טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני :...

שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע: שיבוט וריפוי גנישל

החזון והמציאות

תאי גזע עובריים בתרבית

1981עכבר –

1998אדם –

גזע • תאי של העיקריים המאפייניםעובריים:

מוגבלת בלתי עצמית התחדשות פלוריפוטנטיות

תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים

בתרבית ממוין בלתי במצב התאים גדילת על שליטה

התאים על ספציפית התמיינות השריית יכולת

תאי גזע עובריים

גידול בתרבית - גופיפים

עובריים

הזרקה לעכברים -טרטומות

תאי גזע עובריים לא

ממוינים

התמיינות סטוכסטית

אנדודרם

מזודרם

אקטודרם

התמיינות תאי גזע עובריים

התמיינות תאי גזע עובריים

תאי גזע עובריים לא ממוינים

אקטודרם

התמיינות מושרה

אנדודרם

הנדסה גנטית

הוספת פקטורים ספציפים

לתרבית

( של תאים reprogrammingתכנות מחדש )סומאטיים

“The reversal of the differentiation state of a mature cell to one that is characteristic of the undifferentiated

embryonic state”

Gurdon, 1962

שיבוט למטרת ריפוי Therapeutic Cloning

Gene & cell therapy

Cloning

ES cells isolation

הפריית מבחנה

בלסטוציסט

בידוד תאי המסה הפנימית

גידול בתנאים מתאימים ליצירת תאי גזע עובריים

שיבוט

שיבוט למטרות ריפוי לעומת שיבוט למטרות רבייה

לא באדם!

cloning

First somatic cloning in mammals

Wilmut I. et al, Nature, 1997

Lamb 6LL3 - Dolly

כבשה

1996

מינים משובטים

עכבר

1996

עז

1999

פרה

1998

חזיר

2000

חתול

2002

zebra-fish

2002

ארנב

2002

פרד

2003

סוס

2003

כלב

2005

חולדה

2003

שיבוט בבני אדם

Science. 2005 Jun 17;308(5729):1777

Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669

מאמר הבית

William M. Rideout, III 6, , 1, Konrad Hochedlinger 6, , 1, , 2, Michael Kyba 6, , 1, George Q. Daley 1, 3 and Rudolf Jaenisch , , 1, 4

-/- Rag2עכברי

לא , recombinase RAG2, ללא האנזים•

.VDJ rearrangement-ה מתבצע

, SCID הם עכברי -/-RAG2עכברי •

.B תאי Tללא תאי

בתנאים סטריליים העכברים חיים בצורה •

נורמאלית

ניתן לתקן את מערכת החיסון של •

העכברים ע"י הזרקת תאי גזע

WTהמטופואטים מעכברי

Proof of principle for therapeutic cloning combined with gene therapy

Tetraploid embryo complementationtwo cell embryos (diploid) one cell embryos (teraploid)

teraploid blastocysts injection of ES cells

Eakin GS et al. Dev Dyn. 2003; 228: 751

electrofusion

הם אכן פלוריפוטנטיםntES תאיההוכחה ש

Tetraploid embryo complementation

והתאים ES- העובר נוצר מתאי ה•. הצליחו הטטרפלואידים תורמים ליצירת השלייה

(4/14 )28% עכברונים חיים 4לקבל

ע"י RAG2-תיקון המוטציה ברקומבינציה הומולוגית

האלל המוטנטי, מכיל 3מחדר בתוך אקסון

הקונסטרוקט לצורך תיקון המוטציה

תוצר הרקומבינציה ההומולוגית

האלל המתוקן לאחר הוצאת סמן

הסלקציה Rag2+R-/

LoxPLoxP

) יוצר מערכת /-Rag2 +Rהאלל המתוקן (חיסון תקינה

•Tetraploid embryo complementation הזרקת תאיntES Rag2+R -/

T ותאי B בתאי rearrangements לזיהוי PCRאנליזת •T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת •

) יוצר מערכת חיסון תקינה/-Rag2 +Rהאלל המתוקן (in-vivoתיקון --/- Rag2בעכברי

HSCכתורמים של /-Rag2+Rשימוש בעכברי •(Hematopoietic stem cells) לעכברי Rag2-/-

T ותאי B עם נוגדנים כנגד תאי FACSאנליזת –

ntES cells מתוקנים" מעכברי" Rag2 -/- יכולים ליצור תאי מח עצם נורמאלים.

Repaired ntES EBs

hematopoietic stem cells

Hematopoietic cytokinesHOXB4

GFP

Rag2 -/-

WT

והשתלתם ntES על תאי in vitroהשריית התמיינות -/- Rag2בעכברי

6מים

14 י

מים י

Rag2עכברי במדוע התאים נדחו -/-?

העמידות כנגד ההשתלה היא תכונה •-/-Rag2ספציפית של עכברי ה

MHCהתאים מבטאים רמה נמוכה של •

הורגים תאים המבטאים רמה NKתאי •MHCנמוכה של

מבטאים רמה -/-Rag2יתכן שעכברי • NK cellsגבוהה של

האם הדחייה נובעת מתגובה של תאי NK?

NKלא תאי להשתלת התאים לעכברים •

hematopoietic stem cells

Rag2-/- ,C null

Rag2 +/- ES

Rag2 -/- ,γCתוצאות ההשתלה בעכברי null

התאים לא נדחו•95% מהתאים בדם הפריפרי ביטאוGFP

וכמות )גרנולוציטים( תאים מילואידיםבעיקר•T ותאי Bקטנה מאד של תאי

Bתאי Bתאי גרנולוציטיםTתאי

-/-NK סיכום1) VDJ recombination restored

2) Low level of T/B cells in blood.

3) High level of granulocytes.

סיכום ומסקנותמטרת העבודה – תיקון פגמים גנטים בעכבר ע"י שילוב •

gene therapy" ו therapeutic cloningשל " מוטנטים ntES משוחזרת בתאי Rag2פעילות האנזים •

שתוקנו ע"י רקומבינציה הומולוגית- התקבל שחזור מסויים של מערכת החיסון בעכברי ה•

SCID שתי בעיות עיקריות:•

NK cellsדחייה ע"י –התמיינות לימפואידית נמוכה ביותר–

תמילואידי"דוחף" לכיוון התמיינות שHoxB4 מביטוי שליתכן שזה נובע •

פרוטוקולים משופרים של התמיינות יפתרו כנראה את הבעיה.

אסטרטגיות שונות "לתכנת מחדש" תאים

Jaenisch R & Young R., Cell 2008

תכנות מחדש ע"י הדבקה רטרו-ויראלית של iPS-induced pluripotentפקטורים ידועים )

stem cells)

Jaenisch R & Young R., Cell 2008

Morphological Changes Following Infection with the 4 Factors

WT-MEFsMorphological changes (Day 7)

mIPS colonies at Day>20

Mouse iPS- First reported 2006

Fibroblasts Human iPS

Human iPS- First reported December 2007

שילוב ל ידיטיפול במחלות גנטיות ע( וריפוי iPS"תכנות מחדש" )“ של

:גני החזון והמציאות

Treating Sickle-Cell Anemia with iPS Cells

Hanna J et al., Science 2007

The future ?

L.C

) בשעה שתיים 29.12.08שבוע הבא- הרצאה של יעקוב ביום שני|(בחדר סמינרים- מומלץ!