猪脾中猪脾中 DNADNA 的提的提取取

指导教师：滕利荣 Email:tenglirong@mail.jlu.edu.cn

2005.03

二十世纪是

二十一世纪是

物理、化学和电子科学

生命科学 的世纪

的世纪

生命是

生命 = 核酸 + 蛋白质

二十一世纪是核酸、蛋白质的世纪

？

1 、用于研制核酸类药物及保健品2、用于基因诱变3、用于 DNA克隆4、用于 DNA测序5、用于 PCR扩增

DNADNA 提取的意义：提取的意义：

提取提取 DNADNA 的主要来源：的主要来源：

1 、动物组织及器官 脾、肝、胸腺、鱼类精子等。2、植物 种子的胚芽等3、微生物 细菌、酵母菌等

核酸的存在形式： 核酸包括 DNA、 RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在；

真核生物的染色体 DNA为双链线性分子； 原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；

有些噬菌体 DNA有时为单链环状分子； 病毒的 DNA、 RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。

核酸的分布：95%的真核生物 DNA主要存在于细胞核内，其

它 5%为细胞器 DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占 75%，另有 10%在细胞核内， 15%在细胞器中。

1 、核酸的理化性质 DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。

核酸和核苷酸 大都呈酸味（除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外）。 DNA、 RNA和核苷酸都微溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

DNA钠盐在水中为 10g/L ，呈黏性胶体溶液。 RNA钠盐在水中溶解度可达 40g/L 。

在酸性溶液中， DNA、 RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

DNA溶液的粘度很大，而 RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。

核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。

核酸包括 DNA、 RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用 DNP和 RNP 表示；

DNP和 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。

DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在 0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的 1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高 2倍。

RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。

核酸提取的原理

从不同材料中提取 DNA 的方法不同，分离提取的难易程度也不同。

从高等动植物及细菌中提取 DNA 难度大一些。由于其 DNA 分子量较大。因此易被机械张力剪断。

细菌 DNA ，除核 DNA 外，还有质粒DNA 等。

对于低等生物。如从病毒中提取 DNA 比较容易，多数病毒 DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。

核酸提取的主要步骤：1 ）破碎细胞；2）去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子；

3）去除其它不需要的核酸分子；4）沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质。

核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。

对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。

有坚硬的细胞壁的细胞，首先要破碎细胞。方法有三种：

①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用 SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

2. 细胞的破碎

高等动物的 DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：

1 ）破碎细胞难，从处死动物分离组织器官到破碎细胞费时长。在长时间内 DNA 可能会被DNase降解；

2 ）因分子量大，在使用组织匀浆器破碎组织时易造成 DNA 断裂；

对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。

3.DNA提取的几种方法(1)浓盐法 利用 RNP和 DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1 ）用 1M 氯化钠提取 ,得到的 DNP粘液 ; 2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡 ,使乳化 ; 3) 离心除去蛋白质 ,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而 DNA位于上层水相中 ; 4) 用 2倍体积 95% 乙醇可将 DNA 钠盐沉淀出来 .

（ 2）阴离子去污剂法 : 用 SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性 ,可以直接从生物材料中提取 DNA。 由于细胞中 DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合 ,而阴离子去污剂能够破坏这种价键 ,所以常用阴离子去污剂提取 DNA。

（ 3）苯酚抽提法 : 苯酚作为蛋白变性剂 ,同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时 ,由于蛋白与 DNA 连接键已断 ,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含 DNA 的水相。

利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的 DNA保持天然状态 。

猪脾中提取猪脾中提取 DNADNA

1. 实验材料，仪器和试剂： （ 1） 实验材料：新鲜猪脾： （ 2）仪器： 量筒： 10ml 、 100ml 3个； 烧杯： 100ml 2个、 250ml 2个； 磨口锥形瓶： 250ml 1个、 500ml 1个； 移液管： 1ml 1支、 10ml 1支； 滴管、玻棒、离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。

（ 3）试剂： ① 20×SSC ： 175.2gNaCL ， 88.2g柠檬酸钠• 2H2O， PH=7.0加水至 1000ml；

②   1×SSC， 0.1×SSC由①作相应的稀释得来；

③NaCL-Na2EDTA 液 ：8.77gNaCL ， 3.72g Na2EDTA溶于 800ml蒸馏水中，用固体 NaOH 调 PH=8 后定容至 1000 ；

④ 5%SDS （ W/V ） ： 6gSDS 溶于100ml45%乙醇中；

⑤ 氯仿 - 异戊醇 =24 ： 1（体积比） ⑥ 其他 :95% 乙醇，盐，冰 .

2. 操作步骤 : 取鲜猪脾 ,去脂、血 ,称取 5g,用预冷的1×SSC溶液洗 2次，剪碎； 按脾： 1×SSC=1; 5W/V 加入 25ml预冷的 1× SSC，用高速组织捣碎机破碎 8 次 ,每次 5秒 ,中间间隔 30秒； 将匀浆液放在烧杯中， 于冰盐浴中冷却 10 分钟。4℃ ， 8000rpm离心 5分钟。去掉上清，取↓；沉淀物中再加 2倍体积的 1×SSC搅匀，离心，弃上清，取↓，重复 2次。

将所得沉淀悬于 5倍体积的PH8.0 、 0.15M NaCL-0.1Na2EDTA溶液中。边搅拌边慢慢滴加 5%SDS最终浓度达 1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达 1mol/L，继续搅拌，以确保氯化钠全溶。

所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿—异戊醇，激烈振荡 10 分钟， 8000r离心 10分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同

积氯仿—异戊醇重复去蛋白 2次。

取出水相于烧杯中，逐渐加入 2倍体积 95% 乙醇，玻棒搅动， DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干，用 70% 乙醇洗 DNA纤维 2次，用 95% 乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干。

1、 鲜猪脾 去脂、血 5g 预冷的 1×SSC 洗 2 次 剪碎 , 1×SSC=1:5(W/V ）

捣碎 (8×5s ，间隔 30s) 匀浆液 冰盐浴 冷却 10min

4℃,8000rpm,5min 沉淀物 2V 1×SSC, 搅匀

4℃,8000rpm,5min

　 弃上清 ( 重复 2次 ) 沉淀

操 作 步 骤

3 、水相 搅拌 95% 乙醇 至溶液澄清 DNA 纤维 挤干 70% 乙醇 洗

DNA 纤维 2 次 95% 乙醇 , 乙醚 取出并挤干 DNA 纤维

2 、沉淀　　　 5V Na2EDTA 搅拌 , 滴加 5%SDS( 终浓度达 1%)

固体 NaCL 1M 搅拌 NaCL 全溶 混合液 锥形瓶

同体积氯仿 - 异戊醇 激烈振荡 10min

4℃,8000rpm,10min

上层水相 同体积氯仿 - 异戊醇 重复去 Pr,2 次 水相

二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定 DNADNA 含量含量 强酸、加热条件下，可以使 DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。 其中 2ˊ 脱氧核糖在酸性环境中成为 ω―羟基― γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在 595nm处有最大吸收。 DNA在 40-400μg范围内光密度与 DNA浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。 当样品含少量 RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。

１、二苯胺试剂：使用前称取 0.8g 二苯胺（需在 70% 乙醇试剂中重结晶 2次 )，溶于 180ml冰乙酸中，再加入 8ml过氯酸（ 60% 以上），混匀待用，临用前加入 0.8ml 1.6%乙醛溶液，所配试剂应为无色。　　 每组需 56ml 共需 2800ml ２、 DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以 0.01N NAOH配成 200 微克 / 毫升的标准液。 每组需 12ml 共需 600ml ３、 1.6%乙醛：取 47% 乙醛 3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内可以使用）。　　 共需 70ml ４、待测样品液：准确称取猪脾 DNA 5mg, 用0.01mol/L的氢氧化钠溶液配成 100 微克 / 毫升的溶液。　　 每组需 4ml 共需 200ml

操作方法：

1. DNA标准曲线的制定： 取 10支试管，分成 2 组，依次加入 0.4 、 0.8、1.2 、 1.6和 2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为 2ml。另取 2只试管，各加 2ml蒸馏水作为对照。然后各加入 4ml二苯胺试剂，混匀。于 60度恒温水浴中保温 1h，冷却后于 595nm处进行比色测定。取两管平均值，以 DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 制品的测定： 取 2支试管，各加 2ml待测液（内含 DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。

3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值 DNA的含量，计算出制品中的百分含量。

数据 : DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= X 100 待测液中制品的微克数

DNA产率 : 测得的 DNA的微克数 DNA%= X 100 原料的微克数

1.为什么在低温下进行？

2.加柠檬酸钠和 EDTA的作用 ?

3. 加 SDS的作用？

4. 加 NaCL的作用，为什么要加到 1mol/L?

5.加入异戊醇有什么作用？

1. 生物学基础实验教程 . 滕利荣主编 . 长春 :吉林科学技术出版社 , 1999.8, 573~578.

2. 现代分子生物学实验手册 . 张维铭主编 . 北京 : 科学出版社 , 2003.6, 80~106.

3. 精编分子生物学实验指南 . 颜子颖、王海林译 . 北京 : 科学出版社 , 1998.6, 30~40.

4. 生物化学与分子生物学实验技术 . 厉朝龙主编 . 杭州 : 浙江大学出版社 , 2000.6, 107~116

5. 分子克隆实验指南 (第三版 ). 黄培堂等译 .北京 : 科学出版社 , 2002.8,26~52.

6. 生物化学与分子生物学实验教程 . 梁宋平主编 . 北京 :高等教育出版社 ,2003.3,16~19.

7. 生物化学实验 (第三版 ). 陈钧辉 , 陶力等编 . 北京 : 科学出版社 , 2003.4,128~130.

8. 生物化学实验指导 . 余冰宾 主编 . 北京 : 清华大学出版社 , 2004.1, 158~160.

9. 生物化学实验方法和技术 . 陈毓荃 主编 .北京 : 科学出版社 , 2002.8, 127~132

二、二、 DNADNA 提取技术提取技术技术 1 ：基因组总 DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在 RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的 DNA样品。

仪器： 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。

试剂 ： 细胞裂解液（ 100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿 / 异戊醇；异丙醇； 70%及无水乙醇； 3M NaAC（ pH5.2）； RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液

操作：动植物材料 10g(鲜组织 ) 0.5g(干冻组织 )

液氮，研碎10ml 裂解液 (含 1/10 体积酚 ),(65℃ 预热 ) ( 加入等体积氯仿 ) (65℃， 30min 间隔 5－ 10min 轻摇一

次 )

离心 (12000-15000rpm, 15min )

上清液

(0.6 体积冷异丙醇 )

(0.1 体积 3MpH5,2 乙酸钠）

2mlTE( 或水 )＋ 10ulRNase， 65 ,10-30℃ 分复溶和除RNA

挑取絮状体 （ 70% 冷乙醇洗涤 , 真空干燥 ）

（ 5000RPM， 5min）

等体积酚 / 氯仿 , 氯仿抽提

（轻轻混匀、冰浴沉淀 5min ）

2 倍无水乙醇、 1/10 体积醋酸钠

上清液

(10000RPM,10min )

(-80℃， 30min )

(70 ％冷乙醇洗 )

沉淀

基因组 DNA 干粉

( 真空干燥 )

保存： 干粉 -20℃ 保存，或复溶于 0.5-1mlTE 或水中 , 分装成小体积 , -20℃或 4℃ 保存

注意 :1. 裂解液要预热 , 以抑制 DNase,加速蛋白变

性 , 促进 DNA溶解；2. 各操作步骤要轻柔 , 尽量减少 DNA的人为降

解；3. 取各上清时 , 不应贪多 , 以防非核酸类成分干扰；

4. 异丙醇 , 乙醇，醋酸钠，醋酸钾等要预冷 ,以减少 DNA的降解 , 促进 DNA与蛋白等的分相及 DNA沉淀；

5. 本方法适用于以 DNA片段的酶切分析、 Southern印迹等中，具有快速、省时、省钱的特点。

技术 2 ：细菌基因组 DNA的微量提取法 本方法包括 SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白， CTAB去除多糖成分等内容。仪器： 同技术 1 ；试剂： TE、 TAE缓冲液； 10%SDS；５Ｍ NaCL；

20mg/ml 蛋白酶Ｋ； CTAB/NaCL溶液 (10% CTAB， 0.7M NaCL  4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入 10gCTAB，加热溶解 ) ；酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25： 24： 1)；氯仿 /异戊醇 (24： 1)；异丙醇； 70％及 100%乙醇

操作：1.5ml  对数生长期细菌

100μl NaCL(5M)  ， 混匀

30μl 10%SDS,3μL 蛋白酶Ｋ，混匀

沉淀，溶于 500μl  TE 缓冲液中，混匀

(37 ,1℃ 小时 )

(5000rpm,1min 离心 )

80μl的 CTAB/NaCL, 混匀； 65 10min℃ （可不做）

加入等体积酚 / 氯仿 / 异戊醇混合液

取上清，以下操作与技术 1 中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除 RNA 、复溶等步骤一致

( 混匀 )

( 离心 12000rpm,4-5min)

上清

技术 3 ：酵母菌基因组 DNA的提取

仪器： 同技术 1 ；

试剂： SE缓冲液（ 1M山梨醇， 0.1M EDTA pH7.5 ）；溶菌酶（ 50mg/ml）； 20％ PVP；蛋白酶 K 缓冲液（ 10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前

操作：1.5ml  对数生长期细菌

溶于 590ulSE 缓冲液中混匀

(12000rpm,8-10min 离心 )

(12000rpm,1-2min 离心 )

加入 1.2ml的 CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀

( 加入 10ul 溶菌酶 37 ,1℃ 小时 )

溶于 100ulNaCL 中混匀

( 加入 0.5μl 蛋白酶Ｋ， 37 ,1℃ 小时 )

等体积酚 / 氯仿 / 异戊醇混合液 , 混匀

(65 30min)℃

(12000rpm,4-5min 离心 )

上清 , 以下操作与技术 1 中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除 RNA 、复溶等步骤一致

。

为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：

1 ．核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

2 ．其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；

3 ．排除其它核酸分子的污染，如提取 DNA分子时应去除 RNA，反之亦然。

核酸提取注意事项：

1. 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；

2. 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH4-10的条件下进行；

3. 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及 DNA样本的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性 DNA分子，如真核细胞的染色体 DNA。对分子量小的环状 DNA分子，如质粒DNA 及 RNA分子，威胁相对小些。

高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。

4. 防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中 DNA酶，需要金属二价离子Mg2+、 Ca2+的激活，使用 EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制 DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。

名 称 治 疗 范 围

核糖核酸(RNA)

脱氧核糖核酸(DNA)

免疫核糖核酸(i RNA)

转移因子(TF)

聚肌胞苷酸(聚肌胞)(poly I：

C)

口服用于精神迟缓、记忆衰退、动脉硬化性痴呆治疗；静

脉注射用于刺激造血和促进白细胞生成，治疗慢性肝炎、肝

硬化、初期癌症

有抗放射性作用，能改善机体虚弱疲劳；与细胞毒药物合

用，能提高细胞毒药物对癌细胞的选择性作用；与红霉素合

用，能降低其毒性，提高抗癌疗效

推动正常的RNA分子在基因水平上通过对癌细胞DNA分子

进行诱导，或通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，如

可用于肝炎治疗的抗乙肝i RNA、治疗肺癌的抗肺癌i RNA

相对分子质量较小，含有多核苷酸、多肽化合物，M，

<10000；它只传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，不致促

进肿瘤生长，治疗恶性肿瘤比较安全；亦可用于治疗肝炎等

干扰素诱导物，具有广谱抗病毒作用；用化学合成、酶促

合成结合方法生产

名 称 治 疗 范 围

腺苷三磷酸(ATP)

核酸一氨基酸混合物

辅酶A(CoA)

脱氧核苷酸钠

腺苷一磷酸(AMP)

鸟苷三磷酸(GTP)

辅酶I (NAD)

Ⅱ辅酶 (NADP)

用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、脑动脉和冠状动脉硬化、

急性脊髓灰质炎、肌肉萎缩、慢性肝炎等

用于气管炎、神经衰弱等

用于动脉硬化、白细胞、血小板减少，肝、肾病等

用于放疗、化疗引起急性白细胞减少症

有周围血管扩张作用、降压作用；用于静脉曲张性溃疡等

用于慢性肝炎、进行性肌肉萎缩等症

用于白细胞减少及冠状动脉硬化

促进体内物质的生物氧化

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