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大黄鱼幼鱼肠道菌群多样性分析及其两菌株几丁质酶和脂肪酶基因的克隆与表达
许
洁
指导教师：艾春香
副教授
周志刚
研究员
厦门大学
学校编码：10384 分类号 密级
学 号：22420101151351 UDC
硕 士 学 位 论 文
大黄鱼幼鱼肠道菌群多样性分析及其两菌
株几丁质酶和脂肪酶基因的克隆与表达
Analysis of intestinal microbiota of juvenile Pseudosciaena crocea
(Richardson) and cloning, expression of chitinase and lipase gene
in two strains from intestinal microbiota
许 洁
指导教师姓名：艾春香 副教授
指导教师姓名：周志刚 研究员
专 业 名 称：海 洋 生 物 学
论文提交日期：2 0 1 3 年 0 5 月
论文答辩时间：2 0 1 3 年 0 5 月
学位授予日期：2 0 1 3 年 0 4 月
答辩委员会主席：
评 阅 人：
2013年 06月
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摘要 .............................................................................................................................. I
Abstract ................................................................................................................... III
缩略词 ........................................................................................................................ V
第一章 绪论 ......................................................................................................... 1
1.1 鱼类肠道菌群的形成........................................................................................ 1
1.2 鱼类肠道菌群的影响因素................................................................................ 1
1.3 鱼类肠道菌群的研究方法................................................................................ 3
1.4 鱼类肠道菌群的组成........................................................................................ 4
1.5 鱼类肠道菌群酶类的研究............................................................................... 5
1.5.1 几丁质酶的研究概况.............................................................................. 6
1.5.2 脂肪酶的研究概况.................................................................................. 8
1.6 本项研究的目的、意义.................................................................................... 9
1.6.1 大黄鱼（Pseudosciaena crocea）的概况 .............................................. 9
1.6.2 本研究的目的和意义............................................................................ 10
1.6.3 本研究的主要内容及其研究方案......................................................... 10
第二章 摄食不同食物的大黄鱼幼鱼肠道菌群多样性分析 ................................... 11
2.1 材料与方法...................................................................................................... 12
2.1.1 实验材料................................................................................................ 12
2.1.2 实验方法................................................................................................ 14
2.2 结果................................................................................................................. 16
2.2.1 样品中菌群的分类组成......................................................................... 16
2.2.2 样品中菌群的聚类分析......................................................................... 18
2.2. 3 样品中菌群的主成分分析.................................................................... 19
2.3 讨论................................................................................................................. 29
第三章 传统培养法分离大黄鱼幼鱼肠道内容物菌群 ........................................... 31
3.1 材料与方法...................................................................................................... 31
3.1.1 实验材料................................................................................................ 31
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3.1.2 实验方法................................................................................................ 32
3.2 结果.................................................................................................................. 33
3.3 讨论................................................................................................................. 34
第四章 大黄鱼幼鱼肠道内容物中 Citrobacter sp. P几丁质酶基因 chi-X 的克隆及
表达 ............................................................................................................................. 37
4.1 材料与方法..................................................................................................... 38
4.1.1 实验材料................................................................................................ 38
4.1.2 实验方法................................................................................................ 39
4.2 结果................................................................................................................. 47
4.2.1 几丁质酶基因 chi-X 全长的克隆 ........................................................ 47
4.2.2 几丁质酶基因 chi-X 的序列分析及结构预测 .................................... 49
4.2.3 chi-X 基因登录号 .................................................................................. 51
4.2.4 chi-X 原核表达体系的构建 .................................................................. 51
4.2.5 重组几丁质酶 CHI-X 的表达及检测 .................................................. 52
4.2.6 重组几丁质酶 CHI-X 的纯化及检测 .................................................. 53
4.2.7 CHI-X 作为几丁质酶的性质分析 ........................................................ 53
4.3 讨论................................................................................................................. 60
第五章 大黄鱼幼鱼肠道内容物中 Pseudomonas sp. X 产脂肪酶能力及脂肪酶基
因的克隆 ..................................................................................................................... 63
5.1 材料与方法..................................................................................................... 63
5.1.1 实验材料................................................................................................ 63
5.1.2 实验方法................................................................................................ 64
5.2 结果................................................................................................................. 67
5.2.1 三株菌株的生长曲线及分析................................................................ 67
5.2.2 三株菌株产脂肪酶能力的分析............................................................ 68
5.2.3 脂肪酶基因 lipase-X 全长的克隆 ........................................................ 69
5.2.4 脂肪酶基因 lipase-X 的序列分析及结构预测 .................................... 71
5.2.5 lipase-X 原核表达体系的构建 .............................................................. 74
5.2.6 脂肪酶 Lipase-X 在大肠杆菌中的表达及其检测 ............................... 74
5.3 讨论................................................................................................................. 75
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结语 ............................................................................................................................. 76
附录 ............................................................................................................................. 78
参考文献 ..................................................................................................................... 80
致谢 ............................................................................................................................. 95
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Abstract(in Chinese) .............................................................................................. I
Abstract(in English) ............................................................................................ III
Abbreviations .......................................................................................................... V
Chapter 1. Introduction ........................................................................................ 1
1.1 Development and establishment of intestinal microbiota of fish ................. 1
1.2 Factors affecting the establishment of intestinal microbiota of fish ............ 1
1.3 Methods for researching intestinal microbiota of fish .................................. 3
1.4 Microbial composition of intestinal microbiota of fish ................................. 4
1.5 Enzyme-producing microorganism from intestinal microbiota of fish ....... 5
1.5.1 Present situation of chitinase .................................................................... 6
1.5.2 Present situation of lipase ......................................................................... 8
1.6 Objective, significance of the research ........................................................... 9
1.6.1 Present situation of Pseudosciaena crocea ............................................... 9
1.6.2 Main objective and significance of the research ..................................... 10
1.6.3 Content and protocol of the research ...................................................... 10
Chapter 2. Analysis of intestinal microbiota of juvenile Pseudosciaena
crocea fed with two different diets .................................................................. 11
2.1 Material and method ..................................................................................... 12
2.1.1 Experimental material ............................................................................. 12
2.1.2 Experimental method .............................................................................. 14
2.2 Results ............................................................................................................. 16
2.2.1 Microbial composition in samples .......................................................... 16
2.2.2 Cluster analysis of microorganism in samples ........................................ 18
2.2.3 Principal component analysis of microorganism in samples .................. 19
2.3 Disscussion ...................................................................................................... 29
Chapter 3. Isolation of the microorganism in the intestinal contents
of juvenile Pseudosciaena crocea by traditional culture method ......... 31
3.1 Material and method ..................................................................................... 31
3.1.1 Experimental material ............................................................................. 31
3.1.2 Experimental method .............................................................................. 32
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Contents
3.2 Results ............................................................................................................. 33
3.3 Disscussion ...................................................................................................... 34
Chapter 4. Cloning,expression and characterization of a chitinase
gene chi-X from Citrobacter sp. P isolated from the intestinal contents
of juvenile Pseudosciaena crocea ..................................................................... 37
4.1 Material and method ..................................................................................... 38
4.1.1 Experimental material ............................................................................. 38
4.1.2 Experimental method .............................................................................. 39
4.2 Results ............................................................................................................. 47
4.2.1 Cloning of chitinase gene chi-X ............................................................. 47
4.2.2 Sequence analysis and protein structure prediction of chi-X .................. 49
4.2.3 The accession number of chi-X .............................................................. 51
4.2.4 Construction of expression system ......................................................... 51
4.2.5 Expression and detection of recombinant chitinase of CHI-X ............... 52
4.2.6 Purification and detection of recombinant chitinase of CHI-X .............. 53
4.2.7 Property analysis of CHI-X .................................................................... 53
4.3 Disscussion ...................................................................................................... 60
Chapter 5. The determination of lipase-production, cloning and
expression of a lipase gene from Pseudomonas sp. X isolated from the
intestinal contents of juvenile Pseudosciaena crocea ................................ 63
5.1 Material and method ..................................................................................... 63
5.1.1 Experimental material ............................................................................. 63
5.1.2 Experimental method .............................................................................. 64
5.2 Results ............................................................................................................. 67
5.2.1 Growth curve of three strains .................................................................. 67
5.2.2 Lipase-production analysis of three strains ............................................. 68
5.2.3 Cloning of lipase gene lipase-X .............................................................. 69
5.2.4 Sequence analysis and protein structure prediction of lipase-X ............. 71
5.2.5 Construction of expression system ......................................................... 74
5.2.6 Expression and detection of recombinant lipase of Lipase-X ................ 74
5.3 Disscussion ...................................................................................................... 75
Epilogue .................................................................................................................... 76
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Contents
Appendix .................................................................................................................. 78
References ................................................................................................................ 80
Acknowledgements ............................................................................................... 95
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摘要
I
摘要
鱼类肠道中存在丰富的菌群，它们通过分泌酶类和产生活性物质参与宿主的
生命活动，与机体的免疫和营养密切相关。本实验采用高通量测序技术
（high-throughput sequencing）中的 454 焦磷酸测序技术（454 pyrosequencing）
分析分别摄食配合饲料或冰鲜鱼的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）幼鱼肠道壁和
肠道内容物中的菌群；采用传统培养法筛选分离出大黄鱼幼鱼肠道内容物菌群，
基于培养分离的幼鱼肠道内容物的菌株，采用 Fusion primer and nested integrated
PCR（FPNI-PCR）方法从柠檬酸杆菌 P（Citrobacter sp.P）克隆出几丁质酶基因
chi-X，并在大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)中表达，探讨该酶的性质；测定
假单胞菌 X（Pseudomonas sp. X）分泌脂肪酶能力，采用 FPNI-PCR 克隆出脂肪
酶基因 lipase-X，构建大肠杆菌表达体系。得到结果和结论如下：
1. 摄食不同食物的大黄鱼幼鱼肠道壁及其内容物菌群多样性分析
454 焦磷酸测序结果表明，大黄鱼幼鱼肠道内容物及肠道壁中变形菌门
（Proteobacteria）为主要优势菌，其次是梭杆菌门（Fusobacteria）及厚壁菌门
（Firmicutes）。
基于 16S rRNA V3 区 454 焦磷酸测序结果的聚类分析显示：摄食配合饲料
和冰鲜鱼的大黄鱼幼鱼肠道内容物及其肠道壁中的菌群差异明显。相同处理组的
大黄鱼幼鱼肠道内容物和肠道壁的菌群相似。基于 16S rRNA V6 区 454 焦磷酸
测序结果的聚类分析显示：摄食配合饲料大黄鱼幼鱼肠道内容物和肠道壁菌群较
相似，摄食冰鲜鱼幼鱼肠道内容物与肠道壁菌群差异较大。主成分分析结果发现，
食物种类是主要影响因子。
2. 摄食冰鲜鱼的大黄鱼幼鱼肠道内容物菌群的培养分离
采用传统培养法共鉴定出 17 种细菌及 6 种真菌，分别属于芽孢杆菌属
（Bacillus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、寡单胞菌
属（Stenotrophomonas）、迪茨菌属（Dietzia）、摩根氏菌属（Morganella）、假单
胞菌属（Pseudomonas）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢菌属（Cladosporium）、红
酵母属（Rhodotorula）、菌绒孢属（Mycovellosiella）、青霉菌属（Penicillium）及
大单孢属（Aplosporella）。
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摘要
II
3.大黄鱼幼鱼肠道内容物中柠檬酸杆菌 P 的几丁质酶基因 chi-X 的克隆及表达
采用 FPNI-PCR 从柠檬酸杆菌 P 克隆出几丁质酶基因 chi-X，在大肠杆菌
Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达，并测定该酶的性质。chi-X 基因登录号为
GenBank KC290945。根据预测结果，chi-X 编码的氨基酸序列含 493 个残基及几
丁质酶 18 家族催化域，与其他几丁质酶基因相似性低于 63%。重组蛋白 CHI-X
经镍柱层析后得以纯化。以胶体几丁质为底物时，纯化蛋白 CHI-X 最适反应 pH
为 4.0，pH 3.0-8.0 时其相对酶活大于 60%；最适反应温度为 60℃；在 pH 3.0-11.0
范围内，温度低于 60℃时保存稳定；其比活为 137.65 U/mg 蛋白；Km 和 Vmax
值分别为 6.24 mg/mL 和 2.49 µmol/min；Mn2+促进其酶活、Ag
+抑制其酶活；具
有抗蛋白酶性质；酶解产物为 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和 N,N’-二乙酰壳
二糖（GlcNAc2）。CHI-X 能降解胶体几丁质和虾壳几丁质。
4.大黄鱼幼鱼肠道内容物中假单胞菌 X 产脂肪酶能力及脂肪酶基因的克隆
采用对硝基苯酚法（pNP method），以 4-硝基苯基癸酯为底物，测定脂肪酶
酶活。假单胞菌 X 在 LB 液体培养基中产胞外脂肪酶量为 2.99 U/L。采用
FPNI-PCR 从假单胞菌 X 中克隆出脂肪酶基因 lipase-X，并成功构建了其大肠杆
菌表达体系，初步鉴定重组蛋白 Lipase-X 的表达量为 5 U/L。lipase-X 长度为 834
bp。据预测，lipase-X 可能含 α/β 水解酶 1 家族（α/β hydrolase-1），α/β 水解酶 3
家族，水解酶 4 家族（Hydrolase-4）及未知功能的 DUF1057 结构域。
关键词：大黄鱼幼鱼；肠道菌群；高通量测序；传统培养法；几丁质酶基因；脂
肪酶基因；克隆
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