第二章 基因克隆所需的工具酶

一、限制性内切酶 (restriction enzyme)1 ．限制性核酸内切酶的发现 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DN

A 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据 1994 年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了 2300种以上，可识别 230 种不同的 DNA 序列。 早在本世纪中期，以 Arber 等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制 (restriction) 和修饰 (modification) 系统。

在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源 DNA( 如噬菌体 DNA 等 ) ，使得外源 DNA 对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞 ( 如宿主 ) 自身的 DNA 分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。

2 ．核酸内切限制酶的类型 特性 I 型 II 型 III 型

限 制 和 修饰活性 单 一 多 功能的酶 分 开 的 核酸 内 切 酶和 甲 基 化酶

具 有 一 种共 同 亚 基的 双 功 能的酶核 酸 内 切限 制 酶 的蛋 白 质 结构

3 种 不 同的亚基 单 一 的 成份 2 种 不 同的亚基

切割位点 在 距 寄 主 特异 性 位 点 至少 1000bp 的地 方 可 能 随机地切割

位 于 寄 主 特异 性 位 点 或其附近 

距 寄 主 特 异性位点 3 ，端24~26bp 处

甲 基 化 作 用的位点 寄 主 特 异 性的位点 寄 主 特 异 性的位点 寄 主 特 异 性的位点识 别 未 甲 基化 的 序 列 进行 核 酸 内 切酶切割

能 能 能

序 列 特 异 的切割 不是 是 是

DNA 克 隆 中的用处 无用 十分有用 用处不大

3 ．核酸内切限制酶的命名法 由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。 H ． O ． Smith 和D ． Nathans(1973) 提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点：（ 1 ） 用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成 3 个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌 (Escherichia coli) 用 Eco 表示，流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae) 用 Hin 表示。

（ 2 ） 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如 Ecok 。（ 3 ）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌 Rd 菌株的几个限制与修饰体系分别表示为 HindI 、 HindII 、HindIII 等等。

（ 4 ）所有的限制酶，除了总的名称核酸内切限制酶 R 外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R ． HindIII 。同样地，修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶 M 的名称。相应于核酸内切酶R ． HindIII 的流感嗜血菌 Rd 菌株的修饰酶，命名为甲基化酶 M. HindIII 。 在实际应用上，这个命名体系已经作了进一步的简化： ① 由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 ② 在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称 R 便被省去。

4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 它具有三个基本特性： a. 在 DNA 分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA 分子产生链的断裂； b. 2 个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.    因此，断裂的结果形成的 DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。

a. 识别位点： 绝大多数的 II 型核酸内切限制酶，都能够识别由 4～ 8 个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。 切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构，例如：

5'-CTGCA G-3, 5'-CTGCA G-3,

（ a ） Pst I 切割位点 , 切割后形成 3`—OH 的单链粘性末端，3'-G ACGTC-5 ， 3'-G + ACGTC-5 ，

(b) EcoRI 切割位点 , 切割后形成 5`-P 的单链粘性末端， 5'-G AATTC-3’ 5'-G + AATTC-3’

3'-CTTAA G-5’ 3'-CTTAA G-5’

（ c ） EcoRV 切割位点 , 切割后形成平末端。 5'-GAT ATC-3’ 5'-GAT + ATC-3’

3'-CTA TAG-5’ 3`-CTA TAG-5`

b. 切割类型： 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的 DNA 分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一： （ 1 ）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的 DNA片段； （ 2 ）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的

DNA片段。

c. 产生的末端特征： 我们所说的粘性末端是指 DNA 分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平末端的 DNA片段则不易于重新环化。

(2) 同裂酶 (isoschizomers) 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶 (isoschizomers) 。 同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。例如，限制酶 HpaⅡ和 MspI 是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG 。

与同裂酶对应的一类限制性内切酶 , 它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同 ,但都能产生相同的粘性末端 , 特称为同尾酶。 常用的 BamH I, Bcl I, Bgl I,Xho I 就是一组同尾酶。它们切割 DNA 之后都形成由 -GATC- 4 个核苷酸组成的粘性末端，很显然，由同尾酶所产生的 DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

(3) 同尾酶 (isocaudamer)

由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”(hybrid site) 。但必须指出，这类杂种位点的结构，一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如：Sal I （ 5`-G TCGAC-3` ）和Xho I(5`-C TCGAG-3`) 的消化片段相连，但所形成的重组片段（ 5`-GTCGAG-3` ）则不能被上述 2 种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。

5 ．影响核酸内切限制酶活性的因素(1) DNA 的纯度 核酸内切限制酶消化 DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的 DNA 本身的纯度。污染在 DNA 制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸 (EDTA)、 SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。

为了提高核酸内切酶对低纯度 DNA 的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物 DNA 可高达 10 单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些 DNA 制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的 DNase 的污染。由于 DNase 的活性需要有 Mg2+ 的存在，而在 DNA 的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂 EDTA ，因此在这种制剂中的 DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后， DNA 则会被 DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的 DNA 。

(2) DNA 的甲基化程度 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒 DNA 。

(3) 酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。 不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是 37℃，但也有许多例外的情况，它们要求 37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的 37℃，例如 SmaI 是

25℃、 ApaI 是 30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的 37℃，例如 MaeI 是 45℃、 Bcl I 是 50℃、 MaelII 是 55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达 60℃以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

(4)DNA 的分子结构 DNA 分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒 DNA 或病毒 DNA 所需要的酶量，要比消化线性 DNA 的高出许多倍，最高的可达 20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。 

(5) 核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、 Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT) 以及牛血清白蛋白（ BSA ）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是 Mg2+ 。 对绝大多数限制酶来说，在 pH=7 ． 4 的条件下，其功能最佳。

在“非最适的”反应条件下 ( 包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用 Mn2+取代 Mg2+ 以及高 pH值等等 ) ，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割 DNA 分子。

有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI 限制酶，在正常的情况下，是在 G AATTC 识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过 5％ (V／ V) ，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在 AATT 或 PuPuATPyPy 序列处发生切割作用。 EcoRI 限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以 EcoRI*表示。

6. 限制性内切酶反应的终止 消化 DNA 样品后，在进一步处理 DNA 样品前往往需要钝化内切酶的活性，钝化大多数限制性内切酶的方法是 65℃温浴 5 分钟。 但有些酶，如 BamHI 和 HaeⅡ对热稳定，则需加入终止反应液 ( 如加入 0 ． 5mol／ L 的 E

DTA 使之在溶液中的终浓度达到 10mmol/L)螯合Mg2+ ，以终止反应。 此外，还可以用等体积的酚抽提酶解产物，提取 DNA 。 如果用限制性内切酶消化 DNA 分子后，为了进行凝胶电泳分析，则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，直接上样进行凝胶电泳。

7. 利用限制酶对 DNA 进行消化的具体步骤

限制酶消化反应的进行 以下是对 0 ． 2—1 ． 0 ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的 DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。1) 将 DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为 18ul 。2) 加入 2ul适当的 10X 限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。3) 加入 1—2 单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。 1 单位酶通常定义为，在建议使用的缓冲液及温度下，在 20u1反应液中反应 1小时，使 l ug D

NA完全消化所需的酶量。

4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。5) 加入 0 ． 5mol ／ L EDTA(pH8 ． 0) 使终浓度达 10mmol／ L ，以终止反应。6) 如果消化后 DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入 6ul凝胶电泳加样缓冲液，振荡混合后，即可加样进行电泳。 如欲纯化消化后的 DNA ，可用酚：氯仿和氯仿各抽提 1次，再用乙醇沉淀 DNA 。

8. 使用限制酶的注意点1 ） 限制酶十分昂贵 !遵循以下建议可以最大限度地节省开支。为能从贮存管内取出小量的酶，只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可。这样，你可以取到少至 0 ． 1ul 的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用 1X限制酶缓冲液稀释。但切勿用水稀释以免酶变性。2) 限制酶在 50％甘油中保存于 -20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了 DNA 或其他酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。

3) 尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的 1／ 10 ，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。 4)    通常延长消化时间可使所需的酶量减少。这在切割大量 DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行微胶电泳以判断消化进程。

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