NORTHERN BLOTTING

NORTHERN BLOTTING

Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama

kali pada tahun 1977

secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot

Yang membedakan adalah sampel yang

digunakan, yaitu RNA.

Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi

(transkripsi) suatu mRNA (gen) pada organ atau

jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang,

dan lain sebagainya.

DEFINISI DAN PRINSIP

Northern Blot adalah suatu teknik untuk mendapatkan

informasi mengenai identitas, ukuran dan kelimpahan

RNA.

Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan

ukuran dan

terdeteksi pada membran menggunakan probe

hibridisasi dengan urutan basa komplementer

untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target

TAHAPAN NORTHERN BLOTTING

TAHAPAN UMUM NORTHERN BLOT

isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)

Generasi Probe

Denaturasi dan elektroforesis gel agarosa

Transfer ke support solid dan imobilisasi

Prehybridization dan hibridisasi dengan probe

Pencucian

Deteksi

Pengupasan dan reprobing (opsional)

ISOLASI RNA

Dapat dilakukan dengan cara:

Lisis membran Seluler

Penghambatan aktivitas ribonuklease

Deproteinasi

Recovery intact RNA

ISOLASI POLI (A)

dalam beberapa kasus, langkah terpisah untuk

isolasi mRNA dari RNA total dapat dimasukkan

dengan poly (A) selection, hal ini meningkatkan

sensitivitas.

Isolasi mRNA dari total RNA menggunakan poli-A

prosedur seleksi +, yang melibatkan kolom oligo-T,

atau beads primed oligo-T, untuk mengikat ekor

poli-A + mRNA.

RNA diekstraksi spesies, apakah RNA total atau

poli-A + yang dipilih, kemudian dipisahkan

berdasarkan ukuran molekul dengan elektroforesis

agarosa-gel

GENERASI PROBE

Dapat menggunakan radioaktif atau nonisotopically

label, RNA, DNA atau probe oligodeoxynucleotide.

RNA Probe dapat diproduksi secara in vitro melalui

reaksi transkripsi menggunakan Ambion yang

MAXIscript Kit.

Nukleotida berlabel isotop atau nonisotopic dapat

dimasukkan langsung selama sintesis dengan kit

ini, atau RNA dapat disintesis unlabeled dan

kemudian ditambah Psoralen-Biotin untuk

menghasilkan probe terbiotinilasi untuk

hybridizations blot.

DENATURASI DENGAN ELEKTROFORESIS

AGAROS

Formaldehida biasa digunakan secara tradisional

sebagai denaturan, meskipun sistem glyoxal

memiliki beberapa keunggulan dibandingkan

formaldehida.

TRANSFER KE SUPPORT SOLID DAN

IMOBILISASI

RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif dan kemudian bergerak selama hibridisasi berikutnya.

Metode berteknologi rendah terbaik untuk transfer agarosa adalah dengan elusi, pasif sedikit basa, ke bawah.

Prosedur ini, dibandingkan dengan mentransfer ke atas, jauh lebih cepat dan karena itu menghasilkan band-band lebih ketat dan sinyal yang lebih. Atau, cara transfer yang tersedia secara komersial aktif (electroblotter, semidry electroblotter, vakum tinta, tinta tekanan, dll) dapat digunakan.

Setelah RNA ditransfer, membran harus segera disiapkan untuk Crosslink RNA. Hal ini dapat dilakukan oleh sinar ultraviolet (metode yang disukai) atau dengan dipanggang.

PREHYBRIDISASI DAN HIBRIDISASI DENGAN

PROBE

Prehybridisasi atau memblokir, diperlukan sebelum

menyelidiki hibridisasi untuk mencegah probe dari

lapisan membran. Blocking yang baik diperlukan

untuk meminimalkan masalah back ground.

HIBRIDISASI PROBES

Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target.

Secara umum, ukuran minimum untuk probe untuk memastikan spesifisitas adalah sekitar dua puluh lima basa,memberikan bahwa ada kecocokan lengkap antara urutan probe dan urutan dari mRNA target,

Ada dua bentuk utama probe hibridisasi, pendekatan tradisional yang menggunakan DNA komplementer (cDNA). Atau, anti-sense oligonukleotida (umumnya30-40 basa) dapat dirancang dari data urutan dan disintesis.

Oligonukleotida, seperti cDNA, adalah molekul DNA yang tetapi 'riboprobes' basa RNA nya dapat digunakan.

Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas dibandingkan dengan probe DNA, tetapi mereka kurang stabil dalam arti menjadi subyek dengan kerusakan oleh RNases.

PENCUCIAN

Setelah hibridisasi, unhibridisasi probe dihilangkan

dengan mencuci dengan buffer. Mencuci strigensi

rendah (misalnya, dengan 2X SSC atau SSPE)

menghilangkan larutan hibridisasi dan probe

unhibridisasi.

Mencuci strigenci tinggi (misalnya, dengan 0.1X

SSC atau SSPE) menghilangkan sebagian molekul

hibridisasi.

DETEKSI

Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot

dapat dibungkus dalam bungkus plastik agar tidak

kering dan kemudian segera menggunakan film

untuk autoradiografi.

Jika menggunakan probe nonisotopic, blot harus

diperlakukan dengan reagen deteksi nonisotopic

sebelum terkena film.

DETEKSI

Deteksi dicapai baik dengan radioaktivitas atau

dengan non-radioaktif.

Dengan radioaktivitas, probe ditandai dengan 32P

(atau 33P).

Dengan non-radioaktiv, deteksi dilakukan dengan

pewarnaan. Salah satunya dengan teknik

chemiluminescence, deteksi juga mungkin

didasarkan pada fluoresensi, tapi ini memerlukan

substansial investasi dalam instrumentasi khusus.

TAHAPAN NORTHERN BLOT DALAM JURNAL

Biji tanaman yang sedang imbibisi atau akaar, batang, daun, atau bunga dari tanaman yang

sudah matang

Isolat Total RNA

Poly (A+)RNA

Menggunakan metode phenol-SDS

Elektroforesis

Probing generate

Fragmen RNA

Hasil blotting

Transfer RNA dari gel ke membran

Hibridisasi

deteksi

Seleksi mRNA

PROBING

untuk RNA probe synthesis, 598 bp fragment dari

Cmchi1 cDNA yang sudah diamplifujasi dengan primer

48EM dan 48RV.

527 bp fragment telah diamplifiksi dari Cmchi2 cDNA

dengan primer 24DM and 24RV.

T7 promoter diligasi ke setiap fragmen dari kedua

fragmen tadi (Lign’s Kit, Ambion), dengan template

untuk amplifikasi PCR menggunakan T7 adapter primer

1 (Lign’s Kit, Ambion) and a gen-specific primer (48EM

from Cmchi1 and 24DM from Cmchi2).

DIG-labelled RNA probe disintes menggunakan produk

PCR yang tadi sebagai template (DIG RNA Labeling Kit,

Roche Molecular Biochemicals).

PEMISAHAN DAN TRANSFER

Poly(A+) RNA (1.75–5 ìg) dipisahkan dengan elektroforesi gel dalam1% agarose gel yang mengandung 1× denaturing gel buffer (ada dalam Northern MaxKit, Ambion) selama 2 jam dengan 70 V.

RNA ditransfer dan di cross-linked ke membran positif (Hybond-N+, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA)

membran RNA-blotted di prehybridiz dengan 10 ml buffer komersial hybridisasi(Ultrahyb, Ambion) selama1 jam dan dihibridisasi dengan probe DIG-labelled RNA (0.1 nM) semalaman dengan suhu 68°C.

Membran dicuci di suhu 25°C sebanyak 2 kali pada stringensi rendah untuk 5 min dan dua kali di suhu 68°C pada stringensi tinggi untuk 20 min (NorthernMax kit, Ambion).

Sinyal hybridisasi didetesi menggunakan chemiluminescence

Setelah deteksi, membran yang sama dikupas dan reprobed denganDIG-label antisense-aktin 7 dari Arabidopsis thaliana probe.

HASIL NORTHERN

TERIMA KASIH