1

การแยกจลนทรยจากสงแวดลอมในทะเลและเอนโดไฟตจากฟองน าทสามารถผลตสารเมตาบอไลททตยภมตานการเจรญของเชอสแตปฟลโลคออคอส ออเรยสทดอยาเมธซลลน

Isolation of secondary metabolites-producing endophytics/free living microorganisms from sea

active against methicillin resistant Staphylococcus aureus

บทท 1 บทน า

สารออกฤทธทางชวภาพ (bioactive compounds) เปนสารเมตาบอไลตทตยภมทถกผลตออกมาจากผลตภณฑธรรมชาตสงผลตอสงมชวตทงคน สตว และพช โดยทกลมสารดงกลาวก าลงไดรบความสนใจมากในปจจบน สารออกฤทธทางชวภาพสวนใหญแยกไดจากพช หรอกลมจลนทรย และไดถกน าไปพฒนาเพอผลตเปนยารกษาโรค หรอเพอปองกนการเกดโรคบางชนด หรอใชในอาหารเสรมตางๆ ซงสารออกฤทธทางชวภาพทดตองเปนสารทมผลจ าเพาะเจาะจง เชน มฤทธจ าเพาะตอเซลลของมะเรงเตานม มฤทธจ าเพาะตอเชอวณโรค มฤทธจ าเพาะตอเชอมาลาเรย มฤทธจ าเพาะตอแบคทเรยดอยา เปนตน และสารนนจะตองไมมผลกระทบในทางลบตอรางกาย หรอตองมผลขางเคยงใหนอยทสด เพราะเมอสารนนถกน ามาแปรรปใหเปนสวนประกอบของยา ยอมไมตองการใหยามผลกบสวนทดของรางกาย ยกเวนเชอโรค หรอสวนเกนทเราตองการขจดเทานน สารออกฤทธทางชวภาพบางชนดแสดงฤทธทางชวภาพทดมาก ผน าไปใชจงตองการในปรมาณทมากแตพชอาจสงเคราะหไดในปรมาณทนอย ไมเพยงพอตอการน าไปใชประโยชน จ าเปนตองใชชนสวนของพชเปนวตถดบในการสกดจ านวนมากขน ซงวตถดบจากพชบางประเภท เชน ดอก ผล หรอล าตน มกมขอจ ากดในการน ามาใชหลายดาน เชนมเพยงบางฤดกาล อายของพช หรอสงแวดลอมในการปลก เปนตน ดงนนอาจตองอาศยการสงเคราะหในหองปฏบตการ ซงตองใชสารเคม และผานกระบวนการทคอนขางยงยาก และยงตองใชทนในการสงเคราะหคอนขางสง จงมความจ าเปนในการเสาะหาแหลงของสารออกฤทธทางชวภาพจากแหลงใหม จากรายงานการวจยพบเชอจลนทรยบางชนดอาศยอยในชองวางระหวางเซลล (Intercellular space) ของพช ดวยภาวะพงพาอาศยโดยไมกอใหเกดโรคกบพชอาศย เรยกวา จลนทรยเอนโดไฟต (endophytic microorganisms) ท งในกลมทเปนแบคทเรยและรา โดยทจลนทรยเหลาน นสามารถสงเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพไดดวยระยะเวลาซงนอยกวาการสงเคราะหสารในพช อกทงมขอจ ากดในการสงเคราะหสารออกฤทธทางชวภาพนอยกวาในพช การเตรยมวตถดบหรอแยกสารจากจลนทรยเอนโดไฟตสามารถท าไดทกฤดกาล และมากตามความตองการ ดงนนการเลอกสกดสารออกฤทธทางชวภาพจากจลนทรยเอนโดไฟตจงเปนอกแนวทางหนงทสามารถแยกสารออกฤทธทางชวภาพทอาจแสดงฤทธทางชวภาพทด เพอน าสารเหลานนไปใชประโยชนดานตางๆ เชน ดานการเกษตร การแพทย เปนตน อยางไรกตามสารออกฤทธทางชวภาพจากพชโดยเฉพาะพชสมนไพรไดมการศกษากนมาอยาง

2

กวางขวางดงนนจงไดมความพยายามหาแหลงของสารออกฤทธทางชวภาพใหมๆ อยางตอเนอง ซงหนงในนนคอกลมสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทองทะเล เชน ฟองน า กลปงหา เปนตน นอกจากนยงรวมไปถงกลมจลนทรยทอาศยอยในทะเลและทอาศยอยรวมกบสงมชวตไมมกระดกสนหลงดงกลาวดวย โดยในการศกษาครงนไดพยามยามคดแยกจลนทรยจากทะเลทงทเปนจลนทรยทอาศยอยบรเวณผวภายนอกและภายในของสงมชวตดงกลาว เชน epibiotic และอาศยอยในโพรงภายใน เชน endobiotic รวมไปถงกลมจลนทรยทอาศยอยเปนอสระ (free-living) ในทะเล เพอคนหาสารออกฤทธทางชวภาพในแงมมของสารออกฤทธปฏชวนะเพอน าไปตานการเจรญของเชอสแตปฟลโลคอคคส ออเรยสดยาเมทซลลน ซงอาจจะน าไปสการคนพบสารปฏชวนะชนดใหมได วตถประสงคของการศกษาวจย 1. คดแยกแบคทเรยทผลตสารออกฤทธปฏชวนะตานสแตปฟลโลคอคคส ออเรยส ดอยาเมธซลลน (methicillin resistant Staphylococcus aureus: MRSA) จากฟองน าและสงแวดลอมในทะเล 2. ทดสอบฤทธตาน MRSA จากน าเลยงเชอแบคทเรยทคดแยกไดจากขอ 1. ประโยชนทคาดวาจะไดรบ สามารถคดแยกจลนทรยทผลตสารออกฤทธปฏชวนะตาน MRSA ซงอาจจะน าไปสการคนพบยาตานแบคทเรยดอยา ขอบเขตการวจย 1. คดแยกจลนทรยทงทเปน epibiotic, endobiotic จากกลมฟองน าทเกบจากเกาะสาหราย จงหวดสตล ดวยเทคนคทดดแปลงมาจากการหาเชอราเอนโดไฟตจากพช (Pongpaichit et al., 2006) 2. คดแยกจลนทรยทด ารงชวตเปนอสระจากโคลนเกบจากเกาะสาหราย จงหวดสตล ดวยเทคนคการขดเชอ 3. ทดสอบฤทธตาน MRSA ของจลนทรยทคดแยกไดดวยเทคนคเทราดทบ (double layer overlay) และเทคนคการซมผานของสารเขาสเนอวน (agar well diffusion)

3

บทท 2 วรรณกรรมทเกยวของ

ความหลากหลายของจลนทรยในทะเล

ในปจจบนทเกยวของกบการศกษาทางดานจลชววทยานนพบวามจ านวนสายพนธแบคทเรยทเปนทรจกในโลกเพยงประมาณ 4,000 สายพนธ เทานนจากจ านวนของแบคทเรยทงหมดประมาณ 3,000,000 สายพนธ ซงคดปน 0.1% (Groombridge, 1992) และเนองจาก 75% ของพนผวโลกถกปกคลมดวยน าโดยเฉพาะในทะเลและมหาสมทร จงท าใหจลนทรยในระบบนเวศทางทะเลจงมความซบซอนและหลากหลาย โดยจะมรปแบบของสงมชวตทหลากหลายทงอยบรเวณผวน าและลกลงไปในแถบชายฝงทะเลและไกลออกไปจากชายฝงทะเล ซงระบบนเวศทไดศกษาเปนพเศษ คอบรเวณภเขาไฟใตน า ระบบนเวศแนวปะการงเขตรอน ระบบนเวศปากแมน า บง นาเกลอ (saltpans), backwaters, ปาชายเลน บรเวณเหลานทมความอดมสมบรณและธาตอาหารทหลากหลาย ซงในสงแวดลอมทางทะเลกประกอบไปดวยทอยอาศยของจลนทรยทะเล ดงน 1. บรเวณผวน าทสมผสอากาศ; 2. บรเวณทองน า (ประกอบไปดวยจลนทรยทด ารงชพแบบอสระ); 3. บรเวณผวหนาตะกอนทตดตอกบพนน า; 4. บรเวณตะกอน; 5. บรเวณพนผวอนภาคของสารอนทรยและสารอนน ทรย; 6. บรเวณผวภายนอกและภายในของพชและสตว; 7. บรเวณสภาพแวดลอมทเปนทสด เชน รอนจด เยนจด เคมจด เปนตน โดยในการศกษาครงนมความสนใจจลนทรยทอาศยอยบรเวณผวภายนอก (epibiotic) และภายใน (endobiotic) ของสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเล ไดแกฟองน า รวมไปถงจลนทรยทอาศยอยอยางเปนอสระ (free-living) ในทะเล โดยทสงแวดลอมดงกลาวเหลานนมความเหมาะสมทจะสงเสรมใหจลนทรยตางชนดกนเจรญได แบคทเรยในทะเล

ความสามารถในการเจรญของแบคทเรยในทะเลขนอยกบความทนทานตอความเขมขนของแรธาตในน าทะเลเทาน น แบคทเรยในทะเลหลายสายพนธตองการ โซเดยมอออน โพแทสเซยมไอออน และแมกนเซยมไอออน สวนบางสายพนธยงตองการคลอไรดไอออนและเฟอรรกไอออน โดยทวไปแลวแบคทเรยทะเลมความสามารถเจรญไดเฉพาะในน าทะเลเทานน แบคทเรยทงหมดทอาศยอยในน าทะเลอาจจะไมใชแบคทเรยทะเลทแทจรง โดยทบรเวณใกลชายฝงทะเล 95% ของประชากรแบคทเรยอยในรปแบบทนเกลอ มเพยง 5% ทเปนแบคทเรยทะเลทแทจรง สวนในมหาสมทรเปดและทะเลน าลก แบคทเรยทะเลทแทจรงเปนสายพนธทโดดเดน

น าในมหาสมทรประมาณ 1022 ลตร จะมแบคทเรย 108-109 CFU/L แบคทเรยสวนใหญของโลก (1030) อาศยอยในสวนของทองน าทะเล โดยพบอยในสวนของตะกอนน าทะเลซงครอบคลม 70% ของพนผวโลก แหลงพลงงานทส าคญของแบคทเรยคอแสงแดด แตแสงแดดจะใชไดเฉพาะทบรเวณผวน า สวนแบคทเรย

4

ในน าและตะกอนคาดวาจะตองใชพลงงานในรปแบบอนๆ ทแตกตางกนออกไป ในมหาสมทรสวนใหญแบคทเรยจะด ารงชวตแบบ oligotrophic (Purushothaman and Jayalakshmi, 2010)

รปแบบการด ารงชวตของแบคทเรยในดานความตองการสารอาหารมความหลากหลายเปนอยางมาก จงเปนเรองยากมากทจะจ าแนกแบคทเรยดวยวธใดเพยงวธเดยว จ าเปนตองมการใชระบบตางๆ เปนจ านวนมากในการคนหาแบคทเรยเหลาน ระบบทเปนทยอมรบและใชในการจดจ าแนกคอความเหมอนตามสายววฒนาการ (Woese and Fox, 1977) โดยจะแยกเปน prokaryotes, archaebacteria และ eubacteria ซงหากแบงแบคทเรยเหลานตามแหลงคารบอนและแหลงพลงงานทแบคทเรยตองใชจะถกแบงเปน autotrophs และ heterotrophs

กลม autotrophs จดตามแหลงพลงงานทใชจะถกจดเปน photoautotrophs ใชแสงอาทตยเปนแหลงพลงงาน และ chemoautotrophs เปนตวแทนแบคทเรยกลมใหญ ถกแบงตามลกษณะทางสณฐานวทยาและสรระวทยา ถงแมจะอยในกลมอนกรมวธาน แตแบคทเรยแสดงความหลากหลายของเมแทบอลสมทสงมากและบางกลมยงมความสามารถเฉพาะตวในการใชธาตอาหารตามสภาพแวดลอมทอย ซง Fenical และ Jensen (1993) ไดท าการจดแบงกลมแบคทเรยทะเลไวดงน

ตารางท 1 การจดกลมแบคทเรยในทะเล (Fenical and Jensen, 1993) Archaebacteria Autotrophic

Eubacteria Chemoheterotrophic

Eubacteria Eukaryotes

Chemoautotrophs Photoautotrophs Gram positive Fungi Methanogens Anoxygenic

photosynthesis Endospore forming rods and cocci

Higher fungi

Thermoacidophiles Purple and green photosynthetic bacteria (Order Rhodospirillales)

Non spore forming rods

Ascomycetes

Chemoheterotrophs Oxygenic photosynthesis

(Family Micrococcaceae)

Deuteromycetes

Halophiles Cyanobacteria (Order Cyanobacteriales)

Actinomycetes and related organisms

Basidiomycetes

Prochlorophytes (Order Prochlorales)

Lower fungi (Class Phycomycetes)

Chemoautotrophs Nitrifying bacteria

Rods and cocci aerobic (Family Pseudomonadaceae)

5

Archaebacteria Autotrophic Eubacteria

Chemoheterotrophic Eubacteria

Eukaryotes

(Family Nitrobacteriaceae)

Colorless sulfur oxidizing bacteria

Facultative (Family Vibrionaceae)

Methane oxidizing bacteria (Family Methylcoccaceae)

Anaerobic (sulfur reducing bacteria)

Halophiles Gliding bacteria (Order Cytophagales and Beggiatoales) Spirochete (Order Spirochaetales) Spiral and curved bacteria (Family Spirillaceae) Budding, and/or appendaged bacteria Mycoplasma (class Mollicutes)

สารออกฤทธทางชวภาพจากสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเลและเอนโดไฟต

ในสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเล เชน กลปงหาและฟองน าบางชนดสามารถผลตสารตานจลนทรย แตประสทธภาพของสารออกฤทธดงกลาวเหลานนจะขนอยกบสภาพแวดลอมและอณหภมทเปลยนแปลงไป (Munro and Munro, 2003) โดยจะท าใหอาจมการเพมประสทธภาพในการตานหรอชวยสงเสรมการเจรญของจลนทรยกอโรคได (Alker et al., 2001) ไดมรายงานการศกษาสารออกฤทธทางชวภาพจากผลตภณฑธรรมชาตในทะเลพบวามกคดแยกไดมาจากจลนทรยจดเปนอนดบ 3 รองจากพวกฟองน า (Sponga et al., 1999) และ coelenterates (Blunt et al., 2004) แตสงทนาตระหนกคอหากมการน าสตวไมมกระดกสนหลงดงกลาวมาใชประโยชนมากขน โดยไมมการเพาะเลยงทดแทนกจะท าใหเกดการสญพนธได จงไดมการศกษาเพอลดการใชทรพยากรทางธรรมชาตอยางไมถกตองขนมาอยางมากมาย โดยท Friedrich et al. (1999) ไดรายงานไววากวา 40% ของมวลชวภาพในเนอเยอของฟองน า

6

Aplysina aerophoba มแบคทเรยอาศยอย จงน าไปสความคดทวาแบคทเรยเหลานนาจะผลตสารออกฤทธทางชวภาพทมฤทธตานจลนทรยกอโรคได ดงนนทางเลอกทดทางหนงคอการเพาะลยงจลนทรยทมความเกยวของกบสตวไมมกระดกสนหลง เพอทดสอบหาฤทธตานเชอกอโรค เนองจากมการศกษาจ านวนมากทรายงานความสมพนธของการอยรวมกนของจลนทรยกบสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเล เชน มรายงานถงการคดแยกแบคทเรยทไดจากฟองน าแถบแอนตารกตก (Antarctic) ซงมสภาพแวดลอมทรนแรง แสดงถงความสมพนธของฟองน าและแบคทเรยทมความทนทานตอสภาพแวดลอมตางๆ ไดอยางหลากหลาย และจากการศกษาความหลากหลายของจลนทรยโดยใชวธหาล าดบเบสของยน 16S rDNA (16S rDNA sequencing) ยงมการรายงานพบ α และ - Proteobacteria (17.3 และ 65.3%), CFB group ของ Bacteroidetes (10.7%) และ Actinobacteria (6.7%) (Mangano et al., 2008) ซงจลนทรยทงหมดเหลานนเรยกโดยรวมวา “เอนโดไฟต” โดยทกลมเอนโดไฟตแหลานจะมชวงหนงหรอตลอดวงจรชวตทสามารถอาศยอยในเนอเยอของพช อาจเปนกลมของแบคทเรย แอคตโนมยสท เชอรา และปรสตของพช ซงสงมชวตดงกลาวจะพบอยในชองวางของเนอเยอทมชวตของพช ระหวางเซลลของล าตน กานใบ ราก และใบของพชทมความสมบรณ สามารถแบงตวเพมจ านวนภายในเนอเยอโดยไมกออนตรายตอพชอาศย อาจอาศยอยในภาวะเกอกล (mutuality) กน เนอเยอของพชทมเอนโดไฟตยงสามารถท างานไดอยางปกต ซงในปจจบนพบวากลมเอนโดไฟตเปนแหลงของสารออกฤทธทางชวภาพทส าคญทางดานการแพทย การเกษตร และทางอตสาหกรรม (ณฐวฒ รงจนดามย, 2005) ดงจะเหนไดวามการรายงานเกยวกบเอนโดไฟตในพชบนบกเปนสวนมากทงทเปนสมนไพรและวชพช อยางไรกตามกลมเอนโดไฟตทนาสนใจอกกลมหนงกคอกลมทอาศยอยรวมกนกบสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเล ดงเชนมรายงานทเกยวของมากมาย เชนการตรวจพบแบคทเรยทสไฟลม คอ Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes และ Actinobacteria ในตวอยางฟองน า 4 สายพนธจากทะเลจนใต คอ Stellatta tenui, Halichrondia, Dysidea avara และ Craniella australiensis ดวยการหาล าดบเบสของยน 16S rRNA เทยบกบฐานขอมล BLAST (Li et al, 2005) นอกจากนมการศกษาความหลากหลายของจลนทรยในตวอยางสาหราย เพรยงหวหอม และปะการง จากทางตอนเหนอของชายฝงทะเลบราซล พบเชอรา 256 สายพนธ คดแยกออกมาไดแตกตางกนถง 24 สกล รวมไปถง Ascomycota, Zygomycota และ Basidiomycota แบคทเรย 181 สายพนธ แตกตางกน 41 สกล เชน Bacillus, Ruegeria, Micrococcus, Pseudovibrio และ Staphylococcus (Menezes et al., 2010) Gandhimathi et al. (2008) ไดท าการแยก Actinomycetes จากฟองน าทะเลซงผลตสารออกฤทธทางชวภาพตาน เ ชอแบคท เ รยท งแบคท เ รยแกรมบวกและแกรมลบ ไดแ ก Micrococcus luteus, Staphylococcus haemolyticus, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Bacillus spp., Pseudomonas aeruginosa รวมไปถงตานเชอราไดคอ Aspergillus fumigatus, A. flavus และ Candida tropicalis

7

Ely et al. (2004) คดแยกแบคทเรยและราจากตวอยางฟองน า 7 ชนด และสาหราย 2 ชนด ในแถบชายฝงทะเลของประเทศอนเดย เพอคนหาสารออกฤทธทางชวภาพตานจลนทรย โดยพบวาสารสกดดวยเมทานอลจากสงมชวตในทะเลเหลานน แสดงฤทธในการตานจลนทรยไดหนงชนดหรอมากกวานน โดย Sigmadocia carnosa ใหฤทธตานสง แตยงไมสามารถยบย ง Fusarium sp. ได สวน Echinogorgia ไมมฤทธตานแบคทเรย แต Echninogorgia reticulate ตาน Rhodotorula sp. ไดแตนอยมาก และ E. compecta สามารถตาน Fusarium sp. และ Nocardia sp. ได เชอทมฤทธตานแบคทเรยคอ Haliclona cribricutis และ Chrotella australiensis สามารถผลตสารออกฤทธตาน Klebsiella sp. และ Vibrio cholerae ไดตามล าดบ Anand et al. (2005) คดเลอกแบคทเ รยทะเล 75 สายพนธ ทอาศยอย รวมกบฟองน า 4 ชนด (Echinodictyum sp., Spongia sp., Sigmadocia fibulatus และ Mycale mannarensis) จากชายฝง Tuticorin coast ในแถบ Mannar เพอศกษาการผลตสารออกฤทธทางชวภาพดานปฏชวนะ ทมผลตานแบคทเรย 4 สายพนธ คอ Bacillus subtilis, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi และรากอโรค 1 ชนดคอ Candida albicans โดยใชวธ agar overlay พบวา 21% ของแบคทเรยทแยกไดสามารถสรางสารออกฤทธปฏชวนะตานแบคทเรยไดดและอยางจ าเพาะตอชนดของแบคทเรย และพบวาแบคทเรยสายพนธ SC3 มประสทธภาพสงในการตานจลนทรยและสามารถเจรญไดด ซงพบวาน าเลยงเชอ (culture broth) ของแบคทเรยดงกลาวทถกสกดดวยเอธลอะซเตท (ethyl acetate) แลวน าไปแยกดวย reverse phase HPLC พรอมกบหา fraction ทออกฤทธตานเชอไดดทสด จากการศกษาพบวา SC3 เปนแบคทเรยแกรมบวก รปแทง สรางสปอรได เคลอนทได ผลต catalase และ oxidase จากการวเคราะหแผนภมววฒนาการ (phylogenetic tree) โดยเปรยบเทยบล าดบเบสในสวนของยน 16S rRNA พบวามล าดบเบสทคลายคลงกบ Vibrio และ Bacillus ประมาณ 95-99% การศกษาครงนเปนรายงานครงแรกทเกยวกบการวเคราะหสายพนธของแบคทเรยทมความเกยวของกบฟองน าในแถบทะเลอนเดยทสามารถผลตสารออกฤทธปฏชวนะได ในการคดแยกแบคทเรยจากตวอยางฟองน าจากทะเลเมดเตอรเรเนยน แลวน ามาศกษาฤทธตานจลนทรย สามารถตานเชอกอโรค 5 สายพนธ คอ Escherichia coli, Staphylococcus luteus, Candida sp., Bacillus subtilis และ Mycobacterium sp. หลงจากศกษาล าดบเบสของยนสวน 16S rDNA ของเชอแบคทเรยในตวอยาง แยกไดออกเปนสองกลมคอ α และ -Proteobacteria เมอศกษาทางดานล าดบววฒนาการ (phylogenetic tree) พบวา -proteobacteria เทยบเคยงไดเปน Vibrio sp. และ Pseudomonas sp. (Thiel and lmhoff, 2003) อกทงยงมการศกษาแบคทเรยทอยทผวของฟองน า Petrosia ficiformis ซงจากการแยกโดยวธดงเดมและวธการทางชวโมเลกล พบวาคดแยกจลนทรยทงหมด 57 สายพนธ แบงไดเปน Pseudoalteromonas sp., Flavobacterium sp., Micrococcus sp., Bacillus sp., Corynebacterium, Actinomyces sp., Streptomyces sp., Vibrio sp., Aeromonas sp., Enterobacteriaceae เ ม อน าไปว เคราะ หแบบ Random

8

Amplified Polymorphic DNA (RAPD) พบวาหลายไอโซเลทผลตสารออกฤทธปฏชวนะตานจลนทรย Enterococcus faecalis, Stapylococcus aureus, Micrococcus sp. ซง 2 สายพนธทวเคราะหแยกไดเปน Rhodococcus sp. และ Pseudomonas sp. ดวยการหาล าดบเบสของยน 16S rRNA (Chelossi et al., 2004) การศกษาของ Wilson et al. (2009) พบวาแบคทเรยจากทะเลเปนแหลงทอดมไปดวยสารตานจลนทรย จากความหลากหลายของจลนทรยในระบบนเวศนซงมความมากมายนนคาดวาอาจมสารตานจลนทรยชนดใหมทใหคนพบได โดยแบคทเรยทศกษานนอาศยอยในทะเล ซงแบคทเรยจะอาศยอยบนโฮสตและพนททางภมศาสตรทเหมาะสมกบการด ารงชพแตกตางกน การศกษาลกษณะความสามารถในการเจรญของกลมจลนทรยบนพนผวทะเล ททาเรอซดนย ประเทศออสเตรเลยและทดสอบความสามารถในการผลตสารออกฤทธตานจลนทรย พบวา 47% ใน 104 ไอโซเลท ของตวอยางแบคทเรยทแยกออกมาไดจากแหลงดงกลาว ไมสามารถจ าแนกไดถงระดบจนสไดดวยวธการหาล าดบเบสของยน 16S rRNA ขณะทการทดสอบสารตานจลนทรย 104 ไอโซเลท พบวามแบคทเรยทผลตสารตานจลนทรย 10 ไอโซเลท และม 8 ไอโซเลท ทมความสมพนธใกลเคยงกน โดยททง 8 ไอโซเลทมฤทธตานจลนทรยดชนดวยความเขมขนของสาร 6.6% v/v และเมอศกษาชนดของโมเลกลของสารดงกลาวและการศกษาดวยวธสกดดวยสารตามล าดบความมขว (polarity extractions) ของสารตานจลนทรยนนมขวสงและถกท าใหเสยฤทธดวยเอนซยมโปรตเนสเค (Protenase K) ซงแสดงวาสารตานจลนทรยเปนสารประกอบพวกโปรตน โดยการศกษานเปนครงแรกทมการเชอมโยงขอมลระหวาง phylogenetic tree ของแบคทเรยกลมเกาะตดพนผวกบการผลตสารออกฤทธปฏชวนะตานจลนทรย ดงจะเหนไดวากลมเอนโดไฟตทอาศยรวมกบสงมชวตในทะเลสามารผลตสารออกฤทธปฏชวนะตานแบคทเรยทงแกรมบวกและแกรมลบ รวมไปถงกลมเชอราไดอยางมประสทธภาพและแตกตางกนออกไปขนอยกบสายพนธจลนทรยทแยกออกมาไดและถนฐานทจลนทรยเหลานนด ารงชวตอย จงนบวาเปนวทยาการทางดานการแพทยทนาจะไดรบการพฒนาตอยอดตอไปเพอการคนหาสารออกฤทธปฏชวนะใหมๆ น ามาทดแทนยาเคมในปจจบนทมผลขางเคยงตอผปวย นอกจากนการพฒนาเกดมกลมเชอดอยาไดมอยางตอเนองอนมาจากการใชยาอยางไมถกตองเหมาะสมท าใหการรกษาดวยยาเดมไมไดผลในการรกษา และเชอดอยาบางกลมไดเปลยนกลายมาเปนเชอประจ าถนทพบไดบอยในโรงพยาบาลและยากตอการรกษากอเกดการสญเสยทางเศรษฐกจตอทงของโรงพยาบาลและผปวย จงนบวาการคนหาสารออกฤทธทางชวภาพดานปฏชวนะจากผลตภณฑธรรมชาตจงมความส าคญอยางยงยวดเพอลดคาใชจายในการน าเขายาจากตางประเทศ และสงเสรมใหผปวยมคณภาพชวตทดขน

ขนตอนการศกษาฤทธทางชวภาพของสารจากเอนโดไฟต รวมไปถงในการศกษาสารทมฤทธทางชวภาพจากผลตภณฑธรรมชาตไมวาจากพช หรอ จลนทรยอนๆ มกประกอบดวยขนตอนหลกๆ หลาย ขนตอน โดยมขนตอนหลกๆ คอ การคดแยกจลนทรยทมการผลตสารออกฤทธทางชวภาพออกมาใหไดจากผลตภณฑธรรมชาต แลวหาสภาวะทเหมาะสมในการทกระตนใหกลมจลนทรยเหลานนผลตสารออกมาตานจลนทรยใหโทษ โดยจะกลาวรายละเอยดเหลานในสวนของวธการทดลองในบทตอไป

9

บทท 3 วสด อปกรณและวธการ

3.1 วสด 3.1.1 ตวอยาง ตวอยาง ฟองน าและโคลนจดเกบจากเกาะสาหราย จงหวดสตลโดยมรายละเอยดแสดงในตารางท 2 ตารางท 2 ตวอยางฟองน าและโคลนจากทะเล

วนทเกบตวอยาง ชนดตวอยาง จ านวน รหสตวอยาง สถานทเกบ ผจดเกบ 25 มนาคม 2560 (14.00-17.00 น.) ชวงน าลง

ฟองน าสแดง 1 S1 เกาะสาหราย จงหวดสตล

คณะผท าวจย

ฟองน าสน าเงน 1 S2 ฟองน าสน าตาล 1 S3 ฟองน าสมวง 1 S4 ฟองน าสเขยว 1 S5 ฟองน าสด า 1 S6 ฟองนาสเขยวขมา 1 S7 ฟองน าสเขยวออน 1 S8 ฟองน าสเหลอง 1 S9 ฟองนาสด า 1 S10 26 มนาคม 2560 (6.00-6.30 น.) ชวงคาบเกยวน าขน

ฟองน าสเหลอง 1 - คณะผท าวจย

โคลนบนผวฟองน าสเหลอง

1 M1

3.1.2 แบคทเรยทดสอบ

3.1.2.1 แบคทเรยทสงซอจาก TISTR (สายพนธมาตรฐาน) Staphylococcus aureus TISTR517

10

3.1.2.2 แบคท เ รย กอโรค ทแยกไดจากผ ปวยของโรงพยาบาลมหาราช จงหวดนครศรธรรมราช

เกบรกษาไวใน 15% กลเซอรอล อณหภม -20 องศาเซลเซยส หองปฏบตการเทคนคการแพทย มหาวทยาลยวลยลกษณ (ไดรบความอนเคราะหจาก รศ.ดร. มณฑล เลศคณาวนชกล ส านกวชาสหเวชศาสตร มหาวทยาลยวลยลกษณ) ไดแก methicillin resistant Staphylococcus aureus สายพนธ 142 3.1.3 สารเคม

1. อาหารเลยงเชอ - Marine Broth (MB) - Mueller Hinton broth (M-H)

- Bacteriological agar 2. สารเคมอนๆ - 70% และ 95% เอธลแอลกอฮอล - 15% กลเซอรอล - 0.85% NaCl 3.1.4 อปกรณ - จานเพาะเชอพลาสตก (plastic Petri dish) - กรรไกร (scissor) - หลอดทดลอง (Test tube) - ตะเกยงแอลกอฮอล - บกเกอร (Beaker) ขนาด 500 มลลลตร - ปากคบ (Forceps) - เขมเขยเชอ (Needle) - หวงเขยเชอ (Loop) - เมดลกปดแกว (Glass bead) - ขวดฝาเกลยว (duran bottle) ขนาด 250, 500 มลลลตร - ขวดฝาเกลยวกนจบ (baffled flask) ขนาด 1,000 มลลลตร - Eppendorf - ทป (Tips) พรอม Auto pipette - ปนจดไฟ (lighter) - กระดาษเชด 3.1.5 เครองมอ

11

- เครองเขยา (Vortex) - เครองหมนปนเหวยงแยกสาร (Centrifuge)

- ตบมเชอ (Incubator) - ตอบฆาเชอ (Hot air oven) - ตบมเลยงเชอแบบเขยา (Shaking incubater) - หมอนงฆาเชอ (Autoclave) 3.2 วธการทดลอง 3.2.1 การเกบตวอยางฟองน า เกบตวอยางฟองน าใสในถงทบรรจน าทะเลบรเวณทเกบตวอยาง (ตารางท 2) รดปางถงดวยยาง น าถงตวอยางแชในลงน าแขง น ากลบหองปฏบตการหรอสถานทท าปฏบตการเพอทดสอบภายใน 24 ชวโมง 3.2.2 การแยกเอนโดไฟตจากตวอยางฟองน า น าตวอยางฟองน าจากขอ 3.1.1 โดยเลอกสวนของฟองน าทมลกษณะสมบรณ ไมมลกษณะอาการ ของโรค มาท าการแยกจลนทรยเอนโดไฟต โดยตองท าใหผวนอกของฟองน าปราศจากเชอกอนดวยวธการตางๆ ไดแก น าตวอยางฟองน ามาลางใหสะอาด แชใน 95% แอลกอฮอล นาน 30 วนาท แลวลางดวยน ากลนปราศจากเชอ นาน 3-5 วนาท ใชกรรไกรจมแอลกอฮอล น าไปผานไฟแลวตดตวอยางฟองน าออกเปนชนเลกๆ (ดดแปลงจาก Pongpaichit et al., 2006) น าไปวางบนอาหาร Marine agar (MA) แลวบมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3-7 วน สงเกตผลทกวน เมอพบวามการเจรญของเชอจลนทรยเจรญออกมาจากชนตวอยางฟองน า ใหท าการแยกขดโคโลนทมความแตกตางกนดวยเขมเขยเชอเพอน าไปเพาะเลยงบนอาหาร MA โดยการเกบ ตวอยางเชอจลนทรยเปนเวลา 7 วน นบจากวนแรกทพบการเจรญของเชอจลนทรย เมอแยกไดเชอจลนทรยบรสทธแลวท าการเกบเชอ ใน 15 % กลเซอรอล แลวน าไปแชในตแชเยอกแขง (deep freezer) อณหภม -80 องศาเซลเซยส (ณฐวฒ รงจนดามย, 2005). 3.2.3 การแยกจลนทรยจากโคลนในทะเล น าตวอยางโคลนจากทะเลทเกบรกษาไวในน าแขงมาแยกขดลงบนจานอาหารเลยงเชอ MA ดวยเทคนคขดเชอ น าไปบมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3-7 วน สงเกตผลทกวน เมอพบวามการเจรญของเชอจลนทรย ใหท าการแยกขดโคโลนดวยเขมเขยเชอเพอน าไปเพาะเลยงบนอาหาร MA โดยการเกบตวอยางเชอจลนทรยบรสทธ แลวท าการเกบเชอ ใน 15 % กลเซอรอล แลวน าไปแชใน deep freezer อณหภม -80 องศาเซลเซยส 3.2.4 การทดสอบฤทธตานแบคทเรยมาตรฐาน/MRSA (เบองตน) ทดสอบฤทธการตานเชอดวยวธ double layer overlay ดวยการน าสารแขวนลอยเชอทเลยงไวขามคนในอาหารเลยงเชอ Mueller Hinton broth (MHB) มา 1% ใสลงใน soft agar ปรมาตร 7 มลลลตร (หลอมเหลวแลวรออน) เขยาดวย vortex จากนนน าไปเททบบนโคโลนของจลนทรยทแยกไดจากตวอยาง

12

(บมเลยงไวแลวอยางนอย 5 วน) บมท 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง แลวสงเกตวงใสของการยบย งเชอ (inhibition zone) 3.2.5 การเพาะเลยงเอนโดไฟต/เชอด ารงชวตอสระ น าจลนทรยเอนโดไฟตและทด ารงชวตอสระทแยกไดจากขอ 3.2.2 และแสดงฤทธปฏชวนะในขอ 3.3 ทมลกษณะโคโลนทแตกตางกน น ามาเพาะเลยงใน Marine Agar (MA) บมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส จนพบมการเจรญของโคโลนแยกเดยว (isolated colony) จากนนใชหวงถายเชอเขยโคโลนของเชอ จ านวน 5 โคโลน แลวท าการถายเชอลงในอาหารเหลว Marine Broth (MB) ปราศจากเชอทบรรจในขวดกนจบ baffled flask (ใสเมดลกปดแกว 1 เมด ตอ 1 มลลลตร) น าไปบมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วน ทตบมเชอแบบเขยาความเรวรอบ 200 รอบตอนาท จะไดผลตภณฑออกมา 2 สวน คอสวนน าเลยงเชอ (culture filtrate) และสารแขวนลอยเชอ (cell suspension) 3.2.6 การทดสอบฤทธตาน MRSA 3.2.6.1 การเตรยมเชอ MRSA ส าหรบการทดสอบ เลยงไอโซเลท MRSA บนอาหารเลยงเชอ Mueller Hinton Agar (MHA) ดวยวธการขดเชอแลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง เพอใหเจรญและแยกเปนโคโลนเดยวกอนทจะน าไปทดสอบกบเชอทแยกไดจากตวอยาง 3.2.6.2 การทดสอบฤทธตาน MRSA ทดสอบดวยวธซมผานของสารเขาเนอวน (agar well diffusion) โดยปรบความเขมขนของสารแขวนลอย MRSA ในขอ 3.2.6.1 ใหได 0.5 McFarland (1.5×108 CFU/mL) ใน 0.85% NaCl ปราศจากเชอ จากนนน าไปปายลงบนผวหนาอาหาร MHA ตงทงไวใหผวหนาอาหารแหงประมาณ 10 นาท แลวเจาะหลมดวยทปปราศจากเชอโดยใชสวนทายของทปกดลงไปในเนอวน MHA จากนนน าน าเลยงเชอจากขอ 3.2.5 ปรมาตร 80 ไมโครลตร หยอดลงในหลม ตงทงไวทอณหภมหองจนน าเลยงเชอซมเขาเนอวนจนหมด แลวน าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง วดขนาดโซนใสของการยบย งเชอ เปรยบเทยบกนในแตละไอโซเลทของเชอทแยกไดจากตวอยาง

13

บทท 4 ผลการทดลอง

4.1 แยกเชอจากสงแวดลอมและเอนโดไฟตในฟองน า จากการแยกจลนทรยทอาศยอยอยางอสระในทะเลรวมไปถงกลมเอนโดไฟตทอาศยรวมอยกบฟองน าทเกบรวบรวมจากเกาะสาหราย จงหวดสตล ในวนท 25-26 มนาคม 2560 รายละเอยดตวอยางดงแสดงในตารางท 2 โดยวธการฆาเชอทพนผวบนอาหาร MA ส าหรบแยกเชอเอนโดไฟต และวธขดเชอส าหรบแยกเชอจากโคลน ไดจลนทรยทงหมด 10 ไอโซเลท แบงเปนพบทงในสงแวดลอมและ/หรอเอนโดไฟต 4 ไอโซเลท (รปท 1 A-D) พบเฉพาะเอนโดไฟต 2 ไอโซเลท (รปท 2 A และ 2B) และพบเฉพาะในสงแวดลอม 4 ไอโซเลท (รปท 3 แสดงรปเพยง 2 ไอโซเลท) และสวนใหญเปนแบคทเรยแกรมลบมการเจรญสรางแคปซลท าใหมลกษณะมนวาว มกเยม พบไดทงในรปแบบ free-living และเปน epibiotic ดงแสดงในรปท 1 A B C D รปท 1 ลกษณะโคโลนแบคทเรยมกเยม มนวาว ทตรวจพบเปนประชากรสวนใหญจากตวอยางทน ามาศกษา. ลกษณะโคโลนในรป 1 B ไมแสดงฤทธตาน Staphylococcus aureus TISTR517 สวนทเหลอแสดงฤทธนอย

14

ส าหรบโคโลนของแบคทเรยทตรวจพบเฉพาะในชนสวนฟองน ามลกษณะส าคญ คอฝงวน ผวหนาดานพบจากฟองน ารหส S6 มโคโลนสแดง (รป 2 A) และโคโลนแบนราบ ผวหนาดาน พบจากฟองน ารหส S1 มโคโลนสครม (รป 2 B) ซงทงสองลกษณะแสดงฤทธตานเชอแบคทเรยทน ามาใชเปนดชน A B รปท 2 ลกษณะโคโลนเอนโดไฟตทพบในฟองน า. รป 2 A ใหรหสปน S6.2 สวน 2B ใหรหสเปน S1.2 A B รปท 3 ลกษณะโคโลนของแบคทเรยในสงแวดลอมทแยกไดจากโคลน. รป 3A ใหรหสเปน SL4 สวนรป 3B ใหรหสเปน SL19 ในเบองตนพบวาโคโลนในรป 2A (รหส S6.2) และ 3B (รหส SL19) นอกจากนยงมไอโซเลท SK3แสดงฤทธตานแบคทเรยมาตรฐาน S. aureus TISTR517 ไดเมอทดสอบดวยวธราดทบ (overlay) ดงแสดงในรปท 4 และมเฉพาะไอโซเลท S6.2 ตาน MRSA สวนไอโซเลท S1.2 สามารถตานเชอรา ดงแสดงในรปท 5

S6.2 S1.2

SL4 SL19

15

A B รปท 4 แสดงวงใส (บรเวณลกศรช) ของการตานแบคทเรย Staphylococcus aureus TISTR517 ของไอโซเลท S6.2 (A) ไอโซเลท SL19 ไอโซเลท SK3 (B)

16

A B รปท 5 แสดงวงใส (บรเวณลกศรช) ของการตาน MRSA (A) และวงใสของการตานรา (B). ไอโซเลท S6.2 แสดงการตาน MRSA (A) สวน ไอโซเลท S1.2 แสดงการตานรา (B)

S2

S1.2

17

หลงจากคดเลอกไอโซเลท S1.2, ไอโซเลท S6.2, ไอโซเลท SK3 และ ไอโซเลท SL19 ไปศกษาตอโดยน าไปเลยงในอาหารเลยงเชอเหลว Marine broth (MB) และเมอน าน าเลยงเชอไปศกษาฤทธตาน S. aureus TISTR517 และ ฤทธตาน MRSA พบวาไอโซเลท SK3 แสดงฤทธปฏชวนะตานเชอดชนทง 2 ชนดไดวงใสของการยบย งเชอไดสงสด ภายในระยะเวลาของการบมเลยงเชอเปนเวลา 2 วน ในสภาวะการบมเลยงทมการเขยา 200 รอบตอนาท อณหภม 30 องศาเซลเซยส ดงแสดงในรปท 6 อยางไรกตามไอโซเลท S6.2 กเรมใหวงใสของการยบย งเชอในวนท 2 ของการบมเลยงดงกลาวเชนกน รปท 6 วงใสของการตานเชอ S. aureus TISTR517 (ซายมอ) และ MRSA (ขวามอ) เมอทดสอบดวยวธ agar well diffusion

18

บทท 5 อภปรายผล

ความส าคญในการคนหายาปฏชวนะใหมๆ มเพมมากขน เพอแกไขปญหาโรคทเกดจากเชอดอยาทใชยาเดมรกษาไมไดผล ดงนนการคนหายาใหมเพอใชในการรกษาโรคตดเชอยงคงตองไดรบการพฒนาตอไป โดยมงหาสารออกฤทธปฏชวนะจากสงมชวตในสงแวดลอมโดยเฉพาะอยางยงในทะเล เนองจากเปนพนทสวนใหญของโลก และเปนแหลงทรพยากรทส าคญและมความหลากหลายของระบบนเวศมาก (Colwell, 2002) รวมถงเปนแหลงของสารออกฤทธทางชวภาพมากมาย (สตา ปรดานนท, 2551) ทงในรปแบบของสาร terpenes, polyketides, acetogenins และ peptide เปนตน (Wright, 1998) ซงสารเหลานโดยสวนใหญแลวไดมาจากสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเลและสามารถน ามาใชประโยชนทางดานการแพทยอยางหลากหลาย ดวยการเปลยนแปลงทางโครงสรางทางกายภาพและชวภาพเพมเตมในหองปฏบตการ อยางไรกตามยงคงมอปสรรคอยางมากหากมการศกษาเรองดงกลาวโดยมงหวงแตเพยงยดใชทรพยากรทมอยในธรรมชาต เนองจากความเขมขนของสารทแยกไดจากสงมชวตไมมกระดกสนหลงเหลานนอยกวา 1 ในลานของน าหนกเปยก (Proksch et al., 2002) หากตองการสารเหลานในปรมาณสงจ าเปนตองใชสงมชวตดงกลาวในปรมาณมากอาจท าใหเสยงตอการสญพนธ ดงนนจงไดมการศกษากลมจลนทรยเอนโดไฟททอาศยอยรวมกบสงมชวตดงกลาว เชนในเนอเยอฟองน า Aplysia aerophoba มกลมแบคทเรยทอาศยรวมกนแบบ symbiotic โดยแบคทเรยไดอาหารจากฟองน าและท าใหฟองน าคงรปรางอยได หรอแมแตแบคทเรยจากกลปงหาสามารถผลตสารออกฤทธตานแบคทเรย ตานรา ตานไวรส (Monks et al., 2002) ซงจะเหนไดวาไมใชมเพยงแตเฉพาะสงมชวตไมมกระดกสนหลงในทะเลเทานนทสามารถผลตสารออกฤทธปฏชวนะ แตยงรวมไปถงกลมจลนทรยเอนโดไฟตทอาศยอยรวมกนกบสงมชวตเหลานนกยงเปนวตถดบของสารออกฤทธปฏชวนะไดเปนอยางด และไมจ าเปนตองใชทรพยากรทมอยอยางจ ากดใหเสยงตอการสญพนธ จงไดสนใจแยกกลมเชอเอนโดไฟต รวมไปถงกลมเชอทด ารงชวตอยอยางอสระในทะเลของเกาะสาหรายเพอประโยชนในการคนหายาใหมๆ ชวยในการรกษาโรคตดเชอดอยา โดยในการทดลองนสามารถแยกแบคทเรยไดจากทเปนกลมเอนโดไฟต และอาศยอยปกคลมผวของฟองน า รวมไปถงกลมทอาศยอยอยางเปนอสระในสงแวดลอมจ านวน 10 ไอโซเลท แตมเพยงไอโซเลท S6.2, SK3 และ SL19 ทแสดงฤทธตานแบคทเรยกอโรค จงเปนทนาสนใจศกษาตอไปถงระดบโครงสรางของสารออกฤทธทางชวภาพทเชอผลตออกมาเพอน าไปใชเปนตนแบบของการผลตยาตานเชอดอยาไดอยางมประสทธภาพตอไปในอนาคต สรป สามารถคดแยกจลนทรยเอนโดไฟทจากตวอยางฟองน า และจลนทรยทอยบนพนผว รวมไปถงกลมทอาศยอยเปนอสระในทะเลของเกาะสาหราย จงหวดสตล โดยแบคทเรยทคดแยกไดรหส S6.2, SK3 และ

19

SL19 แสดงฤทธตานแบคทเรยดชนได จงนาสนใจน าไปแยกสกดสารออกฤทธทางชวภาพเพอศกษาดโครงสรางและน าไปเปนขอมลพนฐานของสารออกฤทธปฏชวนะจากจลนทรยในทะเลตอไป สงทคาดวาจะท าตอไป 1. พสจนแยกวนจฉยชนดของเชอดวยการหาล าดบเบสของยน 16S rDNA และหาล าดบววฒนาการทศนยพนธวศวกรรมศาสตรแหงชาต (ศช.) สถาบนวจยวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.) 2. ฝากเกบรกษาไอโซเลทของเชอไวทส านกงานวจยวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงประเทศไทย (TISTR) โดยคดเลอกไอโซเลท S1.2, S6.2, SK3 และ SL19 ดงแสดงในรปท 7 รปท 7 โคโลนของไอโซเลท S1.2, ไอโซเลท S6.2, ไอโซเลท SK3, ไอโซเลท SL19 (เรยงจากซายมอมาทางขวามอ) 3. เตรยมสารออกฤทธทางชวภาพจากน าเลยงเชอจลนทรยทคดเลอกได (รปท 8) และแสดงฤทธปฏชวนะตาน MRSA ใหอยในรปผงแหงแลวสงไปพสจนเอกลกษณทางเคมท มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคล วทยาเขตตรง โดย รศ.ดร. พชร เพชรประดบ

รปท 8 ลกษณะการเจรญของไอโซเลททคดแยกได (S6.2, SK3, SL19 และ S1.2) เมอเจรญในอาหารเลยงเชอ Marine broth (MB) ; C คอ ขวดควบคมผลลบ. ลกษณะของไอโซเลท 6.2 ( ) นาสนใจเนองจากตาน S. aureus TISTR 517 (รปท 4A) และตาน MRSA (รปท 5A)

20

เอกสารอางอง

ณฐวฒ รงจนดามย. (2005). เชอราเอนโดไฟตทผลตสารตานจลนทรยในพชสกล Garcinia. วทยานพนธ. 189 หนา.

สตา ปรดานนท. 2551. การคดเลอกและการจ าแนกชนดของเชอราทสรางสารตานจลนทรยจากกลปงหา. ว ท ย า นพน ธ ว ท ย า ศ าสตรมหาบณ ฑต . ภ า คว ช า จ ล ช ว ว ท ย า . คณะว ท ย า ศ าสต ร มหาวทยาลยวสงขลานครนทร สงขลา.

Alker, A.P., Smith, G.W. and Kim, K. 2001. Characterisation of Aspergillus sydowii (Thom et Church), a fungal pathogen of Caribbean sea fan coral. Hydrobiology. 460:105-11.

Blunt, J.W., Copp, B.R.M., Munro, M.H.G., Northcote, P.T. and Prinsep, M’R. 2004. Marine natural products. Natural Product Reports. 21: 1-49.

Anand, T., Abdul, W.B., Yogesh, S., Shouche, U.R., Jay, S. and Siddhartha, P.S. 2005. Antimicrobial activity of marine bacteria assocociated with sponges from the waters off the coast of South East India. Mirobiological Research. 16: 252-262.

Chelossi, E., Milanese, M., Milano, A., Pronzato, R. and Riccardi, G. 2004. Characterisation and antimicrobial activity of epibiotic from Petrosia ficiformis (Porifera, Demosporangiae). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 309: 21-33.

Colwell, R.R. 2002. Fulfilling the promise of biotechnology. Biotechnology Advances. 20: 215-228. Ely, R., Supriya, T. and Naik, C.G. 2004. Antimicrobial activity of marine organisms collected off the coast

of South East India. Journal of Experimantal Marine and Ecology. 339: 121-127. Fenecal, W. and Jensem, P.R. 1993. Marine microorganisms: A new Biomedical Resource. In: Attaway,

D.H. and Zaborsky, O.R. (Eds.), Marine Biotechnology, Vol I. Pharmaceutical and bioactive natural products, Plenum press, New York, pp.500.

Friedrich, A.B., Markert, H., Fendert, T., Hacker, J., Proksch, P. and Hentschel, U. 1999. Microbial diversity in the marine sponge Aplysina caverniucola (formerly Verongia cavernicola) analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH). Marine Biology. 134: 461-470.

Gandhimathi, M., Arunkumar, J., Selvin, T., Thangavelu, S., Sivaramakrisnan, G.S., Kiran, S. and Shanmughapriya, K.N. 2008. Antimicrobial potential of sponge associated marine actinomycetes. Journal of Medacal Mycology. 18: 16-22.

Groombridge, B. (Ed.). 1992. Global Biodiversity: Status of the Earth’s living Resources. A report compiled by the World Conservation Monitoring Centre, Chapman and Hall.

21

Li, Y.Z., He, L.M., Wu, J. and Jiang, Q. 2005. Bacterial community diversity associated with four marine sponges fron=m the South China sea based on 16S rDNA-DGGE fingerprinting. Journal of Experimantal Marine Biology and Ecology. 329: 75-85.

Mangano, S., Luigi, M., Consolazione,C., Mwtteo, B., Vivia, B., Renato, F. and Angelina, L.G. 2009. Antagonistic interactions between psychrotrophic cultivable bacteria isolated from Antarctic sponges: a preliminary analysis. Research in Microbiology. 160: 27-37.

Menezes, C.B., Bonugli-Santos, R.C., Miqueletto, P.B. Passarini, M.R., Silva, C.H., Justo, M.R., Leal, R.R., Garboggini, F.F., Oliverira, V.M., Berlinck, R.G. and Sette, L.D. 2010. Microbial dib=versity asscociated with algae, ascidians and sponges from the north coast of Sao Paulo atate, Brazil. Microbiological Research. 165: 466-482.

Monks, N.R., Lerner, C., Henriques, A.T., Farias, F.M., Schapoval, E.E.S., Suyenaga, E.S., Rocha, A.B.D., Schwartsman, G. and Mother, B. 2002. Anticancer, antichemotactic and antimicrobial activity of marine sponges collected off the coast of Santa Catarina, southern Brazil. Journal of Marine Biology and Ecology. 281: 1-12.

Munro, L. and Munro, C. 2003. Climate impacts on sea fan populations. Reef Research. 8:1-9. Pongpaichit, S., Rungjindamai, N., Rukachaisirikul, V. and Sakayaroj, J. (2006). Antimicrobial activity in

cultures of endophytic fungi isolated from Garcinia species. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 48(3): 367-372.

Proksch, P., Edrada, R.A. and Ebel, R. 2002. Drugs from the sea-current status and microbiological implications. Applied Microbiology and Biotechnology. 59: 125-134.

Purushothaman, A. and Jayyalakshmi, S. 2010. International training course on mangrove biodiversity and ecosystems. Centre of Advanced Studies in Marine Biology Annamalai University.

Sponga, F., Cavaletti, L., Lazzarini, A., Borghi, A., Ciciliato, I., Losi, D. and Marinelli, F. 1999. Biodiversity and potentials of marine-derived microorganisms. Journal of Biotechnology. 70: 65-69.

Thiel, V. and Imhoff, J.F. 2003. Phylogenetic identification of bacteria with antimicrobial activities from Mediterranean sponges. Biomolecular Engineering. 20: 4210423.

Wilson, J.E. 1988. The systematists’ perspective. In: Fautin DG (ed) Biomedical impoertance of marine organisms. California Academy of Science, San Francisco. pp 1-6.

Woese, C.R. and Fox, G.E. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain. The primary kingdoms. Proceedings of the National Academic of Sciences of the United State of America. 74: 5088.

Wright, A.E. 1998. Isolation of marine natural products. In: Cannell, R.J.P. (Ed.) Methods in Biotechnology, Vol 4. Humana Press, New Jersey, USA. Pp. 365-408.