第三节

大肠杆菌分子克隆载体

一、 E.coli 克隆载体的种类 1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体— λ ， P1 和 M13 、 fd 载体，

复制起点来自噬菌体。 3. COS 质粒载体—质粒载体中插入 λcos 片段，

以利于体外包装 4. 噬粒载体（ phagemid ）—有质粒和 M13 、

fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。

二、质粒与质粒载体 1. E ． coli 的质粒种类 1) colE1 因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接

合转移 DNA ，属高拷贝松弛型。 2) R 因子（抗药性因子） 可接合转移 DNA ，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F 因子（性因子）

2. 质粒的特点 1) 质粒 DNA 复制与染色体复制无关 2) 质粒 DNA 以超螺旋形式存在 3) 质粒 DNA 可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒 DNA 的消除—化学和物理法 ( 吖啶染料，

EtBr ，高温等 )

6) 质粒的整合— F 因子又可整合到 E.coli 染色体中

3. 质粒 DNA 的转移 1 ）质粒 DNA 的转移过程

donor cel l Reci pi ent cel l

ni ck- l i gat i on at or i T

donor cel l

3)分离2) t r o基因表达1)重新环化

DNA转移

供体接合 DNA合成

t r aT

稳定化

细胞壁接触不稳定接合对

性繖毛收缩

繖毛结合-性繖毛 细胞壁接触

+

+

质粒的自主转移过程

5'3'5'3'

质粒 DNA 的转移和复制

2 ）质粒转移的必备条件 ⅰ. 转移起点 (oriT), 它是质粒 DNA 转移时的复制起点—

顺式 作用（ cis-action ） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ. 转移过程所需的全部酶类—反式作用 3 ）质粒转移类型 ⅰ. 自我转移（ Self-transmissible ） ⅱ. 辅助转移（ Donation ）—可转移质粒仅具备 oriT ，

若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。

ⅲ. 重组转移（ conduction ）—若质粒无 oriT ，该质粒只有整合到辅助质粒 DNA 中，重组质粒便可转移。

因此，用于克隆外源 DNA 的分子克隆载体，只要具备oriT 即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有 oriT ，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。

+ +

导入

自主转移

H ++H

donor

DNA无 转移

H 辅助转移

H

质粒自主转移

R +R R RR+

Not r ansf er

+H H

重组

DNA 转移

质粒的辅助转移

质粒的重组转移

R- 重组 DNA 分子

     4. 质粒 DNA 的复制和调节控制 1) 复制机制—复制方向、终止和方式    2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需

高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。

3)  质粒的复制调控机制 例子 : ColE1 质粒的复制及复制起点结构

Boros etal.(1984) 分离到一个 pBR322 突变体，其拷贝数可达 1000/ cell 或 65% 总 DNA ，原因是在 RNAI 基因的 3' 端附近发生一次 G→T 颠换。

- 555bpRNA I I ( pr i mase) or i

RNaseH

ColE1 质粒复制起点结构

质粒 DNA 的复制过程

5. 大肠杆菌质粒载体   1) 常用质粒载体的复制子 质粒载体 复制子来源 拷贝数 pBR322 系列 pMB1 15-20

pUC 系列 pMB1 500-700

pACYC 系列 p15A 10-12

pSC101 系列 pSC101 25

colE1 colE1 15-20

    2) 质粒载体常用的遗传标记基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZα

    3) 多克隆位点区 大多数从 pUC 系列中的多克隆位点衍生出来的

6. 实例— pUC18 和 pUC19 pUC 系列质粒载体由 Messing et al. 构建，具有三

个显著特点： 1 ）分子量小，仅为 2.7KB ，容纳外源 DNA 量增大 2 ）易于检测是否有外源 DNA 插入的标记基因 LacZα

3 ）多克隆位点区 ⅰ. 多克隆位点成对地存在于 pUC18 和 pUC19 中，位点排

列顺序相同，但方向相反。 这种排列方式有利于外源 DNA 的克隆和定向插入 ⅱ. 产生不同末端规律排列 : 两端限制酶位点产生 5’— 突

起端（ EcoRI 和 HindⅢ），与之相邻的两个限制酶位点产生 3’— 突起端（ SstI 、 KpnI 、 SphI 、 PstI ），中央四个限制酶位点产生 5’— 突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入 DNA 片段的单向缺失和缺失片段的回收。

E co S ac K p n S m a B am X b a S a l P st S p h H inR I I I I H I I I I I d III

p U C 1 8

p U C 1 9

H in S ph P st S a l X b a B am S m a K p n S ac E cod III I I I I H I I I I R I

Ap

Or i

LacZ

( 2. 68kb)

r

pUC18 和 pUC19 载体

如插入片段的 5’段定向缺失 : XbaI→SphI→Exo →S1→TⅢ4 DNA lingase; 插入片段的 3’- 端亦可采用类似的方法进行缺失（ SmaI→SstI→Exo →S1→T4 DNA lingaseⅢ ）

不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如 : pBS+ 多克隆位点区的排列顺序是 (见图 ) ：

假设有一 EcoRI→Hind DNAⅢ 片段，并要求在其 3’-

末端或 5’- 端接上另外的 DNA 片段（如终止子、启动子），显然， pUC 系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用 pBS+ 中的多克隆位点区就能满足要求。

ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制。

除上述三个特点外， pUC 系列载体还可用于表达外源基因 （ LacZα启动子）。

P la c

P la c

L a cZ α

o ri

o ri

F 1 (-)

A m p r

T 3 T 7

p B S -S K (-)

p B S -K S (-)

p B S( 3. 0 kb)

pBS 载体的结构

三 .  噬菌体载体 1. 噬菌体 λ 载体 1 ） λ 的结构和特点 i. 一般结构： 48,502bp ，线状 ds-DNA ，两端具有 12n.

t 5‘- 突起（ 5’-GGGCGGCGACCT-3’ ）该末端称为 cos 位点，可被 λ编码的末端酶所识别（该酶由 λ末端的两个基因 Nul 和 A编码蛋白 gpNul 和 gpA 组成）

ii. 基因结构— 46 个基因，分为以下四类： ⅰ) 调控基因： CⅢ、 N 、 CI 、 Cro 、 C —Ⅱ 决定进

入溶源化还是裂解状态 ⅱ) DNA 复制： O 、 P 、 Q ⅲ)λ 重组： int 、 xis 、 redβ 和 gam ⅳ) 噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头 (A-F) 、尾 (E-J) 、

S & R （细胞裂解） λ 中部约 1/3 的 DNA(b2) 与 λ 存活无关。

w G T A B C D E Z U V H K I J N O P Q S R

免疫和调控

整合

切除、重组 DNA合成

宿主裂解at t

PI

ki l

t LOL

PL

N

PMt M Or iPR t R1

O R

T R2

cIi nt exo cI I I r el O P Q S R

PR

Cr o

t L OL OR t R1

PL

t R2

N

P' R

后早期

激活

后期

t M

PM

P E

CI 阻遏物

溶源性建立和保持

M L

头 尾

Pi

大肠杆菌 λ 噬菌体的基因和表达调控

2) λ 噬菌体基因的表达 i. 最早期转录：转录起始于 CI 基因两侧的 PL 和 PR启动

子，止于 N 和 Cro末端的 tL 和 tR1 ，有的右向转录物可継续通过 O 和 P 止于 tR2 。

ii. 后早期转录： N 蛋白可使宿主细胞转录终止因子 ρ

失活，导致转录通过 tR1 、 tR2 和 tL 进入其余早期基因区域。

iii. 后期转录： cro 蛋白可与 OL 和 OR 结合，阻止 RNA

聚合酶与 PL 和 PR 结合，转录终止，此时已合成了足够多的控制蛋白 Q ，它对 P'R 起激活作用，导致后期基因转录。

iv. DNA 复制：因早期转录获 DNA 复制蛋白 O 和 P ，双向复制开始。

v. 包装： Nul 和 A 蛋白与 λDNA 的 cos 位点的识别与切割， FI 蛋白促进 DNA 进入头部蛋白， DNA充满后，gpw 和 gpFⅡ将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒。

vi. 裂解：基因 R 和 S 产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗粒释放。

vii. 溶源反应： CⅡ和 CⅢ基因产物分别激活 PE 和 PI 的左向转录，致使 CI 和 int 基因表达， CI 产物可阻止早期转录，导致后期基因表达受阻。

对于裂解反应和溶源反应的选择，取决于感染细胞中一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。

* 当 λDNA注入宿主细胞后，线状 DNA首先环化为环状DNA ，这种环化有以下几点好处：

a. 若为单向复制，不管从何处开始复制，全基因组均 可全部复制

b. 噬菌体 DNA 插入宿主染色体 DNA ，只需一次位点特异性重组

c. 拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋 d. 受损的基因组增大了存活的可能性，因为双向复

制不会受阻于 损伤的 DNA链，而单向复制就不能通过

3) λDNA 的复制

细胞外

细胞内

4) λDNA 的包装过程  头—尾连接器由 12 分子 gpB 构成中空结构， groE1 和 gro

ES负责装配  pX 由 10 个杂合的 gpC 和 gpE 构成，使连接器定位  gpW 和 gpFⅡ结合在连接器上，防止 DNA 外泄，提供尾部

粘着点末端酶由两基因产物组成（ Nul 和 A ）， gpNul2-gp

A1 (20,444 x 2 + 72,280 = 113,168)

该酶具有以下多种酶活性： 1 ）特异 DNA 位点结合； 2 ）特异位点切口形成； 3 ）头前体结合； 4 ） gpFI 结合； 5 ） c

os 位点变性； 6 ） DNA 转位； 7 ） DNA序列扫描； 8 ）ATP 结合； 9 ） ATP水解。

因此，头部蛋白 gpE和 gpD 以及包装蛋白 gpA 是 λDNA形成噬菌体颗粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这一结论

-头 尾连接器gp B

gp N u 3gp gro E Lgp gro E S

gp c .E

gp N u 3

gp E

p x gp c

gp A

gp N u 1

E .co li

E .co li IN F O r

T H F

gp F II gp w

gp D

末端酶I I复合物

( F1可促进该复合物形成）

扩张

I复合物λ D N A

N u 1 左端 A B C N u 3 D E F I F IIW

λDNA 的包装

5 ） λDNA 作载体的缺点和解决办法 i.λ头部只能容纳自身 DNA 的 78-105% ，即 39-52.5 Kb ，

天然 λ 仅可插入 3 Kb 外源 DNA 片段—除去所有与 λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入 22 Kb 。

ii. 同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源 DNA 插入—体内突变和建立新的克隆位点。

ⅲ. 重组的 λDNA 分子难于直接导入宿主细胞—利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入 DNA 。

6) λ 载体的种类 i. 插入型—即将外源 DNA直接插入已构建载体中，如 λ

gt11 ，可以插入长达 7 Kb 的 DNA 。这类载体被限制酶切成左右臂。

ⅱ.取代型—即利用一段外源 DNA去取代载体中的一段DNA ，而这段 DNA 常含有一定的标记基因。这类载体常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。

* 有的取代型 λ 载体亦可用作插入型载体 ,如 Charon 4A

左臂 隔离段

右臂E X b E E 50 k b

lac5 b io25 6 K H 54 n in 5 Q S R 80

限制酶 克隆方式： E coR I 取代法

E E

20 .1 k b 7 .1k b

X b I 插入法X b X b

5 .64 0

大肠杆菌 λ 载体Charon 4A

red gam red gam P2 导入

DNA外源 取代

无噬菌斑λ + λ

P 2导入

滚环复制λ -

Spi 重组子的筛选

7) λ 载体的遗传标记基因和重组子筛选 由于 λ 载体或重组 DNA 是通过感染途径进入宿主细胞的，因而形成的噬菌斑就是一个明显的标记。用于重组子检测的遗传标记基因主要有 lacZ 基因。不管是用插入或取代法，该标记基因均会失活。 利用 spi-选择重组子：野生型 λ 不能在 P2溶源化菌种中成活，称之为 spi+(sensitive to P2 interference) ，这与 red 和 g

am 基因有关。若用外源 DNA将这些基因取代，形成的重组DNA 分子可在 P2 菌中株中存活，并形成噬菌斑。 λ 载体 λ1

059 、 λL47.1均属此类，这种选择方式亦称之为显性选择。

2. P1 噬菌体载体 1)   基本结构与特征 i.   基因组长 88 kb, 在噬菌体颗粒中的 DNA长 100 kb,

呈线状 , 其中约有 12% 的多余 DNA;

ii.  可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中 , 又可以烈性噬菌体形式进行复制 ;

iii. P1 噬菌体包装原理 : 渐进满头机制（ processive hea

dful mechanism ） 底物 : 滚环复制过程形成的头尾相连串状体

包装过程 : 始于一个长 162bp 的 P1 pac 位点，识别和切割此位点的是 P1编码的 pacase ，切出的 pac 一端进入预制头部，当其头部充满 DNA 后， DNA再次被切。第二次切割是随机的，无特异性 DNA序列。第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始。因此，多次包装都是从一个pac 位点开始的。 P1头部可容 110Kb 。 pac 位点 : 一端含 4 个六聚体 (5’ TGATCA/G 3’) ，另一端则有三个，中间区域长 90 bp ， pacase切点位于靠近90 bp 区的中心序列。每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点 (dam→GATC), pacase 只作用甲基化的 pac 位点 .

P acP1 ( 88 kb)基因组大肠杆菌P

1

噬菌体基因组和包

装

2) P1 载体 ---pAd10 sacBⅡ i. 优点 i)   可克隆较大插入片段 , 可插入 95Kb 外源 DNA ，

二倍于 cos 质粒载体 ii)  较高的转化频率 , 1~2μg 载体 + 2~4μg 外源 DNA→

105 转化子 iii)   与 YAC 载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片

段 ; 易于获得大量特定的克隆 DNA; 克隆过程更可靠 ; 克隆片段易于进行次克隆

ii. 结构 载体被二个 loxP 重组位点分隔为两区— Ampr 和 Kan

r 区 Ampr 区：来自 pBR322 的 ori, pac 位点 ( 反时针

包装 ), 来自腺病毒的 11Kb填充片段 ( 插入到 ScaⅠ位点 )

Kanr 区： Kanr(Tn903) 和 Tetr 基因， P1 质粒复制子和分离系统， P1裂解复制子，其活性受 lac操纵基因启动子控制

E .co li p ro m o tersa cB

P 1 rep re sso rb in d in g s iteT 7 T 3

S a lI

S fiI N o tI B a m H I

lo x PA m p

A d 1 0 p A D 10sacB II(2 9 .3 k b )X b a I

S ca I

p a c

lo x P

te t

ly t R e p

p la sm id R ep

k a n r

大肠杆菌 P1 噬菌体载体 p Ad10 sacBⅡ

sa cB B a m H I

+

9 5 k b D N A frag m en t

p ac lox P

sacB K an

D N A h ea d fu l

+ +

C re

R eco m b i- la tion

D N A

A m p lifi- ca tio n

p ac cleava gep rote in

lo x PA m p

A d 1 0 p A D 1 0sa cB II(2 9 .3 k b )X b a I

S c a I

p a c

lo x Ply t R e p

p la s m id R e p

k a n r

r

P1 噬菌体载体构建基因组文库的示意图

pAd10 sacB Ⅱ ScaI+BamHI

长臂 + 短臂 加入外源

DNA 片段 重组 DNA 分子

离体包装 感染宿主细胞

SacB 基因 :编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在 2% 以上蔗糖培养基中时 ,果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆菌细胞死亡 SacB 基因被克隆到原 Tetr 基因的 BamHI- SalI间 , 在其上游加上 E.coli 基因启动子 , 克隆位点 BamHI 位于这两个 DNA 片段间 , 外源 DNA 片段插入时可进行显性筛选重组子 为了使 sacB 基因自发突变减小到最小限度 ,sacB 基因上游还有一个 P1 C1阻遏物结合位点与其启动子重叠。凡是表达 P1 C1

基因的细胞， sacB 基因表达受阻，在无蔗糖条件下，这种细胞会生长得更好 iii. 克隆策略 3.3kb短臂：含 pac,loxP, 无启动子的 sacB

26kb长臂 : 含 P1裂解复制子， Kanr ， P1 质粒复制子，loxP 位点

包装 : 重组 DNA 分子先用 pacase 或抽提物Ⅰ酶切 pac 位点，然后用抽提物Ⅱ（含头部和尾部）进行包装直至头部充满 DNA ，最后与尾部相连成有感染力的重组 P1 噬菌体颗粒。

iV.   重组 DNA 分子形成 当重组 DNA 分子进入宿主细胞后，特异性位点重组发

生在两个方向相同的 loxP 位点，该过程由宿主细胞表达的重组酶（ Cre ）催化

v. 宿主菌 E.coli NS3529 菌株基因型 recA- ， lacⅠq ， mcrABC ，

mrr: recA-:防止插入 DNA 片段内的同源重组，以免发生重排 ; lacⅠq : 抑制 P1裂解复制子的激活 , 使 P1 质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在，亦防止外源 DNA 分子重排 ;

mcr 和 mrr: 抑制富含 GpMeC 或 ApMeC 插入片段的选择性丢失

3. M13 和 fd 载体 1)  结构特征—环状 ssDNA ，病毒颗粒呈丝状 2)   复制过程： ss （ + ） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min→∞)DNA 包装无严格限制 3) 生活史 a.  病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和 A 蛋白附着于性纤毛顶端

（ E.coli 中 F 因子提供） b. 病毒 DNA 和 A 蛋白进入细胞内，大部分衣壳蛋白则留在

细胞膜上 c. 病毒 DNA 变为双链复制形式（ RF ） , 衣壳蛋白可能为

DNA 复制提供附着位点 d. RF 进行滚环复制，形成单链，同时基因与蛋白质结合 e. ssDNA环化，并形成线状的 DNA— 基因与蛋白质复合物 f. 病毒 DNA穿膜时，基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋

白取代，完整病毒从细胞中释放，释放时不杀死细胞，但因感染细胞生长缓慢，仍然可见噬菌斑

M13 噬菌体的生活史

1 ）基因结构 基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装 基因Ⅱ参与 DNA 复制 基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ编码M13 的结构蛋白 基因Ⅴ参与单链复制过程中的环化作用 基因Ⅵ是衣壳蛋白的重要组成部分 2 ） M13mp 系列载体 a.  特点：在 IR 区中插入一个 lacZα 基因，然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区， ds-DNA 可用常规方法直接导入，ss-DNA 常用感染的方法 噬菌斑的形成用于选择 DNA导入的细胞，在 X-Gal平板上形成的无色噬菌斑检测重组子 b. 优点：易于获得 ss-DNA 用于 DNA序列测定和基因突变，从细胞中易于检测分离到 RF 型的 ds-DNA 用于外源 DNA 重组M13mp 系列载体的多克隆位点区

四 . COS 质粒载体 1. 结构特点：在普通质粒载体中插入一个或两个来自

λ 的 cos 位点片段 , 双 cos 载体比单 cos 载体易于重组   cos 位点的精细结构 cos长 200 bp ，由以下几个亚单位组成： a. cosN— 由 λ末端酶的 gpA亚基识别和切割，产生 5-12

n.t 突起； b. cosB— 分别位于 cosN 的两侧，称之为 cosBL （左

侧）和 cosBR （右侧），为蛋白质结合位点。 R1 、 R2 和 R3长 16 bp ，其中有 12 个 n.t 相等，可

与 gpNul 蛋白进行体外结合。 R4 与上述三个 R 片段仅有 8 个 n.t 相等，不能与 gpN

ul 蛋白进行体外结合，但可以和全酶结合（ ATP 存在时）。

I1 为 IHF 结合位点。

C o s B

C o sN R 3 I1 R 2 R 1 N u 1

+ 20 0-8 0

COS 位点的结构

2. 优点 ⅰ. 容量大（可达 48 kb ），用于基因簇的克隆 ⅱ. 形成的重组 DNA 分子可进行体外包装，并能感

染 E.coli 细 胞（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）

ⅲ. 操作简便，可直接转化细胞 ⅳ. 对重组 DNA 分子长度具有选择性包装 3. 遗传标记：与质粒载体相同，利用抗生素抗性选

择转化子 例子 : pJB8 和 C2XB

C 2 X B(6 .6 k b )

C O S

C O S

S m

B

HCE

A m p r C O S

p J B 8(5 .4 k b )

P

E B E

C H

S m A

COS 质粒载体结构图

五 . 噬粒载体（ phagemid ） 1. 结构特点：在质粒载体中插入一段 M13 或 fd 的复

制起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链

2. 优点 ⅰ. 可以质粒方式复制，高拷贝存在于 E.coli 细胞中，

便于大量提取质粒 DNA 用于 DNA 重组 ⅱ.当有辅助噬菌体存在时（如M13K07 和 R408 ），

噬质粒重组 DNA 分子将以 f1 复制起点开始进行复制，形成单链 DNA 和噬菌体颗粒，形成的单链 DN

A 可用于定序和特异位点突变

T7

Apr

F1 or i

pGEM- 5Zf ( - )( 3003 bp)

or i

l acZMCS

Sp6

T7

Apr

F1 or i

pGEM- 5Zf ( - )( 3003 bp)

or i

l acZMCS

Sp6

噬粒载体 pGEM结构