ว.วิทย. มข. 44(1) 56-68 (2559) kku sci. j. 44(1 ) 5 6-68...

ว.วิทย. มข. 44(1) 56-68 (2559) KKU Sci. J. 44(1) 56-68 (2016)

หลักฐานทางสัณฐานวิทยาและดีเอ็นเอเปรียบเทียบระหวางกลอยและกลอยเขา

Comparative Morphology and DNA Evidences BetweenDioscorea hispida Dennst. var. hispida and D. hispida

Dennst. var. neoscaphoides Prain & Burkillเชิดศักดิ์ ทัพใหญ1* และมลิวรรณ นาคขุนทด2

1ภาควิชาทรัพยากรธรรมชาติและส่ิงแวดลอม คณะเกษตรศาสตรฯ มหาวิทยาลัยนเรศวร จังหวัดพิษณุโลก 650002ภาควิชาชวีวิทยา คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยนเรศวร จังหวัดพิษณุโลก 65000

*Corresponding Author, E-mail: [email protected]

บทคัดยอการศึกษาสัณฐานวิทยาเปรียบเทียบของกลอยและกลอยเขา จากตัวอยางของพืชท่ีเก็บจากภาคสนาม

และตัวอยางท่ีเก็บรักษาไวในพิพิธภัณฑพืชตางๆ พบวาโครงสรางของพืชท้ังโครงสรางท่ีไมเก่ียวของกับเพศและโครงสรางสืบพันธุ ไดแก หัวใตดิน ลําตน ใบ หัวตามซอกใบ ดอก ผล และเมล็ด ตลอดจนลักษณะทางสัณฐานของกลีบรวม ความหนาแนนของขนและหนาม มีขนาดแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ แตผลการศึกษาดีเอ็นเอของกลอยท้ังสองพันธุ พบวาไมสามารถแยกกลอยและกลอยเขาออกจากกันได เมื่อใชลําดับดีเอ็นเอบริเวณยีนrbcL แตเพียงบริเวณเดียว ดังน้ันขอมูลทางดานสัณฐานวิทยาในการศึกษาครั้งน้ี จึงสนับสนุนและยืนยันสถานภาพของกลอยและกลอยเขาใหมีความแตกตางกันในระดับพันธุ (variety) เทาน้ัน แตไมมีความแตกตางมากพอท่ีจะแยกกลอยเขาข้ึนใหเปนชนิด (species) ได

ABSTRACTComparative morphology of Dioscorea hispida var. hispida and D. hispida var.

neoscaphoides was studied by field and herbarium specimens investigation. The result showedthat mostly vegetative and reproductive parts such as tuber, stem, leaf, bulbil, flower, fruit andseed, between two varieties were significant distinction. Moreover, shape of tepal, as well as hairand spine density were also different. On the other hand, the result of DNA study was indicated

งานวิจัย วารสารวิทยาศาสตร มข. ปท่ี 44 ฉบับท่ี 1 57

that D. hispida var. hispida and D. hispida var. neoscaphoides were not distinguished from eachother based on only rbcL sequences. Therefore, only the information of morphological studywere highly supported their variety status but couldn’t state var. neoscaphoides up to thespecific rank.

คําสําคัญ: กลอย กลอยเขา สัณฐานวิทยา ดีเอ็นเอKeywords: Asiatic Bitter Yams, Dioscorea hispida, Morphology, DNA

บทนํากลอย (Dioscorea hispida Dennst.) เปน

พืชลมลุกขนาดกลางถึงขนาดใหญ ลําตนเลื้อยพันตนไมอ่ืนข้ึนไปเพ่ือรับแสง อาจยาวไดถึง 20 เมตร หัวใตดิน(tuber) มีอายุหลายป พบท่ัวไปในเขตรอนของทวีปเอเชีย ตั้งแตอินเดีย จีนตอนกลางจนถึงไตหวัน ไทยคาบสมุทรมาลายู อินโดนีเซีย ฟลิปปนส นิวกินี และตอนเหนือของออสเตรเลีย (Wilkin & Thapyai, 2009)ในประเทศไทยสามารถพบกลอยไดในบริเวณปาเบญจพรรณ ปาไผ ปาดิบช้ืนจนถึงปาดิบเขา หรือบริเวณชายปาท่ีมีดินลึกรวนซุยและระบายนํ้าดีท่ัวทุกภูมิภาคของประเทศไทย ทางภาคเหนือ ภาคตะวันออกเฉียงเหนือภาคกลาง ภาคตะวันออก และภาคใต ออกดอกระหวางเดือนมีนาคมถึงมิถุนายน ติดผลเดือนกรกฎาคมถึงเดือนพฤศจิกายน (Thapyai, 2004)

ในป ค.ศ. 1927 Prain and Burkill ไดจําแนกพันธุ (variety) ของกลอยเขา (D. hispidaDennst. var. neoscaphoides Prain & Burkill)แยกออกมาจากกลอย (D. hispida Dennst. var.hispida) เน่ืองจากพบความแตกตางของลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยเฉพาะขนาดของลําตน ใบ ดอก และผล ท่ีมีขนาดเล็กกวากลอยท่ัวไป ตอมาในป ค.ศ. 2009Wilkin and Thapyai รายงานไวในหนังสือพรรณพฤกษชาติของประเทศไทย (Flora of Thailand) พบพืชสกุลกลอย (Genus Dioscorea L.) ในประเทศไทย

จํานวน 42 ชนิด แตไมไดแยกพันธุของกลอยเขาออกมาตางหาก เน่ืองจากมีขอมูลทางสัณฐานวิทยาและอนุกรมวิธานไมเพียงพอ ท่ีจะจําแนกพันธุของกลอยและกลอยเขาออกจากกันได

เชิดศักดิ์และณัฐพงศ (2555) รายงานพบความแตกตางท่ีสําคัญระหวางกลอยและกลอยเขาหลายประการ ท้ังในสวนของโครงสรางท่ีไมเก่ียวกับเพศและโครงสรางในการสืบพันธุ (ตารางท่ี 1) รวมถึงการสรางหัวตามซอกใบ (bulbil) รูปทรงกระบอก ท่ีพบในกลอยเขาเสมอ ตางจากกลอยท่ีมีรายงานพบหัวอากาศไดจากตัวอยางท่ีเก็บจากอุทยานแหงชาติภูพาน(Wilkin et al., 1016 เก็บรักษาไวท่ีหอพรรณไม กรมอุทยานแหงชาติสัตวปาและพันธุพืช) เพียงตัวอยางเดียวเทาน้ัน ซึ่งคาดวานาจะเกิดข้ึนในกรณีท่ีลําตนของกลอยทอดเลื้อยไปตามพ้ืนดินท่ีมีความช้ืนคอนขางสูง(Thapyai, 2004) เมื่อพิจารณาถึงชวงเวลาออกดอกก็พบวามีความแตกตางกันอยางชัดเจน กลาวคือ กลอยเริ่มออกดอกตั้งแตชวงกลางฤดูรอนในเดือนมีนาคมถึงตนฤดูฝนในเดือนมิถุนายน ตางจากกลอยเขาท่ีเริ่มออกดอกในกลางฤดูฝนเดือนสิงหาคมไปจนถึงเดือนตุลาคมสวนการติดผลน้ันมีความแตกตาง กันไมมากนักเน่ืองจากมีชวงซอนทับกันในชวงเดือนกันยายนถึงเดือนพฤศจิกายน

การศึกษาความสัมพันธทางวิวัฒนาการของกลอยเพ่ือท่ีจะนํามาใชระบุชนิดน้ันทําไดยากเน่ืองจากมี

58 KKU Science Journal Volume 44 Number 1 Research

ความผันแปรของลักษณะทางสัณฐานวิทยาเปนอยางมาก โดยเฉพาะสวนของหัวใตดิน ลําตน และใบ(Wilkin et al., 2005) ดังน้ันขอมูลดีเอ็นเอในคลอโรพลาสต จึงนิยมนํามาใชในการศึกษาความสัมพันธทางวิวัฒนาการของกลอยและมันปา โดย Wilkin andCaddick (2000) ใชดีเอ็นเอบริเวณยีน rbcL และmatK รวมกับลักษณะสัณฐานวิทยา พบวากลอยท่ีมีใบเ ป น ใ บ ป ร ะ ก อ บ จ ะ อ ยู ใ น ก ลุ ม เ ดี ย ว กั น เ ป นmonophyletic ถัดมา Wilkin et al. (2005)ทําการศึกษาความสัมพันธทางวิวัฒนาการของกลอย67 แท็กซาดวยดีเอ็นเอบริเวณยีน rbcL และ matKพบวากลอยโลกเกาท่ีมีการเลื้อยพันของลําตนทางซายและขวามีความสัมพันธเปน monophyletic เชนกันแตก็ยังมีขอจํากัดในเรื่องของความสัมพันธของกลอยในแถบเอเชียท่ียังไมชัดเจน จนกระท่ัง Hsu et al. (2013)ศึกษากลอยในแถบเอเชียจํานวน 72 ตัวอยาง โดยใชดีเอ็นเอในคลอโรพลาสตจํานวน 4 บริเวณ ไดแก trnL-F,matK, rbcL และ atpB-rbcL พบวาสามารถแยกออกเปนกลุม (section) ได และกลอยในแตละกลุมก็มีลักษณะสัณฐานท่ีแตกตางกันอยางชัดเจน

เมื่อพิจารณาจากขอมูลท่ีกลาวมาขางตนและตารางท่ี 1 การท่ีจะแยกความแตกตางของกลอยท้ังสองพันธุน้ีออกจากกันไดหรือไมน้ันคณะผูวิจัยจึงจําเปนตองมีการศึกษาหาหลักฐานสนับสนุนทางสัณฐานวิทยาใหละเอียดมากข้ึน รวมกับการศึกษาหาหลักฐานทางดานดี เ อ็นเอ ท่ีจะสามารถนํามาเปนขอมูลสํ าคัญในการศึกษาทบทวนทางอนุกรมวิธาน (taxonomicrevision) ของกลอยท้ังสองพันธุน้ี เพ่ือเปนการพิสูจนยืนยันถึงสถานะภาพการเปนพันธุ ท่ีใกลชิดกันทางวิวัฒนาการ หรืออาจมีความแตกตางกันมากพอจนกระท่ังสามารถยกระดับพันธุ (variety rank) ของ

กลอยเขา ข้ึนเปนระดับชนิด (specific rank) อันจะเปนประโยชนตอการศึกษาทางดานความหลากหลายทางชีวภาพ การอนุรักษและใชประโยชนของกลอยและกลอยเขาอยางยั่งยืนตอไป

วิธีการดําเนินการวิจัย1. การสํารวจและเก็บตัวอยางพืช

1.1 ศึกษาเอกสาร งานวิจัย และตัวอยางพรรณไมแหงของกลอยและกลอยเขาท่ีพบในประเทศไทย ท่ีเก็บรักษาไว ณ พิพิธภัณฑพืชตางๆ เพ่ือเปนขอมูลเบ้ืองตนในการสํารวจ เก็บตัวอยาง และระบุชนิด

1.2 สํารวจและเก็บตัวอยางของตัวอยางกลอยและกลอยเขาท่ีพบในพ้ืนท่ีปาธรรมชาติระหวางเดือนตุลาคม 2556 ถึงเดือนกันยายน 2557 ในทองท่ีจังหวัดพิษณุโลก อุตรดิตถ พะเยา เชียงใหม และจังหวัดใกลเคียงตามลักษณะนิเวศวิทยาท่ีพบกลอยและกลอยเขาเจริญอยู อยางนอย 1 ครั้งตอเดือน (ความถ่ีจะมากข้ึนเมื่อถึงชวงการออกดอกของพืช) โดยเก็บตัวอยางของพืชท่ีมีท้ังใบ ดอก ผล และเมล็ด พรอมท้ังหัวใตดิน เพ่ือนํามาจัดทําตัวอยางพรรณไมแหง (dryspecimen) สําหรับศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาและดีเอ็นเอ

1.3 ถายภาพและวาดภาพลายเสนแสดงลักษณะของหัวใตดิน ลําตน ใบ ดอก ผล และเมล็ดของกลอยท้ัง 2 พันธุ พรอมท้ังจดบันทึกลักษณะตางๆและวัดขนาดของโครงสรางตางๆ โดยละเอียด

1.4 นําตัวอยางใบสดของพืชจากขอ 3 มาทําใหแหงโดยใชสารดูดความช้ืน (silica gel) ตัวอยางละ3 – 5 ใบ เพ่ือเตรียมตัวอยางไวสําหรับการศึกษาทางดานดีเอ็นเอตอไป


ตารางท่ี 1 เปรียบเทียบลักษณะทางสัณฐานวิทยาและชีพลักษณบางประการระหวางกลอยและกลอยเขา

VarietyTubersize(cm)

Terminalleaflet width

(cm)

Tepallength(mm)

Ovarylength(mm)

Fruitsize(cm)

Floweringtime

Fruitingtime

hispida9 – 25

x 6 – 208 – 25(–35) 0.3 – 1.2 2.5 – 4.4

4 – 5.2 x2 – 3

March –June

July –Nov.

neoscaphoides2 – 3

x 4 – 62 – 5 0.7 – 1.2 3 – 6

2 – 2.5 x2.5 – 3

Aug. – Oct.Sept. –Nov.

ที่มา: เชิดศักดิ์ และ ณัฐพงศ, 2555

2. การศึกษาในหองปฏิบัติการ2.1 ระบุชนิด หาช่ือวิทยาศาสตรท่ีถูกตอง

ของพืช โดยพิจารณาจากรูปวิธาน (key) จากเอกสารงานวิจัยท่ีเก่ียวของ พรอมท้ังเปรียบเทียบกับตัวอยางพันธุไมแหงท่ีเก็บรักษาไวในพิพิธภัณฑพืชตางๆ

2.2 ศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพืชอยางละเอียดท้ังรูปราง โครงสรางและวัดขนาดของสวนตางๆ โดยเฉพาะอยางยิ่งดอกและผล เพ่ือใชเปนหลักฐานเปรียบเทียบท้ังทางดานการบรรยายและทางสถิติของคาเฉลี่ยระหวางกลอยท้ังสองพันธุ

2.3 นําตัวอยางใบพืชท่ีทําใหแหงในสารดูดความช้ืน มาทําการสกัดดีเอ็นเอจํานวน 10 ตัวอยางโดยเปนตัวอยางกลอย 3 ตัวอยาง กลอยเขา 6 ตัวอยางและมันคันขาว 1 ตัวอยาง (D. pentaphylla) ดวยวิธีดัดแปลง CTAB Method ของ Agrawal et al.(1992) จากน้ันทําการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอบริเวณยีนrbcL บางสวนดวย universal primer โดยใช rbcL1F(5’-ATG TCA CCA CAA ACA GAA ACT AAA GC-3’) เปน forward primer และใช rbcL724R (5’-CATGTA CCT GCA GTA GC-3’) เปน reverse primer(Fay et al., 1997) แลวตรวจสอบขนาดของแถบดีเอ็นเอท่ีเกิดข้ึน โดยวิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสท่ีความเขมขนเจล 1% กระแสไฟฟา 100 โวลตเมื่อไดขนาดแถบดีเอ็นเอท่ีตองการแลว นํามาทําใหบริสุทธ์ิโดยใช

Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(USA) และนําไปหาลําดับดีเอ็นเอดวย forward และreverse primers ท่ีบริษัท Macrogen ประเทศเกาหลีใตตอไป

2.4 เมื่อไดลําดับดีเอ็นเอแลวนํามาตรวจสอบดวยการเทียบกับลําดับดี เ อ็นเอท่ีมี ในฐานขอมูลGenbank (NCBI) ของ NCBI (Basic LocalAlignment Search Tool : BLAST) และเมื่อไดลําดับดีเอ็นเอท่ีสมบูรณและถูกตองท้ัง 10 ตัวอยางแลวนํามาจัดเรียงทุกตัวอยางในแตละบริเวณ (alignment)โดยใชโปรแกรม GeneDoc version 2.6.002(Nicholas and Nicholas, 1997) และ ClustalX(Thompson et al., 1997) แลววิเคราะหความสัมพันธทางวิ วัฒนาการโดยการ วิเคราะหMaximum Likelihood ใช Tamura-Nei modelและวิเคราะหคา Bootstrap ท่ี 1,000 ซ้ําดวยโปรแกรม MEGA 5.2 (Tamura et al., 2011) เพ่ือประเมินความ สัมพันธทางวิวัฒนาการท่ีเกิดข้ึนจากphylogenetic tree ท่ีได โดยใชขอมูลลําดับดีเอ็นเอจากพืชชนิด อ่ืนในส กุล เดี ยว กันจากฐานขอมู ลGenbank (NCBI) เพ่ือใชเปน outgroups และขอมูลลําดับดีเอ็นเอเปรียบเทียบจํานวน 6 ตัวอยาง คือD. pentaphylla (AF307470.1), D. antaly(gbAY66710), D. arachidna (AF307468.1),


D. bulbifera (D28327), D. dumentorum(gbAF3074 64) และ D. hispida (AF307463.1)

ผลและวิจารณ1. การศึกษาสัณฐานวิทยาเปรียบเทียบ

กา รศึ กษาลั กษณะทา งสัณฐา น วิทย าเปรียบเทียบระหวางกลอยและกลอยเขา พบวามีลักษณะแตกตางกันหลายประการ ท้ังสวนของหัวใตดินลําตน ใบ ดอก ชอดอก ผล และเมล็ด โดยมีรายละเอียดดังน้ี

1.1 หัวใตดิน (tuber) กลอยมีการเจริญในลักษณะเปนกลุม (cluster) ประมาณ 3–5 หัวตอตนโดยขนาดของหัวผันแปรไปตามอายุและความสมบูรณของพืช รูปรางของหัวโดยท่ัวไปเปนรูปไข ทรงกลมหรือพองออกตอนปลายคลายกระบอง (รูปท่ี 1A)ขนาดเสนผานศูนยกลางโดยเฉลี่ย 6–20 เซนติเมตรยาว 9–25 เซนติเมตร ตางจากหัวใตดินของกลอยเขาท่ีจะเกิดเพียงหัวเดี่ยวๆ รูปทรงกระบอกปลายมน หรือรูปไข (รูป ท่ี 1B) เสนผ านศูนยกลางเฉลี่ ย 2–3เซนติเมตร ยาว 4–6 เซนติเมตร นอกจากน้ียังพบวาหัวของกลอยจะสะสมอาหารเพ่ิมเติมทุกป (perenniallyreplacement) ทําใหมีขนาดใหญข้ึนเรื่อยๆ ตางจากหัวของกลอยเขาท่ีจะเกิดหัวใหมแทนหัวเกาในทุกๆ ป(annually replacement) โดยหัวเกาจะยอยสลายไปเมื่อลําตนของฤดูกาลใหมแตกหนอข้ึนมาแลว ไมสามารถมีอายุของหัวขามปได นอกจากน้ีเมื่อพิจารณาขนาดของหัวใตดินเปรียบเทียบระหวางกลอยและกลอยเขา พบวามีขนาดเสนผานศูนยกลางหัวท่ีแตกตางกันอยางมนัียสําคัญทางสถิติ (ตารางท่ี 2)

1.2 ลําตน (stem) ขนาดลําตนของกลอยท้ังสองพันธุพบวามีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญทาง

สถิติ (ตารางท่ี 2) ชวงเวลาท่ีลําตนของกลอยแตกหนอข้ึนมาน้ัน พบตั้งแตปลายเดือนกุมภาพันธหรือมีนาคมแลวมีการเจริญของชอดอกตามมาทันทีกอนท่ีใบจะเจริญเต็มท่ี โดยชอดอกท่ีเกิดในระยะแรกน้ีท้ังหมดจะเปนดอกเพศผูท้ังสิ้น สวนลําตนท่ีเกิดดอกเพศเมียจะเริ่มพบไดประมาณเดือนเมษายนเปนตนไปถึงประมาณเดือนกรกฎาคม ตรงกันขามกับกลอยเขาท่ีพบวาเริ่มมีการแตกหนอเกิดลําตนใหมออกมา ในชวงตนฤดูฝนประมาณเดือนพฤษภาคม โดยมีการเจริญของท้ังลําตนและ ใบ ไปพรอมๆ กัน เมื่ อลํ าต นและใบมี การเจริญเติบโตเต็มท่ีแลวกลอยเขาจึงจะมีการออกดอกในชวงเดือนสิงหาคมถึงเดือนธันวาคม

การท่ีระยะเวลาในการออกดอกของกลอยท้ังสองพันธุแตกตางกันเชนน้ี สืบเน่ืองมาจากกลอยมีหัวใตดินขนาดใหญ มีอาหารสะสมอยูมาก ทําใหสามารถสรางดอกไดในทันทีท่ีลําตนเจริญข้ึนมา ไมตองรอใบชุดใหมท่ีจะเจริญมาภายหลัง นอกจากน้ีในชวงระยะเวลาดังกลาว ไมตนในปาท่ีกลอยเจริญอยูสวนใหญยังอยูในชวงผลัดใบ สภาพปาโดยท่ัวไปคอนขางเปดโลง ทําใหสื่อผสมเกสรตางๆ สามารถเขาถึงดอกกลอยท่ีมีขนาดเล็กไดงายข้ึน ตางจากกลอยเขาท่ีมีขนาดของลําตนขนาดเล็ก จึงตองรอใหพรรณไมอ่ืนๆ เจริญข้ึนมาเสียกอน เพ่ือท่ีจะไดอาศัยเลื้อยพันข้ึนไปไดงาย อีกประการหน่ึงท่ีสําคัญก็คือ หัวของกลอยเขามีขนาดคอนขางเล็กและเกิดเปนหัวเดี่ยว จึงไมมีอาหารสะสมไวมากพอท่ีจะออกดอกไดทันทีหลังจากแตกหนอข้ึนมาใหม ตองรอใหใบชุดใหมทําการสังเคราะหดวยแสงสรางอาหารใหเพียงพอกอน พรอมๆ กับการสรางหัวใหมข้ึนแทนหัวเกาท่ีจะสลายไป จากน้ันจึงจะมีการออกดอกตอไป


รูปท่ี 1 หัวใตดินของกลอยท้ังสองพันธุ: A กลอย และ B กลอยเขา

1.3 หัวตามซอกใบ (bulbil) พบเปนปกติในกลอยเขา (รูปท่ี 4A) รูปทรงกระบอก หรือรูปกระบองเสนผานศูนยกลาง 5–10 มิลลิ เมตร ยาว 15–25มิลลิเมตร เปลือกนอกสีนํ้าตาลแกมเทา ผิวขรุขระเพราะวามีรากสั้นๆ แทงโผลออกมา เปลือกในสีเขียวเน้ือในสีขาว นอกจากน้ียังพบวาในหัวตามซอกใบท่ีอายุมากมักจะพบหนอออนและใบเกิดข้ึนอยูดวย แมวาหัวน้ันยังคงติดอยูภายในซอกใบก็ตาม สวนหัวตามซอกใบของกลอยน้ันไมพบในตัวอยางท่ีเก็บมาศึกษา

1.4 ใบ (leaf) พบวาใบของกลอยท้ังสองพันธุน้ัน มีขนาดท่ีแตกตางกันอยางมาก ใบของกลอยเขาเมื่อเจริญเติบโตเต็มท่ีแลว กวางไมเกิน 5 เซนติเมตรต า งจากกลอย ท่ี ใบกว า ง ได ถึ ง 15 เซนติ เ มตร

เชนเดียวกับความยาวของกานใบ (ตารางท่ี 2) ท่ีมีความยาวแตกตางกันมาก โดยกลอยเขามีกานใบยาว3–5 เซนติเมตร ในขณะท่ีกลอยมีกานใบยาวตั้งแต6 เซนติเมตรข้ึนไป และมักมีหนามขนาดเล็กเกิดข้ึนตามกานใบอีกดวย ตางจากกานใบของกลอยเขาท่ีจะไมพบหนาม สอดคลองกับการวิเคราะหทางสถิติ ท่ีพบวามีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญในเรื่องความยาวของกานใบและความยาวของใบยอยใบกลาง แตไมมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญในเรื่องความยาวของปลายใบ (ตารางท่ี 2) ลักษณะของเน้ือใบพบวาเน้ือใบของกลอยเขาคอนขางอวบหนา มีขนนุมปกคลุมบางๆสวนเน้ือใบของกลอย คอนขางเหนียวและมีขนแข็งข้ึนปกคลุมหนาแนน

ตารางท่ี 2 ผลการเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโครงสรางท่ีไมเก่ียวกับเพศระหวางกลอยและกลอยเขา (ท่ี∝= 0.05)variety Vegetative Characters

TP1(tuber) TD1(mm) SD2(mm) PL2(cm) TLL1(cm) LTL1(mm)S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D.

hispida 4.2 1.8 16.1 6.0 6.1 1.9 17.6 5.2 15.4 5.7 13.4 5.2neoscaphoides 1 0 3.3 1.2 2.3 0.71 6.7 2.4 7.40 1.5 14.8 4.3

t-score 8.2* 6.6* 11.7* 12.2* 8.6* 1.4หมายเหตุ: TP = number of tuber per plant; TD = tuber diameter; SD = stem diameter; PL = petiole length; TLL = terminalleaflet length; LTL = length of terminal leaflet tip;1 n = 20; 2 n = 40

1 cm1 cm

A B

X X X X XX


รูปท่ี 2 ลําตน ใบ และชอดอกเพศผู (A–B กลอย (D. hispida Dennst. var. hispida), A ลําตน ใบและชอดอก, B ชอดอกยอย; C–D กลอยเขา (D. hispida Dennst. var. neoscaphoides), C ลําตนใบ และชอดอก, D ชอดอกยอย)

1.5 ดอกและชอดอกเพศผู (male flowerand inflorescence) พบเกิดเปนชอแยกแขนง(panicle) ขนาดใหญในกลอย (รูปท่ี 2A) มีความยาวท้ังหมด 4–17 เซนติเมตร ชอยอยแบบชอเชิงลด(spike) ยาว 2–8 เซนติเมตร ตางจากชอดอกของกลอยเขาพบท่ีวา สวนมากเกิดเปนชอสั้นๆ (รูปท่ี 2C)พบบางท่ีมีการแตกแขนง มีความยาวท้ังหมดเพียง 2–7เซนติ เมตร ชอดอกยอยยาว 0.5–1 เซนติ เมตรสวนขนาดของดอกเพศผูในกลอยท้ังสองพันธุน้ัน พบวามีขนาดใกลเคียงกันมาก แตรูปรางของแกนชอดอกยอย(axis) มีลักษณะท่ีคอนขางแตกตางกันอยางเห็นไดชัดกลาวคือ แกนชอดอกยอยของกลอยรูปทรงกระบอก มีดอกยอยเรียงหนาแนนตลอดความยาว (รูปท่ี 2B)

ตางจากกลอยเขาท่ีแกนชอดอกยอยรูปคลายกระบองและมีดอกยอยเรียงหางๆ กัน (รูปท่ี 2D) เมื่อพิจารณาขนาดพบวา ท้ังความยาวของกานชอดอกยอยเสนผานศูนยกลางดอกบาน ตลอดจนความยาวของกลีบรวมช้ันนอก กลีบรวมช้ันใน ใบประดับ (bract) และใบประดับยอย (bracteole) มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคญัทางสถิติ (ตารางท่ี 3)

1.6 ดอกและชอดอกเพศเมีย ( femaleflower and inflorescence) พบเกิดเปนชอเชิงลด(spike) ไมแยกแขนงท้ังสองสายพันธุ แตดอกยอยของกลอยจะเกิดรวมกันอยูเฉพาะตอนปลายชอเทาน้ัน ตางจากดอกยอยของกลอยเขาท่ีคอนขางกระจายอยูตลอดความยาวของกานชอ ความแตกตางทางสถิติท่ีพบ

5 cm

1 mm

A

B1 mm

D

C

1cm


เกิดข้ึนในขนาดของดอกบานและความยาวของกลีบรวมช้ันนอกเทาน้ัน สวนลักษณะอ่ืนๆ มีคาไมแตกตางกัน (ตารางท่ี 4) สวนความแตกตางทางสัณฐานวิทยาพบวากลีบรวมของกลอยมีลักษณะอวบหนา ปลายกลีบ

โคงมนและงองุมเขาหาใจกลางดอกอยางชัดเจน(รูปท่ี 3H, 3I) ตางจากกลีบรวมของกลอยเขาท่ีคอนขางบาง ปลายกลีบแหลมตรงหรือโคงงุมเพียงเล็กนอย(รูปท่ี 4G, 4H)

รูปท่ี 3 โครงสรางสวนสืบพันธุของกลอย (Dioscorea hispida Dennst. var. hispida) (A ดอกเพศผู, B ดอกเพศผูตัดตามยาว, C กลีบรวมเพศผูช้ันนอก, D กลีบรวมเพศผูช้ันใน, E ดอกเพศเมีย, F ดอกเพศเมียตัดตามยาว, G ยอดเกสรเพศเมีย, H กลีบรวมเพศเมียช้ันนอก, I กลีบรวมเพศเมียช้ันใน, J ผล, K. เมล็ด)

0.5 mm

0.5 mm1 mm

1 mm

1 mm

1 cm

1 cm

0.5 mm 0.5 mm

0.5 mm

0.5 mm

A B

C D

E

F

G

H I J K


รูปท่ี 4 โครงสรางสวนสืบพันธุของกลอยเขา (Dioscorea hispida var. neoscaphoides) (A หัวตามซอกใบ, Bดอกเพศผูตัดตามยาว, C กลีบรวมเพศผูช้ันนอก, D กลีบรวมเพศผูช้ันใน, E ยอดเกสรเพศเมีย, F ดอกเพศเมียตัดตามยาว, G กลีบรวมเพศเมียช้ันนอก, H กลีบรวมเพศเมียช้ันใน, I ผล, J เมล็ด)

ตารางท่ี 3 ผลการเปรียบเทียบคาเฉลี่ยโครงสรางสืบพันธุเพศผู (male reproductive parts) ระหวางกลอยและกลอยเขา (ท่ี∝= 0.05)

VarietyMale floral characters

PMA (mm) FLD (mm) OTL (mm) ITL (mm) FBL (mm) BTL (mm)S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D.

hispida 14.6 3.6 1.7 0.4 0.7 0.10 1.1 0.2 1.03 0.19 0.7 0.12neoscaphoides 7.2 2.6 1.2 0.1 1.0 0.1 1.2 0.11 1.4 0.2 0.8 0.1

t-score 10.6* 8.9* 10.3* 2.8* 7.2* 4.0*หมายเหตุ: PMA = partial male inflorescence axis length; FLD = floral diameter; OTL = outer tepal length; ITL = inner tepallength; FBL = floral bract length; BTL = bracteole length; n = 40

0.5 mm0.5 mm

1mm

FB E

C

A

0.5mm 1 cm1cm

IH

0.5 mm

J

D G

5 mm

1mm0.5 mm

X X X X X X


1.7 ผลและเมล็ด (capsule and seed)ผลของกลอยท้ังสองพันธุเมื่อแกจะแตกตามตะเข็บท้ังสามดานแบบ loculicidal capsule (รูปท่ี 3J, 4I)มีจํานวนเมล็ดตั้งแต 1–6 เมล็ด ความกวางของผลมีขนาดใกลเคียงกันระหวาง 20–30 มิลลิเมตร แตขนาดความยาวผลของกลอยจะมากกวาอยางชัดเจนท่ีขนาด40–52 มิลลิเมตร สวนกลอยเขามีความยาวของผล

เพียง 25–30 มิลลิเมตรเทาน้ัน สอดคลองกับการวิเคราะหทางสถิติ ท่ีพบวามีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญ (ตารางท่ี 4) นอกจากน้ียังพบวาเน้ือผลสดของกลอยเขามีลักษณะคอนขางบางและโปรงแสงสามารถมองเห็นเมล็ดท่ีอยูภายในไดชัดเจน ตางจากเน้ือผลของกลอยท่ีหนาแข็งและทึบแสง

ตารางท่ี 4 ผลการเปรียบเทียบคาเฉลี่ยของโครงสรางทางดานการสืบพันธุเพศเมีย (female reproductiveparts) ระหวางกลอยและกลอยเขา(ท่ี∝= 0.05)

Variety

Female floral & capsule characters

FLD (mm)n =14

OTL(mm)n = 18

ITL (mm)n = 18

FBL (mm)n = 6

BTL (mm)n = 5

CPL (mm)n = 20

CPW(mm)n = 20

S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D. S.D.hispida 2.6 0.3 0.8 0.9 0.9 0.1 2.2 0.4 1.3 0.2 48.2 8.9 26.8 4.5

neoscaphoides 1.5 0.3 1.0 0.2 1.0 0.3 2.4 0.5 1.3 0.2 37.4 3.6 22.3 2.2t-score 10.7* 2.4* 1.7 0.1 0.1 5.1* 4.0*

หมายเหตุ: FLD = floral diameter; OTL = outer tepal length; ITL = inner tepal length; FBL = floral bract length; BTL =bracteole length; CPL = capsule length; CPW = capsule wide (mm)

2. การศึกษาหลักฐานทางดีเอ็นเอเปรียบเทียบการสกัดดีเอ็นเอบริเวณยีน rbcL บางสวน

พบวามีความยาวตั้งแต 631–644 คูเบส โดยพบการแทนท่ีเบสจํานวน 68 ตําแหนง (10.56%) อัตราสวนของ transition ตอ transversion เทากับ 0.744 พบการแทรกเขามาหรือขาดหายไป 3 บริเวณ ขนาดตั้งแต5–9 คู เบส จากการวิ เคราะหความสัมพันธทางวิวัฒนาการโดยประเมินจากคา bootstrap supportสามารถแบงกลอยออกเปน 2 กลุมใหญๆ (รูปท่ี 5)โดยกลุมท่ี 1 ประกอบ ดวย Dioscorea ชนิดอ่ืนๆ

จํานวน 4 ชนิดท่ีเปน outgroup ท้ังหมด ไดแกD. arachidna, D. bulbifera, D. antaly และD. pentaphylla ซึ่ง D. pentaphylla 1.1 ท่ีเก็บตัวอยางมาน้ันถือวาจัดจําแนกไดถูกตอง เน่ืองจากตัวอยางอยูใกลชิดกัน มีคา bootstrap support สูงแตอยางไรก็ตามก็ยังมีลําดับดีเอ็นเอท่ีแตกตางกันบางอาจจะเน่ืองมาจาก D. pentaphylla ในฐานขอมูลและในการศึกษาครั้งน้ีเก็บมาคนละแหลง แสดงใหเห็นถึงความผันแปรท่ีเกิดข้ึนไดของบริเวณยีน rbcL ถึงแมจะเปนชนิดเดียวกันก็ตาม

X X X X X X X


รูปท่ี 5 สายสัมพันธทางวิวัฒนาการท่ีไดจากการวิเคราะห Maximum Likelihood ของลําดับดีเอ็นเอ บริเวณยีนrbcL ในพืชสกุลกลอย (ตัวเลขหลังช่ือวิทยาศาสตรหมายถึงหมายเลขตัวอยาง (specimen number))

ขณะท่ีกลุม 2 น้ัน D. hispida และD. dumetorum จะรวมอยูในกลุมเดียวกัน แสดงใหเห็นวา D. hispida และ D. dumetorum มีบรรพบุรุษรวมกัน สอดคลองกับการศึกษาพืชสกุลกลอยโดยใชลําดับดีเอ็นเอในคลอโรพลาสต 2 บริเวณคือ rbcL และ matK พบวาพืชท้ังสองชนิดน้ีมีความสัมพันธใกลชิดกันมาก (Wilkin et al., 2005)ดังน้ันจึงอาจกลาวไดวา D. hispida ไมไดเปนmonophyletic และเมื่อพิจารณาภายในชนิดเดียวกันแตตางสายพันธุ พบวา D. hispida var. hispida กับvar. neoscaphoides ไมสามารถแยกเปนกลุมไดชัดเจน แตสามารถแยกสายวิวัฒนาการไดเปน 2 กลุมท่ีมีคา bootstrap support ท่ีสูงถึง 96 และ 71ตามลําดับ โดยกลุมท่ี 1 น้ัน D. hispida var.neoscaphoides ตัวอยาง ท่ี 1.4 และ 2.2 มีสายสัมพันธ ท่ีใกลชิดกันมากและแยกออกมาเปนสายวิวัฒนาการแรก (basal lineage) ของกลอยท้ังหมดขณะท่ีภายในกลุมใหญน้ัน D. hispida var. hispida

ตัวอยางท่ี 1.1 และ 1.2 มีลําดับดีเอ็นเอท่ีคลายกับD. hispida ท่ีไดมาจาก Genbak (NCBI) มากท่ีสุดขณะท่ี D. hispida var. neoscaphoides ตัวอยางท่ี1.1, 1.2, 1.3 และ 2.1 มีความสัมพันธใกลชิดกับD. hispida var. hispida ตัวอยางท่ี 2.1 ถึงแมจะมีคาbootstrap ท่ีต่ํา แตอยางไรก็ตามความสัมพันธทางวิวัฒนาการระหวาง D. hispida var. hispida กับ var.neoscaphoides ยังไมแนชัดและแยกกลุมไมไดชัดเจนถึงแมวาจะมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาท่ีแตกตางกันเน่ืองจากบริเวณยีน rbcL น้ัน แมวาจะชวยในการจัดกลุมและศึกษาสายวิวัฒนาการของกลอยได แตยีนดังกลาวน้ีในพืชอ่ืนๆ ถือวามีประสิทธิภาพในการนํามาใชแยกและระบุชนิดต่ํา แตถาใชรวมกับบริเวณอ่ืนเชน ยีน matK หรือดีเอ็นเอในนิวเคลียส เชน ITS ก็จะทําใหผลการแยกและระบุชนิดพืชดีข้ึน (Hilu andLiang, 1997)










สรุปผลการศึกษาจากการศึกษาสัณฐานวิทยาเปรียบเทียบของ

โ ค ร ง ส ร า ง พื ช ท้ั ง ห ม ด ร ว ม กั บ ก า ร วิ เ ค ร า ะ หความสัมพันธเชิงวิวัฒนาการจากดีเอ็นเอ พบวากลอยและกลอยเขามีความสัมพันธใกลเคียงกันมากเมื่อเทียบกับกลอยหรือมันปาในกลุมใบประกอบ (compoundleaves) ดวยกัน ผลการศึกษาในครั้งน้ีจึงยืนยันไดวากลอยและกลอยเขามีความสัมพันธทางวิวัฒนาการท่ีใกลชิดกันถึงแมวาจะมี มันปาชนิดอ่ืนถูกจัดอยูในกลุมเดียว กันดวย ก็ตาม ดั ง น้ันขอมูลของดี เ อ็นเอในการศึกษาครั้งน้ีจึงไมสามารถแยกสถานภาพของกลอยเขาจากระดับพันธุข้ึนเปนระดับชนิดตางหากได มีเพียงขอมูลทางสัณฐานวิทยาท่ีแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญทางสถิตเิทาน้ัน ท่ีสนับสนุนใหการจัดจําแนกกลอยและกลอยเขาออกจากกันในระดับสายพันธุ (variety)ตามท่ีไดรายงานไวโดย Prain and Burkill (1927) น้ันถือวาเหมาะสมถูกตองแลว

กิตติกรรมประกาศการศึกษาวิจัยในครั้งน้ี ไดรับทุนอุดหนุน

การวิจัย จากงบประมาณรายไดประจําปงบประมาณ2557 มหาวิทยาลัยนเรศวร ขอขอบพระคุณโครงการอนุรักษพันธุกรรมพืช อันเน่ืองมาจากพระราชดําริอพ.สธ.–กฟผ. เข่ือนสิริกิติ์ ท่ีใหความอนุเคราะหผูวิจัยเขาเก็บตัวอยางพืชประกอบการวิจัย ขอขอบคุณภัณฑรักษประจําหอพรรณไม (BKF) ท่ีอนุญาตใหผูวิจัยเขาศึกษาตัวอยางพันธุไมแหงและคนควาเอกสารวิชาการท่ีเก่ียวของ

ภาคผนวกรายชื่อตัวอยางท่ีศึกษาสัณฐานวิทยา [BKF]Dioscorea hispida Dennst. var. hispida

A. Virapong AV 243; C. Thapyai 13,617, 638, 653, 659; Geesink &Santisuk 4993, 5475; Maxwell 85-1093,87-390; Newman et al. 1375;Phengklai et al. 6717, 15738; Poomaet al. 4063; Puudjaa 138; Smutnavee794; Smitinand 1109; Wilkin et.al. 855,869, 876 987, 1008, 1016

Dioscorea hispida Dennst. var. neoscaphoidesPrain & Burkill

Chayamarit et al. 2093; C. Thapyai538, 619, 654, 655, 656, 657, 658, 660;Hansen 4509; Larsen & Hansen 4509;Larsen et al. 482, 2218, 2286, 2682;Maxwell 87-896, 88-831, 88-1158, 92-531, 95-1293, 96-1147, 05-422; Poomaet al. 4552; Tagawa et al. T-9175; T.Shimizu T-8055

2. รายชื่อตัวอยางท่ีศึกษาดีเอ็นเอ [BKF]Dioscorea hispida Dennst. var. hispida

D his hispida 1.1 (C. Thapyai 617)Sequence Number KU865501D his hispida 1.2 (C. Thapyai 653)Sequence Number KU865503D his hispida 2.1 (C. Thapyai 659)Sequence Number KU865509

Dioscorea hispida Dennst. var. neoscaphoidesPrain & Burkill

D his neoscaphoides 1.1 (C. Thapyai654) Sequence Number KU865504D his neoscaphoides 1.2 (C. Thapyai655) Sequence Number KU865505


D his neoscaphoides 1.3 (C. Thapyai656) Sequence Number KU865506D his neoscaphoides 1.4 (C. Thapyai657) Sequence Number KU865507D his neoscaphoides 2.1 (C. Thapyai658) Sequence Number KU865508D his neoscaphoides 2.2 (C. Thapyai660) Sequence Number KU865510

Dioscorea pentaphylla L.D pentaphylla 1.1 (C. Thapyai 629)Sequence Number KU865502

เอกสารอางอิงเชิดศักด์ิ ทัพใหญ และ ณัฐพงศ แกวทุ ง . (2555). ความ

หลากหลายทางชนิดพันธุของกลอยในพื้นที่ปกปกพันธุกรรมพืช อพ.-สธ. เขื่อนสิริกิต์ิ การไฟฟาฝายผลิต จังหวัดอุตรดิตถ. วารสารวิจัยนเรศวรพะเยา5(3): 271–280.

Agrawal, G.K., Pandey, R.N. and Agrawal, V.P. (1992).Isolate of DNA from Cheorospondias asillarisleaves. Biotechnology and BiodiversityLetters 2: 19–24.

Fay, M. F., Swensen, S.M. and Chase, M.W. (1997).Taxonomic affinities of Medusagyneoppositifolia (Medusagynaceae). Kew Bull.52: 111 – 120.

Hsu, K.M., Tsai, J.L., Chen, M.Y., Ku, H.M., and Liu, S.C.(2013). Molecular phylogeny of Dioscorea(Dioscoreaceae) in East and Southeast Asia.Blumea 58: 21–27.

Hilu, K.W. and Liang, H. (1997). The matK gene:sequence variation and application in plant

systematic. American Journal of Botany84(6): 830–839.

Nicholas, K.B, and Nicholas, H.J.B. (1997). GeneDoc: atool for editing and anno- tating multiplesequence alignment. [Online]. Available:www.psc.edu/biomed/genedoc [2013, May20]

Prain, D. and Burkill, I.H. (1927). The genus Dioscoreain Siam. Bull. Misc. Inform. Kew. 6: 225–246.

Tamura K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei,M. amd Kumar, S. (2011). MEGA5: MolecularEvolutionary Genetics Analysis usingMaximum Likelihood, Evolutionary Distanceand Maximum Parsimony method.Molecular Biology and Evolution 28: 2731–2739.

Thapyai, C. (2004). Taxonomic Revision of FamilyDioscoreaceae in Thailand. Ph.D.Dissertation, Kasetsart University. pp. 186–190.

Wilkin, P. and Caddick, L.R. (2000). Palaeotropicalcompound-leaved yams (Dioscorea;Dioscoreaceae): monophyly andrelationships. In: Wilson KL, Morrison DA(eds), Monocots: Systematics and Evolution:Melbourne: CSIRO, 497–504.

Wilkin, P., Schols, P., Chase, M.W., Chayamarit, K.,Furness, C.A., Huysmans, S., Rakotonasolo,F., Smets, E., and Thapyai, C. (2005). Aplastid gene phylogeny of the yam genus,Dioscorea: roots, fruits and Madagascar.Systematic Botany 30: 736–749.

Wilkin, P. and C. Thapyai. (2009). Dioscoreaceae. Floraof Thailand 10(1): 1 – 140.

ว.วิทย. มข. 44(1) 56-68 (2559) kku sci. j. 44(1 ) 5 6-68...

Documents