Спектрофотометрија

Спектрофотометрија представља квантитативно мерење рефлексивних или трансмисионих особина материјала у функцији таласних дужина. Ова метода обухвата мерења у видљивом (400-700 nm), ултраљубичастом (200-380 nm) и инфрацрвеном (700-1400 nm) делу спектра.

Спектрофотометар је уређај који служи за мерење интензитета светлости у зависности од таласне дужине извора светлости. Важне одлике спектрофотометара су спектрални опсег и линеарни опсег апсорпције или мерење рефлексије. Сваки молекул апсорбује светлост одређене таласне дужине због унутрашње структуре енергетских нивоа, тј. броја и распореда његових функционалних група. Зрак светлости пропушта се кроз узорак, а потом се мери интензитет светлости која је прошла кроз анализирани узорак и упоређује се са интензитетом улазне светлости (слика 1). Интензитет апсорбованог зрачења у узорку је пропорционалан концентрацији материје. Различити молекули апсорбују светлост у видљивом делу спектра.

Пропуштена боја Слика 1. Комплементарне боје Слика 2. Шема спектрофотометра

Спектрофотометар се примјењује у различитим научним областима физике, хемије, биохемије, молекуларна биологије, итд. У зависности од калибрације спектрофотометром се може одредити које супстанце су и у којој количини присутне у узорку. Основни делови спектрофотометра су: извор зрачења, монохроматор, кивета, фотодетектор и дисплеј.

Извор зрачења

Извор зрачења у видљивој спектрофотометрији је најчешће волфрамска лампа (330-900 nm), али се користи и волфрам-халогена (кварц-јод) лампа. Обично се користе за мерење умерено разблажених раствора у којима промена интензитета боје значајно варира са

Апсорбована боја

променама концентрације. Животни вијек ове лампе је 1200 h. Последњих година се користе и ксенонске лампе које покривају UV и видљиви дио спектра тј. (190-1000 nm).

Монохроматор

Монохроматор издваја из полихроматског зрачења влакна волфрамове лампе, монохроматски зрак оне таласне дужине која је најповољнија за дато мерење. Монохроматор раздваја светлост на таласне дужине и фокусира секвенцијално сваку од њих на фотодетектор. Основни делови монохроматора су: улазни прорез, сочива и огледала, дисперзивни елемент (призма, филтери и дифракциона решетка) и излазни прорез. Регистровањем интензитета зрачења које је узорак апсорбовао, пропустио или рефлектовао у зависности од таласне дужине настаје спектар.

Кивета

Кивете могу бити од различитих материјала (оптичко/силикатно стакло, кварц, пластика). Морају бити потпуно хомогене и транспарентне за област таласних дужина у којој се врши мерење. За мерење у видљивом делу спектра користе се стаклене или пластичне кивете. Оптичко стакло апсорбује светлост испод 350 nm тако да се за мерење у опсегу испод 350 nm користе кивете од кварца. Кивете се по правилу перу само дестилованом водом и никада се не смију излагати дејству јаких киселина или база да не би дошло до нагризања стаклених површина или растварања лијепка којим су лепљене. Пре него што се постави у одговарајуће лежиште инструмента, кивета се споља обрише папиром који не оставља длачице и не оштећује стакло.

Детектор и дисплеј

Детектор је фотоосетљиви уређај који производи струјни сигнал пропорционалан интензитету светлости. Постоји неколико основних типова детектора: фотоћелије, фотомултипликатори, силицијум и друге диоде. На дисплеју се приказују подаци мерења.

Апсорпционе методе

Апсорпционе методе се заснивају на мерењу смањења интензитета електромагнетног зрачења усљед апсорпције при проласку кроз испитивану супстанцу. Апсорбовано зрачење доводи до енергетских промена у атомима, молекулима и јонима испитиване супстанце. Апсорпција видљивог и ултраљубичастог зрачења доводи до електронских прелаза, који су у молекулима и њиховим јонима комбиновани са низом вибрационих и ротационих прелаза.

Инфрацрвено зрачење због своје мале енергије, доводи само до промена вибрационе и ротационе енергије молекула. Апсорпцијом зрачења молекул може прећи из основног стања на неки од многобројних вибрационих и ротационих нивоа одређеног побуђеног стања. Енергије фотона који се том приликом апсорбују врло се мало разликују тако да се апсорпциони спектар молекула састоји из стотине па и хиљаде линија, које су веома близу једна другој, да се јављају као континуалне апсорпционе тракеАпсорбанца се мери због:- одређивања концентрације супстанце, - анализе хемијских реакција,- идентификације супстанце,- испитивање структуре молекула и одређивања различитих супстанци.Апсорпционе оптичке методе можемо поделити у три групе: колориметрију, апсорпциону спектрофотометрију и атомску апсорпциону спектрофотометрију

Закон апсорпције

Приликом проласка електромагнетног зрачења кроз неку средину долази до смањења интензитета упадног снопа зрачења. Физички процеси који доводе до слабљења интензитета зрачења су: апсорпција, резонанција, флуоресценција, фосфоресценција, рефлексија и расипање свјетлости. Примењујући закон о одржању енергије, можемо написати:

I 0=I a+ I p+∑ I r ,

где је I 0 - интензитет упадног зрачења, I a - интензитет апсорбованог зрачења, I p -

интензитет пропуштеног зрачења, а ∑ I r - означава збир интензитета рефлектованог, расутог, резонантног, флуоресцентног и фосфоресцентног зрачења.Одређеним експерименталним техникама рефлектовано, резонантно, расуто, флуоресцентно и фосфоресцентно зрачење могу се свести на занемарљиво малу меру.

Смањење интензитета зрачења у слоју супстанце дебљине db , сразмерно је интензитету зрачења у том слоју и дебљине слоја:

−dI=k '⋅I⋅db ,

где је k ' фактор пропорционалности који зависи од таласне дужине зрачења и температуре за дату оптичку средину.

Интеграљењем претходне једначине узимајући у обзир да је при b=0 , I=I 0 добија се

lnI pI 0

=−k ' b, а увођењем нове константе

k= k 'ln 10 , добија се

I pI 0

=10−kb

.

Ова једначина представља општи закон смањења интензитета зрачења у слоју

транспарентне супстанце, дебљине b и назива се Ламбертов закон. Овај закон је универзалан и важи за гасове, течности, растворе и транспарентна чврста тела. У општем случају раствори апсорбују селективно, односно зрачење различитих таласних дужина се неједнако апсорбује. Растворена супстанца која апсорбује зрачење одређене таласне дужине доводи до смањења интензитета снопа упадног зрачења. Ово смањење је сразмерно броју честица у јединици запремине раствора, односно концентрацији. Повећање концентрације раствора еквивалентно је повећању дебљине слоја кроз који пролази електромагнетно зрачење.

На тај начин коефицијент у Ламбертовом закону постаје сразмеран концентрацији: k=a⋅c , при чему a је коефицијент и не зависи од концентрације раствора, већ само од природе растворене супстанце, таласне дужине и температуре.

Тада имамо

I pI 0

=10−a⋅b⋅c

, па се логаритмовањем ове једначине добија:

logI 0

I p=a⋅b⋅c=logT

.

Уместо транспаренције уведена је нова величина, апсорбанца A , која је једнака:

A=−logT тј. A=a⋅b⋅c . Ова једначина је позната као Ламбер-Беров закон.

Дебљина слоја b се најчешће изражава у cm , а концентрација c у mol/dm3. Константа

пропорционалности a (представља ефикасан пресек за сударе фотона са молекулима

растворене супстанце) и назива се моларни апсортивитет и изражава у dm3 /mol⋅cm .

Моларна апсорптивност је једнака апсорбанци раствора јединичне концентрације и јединичне дебљине слоја и може се дефинисати као реципрочна вредност дебљине слоја која почетни интензитет зрачења смањује за 10 пута.

У раствору који садржи више компоненти, које апсорбују електромагнетно зрачење дате таласне дужине, које међусобно не реагују, апсорбанца раствора једнака је збиру

апсорбанци појединачних компоненти A=∑

i=1

n

A i. Адитивност апсорбанце је веома важна

особина и она омогућава одређивање различитих зависности.

Задатак: Одређивање непознате концентрације метил оранжа

Метил оранж је супстанца која служи као индикатор киселости. Често се употребљава у титрацијама, због тога што јасно мења боју у киселим срединама. За разлику од универзалног индикатора, метил оранж нема пун спектар промене боје. Када се киселост раствора смањује, промена боје овог индикатора се мења од црвене преко наранџасте до жуте.

1. Снимали смо вредности апсорбанце за три познате концентрације раствора метил оранжа и то за 2 mg/l; 4mg/l и 8 mg/l и добили смо следеће графике зависности.

Особине

Молекулска формула C14H14N3NaO3S

Моларна маса 327.33 g/mol

Густина 1.28 g/cm3

Тачка топљења >300 °C

2. Нацртали смо калибрациону криву зависности апсорбанце од концентрације метил

оранжа у раствору (A=f ( c )).

3. На основу калибрационе криве одредили смо непознату концентрацију узорка метил оранжа. Када смо снимили калибрациону криву убацује се непозната супстанца, тј непознате концентрације, апрсорбанца изниоси 0,3662 а концентрација према томе износи 4,95 mg/l

Концентрација Апсорбанца2 mg/l 0,14814 mg/l 0,29508 mg/l 0,5945

Непозната концентрација