第一組蛋白質立體結構的測定

• NMR

• X-Ray

• CD

NMR(nuclear magnetic resonance )

核磁共振

前言 簡介• 約 15,000 種蛋白質的三維結構已被解出，

80% 是用 X-ray 解出， 20% 用 NMR 解出

• NMR 解出三維結構時不需要長單晶 (single crystal) ，只要溶在水溶液當中即可，比較符合生物巨分子的生理狀態。

NMR 產生訊號的原理

1. C 、 N 、 H 、 S 等 atoms 的同位素 label → l 不等於 0 → 始可產生 NMR 訊號

〈補充〉每個元素中的核子 (nucleus) ，其磁自旋量子數(magnetic spin quantum number) 以 I 來代表。

若 I ≠ 0 ，此核子在磁場中，會產生 NMR 訊號若 I = 0 ，此核子在磁場中，無法產生 NMR 訊號。

質量數和質子數均為偶數的原子核， l=0

質量數為奇數的原子核， l= 半整數 質量數為偶數，質子數為奇數的原子核， l= 整數

核磁共振儀的射頻器 (transmitter) 打了一個脈衝 (pulse) ，將此淨磁化量偏移 z 軸，此偏移的磁化量就沿著磁場方向 (z 軸 ) 做進動 (precession) 。造成此磁化量形成陀螺的軌跡，如下頁圖所示。此磁化量的軌跡，會引導一個振盪電流而被記錄下來。

2 . 從 NMR 的 peak area 和高度比可知特定原子的數量和原子鍵結的環境。

NMR 的光譜分析• 一維： H 太多 → 訊號複雜 → 難以分析

• 二維： NOE 效應 →可得知原子間的距離

• 三維： NOE 效應 +TOCSY 技術 +NOESY 技術 → 旋性、凡得瓦半徑、鍵角 → 輸入 computer run 出可能的三度結構

〈補充〉 NOE 效應 (Nuclear Overhouser Effect)

• NMR 之所以能解出蛋白質分子在水溶液的三維結構，主要的就是要靠 NOE 效應。

• NOE ＝ (I ′ － I0) / I0

• I ′ 為質子對被照射時的 intensity

• I0 為質子對未被照射時的 intensity

• 如果 NOE 愈強，表示二質子間距離愈短。• NOE 的大小與質子對之間距 (γ) 的 6 次方

成反比： NOE 1 / γ∝ 6

NMR 的研究領域 一、蛋白質與分子之結合 (Interaction) 利用核磁共振技術我們可輕易地藉由

測量化學位移擾動 (chemicalshift perturbation) 的方式找出 protein 與 ligand 作用的殘基，亦可進一步解出整個 complex 的結構。化學位移的擾動主要是因為 protein 與 ligand 結合後某些殘基會和 ligand 接觸或作用，而使得化學環境改變，藉由測量各個殘基化學位移的變化情形，便能找出 ligand 的結合位置 ( 活性位置 ) 。

二、蛋白質分子之折疊 (Protein Folding)

•自然界中所存在的折疊構形約只有 1,000- 5,000 種。 •且有許多蛋白質屬於同一個 family ，具有高 度的 sequence homology 。•定出這 1,000-5,000 種蛋白質的折疊構形並 研究這些構形所具有的生化活性，便能提供 其他屬於同 family 的蛋白質在結構與功能上 的資訊。

優缺比較 • X-ray 繞射技術

§ 快速且較不受分子量的限制§ 但是並不是每一種蛋白質都能得到良好的結晶， ( 蛋白質結晶的取得仍是現今結晶技術的一大挑戰 )

• 核磁共振§ 找尋蛋白質結構較耗費人力及時間§ 圖譜分析的工作是既複雜又費時

X-Ray Crystallography

原理 :所謂 X-Ray繞射結晶法即是利用X-Ray射向蛋白質晶體使X-ray 產生繞射，經由繞射使照相底片曝光而產生一投影圖形，再將此繞射圖案作分析，作出電子密度圖，經過一連串的計算之後，即可判定出蛋白質的立體結構!

Why要使用X-Ray ? 我們採用X 光來決定蛋白質的結構，最大的理由，即是因為X 光的波長10-12-10-8m 恰好近似於蛋白質晶體的晶格大小，因而可以產生繞射，且由於X 光無法聚焦，因此我們必須使用底片曝光法來分析繞射所得的結果。

X 光依形成的方式不同，分成兩種： (1)White radiation: 以經高壓加速之電子撞擊陽極靶標，

高速電子受到靶標原子的阻擋，急遽停止下來，其部分動能即以X 光的形式釋出來。以急遽停止電子所產生之X 光與原子之特性無關，而是以連續性不同波長同時出現，其中最短波長取決於撞擊電子的最高能量。如此產生的光譜，亦稱為白光光譜或連續光譜 (Continuous X-ray spectrum) 。

(2)Monochromatic radiation: 高速電子在撞到原子時，很容易將能量傳遞給原子中的電子，而使原子離子化。當原子內層軌域之電子被激發後，其空出之位置很快會被外層電子的躍入填滿，在此電子躍遷過程中，由於不同軌域間的能階差， X 光會隨著放出；此種過程所產生的X 光與原子中電子軌域之能階有關，因此其波長與原子種類有關，稱之為特性輻射，所形成之光譜則稱為特性光譜 (characteristic spectrum) 。

蛋白質結晶製備 !!

• X 光繞射結晶法當中很重要的一個條件就是 sample 的製備，若是不可結晶，則鐵定不能進行 X 光繞射。蛋白質要結晶，首先必須要先大量製備我們所要結晶的蛋白質，因此會裡用載體將記載蛋白質序列的核酸輸入到生產蛋白質的菌體中，如此便可大量製造出純度高的蛋白質，而後氣相擴散法將此蛋白質結晶出來。

• 結晶方式 :用氣相擴散法結晶 (Vapor Diffusion Method) ，也就是將含有高濃度的蛋白質溶液加入適當的溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發性的沉澱狀態時，蛋白質分子將在整齊的堆疊下形成晶體。

NMR 與 X-Ray 的比較• X-ray 的缺點主要是結晶難結，也並非所有蛋白質都容易結

晶。一旦結晶了，又要擔心他跟平時會否有異，譬如某些水溶性的蛋白質，原本水分子能協助固定有功能的構型，將其結晶後，離開了水的環境，失去固定而變成另一種沒有功能的構型。相對的， NMR 的原理不同，並不需要整齊的晶體排列，而是看原子核的磁力矩。 NMR 不需要結晶，也就避開了許多 X-ray 繞射的缺點； NMR 可以看到生物分子在正常生理狀態下的構型，可以觀察到連續的動態結構，比較不會受到水分子的干擾。有一點值得注意的是， NMR 用低能量的無線電波，而 X-ray 繞射要用高能量的 X-ray ，能量差距相當的大。雖然 NMR 看似比 X-ray 繞射有更多的好處，但NMR 有一個嚴重的缺點：只能觀察 20000 原子量以內的分子。因為 NMR 是觀察一個一個的原子， X-ray 繞射則是觀察一個一個的晶格； NMR 的視野被侷限在原子大小，但是 X-ray 可大可小，他能觀察金屬原子的晶體，也能觀察生物巨分子的晶體。我們不能直接判斷NMR 跟 X-ray 繞射孰優孰劣，兩者是互補的關係。

水的影響•蛋白質結晶中常含 40~60%的水，其液態的成分會使晶體易碎，且容易使蛋白質分子在排列上有不規則的情形出現，造成繞射數據的混亂。但是，若是完全除水的晶體，蛋白質的狀態又與自然環境下不同，因此水是個很令人頭痛的問題。

Circular Dichrosim(CD)

圓二色光譜

Polarizer

E vectors

平面偏振光

振動方向保持不變

振幅發生周期性變化

平面偏振光

兩束相互垂直而相位相差 1/4的波長的平面偏振光可以加和成一束圓偏振

光

平面偏振光疊加成圓偏振光

振幅保持不變，而方向周期變化，電場向量繞傳播方向螺旋前進

圓偏振光(circular polarized light)

朝光源看，電場向量方向按順時針方向旋轉的，稱為右圓偏振光；電場向量方向按逆時針方向旋轉的，稱為左圓偏振光。

圓二色性 (circular dichrosim)

光學活性分子對左、右圓偏振光的吸收也不同，使左、右圓偏振光透過後變成橢圓偏振光，

這種現象稱為圓二色性。

CD 的操作方法

•左圓、右圓的平面偏振光照射有光學異構的分子，會造成不一樣的吸光度。而不同的結構有獨特的測出來的吸收圖形，因此可以經由比對得知立體結構

CD 對蛋白質二級結構的研究

方法 : 將待測蛋白質溶於適當溶劑中，用特定波長的 UV測其吸收度，與已知的二級結構的吸收度圖比對，即可查出未知之結構

建立資料庫 :選取基本的二級結構，將各波長不同的 CD吸收值代入程式可得蛋白質中

各種二級結構之百分比

CD 之優點

•待測物需要量少 ( 不到 0.5mg)

•判斷結構準確性相當高

•可用來觀察一般方法難推測的不可溶蛋白質

CD 之缺點

•受外在環境影響頗大 (因此必須要先找出實驗時需要的溫度、 PH等 ) ，

•因為在測量時一個蛋白質的所有結構都會同時反映在吸收度上，因此造成判斷上的困難。

•Aromatic amino acids 也會吸收 UV 造成干擾