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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（３）：１１１１１６

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技术与方法

“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法构建靶向载体

梁　龙１　杨　华２，３　杨永林２，３　刘守仁２，３　皮文辉２，３（１石河子大学动物科技学院　石河子　８３２００３　２新疆农垦科学院畜牧兽医研究所　石河子　８３２０００）

（３新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室　石河子　８３２０００）

摘要　在同一反应体系内，利用 ＩＩＳ型限制性核酸内切酶和 ＤＮＡ连接酶进行“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆方法，将多个目的基因片段按照设定的顺序连接，实现多基因片段一步“无缝”连接。为编辑小鼠β酪蛋白基因位点，利用“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法，构建了小鼠β酪蛋白基因位点同源重组靶向载体。关键词　ＤＮＡ重组　“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法　小鼠β酪蛋白基因中图分类号　Ｑ７８

收稿日期：２０１２１２２７　　修回日期：２０１３０１１１ 兵团博士资金（２００９ＪＣ０５）；国家自然科学基金（３１０６０１５９）；国家留学基金委“西部人才培养特别项目”（［２００９］５００７）资助项目通讯作者，电子信箱：ｗｚｊｐｗｈ＠１６３．ｃｏｍ

　　经典“酶切—连接”克隆法采用限制性核酸内切酶

和连接酶，逐级将多个目的基因片段克隆进入载体，是

最基础的分子生物学实验内容之一。然而在实际实验

过程中，特别是多个基因片段连接时，经典克隆法的步

骤显得较为繁琐，比较费时，而且在连接基因片段之间

保留了限制性内切酶结合位点。

　　基于位点特异性重组（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）

的基因克隆技术，为快速有效地进行 ＤＮＡ体外重组提

供了新途径。如Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司开发的 Ｇａｔｅｗａｙ克隆系

统、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司开发的 Ｃｒｅａｔｏｒ克隆系统以及 Ｓｔｅｐｈｅｎ

Ｅｌｌｅｄｇｅ实验室开发的 Ｕｎｉｖｅｃｔｏｒ克隆系统［１］。这些克

隆技术能够简单、高效、准确地实现目的片段与特定载

体的融合。然而，用这些克隆方法构建的重组载体中

保留了特定重组位点序列且无法消除，进而新增了额

外的氨基酸（如果这些位点位于表达序列）。

　　２００８年，Ｅｎｇｌｅｒ等［２３］报道了一种 ＩＩＳ型限制性核

酸内切酶（ＩＩＳｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ）介导的克隆策略，称

为ＩＩＳ克隆法（ＩＩＳｃｌｏｎｉｎｇ），也称为 “ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆

法［４］。ＩＩＳ型限制性内切酶能够特异识别双链 ＤＮＡ上

的靶位点，并在靶位点下游非特异性地对 ＤＮＡ双链进

行切割，在 ＤＮＡ双链的 ５′或 ３′端产生粘性末端［５］。

“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法是在同一反应体系中，利用ＩＩＳ型

限制性核酸内切酶，在识别位点之外切开ＤＮＡ，产生含

粘性末端的ＤＮＡ片段，同时用连接酶将几个ＤＮＡ片段

按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的 ＤＮＡ

片段，就像一个线性拼图被正确地拼接在一起，使多个

目的ＤＮＡ片段按照设定的顺序实现“无缝”连接 ［２３］。

如果一种 ＩＩＳ酶切割 ＤＮＡ产生４个碱基的粘性末端，

能够形成２５６种不同的粘性末端。因此设计者能够非

常灵活的设计“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法实施方案。

　　目前人工构建转录激活样效应子 ＤＮＡ结合域方

案中，多篇文献采用“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法［４，６８］。为了

构建小鼠β酪蛋白基因位点同源重组红色荧光蛋白报

告基因靶向载体，实验将目的基因片段进行ＩＩＳ型酶切

分析，确定目的基因片段不含 ＢｓｍＢＩ酶切位点。然后

设计了“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆方案，在一个反应体系中，实

现了两端同源臂和报告基因共三个片段按照预先设定

的顺序同载体融合，成功构建小鼠 β酪蛋白基因位点

同源重组靶向载体，为编辑小鼠 β酪蛋白基因位点提

供靶向载体。

１　材料与方法

１．１　材　料

１．１．１　菌株与载体　大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．３２０１３

ＤＨ５α、ｐＤｓＲｅｄ２１载体、ｐＥＧＦＰＮ１载体、包含小鼠β酪

蛋白基因第一和第八外显子两端同源臂序列的 Ｔ载体

ｐＴｍＥｘｏｎ１和ｐＴｍＥｘｏｎ８由本实验室保存。

１．１．２　酶类及主要生化试剂　ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ

ＩＩＩ、ＮｃｏＩ购自宝生物工程（大连）有限公司；ＴａｑＤＮＡ

聚合酶、ｐｆｕＤＮＡ聚合酶购自天根生化科技（北京）有

限公司；Ｅｓｐ３Ｉ（ＢｓｍＢＩ）购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ

（ＨＣ）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；其他试剂均为国产分析纯。

１．１．３　引物　根据目的基因片段 ＤＮＡ序列和重组

ＤＮＡ理论序列，设计引物并加入 ＢｓｍＢＩ酶切位点（小

写斜体字母）和其他所需要的酶切位点（下划线部分）。

引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成（见表１）。表１　引物名称及序列

Ｔａｂｌｅ１　Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅ

Ｎａｍｅ 引物　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ

ＺＴＦＺＴＲＢ１ＬＦＢ１ＬＲＲｅｄ１ＦＲｅｄ１ＲＢ１ＲＦＢ１ＲＲＢ８ＬＦＢ８ＬＲＲｅｄ８ＦＲｅｄ８ＲＢ８ＲＦＢ８ＲＲ

ＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡｇａｇａｃｇＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＴＣｇａｇａｃｇＣＴＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＣＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＴＴＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＣＧＡＧＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＴＡＴＧＡＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＴＣＣＴＣＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＧＴＣｃｇｔｃｔｃＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＧＡＣｃｇｔｃｔｃＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＴＴＧＧＴ

１．２　方　法

１．２．１　同源重组靶向载体目的片段 ＰＣＲ扩增　针对

小鼠β酪蛋白基因第一和第八外显子，用 ４对引物

Ｂ１ＬＦ／Ｂ１ＬＲ、Ｂ１ＲＦ／Ｂ１ＲＲ、Ｂ８ＬＦ／Ｂ８ＬＲ 和 Ｂ８ＲＦ／

Ｂ８ＲＲ，以 ｐＴｍＥｘｏｎ１和 ｐＴｍＥｘｏｎ８为模版，扩增得到

目的片段Ｂ１Ｌ（１１５６ｂｐ）、Ｂ１Ｒ（１０３３ｂｐ）、Ｂ８Ｌ（９６５ｂｐ）

和Ｂ８Ｒ（７７１ｂｐ）。针对左右臂之间导入的红色荧光蛋

白基因序列，用引物 Ｒｅｄ１Ｆ／Ｒｅｄ１Ｒ和 Ｒｅｄ８Ｆ／Ｒｅｄ８Ｒ，

以ｐＤｓＲｅｄ２１为模版，扩增目的片段 Ｒｅｄ１（９１４ｂｐ）和

Ｒｅｄ８（８８１ｂｐ）。

１．２．２　中间载体 ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ构建　由于常用

载体多克隆位点ＩＩ型限制性核酸内切酶识别序列具有

回文结构，切割产生的粘性末端呈反向互补序列。反

向互补粘性末端存在，可能降低“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法

的效率［３］。为顺利实施“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆方案，本实

验将真核细胞表达载体 ｐＥＧＦＰＮ１进行改造，在

ｐＥＧＦＰＮ１载体多克隆位点导入一段两端含有 ＢｓｍＢＩ

酶切位点的外源 ＤＮＡ片段，构建了 ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ

中间载体。

　　以ｐＴｍＥｘｏｎ８为模板，ＺＴＦ／ＺＴＲ为引物，ＰＣＲ扩增

得到５９４ｂｐ的外源 ＤＮＡ片段，经 ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ双酶切，

将其克隆进入 ｐＥＧＦＰＮ１载体，构建得到 ｐＥＧＦＰＮ１

ＢｓｍＢＩ中间载体（图１）。

图１　中间载体ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ

Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒ

１．２．３　“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法组装同源重组靶向载体

　靶向载体构建方案示意图见图２。首先用琼脂糖凝

胶定量，调整目的片段 Ｂ１Ｌ、Ｒｅｄ１、Ｂ１Ｒ及 Ｂ８Ｌ、Ｒｅｄ８、

Ｂ８Ｒ浓度至 ４５ｎｇ／μｌ，调整中间载体质粒 ｐＥＧＦＰＮ１

ＢｓｍＢＩ浓度至８０ｎｇ／μｌ。采用１０μｌ反应体系：１０Ｕ／μｌ

Ｅｓｐ３Ｉ０．８μｌ，１０×Ｔａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ１μｌ，１０μｍｏｌ／ＬＤＴＴ１

μｌ，２０Ｕ／μｌＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ（ＨＣ）０．７５μｌ，２５μｍｏｌ／ｌ

ＡＴＰ０．４μｌ，３个插入片段各１μｌ，中间载体 ｐＥＧＦＰＮ１

ＢｓｍＢＩ１μｌ，用 ｄｄＨ２Ｏ补至 １０μｌ。反应条件：３７℃ ５

ｍｉｎ，１６℃ ５ｍｉｎ，共２５个循环，８０℃灭活２０ｍｉｎ。取

５μｌ连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞。过夜３７℃培养，

挑２０个长势良好的单克隆菌落，ＬＢ平板划线３７℃培

２１１

２０１３，３３（３） 梁　龙 等：“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法构建靶向载体

养，培养６ｈ后做菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆。

　　为检测中间载体经ＢｓｍＢＩ内切酶消化后在体系中

的自连率，平行做阴性对照实验，对照组反应体系只加

中间载体ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ，不加线性目的片段。

图２　载体ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲ和ｐＥＧＦＰ

Ｎ１ｍＥ８ＨＲ构建示意图

Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔＴａｒｇｅｔｉｎｇＶｅｃｔｏｒ

２　结果与分析

２．１　中间载体ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ酶切鉴定　　用ＢｓｍＢＩ酶切中间载体 ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ，理论酶切片段大小是４７２２ｂｐ与５７１ｂｐ（图１）。由图３可知，酶切结果与理论设计一致，说明载体 ｐＥＧＦＰＮ１多克隆位点成功引入 ＢｓｍＢＩ酶切位点，ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ中间载体构建成功。２．２　反应系统中缓冲液对酶活性影响分析及载体组装　　由于酶活性受反应溶液的影响很大，而 ＢｓｍＢＩ和ＤＮＡ连接酶共处同一反应体系，故应选择能够同时满足两种酶促反应的缓冲系统。根据 Ｓａｎｊａｎａ等［８］报道，

将ＢｓｍＢＩ和Ｔ７ＤＮＡ连接酶置于Ｔａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ中，连接了６个 ＤＮＡ片段。我们决定尝试在 ＢｓｍＢＩ适宜的Ｔａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ中采用Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆实验。将ＢｓｍＢＩ和Ｔ４ＤＮＡ连接酶置于１×Ｔａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ中，添加三个目的基因 ＰＣＲ片段和 ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ载体，分析反应体系缓冲系统对两种酶活性的影响。

　　由图４可知，１、３、５泳道都有一条大约５７０ｂｐ的ＤＮＡ片段，该片段是 ＢｓｍＢＩ酶切中间载体 ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ后产生的片段。Ｂ１Ｌ、Ｒｅｄ１和 Ｂ１Ｒ三个片段连

图３　中间载体ｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ鉴定

Ｆｉｇ．３　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒＭ：ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅ

ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ；２：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｓｍｉｄ

图４　重组靶向载体组装图

Ｆｉｇ．４　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ

ｔａｒｇｅｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒａｓｓｅｍｂｌｙＭ：ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ；１：ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲａｓｓｅｍｂｌｙ；２：Ｔｈｅ

ｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲａｓｓｅｍｂｌｙｗｉｔｈｏｕｔＢｓｍＢＩａｎｄＴ４ＤＮＡ

ｌｉｇａｓｅｅｎｚｙｍｅ；３：ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲａｓｓｅｍｂｌｙ；４：Ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆ

ｐＥＧＦＰＮ１Ｍｅ８ＨＲａｓｓｅｍｂｌｙｗｉｔｈｏｕｔＢｓｍＢＩａｎｄＴ４ｌｉｇａｓｅＤＮＡ

ｅｎｚｙｍｅ；５：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ＯｎｌｙａｄｄｅｄｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩｗｉｔｈ

ＢｓｍＢＩａｎｄＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅｅｎｚｙｍｅ）

接理论长度是 ３００９ｂｐ，图 ４第 １泳道在 ２０００～

４０００ｂｐ之间有一条大约３０００ｂｐ左右的暗带，该条带

应为三个插入片段连接后所得线性片段。Ｂ８Ｌ、Ｒｅｄ８、

Ｂ８Ｒ三个片段连接理论长度是 ２５２３ｂｐ，第 ３泳道在

２０００～４０００ｂｐ之间有一条大约２５００ｂｐ左右的暗带，

该条带应为三个插入片段连接后所得线性片段。初步

判断两个克隆体系中三个目的基因片段在该缓冲液中

“酶切连接”成功。

　　成功组装的 ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲ和 ｐＥＧＦＰＮ１

３１１

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．３２０１３

ｍＥ８ＨＲ线形载体，理论序列大小分别为７７３５ｂｐ和７

２４９ｂｐ。图４第１泳道在４０００～７０００ｂｐ之间有一条暗

带，应为成功组装的ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲ线形载体；第３

泳道在４０００～７０００ｂｐ之间有一条暗带，应为成功组

装的ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ线形载体。

２．３　重组靶向载体菌落ＰＣＲ鉴定

　　用 Ｂ１ＬＦ／Ｂ１ＲＲ引物，扩增目的片段 Ｂ１Ｌ、Ｒｅｄ１和

Ｂ１Ｒ片段连接产物３１０３ｂｐ，阳性对照用 ｐＴｍＥｘｏｎ１质

粒；用Ｂ８ＬＦ／Ｂ８ＲＲ引物，扩增目的片段Ｂ８Ｌ、Ｒｅｄ８、Ｂ８Ｒ

连接产物２６１７ｂｐ，阳性对照用 ｐＴｍＥｘｏｎ８质粒。由图

５ａ可知，检测２０个单克隆，其中２、３、５、１４、１５、１７、１８

及１９号样品ＰＣＲ扩增片段大小与理论大小相符，阳性

率４０％；由图５ｂ可知，检测２０个单克隆，其中３、７、１１、

１２及１６号样品 ＰＣＲ扩增片段大小与理论大小相符，

阳性率２５％。

图５　菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆

Ｆｉｇ．５　Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍ

ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｉｅｓＰＣＲ（ａ）Ｍ：ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ；１～２０：ＴｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＰＣＲｏｆｐＥＧＦＰ

Ｎ１ｍＥ１ＨＲ；２１：ＴｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＰＣＲｏｆｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ；２２：

Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２３：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ　（ｂ）Ｍ：ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ；１

～２０：ＴｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＰＣＲ ｏｆｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ；２１：Ｔｈｅ

ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｃｏｌｏｎｙｏｆｐＥＧＦＰＮ１ＢｓｍＢＩ；２２：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２３：

Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ

２．４　重组靶向载体 ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲ和 ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ的酶切鉴定

　　针对ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ１ＨＲ质粒，选择以下酶切组合鉴定：①ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ，酶切片段大小是 ７００ｂｐ和 ７０３５ｂｐ；②ＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩ，酶切片段大小是２４９ｂｐ、３６０ｂｐ、４２０ｂｐ、７０３ｂｐ、１１３３ｂｐ、１５１７ｂｐ和１５４４ｂｐ；③ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ，酶切片段大小是３０２２ｂｐ和４７１３ｂｐ。针对ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ质粒，选择ＢｇｌＩＩ进行单酶切鉴定，酶切片

段大小是２２６ｂｐ、４９７ｂｐ、１２０８ｂｐ和５３１８ｂｐ。

图６　重组质粒酶切鉴定

Ｆｉｇ．６　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ

ｅｎｚｙｍｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（ａ）Ｍ１：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：ＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩｅｎｚｙｍｅｒｅｓｕｌｔ；２：Ｂｇｌ

ＩＩ／ＮｃｏＩｅｎｚｙｍｅｒｅｓｕｌｔ、３：ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩｅｎｚｙｍｅｒｅｓｕｌｔ；Ｍ２：

ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ　（ｂ）Ｍ１：ＤＬ１００００ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅ；

１：ｐｌａｓｍｉｄ；２：ＢｇｌＩＩｅｎｚｙｍｅｒｅｓｕｌｔｓ

　　从图６ａ和图６ｂ可知，重组真核表达质粒 ｐＥＧＦＰ

Ｎ１ｍＥ１ＨＲ和ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ酶切验证正确。

２．５　重组靶向载体测序结果

　　ＤＮＡ测序结果显示，ＢｓｍＢＩ酶切产生的粘性末端

连接正确，目的片段之间实现“无缝”连接。ｐＥＧＦＰＮ１

ｍＥ１ＨＲ和 ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ载体目的基因的理论

序列与测序结果比对，同源率分别是 ９９．８７％和 ９９．

９６％。红色荧光蛋白报告基因序列同理论序列完全一

致，突变位点都不在编码区。ｐＥＧＦＰＮ１ｍＥ８ＨＲ载体

在Ｂ８ＲＦ引物处缺失一个碱基 Ｃ（图７ｄ），可能是引物

造成。

３　讨　论

　　１９７２年，Ｇｏｆｆ等［９］首次在体外实现了两种 ＤＮＡ分

子的重组。伴随基因工程发展，生物学家建立了多种

ＤＮＡ体外重组方法［１］。

　　“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法能够高效实现 ＤＮＡ片段间

无缝连接，自２００８年报道后，已经在合成生物学［１０］、人

工核酸酶和人工转录因子［４，６８］构建方面被采用。

　　“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆方案实施过程中，需要注意以

下几点。第一，ＤＮＡ片段之间连接的粘性末端序列设

计。理论上４个碱基的粘性末端有２５６种碱基排列，其

中回文序列有１６种排列，为防粘性末端自连而降低克

隆效率，设计者应该选用其他 ２４０种非回文排列序

列［３］。第二，选择合适的缓冲液。内切酶和连接酶同

４１１

２０１３，３３（３） 梁　龙 等：“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法构建靶向载体

图７　重组靶向载体测序

Ｆｉｇ．７　ＳｅｑｕｅｎｃｅｏｆＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇＶｅｃｔｏｒＴｈｅｊｏｉｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｔｏ

ｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄ．（ａ）ＴｈｅｊｏｉｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎＲｅｄ１ａｎｄ

Ｂ１Ｌ　（ｂ）ＴｈｅｊｏｉｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎＲｅｄ１ａｎｄＢ１Ｒ　（ｃ）Ｔｈｅｊｏｉｎｔｓ

ｂｅｔｗｅｅｎＲｅｄ８ａｎｄＢ８Ｌ　（ｄ）ＴｈｅｊｏｉｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎＲｅｄ８ａｎｄＢ８Ｒ

时存在于同一反应体系，缓冲液的选择尤为重要。而

ＮＥＢ公司关于 Ｔ４ＤＮＡ连接酶使用说明显示，在限制

性核酸内切酶４种ＮＥＢｕｆｆｅｒ中，Ｔ４ＤＮＡ连接酶都具有

有效活性①。据此能够推断，多数情况下，“Ｇｏｌｄｅｎ

Ｇａｔｅ”克隆法的反应体系可以考虑首选限制性内切酶的

缓冲液。第三，控制反应体系中目的片段及载体的浓

度。在内切酶含量一定的情况下，若目的片段及载体

浓度过高，可能会造成不完全酶切。本实验反应体系

中，三个目的片段终浓度为 ４．５ｎｇ／μＬ，载体为 １０ｎｇ／

μｌ。第四，中间载体酶切位点设计。Ｗｅｂｅｒ等［６］用

ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ克隆法组装人工转录激活样效应子，连接

目的片段达９个时，连接效率降低。本实验连接３个基

因片段，连接效率分别是２５％和４０％，而且阴性对照

“酶切连接”反应转化涂板后，产生大量单克隆菌落，

说明中间载体自连率较高。若要提高最终构建载体克

隆阳性率，设计时可在中间载体替换序列中再引入一

个ＢｓｍＢＩ酶切位点，能够降低中间载体的自连率，提高

“ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ”克隆法连接目的基因的效率。

　　由于该构建方案采用了 ＰＣＲ扩增，载体最终构建

结果必需通过测序证实。为降低 ＰＣＲ的突变率，应该

用高保真ＤＮＡ聚合酶。

参考文献

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ＴＡＬＥｔｙｐｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｂｙｍｏｄｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ

ＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０１１，３９（１３）：５７９０５７９９．

［５］ＳｚｙｂａｌｓｋｉＷ，ＫｉｍＳＣ，ＨａｓａｎＮ，ｅｔａｌ．ＣｌａｓｓＩＩＳｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅｓａｒｅｖｉｅｗ．Ｇｅｎｅ，１９９１，１００：１３２６．

［６］ＷｅｂｅｒＥ，ＧｒｕｅｔｚｎｅｒＲ，ＷｅｒｎｅｒＳ，ｅｔａｌ．Ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｄｅｓｉｇｎｅｒ

ＴＡＬｅｆｆｅｃｔｏｒｓｂｙｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１１，６（５）：ｅ１９７２２．

［７］ＣｅｒｍａｋＴ，ＤｏｙｌｅＥＬ，ＣｈｒｉｓｔｉａｎＭ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｓｉｇｎａｎｄ

ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｃｕｓｔｏｍ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ｏｔｈｅｒＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｂａｓｅｄ

ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｆｏｒＤＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０１１，３９

（１２）：ｅ８２．

［８］ＳａｎｊａｎａＮＥ，ＣｏｎｇＬ，ＺｈｏｕＹ，ｅｔａｌ．Ａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｌｉｋｅ

ｅｆｆｅｃｔｏｒｔｏｏｌｂｏｘｆｏｒｇｅｎｏｍｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，２０１２，７

（１）：１７１１９２．

［９］ＧｏｆｆＳＰ，ＢｅｒｇＰ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｖｉｒｕｓｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＳＶ４０

ａｎｄｌａｍｂｄａｐｈａｇｅＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｉｎ

ｃｕｌｔｕｒｅｄｍｏｎｋｅｙｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ，１９７６，９：６９５．

［１０］ＷｅｂｅｒＥ，ＥｎｇｌｅｒＣ，ＧｒｕｅｔｚｎｅｒＲ，ｅｔａｌ．Ａｍｏｄｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ

ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｍｕｌｔｉｇｅｎｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．ＰＬｏＳ

Ｏｎｅ，２０１１，６（２）：ｅ１６７６５．

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① ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２０２．ａｓｐ

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．３２０１３

ＡｓｓｅｍｂｌｙｏｆＴａｒｇｅｔｉｎｇＶｅｃｔｏｒｂｙＧｏｌｄｅｎＧａｔｅＣｌｏｎｉｎｇ

ＬＩＡＮＧＬｏｎｇ１　ＹＡＮＧＨｕａ２，３　ＹＡＮＧＹｏｎｇｌｉｎ２，３　ＬＩＵＳｈｏｕｒｅｎ２，３　ＰＩＷｅｎｈｕｉ２，３

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２００３，Ｃｈｉｎａ）

（２ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，ＸｉｎｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ）

（３ＫｅｙＬａｂｏｆＳｈｅｅｐＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＸｉｎｊｉａｎｇＡｇｒｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｉｈｅｚｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ‘ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ’ｃｌｏｎｉｎｇｉｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｙｐｅＩＩＳｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓａｎｄＤＮＡｌｉｇａｓｅｅｎｚｙｍｅｓｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｍｕｌｔｉｐｌｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｎａｄｅｆｉｎｅｄｌｉｎｅａｒｏｒｄｅｒｉｎｏｎｅｔｕｂｅａｎｄｏｎｅｓｔｅｐ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｙｉｅｌｄｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｓｔｈａｔｄｏｎｏｔｃｏｎｔａｉｎｕｎｗａｎｔｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｆｉｎａｌｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｆｔｅｒｊｕｓｔａｓｈｏｒｔｔｉｍｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｔｏｅｄｉｔｍｏｕｓｅβｃａｓｅｉｎｇｅｎｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅβｃａｓｅｉｎｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｌｏｃｕｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｔｈｅ‘ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ’ｃｌｏｎｉｎｇ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＤＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　‘ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ’ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｍｏｕｓｅβｃａｓｅｉｎｇｅｎｅ

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