化学分析化学分析 电分析 电分析 分析化学分析化学 原子吸收光谱原子吸收光谱 仪器分析 光分析 原子发射光谱仪器分析 光分析 原子发射光谱 吸光光度法吸光光度法 …… …… 色谱分析色谱分析

10.1 10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律

10.2 10.2 分光光度计及吸收光谱分光光度计及吸收光谱

10.3 10.3 显色剂及其影响因素显色剂及其影响因素

10.4 10.4 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制

10.5 10.5 其他吸光光度法其他吸光光度法

10.6 10.6 吸光光度分析法的应用吸光光度分析法的应用

10.1.1 10.1.1 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收

吸光光度法吸光光度法 :: 是基于被测物质的分子对光具有选择吸收是基于被测物质的分子对光具有选择吸收

的特性而建立的分析方法。的特性而建立的分析方法。

光的电磁波性质光的电磁波性质

射线

x射线

紫外光

红外光

微波

无线电波

10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm

可 见 光

10.1 10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律

光的波粒二象性光的波粒二象性光的波粒二象性光的波粒二象性

波动性波动性波动性波动性

粒子性粒子性粒子性粒子性

EEEE

hchE

单色光、复合光、互补色光单色光、复合光、互补色光单色光、复合光、互补色光单色光、复合光、互补色光

单色光单色光单色光单色光

复合光复合光复合光复合光

光的互补光的互补光的互补光的互补

??

??

?? 蓝

黄

紫红

绿

紫

黄绿

绿蓝 橙

红

蓝绿

问题问题 :: 光与物质如何发生作光与物质如何发生作用用 ??

物质的颜色与光的关系

完全吸收

完全透过

吸收黄色光

光谱示意 表观现象示意复合光复合光复合光复合光

1.1. 分子能级图：微观上表现为能级跃迁 分子能级图：微观上表现为能级跃迁 EE 电子 电子 + + EE 振动 振动 + + EE 转动转动

11 ～～ 200ev 0.05200ev 0.05 ～～ 1ev 1ev 0.05ev0.05ev 可见、紫外 红外 红外 可见、紫外 红外 红外

2.2. 分子吸收光谱图：宏观上表现为光吸收分子吸收光谱图：宏观上表现为光吸收 （（ 11 ） ） KMnOKMnO44 吸收曲线（吸收曲线（ 22 ）定性、定量依据）定性、定量依据

E

E

E

E1

2

vvv

vv

0

1

2

3

rr1

v

1

2

3

2

Èë

吸收光谱吸收光谱吸光程度

吸光程度

10.1.2 10.1.2 光吸收的基本定律光吸收的基本定律

透光率定义：

0II

T t全部吸收全部吸收 T = 0.0 %T = 0.0 %

全部透射全部透射 T = 100.0 %T = 100.0 %

入射光 I0 透射光 It入射光 I0 透射光 It

T ~ T ~ ？？ ~ C~ C

朗伯朗伯 -- 比耳吸收定律的推导比耳吸收定律的推导

I0

db

b

It

I I-dI dI dI ∝ ∝ N IN I

NN = N = N0 0 c dS dbc dS db

N = k’ c db

dI ∝ N I = I k’ c db

dI = - I k c db ,

bI

Icdbk

IdIt

00

dI / I = - k c db

kcbIIt 0

ln积分 得

KcbkcbIIt

303.2lg

0或 KcbT lg得

吸光度与透光率吸光度与透光率

kcbTA lg令：

A ： 吸光度

1.0

0.5

0

A

C

A

100

50

0T

%

T

KbcAT 1010

T = 0.0 %T = 0.0 %

A = ∞A = ∞

T = 100.0 %T = 100.0 %

A = 0.0A = 0.0

吸光系数吸光系数kcbA b b ～～ cm cm c ～ g ·· L –1–1 或 mol mol ·· L –1–1

KK 比例常数比例常数KK 比例常数比例常数 入射光波长入射光波长入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质物质的性质物质的性质 温度温度温度温度

cc ：： mol mol ·· L –1–1 cc ：： mol mol ·· L –1–1 K 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 L L · · mol mol –1 –1 · · cm cm -1-1

cc ： ： g ·· L –1–1cc ： ： g ·· L –1–1 K a吸光系数吸光系数 a

L L · · g g –1 –1 · · cm cm -1-1

cbA cbA

acbAacbA

333

Fe2+ 3N N

+N N

Fe

2+

桔红色 508邻二氮菲

=1.1 104

1.1. 摩尔吸收系数摩尔吸收系数～～反映吸光物质对光的吸收能力反映吸光物质对光的吸收能力 ,, 取决取决于于

　分子结构　分子结构 ,, 是物质定性依据。是物质定性依据。

2.2. 摩尔吸收系数摩尔吸收系数～反映光度分析方法的灵敏度．～反映光度分析方法的灵敏度．

摩尔吸光系数摩尔吸光系数的意义的意义

bCA

A

C0

< 104

=104 ~105 > 105

低灵敏度中等灵敏度高灵敏度

10.2.1 10.2.1 分光分度计分光分度计分光光度计基本部件分光光度计基本部件

光源光源光源光源

单色器单色器单色器单色器

样品池样品池样品池样品池

检测器检测器检测器检测器

信号输出信号输出信号输出信号输出

氢灯，氘灯，氢灯，氘灯， 185 185 ～ ～ 350 nm350 nm ；； 卤钨灯，卤钨灯， 250 250 ～～ 2000 nm.2000 nm.玻璃棱镜， 玻璃棱镜， 350 350 ～ ～ 2500 nm2500 nm石英棱镜，石英棱镜， 185 185 ～ ～ 4500 nm4500 nm光栅光栅

玻璃比色皿，石英比色皿玻璃比色皿，石英比色皿

光电管，光电倍增管光电管，光电倍增管

表头显示、数字显示、屏幕显示、记录表头显示、数字显示、屏幕显示、记录

10.2 10.2 分光光度计及吸收光谱分光光度计及吸收光谱

14 GXQ 分析化学 2005-2006 学年2005-12

单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计

0.575

光源光源 单色器单色器

吸收池吸收池

检测器检测器 显示显示

（计算（计算机）机）

比值

光源光源 单色器单色器

吸收池吸收池 检测器检测器 显示显示

光束分裂器光束分裂器

单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计

KMnOKMnO44 溶液的吸收光谱溶液的吸收光谱

10.2.2 10.2.2 吸收光谱吸收光谱

吸收光谱与吸收定律的关系吸收光谱与吸收定律的关系

A

C

吸收定律

吸收定律

A

吸收光谱

吸收光谱

A

C

max

三三维维谱谱图图

有机化合物有机化合物有机化合物有机化合物 官能团强吸收官能团强吸收 直接测定 UV-VIS

官能团弱吸收官能团弱吸收 衍生化反应 UV-VIS

显色反应显色反应无机化合物无机化合物无机化合物无机化合物 显色反应显色反应

333

Fe2+ 3N N

+N N

Fe

2+

桔红色 max邻二氮菲

10.3 10.3 显色剂及其影响因素显色剂及其影响因素10.3.1 10.3.1 显色反应与显色剂显色反应与显色剂

1.1. 显色反应的选择显色反应的选择

显色反应： 显色反应： M + R MRM + R MR a. a. 灵敏度高、选择性好；灵敏度高、选择性好； b.b. 有色化合物的组成恒定； 有色化合物的组成恒定； c.c. 显色对比度大：显色对比度大： MRMR

maxmax RRmaxmax nm nm

2. 显色剂 无机显色剂：利用络合反应和氧化还原反应无机显色剂：利用络合反应和氧化还原反应 有机显色剂：利用配位、螯合、缔合反应有机显色剂：利用配位、螯合、缔合反应 结构特点：结构特点： 生色团 有 、 等共轭双键生色团 有 、 等共轭双键

助色团 有 、 助色团 有 、 -OH-OH 等含孤对电子的基团等含孤对电子的基团形成有色有机化合物的类型：形成有色有机化合物的类型：

配合物配合物 螯合物 螯合物 离子缔合物 离子缔合物

= = - N=N-- NH

..

二元：二元： M—RM—R三元：三元： M—R—M—R— 表面活性剂表面活性剂多元： （增敏、增溶、增稳）多元： （增敏、增溶、增稳）

N

NH3C C N

C NH3C

OH

OH

丁二酮肟

OH

COOH

SO3H

FeFe2+ 2+ =1.1 ×10 =1.1 ×1044NiNi2+ 2+ =1.3 ×10 =1.3 ×1044

max max =470nm=470nm

邻二氮菲

max max =508nm=508nm

磺基水杨

酸

FeFe3+ 3+ =1.6 ×10 =1.6 ×1033

max max =520nm=520nm

CH3 C N OH

C N OHCH3+ Ni

2+ CH3 C N

O

CCH3 N

O

H

CH3CN

O

C CH3N

O

H

Ni + 2 H+ 2

二苯硫腙

C6H5N N

H

C SH

N

N

C6H5

C6H5

NN

H

CS

N

N

C6H5 C6H5

NN

H

CS

NN

C6H5

Pb+ Pb2+2 + 2H+

PbPb2+ 2+ =1.3 ×10 =1.3 ×1044

max max =520nm=520nm

吸收曲线 显色剂用量曲线 酸度曲线 吸收曲线 显色剂用量曲线 酸度曲线

温度曲线 时间曲线 工作曲线 温度曲线 时间曲线 工作曲线

RV

T t C

A

AAA

AA

10.3.2 10.3.2 影响显色反应的因素影响显色反应的因素

pHpH

1.1. 测量波长的选择测量波长的选择

无干扰，选择 max 有干扰

A

A

10.4 10.4 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制

10.4.1 10.4.1 测量波长的选择和标准曲线的制作测量波长的选择和标准曲线的制作

A＝ b c

0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)

A

。 。

。 。

*0.80

0.60

0.40

0.20

0.00

Ax

cx

2.2.标准曲线的制作标准曲线的制作

工作曲线法cc11 cc22 cc33 cc44 cc55 ccxx

AA11 AA22 AA33 AA44 AA55 AAxx

标准系列

未知试液

被测物M

干扰N

显色剂R

掩蔽剂L

辅助试剂( 缓冲液等 )

化合物 参 比 溶

液MRn NLn 内容 名

称无色

无色

无色

无色

无色 有

色无色

H2O

NLn+R+ 缓冲液

溶剂 空白

无色

或有色

有色 

或有色

无色 

有色 

或有色 

 NLn+R+

缓冲液

试剂 空白 

或有色

或有色

无色 

或有色

无色  

有色 

或有色

 NLn+M+

缓冲液 

试液 空白 

有色

有色

有色

有色 无色 有

色有色

 NLn+M+L+R

+ 缓冲液 褪色 空白

3.3.参比溶液的选择参比溶液的选择

1.1.非单色光引起的偏离 非单色光引起的偏离 10.4.2 10.4.2 对朗伯对朗伯 -- 比尔定律的偏离比尔定律的偏离

2.2.介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离2.2.介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离

胶体溶液、乳浊液、悬浊液胶体溶液、乳浊液、悬浊液胶体溶液、乳浊液、悬浊液胶体溶液、乳浊液、悬浊液

3.3. 溶液本身化学反应引起的偏离溶液本身化学反应引起的偏离解离、分解解离、分解

4.4. 显色反应的干扰及其消除方法显色反应的干扰及其消除方法

• 控制溶液酸度控制溶液酸度• 控制溶液酸度控制溶液酸度

• 加入掩蔽剂加入掩蔽剂• 加入掩蔽剂加入掩蔽剂

• 改变干扰离子的价态改变干扰离子的价态• 改变干扰离子的价态改变干扰离子的价态

• 选择合适的参比选择合适的参比• 选择合适的参比选择合适的参比

• 增加显色剂的用量增加显色剂的用量• 增加显色剂的用量增加显色剂的用量

A

dA

c

dcEr

TA lg Tln434.0

TdTdA 434.0

TT

dT

A

dA

c

dcEr

ln

dA= b dC

10.4.3 10.4.3 吸光度测量的误差吸光度测量的误差A= b C

如何减少吸光度测量的误差？如何减少吸光度测量的误差？

10

8

6

4

2

020 40 60 80

0.7 0.4 0.2 0.1 AT%

Er

r0.434

lg

( 0.01)

c TE

c T T

T

(36.8)

0.434

A=0.A=0.22

T=65T=65%%

A=0.A=0.88

T=15T=15%%

T% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5T% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 dT=1% 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 dT=1% 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 dT=0.5% 5.4 2.8 2.0 1.7 1.5 1.4 1.4 1.6 2.2 3.3 dT=0.5% 5.4 2.8 2.0 1.7 1.5 1.4 1.4 1.6 2.2 3.3

标准系列标准系列

未知样品未知样品

10.5 10.5 其他吸光光度法其他吸光光度法

10.5.110.5.1目视比色法目视比色法

普通光度法普通光度法 :: 以空白溶液为参比 x

xx bc

I

IA 0lg

示差光度法示差光度法 :: 以标准溶液 CsCs为参比)( sxsx ccbAAA

xcbA

△C△Cx

A′

（ Cx > Cs ）

10.5.2 10.5.2 示差光度法示差光度法

A=0

T=100%A=

TT 12T=0CC s1x

50%

T=5% T=10%1

普通光度法普通光度法 ::

示差光度法示差光度法 ::

示差光度法的实质示差光度法的实质 ??

21

A

X Y

xx AAA 21

xxx bC）（ 21

光源光源

单色器单色器

单色器单色器

检测器检测器

切光器

狭缝

吸收池

10.5.3 10.5.3 双波长光度分析法双波长光度分析法

一阶导数信号与试样浓度呈线性关系 : dI/dλ ＝－Ｉ 0 bc dε/dλ

测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率 dε/dλ。吸收曲线的拐点处dε/dλ 最大，故其灵敏度最高 (见图）。同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）

10.5.4 10.5.4 导数分光光度法导数分光光度法

单组分的测定单组分的测定微量铁的测定微量铁的测定

氨基酸的测定氨基酸的测定

邻二氮菲法邻二氮菲法

茚三酮法茚三酮法

蛋白质的测定蛋白质的测定 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法

总磷的测定总磷的测定 磷钼蓝法磷钼蓝法

海水中营养盐的测定海水中营养盐的测定

10.6.1 10.6.1 工业分析工业分析10.6.1 10.6.1 工业分析工业分析

10.6.2 10.6.2 临床分析临床分析10.6.2 10.6.2 临床分析临床分析

10.6.3 10.6.3 食品分析食品分析10.6.3 10.6.3 食品分析食品分析

10.6 10.6 吸光光度分析法的应用吸光光度分析法的应用

多组分的测定多组分的测定

1. 1. 解联立方程法解联立方程法A

X Y

1 2

yx AAA 111 yy

xx bcbc 11

yx AAA 222 yy

xx bcbc 22

解联立方程，可 求得解联立方程，可 求得 CxCx, , CyCyA

Cs(x)

x1

x

2

10.6 10.6 吸光光度分析法的应用吸光光度分析法的应用

2.2. 双波长光度分析法双波长光度分析法

pHRR

A

HR R

HRHR

10.6.4 10.6.4 其它应用其它应用1.1. 弱酸弱碱离解常数的测定 弱酸弱碱离解常数的测定

][][ BHBA BHB

C

AHBHB

pHlg

HB

Ba

AA

AApK

pH (b=1cm)

pH < < pKa-1 C = [HB]

pH > > pKa+1 C = [B-]

CA HBHB

CA BB C

ABB

10.6.4 10.6.4 其它应用其它应用

饱和法 ( 摩尔比法 )

A

CR/CM

n

2.2. 络合物组成的测定 络合物组成的测定

M:R=1:1

0.5 0.33cM/c cM/c

M:R=1:2

M R=MRnn

等摩尔连续变化法

补充习题补充习题 11 ：：准确称取准确称取 1.00mmol1.00mmol指示剂指示剂 HIn5HIn5份，分别溶解于份，分别溶解于 1.01.0

升不同得缓冲液中，用升不同得缓冲液中，用 1cm1cm 比色皿在比色皿在 650nm650nm下测得下测得数据如下：数据如下：pH 1.00 2.00 4.70 10.0 11.00pH 1.00 2.00 4.70 10.0 11.00

A 0.00 0.00 0.588 0.840 0.840A 0.00 0.00 0.588 0.840 0.840

求该指示剂的求该指示剂的 pKapKa 。。

分析方案设计分析方案设计

☞ ☞ FeFe2+2+ +Fe+Fe3+3+混合液混合液

☞ ☞ Cr(III)Cr(III) + Cr+ Cr (VI)(VI) 混合液混合液

显色剂？ 显色条件？测定波长？ 参比溶液？显色剂？ 显色条件？测定波长？ 参比溶液？

3

2+

3

N

NFe+ Fe2+

N

N

例 1 ：分析 Fe2+ +Fe3+混合液中微量 Fe2+ 和 Fe3

+ 的 含量（ ug/mL）

λmax = 510nm

解：解： (1) (1) 标准系列与待测试液的配制标准系列与待测试液的配制

编号编号 11 22 33 44 55 66 77

铁标液铁标液 /mL/mL 0.000.00 2.002.00 4.004.00 6.006.00 8.008.00 / / //

待测试液待测试液 /mL/mL // // // // // 5.005.00 5.005.00

盐酸羟胺盐酸羟胺 /mL/mL 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 // 1.01.0

邻二氮菲 邻二氮菲 /mL/mL 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0

pH5pH5 缓冲缓冲 /mL/mL 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0

定容至定容至 /mL/mL 50.050.0 50.050.0 50.050.0 50.050.0 50.050.0 50.050.0 50.050.0

(2) 以 1 号试剂空白为参比在 510nm 处测量 2-7 号吸光度 A 值 .

(3) 以 1-5 号标液铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制 A-c 标准曲线，求曲线方程与。

(4) 由曲线方程分别求出或从标准曲线上分别查出 6

号和 7 号对应的铁含量： 6 号～ Fe2+ ； 7 号～ Fe2+ +Fe3+ ； 7 号 -6 号～

Fe3+ 。 (5) 将相应铁含量换算回原始试液中含量。

例例 22 ：：分析分析 Cr(III)Cr(III) + Cr+ Cr (VI)(VI) 混合液中微量混合液中微量 Cr(III)Cr(III)

和 和 CrCr (VI)(VI) 的含量的含量

（（ ug/mLug/mL ） ——） ——二苯碳酰二阱显色法（ 二苯碳酰二阱显色法（ λλmaxmax=540nm=540nm ））

解：解： (1) Cr(III)(1) Cr(III) ￫ ￫ CrCr (VI)(VI) 预处理——预处理—— 77 号测总铬试液号测总铬试液

酸性条件下酸性条件下 KMnOKMnO44 充分氧化充分氧化 Cr(III)Cr(III)

￫ ￫ CrCr (VI)(VI) 后，在尿素后，在尿素

存在下以存在下以 NaNONaNO22 分解多余分解多余 MnOMnO

44--   。加。加 DPCIDPCI 显色剂后转移定容显色剂后转移定容

至至 50.0mL50.0mL 。。 (( 氧化性： 氧化性： MnOMnO44-->> 尿素尿素 >Cr>Cr22OO77

2-2- ））

(2) (2) 标准系列与标准系列与 66 号测号测 CrCr (VI)(VI) 试液的配制——酸性试液的配制——酸性 (H(H22SOSO44)) 条件下条件下

直接以直接以 DPCIDPCI 显色后定容至显色后定容至 50.0mL50.0mL 。。

(3) (3) 工作曲线法求出工作曲线法求出 66 、、 77 号分别对应的铬含量。号分别对应的铬含量。

66 号～ 号～ CrCr (VI)(VI) ； ； 77 号～ 号～ Cr(III)Cr(III) + Cr+ Cr (VI)(VI) ； ； 77 号号 - 6- 6 号～ 号～ Cr(III)Cr(III)

(4)(4) 将相应铬含量换算回原始试液中含量。将相应铬含量换算回原始试液中含量。