סיכום הרצאות קורס

"הנדסה גנטית"

205-1-9191

ר אורי עבדו"ד

אורי גבעוני

ע"תש

.מבוא ואינזימי ריסטרקציה – 4.3.10

כל הקשור לאתיקה של הנדסה גנטית נכנס תחת נושא של אתיקה . הקורס מבוסס על הבסיס של ההנדסה הגנטית

כולם מעוגנים , ם אישורים מגורמים שונים בממשלהגנטית והרבה מאוד נושאים של מניפולציות גנטיות דורשי

.בחוק וישנם כללים מסויימים של מה מותר ומה אסור ואיך יש לשמור מפניי פגיעה בסביבה

המטרה הסופית הינה שינוי גנטי שמוביל , הנדסה גנטית היא מניפולציה או שינוי גנים בתהליך הגדרהב

. לאורגניזם ששונה גנטית מהמקור

גילו כי . הכלי הבסיסי והכח המניע בהנדסה גנטית. התחלה מאנזימי ריסטרקציה – {לא צריך למבחן} היסטוריה

והוא שנתן את DNAאנזים ריסטרקציה יכול לחתוך . DNAכ בחיידקים ישנם אנזימים היודעים לחתוך "בדר

DNAלהעביר י שיטות הנדסה גנטית "שנתיים לאחר מכן הצליחו ע. DNAהאפשרות לבצע מניפולציה על ה

י "פיתחו נוגדנים ע 1975ב. העבירו גן מאדם לחיידקים והביאו אותו לידיי ביטוי, מאורגניזם אחד לאורגינזם שני

המערכת האימונית , י חשיפה של האורגניזם לגוף זר"עי(. כ ביונקים"בדר)מניפולציה של המערכת האימונית

מסוגל לזהות סוג יחיד -ינאלנוגדנים מונוקלויכולת ליצור פיתוח ה. מפתחת נוגדנים שיודעים לזהות את הגוף הזר

.באופן ספיציפי DNAזוהי יכולת לפתח נוגדן שיכול לזהות חלבון או . נוגדן אחד שמזהה אפטיפוט אחד, של רצף

נרשם הפטנט . בעל חיים בעל מניפולציה על הגנום-טרנסגניבעל חיים , יצירת החיה המהונדסת הראשונה – 1981

.שבוצע על בקטריה שיכולה לפרק שמן ביעילות רבההראשון

חלק מהמניפולציה ליצור חיה או , בכמויות גדולות DNAשמאפשרת להגביר מקטע של PCRהמצאת ה-1983

.צמח טרנסגני

אפשרות אחת של יצירת חיסון היא החדרת חלבון מסויים לחיה אשר תפתח נוגדנים . חיסון רקומביננטי – 1986

יצירת ; אפשרות חדשה שנוצרה היא חיסון רקומביננטי. קיחת הנוגדנים ושימוש בהם לחיה אחרתל, כנגד החלבון

ח לייצר חיסון שלא "למשל ניתן לגרום לבע, י מניפלציות על חיידקים"חיסון רקומביננטי נוצר ע. חיסון במעבדה

. שלו DNAנמצא באופן טבעי ב

למשל וירוס מסוגל להדביק , מת מה שהטבע באמת יצרלעיתים השיטות שאנו משתמשים בהן פחות יעילות לעו

כל כלי , לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות משלה. 100%ואילו בהנדסה גנטית לא ניתן להגיע להדבקה של 100%ב

.בעל ייעוד משלו ובעל המאפיינים שלו

ר על הכלאות בין שני זנים לא מדוב, ביצוע מניפולציה לעגבנייה, פיתוח עגבניה בעלת עמידות לוירוס מסויים 1987

.שונים של עגבניות וביצוע סלקציה

.פרסום המיפוי הראשון כאשר עד היום ישנם שינויים 2002התחלת מיפוי הגנום הראשון וב 1990

ישנן הרבה מאוד מחלות . יצירת דולי, פרט אשר דומה באופן מושלם לפרט ממנו הונדס clonedיצירת 1997

שנלקח מהפרט המקורי עבר הרבה מאוד מודיפקציות בעת התבגרותו DNAכיוון שהל מ"ובעיות עם השיטה הנ

הפרט אשר נוצר הינו זהה לחלוטין לפרט הבוגר מבחינה גנטית אולם אינו בריא . והוא אינו מתאים לשלב העוברי

.במהלך ההתפתחות DNAוישנם הרבה פרטים שיש להבינם למשל מה קורה ל

. הגנטיתעד כה ההיסטוריה של ההנדסה

חשוב למדע הבסיסי של תפקודי חלבונים ורמת האורגניזם השלם , שאנו מפתחים לשימושנו האישיכלים

. בהנדסה גנטית ישנו שימוש רב באנזימים. הבנת תהליכים בסיסיים המתרחשים באורגניזם השלם, המתפתח

הם לברור את האנזים הטוב ביותר יצירת אלפי אנזימים ומ, ניתן להגיע למצב בו אנו יוצרים אבולוציה במבחנה

שלהם DNAהינם אורגניזמים בעלי מניפולציה על ה אורגניזמים טרנסגנים. לשם המטרה אותה אנו מחפשים

מציאת מוטציות , דיאגנוזה רפואית גם כן משתמשת בהנדסה גנטית לשם זיהוי מחלות. לשם מטרה מסויימת

.ברמה המדעית וברמה המדינית

ביצוע מניפולציה על , מחיה DNAאו לקיחת ' והכנסתו לחיה ב' מחיה א DNAלקיחת -תחיה טרנסגנייצירת

ניתן לגרום למחלה , למשל גן מסויים שמבוטא יתר על המידה גורם למחלה. והחדרתו חזרה לאותה חיה DNAה

DNAי החדרת "י ביטוי מוגבר של חלבון בחיה שאליה הנבדקת ע"זו בחיה מסויימת שלא מבטאת את המחלה ע

.חיצוני

.שיפור גן ברמת הגן כך שהתועלת שלו תהיה יותר גדולה ושונה – מניפולציה על גן

.להביא לכך שחלבון מסויים יתבטא בצורה מסויימת באופן מוגבר או מופחת - מניפולציה על הגנום

:הצעדים העיקריים שיש לבצע בהנדסה גנטית

ביצוע מניפולציה על . חר הזיהוי בידוד הגן והוצאתו החוצהלא. זיהוי איזה גן מקדד לאיזה חלבון, DNAזיהוי

מעגלי DNAהתקבלה חתיכת . חיצוני וישרוד בו DNAח כ"שמוכנס לבע DNAחלק של -וקטורלהכנסתו . הגן

הוקטור הינו כלי שמאפשר להכניס את . ח"ח ויבוא לידיי ביטוי בבע"מסוגל לשרוד בבע, סגור חוץ כרומוזומלי

. הכנסת הוקטור לבעל חיים לשם קבלת תוצר. אנו בוחריםלבעל חיים ש DNAה

ישנו צורך בהרבה מאוד עותקים של הגן כדי שניתן יהיה לזהות את בעל החיים שמבטא את הגן ולשם כך יש

ישנו צורך ביכולת לשלוט על הכמויות של ביטוי הגן מכיוון שיכול להיות מצב בו כמות גדולה . שימוש בסלקציה

חזרה ולמעשה לקבל כל בעל DNAלאחר שקיבלנו את התוצר ניתן למצות את ה. ה לבעל החייםמדי תהיה רעיל

למשל לקיחת . לכל מטרה בהנדסה גנטית יש את המארח שלה אם אורגניזם אנימלי או צמחי. חיים טרנסגני

DNA חתיכת ה, של חיידק והחדרתו לשמריםDNA תאפשר לזהות את השמר אשר קיבל את הDNA ובנוסף

החיידקי ולהחדיר אותו DNAניתן לבצע מניפולציות על ה. כחלק ממשהו של השמר DNAמר מזהה את ההש

המקורי שלו DNAלהחדיר לחיידק אחריי העלמת ה, החדש לאחר המניפולוציות DNAלהפיק את ה, לשמר

.מהונדס לחלוטין DNAוקבלת חיידק מהונדס גנטית עם

.DNAעד עכשיו הם אנזימים בעלי יכולות לבצע מניפולציה על ה הכלים הראשונים שהתפתחו ומלווים אותנו

אם . הקשר הפוספודיאסטרי, כל אנזים בעל יכולת לחתוך את הקשר בין נוקלואוטידים-אנזימי ריסטרקציה

אנזימים אלו התגלו כחלק ממנגנון . אקסונוקליאזאם חותך בקצוות בלבד נקרא , אנדונוקליאז-חותך באמצע

כיום ידועים . נקראים גם אנזימי הגבלה מכיוון שמגבילים את הוירוס מלהתרבות, כנגד וירוסיםהגנה של החיידק

, מהם בעלי תכונות ייחודיות שניתן להשתמש בהם בהנדסה גנטית 250ו DNAאנזימים בעלי יכולת לחתוך 3000

שקיימים בטבע אנו לוקחים כלים. י הנדסה גנטית"אנזימים אלו פותחו לאורך האבולוציה ולא פותחו ע

מבצעים וגם DNAחתוך אנזימי ריסטרקציה הינם קומפלקס חלבונים שיכולים ל. ומשתשמים בהם למטרנו אנו

י אנזים "מתילציה גורמת לכך שהמקטע לא ייחתך ע. הוספת קבוצת מתיל על המקטע-DNAמתילציה של ה

תפקיד אזימים אלו לחתוך . מיפני DNAחיצוני ומה DNAמה -דבר זה חשוב לשם זיהוי עצמי, ריסטרקציה

DNA על מנת שהמערכת תעבוד האנזים צריך לזהות רצף מסויים . חיצוני שלא עבר מתילציה מתוך הגנה עצמית

בנוסף ישנו אנזים בעל יכולת לבצע מתילציה באותו אזור בו , בעת שהאנזים מזהה הוא מבקע את הרצף, DNAב

עצמי ובכך ימנע DNAאנזים מתילציה יסמן רצפים של , צמיהאנזים ריסטרקציה יחתוך ובכך מונע חיתוך ע

מבצע מתילאז. מספיק נוקלואוטיד אחד בעל מתילציה לשם מניעת חיתוך. מאנזים ריסטרקציה חיתוך עצמי

בחלק הראשון : י הניסוי הבא"את ההוכחה לכך הראו ע. מבצע חיתוך ecoR1, הבקטריאלי DNAמתילציה על ה

לא כל )מתקבל כי החיידק בעל עמידות מסויימת , מסויים' ם והדביקו עם בקטריופאגמזן מסויי E-coliלקחו

ים שכן 'בסיבוב השני לוקחים בקטריופג, בסיבוב הראשון יש יעילות נמוכה(. ים הדביקו את כל החיידקים'הפאג

– EOP=1הדבקה 100%הצליחו להדביק ומדביקים תרבית חדשה של חיידקים מאותו זן ומתקבל

ים מהסיבוב 'בחלק השני של הניסוי לקחו את הבקטריופאג. ים רכשו תכונה ליכולת הדבקה מלאה'ריופאגהבקט

בסיבוב הראשון מתקבלת , E-coliהשני ומדביקים איתם זן אחר של

אם לוקחים . 100%הדבקה חלקית ולאחר מכן בסיבוב השני גם כן

E-coliים מהחלק השני מהסיבוב השני ומדביקים חיידי 'בקטריופאג

המסקנה היא כי . כבר מהתחלה 100%מהזן הראשון יש הדבקה של

ואחריי ' לחיידקים אלו יש אנזימי ריסטרקציה כנגד הבקטריופאג

-ים רכשו תכונות כנגד אנזימים אלו'ההדבקה הראשונה הבקטריופאג

מערכת ההגנה של החיידק . שלהם עבר מתילציה DNAזאת אומרת ה

נחתך בתוך ( DNA)שלא ממותל ' יופאגלכן בקטר-י מתילציה"היא ע

אולם אלה שכן הצליחו להדביק בעלי מתילציה ולכן , החיידק ולא שורד

בעל שני אנזימי E-coliבחלק השני . בסיבוב השני אין יכולת הגנה כלל

.ריסטרקציה ולכן מצליחים בסיבוב הראשון לשרוד

מזהים אזור מסויים , לבצע ריסטרקציה ומתילציהבעלי יכולת -1קבוצה :ארבע קבוצות של אנזימי ריסטרקציה

שני חלבונים שונים כאשר כל -2קבוצה . להנדסה גנטית אנזימים אלו לא עוזרים, במרחק מהזיהוי KB1וחותכים

כלי בעל , חותך במקום בו הוא מזהה, אחד מבצע מתילציה והשני מבצע ריסטרקציה; אחד בעל פעילות שונה

שני אנזימים -4קבוצה . האנזים חותך קרוב לאתר הזיהוי, שני חלבונים שונים-3צה קבו. שימוש להנדסה גנטית

ממקום הזיהוי גם כן לא טוב BP20כ' 3או ' 5סימטרי וחותך מאחד הצדדים -מזהים אתר מסויים א, שונים

שמבצעים מכיוון 2בהנדסה גנטית אנו עובדים בעיקר עם קבוצה . כל אנזים מזהה רצפים שונים. להנדסה גנטית

בנוסף מכיוון שהאנזים חותך באתר הזיהוי הוא נח מאוד . חיתוכים גנומים ואין שימוש במתילזות כי בהן צורך

.לעבודה כך שניתן לדעת בדיוק היכן החיתוך התבצע

אנזימי ריסטריקציה. אחד בעל ריסטרקציה והשני מתילציה, הינם אנזימים בעלי שני חלבונים שונים 2קבוצה

פולינדרום הינו רצף שאם ייקרא ,פולינדרום, ומזהים רצף ספציפי סימטרי DNAנים שרצים על גביי ההם חלבו

בעת הזיהוי . נוקלואוטידים 4-8הרצף יכול להיות בגודל של , מימין לשמאל או משמאל לימין יתקבל אותו הדבר

יכולים . מגנזיום לשם פעילותם לרוב דורשים. לכל אנזים ייחודיות חיתוך משלו, האנזים חותך במקום של הרצף

overhangאו 'overhang 3שיכול להיות sticky endאו , חיתוך ישר-blunt בלאנט: להיות שלושה תוצרי חיתוך

-חותכים אותו באמצע ויוצרים מעין תמונת מראה-הסימטריה של אתרים פולינדרומים נמצא באמצע שלהם. '5

ישנם אנזימי ריסטרקציה אשר אין הם . להיות המשלימים אחד לשניהנוקלואוטיד משני צדי הסימטריה צריכים

מזהים אתר פולינדרי בהכרח אלא מזהים רצף נוקלואוטידים מרווח נוקלואוטידים מסויים ורצף נוסף והוא

לרוב לא בשימוש כי לא ניתן לחבר בין שני מקטעים שונים שנחתכו עקב אנזים שמזהה -מזהה אותם כאתר חיתוך

.פולינדרומיםרצפים לא

מרביתם מזהים וחותכים , באופן ספיציפי DNAישנם מאות אינזימי ריסטרקציה שחותכים את ה :לסיכום

אנזים , שאנו עובדים איתו DNAרצף הי ידיעת "ע, לרוב החיתוכים הם סטיקי. רצפים פולינדרומים

. בצע מניפולציות ברמות שונותניתן ל וכיצד הוא חותך הרצף אותו הוא חותך, שאיתו אנו עובדים הריסטרקציה

י יכולת "ע. לרוב אנזימי ריסטרקציה הם דימרים כך שדימר אחד חותך גדיל אחד והשני חותך את הגדיל השני

אקסונוקלאזות הינם . ל"למקום הנ DNAהזיהוי של החיתוך ותוצריו ניתן לבצע איחויים שונים ולהחדיר

ישנם כאלו הספיציפיים . DNAאנדונוקליאזות החותכים בתוך וישנם ( '5או ' 3)בקצה DNAאנזימים החותכים

סטיקי ' 3, תוצר חיתוך בלנט הוא תוצר בעל קצוות קטומים. וכאלו לא ספיציפיים( לרוב פולינדרום)לרצף מסויים

אינזימי הריסטרקציה יוצרים את . '5סטיקי הינו האזור החד גדילי בקצה ה' 5ואילו ה' 3בעל הקצה החד גדילי ב

.לשם החיבור יש לדאוג ליצירת קצוות מתאימים, וות בעזרתם ניתן לחבר מקטעים שוניםהקצ

יש לדאוג כי אין אתר חיתוך של האנזים בו אנו , למקטע קיים DNAאם רוצים להכניס מקטע :כלל יסוד

.משתשמים במקטע אליו מחדירים אחרת נקבל שני חיתוכים

Rזן , ecoR1 ,eco-E-coliלמשל . קטריה ממנה זיהו את האנזיםהשמות של אינזימי הריסטרקציה נובעים מהב}

{.כי הינו הראשון שנמצא 1ו

4הכלל אצבע הינו כי אנזים בעל רצף זיהוי של . אם אנו רוצים לחתוך גנום שלם ניתן להשתמש בכלים שונים

יסים יופיע רצף בס 1/256לחיתוך זאת אומרת 0.25*0.25*0.25*0.25נוקלואוטודים יהיה בעל הסתברות של

5לחיתוכים יותר גדולים יש לקחת אנזים ריסטרקציה בעל זיהוי של DNAאם נרצה לחתוך את ה. החיתוך

יש הבדל . הוא מספר הנוקלואטידים באתר החיתוך nכאשר n0.25זאת אומרת . וכן הלאה 1/1024בסיסים שנותן

.בסיסים 8בסיסים לבין הסיכוי למצוא אתר בעל 4משמעותי בין אתר של

BamHIלמשל , ניתן לבצע שימוש באנזימים שונים בעלי זיהוי של מרכז רצף זהה

ניתן ליצור מניפולציה . המרכז של הזיהוי שלהם זהה אבל הקצוות שונים, Bgl2ו

י כך ניתן "ע. אשר תביא לכך שיתקבל היבריד ששני אנזימי הריסטרקציה מזהים

. clonedלהתגבר על בעיות של

החברות . 'ריכוז מלחים קבוע וכו, ספציפית' טמפ, מסויים PHדורשים האנזימים

י הנדסה גנטית לגרום לאורגניזם לייצר "המייצרות את האנזימים יכולות לבטא את האנזים ישר מהבקטריה או ע

אנזים המגיע מחיידק מקורי עובד יותר טוב מאשר מאשר חלבון שמגיע . רקומביננט, הרבה מאוד חלבונים

למשל הטבלה . הגדרת פעילות האנזים, עד כמה האנזים שקיבלנו עובד טוב-Uלשם כך מגדירים . ביננטמרקומ

חשיבות הטבלה הינה לשם שילוב של אנזימי ריסטרציה שכל . מראה את היעילות של כל אנזים בבופרים שונים

זימים שונים חשוב מסויים עם שני אנ DNAאם אנו רוצים לחתוך , אחד מהם דורש בופר אחר לשם פעילותו

הטבלה אומרת כמה פעילות תהיה לאנזים בבופר מסויים וכך ניתן לתכנן את . לדעת מהו הבופר המתאים

בכל בופר של אנזים DNAניתן להשתמש בבופר טנגו או לחתוך את ה. הפעילות שלו בשילוב עם אנזים אחר

יחתכו באופן רנדומלי בגנום - אקטיביטי סטאר-לחלק מהאנזימים בתנאים לא אופטימליים פעילות כוכב. בנפרד

. חיתוכים בצורה לא ספציפית, באזורים לא ספיציפיים לפעילות שלהם

שני האנזימים . אנזימים המזהים את אותו הרצף אבל חותכים בצורות שונות-isoschizomers מרזאיזוסכיזו

עבודה בליגציה יש להתייחס מזהים את אותו האתר לחיתוך אבל מכיוון שחותכים בצורה שונה להמשך ה

. בהתאם

אוברהנד יוכל ' 5. מה שקובע את היכולת לעבור ליגציה בין שני מקטעים הינו הרצף אשר נמצא בקצה הסטיקי

ליגציה יכולה להתרחש רק בין שני אתרי חיתוך שהם מאותו . אוברהנד' 3אוברהנד בלבד ולא אל ' 5להתחבר אל

בנוסף חייב להיות כי הרצף באזור החד גדילי . 'P5-לבין ' OH3-בין חייב להיווצר קשר קוולנטי . הסוג

.ללא שני תנאים אלו לא תהיה ליגציה, קומפלמנטרי לרצף של האזור החד גדילי שאליו רוצים לחבר

אם אנזים ריסטרקציה מזהה את הרצף המדובר . מזהות רצף מסויים ומוסיפות אליו מתיל-כלליות מתילזות

לכן במעבדה בהתעסוק עם . ביצע את עובדתו על הרצף המדובר אין האנזים יוכל לחתוך אותווהאנזים מתילציה

חיידקים יש לראות עם איזה זנים אנו עובדים ואם אין לו מתילזות ספיציפיות כנגד אנזים ריסטרקציה מסויים

. שאנו עובדים איתו

.אנזימי מפתח נוספים ופלסמידים – 11.3.10

ברגע , DNAמשלים שברים של – ligase DNAליגאז DNA. של אנזימים בשימוש במעבדהת קבוצות נוספו[ 2]

יוצר קשרים פוספודיאסטרים .שיש שבר בקשר הפוספודיאסטרי בין שני נוקלואוטידים ליגאז מגיע ומשלים אותו

מגורמים שונים אותם שברים יכולים להגיע .ל בשביל לחבר ולעבוד"חייב את הקצוות הנ-OH' 3פוספט ל' 5בין

DNA. [3 ]הליגאז אחראי על השלמת גדילי ה. מתהליכים בתוך התא או תהליכים חיצוניים יכול להיות ,ומגוונים

אשר 4T' מהפאג ליגאז DNAו sticky endsאשר יודע לחבר רק E.-coliמ אנזים: שימוש במעבדהבאנזימים שני

יש שני סוגי ליגציות בהתאם לקצוות אותם הם . sticky endsו bluntויודע לחבר ATPדורש , הוא לרוב בשימוש

ה יותר מכיוון שיש רב בעלת יעילותדביקים קצוות ליגציה של. ליגציה של בלנט או ליגציה של סטיקי: מדביקים

לעומת , נשארים מחוברים לאורך זמןו את השני ויושבים אחד מול השנימנטריים שמשלימים אחד אזורים קומפל

מחובר הינו יותר נמוך מכיוון שאין לו ייצוב עצמי ולכן הסיכוי שליגאז יגיע בזמן bluntלתפוס זאת הסיכוי

אולם מצד שני אין .הליגאז ישלים אותו בפחות יעילות, יושב אחד מול השני כדי להשלים אותו יותר נמוך bluntש

ם יותר אופציות אבל מבחינת מכילי-בעיה לחבר שני קצוות שהם בלנט בלי קשר למה מכילים בקצוות שלהם

ככל -ריכוז :גורמים שונים המשפיעים על יעילות הליגציהישנם . אינזימטית קצוות סטיקי בעלי יעילות יותר גבוה

אבל מעלות 37 ליגאז היא פטימלית שלאו עבודה' טמפ ,שהריכוז יותר גבוה כך הליגציה תהיה יותר טובה

י "ע sticky endsכדי למנוע את הרס ה וזאת( החדר ומטה 'טמפ) יותר נמוכה' ים בטמפשמבמעבדה משת

ההיתוך שלהם ' יותר נמוכה כדי להחזיק את קצוות הסטיקי אחד מול השני מכיוון שטמפ' הטמפ .אנדונוקליאזות

' ככל שנוריד את הטמפ. גבוהות הם לא יישארו צמודים אחד לשני כמעט כלל' מאוד נמוכה זאת אומרת בטמפ

ניתן להוסיף חומר bluntלשם הגברת החיבור של [ 4. ]ילים שעומדים אחד מול השני יותר גבוההסיכוי לתפוס גד

PEG-מולקולות ה, סופח אליו מולקולת מים וכך הוא מעלה את הריכוז האפקטיביDNA יישארו בפחות מים

במקום ליגאז מבצע ריאקציה של השלמת פוספט DNA[ 5] .התמיסה תהפוך להיות יותר צמיגה, PEGעקב

ולחבר bluntבצורת DNAניתן לחתוך כל רצף של ה. blunt endsליגציה של תדוגמ OH. [6]הקצה שישנו

. החיבור שיתקבל לא חייב להיות דומה למקור, חיתוך של גדילים שוניםמ-החיבור יכול להיות היברידי, הםיבינ

יש sticky endsב. bluntיתוך הינו לא חייב להיות קומפלמנטרי מכיוון שהח DNAהחיתוך בין הפלסמיד וה

כ קצוות "הו האנזים שחותך ולראות איזה קצוות משאיר אחריו כדי להתאים אחילברור ולבחור היטב מ

. קומפלמנטרים

:אנזימי מודיפקציה נוספים[ 7]

– kinasesוקינאזות alkaline phosphtaseאלקליין פוספטס -

מסיר פוספט פוספטאז ייןהאלקל ,end '5 ים מניפלציות עלעמבצ

.'5על הקצה לעבודה משמשים שניהם, והקינאז מוסיף פוספט

[8] .אלא מבצעים באופן רנדומלי מסויימים האנזימים אינם ספיציפיים לקצוות

לאחר חיתוך עם , פלסמיד בעל רצף לקיחת: אלקליין פוספטאזבשימוש עיקרי

אולם אנו רוצים , חזרהאנזים ריסטרקציה הפלסמיד יכול להיסגר על עצמו

שיוריד את על הפלסמיד מפעילים אקליין פוספטאז. לתוכו DNAלהחדיר

גם , OHומתקבל פלסמיד שכל הקצוות הפתוחים שלו בעלי '5הפוספט מהקצוות

. חופשי עם פוספט' 5אם יהיה ליגאז בתמיסה הוא לא יידע לעבוד כי אין לו קצה

ולכן יוכל OH' 3פוספט ו' 5המכיל הרצוי DNAלאחר מכן ניתן להחדיר את ה

לאחר ההחדרה ישנם . פוספט' 5תיכנס לפלסמיד מכיוון שהיא בעל קצה DNAחתיכת ה-ליגאז בעזרתחבר התל

סגירה של יתה מתקבלתלא היינו מבצעים זאת היאם . ל החיידק יודע לסגור בעצמו"את הניקים הנ-שני ניקים

כך שיש .חדש פנימה DNAמאשר להחדיר מועדףת מצב זה יותר מבחינה אנרגתיהפלסמיד חזרה על עצמו כי

.אחיזה בשתי קצוות ולכן הוא מחזיק את עצמו בפנים עד ההחדרה

.השימוש בקינאז הינו לסימון רדיואקטיבי של גדיל בפוספט רדיואקטיבי

טרמינל טרנפרזד או בשמו היותר נחמ, deoxynucleootidyl transferaseדהאוקסינוקלאוטידיל טרנפרז -[ 9]

בהתאם למה שיש ' 3יכול להוסיף נוקלואוטידים בקצה ה

עקב הגבלה של הומופולימרניתן לקבל .בלי קשר לרצף בתמיסה

,מה שיש בתמיסה זה מה שהוא יוסיף-הנוקלואוטידים בתערובת

.'3יכול להוסיף לגדיל כפול או יחיד אבל רק בקצה ה

[10]- DNA פולימראזDNA polymerase מבצע פולימרזציה

הוא האנזים העיקרי שמבצע את 3פולימראז DNA. 1,2,3העיקריות והראשונות הינן הפולימרזות .DNAשל

פ "בגדיל המפגר מבצע זאת ע, (lagging)ובגדיל המפגר ( leading)גם בגדיל המוביל DNAהפולימרזציה של ה

מסלק , המפגר ומזהה את מקטעי אוקוזקי לל הגדירץ ע 1פולימראז DNA. מקטעי אוקוזקי ובמוביל באופן ישיר

proof readingממלא את החור בנוקלואוטידים ובעל יכולת של , פריימר שלהם ומשלים את הגדיל RNAאת ה

בעל , במעבדה ישנו שימוש בחלק מהאנזים, בעל כל התתי יחידות 1פולימרז DNAהמחשה של DNA. [11 ]ל

התת יחידה -klenowקלנו במעבדה עובדים בעיקר עם proof reading. [12]ומבצע ' 3ל' 5פעילות השלמה מ

במעבדה האנזים לא שלם ושומר על . מחסירים את היכולת של סילוק הפריימר, 1פולימראז DNAהגדולה של

יש לקלנו הינה השלמה שהפעילות [13]. '3ל' 5ללא אקסונוקלאז ' 5ל' 3אז מואקסונוקל' 3ל' 5יכולת פולימרציה

מצד שני, קלנו ישלים את הרצף 'over hangs 3 בקצוות ,ולכן ניתן בעזרתו להפוך קצוות שונים לבלנט '3ל' 5מ

ל מקטע קטןשימושו של אנזים זה הינו לסימון רדיואקטיביות ש. 'over hangs 5הקצה ב להחסיר את הוא יכול

פולימראז רגיל הוא DNAאם היה -םחור שישנו בגדיל מסויים הוא ימלא אותו בנוקלואוטידים רדיואקטיבי-קצר

רצף תבנהלריאקציה ש שימוש נוסף הוא. יווצר ניק שייסגר בתוך החיידק, היה מוציא ומחליף את המשך הגדיל

יכול להוסיף די דאוקסי י כך שהוא"ע DNAשימוש שלישי בקלנו הינו לשם ריצוף .מסויים DNAשל

.וקלואוטיד נוסףן להוסיף אחריו נלא ניתנוקלואטיד ש -נוקלואטיד

[14]- DNA אייזDNAase1 "את כל ה "אוכלDNA ,קוצץ את כל הDNA ,משמש להיפתר מDNA מסויים לשם

. מכיוון שהוא אנדונוקליאז ולכן חייב לחתוך באמצענוקלואוטידים שלשות ל DNAמפרק את ה ,ריאקציות שונות

כאשר קונים מהחברה אנזימים . פעילים DNAseלוודא כי אינם מכילים אם רוצים לעבוד עם אנזימים נקיים יש

. אייז אקטיביטי DNAיש לוודא שאין להם

מסנתז רוורס טרנסקריפטז, DNAעל טמפלייט של RNAמסנתז T7 RNA polymerase אנזימים נוספים[ 15]

DNA על טמפלייט שלDNA ,RNAse- חותך גדיליRNA ללא הבחנה ,RNAse H חותך היברידים שלDNA-

RNA י חיתוך ה"עRNA.

:פלסמידים ווקטורי שיבוט[ 16]

מטרת הוקטור להוות דרך להכפיל או לשלש את . חיצוני DNAשאליו מכניסים DNAחתיכה של -וקטור[ 17]

על יכולת וקטור צריך להיות ב קלונינג. cloning vectorקלונינג וקטור -החיצוני שהחדרנו פנימה DNAה

הוקטורים שונים אחד . הוקטורים שמשתמשים בהם מקורם בעיקר בחיידקים[ 18] .להישמר בתוך התא המארח

לכל וקטור יש .בגדלים שונים DNAשמחדירים איתם ומהווים פתרונות של הכנסת DNAמהשני בגודל ה

.נות טבעיות על מנת שישמש במעבדהלהחסיר תכו

. חוץ כרומוזומליים DNAמקטעי , kb15הינם קטנים והגודל של ההכנסה יכול להגיע עד - פלסמיד[ 18]

בעלי יעילות , התוצר הוא פלאקים kb 20-5מאשר לפלסמיד יותר גדולים DNA מקטעי ניתן להכניס - λ' פאג

. החדרה יותר גבוה מאשר פלסמידים

kb 25-45 .החסירו ממנו כמה דברים והעלו את יכולת ההחדרה' לקחו את המרכיב של הפאג – קוסמידים

.ים ולכן יתקבלו מושבות ולא פלאקים'יות אבל לא מכילים גנים פאג'כולות פאגמתבססים על י

.kb100-200אבל חסר יכולת הריגה של החיידק ומאפשר החדרה של ' מתבסס על רצף של פאג – פאק

.kb.150-300מקטעים מאוד גדולים של – באק

.ומוחדר לשמר בתוך וקטור kb300-1000 החדרה של – יאק

נמצאים במספר . יכולים להיות חד גדיליים, מעגליים םדו גדיליילרוב DNAמולקולת – דיםפלסמי[ 19]

באופן . הכרומוזומלי תוך שימוש באנזימים של המארח DNAהפלסמיד נמצא בצורה בלתי תלויה מה, בקטריות

בעלי .אים מסויימיםח בו נמצא אבל נותן לו יתרון מסויים על פניי פרטים אחרים בתנ"עקרוני לא חיוני לאותו בע

[20. ]מקטעים גדולים לא יוכלו להחזיק מעמד בתוך החיידק, המחדרים הקטנים ביותר ולכן גם הכי יציבים

, מתכות כבדות, מתן עמידות לחומרים שונים כגון אנטיביוטיקה (1) :תפקיד הפלסמידים מתחלק לשלוש

( 3) .יותיכולות מטבול (2) .הכרומוזומלי DNAהעמידות זו התפתחה בצורה בלתי תלויה מ', וכו' בקטריופאג

הפלסמידים מחולקים לכאלה המסוגלים [21] .ת שונות שקשורות לאורח חיי המארח כגון ייצור טוקסיניםויכול

לעתים יכול להעביר גם גנים , יכול לעבור מחיידק לחיידק Fסוג . לעבור מחיידק לחיידק או שלא מסוגלים לעבור

נותנים עמידות Rפלסמידי . כך שלא תהיה חלוקה זהה לחלוטין בין שני חיידקים, מידכרומוזומלים עם הפלס

נמצאים בחיידקים היכולים ליצור טוקסין הפוגעים בבקטריות colפלסמידי . בעלי יכולת מעבר, לחומרים שונים

. אחרות ושונות מהבקטריה שמייצרת את אותם טוקסינים

לסמיד במעבדה הוא חייב להיות בעל שלושת לשם עבודה עם פ. מבנה הפלסמיד[ 22]

יהיה בהתאם ORIה, בעל יכולת להכפיל את עצמו-ORIפלסמיד צריך להכיל : המאפיינים

כדי שיהיה ניתן לזהות את בעל תכונת סלקציה . לאורגניזם שאליו הפלסמיד מוחדר

. כי בלעדיו התא ימותהמרקר סלקציה יחייב את הפלסמיד להישאר בתא .החיידקים אשר קיבלו את הוקטור

מבלי לפגוע בפלסמיד DNAאזור בו יהיה ניתן להכניס את ה-multi cloning site MCSמולטי קלונינג סייט

multiחיצוני נכנס לתוך ה DNA(. שיופיע אך ורק בו פעם אחת)אזור זה צריך להכיל את רצף החיתוך ,עצמו

cloning site חייבת להיות שליטה על מספר הפלסמידים –פלסמיד תכונות נוספות של ה[ 23] .עם הוקטור (copy

number) לתא כי ישתמשו באנזימים של החיידק דול מדי עלולים להיות הרסנייםבחיידק כי אם יהיו במספר ג

של כל ORIה, יכול להיות מאוד גבוה או מאוד נמוך, מספר עותקים של הפלסמיד בתא .ולא יאפשרו לו לחיות

אם המטרה היא להפיק יחידות דנא ככל שמספר . מספר הפעמים שהוא ישתכפל בחיידקפלסמיד קובע את

פלסמידים בעלי מספר נמוך ישמשו לביטוי חלבונים . העותקים יותר גדול כך יתקבלו יותר עותקים של הפלסמיד

, איםבחלוקה חייב לעבור באופן שווה בשני הת plasmid partitioning, DNA תכונה נוספת[ 24] .רעילים

פלסמידים צריכים להיות בעלי אתרים מסויימים שיבטיחו , בחיידקים נצמד לדופן מסויים שממנו ייפרדו DNAה

חשוב ביותר כאשר מספר העותקים של פלסמיד .כי הפלסמידים יורשו באופן שווה לחיידקי הבת באופן החלוקה

קומפטבליטי תכונה של [ 25. ]תחלקו שווהבתא נמוך כי אז ייתכן כי כל הפלסמידים יילכו לאותו תא בת ולא י

שני . היכולת של כל פלסמיד לחיות עם פלסמיד אחר באותו חיידק הינה קומפטביליות, לעומת איקומפטבליטי

פלסמידים המסוגלים להתקיים יחדיו יהיו שייכים לקבוצה קומפטבליט אם אינם מסוגלים להתקיים יחדיו

לא יוכלו להיות יחדיו כי מערכות הבקרה וההכפלה יתחלקו ORIאותו פלסמידים בעלי .שייכים לאיקומפטבליט

על מנת לוודא ששני הפלסמידים שאנו מחדירים לחיידק באמת .בין שני הפלסמידים וכך לא יתחלקו כמו שצריך

על גביי ( פלסמידים)גדל את החיידקים שהוחדרו להם הוקטורים יש ל וששניהם יישארו בחיידק קומפטבילים

אם הבקטריה בעלת שני הוקטורים היא -גורם סלקציה אחד לכל פלסמיד)שני סוגי אנטיביוטיקה מכילמצא ה

מקבוצות שונות וכמו כן גם בעלי ORIשמוחדרים יהיו בעלי ( או יותר)יש לדאוג ששני הפלסמידים (. תשרוד

.מרקר סלקציה שונה

בעל גן ששולט על מספר ,ORI מכיל. ליןדות לפניצילין וטטרצקבעל עמי PBR322 –הפלסמיד הראשון [ 26]

ותך בעמידותי חיפוש רצף המופיע פעם אחת וח"מקום להחדרת גן חיצוני נמצא ע. ROP-העותקים

גורם צלחת עם לאחר החדרת הגן וגידול מושבות יש לקחת דוגמאות מהתרבית המקורית אל . לאנטיביוטיקה

.מי שישרוד קיבל את הוקטור, DNAהחדרנו את ה העמידות לאנטיביוטיקה שלתוכה-גורם סלקציה בהתאמה

פיתוח היכולת לזהות , גדלו מספר האנזימים שניתן לעבוד איתם, multi cloning siteהכיום ישנה הגדלה של [ 27]

של פלסמידים אשר עלולים להחשב ' יש אוכ-את הפרטים אשר צלחו את ההחדרה מעבר לעמידות לאנטיביוטיקה

את הזיהוי עושים בעזרת מערכת [ 28] .אולם למעשה לא מכילים את ההחדרה( מידיםע)כמכילים את ההחדרה

lacZ, שימוש בגןlacZ המקדד לאנזיםβ החומצות 146שימוש בפלסמידים בעלי רצף קידוד לה .גלקטוזידאז

ד אם נחדיר את הפלסמי. השימוש הוא בחיידקים בעלי החלק המשלים לאנזים. lacZאמינו הראשונות של הגן

כמו שהוא החיידק יוכל לסנתז בצורה מלאה את האנזים מכיוון שחלק מהגן מגיע מהפלסמיד והחלק השני

. כל חלק בנפרד לא פעיל ואילו יחדיו יכולים להשלים אחד את השני ולהביא את הגן לידיי ביטוי, מבוטא בחיידק

אשר הינו Xgalי "עוה רפרסור לגן ואשר הינו אנלוג ללקטוז ומהו IPTGי "במצב רגיל ביטוי של הגן ייראה ע

multi cloningאם מכניסים לתוך ה [29] .פירוקו נותן אינדיקטור כחול לפעילות האנזים, אנלוג ללקטוז גם כן

site נפגע ב את המחדרlacZ זאת אומרת אנו מונעים את ביטוי החלבון , הריסה של הגן-ונחלק אותו לשני חלקים

בנוסף (.לא יבטאו את הגן)לא יבטאו את הגן ולכן יהיו בצבע לבן ולא כחול חדרמכאן הבקטריות שקיבלו את המ

על מנת להוריד את . ל'פ הגודל בהרצה על ג"ע PCRניתן לבצע סלקציה של מושבות המכילות את המחדר בעזרת

חיתוכים אינזימטים על , PCRהרעש רקע של חיידקים שקיבלו את הפלסמיד אבל בלי המחדר יש שימוש ב

. אם יתקבל רצף דומה למחדר יש הצלחה-ריצוף יתבצע כמעט תמיד וקובעת את הרצף של הפלסמיד, DNAה

כמו הפלסמידים הקודמים אולם בעל יכולת לסנתז גדיל יחיד של bluescript: ואריינטים של פלסמידים[ 30]

DNA .שבעל יכולת לסנתז ' הוסיפו לו חלק מפאגDNA .ייב להיות על מנת שזה יבוצע החיידק חF+ כדי שיוכל

.לינארי DNAהפלסמידי המעגלי ל DNAאשר יעזור להפוך את ה 'חייב להיות מודבק בפאג(. תעלות)לייצר פילו

לכל דבר cloningהפלסמיד משמש כ[ 31. ]י החיידק לריצוף"פעם היה שימוש במבנה החד גדילי לינארי שנוצר ע

הפלסמיד מיועד לביטוי ולכן מחוייב להיות . white&blueציה של יכול לעבור סלק .ובעל יכולת ליצור חד גדיל

בעלי פרומוטורים . החדרת הגן עם הפלסמיד תביא לביטוי של החלבון המתורגם מהרצף המוחדר. בעל פרומוטור

פלסמיד יותר קטן אשר מעלה את הוא pGEM[ 32. ]יים אשר ניתן לשלוט בעזרתם על הביטוי של החלבון'פאג

ומאפשר lacZלרוב פוגע ב. בקלות PCRהפיכת הפלסמיד לכלי המאפשר שיבוט של תוצרי [33] .קהיכולת ההדב

.החדרה קלה יותר

ייחודי ומשלים חיתוך הפלסמיד באנזים ריסטרקציה, חיצונית DNAלקיחת חתיכת – cloningתהליך [ 34]

מחדר החדרת ה, multi cloning siteב מתבצעחיתוך ה לקצוות של המחדר

-החדרה חזרה לחיידקים, יצירת פלסמיד המכיל את המחדר-יצוע ליגציהוב

אנטיביוטיקה וקבלת החיידקים שקיבלו את מצע עם זריעה על, טרנפורמציה

ולהכניסו לוקטור DNAהמטרה היא לשבט מקטע .הפלסמיד עם ההחדרה

למטרות אחרות או להשתמש DNAמתוך כוונה לשכפל את ה( פלסמיד)

וי בעזרת אנזימי הרצ DNAממצים את מקטע ה. אחרותבפלסמד למטרות

לאחר מכן ניתן לחתוך את הפלסמיד בעזרת אנזימי , ריסטרקציה

על עצמם חוזריםאזורי החיתוך לא ) MCSהריסטרקציה תואמים בתוך

ריעתז, ההפלסמיד לבקטרי החדרת ,ליגאז DNAלתוך הפלסמיד בעזרת DNAהכנסת ה, (יותר מפעם אחת

, המכילים את הפלסמיד יגדלו על הצלחת החיידקיםסלקטיבי אשר ישמש לסלקציה ורק מצע הבקטריות על

הפיכת בקטריה לבקטריה היכולה . לאחר מכן נפיק את הפלסמיד חזרה על מנת להשתמש בו לשימושים השונים

(.לא יעיל אבל מספיק טוב)לקבל פלסמיד חיצוני

: שתי שיטות מקובלות .DNAעירעור הממברנה והחדרת ה .חיצוני לבקטריה DNAהחדרת -טרנספורמציה[ 35]

לבין המבנה DNAהפקת החיידקים בתוך מדיום המכיל סידן המבצע נוטרליזציה בין ה היט שוק-כימית

אשר פותחת את הממברנה חום ברגע שמבטלים את ההתנגדות נותנים מכת שוק, הממברנלי של החיידק

מחייב הפקה במדיום ללא מלחים רציהואלקטרופ-שוק חשמליי "עהשיטה השנייה היא . יםנכנס פלסמידיםוה

מבין .העברת פולס חשמלי בתמיסה וכך הפלסמיד יכול לחדור פנימה אל תוך החיידק .אחרת התאים יתפוצצו

אם ביצענו .אולם גם היט שווק מספקת שתי השיטות האלקטרופרציה יותר יעילה אבל דורשת מכשיר מיוחד

הוא גם ככה לא הכי יעיל וישנו סיכוי כי חלק מהפלסמידים לא סגורים כראוי ישנו שימוש תהליך ליגציה אשר

שימוש [ 36]. באלקטרופורציה על מנת לקבל פלסמידים סגורים ולהעלות את הסיכוי לקבלת חיידק מהונדס

אחר מכן ל, חודר DNAה חוםיצוני לא נדחה ולכן בעת מכת ההח DNAה ,בעת ביצוע היט שוק בקלציום כלוריד

נותנים לחיידקים לגדול במשך שעה ללא לחץ סלקציה במצע נוזלי כדי שאותם חיידקים שקיבלו את הפלסמיד

.ם זריעה על צלחת עם גורם סלקציהלאחר שעה מבצעי, יבטאו את האנטיביוטיקה על מנת שישרדו בעת הזריעה

לאחר סיום [ 38] .עם היונים באלקטרופורציה יש לשמור על מלח נמוך כדי לא לגרום לריאקציה[ 37]

ווידו כי החיידקים קיבלו את הפלסמיד , חיפוש המושבות שגדלו, ביצוע זריעה, הטרנספורמציה ומתן התאוששות

ים המכילים את כמעט תמיד יהיה רעש רקע של חיידקים המכילים פלסמיד סגור וחיידק. וגם את האינסרט

הכרומוזומלי לבין DNAהפרדה בין ה-אלקליין ליזיסב גידול במצע נוזלי ושימוש-DNAהפקת ה .האינסרט

חשיפת החיידקים לתמיסה . נשבר יותר בקלות, הכרומוזומלי הרבה יותר גדול ורגיש לשינויים DNAה. הפלסמיד

ברגע שישנה שבירה והשקעה (. SDS)הכרומוזומלי ופגיעה בחלבונים DNAגבוה אשר גורם לשבירה של ה PHב

השאריות המכילות את ולקיחת( כבד וגדול יותר)כל מה שאין בו צורך שוקע של התמיסה בצנטרפוגה

הוספת SDSלאחר חשיפת החיידקים ל. גבוה PHהרחפה בבופר , השקעה, בידוד – מיניפרפ [39] .הפלסמידים

וחלבונים DNAנורמלי אשר בו הפלסמיד נמצא בצורה שניתן להפיק אותו ושאר ה PHפוטסיום אצטט להחזרת ה

לרוב משתמשים .ישנן שיטות הפקה שונות של הפלסמידים[ 40] .בשיטות שונות DNAלאחר מכן הפקת . יםשוקע

.הכרומוזומלי DNAכרומוזמלי נעשה בעזרת שימוש באילוציה וקולונה שאוספת את ה DNAבשיטה שבה סילוק

.שיטות לסימון גנטי – 18.3.10

לדוגמא חקירה כמה . blottingל ובלוטינג 'י שימוש בג"עוחלבונים DNA ,RNAשיטות עיקריות לזיהוי [ 1]

הכנה , ל'הרצה על ג, חיתוכו במספר אנזימי ריסטרקציה, גנומי DNAלשם כך יש לקחת ? פעמים מופיע גן בגנום

ישנו צורך . סימונו בצורה מסויימת כך שכאשר יגיב עם הגדיל הקומפלמנטרי שלו הממברנה תידלק-מהגן פרוב

ניתן של הפרוב אל הגן יהיה בעת הידבקות. חלבון שאנו מחפשים/DNA/RNAו את חתיכת הכלים אשר יזהב

אם נסמן את כל , לאחר מכן העברת הדוגמא לממברנה, ל'בשלב ראשון הרצת הדוגמא על ג .לראות את ההדבקה

לוקחים פרוב אנו רוצים לזהות את הגן בסמיר לשם כך אנו , (מריחה)הגדיל באיטדיום ברומיד אנו נראה סמיר

חלבונים או , משלים DNAגדיל )הפרוב מזהה את המקביל לו על הממברנה . חיצוני ומגיבים אותו עם הממברנה

הפרוב צריך להיות מסומן רדיואקטיבית או פלורסנצית כך שלאחר הדבקה יהיה ניתן לזהות את , (נוגדנים

לבונים ברקמות מסויימות או מציאת שיטה זו משמשת בין היתר למציאת ח. ההדבקה ואת המיקום של הגן

RNA למציאת (. היכן מבוטא)ברקמהDNA שימוש בsouthern blot , מציאתRNA northern blot ומציאת

הפרדה של מולקולות טעונות בתוך שדה חשמלי -אלקטרופורזה שון ביצועשלב הראב western blot. [2]חלבונים

ט על מנת חלבונים צריכים טיפול בדטרגנ, עונים בצורה שליליתט RNAו DNA. ל'על בסיס קצב הנדידה שלהם בג

לרוב , לים שונים'יש סוגי ג[ 3] .ל'על בסיס הגודל ותלוי בצפיפות הג ההפרדה מתבצעת, לבטא מטען חשמלי עליהם

אשר הינו קצר DNAלהפרדת חלבונים ו פוליאקרילאמידאו RNAו DNAלהפרדת ל 'אגרוז גהשימוש הוא ב

ניםטעו RNAו DNAה, DNAו RNAמשמש להפרדת והינו פוליסכריד שמקורו באצה ל אגרוז'ג [4] .יותר צפוף

בהרצה[ 5] .ל'לכיוון הצד החיובי של הג צובאופן שלילי ולכן ירו

למטה ש יותר גבוה הם יותר גדולים ואלותקבלו יבנדים אשר

ניתן לשחק עם ריכוז האגרוז בהתאם לגודל . יותר קטנים

כל הוא יותר מרוכזהאגרוז ככל ש .ים לזהותשרוצהמקטעים

יותר צפוף ומפריד למולקולות יותר קטנות אבל עד לשלב

טית תוך סצנראובשיטה פלו DNAניתן לראות את ה. מסויים

בעת הכניסה הופך להיות , DNAקולות הלשימוש באיטדיום ברומיד אשר הינו מולקולה שיכולה להיכנס בין מו

.םרך גל מתאיטי בחשיפה לאונצסרואופל

[7 ]Southern blot-משמש לזיהוי ואנליזה של גן בDNA מתוך מכלול הDNA בתא .orthern blotN- משמש

( 2), ביצוע אלטרופורזה( 1) :שלבי עבודה. DNAהגלאי בשני המקרים הוא פרוב של .RNAבלזיהוי ואנליזה של גן

DNAמולקולות -ניתן להריץ מרקרים, ל אגרוז'הרצה על ג

שמורץ וכך ניתן לדעת את גודל DNAבמקביל ל דל ידועבגו

לאחר ההרצה צביעה באטידיום ( 3. )הנבדק DNAדגימת ה

הריאקציה לגילוי הגן מתבצעת על גביי ממברנה . ברומיד

העברה של מולקולות ( 4(. )בעלת תכונות להמשך העבודה)

לאחר שקיבלנו הפרדה לפי לממברנה( דף)מהאגרוז DNAה

בופר המכיל מלחים עובר -שיטת קפילריהב העברה. גודל

ללא . ל ומעביר אותו לממברנה'ל אוסף אתו את הג'דרך הג

לאחר ההעברה ( 5. )שדה חשמלי רק על בסיס תנועת נוזלים

לממברנה כי לאחר DNAיש לבצע קשירה ולוודא קשירת

לאחר ( 6. )לאחר המעבר המקובע על הממברנ DNAמכן כל העבודה היא בשטיפות וטלטול ולכן יש לוודא כי ה

נכונים תנאים ל יש לדאוג מכיוון שיש לוודא ספיציפיות .ביצוע שטיפה, הקיבוע ישנה חשיפה לפרוב לזמן מסויים

לאחר ההיברדזיציה ( 7. )קשירה ספיציפית וסילוק המולקולות הלא קשורות באופן ספציפי-של ההיברדידציה

: השלבים השונים של העבודה[ 9] .ההצמדה ולראות אתיבי ת את החומר הרדיואקטחשיפה לרנטגן כדי לזהו

פורשים את הגדיל כך שיעבור בצורה של כדי שהפרוב יוכל להיקשר DNA/RNAדנטורציה ל, ל'הפרדה על גביי ג

, הכנסה להבדרידזציה, ביצוע פיקסציה, העברה לממברנה. חד גדיל פרוש לממברנה והפרוב יוכל להיקשר אליו

.פהשטי, היברדזיציה

[10 ]RNA ל שמכיל פורמל אלדהיד וכך תוך כדי הריצה הוא עובר דנטורציה מבחינת המבנה השניוני'מורץ בג .

RNA צורך בתנאים מאוד מסויימים הינו מולקולה שמאוד קשה לעבוד איתה ומתפרקת מאוד בקלות ולכן ישנו

ל 'לעומתו מורץ בג DNA. ף הראשוניל נטורטיבי מתוך מטרה שיהיה לפרוב קל לזהות את הרצ'מורץ בג ולכן

חושפים לתנאים חומציים אשר גורמים לסילוק קבוצת הפירוז . ל'אגרוז בלבד ואת הדנטורציה מבצעים על הג

ביצוע דה פולריזציה בחתיכות קטנות (. הכרחי)ולאחר מכן חשיפה לתנאים בסיסיים לשם דנטורציה ( לא הכרחי)

על מנת להקל DNAלעיתים בנוסף יש שבירה של ה, (הפרדת שני הגדילים)גרימת דנטורציה . בצורה של חד גדיל

ממברנת ניילון אשר , ההעברה לממברנלאחר מכן [ 11] .נורמלי לשם העברה לפרוב PHהחזרה ל. את ההעברה

י בלוטיניג "נעשה ע המעבר לממברנה, חד גדילי DNAקשור תטעונה כך ש

בתוך המיכל שמים . עד לגובה מסוייםקיים מיכל אשר בו יש נוזל [ 12] .ונימיות

, את הבופר עם מלחים גבוהים ועליו שמים נייר סופג אשר ברוחב הממברנה

, ל ואת ממברנת הניילון מעל שלוש ניירות סופגים ונייר טואלט'עליו את הג

עובר DNAיש תנועה פנימית מהבופר לכיוון היבש המוביל לכך שה. זכוכית

לאחר המעבר יש לקבע את המולקולה [ 13] .מהל לממברנה עצ'דיסטרציה מהג

אשר מבצע קרוס לינק בין הממברנה UVבעבר היו מחממים וכיום יש חשיפה ל. לממברנה

לאחר המעבר לממברנה והקיבוע ביצוע [14] .לממברנה DNAיצירת קשרים קוולנטים בין ה, DNAל

לרוב , (חסימה של הממברנה)ברנה עצמה חשיפת הממברנה כך שהפרוב לא ייקשר על גביי הממ-פרההיברדיזציה

לא תגיב עם -ממברנה אינרטיתמתקבלת . שימוש בגן מסלמון אשר מגיב עם כל הממברנה והוא נקשר לממברנה

DNAלא ספיציפי כך שהפרוב ייקשר רק ל DNAחסימת הממברנה ב. הפרוב כי קשורה עם הגן של הסלומון

ביצוע דנטורציה , דו גדילי DNAסימון -לאחר מכן היברדיזציה. שלב חשוב אחרת יתקבל רעש רקע. קומפלמנטרי

. DNAעל הפרוב כדי שידבק ל

לקיחת פריימר קצר -random primingרנדום פריימר היא שיטה אחת : באופן רדיו אקטיבי DNAסימון [ 15]

קלנו אשר יסנתז הפריימר הרנדומלי יידבק ולאחר מכן לקיחת . DNAאשר יכול להידבק באופן רנדומלי על גביי ה

DNAיתקבל . את המשך הגדיל כאשר במדיום יש נוקלואוטידים שחלקם מסומנים רדיואקטיבית בפוספט שלהם

שלם DNAלא לוקחים . חלק מהנוקלואוטידים מסומנים רדיוקאקטיבית, רדיואקטיבית תמסומן באופן רנדומלי

שחלק מהנוקלואוטידים שלו Aב גן קבלת פרו. מהמקור אלא מקטע קטן מהגן המשלים אותו אנו מחפשים

סימון נוקלואוטידים באופן . שימוש בנוקלואוטיד מסומן, PCR בעזרת שיטה נוספת הינה [17] .מסומנים

מעט מאוד מסומנים מכיוון שלא רוצים לסמן את הפרוב . רנדומלי בפוספט רדיואקטיבי המחוברים אל הפריימר

ואז מרבית התוצרים PCRת אם רוצים לסמן יותר יש להשתמש ביש סימון פעם אח, רנדום סייקלב. יותר מדי

יבצע השלמה בקצה ולכן , לא סימון חזק מדי, שימוש בקלנושיטה נוספת היא [ 18] .יהיו מסומנים רדיואקטיבית

הופך את המקטע לבלנט תוך כדי השלמה עם נוקלואוטידים .יכול להכניס נוקלואוטידים רדיואקטיבים בקצוות

וקינאז פוספט '5פוספטאז מוריד מה. י קינאז ופוספטאז"שיטה נוספת ע-אוליגונוקלואוטידים[ 19. ]יםרדיואקטיב

כי הקינז מכניס את γבעמדת ןמסומ ATPוללא קבוצת פוספט ותגובה עם קינז לקיחת מקטע . '5ל מוסיף פוספט

לא ניתן לסמן פרובים. αת עמדעד כה שהיו מסומנים ב הנוקלואוטידים ששימשו לעומת, לגדיל ATPהפוספט מ

הכנסה , ביצוע מודיפקציה לנוקלואוטידים לשייר אשר לא משפיע על הנוקלואוטידים-בסימון רדיואקטיבי

לא מסומן רדיואקטיבית וניתן להכניס נוגדן המזהה את dNTPsלריאקציה ומתקבלות מולקלות שחלק מה

.השייר

השיטה בה ,מבצעים היברדזציה לגן לאחר קבלת הפרוב[ 20]

אם : מבצעים את ההיברדיזציה תלויה בשאלה ובכוונה של המחקר

מבצעים , שהורץ לגן 100%את הגן שזהה כמעט ב רוצים למצוא

גבוה בנוכחות ' טמפ)היברדיזציה שתתן עדיפות לדימיון גבוה

לא ספיציפית תסולק כאשר כל קשירה( חומרים דנטורטיבים

באורגניזם אחר זאת אומרת שנמצא Aרוצים למצוא גן אם . החוצה

ההיברדיזציה דימיון אבל אנו מחפשים דימיון מסויים 100%באין

תתבצע עם תנאים אשר יאפשרו לו להתחבר עם מולקולות אחרות

ניתן לזהות גנים באופן ספציפי וגנים לא עם . 100%דומות אבל לא ב

,שונות' לשם כך יש לבצע את העבודה בטמפ [21] .ספיציפיות מלאה

כי הפרוב קיבל תנאים יגם לאחר הווידו[ 22] .'וכו טיביבנוכחות חומר נטור, שונה GCריכוז , ריכוז מלחים שונה

אופטימליים יש לבצע שטיפה שחשובה לשם מניעת תגובה לא ספיציפית או לשם חיזוק תגובות לא ספיציפיות

כוז המלח תשתפר האינטרקציה בין הגדיל אם מעלים את רי. סילוק הפרוב והוספת בופרים חדשים(. תלוי מחקר)

אם רוצים להיפטר מאי . אם ישנה אי התאמה יגרום לשמירה על קשירה לא מושלמת, DNAהכפול של ה

יותר גבוה תגרום ' טמפ. שהייתה לפניי כן' כל השטיפות הינן בטמפ, סימלריות תהיה שטיפה במלחים נמוכים

בוהים יחזקו את מלחים ג, להפרדה של פרובים לא קומפלמנטרים

משמאל הרצה של . southern blotדוגמא ל[ 23] .האינטקרציה בין הגדילים

על מנת לדעת את המשקל המולקולרי של הגן ניתן . נה מצד ימיןרל והממב'הג

את גבולות אם נסמן . ל עם מרקר אשר מסומנים בקצה'להריץ את הג

חשיפת .יםניתן לראות את המשקלים המלוקולר ל'גהממברנה ונחזור ל

הממברנה לפילם רגיש רדיואקטיבי ומכיוון שהפרוב הוא רדיואקטיבי הוא יראה לנו היכן הוא נדבק וניתן לכמת

.את כמות הגלאי שנדבק

מבצע דנטורציה של החלבונים , טעון באופן שלילי SDS[25], לים של חלבונים'ג[ 24]

ממסך את . על פי גודללהפריד ושניוני של החלבונים המבנה ה את על מנת לשבור

המטען של החלבון אותו הוא עוטף ולכן גורם לחלבון להיות בעל מטען שלילי וגורם

הטענה של , ל פוליאקריל אמיד'הטענת החלבונים על ג [26] .לריצה לכיוון החיובי

זיהוי חלבון מתוך קומפלקס - SDS page. [27 ]Wesrern blotהחלבונים ב

הרצה על :השלבים [28] .באמצעות נוגדנים חלבון אחד אנו רוצים לזהות, חלבונים

י "חסימת הממברנה לקשרים לא ספיציפיים לממברנה ע, העברה לממברנה, ל'הג

לאחר מכן תגובה עם הפרוב אשר מהווה נוגדן ראשוני , שימוש בחלבון מסויים

שטיפה בתנאים בהם כל קשירה לא ספיציפית תרד , (מזהה את החלבון הרצוי בלבד)

הנוגדן השניוני הינו – השניוני קשר לנוגדןישימוש בנוגדן ש(. לרוב בנוכחות ריאגנט)

מולקולות -נוגדנים [29] .צנטית ובחשיפה תהיה זהירה של הצימודסראואנזים אשר יכול לבצע ריאקציה פלו

כ "ת בדראנטיגן יכול להיו. אנטיגנים-חלבון המיוצרות ביונקים כחלק מהמערכת האימונית כתגובה לפולשים

. אזור בחלבון שהנוגדן יזהה וייקשר אליו, פותח הנוגדןיאזור באנטיגן שכנגדו -אפיטופ .סוכרים/DNA/חלבון

י "אפיטופ מיוצר ע. שחדר בתוך האנרנבת יהיו הרבה נוגדנים כנגד האפטיטופים אשר מרכיבים את החלבון

הנטורטיבית והאפיטופ יכול לזהות רצפים נטורטיבית או דהאנטיגן יכול להיות בצורה .לימפוציט אחד בטחול

-אם הוא לינארי הוא יכול לזהות רצפים שונים שהתקבלו בצורה לא לינארית, מסויימים שקרובים אחד לשני

מתן . פולינוקלוניםוחלקם מונוקלוניםחלק – נוגדניםסוגי [ 30] .תלוי באיזה גן אנו רוצים להשתמש לשם הזיהוי

גד האנטיגן לשם קבלת מצב של הרבה נוגדנים כנ, נוצרים הנוגדנים השני הזרקהר לארנבת ולאח נהראשו הזרקה

מכיוון שהרבה פוליקלונלאת הסרום והסרום הינו הארנבתמ קוצרים לאחר מכן. יש להזריק מספר פעמים

מזהים מגוון אפיטופים במקביל החיסרון בכך שייתכן כי יהיה זיהוי לא , אנטיגנים כנגד הרבה אפיטופים

יקרים מאוד וקשה , ספיציפימאוד יש הפקה מתא לימפוציט יחיד והוא מונוקלונלי לשם קבלת נוגדן . פיציפיס

.ייתכן כי לא יזהו בצורה חזקה מספיק חלבונים מכיוון שמזהים אפיטופ אחד בלבד, מאוד להכין אותם

, מזהה את האפיטופ באופן שונהבנויים בצורה שהאזור ה. heavy chainו light chainמכיל :מבנה נוגדן[ 31]

יש להכין נוגדנים על מנת לזהות את [32] .אזור שנוצר לזיהוי אפטיפוט אחד בלבד

הרצהקולה או החלבון שאנו מחפשים בלשם כך מזריקים את המול. פרובים-החלבון

מבודדים את הנוגדנים , נוגדנים ראשונייםומקבלים ( תרנגולת, ארנב)לחיה

נוגדן שניוני למעשה [ 33] .נוגדנים שניוניםם אותם שוב לקבלת הראשוניים ומזריקי

לנוגנדים שניוניים ניתן לחבר .ייקשר אל הנוגדן הראשוני שהוא ספציפי לחלבון הנחקר

זיהוי -מולקולת צבע או אנזים שיודע לבצע ריאקציה עם מולקולת צבע לקבלת צבע

בנוגדן משיםשתהחלבון מ ורוצים לזהות את ממברנהכאשר יש [34] .מיקום החיבור

ניוני שאליו מחובר המרקר הראשוני שנקשר אל החלבון ואליו מתחבר הנוגדן הש

כך שיתקבל מיקום החלבון הנחקר עקב הקשירה של הנוגדן הראשוני הצבעוני

בהתאם לחיה ממנו )לנוגדן הראשוני ייקשר נוגדן שניוני שמתאים לו , הספיציפי אליו

.בעזרת ריאקציית הצבע שעל הנוגדן השניוני נראה את מיקום החלבוןו( הופק הנוגדן הראשוני

ל עליו 'ג. או בהעברה בשדה חשמלי( לא יעיל במיוחד)בלוט בשיטה קפלרית /החלבונים מועברים לפילטר[ 35]

בסופו של דבר , בלוט מתחתיו ספוג ומעליו נייר/פילטר/ממברנה

מחברים -רנהמחברים את כל העסק למתקן להעברת חלבונים לממב

, לחשמל והחלבונים נעים לכיוון הפלוס מכיוון שטעונים שלילית

את כל השכבות מחברים [36] .ל אל הממברנה'החלבונים ינועו מהג

לאחר [37] .בעזרת מתקן של רשת ומכניסים לבופר שמעביר חשמל

הלא ספציפיים העברת החלבונים יש למלא את האזורים של הממברנה

בחלבון ממקור לשם כך יש שימוש, החלבון הנחקראשר בהם לא נקשר

לאחר מכן שטיפה והוספת בופרים ליצירת תנאים . BSAשל חלב או

מזהה מיוזין וייקשר -לדוגמא שימוש בנוגדן ראשוני אנטימיוזין[ 38] .נכונים ועזרה באי הדבקת נוגדנים לממברנה

לבסוף ביצוע ריאציית צבע על מנת [ 39] .שניוני נוגדןבלאחר מכן שימוש , אליו כאשר בדרך יש שטיפות שונות

.ל ולשמור אותו'ניתן לייבש את הג. קבלת ריאקציה צבע[ 41] .לזהות את אזורי הקשירה של הנוגדנים

.ים כמודל להחדרת וקטורים 'בקטריופאג – 8.4.10

לא הכל ניתן לבצע , סמידיםבעלי יתרונות על פל? ים'למה פאג[ 2] .כמערכת שיבוט של פרגמנטים זרים' פאג[ 1]

מאפשרים החדרה של פלסמידים עם .הם וירוסים של חיידקיםים 'פאג. ים'בפלסמיד לכן התפתחו מערכות פאג

י "מסלולים עיקריים של הדבקת חיידקים ע ישנם שני .מחדרים גדולים יותר ויעילים יותר מאשר פלסמידים

כאשר 'פרופאגאשר יכולים להפוך ל מתוניםים 'דק או פאגמתרבים ומפוצצים את החיי,נכנסים-ליטיים: ים'פאג

החיידקים יכולים להתרבות מבלי להרגיש את ( מתון)במסלול ליזוגני . נכנס לכרומוזום החיידק' של הפאג DNAה

מסלול ליטי הוא מסלול . ושם הוא הופך להיות בעל מסלול ליטי' עד לאירוע אשר יגרום ליציאת הפרופאג' הפאג

. שלו אל החיידק וישר מתחיל להתרבות DNAמזריק את ה' בו הפאג

חיתוך .מתרבה בצורה רגילה עם שני מזלגות ובשלב יותר מאוחר בצורה של רולינג סייקל' בהתחלה הפאג[ 3]

מתקבל , קיבמקטעי אוקוז עקב כך הקצה נפרם ואז אין ברירה אלא לסנתז את הגדיל המשליםו' 5בקצה של

DNA צריך לחתוך במקומות הנכונים ' לאחר מכן הפאג. רוך המורכב מהרבה גנומים קשוריםדו גדילי לינארי א

. ים לתאים'בעזרת פאג DNAהעברת -טרנסדוקציה ים מבצעים 'פאג[ 4] .יילך לקופסית DNAואז כל מקטע

בסופו של ,ר טרנפורמציה של פלסמידיםמאש תואפקטיבי היותר יעיל בצורה ים מדביקים את התאים'פאג

ים מדביקים את החיידקים וכל הרובד חיידקים שגדל הינו חיידקים 'בקטריופאג. קבלים פלאקיםתהליך מהת

בתוך פלאק יש עשרות . ים שהדביקו ופוצצו את החיידקים שבהם היו'כל הפלאקים הינם פאג, שלא עברו ליזיס

מתקבלים . ים ולכן גדלו'פאג י"כל שאר האזורים לא הודבקו ע, מיליוני וירוסים שהתרבו ופוצצו את החיידקים

ים לא יכולים להתרבות גם כן כי 'פלאקים כי החיידקים הגיעו לשלב סטציונרי בו הפסיקו להתרבות ולכן הפאג

.לבדו חסר מטבוליזם עצמי להתרבות' התרבות של החיידק לא קיים יותר והפאגהמטבוליזם

השימוש . כפול גדיל/גדיל יחיד/DNA-RNAל בסיס ים ע'ניתן לחלק בקטריופאג – ים'קבוצות של בקטריופאג[ 5]

לבניית ספריות גנומיות כי ניתן להחדיר פרגמנטים ואה ים'בעזרת פארג DNAשל החדרת העיקרי במערכת

חיתוכו לחתיכות וקבלת אורגניזםלקיחת גנום של -ספרייה גנומית. גדולים דבר שלא ניתן לעשות בפלסמידים

אנו . אורגניזםשל ה DNAחדיו מכילים את כל הקים כאשר כל הפלאקים יאיסוף הפלא, החתיכות בפלאקים

. מעוניינים בשיבוט פרגמנטים יותר גדולים כי כך יצריך מאוחר יותר חיפוש יותר קל וקצר של מקטעים

ני הינו ליזוג 'גילו כי האזור האמצעי בגנום הפאג' לאחר לימוד הפיסיולוגיה של הפאג, מתון' פאג :למדא' פאג[ 6]

חסר האזור הליזוגני ולכן יתחבר לחיידק ויחדיר את ' הפאג. במילוי החליפוללהוציאו החוצה ו ,וניתן לוותר עליו

לאחר ההזרקה יש קצוות דביקים קומפלמנטרים שליגאז יסגור . פנימה אולם לא ייצור פריצה לאחר מכן DNAה

-המילוי מכיל את הגן לסלקציה, תו במילוימוציאים את האזור המרכזי ומחליפים או[ 7] .אותם בתוך החיידק

כ יהיה ניתן לברור"חייבים להוסיף גן לסלקציה כדי שאח

ים וקיבלו אל תוכם את ההחדרה של 'י הפאג"החיידקים שהודבקו ע-מחדראת הפלאקים הנכונים בעלי ה

שאנו המקטעכולל את הגן לסלקציה ואת ' ים בגנום המקורי הליזוגני של הפאגפהמקטע שאנו מחלי. DNAה

וכך ניתן לברור את המושבות ' הפלאקים יהיו מהמושבות אשר חדר אליהם הפאג .רוצים לשבט ומעוניינים בו

.המכילות את הפלסמיד

חיתוך -רפלייסמנט וקטורהראשונה נקראת :מערכות החדרהשתי [ 8]

נעשה , והוצאה של המילוי שמוחלף עם חתיכה של גנום מאורגניזם אחר

אתר -אינסרשיין וקטורהמערכת השניה . נזימי ריסטרקציהבעזרת שני א

מאורגניזם DNAוהכנסה של ה של אנזים ריסטרקציה אחד בו יש חיתוך

' הקופסית מוגבלת לקבלת גנום של פאג-יש מגבלה של הקופסית. אחר

י 'אגפ DNAברפלסיימנט וקטור בגלל שישנה הוצאה של חתיכת . היא מוגבלת סביב גודל מסויים-למדא בלבד

החדרה . ים'הוא הבעיה של החדרה בעזרת פאג גודל המקטע המוחדר. kb25חיצוני עד DNAס יותר ניתן להכני

ישנו גודל מינימלי שחייבים להכניס כי [ 9]. מאשר החדרה בעזרת פלסמיד 2-3ים היא יעילה פי 'באמצעות פאג

ן הקופסית תזהה מקטע שנמצא בין שני כמו כ .ולכן לא ייארזאת המקטע גודל יותר קצר הקופסית לא תזהה ב

40באורך של סביבות DNAוביחד עם הוקטור מתקבל kb20-25המקורי הוא בסביבות DNAה .קוסמידים

. קילובייס

לא חייב להיות )לתאים רקומביננטיים ( חומצות גרעין) RNAאו DNAהעברה של מולקולות -טרנסדוקציה[ 10]

העברה של חומצות -יהטרנספקצ. בעזרת הוירוס( חיידקים

השלב הבא [ 11] .לא בעזרת וירוסיםגרעין לתאים אנימליים

הוא DNAמחדר למקטע החר שיבוט המולקולה והכנסת הלא

לחיידקים כדי לשכפל בכמות המשובט DNAת מקטע ההכנס

אם אנו מבצעים . )מיליוני עותקיםולקבל מקטע ה גדולה את

ות המכילות ספרייה גנומית ישנן הרבה מאוד מולקול

ב הנוכחי לא ניתן להכניס את במצ(. כל חתיכות הגנום של האורגניזם אותו לקחנו-פרגמנטים זהים ושונים

לשם . יש לארוז אותו לתוך קופסית כך שהיא תדביק באופן עצמאי את החיידקים, הרקומביננטי לחיידק מקטעה

לבונים שזקוק להם את כל הח רק וא מרכיבהולמדא פגום שלא יודע להתרבות ' פאג: כך נבנו מערכות נוספות

ייצור חלבון מערכת נוספת היא מערכת בה הגנום פגום בגן המקדד לחלבון חיוני ל .הקופסית את להרכיבבשביל

שתי המערכות משלימות אחת את השנייה ויחדיו נותנות את כל מה שצריך על מנת לארוז את . חיוני לאריזה

בשלב הבא אנו מבצעים אריזה של הגנום [ 13]. נת להדביק חיידקהרקומביננטי בקופסית על מ DNAה

חיידק מתחילה הרכבה חדירה לכמו ב. שקיבלנו משתי המערכות' הרקומביננטי ביחד עם כל החלבונים של הפאג

י אנזים "אשר מזוהה ע cosי "לינארי שמופרד ע DNAבטבע מתקבל , של כל החלקים והגנום נכנס לקופסית

כי cosחייבים להיות אתרי [ 14] .ל גנום ייכנס לקופסית ואילו במעבדה מתקבל הגנום חתוךולאחר החיתוך כ

מוכן להדבקה הרקומביננטי נכנס והוירוס DNAה, בקצוות cosללא אתרי DNAהמערכת של הוירוס לא תכניס

יפיים ספיצ DNAהם מקטעי cosה .הרצוי DNAשל החיידקים על מנת להביא ליצירת עותקים רבים של ה

כ יכולים להיסגר על עצמם וליצור "שהוירוס מזהה ועוזרים לו להחדיר את הפלסמיד בצורה לינארית ואח

.פלסמיד מעגלי

. לקופסית DNAהכנסנו לוירוסים ריקים וביצענו אריזה של ה מחדרים שאותםעם DNAמקטעי התקבלו[ 15]

-Eהוירוס מזהה את ה , E-coliונדביק חיידקי הרקומביננטי DNAעכשיו ניקח את כל הוירוסים שמכילים את ה

coli ומזריק לו את הDNA ,איך ניתן להבדיל בין פלאק הנושא . בסופו של דבר קיבלנו פלאקים ממסלול ליטי

זאת אומרת , יש לנו מולקולות בהן אין את המחדר אולם הן גם כן עברו אריזה. מחדר לבין לפלאק ללא מחדר

שימוש במולקולת הצבע . lac Zעל מנת להפריד מבצעים סלקציה בעזרת . וגיםהפלאקים מכילים את שני הס

קס חיידקים אשר קיבלו את המחדר נפגע להם הגן ולכן לא יוכלו לפרק אי. קבלת צבע כחול בעת פירוק-איקס גל

ל ויהיו בצבע לבן ואילו אלו שלא קיבלו את האינסרט יפרקו את האיקס גל ג

. ויצבעו בכחול

לקיחת צד של . קוסמידיםשפותחה בהמשך היא מערכת של נוספת מערכת[ 16]

בצורה DNAבוירוס ה. בסיסים קומפלמנטרי בשני הקצוות 12רצף של –קוס

לינארית וכאשר הוא מוזרק לחיידק הקו סייד מוצאים אחד את השני ומתקבלת

תם יחת קו סייד והוספלק-קוסמידים. תמתחיל להתרבו' מולקולה מעגלית שליגאז סוגר ולאחר מכן הפאג

כך ניתן להגדיל את המחדר שמחדירים מכיוון שישנו שימוש רק במקטעי הקוס ולא בכל הפלסמיד של .לפלסמיד

קוסמידים . על הוירוס כאילו הוא מכניס את המולקולה שלו בהתאם לגודל" עבוד"בעזרת קו סייד ניתן ל .'הפאג

חיצוני יותר גדול בהשוואה למערכת DNAניתן להחדיר -'פאגשל DNAנושאים קו סייד בעלי גודל קרוב לגודל

בעל , פלסמיד למעשה פלסמיד עם כל המאפיינים שלהקוסמיד הינו [ 17] .הקודמת והוירוס יבצע עליהם אריזה

אם נשבט פרגמנטים רבים ניתן יהיה להשתמש בפחות עותקים של שכפול כי כל . 'וכו ORI, עמידות לאפטניצילין

, בהתחלה מפיקים את הקוסמיד. יותר מידעשכפול מכיל

לאחר מכן מבצעים חיתוך עם אנזימי ריסטרקציה בהתאם

לשם האריזה יש. לאינסטרט ולאחר מכן ביצוע אריזה

זאת ומעגלי לא ייארז לקופסית DNAכי DNAלפתוח את ה

מבצעים בעזרת חיתוך באתר קוס כך שמתקבל רצף שקרוב

ל נארזת "המולקולה הנ. סיידקילובייס ובקצוות בעל קו 50ל

-לקופסית וניתן להדביק חיידקים ולהביא להתרבות שלהם

ולא )נקבל מושבות . החדרה של פלסמיד בעל קצוות קוס

זהו פלסמיד גדול שהוחדר דרך -כי זהו פלסמיד( פלאקים

וסמיד הסיכוי לקבל ק. וביצוע הסלקציה ייעשה באמצעות האמפנצילין ORIהפלסמיד יתרבה דרך ה. 'הפאג

ביצוע [ 18]. שהוחדר בלי האינסטט קטן מאוד כי ללא האינסטרט הפלסמיד קטן מאוד ולכן לא ייארז כלל

, לקבלת מולקולה לינארית 1חיתוך עם בייגל , לוקחים את הקוס סייד ומחדירים לפלסמיד. הליגציה והאריזה

כך 1קומפלמנטרים עם בייגל ערבוב עם הפרגמנטים הרצויים שנחתכו עם אנזים אחר אשר מייצר קצוות

למעשה זהו סוג של פאזל שמחברים , מחדר וכן הלאה-קוסמיד–מחדר -שמתקבלת מולקולה ארוכה של קוסמיד

דבר זה לא מחייב להיות תמידית כי מחדר יכול להתחבר למחדר ווקטור לוקטור אבל . הרבה מקטעים אחד לשני

בין כל שני אתרי קוס אנו מקבלים , ים לזיהוי אתרי קוסלאחר מכן חיתוך עם אנז. זה לא יפריע בהמשך הדרך

מזריק ' הפאג. אם יש חיבור של שני מחדרים הם יהיו גדולים מדי ולכן לא ייארזו. פלסמיד שלם עם מחדר

פ "הקופסית מזהה את הקצוות של הקוס וע .הקו סייד מתחברים והחיידקים מתרבים, לחיידק את הקוסמיד

אתרי .קונטרומריםהמולקולה הארוכה של השרשרת חיבור מחדר פלסמיד נקראת .הגודל המתאים היא אורזת

.DNAלארוז ' הקוס גורמים לפאג

ולכן פותחו מערכות נוספות DNAעבור גנום של עכבר או אדם יש צורך בכמות עצומה של .מערכות נוספות[ 19]

. מגהבייס 1טים גדולים עד וקטורים אלו נועדו להכניס פרגמנ, לשיבוט גנומים גדולים אנימליים

BAC- פיתוחו היה שימוש במערכת םלש. קילובייס 500לשבט בתוכו עד וניתן( נראה כמו פלסמיד)מאוד קטןF

לקחו את . שמקורו גדול והוא יודע לשכפל את עצמו ולבצע הפרדה עצמית E-coliפלסמיד טבעי של -פקטור

בנוסף החדירו את הגנים האחראים על חלוקה נכונה , מידפקטור והחדירו אותה לפלס Fמערכת הריפלקציה של

ישנו . לאחר הכפלה של התא וגם הכניסו גורמים האחראים על שמירת עותק נמוך של הפלסמיד בחיידק

אם מתקיים יבטא -וגן התאבדות LAC Z)קילובייס ובנוסף ישנם גנים לסלקציה 500פולילינקר בו מוחדרים ה

. לתא בת BACגנים רגולטוריים המוודאים כי לאחר כל שכפול יהיה מעבר של כל . (רעלן שיגרום למוות של התא

.לחיידק ולכן החיידק יכול להתמודד עם גודל כזה 1-2כמות עותקים מאוד קטנה

[20 ]PAC חלוקה של הפאג-'הפלסמיד בעל שני חלקים המכילים את אלמנטי הפאג. הקוסמידים' על בסיס פאג '

מתקבל כרומוזום מעגלי שמופק [ 21] .כאשר מערבבים מקבלים פלסמיד ארוך. חלקיםוזיהוי לחיבור שני ה

אנזים ריסטרקציה )המחדר נחתך רק בבאם . נחתך בשני אנזימי ריסטרקציה ומתקבלות שתי חתיכות, מחיידק

. והוא צריך להיכנס בין שתי החתיכות( מסויים

ל "הנ. זרוע ארוכה-מחדר-מתקבלת הזרוע הקצרה

ביצוע טרנסדוקציה לחיידק והמולקולה , העובר אריז

הלינארית בעזרת זיהוי אתרי הלוקס מחוברת

100מכניסה בערך -ומתקבלת מולקולה מעגלית

.לאחר מכן ניתן לבצע סלקציה ורבייה. קילובייס

יכולים לחבר שני קצוות של פלסמיד למבנה מעגלי

ומשם אל ' שיהיה מסוגל לעבור החדרה אל תוך הפאג

.גדולים מאוד יחסית DNAייצור מושבות של חיידקים המכילים רצפי . םהחיידקי

[22 ]YAC-כדי שנפלסמידים החיצוניים ישרדו צריכים מספר דברים. כרומוזום נוסף לתוך שמר חי :ORI כדי

רצף חלבונים שתפקידם שמירה על קצוות ) הפרדה לשתי תאי בת וטלמורים -רכיבי צנטרוזום, שיעבור ריפלקציה

. חיידקי אם נכנס לחיידק ORIובנוסף יש צורך ב (.ר דו גדילישלא יעברו דגרטציה ומניעת זיהוי כשב DNAה

לאורגניזם אליו ORI, יש צנטרוזום YACב. לשני אורגניזמים שונים נקרא שאטל וקטור ORIוקטור המכיל שני

את , פיק וחותכים אותו באקושאנו רוצים לה DNAמפיקים את הכרומוזומים של ה. גן לסימון סלקטיבי, נכנס

YAC חותכים עם אקו ובאם כך שבסופו של דבר יתקבלDNA מוחדר שבקצוות יש את כל האלמנטים הדרושים .

. המוחדר DNAהכרומוזום של השמר הינו לינארי ולכן יש לחתוך אותו פעמיים ולהחדיר אליו פנימה את ה

ובגלל , קשה מאוד לבנות אותו. מגהבייס 1לים של עד מאפשר להכניס קלונים גדו. מבצעים טרנספורמציה לשמר

. משמש לבניית ספרייה גנומית גדולה מאוד. יכול לעבור שינויים כרומוזומלייםגודלו הוא לא יציב ו

המטרה הסופית היא בניית ספרייה גנומית שתייצג את כל הגנום לשם כך אנו משתמשים בוקטורים שיכולים [ 23]

מערכת קלה , קילובייס 20למדא יכול להכניס עד . ים'לשם כך יש שימוש בפאג, גדולים יותר DNAלקלוט מקטעי

אולם החיסרון הוא בשעת ( בתוך החיידקים המערכת לא תתפרק)הקלונים יחסית יציבים , לבנייה ולשימוש

דא שלקחו הקוסמידים הם סוג של למ. עבודה עם גנום גדול יש צורך בהרבה פלאקים על מנת למפות את כל הגנום

. מהם רק את הקצוות ולאחר ההחדרה מתנהג כפלסמיד לכל דבר

מש לחקירת שהריצוף מ. כרומוזלי של אורגניזם מסויים וריצופו DNAלקיחת -בניית ספרייה גנומית[ 24]

בעת קבלת הספרייה הגנומית ניתן . למדא לשם הריצוף' לרוב יש שימוש בפאג. של אותו אורגניזמים DNAה

שימוש -הספרייה הגנומית מתייחסת למיפוי גנטי[ 25] .פרומוטורים ועוד, להבין גנים שונים, גן ספיציפילחפש

חיפוש גן מסויים על . תאחיזות ניתן לראות היכן נמצא הגן ובנוסף מיפוי פיסי בתוך הגנום, ברקומבינציה

מיפוי גנטי הינו . יקומו בלוקוסכרומזום מסויים ומיקומו בתוך הכרומוזום יחסית לגנים אחרים ולאחר מכן מ

מעט אנזים או זמן )חיתוך באנזים ריסטרקציה עם חיתוך חלקי : שלבי בניית ספריה[ 26] .מיפוי בטווח מסויים

אם היה , להקטנת האפשרות לזיהוי כל אתרי החיתוך בגנום דבר אשר יוצר מצב של חפיפה של החיתוכים( קצר

.קטנות ללא חפיפה מתבצע חיתוך מלא היו מתקבלות חתיכות

[ 27] .החפיפה היא כדי שיהיה ניתן לחבר בין המקטעים השונים

הפקת , ל'חיתוכו באנזים ריסטרקציה והרצה על ג DNAלקיחת -הטכניקה[ 28] .דוגמא נוספת לחתיכות חופפות

טרנפורמציה. אנו רוצים מקטעים בגודל מסויים שהחיתוך הוא סביר-הגודל הרצוי שאנו רוצים לוקטור

בסופו של גבר יהיה ניתן לבנות מפה של הכרומוזום של אותו .וחיפוש הגן הרצוי חיידקים עם וקטוריםל

ומכינים DNAלוקחים , מתקבל קלון מהריצוף[ 29. ]אורגוניזם

בפועל . ממנו חתיכת פרוב וסורקים את הספרייה עם אותו פרוב

חלק יהיו -שהרצנו DNAיידלקו מספר מושבות המכילות חתיכת

מרצפים אותן , לוקחים את החדשות. המקור וחלק יהיו חדשות

. סורקים את הקצה וכך ממשיכים הלאה, ולוקחים את הקצה

י סריקה של הספרייה "ע. הליכה על הכרומוזום גן אחריי גן

[ 30] .בפרוב חדש שהגיע מריצוף קודם אנו מגיעים אל גן חדש

הגן ממנו הגיע ועוד שני קלונים חדשים אשר מהם אנו נכין הכנת פרוב מקלון אשר מדליק את, דרך נוספת להצגה

אחת [ 31] .ההדלקה החדשה נובעת מהחפיפה שהייתה בחיתוך. קלון חדש אשר ידליק את הקודמים ועוד גן חדש

לשם ריצוף קלונים כאלו יש ריצוף . המגבלות של וקטור גדול היא שאין אפשרות לרצף כל כך הרבה בבת אחת

כך ניתן לרצף מהקצה , מהקצהיית פריימר חלק מסויים ובנ

ריצוף . עוד רצף ממנו ייבנה פריימר חדש וכן הלאה גלותול

בניית פריימר חדש אשר , מקטע מסויים של המחדר מהקצה שלו

1המגבלה היא עד . יתחיל את הריצוף הבא בתור וכן הלאה

הפריימר הראשון יהיה צמוד (.מגבלת טכנולוגיה)קילובייס

מתקבל , רה של המחדר והוא נמצא על הפלסמידלמקום החד

ומהמקטע ( עד איפה שהפולימראז יצליח)הרצף של המחדר

.שיתקבל מקצהו נכין פריימר חדש וכן הלאה

.ספריות גנומיות – 15.4.10

הגנים לבנות ספרייה המושטטת על מאפלקציות מסויימות ניתן . ספריות גנומיות משמשות לסידור גנים[ 2]

ספרייה המושטטת על לשם כך יש לבנות ,בכל רקמה םמתורג mRNAאיזה .ם ברקמה ספיציפיתהמבוטאי

mRNA .ספרייה כזאת נקראת . המתבטאים ברקמה לאורך התפתחות האורגניזם ניםספרייה תייצג את הג

cDNA ,בנוסף . יכול לשמש לביטוי חלבון שמבוטא ברקמה, מטרתה לזהות גנים ספציפיים המבוטאים ברקמה

, המקודד לחלבון DNAלדעת מהו ה כאשר המטרה היא הפקת חלבון מרקמה ובידודו-ניתן להגיע מכיוון הפוך

אמינו . ח 5-8של שיתקבלו הינם רצפיםה, (ף ביוכימיריצו)רצף מסויים של החלבון קבלת ומהם קבלת פפטידים

.אל רצף החלבון הכולל מנוהכולל ומ mRNAם ניתן להגיע אל הומה

כל הגנים הספרייה צריכה לייצג את סך ,cDNAבונים ספריית mRNAכיל את הספרייה שת הכיןכדי ל[ 3]

כי מכילה רק את הגנים שבאים תהיה יותר קטנה מספרייה גנומית ספרייה כזו. המבוטאים ברקמה מסויימת

ן אם אין את ניתן לבנות ספרייה כזו בה ניתן לבטא את החלבון או לא לבטא את החלבו. לידיי ביטוי ברקמה

.mRNAאיזה רצפים מסך כל הגנום בא לידיי ביטוי ומגיעים לידיי ביטוי ברמת .הכלים לביטוי החלבון

-רוורסי "ע DNAלאחר מכן הפיכתו ל( קשה מאוד לעבוד איתו) mRNAבידוד : cDNAהשלבים בבניית [ 4]

. DNAל ךהמתיישב עליו והופ בעזרת פריימר והוא עושה זאת DNAל RNAאנזים היודע להפוך , זטרנסקריפט

פריימרים רנדומליםאו DNAשקיים בקצה השלוש פריים של ה oligo-dT; שני סוגי פריימריםיכולים להיות

,הגנום ולכן יתחברו במקומות רבים בעלי הסתברות גבוה להכרת רצף על שהינם ספרייה של פריימרים צרים

,שני DNA גדיל השלב הבא הוא סינתזת. צע את הסינתוזמשמשים בעיקר בגנום גדול כי ניתן להתחיל מהאמ

גון ולבסוף הוספת קצוות שיהיו קומפטביליים לפלסמידים כ. משלים DNAוסינתוז RNAמה DNAהפרדת ה

.לינקרים או אדפטורים

mRNAמכיוון ש, tDNAיש להיפטר מ, tDNAו mRNAל המופק בשלב הראשון מכי RNA :השלב הראשון[ 5]

mRNAכל .להפריד ביניהם TTTTTT שלהרצתו בקולונה בעלת בידס י"ע בקצהו ניתן Aשל פולי מכיל קצה

mRNAהפיכת ה :השלב השני[ 6] .לשחרר אותו EDTAלאחר מכן באילוציה עם , לקולונה ייקשר AAAAAבעל

כאשר ישנם שני סוגי פריימריםוטרנסקריפטאז -רוורסיש שימוש ב DNAל mRNA לשם הפיכת .DNAל

הינם פריימרים אשר מכוונים אל oligo-dT .ופריימרים אקראיים oligo-dT: ריימרים שניתן להשתמש בהםפ

כיום .ופריימרים אקראיים הינם קבוצה של פריימרים אקראיים בעלי סבירות גבוהה להתאמה לגנום' 3הקצה

: שלישיהשלב ה[ 7] .ניםמרבית הגתתקבל ספרייה אשר מכילה את הפריימרים כך ש סוגי נהוג לשלב את שני

ניתן שיטה ראשונה היא כי( 1) .טרנסקריפטז-אשר התקבל מרוורס מהגדיל היחיד DNAגדיל כפול של צירתי

מתקבל גדיל , NAOHבעזרת חימום או (DNAשממנו סונתז הגדיל הראשון של ה) שנמצא RNAלהיפטר מה

טידים שיסנתז את ההמשך ולאחר מכן חיתוךהכנסת קלנו עם נוקלואו. יחיד אשר לרוב מתקפל על עצמו בקצה

לסינתוז הגדיל שיטה נוספת( 2[ )8] .בקצוות יש איבוד מקטע מסויים בשיטה זו .נוקליאז 1Sי "בקצה המחובר ע

אנזים , RNAase Hהינה שימוש ב השני

דבר DNA-RNAתוך את ההיבריד יח זה

שניתן יהיה RNAפריימרים של צורשי

המשלים DNAלהשתמש בהם לסינתוז ה

אולם dNTPsפולימראז וDNAי "ע

. י פריים סינתז"ע היא אפשרות שלישית( 3[ )9] .שלא יוסר ויילך לאיבוד' 5בקצה ה RNAתישאר חתיכה של

.י טרמינל טרנפרז"ע' 5קצה על ה C הוספה של מונו נוקלואוטיד כמו בשיטה הראשונה RNAלאחר סילוק גדיל ה

שיטה זו עדיפה על שתי .יתיישב קלנו ויהיה סינתוז של הגדיל המשלים עליו ,רתשמש כפריימ התוספת אשר יצרנו

לאחר שקיבלנו את הגדיל הכפול :שלב רביעי[ 10-16. ]השיטות הקודמות מכיוון שכך אין איבוד מקטעים בדרך

ל י הוספה ש"ע. המחדרים קטורים לקבלת כמות גדולה וביטויאנו רוצים להכניס לו cDNAוקבלת DNAשל ה

אתרי הרצף המוסף מכיל .ניתן יהיה להשתמש בכלים השונים שישנם להחדרת הרצף לוקטור לקצוות DNAרצף

ל המכיל את אתר החיתוך ניתן להכניס לתוך וקטור מקב כעת. לינקרים או אדפטורים, טרקציהסהכרה לאנזים רי

בתוכו אתר הכרות לאנזים אשר יתחבר בקצה המקטע ומכיל DNAרצף של -לינקרים. ריסטרקציההלאנזים

ביצוע מתילציה " האפשרות כי האנזים רסטריקציה יחתוך בתוך הגנום עניתן להתגבר על . ריסטרקציה מסויים

בצורה DNAבניית אדפטור המתחבר על ה-אדפטוראפשרות אחרת היא שימוש ב. לגנום לפניי חיבור הלינקרים

ן להשתמש בטרמינל טרנפרז שיוסיף מונונוקלואוטידים נית .כזו שלא יהיה צורך בשימוש באנזים ריסטרקציה

האדפטור .בקצה ולהכניס לוקטור המכיל את הקצה הדביק הקומפלמנטרי לקצה הדביק שיצרנו על גביי המחדר

כדי שיתחבר לקצוות של OHו P' 3האדפטור מכיל בקצה . שבקצה מכיל את הקצה של הוקטור DNAמכיל רצף

טי בצורה כזו שמכיל בקצה אחד פוספבנו, כי אחרת היה נסגר על עצמו בלבד OH מכיל '5לעומת זאת ב cDNAה

כך (OHוהקצה השני שני הגדילים בעלי , Pוהתחתון עם OHשל גדיל עליון עם ' 5) OHשני קצה השניב OHו

אפשרות שלישית. י קינאז כדי שייסגר על עצמו לאחר ההחדרה"הפוספט ע יוחזר לאחר הכנסתו לוקטורשרק

הרבה פעמים יש אי , ולימר קומפטבילי לוקטור עצמוימי ריסטרקציה אלא שימוש בהומו פהיא ללא שימוש באנז

, DNAיצירת גדיל : סיכום של כל השלבים[ 17] .השלמה בין הוקטור למחדר עצמו ולכן יש שימוש בקלנו בסוף

, ריצופו, DNAמיצוי ה, וריםהחדרה לוקט, DNAיצירת גדיל משלים וקבלת גדיל כפול של , RNAהפטרות מה

לא יכול אנזים זה .בשני סוגי הפריימרים יכול להשתמשטרנסקריפטאז -רוורס :הערות [18] .הפקת חלבונים

וחלק DNA-RNAמנת להרוס את ההיבריד הוא על RNAase Hהשימוש ב[ 19].ללא פריימרים DNAלסנתז

.משלים DNAמהחיתוכים ישמשו כפריימרים ליצירת

זאת עקב , ישנם מקרים רבים בהם חסר הקצה של המקטע אותו אנו משבטים .השלמת קצוות של מקטעים[ 20]

לשם השלמת הקצוות החסרים ישנו . אי סינתוז גדיל משלים כראוי או חיתוכים של הקצוות אשר נעשו בדרך

יש שיטה קצת שונה לקבלת המקטע ' 3או ' 5לכל קצה . שימוש בשיטת רייס

ע שיטה זו יש שימוש במקטעים ידועים ומרוצפים אשר לשם ביצו. החסר

בו יש רק חלק ' מקרה א, RNA' 5מאפשר ללמוד על ה רייס' 5[ 21. ]התקבלו

ומתכננים פריימר מהאזור mRNAמפיקים את ה. חסר אזור מסויים, RNAמה

בעזרת וממשיך עד הסוףהמתחיל מקצה שידוע לנו cDNAקבלת . שידוע לנו

mRNAלשם סילוק ה אייזRNAשימוש ב השלב הבא הוא. רוורס טרנסקריפטז

' 3ה בקצה CCCCCהוספת ז לשםטרמינל טרנפרב שימוש, וקבלת גדיל מסונתז

פולימראז DNAו( GGGG)פריימר מקביל וכך ניתן להכניס .המסונתז החדש

cDNAבמצב כזה סיכוי גבוה לקבלת . דו גדילי DNAלקבלת את הגדיל שליםשי

מהגדיל שלא ' 5למעשה קיבלנו את החלק של ה .כאשר אנו יודעים את הקצוות PCRיש לרצף ברלוונטי ואותו

' 3ה בקצה CCCהוספת , כי היה שימוש בפריימר מאזור ידועמקוצר cDNA בהתחלה התקבל .היה ידוע לפניי זה

והשני CCCCCפריימר אחד יהיה שבה PCRובריאקציית , GGGGGסינתוז הגדיל המשלים בעזרת לאחר מכן

כדי לנקות . דרך נוספת להצגה[ 22. ]שלא היה ידוע' 5נקבל הגברה של המקטעים עם הקצה .יהיה הפריימר הידוע

חוזרת בעזרת פריימרים PCRאת הרצפים שאנו לא רוצים והינם ארטיפקט של המערכת אנו מבצעים ריאקציית

ה של התוצר והתאמה לגן שאותו אנחנו הגברה בכמות סביר. יםהראשונ PCRמתוך הגן אשר נלקחו מתוצרי ה

פריימר שאנו םואליו מוסיפי dTהזמנת פריימר שמכיל פולי , (של הגן' 3חסר הקצה ה) רייס' 3[ 23] .מחפשים

שמתקבל עם ) Aסינתוז בעזרת רוורס טרנסקריפטז מהפולי .ינתוזאותו הפריימר מתיישב ומבצע ס, יודעים אותו

שקומפלמנטרי Tוקבלת מולקולה חד גדילית בעלת קצה של פולי RNAseHם ע RNAלאחר מכן פירוק ה ,(הגדיל

בניית שני פריימרים כאשר אחד הינו (. זהו הגדיל שסינתזנו עכשיו)והאדפטור השצמדנו אליו Aלפולי

.'5קומפלמנטרי לאדפטור והפריימר השני יהיה מהאוזר הידוע לנו מהקצה

נוספת עם PCRאקציית לאחר מכן ביצוע רי, PCRשימושב גם כאן יש

לוודא ספיציפיות ,כדי לקבל ספציפיות יותר גדולה' 5פריימר מהצד של ה

העיקרון של שתי השיטות הוא שימוש .והגעה לכמות גדולה של תוצר

ושימוש במקטע ( בהתאם לקצה שמחפשים' 3או ' 5)במקטעים ידועים

.Tפולי י"י אדפטור או אם ע"קומפלמנטרי לפריימר שאנו יוצרים אם ע

נועדו לזהות את הגנים המבוטאים , ESTנקראת גם cDNAספריית [ 24]

לשתמש באותו לאחר מכן ניתן. גילוי גנים חדשיםהוביל ל-בתוך רקמה

cDNA למיפוי הDNA אקסון-גילוי מבנה אינטרון, המלא של האורגניזם ,

חוקר ומשתנים בין חוקר לחוקר בממוצע הגדלים תלויים בכל . הינו הביטוי של הגן לספרייה EST. פרומוטורים

.וכיום הגדלים יותר גדולים bp200-800האינסרטים היו

אולם יכולים ,סידור הגנים לאחר מכןי ביטוי מרובה ו"חת היא ריצוף עדרך א :cDNAחיפוש גנים בספריית [ 25]

ות אחרת היא אם ידוע מה הגן אפשר. להיות בעיות בשיטה זו מכיוון שישנם גנים שמבוטאים יותר מגנים אחרים

DNAוב להחיפוש יכול להיות ליצירת פר. בסריקת ספרייה יהיה חיפוש של הגן, ויש כלים או חלקיים מהגנים

במקרים אחרים ניתן לבנות ספרייה שבה אותו גן יהיה בעל סיכויים . דמיון לגןי חיפוש "והחיפוש יהיה ע

אפשרות שלישית היא . י הנוגדן"י נוגדן יש סיכוי לזיהוי ע"ביטוי ע בסריקה של ספריית. מסויימים לביטוי בחיידק

אותו כניסאם ניקח גן מאדם ונ-זמים שוניםי הומולוגיה בין גנים באורגני"ע-י סריקה בחיפוש פונקציונאלי"ע

ף הגן של האדם יכול להחלי כי שמר חסר הגן הזה והשמר יוכל להתפתח ללא הפנוטיפ של חוסר בגן נוכל להסיקל

לסריקת שיטה ראשונה[ 26] .הומולוגי לשמר הנמצא באדםי ריצוף ניתן לגלות את הגן "ע. יאת הגן השמר

רפליקה של .DNAהיברדיזציה עם שימוש בפרוב ל-cDNAספריית

לקיחת , חלק מהמושבות נמצאות על צלחת ,גן למציאת מושבות

יעה בעת הנג, ממברנה מיקרוצלולוז הנחה של הצלחת והרמה מהצלחת

קבלת ממברנה של מיקרוצלולוז . חלק מהמושבות עברו לממברנה עצמה

על כל southernבשלב זה ביצוע . ת החיידקיםהמכילה חלק ממושבו

וביצוע הכרה של על מושבות החיידקים מהרפליקה שלביו השונים

בשלב האחרון ניתן לשחק עם רמת ההכרות . הפרוב על הממברנה

לאחר מכן זיהוי המושבה . נבדקבהתאם למין הנבדק והמקטע ה

שיטה[ 27] .והפקת הפלסמיד ממנה השלחה של המושבה המבטאת על הצלחת המקורית, הרצוי שמבטאת את הגן

סריקת מושבת . סריקה עבור מושבות המכילות חלבון מסויים, פרוב שהוא נוגדן, שימוש בפרוב שונה-שנייה

cDNA הספרייה המתקבלת הינה חלבון . סויימת של ביטוי חלבוןאשר בנויה בצורה כזו שהפלסמיד בעל בקרה מ

לקיחת -המכילה את התנאים לביטוי החלבון זריעה על גביי הצלחת. 'וחלק מגן ב' חלבון שמכיל חלק מגן א-איחוי

. ניתן לבצע אינדוקציה לחלק מהחלבונים וסריקה עם נוגדנים. ממברנה וקבלת ממברנה המכילה חלק מהמושבות

א חלבון בחיידק ומבצעים קלונינג בחיידק יש לוודא כי השיטה בה הקלונינג מבוצע הינו הומולוגי אם רוצים לבט

1:3סיכוי של . למעשה יש יצירה של חלבון מאוחה משני חלבונים שונים. ומתאים לרצף הקריאה של החלבון

חשיפה , ראשוני ושניוני מבצעים היברידיזציה עם נוגדן .מכיוון שכל שלושה נוקלואטודים יש רצף קריאה נכון

.לראות באיזה מושבה יש ביטוי של החלבון, לפילם

שימושים מה הם ה. השלב הבא לאחר יצירת הספרייה[ 28]

הינו לענות על cDNAשימוש אחד לספריות ? בספרייה

איך , איזה גנים באים לידיי ביטוי במצבים שונים :השאלה

ספריות ? הגנום של אותו אורגניזם מגיב למצב של סטרס

cDNA מייצגות את ביטוי הmRNA רוצים לראות איזה ואנו

רוב הגנים יבוטאו בשני המצבים , גנים מובטאים במצבים שונים

תוך " הפחתה"אולם אנו רוצים לסרוק בצורה מסויימת ולעשות

למשל .כדי השוואה ולשלוף גנים ספיציפיים לשלב מסויים

איזה השאלה היא,סרום שלהוספה י"יצירת תנאים חדשים ע

. גנים מבוטאים בעת הוספת הסרום לעומת אלו ללא הסרום

משני סוגי התאים mRNAיך יש הפקת תהלה לשבשלב ראשון

תרבית במסומן באדום גן המבוטא בתרבית הסרום ולא מבוטא )

הפקת , של תאי הסרום mRNAה לוקחים את מכלול. (השנייה

mRNA אותו עיקרון עבור התרבית ללא הסרום, ידים רדיואקטיביםטרקריפטז עם נוקלואוט-ביצוע רוורסו .

.ביצוע שתי היברדיזציות לממברנות וסריקה, נגיעה במושבות וקבלת שתי ממברנות, לאחר מכן לקיחת ממברנה

לאחר פיתוח אותו גן שאותו חיפשנו .כאלו עם סרום וכאלו בלי סרום-אנו מכינים גלאים לשני סוגי הטיפולים

הסריקה . כך שמושבה אשר תידלק תבטא גן שמבוטא בתרבית עם הסרום, יע מהספרייה של הסרוםיידלק כי מג

פרוב שלא יידבק .פרוב שלא קיים משמע לא בא לידיי ביטוי, של הרקמה mRNAהיא בפרוב המייצגים את כל ה

בר ניתן לדעת בסופו של ד. במושבה ללא הסרום מראה כי הגן ממנו הוכן הפרוב לא קיים במושבה ללא הסרום

מאפשר לראות איזה מושבה מבטאת ולא איזה -איזה מושבה ביטאה גנים שונים בהתאם לשינוי בתנאי הסביבה

.ירידה בביטוי של גן מסויים בתנאים מסויימים-המצב יכול להיות הפוך(. לשם כך יש שיטות אחרות)גן מבוטא

מתבטא mRNAחקירת איזה . ספריות החסרה, שנייהאחת ולא ב' לזיהוי גנים ייחודיים לאוכ שיטה נוספת[ 29]

י רוורס "ע cDNAהפיכתו ל', ב' מאוכ Aפוליהפקת ',א' מאוכ Aהפקת פולי. בספריה אחת ולא בשנייה

של Tעם פולי' א' של אוכ Aלאחר מכן ערבוב פולי .'ב' של אוכ mRNAסילוק ה, Tטרנסקריפטז אשר מכיל פולי

מי שאין לו , יד שלא נקשר יישאר בודד חד גדיליהיבר. Tמנטרי שלו פוליללקומפ Aתהיה פגישה בין פולי ',ב' אוכ

ניתן להריץ בקולונה אשר קושרת גדיל כפול וקבלת אילוציה של חד גדילי שלא ייקשר .המקבילה' בן זוג באוכ

פרוב , קלונינג ביצוע. ניתן להפוך אותם לדו גדילי לאחר מכן .השנייה' אחת ולא באוכ' כווהוא הגן אשר מבוטא בא

. בגדול יצירת היברידים משותפים ואת הקומפלמנטרים מסלקים. וסריקתו

[31 ]SSH – לוקחים טסטרcDNA (מאוכ' A זוהי ספרייה שאנו רוצים לבדוק אותה) , יוצרים ממנה שתי קבוצות

טורים מסוג הקבוצה מסמנים באדפואת ( אדום כחול) 1כאשר את הקבוצה הראשונה מסמנים באדפטורים מסוג

השאלה , Bתאים ' מאוכ cDNAלאחר מכן הפקת . שתי קבוצות האדפטורים בעלי רצף שונה. (אדום שחור) 2

מבצעים. Bולא באים לידיי ביטוי בספרייה מתאי Aהמחקרית היא אלו גנים באים לידיי ביטוי בספרייה מתאי

נוצרות .Bעם 2מקבוצה Aומקביל Bעם 1מקבוצה Aפעם אחת , יחדיו' והיברידיזציה של שתי האוכ ערבוב

Bעם Aדו גדיל היבריד של , (bאפשרות ) Aדו גדיל מקבוצה , (aאפשרות ) ,Aחד גדיל מקבוצה : מספר אפשרויות

לאחר מכן מבצעים היברדזיציה (.dאפשרות , חד גדיל או דו גדיל)תישאר עם עצמה Bאו שקבוצה ( cאפשרות )

וגם אפשרות ( a-d) תוצאותמתקבלות אותן כעת . י הקבוצות שהתקבלו מקודםלאחר שמערבבים את שתשנייה

למעשה זהו חיבור של , eאפשרות ) 2בעלי אדפטורים מקבוצה ו 1קבוצה נוספת של כאלה בעלי אדפטורים מ

י שימוש בפריימרים המתאימים לאדפטורים "ע PCRעכשיו יש לבצע ריאקציית (.מכל קבוצה בנפרד aאפשרות

האפשרות הראשונה לא תוגבר באופן ;eכך שלרוב תתקבל הגברה רק עבור אפשרות ( הרצף האדום)יים החיצונ

גדילים בעלי קצוות זהים ייסגרו על עצמם וייצרו האפשרות השנייה לא תוגבר כי ,לוגריתמי כי אין לו גדיל מקביל

, ו הצד יוגברו באופן לינאריהאפשרות השלישית של גדילים בעלי אדפטורים באות ,לולאה ולכן לא יוגברו

כי חסרי פריימרים ורק האפשרות החמישית תוגבר גם כן רצפים ללא אדפטור לא יוגברו האפשרות הרביעית של

נוסף בו יש PCR ,PCR נסטד לאחר מכן על מנת למנוע אפקטי שוליים מבצעים. כי ישנו קצה אדום בשני הקצוות

אדפטור ראשון בנוי בצורה שונה מהשני באזור [ 32] .(וכחולים שחורים) הפנימיים יותר שימוש בפריימרים

(.כחול שונה, אדום משותף)מסויים

29.4.10 – PCR ,שימוש ושיטות בהנדסה גנטית.

והמטרה םזולי מרכיבי הריאקציה, חסית זולהשיטה י ,1983פותח ב PCR[ 2] .בהנדסה גנטית PCR ישימוש[ 1]

מרמה נמוכה לגבוה כאשר ניתן לבחור DNAנועד להגביר PCR. מות גדולהלכ DNAהיא לגביר את הכמות ה

מתוך RNAאו DNA מקטעי להגביר באופן סלקטיביניתן [ 3] .איזה מקטעים להגביר במערכת פשוטה יחסית

ות קטנות ולהגביר מאפשר להתחיל מכמוי, ספיציפית ניתן להגביר גן אחד' אם יש אוכ .שקיים DNAמכלול ה

על כל חד גדיל יש , מפרידה אותו, DNAהשיטה לוקחת . שימוש בפריימרים ספיציפיים לגן תוך גדולותלכמויות

אפשרות לפריימר להתחבר ואז לתת -אנהילינג, דנטורציה. פולימראז לעבוד וכן הלאה DNAנותנים ל, פריימר

, dNTP's, ולימראזפDNA, פריימרים, טהריאקציה מכילה את הטמפליי[ 4] .לפולימראז לעשות את עבודתו

הביא בכך לקרר אותה ו, למכשיר בעל אפשרות לחמם פלטההכנסת כל מרכיבי הריאקציה לטיוב ו. מגנזיום ובופר

.לשימוש מהיר ואוטומטי לריאקציה

18-30מחייב , נוקלואוטידים 18-100הפריימר יכול להיות . תכנן את הפריימרכאשר מתכננים ריאקציה יש ל[ 5]

' 5מעבר לכך לכיוון ה. נוקלואטידים ספיציפיים וקומפלמנטרים לגן שאותו אנחנו רוצים להגביר ('3מהצד של ה)

, 'טרקציה וכורצפים לאינזימי רס, ניתן להכניס גנים של שמרים. ניתן לשחק עם כל הגנים ורצפים שאנו רוצים

ת כי אם לא יהיה ספיציפי ספיציפיו יש צורך לזהות. רצפים שונים שלא אמורים להתחבר אלא ישמשו לאחר מכן

נקבל והמקורי DNAהה לעומת מספיק טעות אחת ברצף של הפריימר-הפריימר לא יישב ויכול לגרום למוטציה

. הפריימר הוא אבן הבסיס לשימוש בריאקציה. ניתן לנצל זאת על מנת ליצור מוטציה מבוקרת ,תוצריםמוטציה ב

מעט מדי יביאו לאינטרקציה נמוכה של שניוני הכך יוצר מבנכי מעבר ל 60%-40%יה יה G-Cשל היחס כלל אצבע

, מעלות 50-65צריך להיות בין Tmה .מעלות 2הינו A-Tמעלות היברדיזציה ו 4מחושב כ G-C רחיבו. הפריימר

100%שיהיה ' 3ההתאמה החשובה ביותר היא ב .אם יהיה נמוך מדי הפריימר ייקשר בצורה לא ספיציפית

הדברים יכולים שאר ,G/Cקומפמנטריות מושלמת ואם אפשרי עדיפות גבוה מאוד ל, יהתאמה לגן הספיציפ

י הפריימרים יהיו קומפלמנטרים אחד לשני ויש לתכנן אותם כך שלא יגיבו בינם לבין כייתכן . להשתנות קצת

.עצמם או עם השני

, שמהם אנו רוצים לרצף את הגןקיבלנו פפטידים חלבוניים קצרים . הגברה של רצפים שלא ידועים במלואם [6]

. מהגן אולם לחומצה אמינית יש מספר אפשרויות של קידוד

יצירת -פריים רייס' 5 אנו רוצים לזהות את הקצה בעזרת

פריימרים שונים בתקווה שחלק מהם ייתיישבו על 1024או 256המכילה פריימרים 'אוכ-פריימר דגנרטיבי

שניתן יש כמות מוגבלת של פריימר דגנרטיבי. רייס' 5תוצאה של כך שנקבל הטמפלייט ויבצעו את הריאציה

פריימר דגנרטיבי יכלול את הנוקלואוטידים שאנו יודעים שצריכים להיות בוודאות . להשתמש בהם

ניתן [ 8. ]פריימרים יכולים להפריע לריאקציהיותר מדי [ 7]. המשתנה והנוקלואוטיד המשתנה יהיה הקומבינציה

הוא יכול כך, נוקלואוטיד שיכול להיקשר למספר נוקלואוטידים בעזרתטיביות של הפריימרים נרלשחק עם הדג

tRNAכדי לחסוך ב. יכול להיקשר לכל הנוקלואוטידים אינוזין .לחסוך בכמות הפריימרים שהכנסנו לריאקציה

חת ישנו המזהים חומצה אמינית א tRNA במקום ארבע) tRNAישנו נוקלואוטיד הנמצא במקום השלישי ב

tRNA מבחינה אבולוציונית הוא חוסך בכמות (. לחומצה אמינית מסויימת המזהה את ארבעת הרצפים אחד

tRNA .ירדנו . ספיציפי לגן שלנו 1וכך מתקבל רק פריימר . ל והכניסו אותו לפריימר"לקחו את הנוקלואוטיד הנ

ן הינו יהחיסרון של האינוז[ 10] .באינוזין הנוקלואוטידים האפשריתי החלפת מספר "רנטיביות שלנו ענבמידת הדג

יש לשמור על . הריאקציה' מעלה את טמפ, הוא מאוד יקר, בכך שהסתברותית הוא לא נקשר באופן שווה לכולם

אומנם הוא לא אפיני לכולם באותה מידה אבל הוא מוריד את כמות ההדבקות הלא .כמות מסויימת של אינוזין

פולימראז לא יכול לשבת ולא תהיה הגברה לכן יש לשמור DNAהתאמה לפריימר ה ברגע שיש אי[ 11. ]ספציפיות

. '3על התאמה מעולה ב

לרוב אם רוצים להגביר הטאק פולימראז יעיל [ 13] .פולימריזציה, חיבור גדילים, הפרדה – PCRראקציית ה[ 12]

תלוי במקור -רום להפרדת הגדיליםיש לוודא שאפשר לג. קילובייס ואם רוצים מעבר לכך יש טאקים אחרים 1עד

אם לוקחים פלסמיד נקי לא צריך הרבה זמן אולם ניתן לקחת חיידקים חיים ומהם אנו רוצים להפיק , DNAה

.באמת השתחרר ואין לו הפרעות DNAהגבוהה יהיה יותר ארוך כדי לוודא שה' ולכן הזמן של הטמפ DNAאת ה

, מעלות DNA .G-C 4תאפשר קשירה ספיציפית של הפריימר אל הש' הורדת הטמפ –אנהילינג –השלב הבא [ 14]

A-T 2 רות בטמפניתן לבצע מספר חז. כלל אצבע אשר נתון לשינויים –מעלות 5כ מורידים "מעלות ומהסה '

בספיציפיות בריאקציה של החוקרהמקום למשחק . תאמה הכי טובהה ןתת' אנהלינג שונות ולראות איזה טמפ

הריאקציה הינה הגברה [ 16] .י טאק פולימרז"ע פולמריזציה[ 15] .הריאקציה הינה באנהילינג של

בפעם , מתקבלים ארבע גדילים, אם יש שני זוגות פריימרים וכל אחד קומפלמנטרי לגדיל. אקספוננציאלית

עובד עם PCR .ריימרים אבל ההגברה תסתיים יותר מוקדםאותו טמפלייט שקיבלנו יתיישבו הפהשנייה על

את המקטע הפריימר גורםלהגברת .אחד הולך קדימה והשני אחורנית רכאש םמרים ספיציפייפריי

בערך PCRבעת תכנון -כלל אצבע .המקטע שאנו מחפשים שלבצורה אקספוננציאלית גברהה[ 17]. הקומפלמנטרי

ה לפי הפריימר אנהלינג נעש, מעלות 95של ' דנטורציה נעשית בטמפ. לעבוד PCRבסיסים נותנים דקה ל 1000לכל

ואלונגציה נעשה בהתאם לטאק פולימרז איתו Tmקצת יותר נמוכה מה' נעשה בטמפ, של הפריימר Tmבהתאם ל

עם התהליך הפריימרים יתיישבו על הטמפלייטים המקוריים וגם על . גבוהות' אנו עובדים אבל כולם יהיו בטמפ

.ביאו להגברה אקספוננציאליתהתוצרים אשר התקבלו ולכן פריימרים שרצים אחד מול השני י

דברים שמתקבלים ולא הרצויים למשל התיישבות של הפריימר -בעל תכונות שליליות PCR: PCRבעיות של [ 18]

כל מקטע מכיל שילוב של שני גנים –ימרה כ. של אנילינג' י קביעת טמפ"במקום לא נכון אשר יכול להיות מתוקן ע

לאחר דנטורציה והפרדה , ל מסויים והפריימר השני הגביר את השנימתרחש כאשר פריימר מגביר גדי -שונים

-בשלב האנלינג הייתה אנולוגיה בין שני הגדילים והם התיישבו אחד על השני וכך משמשים כפריימר אחד לשני

קורה לרוב במיקרו ביולוגיה כאשר רוצים להגביר . מתקבל בליל שכל גדיל מורכב מגן שונה. מתקבלת כימרה

דוגמא שנייה .מצב של קבלת הומולוגיה של כימרות[ 19] .אם יש אנלוגיה מספקת בין גנים. יה בין גניםהומולוג

כאשר מגבירים גנים . הטרודופלקס-היא בה כל הגדיל בעצם משלים אחד את השני ומתיישב אחד מול השני

.נראה זאת רק בריצוף-שמורים לרוב זה מה שיתקבל

פולט אורך גל שונה בעת צביעה בעזרת אטדיום ברומיד אשר , ל אגרוז'על ג הפרדהלאחר ההגברה ביצוע [ 20]

.מעלה וקטנים מטהלבנדים גדולים . שר יעיד על הגודלחשוב לשים מרקר א. DNAכניסה בין גדילי

אם יש פריימרים שמגבירים מוצר . מאשפר להגביר ספציפית יותר רצפים מסויימים – PCRבנסטד שימוש [ 21]

הראשוני PCRהתוצר .פנימי בעזרת פריימרים פנימיים PCRקבל תוצר מסויים שעליו ניתן לבצע נ, מסויים

זאת על מנת להגדיל את הספיציפיות כי הפריימרים הפנימיים יותר .שמתקבל יכול להגיע גם מהגברות מסביב

גביר את התוצרים ל ועל מנת לה'ראשון ייתן מעט תוצרים אשר לא יראו על ג PCRספיציפיים ובנוסף לרוב

עצם הרעיון של הריאקציה השנייה נובע מכך שהקישור הלא ספציפי שהיה בתוצר הראשון .משתמשים בשיטה זו

מבוצע כאשר , אומנם יש איבוד חלק מהאזור. ונתן תוצרים לא ספציפיים לא יתרחש שוב פעם בריאקציה השנייה

פריימר ראשון כמו בפעם הראשונה ובפעם השנייה , טדאפשרי לעשות סמינס. יש חשיבות גדולה מאוד לספציפיות

.פריימר אחד חדש בלבד

לפעמים .המאפשר להגביר רצפים כאשר רק אזור קטן מאוד ידוע PCR – PCRרס אינוו :שימושים נוספים[ 22]

-יש מקרים בהם יש מקטע של גן בגנום שידוע הרצף שלו ואנו מחפשים את מיקומו ואת הרצף משמאלו ומימינו

-נייד אשר יכול ליפול בתוך גן DNAלרוב בגנטיקה בעת ביצוע מוטציות משתמשים ב. הרחבת המידע על הריצוף

יש למצוא דרך -אנו יודעים את אמצע הגן ומעוניינים לדעת את הקצוות .יש רצון למצוא היכן הגן הנייד נמצא

, עלי אתרים לאנזימי ריסטרקציהחיבור קצוות ב, שיש לנו מוסיפים לינקרים cDNAלכל ה. לשלוף את האמצע

לאחר מכן מבצעים ליגציה והחיתוכים של המקטע , חיתוכים בקצוות, חשיפה של האתר לאנזימי ריסטרקציה

למעשה אנחנו גורמים למקטע שלנו לסגור על עצמו מעגל בעזרת המקטעים שהוספנו , מעגל משני הצדדים ייסגרו

הסיכוי שהמקטעים יתחברו חזרה אחד לשני אלא ייסגרו על חשוב מאוד לעשות מהילה כדי להקטין את . לו

כל המעגל מכיל את .מעגלי סגור על עצמו DNAאנו רוצים לקבל . עצמם

לאחר מכן תכנון . הרצף שאנו יודעים וגם את הרצפים שאנו לא יודעים

אחד מתחיל במקום הידוע והולך שמאלה והשני -פריימרים גב אל גב

עקב הסגירה הפריימרים הפכו כיוון . ימינה מתחיל מאותה נקודה והולך

.שנמצא בצדדים של המקטע שהחדרנו DNAואז הם מגבירים את ה

התקבלו -התוצר יהיה תוצר לינארי ואותו אנו מחברים חזרה למעגל

מבצעים חיתוך עם האנזים ריסטרקציה , הרבה העתקים של מעגל סגור

בגלל – PCRינוורס א .חזרה על מנת לקבל את הרצף המקורי שלנו מוגבר

לרוב קשה למצוא אזור ריסטרקציה משני . שהפריימרים הפכו כיוון

י חיתוך באנזים שמזהה אזורי חיתוך רבים ולכן יחתוך "הצדדים ולכן ניתן למפות כל אזור בנפרד זאת עושים ע

גברה של צד נקבל הויו לנו הם רק מהאזור שהחדרנו את הגן שהחדרנו ואת המשך הגנום וכך הפריימרים שיה

.ניתן להגביר את שני הקצוות בבת אחת או כלל צד בנפרד PCRאנוורס ב. אחד בלבד

מכיוון שיש רצף , לופ –הרפין יכולים ליצור לא נכון פריימרים בתכנון – תכנון פריימרים נכונים[ 23]

ון א תהיה הגברה מכיולא יכול להתיישב על הטמפלייט ואז להפריימר עקב ההרפין לופ, קומפלמנטרי אחד לשני

-קרוס דימר. עם עצמו עצמי ימרכל פריימר יכול ליצור ד ,אותו פריימר – עצמי דימר .שנסגר על עצמו ולא לינארי

לשם כך יש לנסות . מתיישבים אחד מול השני ומגבירים זה את זה 2ו 1פריימר , לשני דהפריימרים משלימים אח

.תוכנות שונות החוזות את הבעיות שיכולות להיויש ת. להימנע ככל הניתן מפריימרים כאלו

ש מידת לכל טאק י. יכולות להתקבל מוטציות בקטע המוגבר ולכן proof reading חסר – טאק פולימרז[ 24]

מקטין את יעילות , על חשבון יעילות ההגברה וחזק יבוא proof readingטאקים בעלי . טעויות מסויימת

.טרייד אוף-יהיה מדוייק אבל ההגברה תהיה חלשה יותר ולהפך proof readingאנזים בעל . הריאקציה

30לאחר מכן , ה מלאהמעלות על מנת לקבל הפרד 94בהתחלה ארבע דקות ב. PCRשל השלבים השונים[ 25]

ולאחר מכן מוחזק . דקות להשלמת כל החלקים 7בסוף יש . פ הפריימרים והטאקים"נקבעות ע 'חזרות שהטמפ

.קר עד להרצה

הכנסת מוטציות לגן ידוע על מנת לשנות חומצה אמינית , רצוי DNAלהגביר מקטע : PCRאפליקציות [ 26]

כימות של . יםשימוש בפריימר דגנרטיבי הגברת גנים לא ידוע. מסויימת ולראות את פעילות החלבון לאחר מכן

RNA משל מיקרואריי נותן הבדלבתא כאשר יודעים את הכמות ההתחלתית או להשוות בין שני רקמות שונות ל

אריי יש לכמת בשיטות אחרות האם התוצאות שקיבלנו נכונות שבאמת גן ורלאחר מיק. בגנים בין רקמה לרקמה

שימושים בתעשייה . גנומי ולחפש מוטציות בבני אדם חולים DNAעל PCR ,יותר מגן אחר מבוטא מסויים

.לראות אם דגימה מזוהמת בחיידקים

, אשר הרצף ידוע cDNAמשמש לבניית ספריית -RPCרוורס טרנסקריפטז , PCR-RTהינו שימוש נוסף[ 27]

. בריאקציה כזו אנו מבצעים גם הגברה של המקטע וגם סריקה בו זמנית .cDNAאחד mRNAניתן לבנות מ

י "חד גדילי ע cDNAהפיכתו ל mRNA עם התחלה: י"מבצעים זאת ע

שימוש בפריימרים מהקצה . םרוורס טרנסקריפטאז בעזרת פריימר מסויי

לאחר מכן היפטרות , עם אדפטורים בקצה cDNAאותו אנו רוצים לבנות

. בעל אדפטור mRNAשל ה' 5וסינתוז פריימר מתאים ל mRNAמ

עם אותם שני פריימרים מבצעים . מתקבל תוצר בעל אזור דו גדילי שלם

חיתוך עם אנזימי הריסטרקציה בקצוות והחדרות, הגברה של הרצף

חייב להיות ' 3האזור של ה PCRחשוב לציין כי ב[ 28. ]לחיידקים

ללא מחוייב להיות ' 5המוגבר לעומת זאת DNAל 100%קומפלמנטרי ב

סטיקי כדי לעזור בליגציה קצה אחוז אלא יכול להיות 100%מותאם ב

PCRאם מוסיפים אתר ריסטרקציה מסויים מקבלים תוצר . לאחר מכן

. נו עם נספחים של אתרי חיתוך שעוזרים לשיבוטשמכיל את כל הגנים של

אם , Tעם עודפי mcsבנוסף ניתן לעשות פלסמיד מעגלי בעל קצוות של

DNAכך מתקבל Aיוסיף עודף proof readingמשתמשים באנזים חסר

טאק . בעת החדרת המקטע אל הפלסמידאשר ייסגרו יחדיו Aעם עודף PCRלא סגור ותוצר Tמעגלי עם

ולכן יכול להכניס מוטציות ובמעבדה משתמשים במיקס של טאקים כדי proof readingמרז חסר יכולת של פולי

.שאחד יפצה על השני

י שינוי "ע מוטציה נקודתית בחלבון. אנו רוצים לבצע מניפולציה על החלבון על מנת לבחון את פעילות החלבון[ 29]

על מנת לעשות מוטציה נקודתית מהירה .יה בתוך גן מסוייםהמטרה ליצור מוטצ. שיש לנו DNAנוקלואוטידים ב

אנו רוצים להגביר את הגן הזה כאשר ישנו רצון להכניס , זאת משתשמים בפלמסמיד שבתוכו יש את הגן הרצוי

מתכננים שני פריימרים יחסית גדולים קומפלמנטרים אחד לשני ובאזור בו אנו רוצים . מוטציה באזור מסויים בו

הפריימרים יהיו בדיוק על .ציהטשני הפריימרים מכילים את המו, מוטציה משנים את הנוקלואטידלבצע את ה

הפריימרים הם למעשה דימרים מושלמים , אותו אזור בכיוונים מנוגדים ובמרכז הפריימר מכילים את המוטציה

שלים את הפלסמיד מתוך תקווה שתהיה הגברה של הפלסמיד עם ניק ולא יהיה ניתן לה PCRהרצת .אחד לשני

התוצר אשר .המכיל את המוטציה מעגלי לא סגור PCRכעת יש לנו את הטמפלייט ממנו התחלנו ותוצר . המעגלי

זוהי ריאקציה לינארית . נוצר לא יכול להוות טמפלייט לאחר שהוא נוצר כי הפריימרים לא יכולים להידבק אליו

אשר חותך DPN1 רי יש שימוש באנזים ריסטרקציהפלייט המקומטהמלהיפטר על מנת .ולא אקספוננציאלית

ל חיידקים אשר לאחר מכן יש החדרה של התוצרים א. המקורי בלבד גדילמתילציה ויחתוך את ה יבעל רצפים

כאלו לרוב גדולים יםאחת הבעיות במערכת כזו היא כי פלסמיד. החלבון ם ניתן להפיק אתהישלימו את הניק ומ

פתרון אחר הינו סריקת למושבות עם . לכן עובדים עם פלסמידים קטנים, DNAהמאוד ולא ניתן להגביר את

עם פריימרים בהם הנוקלואוטיד האחרון הוא PCRאם לא חתכנו את הטמפלייט המקורי ניתן לבצע , מוטציה

. תהיה הגברה רק של המושבות בעלות המוטציה אחרת לא יהיה חיבור ולא תהיה הגברה-נוקלואוטיד המוטציה

דבר נוסף שניתן לעשות הינו לשנות נוקלואטידים . על החיידק השלם ולקבל תוצרים PCRן לבצע את הנית

ביצוע מוטציה , מסויימים ברמה כזו שיווצר אתר ריסטרקציה שלא קיים בתוך הגן בנוסף למוטציה הרצויה

ות חיידקים מתקבלות מושב. השלם תגרום לשינוי מסויים DNAשקטה שלא תשנה את החלבון אבל ברמת ה

-שבה אנו מגבירים את הגן שלנו נכניס לאנזים ריסטרקציה PCRלאחר הגברה ב, DNAהמכילות את שני סוגי ה

במקומות בהם יהיה חיתוך לקבלת שני בנדים ואילו היכן שלא , נקבל בנד אחד או שניים PCRכאשר נריץ ב

.הייתה מוטציה שקטה יהיה בנד יחיד

?איך זה עובד. מוטציה נקודתיתדרך אחרת היא ביצוע . אנזים יגביר את הפלסמידהרבה פעמים יש בעיה שה[ 30]

לוקחים גן והמוטציה אשר רוצים להכניס נמצאת

אחת בה PCRת ויצריאק שתי מבצעים, באמצע

ים בפריימר מתוך הגן ואחד שמכיל את שממשת

PCRבמקביל מריצים ריאקציית . המוטציה לגן

שתי ,הפוך,יימר שהינובה עושים את אותו פר נוספת

יש אזור משותף לשתי אבל שונות PCRריאקציות

זוג -למעשה יוצרים שני זוגות פריימרים .הריאצקיות

. ראשון הוא גב אל גב והזוג השני נמצאים בקצוות

ההגברה הראשונה היא שתי הגברות נפרדות בשתי

הראשונה עם הפריימר הקיצוני : מבחנות נפרדות

-ו שמכיל את המוטציה בווהפריימר המשלים ל

הריאקציה , מקבלים חלק מהגן שמכיל את המוטציה

השנייה היא עם שני הפריימרים האחרים ויתקבל

לאחר מכן .ההמשך של הגן בעל מוטציה בקצה השני

. PCRמפיקים את כל התוצרים ומבצעים ריאקציית

אחד טמפלייטיםכולימאז יזהה אותם הטאק פ. ת השנירים אחד אהזו חלק מהגדילים יזהו קומפלמנט בריאקציה

התקבל תוצר בעל .הזוג העליון בציור, ישלים אותם לשני הכיוונים בפריימר שלהם' 3לשני ורק כאלו בעלי

נוספת עם PCRעכשיו מבצעים ריאקציית . ל טמפלייט חדש שמכיל את המוטציהמתקב ,מוטציה באמצע

טע בעל המוטציה ולאחר מכן לקיחת המקטעים והכנסה הפריימרים מהקצוות המקוריים כך שיגבירו את המק

.לחיידקים והמשך מחקר מהנה

זאת . ות שונות ויש לבדוק זאתממיקרואריי כי יש שינוי בין רקמ לרוב מתקבל. בדוגמא נדגמת DNAכימות [ 31]

אנו . ניתן לכמת את כמות התוצרים PCRכך שבכל סיבוב של PCRמריצים ,real time PCRבשיטת עושים

-בזמן אמת PCRכימות תוצרי . יודעים את קצב ההגברה וכך ניתן לחזור אחורנית לחשב את הכמות ההתחלתית

צנטי סרואולמכמת את התוצר הפ, צנטייםסראופלו PCRלקרוא תוצרי הביצוע ריאקציה היכולPCR. [32 ]הרצת

ריאקציית [ 34]. שהתחלנו איתו התוצר עולה באופן אקספוננציאלי שתלוי במספר הטמפלייטים[ 33]. שמתקבל

PCR – אם מתחילים בT4 (4 טמפלייטים) עלה יותר מהר מאשר ת יהצנסראוהפלוT2 לעומתT ככל שיש יותרT

ככל . בסיסים 200ולכן מגבירים תוצרים עד 100%זה לא [ 35] .העלייה האקספוננציאלית תתחיל יותר מוקדם

הוא לא אין סופי אלא בשלב מסויים יש הגעה PCR[ 36] .טיתצנסראור ארוך יש יותר מקום לטעות פלותשיו

סיבובים יהיה מישור עקב ירידה ביעילות 30-40לרוב אחריי ', נגמרו הנוקלואוטידים וכו, טאק מתעייף, למישור

לא נחשב את כמות לכן על מנת להימנע מארטיפקט זה .PCRאין עלייה במספר התוצרים של ה. הריאקציה

להיות מצב בו ריאקציות יכול[ 37] .בזמן הרצת הריאקציה ר אלא בעלייה האקספוננציאליתהתוצרים במישו

לכן נחשב את יעילות הריאקציה ומספר התוצרים באזור , יתנו תוצרים שונים( מבחינת כמויות)זהות

לכן תמיד יש לחשב באזור, יכול להיות כי בריכוזים שונים תהיה עלייה שונה[ 38] .האקספוננציאלי

ל אלא 'לא ניתן לכמת על ג, את המצב הסופי של הפלאטו הל מכיר'הרצה על הג[ 39] .האקספוננציאלי של העלייה

[ 40] .הרצה צנטית אשר תחשב תוך כדיסראופלו PCRמחייב ריאקציית . רק בזמן אמת תוך כדי חישוב אחורנית

PCR י מכשיר שקורא את "ות עגמאוהשוואה בין ד, ילוורציוני למספר הטמפלייטים שהתחהוא פרופ

דו גדילי DNAמולקולה שיכולה להיכנס ל – גרין ברסיי :ציהסנראושיטות לחישוב פלו[ 41] .יהנצרסאוהפלו

ככל [ 42. ]דומה לאטידיום ברומיד ורק כאשר נכנס למולקולה דו גדילית מפיץ אור .אור ובאורך אור מסויים פולט

שיטה זולה . נספחים PCRהה הרבה מאוד פעמים יז. רסנציהאור פלושנכנסת ליותר גדילים דו גדיליים יהיה יות

הפריימרים אותם , פשוט מאוד[ 44] .דוגמא אחרת להראות את השיטה[ 43] .הרבה מאוד רעש רקע אבל עם

.זול ולכן טוב מאוד לכמת ברמת קיים או לא קיים. לא ספיציפי, פריימרים

בעל פריימר ייתבנ – רובטאק מייל פ: פיתחו שתי שיטות נוספות[ 45]

י סצנטראופלו דווח המכיל בקצוות ספציפי לתוצר בסיסים 20-26

אם הוא במרחק ,סנציהרואולומולקולה היודעת להשתיק את הפ

בה טאק עובד הוא יישאר ' הפרוב מתוכנן כך שבטמפ. מסויים ממנו

ם כאשר הטאק יעבוד הוא מספיק ארוך כך שג, PCRהתוצר מחובר אל

כאשר , בזמן שהטאק עובד הפרוב עדיין מחובר[ 46]. ר מחוברהוא יישא

לבין המולקולה שמיסכה על דווחאק מגיע לפרוב הוא מפריד בין ההט

שיטה . ציהסנראויש עלייה בפלו פלמורככה בזמן ה. ציה שלוסנראוהפלו

מאוד ספיציפית כי הפרוב יישב רק על הגן שאנו מחפשים וכך ניתן

.שיטה מאוד יקרה. ן שלנולכמת את התוצרים של הג

יכול להיסגר על – יצור לולאה עצמיתן פרוב שיכול לתכנו, (תרגום חופשי) מגדלורשימוש ב –שיטה שלישית [ 49]

הפרוב הוא רצף ספיציפי לגן . עצמו ואליו מחברים שתי מולקולות שאחת זוהרת והשנייה ממסכת את פעילותה

לאנהלינג הוא' יתנתק מעצמו ועם הורדת הטמפ הוא בדנטורציה. תיוצר לולאה עצמאינמוכות ' שלנו אבל בטמפ

יהיה פרופורציונלי לכמות כך שהואליג וזוהר המתיישב בשלב האנ[ 50] .ר אל הטמפלייט כי נהייה לינאריבתחי

לשלב 'לינג יושב על התוצרים ובעת עליית הטמפנהבנינו פרוב שבשלב הא. הטמפלייטים שהוא יושב עליהם

ג אבל יותר נמוכה נלינאהמשלו יותר גבוה Tmה. ולא יזהרחזרה הוא יתנתק וייסגר על עצמו ההאלונגצי

.ולא יזהר כדי שיתנתק וייסגר אלונגציהמה

ו נאש DNAההבדל בין הריאקציות השונות יכול להיות בכמות הכאשר real time PCR יה של ריאצ[ 52]

על . יהיה יותר נמוך CQקספוננציאלית נמוכה יותר ולכן היותר נמוכה העלייה הא DNAת הוככל שכמ. פיםימוס

שלב האקספוננציאלי על הצורה הכי נכונה יש השוואה באמצע מנת להשוות ב

בהם םהינו מספר המחזורי CQ .מנת להימנע מרעשי רקע שונים של המערכת

היא להביא לאותה בין שתי דוגמאות אההשווהבעיה ב. שיאהדוגמא הגיע ל

תן את תא השיטה לאם יש טעות בכמות ההתחלתית , cDNAכמות של

מגיע מתוך , חייבים משהו שקיים בדוגמא שאליו ניתן להתייחס כקבוע. תוצאות הניסוי אלא את טעויות הדרך

גנים ידועים שלא משתנים במצבי סטרס אלא באים תמידית לידיי ביטוי ולכן לא משנה מצב הביטוי . הרקמה

אם -לעומת הגנים מהרקמה (house keeping gene)על כמות ההדלקה של גנים אלו תמיד ניתן להסתכל , שלהם

בפועל . תר גדולהזאת אומרת התחלנו עם כמות גנים יו גן השמורהגנים מהרקמה עלו במספר סיבובים יותר מה

והי ביקורת ז. גן השמורל PCRובמקביל אליה ביצוע PCRלכל רקמה מבצעים -RT PCR אנו מריצים ארבע

. DNAלבנות עקומת כיול על מנת לבדוק את כמות ה יש RT PCRב[ 53] .גנים על מנת לעבוד מולוה מותלכ

בכמות ידועה ועם מיהולים שונים על מנת לבנות עקומת כיול וממנה ניתן לקבל את DNAמודדים את כמות ה

כל הרצה .שהתקבל CQההגיע אל ל מנת הדרושה על DNAמה כמות הניתן לחשב ריאקציות המבכל אחת .CQה

.TR PCRמתחילה מתחילה מ real time PCRשל

.DNAטביעות אצבע של – 6.5.10

ניסיון -RFLP. וריאציות שונות בגנום של פרטים מסויימים, שונה בין פרט לפרט DNA - פולי מורפיזם[ 2]

חים קואם ל. רט אחד לאחרהשונות בין פ זיהוי, טרקציהסי שימוש באנזימי רי"עלזהות את השוני בין בני אדם

ימנע מאנזים ריסטרקציה את ,אפילו בנוקלואוטיד אחד ,השוני בגנום הגנום וחותכים באנזימי ריסטרקציהאת

אשר בעזרתו southernעים צבלאחר מכן מ. ם החיתוך בין הפרטיםהחיתוך עקב אי זיהוי ולכן יהיה הבדל בדג

, סניפ –שוני בנוקלואוטיד אחד : דוגמא[ 3] .יות בכל מקום בגנוםהשינוי יכול לה ,מזהים את השוני בדגם החיתוך

בגדיל הראשון , EcoR1של במקרה זה משפיע על אתר החיתוך. ספיציפי שינוי נוקלואטיד אחד באותו אתר

אחד האנזים מספר בפרט. southernבעזרת סניפים ניתן לגלות[ 4] .יהיה חיתוךואילו בשני לא יתבצע חיתוך

פרט שלוש, מקומות חיתוך שלו ישנם רק יים היה סניפ יחיד ולכןתש מספר בפרט, רבע מקומות שוניםיחתוך בא

י"הזיהוי נעשה ע .וכן הלאה סניפ שהוסיף חיתוך בעל

בפרט . פרוב אשר מגלה אזור מסויים בגודל מסויים

תר גדול כי נעלם אתר יו מזהה הפרובשמקטע השתיים

גבוה יותר -גדול ותרי מקטע זיהוי קבלהתחיתוך ולכן

המקטע פרט שלוש הוסף אתר חיתוך ולכן יהיהב. בהרצה

, שני מקטעים כי הוסף אתר חיתוך באמצע הפרוב ציגפרט ארבע י. ונמוך יותר בריצה קצר יותר שהפרוב מזהה

קלואטיד ניתן לדעת על שינוי בנו .קובע את הספיציפיות הפרוב. הפרוב מזהה שני אתרים ולכן יידלקו שני בנדים

מחלה -דוגמא[ 5] .י הפרוב"אחד או על אירועים של החסרה או הוספה של מקטעים מגודל המקטע שמזוהה ע

בהרצה על , בבניית פרוב מתוך כל הגן מתקבלים שני בנדים, נחתך בשלוש נקודות חיתוך WT. הפוגעת בגן גלובין

אה רק אדם בעל מוטציה יר. ם מתוך המריחהאת הבנד שאנו מחפשי המון בנדים ואילו הפרוב יזהה ל מתקבלים'ג

קצה המולקולה , נות עם פריימרים רדיואקטיבייםניתן גם כן לב RFLP-Tב[ 6] .בנד אחד כי חסר אתר חיתוך

כדי .שאנו רוצים ממנו את המוטציהמגבירים את הגן ,במקרה זה שלושה פרטים שונים. מסומנת רדיואקטיבית

על גביי הגנום שרק פריימר אחד מסומן רדיואקטיבית כך שיתקבל רק PCRליצור את הרצף המסומן מבצעים

נקודת החיתוך לאנו מתייחסים תמיד . לאחר מכן מבצעים חיתוך עם אנזימי רסטריקציה. קצה אחד מסומן

ביותר ןיהיה הקט Cפרט. מכיוון שהגדיל מסומן רדיואקטיבית בקצה הקרובה ביותר לפריימר כי היא זו שנראה

ל טובה לא לסריקת "יטה הנהש. גדול ביותר כי החיתוך שלו הגדול ביותר Bתוך קרוב אליו ביותר ואילו כי החי

.ם אלא למוטציות ידועות וחיפוש איך הן משפיעותגנום של

כך שנוצרים ( לרוב בשניים) הגנומי באנזימי ריסטרקציה DNAחותכים את ה: PLAFשיפור לשיטה הינה [ 7]

בעזרת DNAאולם הפעם מגבירים את ה .ות יש תוצרים של אנזימי הריסטרקציהפרגמנטים שונים שבקצו

לוקחים את [ 8] .ל יכולה לעלות על כך"כאשר יש שוני באתר ריסטרקציה השיטה הנ. פריימרים מסויימים

לאחר מכן לוקחים פריימרים אדפטורים היודעים להידבק . ו בשני אנזימי ריסטרקציהתוחותכים או DNAה

בקצה אחד עם אנזימי הריסטרקציה וצד שני בעל רצף שיהווה קומפלמנטרי לפריימר צרי חיתוךלאותם תו

חתכנו את הגנום בשני אנזימי ריסטרקציה ולכל . הרצפים של האדפטורים שיהוו פריימרים יהיו שונים, מסויים

הארכת .אנזיםפ הומולוגיה לאתרי ריסטרקציה של ה"החיתוכים מוסיפים פריימרים אדפטורים הנדבקים ע

המגביר מקטעים מסויימים שאנו בוחרים את PCRלאחר מכן מבצעים .הרצף הנמצאים בקצוות ברצף ידוע

לאחר מכן ניתן להגיע ליותר , אם תהיה התאמה תהיה הגברה אחרת לא תהיה הגברה, (Nהיכן שכתוב )הרצף

מספר הבנדים שניתן לקבל הינו גדול [9] .בפריימר ספיציפיות כאשר אנו מוסיפים את הנוקלואטיד הבא בתור

הפריימרים מתוכננים בצורה בה אנו יודעים את הרצף של .'3י משחק ב"מאוד וניתן לקבל שינוי במספרם ע

של הפריימר נקבל ' 3י הוספה ושינוי הנוקלואוטיד ב"ע, האדפטור והמשך רצף הזיהוי של אנזים הריסטרקציה

של הפריימר ' 3בגלל השינוי ב. קטינים את כמות הרצפים שיעברו הגברההגברה רק אם חלה המוטציה כך אנחנו מ

לקרובי משפחה יהיה דגם הגברה מאוד דומה לעומת שני . לא תהיה התאמה מושלמת ולכן לא תהיה הגברה

PCRב היה משחק עם הפריימריםכאשר PCRכל אחד תוצר -דוגמאות שונות 12[ 10. ]פרטים זרים לחלוטין

כל בנד שמופיע בפרט אחד ולא . לראות שינויים בין פרט לפרטניתן .שונים

אתר ריסטרקציה -לא ידוע עדיין איזה שינוי)מופיע באחרים מעיד על שינוי

כך ניתן לראות מה ייחודי לפרט (. או שוני בנוקלואוטידים שהוספנו

שינויים במקטעים השונים באים לידיי .מסויים ולא קיים בפרט אחר

ניתן לשלוט על מספר הבנדים שיתקבלו כתלות . טים השוניםביטוי בין הפר

כ "אותו מרקר בדר[ 11. ]'3במספר הנוקלואוטידים שאנו משנים בקצה ה

PCRניתן להגברה ב, יע על כרומוזום אחד ולא על שנימופ–דומניננטי

אם אותו הפרט הכיל לא ניתן לדעת . משני הכרומוזומים ולכן לא ניתן לדעת אם הפרט הומוזיגוט או הטרוזיגוט

. לא ניתן לדעת אם הסניפ בכרומוזום אחד או בשני או בשניהם בכלל. בשני הכרומוזומים ההומולוגיים את הסניפ

AFLP לשם זיהוי . דומיננטייםעדה לגלות פלימורפיזם ומגלה שינויים כרומוזולמלים ושיטה שנ היא

ר או הוספהומחס, ול לנבוע משוני באתר החיתוךהשינוי יכ. PCRולהגביר ב DNAיות יש לרצף את ההומוזיגוט

היכולת לחזור על הריאצקיה ולקבל את , האחרון מגלה יותר שינויים. או סניפ בבסיס הסלקציה של נוקלואוטיד

.אותה תוצאה היא חשובה מאוד כי כך אנו מוכיחים כי השוני נובע מהכרומוזום

מוטציה נקודתית ברצף של , שנוי יחידי בנוקלואוטיד אחד-SNP סניפים: הסוגים השונים של פולי מורפיזם[ 12]

חזרה . רצף של נוקלואוטידים החוזרים על עצמם אחד אחריי השני מספר פעמים בגנום – DNA .STRה

יש הרבה מאוד לוקוסים החוזרים . ואוטידים החוזרים על עצמם מספר פעמים בגנוםנוקל( 2-13)מסויימת קצרה

, פרט יש חזרות שונות הנובעות ממה שקיבל מהוריו בכל. ובצורות שונות בכל הגנום על עצמם בכמויות גדולות

שונה בין אינדיבידואלים , החוזרים על עצמם bp25רצפי נוקלואוטידים מעל -VNTR. תהליכי רקומבינציה

עד . ונותההבדל נובע מרקומבינציות ש, קרובי משפחה יהיו בעלי מספר חזרות דומה באזור מסויים בגנום. שונים

VNTR[ .13 ]מעל נקרא STRנקרא ( לא מספר הנוקלואוטידים החוזר על עצמו)פעמים שהרצף חוזר על עצמו 13

גן בעל אתר ריסטרקציה כאשר לאנשים חולים יש שינו בנוקלאטוטיד אחד , PCRי "ע: סניפים ילוישיטות לג

ם של הגן מקבלים שני בנדים כי ישנו חיתוך אנשים בריאים המכילים שני עותקי. ולכן אין אתר זיהו של האנזים

( הטרוזיגוטיים)עבור נשאים ,אנו נקבל בנד אחד כי לא יהיה אף חיתוך( הומוזיגוטים חולים)עבור חולים . כפול

[ 15] .דרך נוספת הינה שימוש בפרוב[ 14] .כ שלושה בנדים"נקבל חלק שיחתכו וחלק שלא יחתכו ולכן נקבל סה

יפי את המקום ל נוקלואוטידים המזהים באופן ספיצרצף ש-שימוש באוליגונוקלואוטידיםאפשרות נוספת הינה

התאמה וברגע שלא תהיה התאמה 100%י משחק בהיברידיזציה ניתן להביא ל"ע, שבו הם מגבירים DNAב

עקב מוטציה . התאמה לאי התאמה בודדת 100%ניתן להבדיל בין . מלאה לא תהיה התיישבות ולכן לא ייראה

לאחר , לקיחת גנום מפרטים שונים וקיבועו על ממברנה. כולה להיות אי התאמה מלאה ולכן לא תהיה הדלקהי

על מנת לראות האם . מכן סריקה עם פרוב לגן מסויים כך שכל הפרטים שלא מכילים את המוטציה יידלקו

הומוזיגוט בריא , פעם אחת הומוזיגוט למוטציה יידלק רק, הטרוזיגוט או הומוזיגוט יש שימוש בפרוב למוטציה

אנו מחפשים , תמיד יש לדעת המוטציה. יידלק גם כן פעם אחת בלבד ואם הטרוזיגוט יידלק בשני המקרים

.אנחנו יודעים בדיוק איפה המוטציה ומהי. בדיקה האם המוטציה קיימת או לא. מוטציה ידועה על גביי גנום

אפשרות אחת היא . ות אנשים החולים או נשאים למוטציהאנו רוצים לזה, מוטציה הפוגעת בגן מסויים[ 16]

ו את הגן שחשוד ומגבירים ממנ לוקחים את הפרט. את המוטציהשל כל הפרטים ולראות DNAלרצף את ה

ביצוע היברדזיציה עם , לוקחים את האנשים השונים. י שימוש באוליגונוקלואוטיד"זציה עדביצוע היבר-כחולה

הטרוזיגוט ייקשר בשתי -ניתן להגדיר מי נקשר למי וניתן לראות מי תואם למיהאוליגונוקלואוטידים וכך

לוקחים את הפרוב שמזהה , חיתוך באתר ריסטרקציה מסויים: שיטה נוספת[ 17] (.WTגם בשינוי וגם ב)פעמים ה

SNP .מקבלים את השוני בDNA הכללי של הDNA ונה המתקבלת היא של כל הגנום התמ. החוזר על עצמו

אם אין אתר , חחותכים את הגנום עם אנזים ריסטרקציה ושימוש בפרוב שמזהה את האתר. DNAיב טטלרפ

יש לשים לב כי הפרוב יתאים , אם יש אתר חיתוך הוא יידבק לשניים הקטנים, החיתוך הוא יידבק למקטע הגדול

אם יש דוגמא [ 18] .פ האורך יודעים האם יש לרצף מוטציה או לא"ע. לשני הקצוות מהצדדים של אתר החיתוך

לאחר מכן יש לבצע , דבר ראשון יש להשוות לקורבן ואם יש שוני הוא לא של הקורבן, שנלקחה מזירת הפשע

אם מתקבלת דוגמא זהה לחלוטין לחשוד ניתן להגיד כי . השוואה לחשוד מסויים עם בקרות לאנשים שונים

.מגיע מהחשוד DNAהדוגמא של ה

כך ניתן לקחת כרומוזום . DNAיב טטמרבית האתרים בגנום בהם קיים רפ ויפמי-PCRלרוב משתמשים ב[ 19]

י השוואה "ע[ 20]. ניתן להגביר מספר מקומות במקביל בגנום .אנו נקבל פרופיל של הגברה PCRמסויים ובהגברת

ניתן לראות את המקטעים שמגיעים , חשוד לאבא DNAבין אמא לילד ו

י אלימנציה של מה שיכול להגיע "מהאמא ומקטעים שמגיעים מהאבא ע

מהאמא ובתנאים מחמירים על מנת להגיד בהסתברות גבוה את קביעת

מכיוון שפרטים שונים , יש לדעת מראש את הרצף של הגנום .האבהות

ניתן לראות את מספר הפעמים שהם חוזרים על עצמם בעזרת VNTRב

הדיון הוא על גודל הבנדים שהוא . ל עצמםניתן לדעת את מספר הפעמים שהם חוזרים ע VNTRפריימרים ל

.אקוולנטי למספר הפעמים שהוא חוזר על עצמו

.תרביות תאים – 20.5.10

המהות שלהם ? מה אפשר לעשות איתם וכיצד הם משמשים אותנו, עבודה עם תרביות רקמה ותרביות תאים[ 1]

.איתם ומה ניתן לעשות

מחוץ לגוף עם לודיג ,החוצה הוצאה שלהםאת מרבית התאים וה המייצגת לקיחת רקמה שלמ-תרבית רקמה[ 2]

באים יחדיו תרבית רקמה נותנת קונטקס של רקמה שלמה אבל עדיין יש תאים ש. כל המרכיבים הדרושים

דוק בניתן לבצע בצמחים וניתן ל אותו הדבר. לול תאים ולא תא יחידתוצאות של מכ היוכקבוצה והתוצאות י

ברקמה אנו לא . 'ביטוי חלבונים וכוה על פעשה ,mRNAלרוב הפעולות יביאו לבידוד . בצמחים גורמים שונים

: רקמה תרבית לודידרישות המינימום לג[ 3. ]חיצוני לתא DNAנטיות כגון החדרת יכולים לבצע מניפולציות ג

יסוי צבע אלא הכל נאין כלל א)בחירת החלק מהרקמה לגידול , בחירת הרקמה אשר ניתן לגדל אותה ויטרו

ם שמדמים את הסביבה של הרקמה מלחי, צריך להכיל מקורות אנרגיה ,המתאיםהמדיום אספקת(. וטעייה

י הוספת אנטיביוטיקות "תנאים סטירליים ע. נכוןהרכב מלחים ,רמת חומציות', שמירה על טמפ. ההגיע הממנ

מנת ים ובחדרים סטירליים עלעבודה במנדפים סטרילי. שייפגעו במיקרו אורגניזמים אבל שלא ייפגעו ברקמה

מעבר לדברים הבסיסיים כגון הורמוני גדילה שבזכותם הרקמה מצליחה אספקה. להביא למינימום זיהום

כל כמה זמן יש להחליף את המדיום מכיוון . הייחודיות שלה כרקמה את להתרבות ולהתחלק ועדיין לא לאבד

: מתי ניתן לעקוב אחריי הרקמהאשר מרמזים עד יםיש מדדים שונ. ש ניצול של המדיום והפרשה מהרקמהשי

.ביטוי גן מסויים, התאים המתים זואח

לבודד תאים על מנת עם אנזימים לופיטו חת הרקמה כמו שהיאילק, עבודה על שורת תאים פרימריים[ 4]

נים מתאים שו תאים אלושל מקורם , סדרה של תאים במדיום התקבלה. רקמה מפורקת למרכיבים-ייםספיציפ

גם לרקמת תא בודד יש אורך . ךרלאורך כל הד עובדים אין תא בודד שאיתו-כבד, רידו, תאי אפיתל-ברקמה עצמה

. חשוב כל הזמן לרענן את המדיום. חייים והוא לא יותר משבוע מאחר והתאים לא מרגישים טוב ומתחילים למות

זאת ניתן לראות בעזרת חומרים שונים -לעיתים בעת רענון ניתן לקבל תאים שקיבלו חיזוק והמתים הוסרו

,(סרטן)מקור התאים יכול להיות ספונטני -החזקת סדרת תאים מתמשכת[ 5]. 'שעוקבים אחר אחוז החיים באוכ

איבדו את יכולת הבקרה על החלוקה והתאים מתחלקים כל תאים אלו. תאים בעלי מניפולציה כימית או וירלית

, ניתן להקפיא את התאים מכיוון שגם אורך הרקמה הזאת הוא שבוע(. דתא אח)כל התאים זהים במקורם -הזמן

התאים האלו מכילים מניפלוציות על הגנום . כולם מאותו מקור לאורך זמן-כך שניתן לעבוד עם אותו סוג של תא

לים גד. גרעין ענק-היחס בין גרעין לציטופלזמה משתנה. וחשוב לדעת מהו כדי להבין את הרקע הגנטי והמולקולרי

-תאים שונים דורשים צפיפות שונה. יש להפיק ולרענן אותם, מיליון תאים תוך יומיים 6ניתן להגיע ל, מהר מאוד

תאים . יהיו תוצאותשים מגע בין תא לתא ויש להכיר את תכונות התא אחרת לא רחלק דורשים מרחב אחרים דו

המקור אבל הם לא מבטאים את הגנום אנו יודעים את –הזהות הרקמתית שלהם אלו מאבדים בשלב מסויים

ניתן לנתח חיה או להזמין [ 6] .'להשתיק גנים וכו ,אלו ניתן להחדיר גנים חיצונייםבתאים . הייחודי לרקמה

אינדיקטור לחומציות והינ וום שאנו עובדים איתרוב המדי. משאירים פתח לאוויר, בכלים שונים גידולםרקמות ו

(.תהאדום טוב ורוד חומציות השתנ)

ומחקר איך התא החסרת גן מסויים , מודל להבנת תהליכים ביולוגיים בסיסיים .ברקמות תאים שימוש[ 7]

לעומת זאת אנו לא יודעים את , זה ייקח הרבה זמן ואילו ברקמה זה יהיה מהיר שלמהבחיה . מתנהג ללא הגן

ולכן ניתן ללמוד על ל גןש ביטוי גדול מדייתן לפתח תאים שמדמים מחלה נ. ההשפעה על החיה השלמה

כל תרופה , מהתאים מתים 50%באיזה ריכוז מסויים -ניתן לבצע מבחני רעילות. ציה בין חלבון לחלבוןקהאינטר

.ביצוע מניפולציה ברמת הגנום ולראות כיצד משפיע, הבנת תהליכי סרטן. שמפותחת חייבת לעבור מבחני רעילות

לציות על התאים ולייצר אותם וביצוע מניפ. לימוד על הוירוסים, םבוירולוגיה שימוש מרובה ברקמות תאי[ 8]

לא עוברים ,החלבונים לא ממיסים בכמות גדולה ההבדל ממערכת חיידקים הינו כי רוב, לטובת התעשייה

לקחת תא -ריפוי גנטי. גליקוליזציות שחשובות מאוד לקיפול החלבון ולכן יש שימוש ברקמת תאים ולא חיידקים

.יצוע מניפולציה גנטית והכנסת התא חזרה לגוף כדי שיחליף את התא הדפוקתוך כדי ב

החדרה של . ביטוי חלבונים לגן דווח, הפלסמיד יכול לתת מצב לביטוי חלבונים בתא, החדרת פלסמיד לתא[ 9]

DNA שימוש במערכת : נותנת אפשרות להשתקת גניםRNAI פת גן פנימי בגן החל-או רקומביציה הומולוגית

: DNAהחדרת . מה החלבון גורם לתא, מחקר על החלבון, ניתן לבטא חלבונים בכמויות מסחריות. צוניחי

הפלסמיד (1) :שתי צורותההחדרה יכולה להתבצע ב. י וירוסים"חיצוני לתאים לא ע DNAדרת הח-טרנספקציה

זהו , ן יבוא לידיי ביטוימצא בתא החלבובקרה נמצאות עליו וכל עוד הוא נהערכות מכל , פלסמיד בגרעיןנשאר כ

אינטגרציה -יד לתוך הגנוםהחדרת הפלסמ (2). זמני ועם הזמן הפלסמידים ימהלו כי הם לא עוברים שיכפולמצב

י הכנסת עמידות למרקרי "מבוצע ע. מתקבל תא טרנסגני כי קיבל גנום חיצוני ויבטא תמידית את החלבון, לגנום

. DNAסלקציה למרקר בהנחה שיניחו את החדרת ה ורתאים שעב י סריקה של התאים נבחר"סלקציה שונים וע

יכנס שיעתוק הוא צריך לה ריתחיל לעבו DNAעל מנת ש [10]. ההחדרה תלויה במטרה שלשמה אנו חוקרים

. ממברנת הגרעין מתפרקת ובעת חלוקת תא ב הפלסמיד יכול להיכנס. ד צריך להיכנס לגרעיןהפלסמי ןלגרעין ולכ

ממברנת גרעין יש הכנסה אקראית של הפלסמיד פנימה ולכן כאשר נוצרת מחדש

, פלסמיד מכיל פרומוטר. ותמניפולציות על תאים שלא מתחלקים כמעט ולא אפשרי

ORIו, cDNA, להכיר ותשמערכות היונקים יודעמסוג חייב להיות הפרומוטור

חשיפת התאים [ 11] .עמידות לאנטיביוטיקה, חיידקי אם הגיע מחיידק

, התא יקבל עמידות לאנטיביוטיקה בשלמותו DNAעקב הכנסת ה ,וטיקהלאנטיבי

אין שליטה על . לגנוםהוחדר DNAי סלקציה לאורך זמן נקבל תאים בהם ה"ע כך

לכן אנו מייצרים . נסים לגנוםשנכ (בלשון אורי עבדו-קופאים)עותקים מספר ה

כל תא יכול להיות בעל מספר עותקים ן שמכיוומות ביטוי זהה וים מתא בודד כי אנו רוצים לקבל כתא תרקמ

[ 12] .חשוב לשלוט על חוזקהשלמשל חלבון יכול להוביל להשתקה אשר . שונים ובהתאם הביטוי של החלבון

פשרות א. והממברנות DNAק עם המטען של המשח קלציום פוספטשימוש ב . לתוך התאים DNAהחדרת ה

נכנס DNAוה של התאאשר עוברת איחוי עם הממברנה ממברנה ליפידית -ליפוזוםב DNAאחרת היא עטיפת ה

יש צורך בחדירה נכונה על , פנימה DNAלהזריק את הבתאים גדולים ניתן . שוק חשמלי-אלקטרופורציה. פנימה

, שיטה ביולוגית. באולטרא סאונד ןשיטות נוספות הינ. חודר ממברנות אשר ירי בליסטי. מנת לא לפוצץ את התא

.בוירוסים י שימוש"ע טרנסדציה

, ממוסך וכך הוא יכול לחדור לתוך הממברנה DNAהמטען של ה קלציום כלורידבנוכחות – שיטות כימיות[ 13]

מולקולה גדולה -דקסטרן[ 14] .לאחר כמה זמן יש החלפה של המדיום כדי לבטא את התאים שקיבלו את הגנום

י "הננא ע ה שלניתן לבצע הכנסאת הדקסטרן ולכן התא מזהה, DNAמבטלת את מטען השבעלת מטען

הוא עובר איחוי עם . נסגר בתוכן DNAממברנות שה, ליפידיםימוש בש[ 15]. פנימה DNAקליטת ה-אנדוציטוזה

י "שיפור יעילות מתקבל ע. פנימה DNAזוהי השיטה הנפוצה ביותר להחדרת ה. ממברנת התא וכך נכנס פנימה

שיטה נפוצה . י מחט"מיקרו החדרה עDNA. [17 ]רנה והחדרת הערעור הממב-אלקטרופורציה[ 16] .שינוי תנאים

. בתאים של צפרדע וזבובים

גרעין הנקבי הלאחר ההפרייה יש ניקוי של רחם הנקבה ולקיחת תאים ש עכברים טרנסגנייםעל מנת ליצור [ 18]

לנקבה המוחדרת י מיקרו החדרה מחדירים את הגן הרצוי ולאחר מכן מכניסים את הביצה"ע ,והזכרי לא התאחו

.כעובר היידע לקלוט את הביצה ויתייחס אלימחייב שהרחם -לית שמדמה פסאדו הריוןנואחרת מעורערת הורמ

חלק מהביצים מתות , ביצים מופרות מכיוון שלא כולן ייקלטו ברחם 50-60כמובן שלא מבצעים ביצה אחת אלא

שהוחדר DNAצאצאים אלו הם -קבלת צאצאים לאחר מכן. ייכנס לגנום DNAולא בכל הביצים ה לפניי כן כבר

ף צריך להכיל את זאת אומרת כל תא בגו-בתא הבסיסי

החיצוני DNAשה תאים-PCRצעים לוקחים תא ומב. הגן

אפשרות אחרת PCR .[19 ]הגברה ב אליהם יתנו דרהוח

ליצירת עכברים טרנסגניים היא טרנפורמציה על תאים

ה על עכבר בו אנו לציכאשר רוצים לבצע מניפו. עובריים

נבצע . מש בשיטה זומהגנום אנו נשתמחסירים גן שלם

חשוב מאוד לבצע . על התאים העוברייםמניפלוציות

עכבר לבן למשל -ות על גנים בעלי מרקר חיצונימניפולצי

. קבל עכבר שחור עם פסים לבניםומקור הביצית שחור נ

בשיטות , לוקחים מעכבר ביצית בשלב הבלסטוצית

ומכניסים inner cell massטיות לוקחים את האנזימ

כעת ניתן לבצע מניפלוציות . כל תא בעל יכולת ליצור את מרבית הרקמות של העכבר השלם, אותו לצלוחית פטרי

ל ומזריקים אותם "לוקחים את התאים הנ. י סלקציה ניתן לקבל תאים עובריים שחסר להם גן אחד"ע. על הגנום

ם שייצרו חלק מסויים מהעכבר חלק מהתאים המוחדרים הם תאי. אותם כתוספתמזריקים -קבה בהיריוןנל

חלק נוצר מביצית המקור של העכברה האפורה וחלק מהרקמות נוצרו מהעכברה -עכבר כימרהמתקבל . השלם

יהיו הצאצאים שלהם .כעת מכליאים עכבר כימרה עם עכבר חיצוני. הלבנה שעליה ביצענו את המניפולציות

בעל מניפולציה וחלק ללא DNAבגונדה ניתן לייצר תאי זרע בודדים שנוצרים מ עכשיו. בניםאפורים ול

יצור שימוש בשיטה זו על מנת ל. שעבר מניפולציה וחלק רגילים DNAמניפולציה ולכן חלק מהצאצאים יהיו בעלי

וא מבטא חלבון הוחדר בשלב הפרו גרעין ה DNAה בהם במקרים אחרים[ 20] .עכבר שלם חסר גן זה או אחר

כל , ל הכבשהשהזרקת הגן בפרו גרעין , ם של חלבפרומוטר לעטיני למשל. לביטוי ברקמה מסויימתתחת בקרה

יבוא לידיי זאת אומרת הוא יבוטא רק בהתאם לפרומוטר גןהמוסף אבל ה DNAאת ה שכל תאי הכבשה מכילים

. ולכן יתקבל חלב עם החלבון המבוקש בלבד ביטוי בעטינים

מכבשה אחרת לקחו . לקיחת כבשה והפקה ממנה תא בוגר-דולי תהליך של שיבוטת היא רמניפולציה אח[ 21]

הגרעין שהוכנס הוא גרעין מתא בוגר . ביצית והוציאו ממנה את הגרעין

השתלת הביצה ו 2לאחר מכן החדרת הגרעין לביצית כבשה . 1של כבשה

זאת 1של כבשה הצאצאים שיוולדו יבטאו את הגנים . חזרה בכבשה

.1משובטים של כבשה הינם צאצאים 2אומרת הצאצים של כבשה

, כגון מתילציות שונות DNAות יש שינויים של החלאורך ההתפת

טוי בגיל הבוגר הפריע לביטוי גנים שצריכים לבוא לידיי בי DNAה

שיבוט . מכיוון שהם היו מושתקים כבר נהצעיר והתפתחות גנים תקי

ייצר קלון זאת אומרת הצאצא שייצא בסוף יהיה המטרה היא ל-חיה

ביצית י לקיחת"עושים זאת ע. כמעט זהה לחלוטין לאמא השחורה

תמיד צריך לחפש מרקרים שיעזרו לזהות את )מאמא אחרת לחלוטין

לבדוק יהיה שבשלב הסופי ניתן כך, ההחדרה או המניפולציה שעשינו

אמא הומ( לעין בפנוטיפים נראים שימוש י"עאת הגן של הצאצא

ם את הגרעין לביצית מחדירי(. שחור)לוקחים תא ואת הגרעין ממנו

שוק חשמלי אשר עוזר בהחדרת הגרעין פנימה והוא םהריקה ונותני

.משתילים ברחם של אמא לבנה וממנה נזהה את הצאצאים השחורים. נותן את האות להתחלת חלוקה

צריך להכיל מערכת ? מה צריך להכיל הפלסמיד, לבון שאנו רוציםניתן ליצור תאים שבהם ניתן לבטא את הח[ 22]

רים שמגיעים מוירוסים שפוגעים ורים הם פרומוטורוב הפרומוט. של פרומוטרים בעלי ייחודיות לתאי יונקים

מוסיפים בוקטורים אינטרון שיודע לעבור חיתוך אחרת הגן , Aפרומוטור ויראלי שמסתיים בפולי . בתאי יונקים

בתוך הפלסמיד הזה יש סיומת ויראלית ואינטרון . מערכת האינטרון הינה בקרת איכות-א לידיי ביטוילא יבו

בתאי יונקים יש . שיבוא לידיי ביטוי RNAייחתך החוצה ויתקבל ה ,חלק מהגן עצמו כך שיעבור שיעתוקכ

כל -וקטורי ביטוי. ההפלסמיד לא יכול להיכנס לגרעין סתם ככה אלא רק בעת חלוק. חשיבות להוספת אינטרון

דבר צריך להיות מותאם לאותו מין למשל פרומוטור חייב להיות ספיציפי לאותו אורגניזם כך שהוא יוכל לזהות

חלק מתהליך בקרת איכות -ואינטרון Aבמקביל שמים פולי . בבני אדם יש שימוש בפרומוטורים של וירוס. אותו

. יטופלזמהלא ייצא החוצה ויגיע אל הצ mRNAאחרת בלעדיו ה

החלבונים יכולים להיות ,מערכת בה ניתן לבטא חלבונים בתוך התאים[ 23]

את העמידות לאנטיביוטיקה . הגנים ביטוישיהיה גן דווח ל GFPרים לבומח

פלסמיד אחד שיכיל רק עמידות , ניתן להכניס על פלסמיד אחד או שניים

הפלסמידים מהמקרים שני 99%ב, והפלסמיד השני יכיל את הגן מוחדר

יחדרו יחדיו לגרעין כך שהעמידות למרקר סלקציה תצביע על קבלת שני

-ביצוע סלקציה עם אנטביוטיקה יש תאים יציבים קבלתלשם . הפלסמידים

הכנסת גן לסלקציה וניתן לייצר קו יציב כך שברגע שתהיה אינטרקציה לגנום

.ניתן יהיה לסלק את אלו שלא קיבלו את הגן

-פ סדר גילוי"הגנים הדווחים מסודרים ע .ים דווחיםשימוש בגנ[ 24]

אחד התוצרים פולט אנזים המבצע ריאקציה ש-פרזלוצי. בצמחים יש וריאציה אחרת, גלוקטזדאז β ,כלורפניקול

שימוש . התחיל בירוק וכיום יש צבעים שונים, צנטיסראושהינו פלו GFP ,אור שניתן למדידה בספקטרופוטומטר

. מיקום החלבון או אינדיקציה ליעילות הטרנספורמציה, רובעת בדיקת פעילות פרומוטבגנים דווחים נעשה

. חלבון בתוך התאהמיקום את לבדוקש ממש גן דווח. ון וגם הגן דווח הולכים יד בידההנחה היא כי גם הגן לחלב

וח יכול להיות הגן דו. שניתן לראות ויזואלית את החלבון שאנו מחפשיםכך לגן החדש יםתכונה שאנו מעניק

שנראה אותו י צנטסראומאוחה לאנזימים מסויימים כך שאת הריאקציה נראה בעין או שיהיה חלבון פלו

י רופקט זיהוי, זיהוי ואיפיון פרומוטור-ורשימוש נוסף הינו בדיקה של פרומוט. צנטיסראובמיקרוסקופ פלו

ואם הגן מבוטא במערכת הוא יעיד על פעילות ר של גן דווח וניתן לקחת פרומוט-זיהוי מבנה תלת מימדי, שיעתוק

על , האם שני הפלסמידים אשר החדרתי נכנסו לתא-שימוש אחרון הינו בחינת הטרנספורמציה. הפרומוטור

GFPלעתים ה. שני הפלסמידים ייכנסו יחדיו 99%פלסמיד אחד נמצא גן דווח ועל הפלסמיד השני שאר הגנים כי ב

: שתי מערכותגני דווח שבהם משתמשים ניתנים לחלוקה ל. חרים או לפעילותםיכול להפריע לביטוי חלבונים א

פניקול םי בדיקת הכלור"לכלורם פניקול וע טהינו אנזים שמוסיף קבוצת אצט CAT. טיםצנסראוכימיים ופלו

באורך קולט אור לוקסירז. גלקטוזידאז βדומה ל גאס. ניתן לקבל צבע כחול גל β. פעילות של האנזיםניתן לזהות

חלבון שמגיע ממדוזות וכאשר GFPטים צנסראובוצה השנייה היא קבוצה של חלבונים פלוהק. גל מסויים

.מקרינים את החלבון באורך גל מסויים הוא מחזיר אור באורך גל שונה

האורך גל שבהם הם קולטים את , מבעלי חיים שונים נוספים חלבונים זוהו GFPמאז הזיהוי הראשוני של [ 25]

מתאר -ירוקים, צהובים, יש חלבונים שיכולים להיות אדומים. אנרגיה הוא שונה ולכן ניתן לקבל צבעים שוניםה

יש הרבה חפיפה באורכי הגל .את האורכי גל שבהם ניתן לערער את המולקולה ואת האורך גל שהם פולטים חזרה

. ע לשימוש בירוקים או באדומים בנפרדכלל אצב. ולכן אין שימוש במספר חלבונים במקביל( ת שהפיק שונהלמרו)

.ביצעו המון מניפולוציות גנטיות הפכו אותו למקרין בצורה חזקה יותר GFPעל

שלו RNAבהנחה כי הגן מבוטא ה, (בעת חלוקת התא)הכנסה לגרעין , חים פלסמיד עם הגןקול-גן ריפרטור[ 26]

במקרה זה ניתן לראות את התא בצביעה . ת הגןניתן לראות את התא שקיבל איטוי וכך מבוטא ויבוא לידיי ב

את הפעילות דלזמה ובניסויים במבחנה ניתן לבדובמקרים אחרים ניתן להפיק מהתאים את הציטופ. מסויימת

הפקת הציטופלזמה והוספת , התאים יזהו את הפרומוטור, החדרת הקאט לפלסמיד ,קאט[ 27] .האנזימתית

כרומוטוגרפי ניתן לראות הדלקות של כלורם פניקול כלורם פניקול ובהרצה על גביי נייר

קבלת כלורם . אנו בודקים את נוכחות האנזים בריאקציה. אשר בא בריאקציה עם הקאט

ק מגחלילית אם מספקים לו הופ – לוציפרז[ 28]. י האנזים"פניקול שעבר מתילציה ע

וניתן לקמט את פליטה באורך גל מסויים לוצפרין וחמצן נותן תוצרסובסטרט ,אנרגיה

ניתן . החיסרון של שיטה זו הוא בכך שהיא מאוד יקרה והוא מוגבל למקרים של מבחנה. פעילות הלוציפרז עצמו

את הציטופלזמה לוקחים את התא מפוצצים אותו ומפיקים . לבנות אורגניזם שלם שתהיה בו פעילות של האנזים

ון את חכדי לב GFPהשימוש ב[ 29] .הריאקציהיה של נצרסאומוסיפים את הסובסטרטים ובודקים את הפלו

שני החלבונים האלו נמצאים .קבלת חלבון חדשלניתן לאחות את החלבון לגן -המיקום של החלבון בתוך התא

י הקרנה באורך גל מסויים ניתן לראות את "וע GFPכחלבון חדש ובשיטה זו החלבון לא מפריע לקיפול של ה

של יבודקים את האם האיחו. לבד GFPהבקרה היא תמיד לקחת . ם יחדיומכיוון שהם נמצאיהמקורי החלבון

יהיה בכל מקום בתא מכיוון שהוא מאוד קטן יחסית ויכול GFPלרוב . GFPהחלבון הביא לשינוי במיקום של

אם גן האיחוי מכיל דומיינים שאחראים להוליך אותו . לעבור בתעלות בממברנת הגרעין ולכן יהיה בכל מקום

GFPלאחר מכן ניקח האת הדומיינים ונצמיד אותם ל. במקומות אלו GFPמסויים אנו מצפים לראות את למקום

אנו מצמידים את ,מדידת פעילות פרומוטורב הוא GFPב שימוש נוסף. ו באותם מקומותונצפה למצוא אות

-GFPתאים היו בעלי ניסוי בעכברים בהם כל ה[ 30] .ייראה GFPלפרומוטור והיכן שהפרומוטור מבוטא ה GFPה

לא טוקסי לבעל GFPכמעט לרוב ה, לרוב לא פוגע בחיוניות התא ובאורגניזמים השלם GFP, טיםצנסראוהיו פלו

ניתן -גל βטרנספקציה ל ורדוגמאות של תאים שעב[ 32] .דוגמאות[ 31] .חיים ולכן הוא גן דווח מאוד נוח לעבודה

.גל βת של להוסיף את החומרים למדיום ולראות את הפעילו

פ הסיומות המאפשרות ביטוי "לקיחת פרומוטור מסויים וחיבורו אל הגן דווח ע-בדיקת פעילות הפרומוטור[ 33]

ים מחסרים מקטע. DNAנמצאים על הש ורים החיוניים שנקראים ציס אלמנטכדי לזהות את האז. של הגן דווח

ות אזורים שמבקרים ברמת האקטיבציה וברמת י החסרת אזורים ניתן לזה"ע. ים אותם לגן דווחומאח DNAשל

לפעמים יכול להיות מצב בו . לרוב ניסויים כאלו דורשים גן שידווח על רמה של הטרנספקציה עצמה. הרפרסיה

לכן חייבים בקרה פנימית בתוך כל המערכת . נראה הבדל בפעילות הרפרטור אשר יכול לנבוע משינוי בטרנפקציה

. ניקח גן דווח אחר אשר נמצא תחת פרומוטור קבוע אותו נמדוד גם כן. כל המערכתאשר על פיו ניתן לאפס את

ואליו ניתן להשוות את מראה לנו את יעילות הטרנספקציה פרומוטורים אשר לא נעשו עליו פעולות של החסרה

בקרה אם אנחנו לא רואים הבדל בין ה. פ הבקרה"כך ניתן לאפס את המערכת ע ,שאר ההחסרות והמניפולציות

בניסוי של ההחסרה יש . לבין הפרומוטור שלא עבר שינוי זאת אומרת שההחדרה היא באותם אחוזי הצלחה

החדרה של הגן דווח אשר מוחדר גם כן בניסוי הבקרה ולכן אם היחס

בחלק [ 34] .נשמר זאת אומרת אותו יחס של פלסמידים נכנסו לתאים

DNAאורך האלא גם ל DNAמהמקרים יש חשיבות לא רק לרצף ה

הפרומוטור נכון וכך ניתן להביא לפקטורי שיעתוק אשר גורם לקיפול

במקרים של החסרה אין אנחנו יכולים לדעת אם יש . מקום להתחבר

פקטור שיעתוק או שחיוני אליו יתחבר ה DNAרצף של -ציס אלמנט

מ לשמור על אורך "עשונה DNAרצף עםליצור את גן הבקרה יש לכן. DNAשהחסרנו רצף חשוב לקיפול ה

חפיפה בין מקומות בהם יש ירידה בפעילות ניתן החסרה והי ה"ע. ובדיקת פעילות הפרומוטור בגן דווח DNAה

.למפות את האזורים שהם חיוניים לבקרת הפרומוטור

ברמה של אנטיביוטיקה יש . צריכים מרקרי סלקציה שיעזרו לזהות את התאים שקיבלו את ההחדרה של הגן[ 35]

שימוש נוסף הינו על . ויש את האנזים המבצע לו אינאקטיבציה 80Sגזרת של נאומיצין אשר מעכב א הריבוזום נ

בעת החסרת האנזים , ביצירת מרכיב חיוני בתאבניין החסרה של גן מסויים החיוני ליצירת אבן -מטבוליזם

יב שהאנזים מסנתז באופן התאים ימותו אולם אם אנו רוצים לגרום להם לחיות ניתן לספק להם את המרכ

י המעקף ישרדו כי יש להם את הסובסטרט "התאים למרות שהם חסרים באנזים ע. אין צורך באנזים-חיצוני

אם לוקחים תאים וחושפים אותם לחומר מסויים הוא . מבצע פוספורילציה – אנזים טימידין קינז[ 36] .הסופי

התאים ימותו כי . אותו חומר יודע לעכב את יצירת טימידין ,מעכב יצירת ניאוזין: מונע פעילות בשני מסלולים

י אנזים אחר ובמסלול "הה עוניתן לעקוף זאת ולספק לתאים חומר חיצוני אשר יז. אין יצירת נוקלואטידים

אם אנו רוצים ליצור מערכת סלקציה חיובית או שלילית נותנים . היקפי יודע לסנתז את הנוקלואוטיד החסר

האמינוטרין מעכב מסלול ולכן באספקת טימידין חיצוני . HATהמדיום נקרא [ 37] .ייםלתאים מדיום מסו

וטימידין קינז יהיה מעקף ובהוספת היפוקסדין עם האנזים הנמצא בתאים יהיה סינתוז של הנוקלואוטידים

ס את אם רוצים לעשות סלקציה לתאים שקיבלו את הפלסמיד על התאים ניתן להכני :עקרונות[ 38] .החסרים

סלקציה בה בחרנו באופן חיובי כמו . האנזים והוא ייכנס לתאים וכך עם המדיום הוא יוכלו להיות עמידים

תאים אשר ביצענו עליהם מודיפיקציה לא קיבלו את -סלקציה שליליתניתן לשימוש גם כ[ 39]. אנטיביוטיקה

ד שהטימיין קינז משתמש בו לשם נוקלואוטי-BRDUחושפים את התאים ל. הפלסמיד ואיבדו את הטימידין קינז

הוא טוקסי לתאים כתוצאה BRDU. אולם נוקלוטאוטיד כזה הוא טוקסי DNAיצירת נוקלואוטידים ל

ברגע שהפלסמיד פוגע בחיוניות התאים -תאים יש אינטרס לזרוק את הפלסמיד החוצהללכן . מסינתזה מחומר זה

.בוד המרכיב המכיל את הטימידן קינזאי-י מניפולציות שונות"מסוגלים לזרוק אותו החוצה ע

מתן תכונה – סלקציה שלילית, אנו מקנים תכונה לתא שנותן לו יתרון על פניי תאים אחרים – סלקציה חיובית

עמידות לאנטיביוטיקה בתנאים של היאלמשל סלקציה חיובית . רון שלילישבתנאים מסויימים ייתן לו ית

במטבוליזם התכונה שאשר נתנו לתא גורמת לו להיות טוקסי –שלילית סלקציה. אנטיביוטיקה הם יהיו עמידים

.ולכן נותנת לו פחות יתרון

יכול להיות קצוות פנימה או קצוות . נוק אאוט גן, ניתן להחסיר את כל הגן מהגנום עצמו: השתקה של גן[ 40]

החדרת . RNAIאו RNAטיסנס אנ: שתי שיטות חדשות יחסית. אנו רוצים לבדוק חיוניות גן לפעילות-החוצה

לגן ספיציפי RNA RNAמסויים שיכול לגרום לפגיעה ב

וא האנדוגני שאליו ה

ניתן לקחת את . מכוון

, חסיר את הגןהלהגנום ו

בשיטה שנייה אנו

האנדוגני RNAפוגעים ב

.של התא

ביצוע נוק אאוט [ 41]

שימוש בטימוזים ,לגן

אנחנו רוצים ליצור . קינז

לו עכבר שהחסרנו

ביצוע מניפולציות -י לקיחת הבלסטוציט הפקת תאי גזע עובריים"ניתן לעשות זאת ע-מהגנים מהגנום עותק אחד

של תאי גזע עובריים כך שבסופו של התהליך יהיה עכבר חסר ' יצירת אוכ, עליהם והחסרת עותק של גן מסויים

-שימוש ברקומבינציה הומולוגית: נהמה אנחנו עושים במבח-הגן שהחסרנו המקור שלו הוא מההחסרה במבחנה

אם נקבל את . שמכיל את הגן שלנו עם אזור הומולוגי DNAפלדסמיד PCRבתוך המעבדה אנחנו מייצרים ב

ישנם מקרים שלמרות . י רקומבינציה הומולוגית הכנסנו גן שיפריע לקריאת הגן"המחדר נכנס ע-המצב הסופי

ואלא אשר לקיחת תאי גזע עובריים במצע אנטיביוטיקה. בגנום ההומולוגיה הוא יכול להיכנס למקומות אחרים

ניתן . יכול להיות שהוא ייכנס למקום אליו כיוונו או למקומות אחרים-DNAמקטע ה שרדו הם בעלי הכנסה של

אם תהיה . י פריימרים שאחד בגן לעמידות והשני מחוץ למקטע ההומולוגי"בדיקה ע-PCRי "לבדוק זאת ע

ל תוצר במקומות אחרים בהם לא ייכנס למקומות נכונים הפריימר השני לא יישב במקום הנכון החדרה נכונה נקב

מצד שני ניתן. ולכן לא יתקבלו הגברות וכך ניתן לברור את התאי גזע העובריים שבהם יש החדרה במקום הנכון

אם הייתה . זקיני שימוש בגן לטימין "רמת תאי הגזע העובריים עבלברור י שימוש בסלקציה השלילית "ע

ת לגן שאנו רוצים נקבל החדרה של הגן לעמידות לאנטיביוטיקה ושום דבר מהטימידין רקומבינציה הומולוגי

על מנת . במקומות בהם הרקמבוניציה לא הומולוגית הוחדרה העמידות לאנטיביוטיקה וגם טימידין קינז, קינז

בתאים בהם אין טימידין קינז הם . נטיביוטיקהלואוטיד הטוקסי והאבדיל בין התאים צריך לתת את הנוקלה

אזור של , גן שאנו רוצים לפגוע בו[ 42] .ישרדו ואילו אלו שבהם אין החדרה נכונה יהפכו להיות טוקסים

יכולים להיות מספר . הומולוגיה אשר באמצע יש החדרה של עמידות לאנטיביוטיקה ובקצה טימידין קינז

בסופו של דבר . השני החדרת הטימידין קינז גם כן או אי החדרה כלל. נכונההראשון החדרה הומולוגית : מצבים

.יישארו תאים מההחדרה הראשונה כי השאר ימותו בעת חשיפה לאנטיביוטיקה וטימין קינז אשר יהיה טוקסי

הבסיס להשתקה זו הינו וירוסים וחיידקים אשר משתמשים במערכת זו ולכן בתאים . RNAי "גן ע תהשתק[ 44]

התאים פיתחו מערכת הגנה כנגד וירוסים . י הטבע"מנגנון השיטה פותח ע-קיימת מערכת אנזמים למניפולציה זו

.RNAהחדרת דו גדיל לש י מניפולוציות"ע RNAהשתקה של – RNAI[ 45] .ביצוע תיעול להנדסה גנטית-'וכו

יכולים להשתיק גנים שהם חלקים בגנום שלנו שמסונתזים ו RNAשנקראים מיקרו RNAישנם בתאים

עוברים עיבוד מסויים , במערכת שלנו RNAנוצרים , מערכת בקרה נוספת על ביטוי גנים. גניים בגנוםראנדו

ובסופו של דבר מביא

איך שתי . להשתקת גנים

? ל עובדות"המערכות הנ

וסינתוז RNAאיך לוקחים

דו RNAההופכי שלו או

? גדילי עובדים בתוך התא

רו בעיקר מאחר ומיק

RNA נית גהינו תכונה אנדו

לגנים מסויימים קשים

מאוד לשימוש עבור גנים

. שאליהם הם לא מכוונים

ניתן RNAגדיל כפול של

לכוון אל כל גן שאנו

אותו גדיל כפול -רוצים

ישתיק כל גן מטרה שאנו

.דו גדילי RNAהשימוש הרחב בהנדסה גנטית הוא ב, RNAלדו גדיל RNAIל RNAיש הבדל בין מיקרו . רוצים

RNAומיקרו RNAיביא לדרגדציה של RNAדאבל סטרנד -RNAיש לנו שתי מערכות שיכולות לגרום להשתקת

ו ואיל RNAהדאבל מביא לאנזימים שיחתכו את ה. RNAשתיהן משתיקות את ה-RNAיעצור את תרגום ה

לקיחת הגן שאנו רוצים , RNAין בפלסמיד ניתן ליצור הרפ .ן אין קבלת חלבוןבשתיה, המיקרו עוצר את השיעתוק

וקבלת לולאה 5ל 3לינקר ו 3ל 5. כך שייסגר על עצמו יצירת קומפלמנטריות בקצוות-לולהשתיק ויצירת הרפין ש

המסלול . י אנזים והוא יכול לצאת מהגרעין החוצה"נכנס לגרעין מזוהה ע. שנסגרה על עצמו והכנסה לפלסמיד

י קובץ חלבונים והוא מקצץ "מזוהה ע RNAהמיקרו . RNAסטרנד והתחתון דאבל RNAהעליון הוא מיקרו

3UTRי חלבון אחר והוא מוליך אותו אל מקום בגנום בדרך כלל ב"נוקלואטודים אשר מזוהים ע 21-22אותו עד ל

18נוקלואוטידים חייבים 22מתוך . של הגנום אשר קומפלמנטרים לגן אשר הוא אמור להשתיק אותו

הוביל ליצירת RNAאותו מיקרו , ולכן מונע תרגום RNAהוא מתלבש על ה-מהנוקלואוטידים להתא

הוא מזוהה RNAבדאבל סטרנד . RNAנוקלואוטידים אשר מזהים אתרים קומפלמנטרים ומתלבש על הגואולי

י "הקומלפמנטרי שלו וברגע שהוא דו גדילי יש חיתוך ע RNAי דייסר אשר חותך אותו והוא מחפש את ה"ע

השלב הבא . מנטרים לגן שאנו רוצים להשתיקלנוקלואטידים חייבים להיות קומפ 22נים במקרה זה האנזימים שו

.SiRNAנוקלואטידים שיזוהו וזה נקרא 22הוא יצירת

.mRNAשתי השיטות נועדו להשתקת התרגום ברמת ה

אנו . הוא יהיה טוקסי יש חלבון מסויים שאנו יודעים שברגע שהוא יבוא לידיי ביטוי .ביטוי תחת בקרה[ 46]

למשל אנו יכולים להחדיר . רוצים לשלוט על הבקרה של הגן ברגע שאנו הופכים את התא שמכיל את הפלסמיד

פרומוטור עם פלסמיד ולא לבטא את הפלסמיד אלא לבטא אותו רק בתנאים מסויימים למשל לחקור את

ילסור המכPCRר tetהמערכת בנויה על ה. tet offו tet onבתאים של יונקים בנו פלסמידים של . טוקסיות החלבון

הוא גורם לביטוי DNAעשו לו מניפולציה כך שברגע שהוא קושר את הציס אלמנט על ה ,אתרי שפעול שיעתוק

אם נוסיף למערכת טטרה ציקלין הוא . tet offזוהי -(למטה)חלבון ון וזאת רואים במינוס ביטוי של האותו החלב

ימנע את ביטוי החלבון ולכן בנוכחות דוקס כיבינו את המערכת והוא הפך להיות רפרסור ייקשר לאותו רפרסור ו

מצד שמאל באופן רגיל הוא ייקשר . לקחו את המערכת ועשו עליה מניפולציות. ולכן אין ביטוי של החלבון

בעת הוספת tet onב. לפרומוטור והוא יבוא לידיי ביטוי ואילו בהוספת דוקס הוא ייקשר ולא יבוא לידיי ביטוי

יש לנו מערכת של פלסמידים אחד מבטא את הרפרסור והשני מכיל את הפרורטור . דוקס יהיה ביטוי של החלבון

ברגע שמוסיפים טטרה ציקלין אותו רפרסור מסולק ויש ביטוי . של אותו גן שמכיל את החלבון שנקשר לרפרסור

החלבון לא מונע את הריפרסיה של הגן אלא ברגע שני פלסמידים אבל -במצב השני התנאים הפוכים. לחלבון

הוספת הטטרה ציקלין הוא ייקשר וימנע את

פולימרז להיקשר RNAרפרסור מונע מ tet. הביטוי

בצד ימין הטטרה ציקלין . ומונע את השיעתוק

ייקשר לרפרסור ויגרום לו להיות מסולק ולכן יהיה

בצד שמאל עשו על . שיעתוק וביטוי של החלבון

ון מניפולציה אומנם הוא עדיין בעל יכולת החלב

את לו מונעת DNAאבל הקשירה שלו ל DNAלהיקשר ל

.רק בהוספת דוקס הוא יתפקד כרפרסור לאהרפרסיה א

.שמרים – 3.6.10

–זור חיים חאורך מ. לשאלות ביולוגיות מובילה לשם תשובותהשמר הוא חיית מודל [ 2] .השמר כחיית מודל[ 1]

פלואידי אבמצב ה. או דיפלואידי( ומולוגייםכרומוזומים ה שלסט אחד )פלואידי אחיות במצב של ההשמר יכול ל

במצבי סטרס . חלוקה במיטוזה, הינות אותיש תכונות שמאפישחיות בנפרד ולכל אחת מהן ' יש שתי אוכ

ולאחר מכן איחוי של מסויימים או באינדוקציה מסויימת אותם שני תאים יכולים לעבור איחוי של הממברנה

בתנאים , יכולה להתחלק מיטוטית' גם במצב דיפלואידי אותה אוכ. דיפלואידית' קבל אוכתהגרעין כך ש

הינו האפלואידי וחוזרים כל תא ,לחלוקה מיוזיס וקבלת ארבע תאים כולים להיכנסמסויימים אותם תאים י

במצבים האפלואידים אחת הבעיות היא גן שיכול להיות חיוני ובעת ביצוע נוק אאוט התא . פלואידיתאה' לאוכ

.דיפלואידים תאים ימות ולכן ביצוע נוק אאוט לגנים חיוניים חייב להיות עבור

:בשמר DNAסוגים של פלסמידים או ישנם ארבע [ 3]

DNAתכונת לשרוד כ אותו פלסמיד חסר, ן להכנסה לשמר ויכול לעבור אינטגרציה לגנוםפלמיד שנית .1

פלסמיד . ייקשר לכרומזום הוא יסולק או יימהל בחלוקותא אם הוא ל, כרומוזוםנוסף מחוץ ל

של בקטריה ORIכמות גדולה ולכן מכיל תלשימוש בחיידק לקב, מכיל מרקר לסלקלציה, אינטראקטיבי

.ומרקר סלקציה של בקטריה

שמגיע מפלסמיד ORIשלו הוא ORIה, ל פלסמידנוגאופי –ל שמרים על פלסמיד טבעי ש פלסמיד שבנוי .2

.המוחדר הגן, מרקר סלקציה שמרי וחיידקי, או חיידקי, מקורי של שמר

. פשר הפרדה זהה של פלסמידים בין תאי הבתמא, לקוח מכרומוזום והוסיפו צנטרומר ORIפלסמיד בו .3

מרקר סלקציה , צנטרומר שמאפשר הפרדה, לומרים בקצוותמכיל ט-כרומזום של שמר עצמו –אק י .4

.גן הוקטור, ORI, לשמרים

DNAאת אותה חתיכת , הפלסמיד הראשון מכיל עמידות בשמר עצמו[ 4]

. קי ומרקר סלקציהחייד ORIשאנו רוצים וחתיכה מפלסמיד חיידקי המכיל

בשמר ולכן לא מכיל צנטרוזוםאבל כרומוזומלי ORI בעל אחר הוא דיפלסמ

לכן הוסיפו לו צנטרוזום של שמר שמאפשר חלוקה זהה .ייעלם לאורך זמן

.עמידות לסלקציה ועוד, טלמורים, ORIהיאק מכיל . ושווה בין תאי הבת

אנזימים בקסקדה של חומצות אמינו או -קר סלקטיבי של שמריםמר[ 5]

יש לבדוק )ניתן להוסיף היסטדין למדיום זאתהשמר הוא ימות אבל כדי לעקוף אם הגן חסר בתוך . נוקלואוטיד

חסר אנזים ליצירת היסטדין ולכן 3שמר היס(. לשמר במדיום קר שקיים על הפלסמיד ומה צריך לספמהו המרק

ניתן לגדל שמר זה ולהחדיר לו פלסמיד המכיל את הגן ליצירת היסטדין לאחר . ין במצע שלוצריך היסטד

.ההחדרה זורעים על מצע חסר היסטדין כך שאותם שמרים שלא מכילים את הפלסמיד ימותו ולא ישרדו

. גיתהשמר מצליח בקלות גדולה לעשות רקומבינציה הומולו. רקומבינציה הומולוגיתהשמר חזק מאוד ב[ 6]

. במיקום מסויים DNAמדובר על מצב בו יש הומולוגיה ברצף בין שני דברים כך שאפשר להחדיר מקטע של

להוביל הרקומבינציה הומולוגית יכול

החלפה של גן אחד בגן : י תוצאותתלש

-קבלת דופליקיישן או (למעלה)השני

DNAהוספת הגן המוחדר בנוסף ל

עותקיםם שני מקבלי(. למטה)הקיים

למשל .של אותו גן ("קופאים" :ציטוט)

במצב מסויים אם יש , לוקחים פלסמיד שמכיל הומולוגיה לאזורים מחוץ לגן עצמו, ניתן להכניס גן בעל מוטציה

אנו מכניסים . דופליקציה-קרוסיניג אובר במקום אחד בלבד במקום הומולוגיה אחת בלבד תהיה תוספת של הגן

ב לפרומוטור כדי שיהיה ניתן לראות האם יש הצלה של הפנוטיפ ולכן קרו-את הגן המוחדר לפניי הגן המקורי

ברגע שיש הרחקה הגן מהפרומוטור הגן המקורי לא יבוא . חשוב מאוד לראות היכן נמצאת נקודת ההומולוגיה

מבטא רצף אחד הגן המוחדר צמוד אחד mRNAש בנוסף מכיוון. לידיי ביטוי כי הגן המוחדר בא לידיי ביטוי

יש הומולוגיה ends outבמצב שני . ולכן הוא יבוא הגן המוחדר יבוא לידיי ביטוי רילפרומוטור ולא הגן המקו

כאשרולהחדיר את התוצר פנימה PCRשות ניתן לע. מוטנטי עם הגן המקוריהכפולה ומתקבלת החלפה של הגן

אנו יכולים ליצור שבר דו גדילי בנקודות . הקצוות יהיו אזורים הומולוגיים אבל צריך להכיל מרקר סלקציה

דרה יש לבצע לשם העלאת הסיכוי להח אולם. אזורים רקומביננטים ההמולוגיה אבל בשמר אפילו מספיק להכניס

ולשם מניפלציות אחרות כגון גו ends outלשם ביצוע נוק אאוט יש שימוש . ות אנזימיםעצשבירה דו גדילית באמ

. ends inדווח יש שימוש ב

בדיקת אינטרקציה בין חלבונים או האם יש השלמה גנטית לגביי : רת שמריםחקירה בעזשתי אפשרויות ל[ 7]

חלבונים לא עובדים לבד אלא בקומפלקס חלבוני ויש הרבה שאלות בביולוגיה שקשורות [ 8] .חלבונים

? האם חלבונים בעלי יכולת לקשור אחד את השני או האם יש ביניהם קשר פיסי, לאינטרקציה בין חלבונים

קשר נוצר ולראות האם' וב' ניתן לקחת חלבון א? לגלות אינטרקציות בין חלבונים השמר יכולה המערכת של

ניתן לעשות מוטציות . ולתת לו כמות חלבונים גדולה ולראות אל מי הוא נקשר' חת חלבון אקל ניתן, ביניהם

מרי לרצף מסויים המערכת בנויה על יכולת קשירה של חלבון ש[ 9] .נקודתיות על חלבונים ולראות את ההשפעה

אזור רגולטורי על -DNA UASחלבון שהוא פקטור שיעתוק והוא יכול לזהות רצף על ה ישנו .שאותו הוא מזהה

ולכן בעת 4גלקטוז גורם להפעלת הגאל . שיעתוקהרצף את חלבון שיעתוק שיודע לקשור ואה 4גאל . DNAה

בנוי בצורה כזו שהוא בעל חלק בחלבון שיודע לקשור את 4גאל . ש שיעתוק וביטוי של חלבוניםנוכחות גלקטוז י

. השיעתוק ונים אחרים ולהתחיל אתר חלביכולת לקשו-אחר שהוא אזור מפעיל שיעתוק ןיובעל דומי UASה

בים המכילים את הגן בגנטיקה יש מינים ר}. לתפקוד שלם של אותו פרומוטר יש צורך בשני הדומיינים יחדיו

רישום באות : המקורי או מוטנטים לגן מסויים או שמכילים את אותו חלבון ולכן לשם הבדלה יש רישום שונה

אם מדובר על החלבון הכתיבה תהיה כך שרק האות הראשונה היא , מוטציה בגן-אותיות קטנות, זן בר-גדולה

. {אות גדולה

, UASההתחלתיות קושרות את כאשר חומצות אמינו 71, חומצות אמינו 881בנוי בצורה של 4החלבון גאל [ 10]

-במערכת שלנו חתכו את החלבון באמצע. חומצות האמינו האחרונות חשובות להפעלת השיעתוק שהינן 881– 738

אזור קושר יש [ 11] .וחלק אחר המכיל את החלק השני UASיש חלק מהחלבון המכיל -הפרדנו בין שני האזורים

DNA שני פלסמידים שונים שכל אחד מכיל חתיכה .ראי על הפעלת השיעתוקר אחלסמיד אחר אשואזור על פ

.נבדוק האם תהיה אקטיבציה ,כל אחד מהפלסמידים ונכניס לשמר זאת אומרת אם ניקח. 4מאותו חלבון גאל

לא יוכלו לעשות זאת כי התוצאה היא כי הם

. חסר להם רכיב בשביל להביא לשיעתוק מלא

ן שני החלבונים פיסית בי ברגע שיש אינטרקציה

חלבון כימרה חדש המכיל את שני נוצר

למעשה קיבלנו חלבון שיכול להתחיל . האזורים

את השיעתוק וניתן לחבר אל השיעתוק גן דווח

. וכך ניתן לדעת כי החלבון בא לידיי ביטוי

קרבה גדולה מביאים לשמר שמכיל את שני החלבונים וברגע ששני החלבונים מזהים אחד את השני אנו מתקבל

יהשאלה שלנו היא האם שנ. בין שני האזורים החשובים לנו וכך מתקבל חלבון כימרה שיבוא לידיי ביטוי

אם אין אינטרקציה בין החלבונים והם לא ייקשרו אחד לשני . החלבונים יכולים לבוא באינטרקציה אחד עם השני

אם שני החלבונים , ות כל גן עמידות למטבוליזם מסוייםהגן דווח יכול להי. לא תהיה הפעלה של הפרומוטורים

רק שמר שיגדל על מצא חסר -התחברו אחד לשני זאת אומרת שיהיה ביטוי של גן שנותן מטבוליזם לשמר

.ההחדרה צריכה להיות לשמר חסר הגן לסלקציה. הנוקלואוטיד מראה על אינטרקציה בין החלבונים

אנו מחדירים . שתיים לכל פלסמיד והשלישית לגן דווח; יות לגנים שוניםלוקחים שמר בעל שלוש מוטצ[ 12]

לשמר את שני הפלסמידים אשר ייתנו לשמר עמידות לשני נוקלואוטידים ולכן רק שמר אשר יצליח לסנתז לעצמו

לאחר מכן ניתן לזרוע את השמר על מדיום חסר . ל קיבל את שני הפלסמידים"במדיום חסר הנוקלואוטידים הנ

ביא לידיי ביטוי את הגן דווח אשר מקדד יינטרקציה בין שני החלבונים לושת הנוקלואוטידים ורק שמר בו יש אש

יש ככלל מה שיצמח על הצלחת הם שמרים אשר בהם . יצליח לשרוד ,לאנזים שמסנתז את הנוקלואוטיד השלישי

.לידיי ביטוי אפלסמידים והגן דווח באת שני ה

י"ע גן מזבוב ולראות האם ,אנו רוצים לקחת גן מהשמר – קומפלמנטריותבחון מרים לשימוש נוסף בש[ 13]

שני הגנים בעלי . ון פונקציונאלי בין חלבון זבובי לחלבון שמרייש איזשהו דמילשמר החדרת הגן מהזבוב

לוקחים . חיוני להתפתחותהגן הינו גן . ההחדרה של הגן הזבובי לשמר היא לשמר מוטנט חסר הגן, הומולוגיה

. ללא הפלסמיד השמר ימות ,לכן השמר ישרוד ,שמר מוטנטי חסר הגן ומחדירים אליו פלסמיד בעל הגן השמרי

פלסמיד , ל מוטציהמכימתקבל שמר ש-יל את הגן הזבובילאחר מכן מחדירים לאותו שמר פלסמיד אחר המכ

וציא מהשמר את הפלסמיד השמרי הראשוני ולהביא לידיי ביטוי שמרי ופלסמיד זבובי כל שנותר לעשות הוא לה

יש השלמה -אם הוא ישרוד זאת אומרת שהחלבון הזבובי יתפקד כמו החלבון השמרי-את החלבון הזבובי

אנו חושפים את השמר למדיום המכיל חומר מסויים אשר עובד על סלקציה . פונקציונאלית של החלבונים

שמר בעל פלסמיד שמרי , ל גן סלקציה שלילי בנוכחות החומר אשר יהיה טוקסיהפלסמיד השמרי מכי. שלילית

הפלסמיד את ביטויידיי בהוספת גלקטוז למדיום נביא ל .מר ירצה לזרוק את הפלסמיד החוצהימות ולכן הש

כולם מכילים . כל החלוקות על הצלחת הם שמרים בעלי פנוטיפים וגנוטיפים זהה. ברמת הניסיונית[ 14] .הזבובי

אשר כל קבוצה כהפלסמיד השמרי עם הגן לסלקציה שלילית ובנוסף כל אחד מכיל את הפלסמיד הזבובי את

במצע לא סלקטיבי כולם גדלים . אנו בודקים איזה גן יכול לתפקד כמו החלבון השמרי-מכילה גן מאורגניזם אחר

צע גלקטוז המכיל את במעבר למ. כי כולם מכילים את הפלסמיד של השמר למרות שהם מוטנטים בגנום שלהם

.ידיי ביטוי את הפלסמידים השנייםהחומר לסלקציה שלילית הפלסמיד השמרי נזרק החוצה והגלקטוז מביא ל

פילה הצליח לשמור את השמר בחיים ולמעשה להחליף את החלבון השמרי וניתן לראות כי רק החלבון מהדרוז

.בתפקיד