A szabályozó fehérjék szabályozása

GAP Rac·GTP Rac·GDP

GEF

RhoGDI·Rac·GDP

A Rac kis G fehérje szabályozása

GAP = GTPáz aktiváló protein

GEF = Guanin nukleotid kicserélő faktor

GDI = Guanin nukleotid disszociáció inhibitor

A kis GTPázok alcsaládjai és szabályozó fehérjéi

RAS RHO RAB ARF RAN

H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C

Rap1 Rac1Rap2 Rac2

Ral Cdc42

GAPok 25 70 52 27 1

GEFek 50-60

Rho-GDI Rab-GDI

Mi újság a GEF-ek körül?

(Zheng, 2001)

A DH-GEFek domén szerkezete

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

PROBLÉMA: Hol a specificitás?

Specificitás pedig van:

Patel et al. 2002, MBC, 13., 1215-1226

GEF-ek

GTPázok

Target fehérjék

MEGOLDÁS: fehérje komplexek

PH/DHRGSp115RhoGEF

1. példa

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

Jaffe A.B. et al. MCB 24. 1736. 2004; Cur. Biol. 15. 405. 2005;

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

MKK7

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

MKK7

Gα12

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

MKK7

Gα12

LPA-RPlazmamembrán

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

MKK7

Gα12

LPA-RPlazmamembrán

PH/DHRGSp115RhoGEF

Rho

CNK1 target/scaffold fehérje

MLK2 kináz

Jun → Jun-P

MKK7

Gα12

LPA-RPlazmamembrán

Kísérleti tény:

CNK1 hiány: LPA-indukált jun-P hiányzik, de stressz-rost képzés változatlan

CNK1 túltermelés: (GEF/Rho63 indukált) jun-P ↑

stressz-rost képzés ↓ (Rho megkötése)

2. példa

Tiam-1

Rac

Conolly BA et al., MCB 25. 4602. 2005.

2. példa

Tiam-1

Rac

IBS/JIP2

siderophilinIRSp53

2. példa

Tiam-1

Rac

IBS/JIP2

siderophilinIRSp53

p38 MAP kináz

p70 S6 kináz

WAVE 2

Aktin citoszkeleton

2. példa

Tiam-1

Rac

IBS/JIP2

siderophilinIRSp53

p38 MAP kináz

p70 S6 kináz

WAVE2

Aktin citoszkeleton

IRSp53

Cdc42

Mena

filopódium képzés

IRSp53

Tiam-1

RacCdc42

DH/PH

IRSp53

Tiam-1

RacCdc42

DH/PH

IRSp53

Tiam-1

Rac

WAVE2

lamellipodium képzés

DH/PH

IRSp53

Tiam-1

Rac

WAVE2

lamellipodium képzés

DH/PHRasPDGF-R

IRSp53

Tiam-1

Rac

WAVE2

lamellipodium képzés

DH/PHRasPDGF-R

Kísérleti tény:

IRSp53 hiányban

PDGF-R indukált lamellipódium képzés ↓

3. példa

Cool-2/α-Pix

(Cloned out of library 2) (PAK-interactive exchange factor)

Feng et al., EMBO J. 23. 3492. 2004; Baird et al., Curr. Biol. 15. 1. 2005

Cool-2/α-Pix dimér mint Rac-GEF

Cdc42 → Rac aktiválás mechanizmusa

Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF

Gβγ + PAK kötődés

Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF

Gβγ + PAK kötődés

GEF-smg-target komplex

Gondolatok:

1. G-fehérje kaszkádok

Gα12 → p115RhoGEF → Rho

Ras → Tiam-1 → Rac

Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac

2. smg kezd „beágyazódni”

(up-stream, down-stream kapcsolatok)

GAPok

Rho/Rac GAPok doménszerkezete

TiCB 13. 13-22. 2001

Lipidek részvétele GAP-ok szabályozásában

Chimaerin Rac PMA, DAG, stb. ↑ / ↓

ASAP1 ARF1, ARF5 PIP2 ↑

GIT ARF6 PIP3 ↑

ARAP1 ARF1, ARF5 PIP3 ↑

Rho =

ARAP3 ARF6 PIP3 ↑

Brown et al. MCB 18. 7038. 1998; Vitale et al. JBC 275. 13910. 2000; Miura et al. Mol. Cell 9. 109. 2002; Krugmann et al. Mol. Cell 9. 95. 2002

Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848.

A PL szerkezet hatása az ARF-GAP1 aktivitására

Bigay J. et al. Nature 2003. 426. 563.

A vezikulaméret hatása az ArfGAP1 aktivitására

Bigay et al. Nature 2003. 426. 563

Az ARF-GAP1 szabályozásának modellje

ARF1.                             

Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51

Az ARFGAP és ARFGEF lipid érzékenysége

Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51

GTPáz 4 x FF GAP

A p190RhoGAP domén szerkezete

PKCSrc

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 min 15 min 15 min + PS

32P

-GT

P (

%)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 min 5 min 5 min + PS

32P

-GT

P (

%)

PS hatása az endogén GTPáz aktivitásra

Rho Rac

Ligeti et al. JBC 2004.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

1 10 100 1000

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

1 10 100

p190GAP relatív menyisége

Bou

nd 32

P-G

TP

(%

)

Bou

nd 32

P-G

TP

(%

)

PS hatása p190 Rho-GAP és Rac-GAP aktivitására

Rho Rac

+ PS

Ligeti et al. JBC 2004.

Rho

0

20

40

60

80

100

1 3 10 30 100

Relative amount of p190

Pro

tein

bo

un

d

[32

P]G

TP

(%

)

Rac

0102030405060708090

100

1 3 10 30 100

Relative amount of p190

Pro

tein

bo

un

d

[32

P]G

TP

(%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 3 10 30 100

Relative amount of p190

Hy

dro

lys

ed

[3

2P

]

(cp

m x

10

3 )

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 3 10 30 100

Relative amount of p190

Hy

dro

lys

ed

[3

2P

]

(cp

m x

10

3 )

[32P]GTP fogyás

alapján

[32P]foszfát keletkezés alapján

A kísérletek kontrollja

Ligeti et al. JBC 2004.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rho Rac

Pro

tein

bo

un

d [

32P

]GT

P (

%)

no SDS

+ SDS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Rho Rac

Pro

tein

bo

un

d [

32P

]GT

P (

%)

no PS

+ PS

PS és SDS hatása a p190 Rho- és RacGAP activitására

Ligeti et al. JBC 2004.

0102030405060708090

100

noPL

PC PE PS PI PIP2 PA

Prot

ein

boun

d [3

2P]-G

TP (%

)

0102030405060708090

100

no PL PC PE PS PI PIP2 PA

Prot

ein

boun

d [3

2P]-G

TP (%

)

Különböző PL-k hatása a p190 GAP activitására

Rho Rac

Ligeti et al. JBC 2004.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rho Rac

Pro

tein

-bou

nd [3

2P]G

TP (%

)

no PS, no PKC + PS +PS, +PKC

01020

3040506070

8090

100

Rho Rac

Prot

ein-

boun

d [3

2P]G

TP (%

)

A PKC hatása a p190 Rho- and RacGAP activitására

ATP jelen ATP nélkül

P190 kísérletek újdonsága:

GAP fehérje módosítása változtatja a

szubsztrát specificitást

Hasonló helyzet: MgcRacGAP

→ nem-foszforilált állapotban Rac/Cdc42-GAP

foszforiláció után: Rho-GAP is

Minoshima et al. Dev. Cell 4. 549. 2003.

Autoinhibició:

p50GAP – nyitja: smg prenil csoportja

RA-RhoGAP – nyitja: RapGTP kapcsolódás

funkció: neurit növekedésben

További példák GAP-szabályozásra

GAP hatástól független funkciók:

p190GAP

FF-domén TFII-I köt, citoszolba lokalizálja azt

FF-domén Tyr-foszforiláció → TFII-I elengedés → magba vándorol

Tumbleweed (RacGAP50C) (Droso)

axon növekedés – GAP hatás függő

citokinesis – GAP hatástól független

p50GAP

Sec14 domén lokalizálja,

Sec14 mutáció – de nem GAP domén mutáció – biológiai hatása

p50GAP eloszlása és biológiai hatása a Sec14 doménhoz kötött

Sirokmány et al. 2006 JBC. 281. 6096.

Rho-GDI

RhoGDIRacGDP

RhoGDP

P - RhoGDI

RacGDP → RacGTP

RhoGDP

PAK

X

P - RhoGDI

RhoGDP

PAK

X

Cdc42 / Rac

RacGDP → RacGTP

DerMardirossian C. et al. Mol. Cell 15. 117. 2004.

Gondolatok:

1. G-fehérje kaszkádok

Gα12 → p115RhoGEF → Rho

Ras → Tiam-1 → Rac

Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac

Cdc42→ PAK → RhoGDI→ Rac

Rap → RA-RhoGAP → Rho↓

2. smg kezd „beágyazódni”

(up-stream, down-stream kapcsolatok)

IRODALOM

Bernards A.

GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila

BBA 1603. 47-82. 2003.

Bernards A. and Settleman J.

GAP control: regulating the regulators of small GTPases

Trends Cell Biol. 14. 377. 2004.