מעבדה בביוכימיה

: 4 דו"ח מספר

מגישות:דודי העייפבורגר-מצאתי-מחשבון-הזוי-בגוגל

עמיר אמויאלוקרבונאט

הקדמה:

האנזימים הינם חלבונים המשמשים כקטליזאטורים ביולוגיים בעלי יעילות וספציפיות גבוהה מאוד אשר על ידי קשירה לסובסטרט, יוצרים סביבה נוחה מבחינה אנרגטית המאפשרת לריאקציה כימית להתרחש. קומפלקס

אינזים-סובסטרט הוא המרכזי בפעילות אינזימים; זוהי נקודת ההתחלה לטיפול מתמטי המגדיר את ההתנהגותהקינטית של תגובות של אינזימים קטליטיים.

זורים: י מולקולת האנזים מורכבת ממספר א האתר הפעיל, המהווה חלק קטן מסך גודלו של החלבון, הינו האיזור אליו נקשר הסובסטרט. כתוצאה מהקשירה,

מתרחש שינוי כימי במבנה הסובסטרט ויוצאת לפועל תגובה קטליטית. האתר הפעיל כולל בתוכו את האתר שקושר את הסובסטרט ואת האתר הקטליטי שמפרק אותו. ,הקושר

- מותאם לסובסטרט בגודל, בצורה, מטען ואופי הידרופילי או הידרופובי. זוהי אינטראקציה ספציפית:אתר קושר ובאופן סלקטיבי להתחבר לאחת או לכמה. לחלבון,החלבון מסוגל "לסנן" דרך אלפי מולקולות שונות בסביבתו

מסויים יכולים להיות אתרי קישור שונים ונפרדים עבור מספר ליגאנדים שונים. אינטראקציה מולקולרית ספציפיתזו קריטית על מנת לשמור על רמת אירגון וסדר גבוה במערכת החיים.

הנמצא בתוך החלבון ולא על פני שטח הפנים, אתר הקטליטי הכאמור, הקישור מתקיים באתר הקושר ואילו אחראי על קיומה של הפעילות הקטליטית לאחר היקשרותו של הסובסטרט. באתר זה מצויות חומצות אמינו עם

פעילות ספציפית של האינזים, בדר"כ בתוך שקע הידרופובי.

( Inhibitors מעכבים ) חומרים הנקשרים לאנזים ומשפיעים על פעולתו. פעולתם ואתרי התקשרותם שונים זה מזה אולם בעיקרון כולם

בדרך זו או אחרת.Vmax ו Kmתוצאה דומה - פגיעה ביציאתה של תגובה לפועל והשפעה על הפרמטרים למביאים , כך שהאנזים יכול להשתחרר מהמעכב ולהמשיך לפעול. אוהפיךהקישור של המעכב לאנזים יכול להיות קישור

, כזה שלמעשה נקשר בקשר חזק לאנזים ומונע פעילות עם הסובסטרט. בלתי-הפיךקישור

כיווןVmax. קשירה זו אינה משפיעה על אל האתר הקושר, המעכב נקשר לאינזים בצורה לא קוולטיתבעיכוב הפיך המעכב מתחרה עם הסובסטרט על אתר הקשירה, וע"י כך מקטין את סיכויי הסובסטרטשההפרעה הינה ארעית.

והזיקה לסובסטרט יורדת. במידה ונטה את ש"מ לטובת הסובסטרט ע"י הגדלת Kmלהיקשר לאינזים, מגדיל אתריכוזו, נוכל להקטין את מידת העיכוב.

מעכבים הפיכים מתחלקים לשלושה סוגים:

חומרים הדומים במבנה המרחבי לסובסטראט ונקשרים לאתר הפעיל של האנזים. כל עוד:מעכבים תחרותים כאשר מדובר על קישור מעכב-סובסטרט הפיך, שלאחריו יכולהמעכב קשור לאנזים, האנזים אינו יכול לפעול.

מידת העיכוב של התגובה תלויהשוב הסובסטרט יכול להקשר אליו. אז אתר הפעיל, המעכב להשתחרר מה בריכוזים היחסים של הסובסטרט ושל המעכב. ככל שיש יותר סובסטרט ביחס למעכב, הסיכוי שהסובסטרט ייכנס

לאתר הפעיל גבוה יותר. כלומר, בריכוז סובסטרט מספיק גבוה, הסובסטרט "יתגבר" על העיכוב. ע"י הקשרותו מלמד על הזיקהה Kmלאתר הפעיל, מקטין המעכב את סיכויי הסובסטרט להיקשר לאינזים ובעצם כך מגדיל את

. אינו משתנהVmax , בעוד ששל האנזים לסובסטרט

חומרים הנקשרים לאנזים באתר שאינו האתר הפעיל, אך עם זאת, עצם הקישור:מעכבים בלתי תחרותיים משפיע על פעילות האנזים. עצם הקשרותם לאתר אחר מהאתר הפעיל, היא שמקנה להם את שמם "בלתי

הפרעתםולכן הוספת סובסטרט למערכת לא תקטין את העיכוב. תחרותיים" כיוון שאינם מתחרים בסובסטרט משתנה כי המעכב מפריע Vmaxוקבלת תוצר בכמות פחותה. במצב זה, בקצב איטי יותר של פירוק ביטויבאה לידי

אינו משתנה וזאת מכיוון שאין פגיעה באפיניות קומפלקס אנזים-סובסטרט.Kmכל הזמן להגיע לערך זה אולם החופשי או לקומפלקסE וקיימים כאלה הנקשרים ל ES (Un)קיימים מעכבים לא תחרותיים הנקשרים לקומפלקס

ES) לאחר שנוצר Non(.

2

+ +

Vmax = Un ומשפיע על Kmמשנה את ESמתקשר רק לקומפלקס

= Non לא משפיע עלKm אבל Vmax.יורדת המעכב יכול להיקשר או לקומפלקס או

Eל בלבד

לעומת זאת, מבוסס על מודיפיקציה כימית כתוצאה מיצירת קשרים קוולנטיים בין האינזיםעיכוב בלתי הפיך למעכב. קשרים בלתי הפיכים אלה גוררים שינוי בלתי הפיך בצורתו המרחבית של האינזים, חסימת אחד האתרים ע"ג האינזים בצורה בלתי הפיכה המפריעה לפעילות האינזים. העיכוב יכול להיות סלקטיבי = ייפגע ישירות באתר הפעיל, או לא סלקטיבית = יהרוס בכל צורה אחרת את האינזים. מנגנון העיכוב מבוסס בדרך כלל על שני שלבים: תחילה נקשרים לאתר הקושר ורק אחר כך נקשרים לאתר הקטליטי. עד רגע הקשירה לאתר הקטליטי, מדובר על

הרברסיבליות תלויה בזמן הדגירה בין האינזים למעכב.עיכוב הפיך.

במעבדה זו, ננשתמש באינזימים טריפסין וכימוטריפסין. אלו הם אנזימים פרוטואוליטים אשר הזימוגנים (הצורה הבלתי פעילה) שלהם נוצרים בתאים האקסוקרנים של הלבלב, ממנו הם מופרשים אל המעי הדק ושם הופכים

להיות פעילים בעקבות תהליך אקטיבציה.

הטריפסין והכימוטריפסין הם אנזימים הומולוגים בעלי דימיון רב במבנה הראשוני והמרחבי, וכן במבנה האתר . למרות זאת, הספציפיות של אינזים אלו שונהSerine ו Aspatic acid, Histadinהקטליטי שלהם הבנוי מ

לחלוטין. בעוד שטריפסין פותח קשרים בהם הקבוצה הקרבוקסילית נתרמה על ידי חומצות אמינו בסיסיות כגון ליזין וארגנין, הרי שכימוטריפסין פותח בעיקר קשרים פפטידיים בהם הקבוצה הקרבוקסילית נתרמה ע"י חומצות

אמינו ארומטיות. שוני זה נובע מאופיו של האתר הקושר הבנוי כ"הכיס ההידרופובי". בתחתית האתר הקושר של הטריפסין מצויה החומצה האספרטית בעלת מטען חשמלי שלילי ואילו בכימוטריפסין,

חומצת האמינו סרין, חסרת המטען, היא שמצויה בתחתיתו של "כיס" זה. שוני זה מביא גם כן, להיווצרותן של אינטראקציות שונות כן; בטריפסין, החומצה האספרטית אחראית ליצירת קשר יוני (חזק) עם סובסטרט טעון

חיובית (הבדלי מטענים) ואילו בכימוטריפסין, האינטראקציה בין האינזים לטבעת הבנזנית של הסובסטרט, הינהחלשה יותר כיוון שהינה בעלת אופי הידרופובי.

יש לציין כי שני האנזימים מאופיינים ביכולתם לפתוח קשרים פפטידים, אמידים ואסטרים.

3

מטרות המעבדה:

קצב הריאקציהעל השפעת ריכוז סובסטרט א. על הפעילות האינזימטית.PABA (p-amino benzamidine) השפעת מעכב ב. בדיקת הפעילות של טריפסין וכימוטריפסין על סובסטרטים ספציפיים ועיכובם ע"י מעכבים ספציפיים בלתיג.

הפיכים.

' ' ו- ז ו ים - ניסוי 1 ניסוי

ת הניסוי: ו מטר

בדיקת השפעת ריכוזים שונים של סובסטרט על קצב הריאקציה של האנזים טריפסין. ניסוי ו': על הפעילות האינזימטית של האינזיםPABA (p-amino benzamidine)בדיקת השפעת מעכב תחרותי - ניסוי ז':

תו והקינטיקה שלו.וליטריפסין, קביעת אופי פע

שיטת עבודה:

מערכות. כל מערכת, שהכילה שתי מבחנות ריאקציה5 מבחנות שחולקו ל 15במהלך הניסוי הוכנו ניסוי ו': ) שהוכנסה אליה ריכוזים משתנים בטווחBAPNAומבחנת ביקורת, נבדלה מאחרת בריכוז תמיסת הסובסטרט (

).2ml(. כמו כן, לכל המבחנות הוכנס נפח זהה של בופר טריס ml 0.1בכמות של 10-3M*2.0 ל 10-2M*1שבין הוספנו לכל30°C דקות - הושמו באמבט מים בטמפרטורה 5לאחר שהמבחנות עברו פראינקובציה למשך

דקות - זמן15מבחנות הריאקציה כמות זהה של האינזים טריפסין, והמבחנות הושמו שוב באמבט למשך אינקובציה.

בנפח זהה לכל המבחנות. לאחר סיום האינקובציה, לשם30%הריאקציה הופסקה על ידי הוספת חומצת חומץ לשם קבלת תמיסותVortexת ה"בלנק". לאחר מכן, עורבבו כל המבחנות ב והשוואת נפחים, הוסף אנזים למבחנ

.nm 410הומוגניות ובוצעה קריאה של התמיסות בספקטרופוטומטריה באורך גל של

י, שהינו מעכב תחרותPABAהכנת הניסוי ומהלכו זהים לניסוי ו'; בניסוי זה נבדקה השפעתו של המעכב ניסוי ז': של טריפסין, על הפעילות האנזימטית ולשם כך, בתמיסת בופר הטריס שהוכנסה לכל מערכת הומס המעכב

הנבדק.

למטרת הבטחה כי לפני התחלת הפעילות 30°C = הכנסת המבחנות לאמבט מים בטמפרטורה של פראינקובציההאינזימטית, כל מרכיבי המערכת יהיו בטמפרטורה אחידה ואופטימאלית.

= זמן הריאקציה. מרגע הוספת הסובסטרט למבחנות הריאקציה ועד להפסקת התגובות ע"י הוספתאינקובציהחומצת חומץ. המבחנות הוכנסו לאמבט המים על מנת לספק לאנזים תנאים אופטימאליים לפעילותו.

= מכילה את כל מרכיבי הריאקציה, אך מבלי שתתרחש בה תגובה. סדר הכנסת החומרים שונהמבחנת ה"בלנק" ממבחנות הריאקציה אך מוודאים כי הנפח הסופי של כל המערכות הנבדקות יהיה שווה. שתי מטרות אלו מושגות,

כאמור, ע"י הוספת החומרים בזמנים שונים.

4

תוצאות:

: )ניסוי ו'( : השפעת ריכוז הסובסטרט על מהירות הראקציה, ללא נוכחות מעכב במערכת 1 טבלה מספר

מס'מבחנ

ה

ריכוז סובסטרט

מקורי [M]

ריכוזסובסטרט

סופי[M]

צפיפותאופטיתOD410

nm

ממוצע צפיפות

אופטית - מבחנותריאקציהOD410 nm

ממוצע צפיפות

אופטית לאחר הפחתת מבחנת

ΔOD4ביקורת

10 nm

פעילותאינזימטית

V0

[µmol/min]-1[µmol/min]

[M-1]

12.0*10-36.452*10-5

0.231

0.22150.21450.005792172.666815500.00 20.212

30.007-4

3.3*10-31.065*10-40.3790.378

0.3720.01004499.561939393.94 50.377

60.006

75.0*10-31.613*10-4

0.5530.542

0.5360.01447269.098956200.00 80.531

90.006-10

6.6*10-32.129*10-40.6630.6525

0.64250.01734857.645194696.97 110.642

120.01-13

1.0*10-23.226*10-40.9720.9795

0.96650.02609638.32078

3100.00 140.987

150.013-

: מהירות הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטרט ללא נוכחות מעכב במערכת: 1 גרף מספר

y =57 .318 x + 0 .100

R 2 = 0 .8999000.0

500.0

010.0

510.0

020.0

520.0

030.0

00+E0.0 50-E0.5 40-E0.1 40-E5.1 40-E0.2 40-E5.2 40-E0.3 40-E5.3

5

)M ריכוז טריפסין (

ת טי

מנזי

אית

לועי

פV

0(n

im/l

omμ)

חישובים:

:(V 0 פעילות אינזימטית ) . 1

חישוב הפעילות האינזימטית יעשה על פי הנוסחה:

הפרמטרים:

. ערכי הצפיפות האופטית שנמדדו עבור ממוצע תמיסות נבדקות ותמיסת הביקורת הפרש:

הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת.:

מקדם הבליעה המולרי של התוצר. של : ערכו

אינקובציה = משך זמן הריאקציה, החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט) במגע.:

)ממוצע לאחר הפחתת ביקורת(: 1-3 חישוב עבור מבחנות מספר

: )ניסוי ז'( : השפעת ריכוז הסובסטרט על מהירות הראקציה בנוכחות מעכב במערכת 2 טבלה מספר

מס'מבחנ

ה

ריכוז סובסטרט

מקורי [M]

ריכוזסובסטרט

סופי[M]

צפיפותאופטיתOD410

nm

ממוצע צפיפות

אופטית - מבחנותריאקציהOD410 nm

ממוצע צפיפות אופטית לאחר

הפחתת מבחנת

ΔODביקורת 410 nm

פעילותאינזימטית

V0

[µmol/min]-1[µmol/min]

[M-1]

12.0*10-36.452*10-5

0.1040.0990.0992.7*10-3370.37115500.00 20.105

30.004-4

3.3*10-31.065*10-40.1790.149

0.1494.064*10-3246.0859393.94 50.183

60.005-7

5.0*10-31.613*10-40.2710.246

0.2466.709*10-3149.0526200.00 80.264

90.006-10

6.6*10-32.129*10-40.5150.385

0.3831.045*10-295.7354696.97 110.336

120.007

131.0*10-23.226*10-4

0.5070.5240.5181.413*10-270.7853100.00 140.512

150.011-

6

: מהירות הריאקציה כפונקציה של ריכוז הסובסטרט בנוכחות מעכב במערכת: 2 גרף מספר

y =54 .430 x -0 .5000

R 2 = 0 .1899000.0

200.0

400.0

600.0

800.0

010.0

210.0

410.0

610.0

00+E0.0 50-E0.5 40-E0.1 40-E5.1 40-E0.2 40-E5.2 40-E0.3 40-E5.3

10-12* החסרנו את מבחנות

חישובים:

:(V 0 פעילות אינזימטית ) . 1

חישוב הפעילות האינזימטית יעשה על פי הנוסחה:

הפרמטרים:

.ערכי הבליעה שנמדדו עבור תמיסה הביקורת ותמיסה נבדקת הפרש:

הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת.:

מקדם הבליעה המולרי של התוצר. של : ערכו

אינקובציה = משך זמן הריאקציה, החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט) במגע.:

)ממוצע לאחר הפחתת ביקורת(: 1-3 חישוב עבור מבחנות מספר

7

)M ריכוז טריפסין (

ת טי

מנזי

אית

לועי

פV

0(n

im/l

omμ)

: סופי )מחושב באופן זהה עבור שני הניסויים( ריכוז סובסטרט . 2

0.1 ml .נפח הסובסטרט במערכת הריאקציה :3.1 ml 0.5: נפח מערכת הראקציה שהשתתף בתגובה. (לא לוקחים בחשבון את ה ml(של חומצת החומץ

נחשב את הנפח החדש של הסובסטרט על פי המשוואה:

של ריכוזי הסובסטרט המקוריים.31כלומר, במערכת נעשה מיהול פי

על מנת למצוא את הריכוז הסופי של הסובסטרט נשתמש המשוואה:

: 1-3 לדוגמא, חישוב עבור מבחנות

: ריכוז מקורי של סובסטרט.10-3*2.0

נציב במשוואה:

ית רציפרוקל קצב הראקציה: י : רציפרוקל ריכוז הסובסטרט כפונקצ 3 רף ג

y = 0 .5010 x + 9 .7741

R 2 = 0 .7899

y = 0 .3420 x + 1 .2053

R 2 = 0 .6299

0

05

001

051

002

052

003

053

004

0 0052 0005 0057 00001 00521 00051 00571

ללא נוכחות מעכב

עם נוכחות המעכב

נשתמש במשוואות קווי הרגרסייה שהתקבלו.Km וVmax על מנת לחשב את ערכי הפרמטרים

של המערכת בעוד שנקודת ), מהווה את y = 0, כאשר הפעילות היא אפס (x נקודת החיתוך עם ציר ה

החיתוך עם ציר

של המערכת.), מהווה את ה x = 0, כלומר כאשר הריכוז הוא אפס (yה

8

S

1[M 1-]

A Lineweaver-Burk plot

)ללא מעכב(: עבור ניסוי ו'.משוואת קו הרגרסייה שהתקבלה הינה:

ונקבל: x = 0 נציב

ונקבל: y= 0 נציב

ז' )עם מעכב(: עבור ניסוי .משוואת קו הרגרסייה שהתקבלה הינה:

ונקבל: x = 0 נציב

ונקבל: y= 0 נציב

. מספר מולים של אינזים טריפסין במערכות הריאקציה:3

ET: סך האינזים במערכת הריאקציה: טריפסין

ml 1: נפח של אינזים במערכות הריאקציה

g = 100 μg 10-6*100 כמות (מסה) של אינזים במערכות הריאקציה :

MW :דלטון.24000 (מסה מולרית) של טריפסין

חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה:

9

:K 2 . קבוע קטליטי - 4

אשר הינם, כאמור, נקודות החיתוך של הגרף עם הצירים. מתוכם ו- התקבלו הערכים 3מגרף

.Vmax ו Kmחושבו הערכים על מנת למצוא את הקבוע הקטליטי של מערכות הניסוי, בנוכחות וללא נוכחות מעכב, נשתמש במשוואה

הקושרת בין הקבוע הקטליטי, סך האינזים במערכת הראקציה והפעילות האינזימטית.

הפרמטרים:

ET: סך האינזים במערכת הריאקציהK2 קבוע קטליטי של פירוק קומפלקס :ES) לתוצר P (

:60, עלינו לחלק את הערך המתקבל ב sec-1) בעל יחידות של K2כיוון שהקבוע הקטליטי (

נציב:

)ללא מעכב(: עבור ניסוי ו'

הפעילות האינזימטית שחושבה:

נציב במשוואה:

: 60 ולכן נחלק ב sec-1 הינן K2כאמור, יחידות

ז' )עם מעכב(: עבור ניסוי

הפעילות האינזימטית שחושבה:

10

נציב במשוואה:

: 60 ולכן נחלק ב sec-1 הינן K2כאמור, יחידות

)קבוע אינאקטיבציה(:K I . חישוב של 5על מנת למצוא את ערכו של קבוע זה, נשתמש במשוואה:

הפרמטרים:

Km': Km) בנוכחות מעכב PABA.(

:Km Km.(ללא נוכחות מעכב) אמיתי

KI.קבוע אינאקטיבציה :

[I].ריכוז סופי של מעכב במערכת הריאקציה :

: הסופי של המעכב )מחושב עבור ניסוי ז'( ריכוז תחילה נחשב את ה

2.0 ml 10-4*0.5בופר ההתחלתי שנלקח, המכיל : נפח M של PABA.3.1 ml 0.5: נפח מערכת הראקציה שהשתתף בתגובה. (לא לוקחים בחשבון את ה ml(של חומצת החומץ

על פי המשוואה: מעכבנחשב את הנפח החדש של ה

המקוריים.מעכב של ריכוזי ה1.55כלומר, במערכת נעשה מיהול פי

נשתמש המשוואה: מעכבעל מנת למצוא את הריכוז הסופי של ה

נציב:

כאמור, על מנת למצוא את ערכו של קבוע זה, נשתמש במשוואה:

נציב ערכים:Km' =

Km =

[I] = 3.226*10-5 M

11

דיון ומסקנות:

גרף של פעילות אינזימטית כפונקציה של ריכוז הסובסטרט הינו גרף מיכאליס מנטן. לפי גרף זה, ככל שמעלים את ריכוז הסובסטרט, כך גדלה הפעילות האינזימטית עד לשלב מסויים בו מגיעה המערכת למהירות מקסימלית

על מנת שנוכל להגיע לערך זה,.Vmaxלפרמטר הקינטי - העקום ישאף לאסימפטוטההנשארת קבועה. בשלב זה היות ודבר זה לא התאפשר במעבדה כיוון שמסיסות הסובסטרטעלינו לעבור בריכוז עודף של סובסטרט אולם

בו הצבנו את הערכים Lineweaver-Burk איתו עבדנו הינה נמוכה, חישבנו והסקנו את מסקנותינו על סמך גרף

. ו -

Vmax:הינו ערך קבוע אליו מגיעה מהירות הריאקציה כאשר שומרים על ריכוז קבוע של אינזים ומעלים את ריכוז הסובסטרט.

העלאה נוספת של ריכוז הסובסטרט לא תשנה את ערך זה. ערך זה נמדד במצב רוויה, כלומר, כאשר כל ועל כן, כאמור, תוספת סובסטרט לא תשפיע. ערך זהESמולקולות האינזים תפוסות ליצירת קומפלקס

מאפיין את הפעילות המתרחשת באתר הקטליטי.

Km: זהו ערך קבוע בכל מערכת, המבטא את האפיניות בין האינזים לסובסטרט כאשר K2 << K-1ערך זה מאפיין . את הפעילות המתרחשת באתר הקושר.

בניסויים אלו נבדקה השפעתו של מעכב על הפעילות האינזימטית. מערכות הריאקציה שהוכנו בניסויים אלו, היו . PABAזהות לגמרי מלבד העובדה כי בניסוי ז' הוסף למערכות המעכב

בנוכחות מעכב, כלומר, ירידהKmעל סמך התוצאות והחישובים שהתקבלו, בהם נצפתה עלייה בערכו של שהתקבלו (Vmaxבאפיניות, ניתן להסיק כי מדובר במעכב תחרותי הפיך. למרות שמסקנה זו לא תואמת את ערכי ה

Vmaxבנוכחות מעכב עלה ולא נשאר קבוע כמצופה) עדיין ניתן לזהות בוודאות מעכב זה כתחרותי הפיך. כמו כן, לא מתבטאת בעלייה. Kmידוע על מעכב אחר (הפיך או בלתי הפיך) אשר השפעתו על

, עם וללא נוכחות מעכב, למרות שציפינו כי יהיה זהים. ההבדל נובעVmaxבניסוי שלנו התקבלו ערכים שונים עבור משגיאות אפשריות כגון:

. תנאי טמפרטורה שונים בין המערכות.12 .pH.שונה למרות שימוש בבופר זהה . חוסר דיוק במדידות: זמנים, נפחים.3.. שגיאות מכשירים (ספקטרופוטומטר, פיפטות)4. ניקיון ואיכותם של החומרים בהם השתמשנו (אינזים, מעכב, בופר)5

12

K-1

K2K1

K2, או הקבוע הקטליטי turnover numberהינו מושג המכמת פעילות קטיליטית, דהיינו חישוב מספר מולים של תוצר הנוצרים על ידי מול אינזים במשך שנייה אחת.

, גם כן השתנה, וזאת בניגוד לציפיותינו. , אותו חישבנו מתוך המשוואה:K2ערך

K2בנוכחות מעכב צריך להיות דומה לזה שמתקבל ללא נוכחות מעכב משום שVmax בשני המצבים אינו אמור להשתנות אולם כיוון שלא כך קרה, הרי שניתן לההתייחס לסטייה זו כנגררת.

. sec -1 0.611 הינו K2הערך הסיפרותי של

נחשב אחוזי שגיאה עבור שני הניסויים:

ניסוי ז' )בנוכחות מעכב(ניסוי ו' )ללא נוכחות מעכב(K2 = 0.434 שהתקבל sec-1K2 = 2.963 שהתקבל sec-1

מקנה גבוההמהטמפרטורה (טמפרטורה והרי הפעילות האינזימטית מושפעת K2 ל Vmaxכיוון שקיימת תלות בין דבר המביא למספר גדול יותר של מפגשים "פוריים" ומכאן ליצירת יותר,לאנזים אנרגיה קינטית גבוהה יותר

,קומפלקסים בכל פרק זמן) בהן שנצפה לקבל הינו גדול מהערך הסיפרותי וזאת כאמור מהבדלי הטמפרטורותK2הרי שניתן לומר כי ערך

נמדדו. כפי שניתן לראות מחישוב אחוזי השגיאה, קיים הבדל בין הנתון הסיפרותי לבין הערכים שהתקבלו, ובעיקר בניסוי

ז'. 15°), הרי שהערך הסיפרותי נמדד בטמפרטורה של pH = 8-8.5 דומה ( pH יש לציין כי למרות שהניסויים בוצעו ב

C 30° בעוד שאנו ביצענו את הניסוי בטמפרטורה שלCאומנם תוצאה זו עלולה להוביל להבדל מסויים, אך אין . .Vmaxלהשליך מכך על ההבדל העצום שהתקבל עבור ניסוי ז' אלא לקחת בחשבון, כאמור, טעות נגררת מערכי ה

KIהינו קבוע הדיסוציאציה של קומפלקס אינזים-מעכב המייצג את האפיניות בין האנזים למעכב.ערך זה ניתן תוך שימוש במשוואה:Kmלחישוב לאחר קבלת ערך

המבטא את הזיקה בין'Km גדול יותר, כלומר, ככל שהזיקה בין האינזים למעכב קטנה יותר, KIניתן לומר כי ככל ש האינזים לסובסטרט בנוכחות מעכב יהיה ערך גדול יותר, ולהיפך. וזאת כמובן כיוון שמדובר על מעכב תחרותי

הפיך.

13

נחשב אחוז שגיאה:

KI :10-6*2.198 שחושב M

KI:10-6*8.25 סיפרותי M

שוב התקבל הבדל משמעותי בין הערך הספרותי לערך שחושב. הסיבות להבדל זה הינן אותן הסיבות המשוערות לגבי שאר הערכים שחושבו. יש לזכור כי לסטיות הנגררות לאורך החישובים משקל גדול יותר ככל שמתבססים על יותר ערכים מחושבים מתוך התוצאות שקיבלנו. כמו כן, יש לזכור כי הערך הסיפרותי חושב עבור טמפרטורה של

15°C 30° ואנו ביצענו את הניסוי בטמפרטורה שלC.

14

- ניסוי ח' 3 ניסוי מטרת הניסוי:

א. בדיקת הספציפיות של טריפסין וכמוטריפסין לגבי סובסטרט ומעכבים בלתי הפיכים. ב. השוואה בין האינזימים על סמך רגישותם לסובסטרטים ולמעכבים שלהם.

ג. בדיקת הערכים, בהתאם למבנה האינזימים.

שיטת עבודה:

מבחנות הוכנס הסובסטרט10 מערכות על פי מטרות הניסוי. ל 2 מבחנות; המבחנות חולקו ל 24בניסוי זה הוכנו BAPNA) 0.1ml 10 בריכוז של mM ול (המבחנות האחרות הוכנס הסובסטרט 10 ATPNA ) 0.5ml בריכוז של

1.25 mM.מבחנות נוספות הוכנסה 2 ל ). סובסטרטים אלו הינם ספציפיים לטריפסין ולכימוטריפסין בהתאמה HCl BAPNAעם

מבחנות אלו הוכנו על מנת לבדוק האם ישATPNA. 4ו BAPNA הנותרות הוכנס אתנול עם2 ול ATPNAו לממסים, הן של האניזימים והן של המעכבים, השפעה כלשהי על כמות הריאקציה המתרחשת.

: בדיקת ספציפיות סובסטרט לאנזים א. ) שהכילו את האינזימים, אליהן הוספו שני הסובסטרטים (בכל מבחנה, אינזים13-16 ו 1-4הוכנו מבחנות (מבחנות

אחד וסובסטרט אחד) ונבדקה התקדמות הריאקציה על סמך תוצאות צפיפות אופטית שנמדדו (בליעה האופיינית לתוצרי הפרוק של הקומפלקס).410nmבספקטרופוטומטריה באורך גל

(ממס שלHClעל מנת להבטיח תוצאות מדוייקות ככל האפשר, הוכנו מבחנות ביקורת: מבחנות עם סובסטרטים ו אינזימים) ומבחנות עם סובסטרט, אינזימים ואתאנול (ממס של מעכבים).

:בדיקת ספציפיות מעקב לאנזים ב. אשר הינו ספציפי לטריפסין TLCKכל אחד מהאינזימים נבדק בנוכחות שני סוגי מעכבים (בנפרד, כמובן); המעכב

).התקדמות הריאקציה נבדקה על פי עוצמת22-19 ו 7-10 אשר הינו ספציפי לכמוטריפסין (מבחנות TPCKו (בליעה האופיינית לתוצרי הפרוק של410nmהבליעה (צפיפות אופטית) בספקטרופוטומטר באורך גל של

הסובסטרטים).

יש לציין כי: אופטימלי לראקציית האינזימים. כמו כן, כל pH) על מנת לשמור על pH =8בכל המבחנות הושם בופר טריס (

מבחנות זהות, וזאת בכדי לקבל תוצאות מדוייקות ככל האפשר. על2אחד מהניסויים בוצע פעמיים, כלומר הוכנו מנת להבטיח זאת, הנתונים שהתקבלו חושבו כממוצעים.

על מנת להביא30°C דקות בטמפרטורה של 15את מרכיבי מערכת ללא הסובסטרט שמנו לפרהאינקובציה למשך את המערכות לטמפרטורה אחידה, רצויה ואופטימלית.

דקות15לאחר פרההאינקובציה, הוכנסו הסובסטרטים למבחנות הרצווית והמערכות הוכנסו שוב לאמבט המים ל לשם הפסקת הריאקציות. לאחריה, נבדקו0.5ml 30%של אינקובציה. בשלב הבא הוספה חומצת חומץ

התמיסות בספקטרופוטומטריה.

תוצאות:

: ריכוזי וכמויות החומרים במערכות הריאקציה: 3 טבלה מספר

כמותריכוזהחומרבופר טריס

.08 pH=0.14 Mבטווח שבין

1.2 - 1.7μg/ml(1.0 ml (60כימוטריפסין

μg/ml(1.0 ml (25טריפסיןBAPNA)10 mM(0.1 mlBTPNA)1.25 mM(0.1 mlTLCK0.02 M0.1 mlTPCK0.02 M0.1 mlHCl0.002 M1.0 ml

15

ml 0.1-אתאנול

ריכוז תוצאות הניסוי: : 4 טבלה מספר

מס'מבחנ

ה

/HClמעכבסובסטרטאנזיםאתאנול

צפיפותאופטיתOD410 nm

ממוצע צפיפות אופטית - מבחנות

ריאקציהOD410 nm

תגובה צפויה

1--BAPNAטריפסין

0.4580.4535+20.449

3--BAPNAכימוטריפסין

0.0060.006-

40.006

5-BAPNA-HCl

0.0070.007-

60.007

7-BAPNATLCKטריפסין

0.0130.012-

80.011

9-BAPNATPCKטריפסין

0.4990.5005+

100.502

11אתאנול-BAPNAטריפסין

0.5020.4945+

120.487

13--ATPNAטריפסין

0.0080.008-

140.008

15--ATPNAכימוטריפסין

0.3780.377+160.376

17-ATPNA-HCl

0.0140.0175-

180.021

19-ATPNATLCKכימוטריפסין

0.3330.327+

200.321

21-ATPNATPCKכימוטריפסין

0.0250.025-

220.025

23אתאנול-ATPNAכימוטריפסין

0.331

0.3255+

240.32

חישובים:

חישוב הפעילות הספציפית : . 1על מנת לחשב את הפעילות הספציפית של כל אנזים נשתמש במשוואה הבאה:

הפרמטרים:.תו נבדקות הביקורת ותמיסותערכי הבליעה שנמדדו עבור תמיס הפרש:

הנפח הכללי של כל מערכת נבדקת.:

מקדם הבליעה המולרי של התוצר. של : ערכו

אינקובציה = משך זמן הריאקציה, החל מהרגע בו הובאו שני החומרים (אנזים וסובסטרט) במגעמשך זמן ה: =)15 min(

.mg = כמות האנזים ביחידות של

16

: עבור טריפסין .א - 1

מסת האנזים -O.D410 = 0.565) - 1,2 בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות

O.D410 = 0.0195) - 5,6בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות

עבור כימוטריפסין: . ב - 1

מסת האנזים -O.D410 = 0.03145) - 15,16 בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות

= O.D410 0.0160) - 17,18בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות

:K 2 חישוב הקבוע הקטליטי . 2

הקבוע הקטליטי מתאר את שלב הפירוק של הקומפלקס אינזים-סובסטרט לתוצר סופי. היות ולשני האנזימים עבורK2משקל מולקולרי זהה ניתן להתייחס לפעילות הספציפית של שניהם. בנוסף לכך, היות ואנו מחשבים את

.V0 אלא במהירות הרלוונטית למבחנה הנבדקת. נסמנה Vmaxמבחנה אחת, הרי שלא נוכל להשתמש ב

של כל אנזים, נשתמש במשוואה הבאה:K2על מנת לחשב את ערכו של

הערות:, פעילות אינזימטית, הרי שעלינו לעבוד עם מולים.V0 נובע מ K2מכיוון שחישוב *.60, עלינו לחלק את הערך המתקבל ב sec-1) בעל יחידות של K2מכיוון שהקבוע הקטליטי ( *

17

5545.0 = D.OΔ 014

5892.0 = D.OΔ 014

: TLCK עבור טריפסין עם .א - 2

מסת האנזים -Mw (מסה מולרית) -דלטון24000

: חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה:

O.D410 = 0.0265) - 7,8בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות

O.D410 = 0.0195) - 5,6בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות

: TPCK עבור כימוטריפסין עם . ב - 2

מסת האנזים -Mw(מסה מולרית) - דלטון24000

חישוב מספר המולים של האינזים במערכות הריאקציה ייעשה על ידי שימוש במשוואה:

O.D410 = 0.0375) - 21,22בליעה ממוצעת במבחנות עם המעכב (מבחנות

= O.D410 0.0160) - 17,18בליעה ממוצעת במבחנות הביקורת (מבחנות

18

5120.0 = D.OΔ 014

700.0 = D.OΔ 014

: . חישוב % עיכוב3

- מתייחס לבליעה שהתקבלה במבחנה ללא מעכב שהכילה אתאנול.100%X.מתייחס לבליעה המתקבלת במבחנה עם מעכב לאחר החסרת מבחנת ביקורת -

: TLCK + עבור טריפסין .א - 30.2795) - 11,12 (ממוצע בליעה במבחנות 100%

X 0.007) - 7,8 - (ממוצע בליעה במבחנות

: T P CK + עבור טריפסין .א - 30.2795) - 11,12 (ממוצע בליעה במבחנות 100%

X0.4905) - 10 ,9 - (ממוצע בליעה במבחנות

: TPCK + טריפסין כימו עבור . ג- 30.0275) - 23,24 (ממוצע בליעה במבחנות 100%

X 0.0375) - 22 ,21 - (ממוצע בליעה במבחנות

: TLCK + טריפסין כימו עבור . ד- 30.0275) - 24 ,23 (ממוצע בליעה במבחנות 100%

X0.227) - 19,20 - (ממוצע בליעה במבחנות

דיון ומסקנות

: ריכוז חישובים: 5 טבלה

19

כימוטריפסיןטריפסיןS.Aפעילות ספציפית-

K2קבוע קטליטי -

%97.521.8 עיכוב עם מעכב ספציפי%75.5725 עיכוב עם מעכב לא ספציפי

: סיכום הממצאים: 6 טבלה מספר

תוצאות + מסקנותמטרת הניסוימבחנהמדידת התאמת סובסטרט לאנזים2,1

.BAPNAטריפסין + סובסטרט התרחשה תגובה;

BAPNA .הינו הסובסטרט הספציפי לטריפסין מדידת התאמת סובסטרט לאנזים3,4

BAPNAכימוטריפסין + לא נצפתה תגובה;

BAPNAאינו סובסטרט ספציפי לכימוטריפסין . על כמות התוצר HClבדיקת השפעת 5,6

)HCl(הינו הממס של האינזימים לא נצפתה תגובה;

HCl.אינו משפיע על קבלת תוצר מדידת פעילות טריפסין בנוכחות מעכב בלתי7,8

הפיך ספציפי לטריפסין + בדיקת ספציפיות המעכב.

לא נצפתה תגובה;TLCKהינו מעכב ספציפי של הטריפסין. זהו

מעכב בלתי הפיך. מדידת פעילות הטריפסין בנוכחות מעכב בלתי9,10

הפיך ספציפי + בדיקת ספציפיות המעכב.

התרחשה תגובה; אינו מעכב של הטריפסין TPCKה

בדיקת השפעת אתאנול על כמות התוצר 11,12(אתאנול הינו הממס של המעכבים).

התרחשה תגובה;אתאנול אינו משפיע על קבלת תוצר.

בדיקת התאמת אנזים טריפסין לסובסטרט13,14BTPNA.

לא התרחשה תגובה;BAPNA.אינו סובסטרט ספציפי לטריפסין

בדיקת התאמת אנזים כימוטריפסין לסובסטרט15,16BTPNA.

התרחשה תגובה; BTPNA.הינו סובסטרט ספציפי לכימוטריפסין

על כמות התוצר HClבדיקת השפעת 17,18)HCl(הינו הממס של האינזימים

לא נצפתה תגובה;HCl.אינו משפיע על קבלת תוצר

מדידת פעילות כמוטריפסין בנוכחות מעכב19,20בלתי הפיך ספציפי + בדיקת התאמת המעכב.

התרחשה תגובה; אינו ספציפי לכימוטריפסין ולכן אינוTLCKה

משפיע. מדידת פעילות האנזים בנוכחות מעכב בלתי21,22

הפיך ספציפי+ בדיקת ספציפיות המעכב.

לא נצפתה תגובה; הינו מעכב ספציפי של כימוטריפסין.TPCKה

בדיקת השפעת אתאנול על כמות התוצר 23,24(אתאנול הינו הממס של המעכבים).

לא התרחשה תגובה; אתאנול אינו משפיע על קבלת תוצר.(*)

, הספציפי לוATPNA לא התרחשה תגובה דבר שנוגד את הציפיות היות והכימוטריפסין הושם עם הסובסטרט *ולא היה אף מעכב במערכת (אתאנול אינו משפיע על קבלת התוצר).

20

בניסוי זה נבדקו שני האינזימים הפרוטאוליטים - טריפסין וכימוטריפסין. דומה אך הם הינם בעלי ספציפיות שונה הנגרמת כתוצאהמבנה ראשוני ומרחביכאמור, לשני אינזימים אלו

מהמצאותן של חומצות אמינו שונות בתחתיתו של האתר הקושר ("הכיס ההידרופובי"). בין החומצה האספרטית, בעלת המטען השלילי, לבין סובסטרטיוניותמאינטרקציות הקשירה נובעת בטריפסין

כתוצאההידרופובית אינטראקציה הינהה מוטריפסיןיכ בעוד שבטעון חיובית עליו מצויות חומצות אמינו בסיסיות,מהמפגש בין הסרין, חסרת המטען, לבין הטבעת הבנזנית של הסובסטרט.

מזו שבכימוטריפסין ועל כןחזקה יותריש לזכור כי האינטראקציה היונית, המתרחשת בטריפסין הינה נמוך בהשוואה לאלו של הכימוטריפסין.Kmהסובסטרטים הספציפיים של הטריפסין בעלי

מצוייהATPNA מכיל בתוכו את חומצת האמינו ארגנין שהיא בעלת מטען חיובי, בעוד שב BAPNAהסובסטרט שהיא לא פולרית ובעלת טבעת בנזנית. חומצת האמינו טירוזין,

כאמור, ייחודיות זו מושתת על מבנה האתר הקושר. על כן, בהסתמך על עובדה זו ועל תוצאות הניסוי ניתן לומר כיאכן

הינו הסובסטרט הספציפי לטריפסין (נוצר קשר בין החומצה אספרטית בעלת המטען השלילי לביןBAPNAה הינו הספציפי לכימוטריפסין (נוצר קשר בין הסרין חסרת המטעןATPNAהארגנין בעלת המטען החיובי) ואילו ה

לבין הטבעת הבנזנית של טירוזין הלא פולרית). למעכבובהתאמתו במבנה המרחבי והרכבו של האתר הקושר גם כן ספציפיות המעכבים לאנזימים השונים תלויה

יש מבנה מרחבי דומה לחלק TPCK(לחלק ממנו) ואילו ל BAPNA לדומה הבנה מרחבי בעל מ TLCK .ספציפיה. ATPNAמה

על כן, מתוך ספציפיות אינזים-סובסטרט, ניתן להשליך על ספציפיותם של מעכבים אלו; לטריפסין ולכימוטריפסין בהתאמה.

) באתר הפעיל של האינזימים,Hist 57מעכבים אלו הינם בלתי הפיכים וזאת כתוצאה מאלקילציה של היסטדין (דבר המביא ליצירת קשר קוולנטי בלתי הפיך בין המעכב לאינזים.

ם החלק שפונה לאתר הקטליטי שונה מזה של הסובסטרט ולכן לא תהיה תגובהינהני המעכבים בש* יש לציין כי .אנזימתית

מבחינה קינטית, פעילותו הספציפית של כימוטריפסין גבוהה יותר מזו של הטריפסין וזאת מכיוון שהקשר היוני חזק , של כימוטריפסין שהתקבל בחישובים גבוה יותרK2יותר מהאינטראקציה הידרופובית. אולם, הקבוע הקטליטי,

מזה של טריפסין כלומר יותר מולקולות סובסטרט הופכות לתוצר בעזרת כימוטריפסין מאשר בטריפסין, בפרק זמן זהה. קביעה זו נוגדת את מה שהיה אמור לקרות ועל כן ניתן להסיק כי קיימות בניסוי שגיאות רבות, אשר השפיעו

על התוצאות באופן דרסטי.

על סמך תוצאות הבליעה ניתן לקבוע ספציפיות אינזים-מעכב ואינזים-סובסטרט אולם על סמך חישובי אחוזי הינו אכן המעכב הספציפי של הטריפסין. לעומת זאת כתוצאה משגיאות ניסוי,BAPNAהעיכוב ניתן רק לקבוע כי

אותן נפרט בהמשך, התקבלו תוצאות הפוכות בקשר לכימוטריפסין - אחוז העיכוב גבוה יותר כאשר המעכב איננוספציפי.

היתה23-24יש לציין כי כל הסטיות והתוצאות ההפוכות שקיבלנו נובעות כנראה מעצם העובדה כי במבחנות אמורה להתרחש תגובה, דבר שלא קרה וכאמור השפיע על כל החישובים.

השגיאות האפשריות בניסוי:א. שגיאות מדידה של מבצעות הניסוי.

ב. סטיות של המכשירים בהם השתמשנו. ג. ניקיון ואיכותם של החומרים בהם השתמשנו: בחומרים ישנים, לא נקיים, ריכוזים לא מדוייקים וכדומה (למשל:

הבופר לא קבוע).pH שמר על

תנאי טמפרטורה שונים בין המערכות.ד.

21