij/.

Dodala sem slike, ki so bile slikane med mikroskopiranjem.

Slika 13: Celice S. pombe v gojišču z natrijevim benzoatom

31

Slika 14: Celice S. pombe v gojišču z amonijevim sulfatom

Slika 15: Celice S. pombe v gojišču z natrijevim nitritom

Slika 16: Celice S. pombe v gojišču s kalijevim bromatom

32

Slika 17: Celice S. pombe v gojišču s citronsko kislino

Slika 18: Celice S. pombe v gojišču brez aditivov (kontrola)

SPEKTROFOTOMETRIJA spada med molekulsko absorpcijsko spektrometrijo, pri kateri se

meri absorpcija svetlobe ob prehodu skozi določeno raztopino v vzorcu. S spektrometrom

SpectroVis Plus sem pri valovni dolžini 600,4 nm merila absorpcijo svetlobo v gojiščih z

dodanimi aditivi in pri kontrolni skupini. Podatki so se zbirali na računalniku v programu

Logger Pro. Najprej sem spektrometer kalibrirala na gojišče, kateremu ni bila dodana kultura

glive S. pombe. Nato sem v kivete s kapalko dodala vzorec vsakega gojišča.

Rezultate mikroskopiranja in merjenja absorpcije s spektrometrom sem zbrala in statistično

obdelala.

33

Slika 19: Epruvete z YPD in aditiv

Slika 20: Priprava na mikroskopiranje

34

Slika 21: Nikon Eclipse E800

(http://www.labexchange.com/products/technical/9807%20Nikon%20Eclipse%20E800M-image002.jpg)

Slika 22: Spektrometer (http://www.vernier.com/images/cache/product.svis-pl._hero.001.590.332.jpg)

35

4. REZULTATI

V tem delu sem s tabelami, grafi in tortnimi diagrami prikazala obdelane podatke. Iz

dobljenih slik pri mikroskopiranju sem izmerila dolžino vseh celic, jih uvrstila v skupine, ki

so prikazane v spodnji tabeli.

Podatke sem statistično obdelala s programom Excel. Določila sem povprečne dolžine celic v

mitotskem in mejotskem ciklu, izračunala standardno deviacijo9 (na grafih označeno s S. D.),

izrazila deleže celic v posameznih fazah mitoze in mejoze ter delež celic v mitotskem in

mejotskem ciklu. Gojiščem z dodanimi aditivi sem določila tudi mitotski indeks10

Tabelni prikazi so dodani v prilogi.

Razvrstitev celic S. pombe v posamezne mitotske in mejotske faze:

Tabela 1: Slikovni prikaz mitotskih faz

FAZE MITOZE SLIKOVNI PRIKAZ

1=G1

2=S

3=G2

4=M

Tabela 2: Slikovni prikaz mejotskih faz

FAZE MEJOZE SLIKOVNI PRIKAZ

I (faza konjugacije)

II (mejoza I)

III (mejoza II)

IV (faza sporulacije)

9 standardna deviacija/odklon: za merjenje statistične razpršenosti podatkov

10 mitotski indeks (MI): delež delečih se celic v mitozi

36

4.1 REZULTATI: NATRIJEV BENZOAT

Graf 1: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim NATRIJEVIM BENZOATOM

Tortni diagram 1.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 1.2: Število celic v fazah MEJOZE

5,3

1,5

4,7

1,6

5,1 4,6

4,9

1,8

4,2

1,3

0 0

6,9

0

4,6

1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

MITOZA MEJOZA S. D.

PO

VP

RE

ČN

A D

OL

ŽIN

A C

EL

IC (

µm

±0

,1

FAZE MITOZE IN MEJOZE

1=G1

2=S

3=G2

4=M

I

II

III

IV

8%

21%

43%

28%

MITOZA 1=G1 2=S 3=G2 4=M

75%

6%

19%

MEJOZA

I II III IV

37

Tortni diagram 1.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini

natrijevega benzoata

MITOZA 75%

MEJOZA 25%

38

4.2 REZULTATI: AMONIJEV SULFAT

Graf 2: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim AMONIJEVIM SULFATOM

Tortni diagram 2.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 2.2: Število celic v fazah MEJOZE

9,9

3,5 3,7

2

4,1

0,5

5

1,2

3,8

1,1

7 7

3,4

0,7

4,5

0,8

0

2

4

6

8

10

12

MITOZA MEJOZA S. D.

PO

VP

REČ

NA

DO

LŽIN

A C

ELIC

(µ

m±0

,1)

FAZE MITOZE IN MEJOZE

1=G1

2=S

3=G2

4=M

I

II

III

IV

12%

31%

26%

31%

MITOZA

1=G1 2=S 3=G2 4=M

50%

23%

4%

23%

MEJOZA

I II III IV

39

Tortni diagram 2.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini amonijevega

sulfata

MITOZA 70%

MEJOZA 30%

40

4.3 REZULTATI: NATRIJEV NITRIT

Graf 3: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim NATRIJEVIM NITRITOM

Tortni diagram 3.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 3.2: Število celic v fazah MEJOZE

7,4

5,1

3,3

1

3,4

0,9

5,8

2,1

3,1

1,1

6,2

0,6

5,7

1,2

7,2

3

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

MITOZA MEJOZA S. D.

PO

VP

REČ

NA

DO

LŽIN

A C

ELIC

(µ

m±0

,1)

FAZE MITOZE IN MEJOZE

1=G1

2=S

3=G2

4=M

I

II

III

IV

9%

28%

49%

14%

MITOZA

1=G1 2=S 3=G2 4=M

21%

57%

11%

11%

MEJOZA

I II III IV

41

Tortni diagram 3.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini natrijevega

nitrita

MITOZA 85%

MEJOZA 15%

42

4.4 REZULTATI: KALIJEV BROMAT

Graf 4: Povprečne dolžine celic S. pombe v gojišču z dodanim KALIJEVIM BROMATOM

Tortni diagram 4.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 4.2: Število celic v fazah MEJOZE

7,1

2,5

3,5

1,2

3,9

0,8

6,3

3,1

3,8

1

2,8

0,2

3,5

0,5

7

1,2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

MITOZA MEJOZA S. D.

PO

VP

REČ

NA

DO

LŽIN

A C

ELIC

(µ

m±0

,1)

FAZE MITOZE IN MEJOZE

1=G1

2=S

3=G2

4=M

I

II

III

IV

8%

15%

54%

23%

MITOZA

1=G1 2=S 3=G2 4=M

57%

7%

22%

14%

MEJOZA

I II III IV

43

Tortni diagram 4.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v raztopini kalijevega

bromata

MITOZA 95%

MEJOZA 5%

44

4.5 REZULTATI: KONTROLA

Graf 5: Povprečne dolžine celic S. pombe: KONTROLA

Tortni diagram 5.1: Število celic v fazah MITOZE / Tortni diagram 5.2: Število celic v fazah MEJOZE

7,4

1,7

3,9

1,5

4,3

1,0

7,8

2,0

5,5

1,9

12,7

6,4

2,3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

MITOZA MEJOZA S.D.

PO

VP

REČ

NA

DO

LŽIN

A C

ELIC

(µ

m±0

,1)

FAZE MITOZE IN MEJOZE

1=G1

2=S

3=G2

4=M

I

II

III

IV

15%

18%

42%

25%

MITOZA

1=G1 2=S 3=G2 4=M

54%

4%

8%

34%

MEJOZA

I II III IV

45

Tortni diagram 5.3: Odstotni delež celic S. pombe v mitozi in mejozi v kontrolni skupini

MITOZA 85%

MEJOZA 15%

46

4.6 MITOTSKI INDEKS

𝒎𝒊𝒕𝒐𝒕𝒔𝒌𝒊 𝒊𝒏𝒅𝒆𝒌𝒔 =š𝒕𝒆𝒗𝒊𝒍𝒐 𝒄𝒆𝒍𝒊𝒄 𝒗 𝒎𝒊𝒕𝒐𝒛𝒊

𝒔𝒌𝒖𝒑𝒏𝒐 š𝒕𝒆𝒗𝒊𝒍𝒐 𝒄𝒆𝒍𝒊𝒄

Tabela 3: Vrednosti mitotskega indeksa

ADITIVI MITOTSKI INDEKS

NATRIJEV BENZOAT 0,38

AMONIJEV SULFAT

0,40

NATRIJEV NITRIT 0,17

KALIJEV BROMAT 0,31

KONTROLA 0,34

Graf 6: Mitotski indeks celic S. pombe v gojiščih z raztopinami vseh aditivov

Natrijevbenzoat

Amonijevsulfat

Natrijev nitrit Kalijev bromat Kontrola

Nizi 1 0,38 0,4 0,17 0,31 0,34

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Mit

ots

ki in

de

ks

47

Tortni diagram 6: Vrednosti mitotskega indeksa v kontroli in po dodatku aditivov

4.7 MERJENJE ABSORPCIJE SVETLOBE S SPEKTROMETROM

Tabela 4: Prosojnost gojišč z dodanimi aditivi

GOJIŠČE Z DODANIM

ADITIVOM

PROSOJNOST

NATRIJEV BENZOAT 0,19

AMONIJEV SULFAT

0,12

NATRIJEV NITRIT 0,21

KALIJEV BROMAT 0,30

CITRONSKA KISLINA 0,03

KONTROLA 0,31

0,38

0,4

0,17

0,31

0,34 Natrijev benzoat

Amonijev sulfat

Natrijev nitrit

Kalijev bromat

Kontrola

48

Graf 6: Prosojnost gojišč z dodanimi aditivi

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Natrijevbenzoat

Amonijevsulfat

Natrijevnitrit

Kalijevbromat

Citronskakislina

Kontrola

PR

OSO

JNO

ST

PROSOJNOST

49

5. INTERPRETACIJA IN RAZPRAVA

Znana sta dva mutanta glive S. pombe, en tip predstavljajo mutanti, katerih celice so

podaljšane. Imenujejo se CDC in celice tega tipa se ne morejo deliti, vendar še zmeraj rastejo

in se podaljšujejo ter so zaradi tega abnormalne velike. Drugi tip pa predstavljajo celice, ki so

izjemno majhne, mutant se imenuje WEE. Pri tej vrsti so okvarjeni proteini, ki bi celici (ker je

premajhna) preprečili nadaljnjo delitev. Zaradi tega se celice vedno znova delijo.

Iz vseh podatkov lahko razberemo, da so celice vseh 4 raztopin vstopile v celični cikel zelo

male. To nakazuje, da so se razvili mutanti Wee.

Pojasniti je treba, da med obdelanimi podatki ni rezultatov gojišča, kateremu je bila dodana

citronska kislina, saj je imela ta prevelik vpliv na glivo. Razvilo se je malo celic, katerih

vzorec pri obdelavi ne bi bil reprezentativen. S spektrometrom sem izmerila absorpcijo, ki je

imela najnižjo vrednost od vseh vzorcev, le 0,03. Torej, čim manjša je absorpcija svetlobe,

tem večja je prosojnost, kar nakazuje na manjšo gostoto gojišča in na to, da se celice glive S.

pombe v prisotnosti citronske kisline niso namnožile, najverjetneje zaradi prenizke pH

vrednosti, ki je v gojišču merila 1.

Pri gojišču, kateremu je dodan natrijev benzoat, lahko opazimo, da je 75% celic v mitotskem

in 25% v mejotskem ciklu. V primerjavi s kontrolo, je za 10% več celic v fazi mejoze. V

gojišču z natrijevim benzoatom je bila najdaljša povprečna dolžina celic mitotskega cikla 5,3

µm in to v fazi G1, kar je v primerjavi z ostalimi rezultati za več kot 2 µm krajše. V fazi S

(4,7 µm) in G2 (5,1 µm) so bile celice daljše v primerjavi z drugimi gojišči. V fazi M pa so

celice ponovno krajše kot druge. Največji delež celic se nahaja v mitotski fazi G2, kar 43% in

najmanj v fazi G1 (8%). V mejotskem ciklu se je 75% celic nahajalo v I. fazi (faza

konjugacije), nič jih pa ni bilo v II fazi (faza mejoze I). V primerjavi z ostalimi gojišči so bile

celice v fazi mejoze II podaljšane, vendar v primerjavi s kontrolo še zmeraj manjše.

V gojišču z amonijevim sulfatom je bilo 70% celic v mitotskem in kar 30% v mejotskem

ciklu, kar je najvišji delež med vzorci in je dvakrat večji od deleža celic kontrolne skupine.

Povprečna dolžina celic v fazi G1 je daljša od ostalih, celice so v povprečju merile 9,9 µm,

kar kaže na signifikantno podaljšanje celic, saj so pri kontroli bile celice te faze povprečno

dolge 7,4 µm. Amonijev sulfat je znan kot umetno gnojilo, kar bi lahko povezali z njegovim

vplivom na podaljšanje celic. Nekoliko daljše celice se pojavljajo tudi v fazah S in G1. Pri

50

mitotski M fazi pa so bile celice za skoraj 3 µm krajše od celic kontrolne skupine. Enak delež

celic se je nahajal v fazah S in M, najmanjši delež pa se je nahajal v fazi G1.

Pri mejotskem ciklu so bile celice najdaljše v fazi mejoze I in najkrajše v fazi mejoze II. Kar

50% celic se je nahajalo v I. mejotski fazi, fazi konjugacije, najmanj pa jih je bilo v mejozi II.

V gojišču z natrijevim nitritom so celice v fazah S in G2 najkrajše od opazovanih vzorcev.

Glede na kontrolo so celice v fazi M za 2 µm krajše, vendar daljše v primerjavi z ostalimi

vzorci. Skoraj polovica (49%) celic se nahaja v mitotski fazi G2, najmanj (8%) se jih nahaja v

G1.

V mejotski fazi lahko opazimo podaljšanje celic v fazi sporulacije (IV), saj so celice dolge kar

7,2 µm, kar je za več kot 1 µm več kot v kontrolni skupini. Celice so krajše od kontrolne

skupine v fazi konjugacije in mejozi II. Največji delež celic se nahaja v mejozi I, kar 57%.

Delež celic v mitozi (85%) in mejozi (15%) je enak deležu v kontrolni skupini.

V gojišču s kalijevim bromatom je kar 95% celic v mitotskem ciklu in le 5% v mejotskem. To

nakazuje na primerne pogoje za rast celic, kar se pokaže tudi z dolžinami celic v mitotskem

ciklu, ki ne odstopajo signifikantno od celic kontrolne skupine. Le celice v fazi M so 1,5 µm

krajše od celic kontrole. Več kot polovica celic se nahaja v fazi G2, najmanj pa jih je v fazi

G1.

V mejotski fazi so celice v fazi konjugacije, mejozi II in predvsem v mejozi I skrajšane.

Daljše celice se pojavijo v fazi sporulacije. Največji delež jih je v fazi konjugacije in

najmanjši v mejozi I.

MITOTSKI INDEKS:

Mitotki indeks je višji tam, kjer se več celic nahaja v fazi delitve.

Iz podatkov lahko razberemo, da je najvišja vrednost mitotskega indeksa 0,4 t.j. pri gojišču z

dodanim amonijevim sulfatom. Amonijev sulfat se uporablja tudi kot umetno gnojilo, kar

lahko povežemo z velikim deležem celic v fazi delitve. Najnižji indeks (0,17) pa je pri

natrijevem nitritu. V tem gojišču je bilo v fazi delitve najmanj celic, kar lahko nakazuje na

neprimerne pogoje za delitev celic.

51

ABSORPCIJA:

Večja vrednost absorpcije svetlobe nakazuje na manjšo prosojnost in večjo gostoto celic,

prisotnih v gojišču.

Iz podatkov lahko razberemo, da je bila največja (0,31) absorpcija svetlobe pri gojišču brez

dodanih aditivov (kontrola). Iz tega lahko sklepamo, da se je tam razvilo največ celic S.

pombe, saj so bili pogoji za rast in razmnoževanje najprimernejši. Podobna vrednost

absorpcije se pojavlja pri gojišču z dodanim kalijevim bromatom (0,30). Najmanjša vrednost

(0.03) se pojavi v gojišču s citronsko kislino, kar se je pokazalo tudi z mikroskopiranjem, saj

se je razvilo zelo malo celic.

IZBOLJŠAVA METODE:

Za natančnejše rezultate bi morala izbrati in izmeriti večji vzorec celic vsakega gojišča. Tudi

več ponovitev poskusa bi prispevalo k večji signifikantnosti ugotovitev. Morda bi bilo

potrebno poskus izvesti z različnimi koncentracijami aditivov, saj bi lahko na podlagi tega

prišla do ugotovitev širše narave.

52

6. ZAKLJUČEK, SKLEPI

V raziskovalni nalogi sem preiskovala in ugotovila vpliv aditivov na razvojni krog glive S.

pombe. Prišla sem do zaključkov, da raziskovani aditivi vplivajo na oba razvojna kroga glive.

Potrjena je bila hipoteza raziskovalne naloge, saj so aditivi vplivali na mejotski in vegetativni

razvojni krog. Nekateri aditivi, kot so na primer amonijev sulfat, natrijev nitrit in kalijev

bromat, so celice v fazi G1 mejotskega cikla podaljšali. Največ delečih se celic se je

pojavljajo v gojišču, kateremu je bil dodan amonijev sulfat, najmanj pa v gojišču z natrijevim

nitritom. Amonijev sulfat torej stimulira delitev in rast celic, natrijev nitrit pa ju zavira.

Kalijev bromat predstavlja dokaj ugodne možnosti za razvoj in rast celic glive S. pombe.

Natrijev benzoat pa podobno kot amonijev sulfat stimulirata rast celic, saj so celice določenih

faz mitotskega in mejotskega cikla podaljšane.

Na začetku raziskovalne naloge sem želela uporabiti več aditivov, ki so v množični uporabi v

raznih prehrambnih izdelkih, vendar sem naletela na težavo, saj jih je zelo težko dobiti. Kljub

temu bom v prihodnje preverila še delovanje raznih umetnih sladil na razvojni krog glive.

Prišla sem do zaključkov, ki niso signifikantni samo na področju mikrobiologije, temveč se

lahko vpliv preiskovanih aditivov prenese tudi na človekovo zdravje. Zavedati se je treba, da

imajo tovrstni aditivi podoben vpliv tudi na človeške celice, vplivajo na njihovo celično

aktivnost. Z raziskovalno nalogo želim predvsem povečati pozornost ljudi na vsebnost raznih

aditivov v hrani in njihov potencialno negativen vpliv na zdravje. S preiskovani aditivi želim

tudi povečati ozaveščenost ljudi o njihovih, morda ne tako znanih negativnih učinkih.

53

7. PRILOGE

PRIKAZ PODATKOV V TABELAH

Tabela 5: Povprečne dolžine celic (µm±0,1) S. pombe v mitotskem ciklu

Tabela 6: Povprečne dolžine celic (µm±0,1) S. pombe v mejotskem ciklu

FAZE MEJOZE

ADITIVI I II III IV

NATRIJEV

BENZOAT

4,2 / 6,9 4,6

AMONIJEV

SULFAT

3,8 7,0 3,4 4,5

NATRIJEV NITRIT 3,1 6,2 5,7 7,2

KALIJEV

BROMAT

3,8 2,8 3,5 7

KONTROLA 5,5 / 12,7 6,4

FAZE MITOZE

ADITIVI 1=G1 2=S 3=G2 4=M

NATRIJEV

BENZOAT

5,3 4,7 5,1 4,9

AMONIJEV

SULFAT

9,9 3,7 4,1 5,0

NATRIJEV

NITRIT

7,4 3,3 3,4 5,8

KALIJEV

BROMAT

7,1 3,5 3,9 6,3

KONTROLA 7,4 3,9 4,3 7,8

54

Tabela 7: Delež celic v fazi mitoze (%)

Tabela 8: Delež celic v fazi mejoze (%)

FAZA MEJOZE

ADITIVI I II III IV

NATRIJEV

BENZOAT

75 6 19 /

AMONIJEV

SULFAT

50 23 4 23

NATRIJEV NITRIT 21 57 11 11

KALIJEV

BROMAT

57 7 22 14

KONTROLA 54 4 8 34

FAZE MITOZE

ADITIVI 1=G1 2=S 3=G2 4=M

NATRIJEV

BENZOAT

8 21 43 28

AMONIJEV

SULFAT

12 31 26 31

NATRIJEV

NITRIT

9 28 49 1

KALIJEV

BROMAT

8 15 54 23

KONTROLA 15 18 42 25

55

Tabela 9: Skupni delež celic (%) v MITOZI in MEJOZI

FAZI DELITVE

ADITIVI MITOZA MEJOZA

NATRIJEV BENZOAT 75 25

AMONIJEV SULFAT

70 30

NATRIJEV NITRIT 85 15

KALIJEV BROMAT 95 5

KONTROLA 85 15

56

8. VIRI IN LITERATURA

PETERMAN, M., PAJK ŽONTAR, T. in PONDELEK, D.: Aditivi. Tiskarna

Razvedrilo, Ljubljana. September 2007.

ELMANDFA, I., MUSKAT, E., FRITZSCHE, D.: Števila E. Za izdajo v slovenščini:

Mladinska knjiga. Ljubljana. 2007.

MOLECULAR CELL BIOLOGY. 6th ed. New York: W. H. Freeman and Company,

2008. Strani: 851-52. 859-863. 873-874.

FISSION YEAST. [online]. [citirano: 11.1.2015; 20.09]. Dostopno na URL:

http://www.cellcycle.bme.hu/research/pombe/pombe.htm

EuropePubMed Central. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe. .

[online]. [citirano: 11.1.2015; 20.10]. Dostopno na URL:

http://europepmc.org/abstract/MED/11859360

EnsemblFungi. Schizosaccharomyces pombe Assembly and Gene Annotation. .

[online]. [citirano: 11.1.2015; 20.15]. Dostopno na URL:

http://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Info/Annotation/#assembly

PombeNet. [online]. [citirano: 11.1.2015; 20.30]. Dostopno na URL: http://www-

bcf.usc.edu/~forsburg/main.html

National Institute of Health. Tran-NIH S. pombe Initiative. [online]. [citirano:

11.1.2015; 20.30]. Dostopno na URL:

http://nih.gov/science/models/Schizosaccharomyces/index.html

Uradni list RS. Pravilnik o aditivih za živila. [online]. [citirano: 17. 1. 2015, 13.35].

Dostopno na URL: http://www.uradni-list.si/1/objava.jsp?urlurid=20041929

Veste, katere snovi se skrivajo v vaši hrani? Dnevnik. 2012. [online]. [citirano: 17. 1.

2015, 13.35]. Dostopno na URL: http://www.dnevnik.si/dom/varnost/veste-katere-

snovi-se-v-resnici-skrivajo-v-vasi-hrani#

Aditivi u hrani (E-brojevi). [online]. [citirano: 4. 2. 2015, 23.35]. Dostopno na URL:

Ammonium Sulfate. Wikipedia. . [online]. [citirano: 17. 1. 2015, 13.35]. Dostopno na

URL: http://en.wikipedia.org/wiki/Ammonium_sulfate

Cell Shape and Cell Divison in Fission Yeast. Current Biology. 2009. [online].

[citirano: 18. 1. 2015, 15.47]. Dostopno na URL: http://www.cell.com/current-

biology/abstract/S0960-9822%2809%2901544-9

57

Heterokromatin. Katalog znanj. [online]. [citirano: 21. 1. 2015, 19.16]. Dostopno na

URL: http://www.katalog-znanj.bf.uni-lj.si/vsebina/h/hen_heterok.htm

Centromer. Katalog znanj. [online]. [citirano: 21. 1. 2015, 19.17]. Dostopno na URL:

http://www.katalog-znanj.bf.uni-lj.si/vsebina/c/cent_cer.htm

Natrijev nitrit. Wikipedia. [online]. [citirano: 21. 1. 2015, 19.17]. Dostopno na URL:

http://sl.wikipedia.org/wiki/Natrijev_nitrit

Nitrozamin. Onkogeni in protoonkogeni. [online]. [citirano: 21. 1. 2015, 19.20].

Dostopno na URL: http://www.emedicina.si/nitrozamini/

Food-Info. [online]. [citirano: 24. 1. 2015, 9.20]. Dostopno na URL:

http://www.food-info.net/si/qa/qa-fi13.htm

The Truth About 7 Common Food Additives. [online]. [citirano: 25. 1. 2015, 10.42].

Dostopno na URL: http://www.webmd.com/diet/features/the-truth-about-seven-

common-food-additives?page=5

Citronska kislina. Wikipedia. [online]. [citirano: 25. 1. 2015, 10.50]. Dostopno na

URL: http://sl.wikipedia.org/wiki/Citronska_kislina

YEPD. Wikipedia. [online]. [citirano: 31. 1. 2015, 13.24]. Dostopno na URL:

http://en.wikipedia.org/wiki/YEPD

Spektrofotmetrija. Wikipedia. Wikipedia. [online]. [citirano: 3. 2. 2015, 15.50].

Dostopno na URL: http://sl.wikipedia.org/wiki/Spektrofotometrija