slides de microbiologia

Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF

Curso de Graduação em MedicinaDisciplina: MicrobiologiaDocente: César Augusto

Discentes:

Carla Larissa

Felipe Diego

Juliana Conduru

Lucas Torres

Roberta Magalhães

TESTES SOROLÓGICOS

TESTES SOROLÓGICOS

• O que medem?

• Os Ac dirigidos contra antígenos microbianos específicos.

• A maioria consiste em ensaios em fase sólida.

• Objetivo da reação sorológica:

+

AGAG ACAC

ELISA ELISA

ELISA

ENZIME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (enzimaimunoensaio)

Técnica de imunoensaio in vitro.PRINCIPIO BÁSICO: imobilização de um dos

reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação da atividade enzimática e imunológica do anticorpo.

ELISA

Suporte sólido

Suporte sólido

Placas de microtitulação

Tubos

Poliestireno

Identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra;

ELISA

Ag purificado;Ac purificado;Placa de poliestireno;Tampão de lavagem.Cromógeno.

Leitora de Elisa;

Elementos necessários:

ELISA

o INDIRETO: detecta Aco DIRETO OU SANDUICHE: detecta Ago COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo

peso molecular;o CAPTURA: detecta Acs (principalmente

IgM)

TIPOS:

.Lavagem para retirada de Ag livre:

.Lavagem para retirada de Ac não fixado:

.Adição do conjugado:

.Adição de soro-teste: (1) e (2) ELISA indireto

1. O Ag é add á placa e se adere à superficie dos poços.

.Lavagem para retirada de conjugado livre

.Adição de substrato e cromógeno que é ativado pela parte enzimática

do conjugado

.Positivo .Negativo

Aplicações do Elisa indireto:Exemplos : diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDSAplicações do Elisa indireto:Exemplos : diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS

Cont. negativo

Cut-off

Cont. positivo

ELISA sanduíche 1. Um Ac é add á placa e se

liga à sua superficie.

2. Lavagens são feitas para retirar os anticorpos livres.

3. Adição de solução-teste com Ag a ser pesquisado, e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços.

4. Lavagem para retirada

do Ag não capturado

5. Adição de outro Ac marcado, nova lavagem e revelação

Aplicação do Elisa sanduíche

• Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos, nas fezes, na urina em secreções etc.

• Exemplos na medicina: Teste de gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro.

ELISA por competição

1. Adição do Ac especifico aos micropoços da placa.

2. Lavagem para retirar os Ac livres

4. Lavagem para retirada de Ag não capturados.

3. Adição de Ag-teste:

Adição de Ag-marcado:

Competição para ligar Ac

Aplicação:

Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou-tras proteínas séricas. Nodiagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS

Aplicação:

Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou-tras proteínas séricas. Nodiagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS

5. Adição do substrato e do cromógeno. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac, ocorrera reação enzimática e o cromogeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor.

Quanto maior a quantidade de antigeno-teste, < a possibilidade de ligação do Ag marcado e < a intensidade de cor emitida.

Quanto maior a quantidade de antigeno-teste, < a possibilidade de ligação do Ag marcado e < a intensidade de cor emitida.

ELISA de Captura

Pesquisa de IgM humana contra T.gondii:T.gondii:

-Poço revestido com IgG monoclonal contra IgM

humano

-Adição da amostra (contendo IgM)

-Lavagem para retirar o anticorpo não capturado

-Adição de Ag especifico marcado com enzimamarcado com enzima

-Lavagem

-Adição de cromógeno ( )

-Revelação: leitura em fotocolorímetro.

Utilização do ELISA captura:

Detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos , em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, toxoplasmose ou citomegalia da gestante.

Utilização do ELISA captura:

Detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos , em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, toxoplasmose ou citomegalia da gestante.

Infecções na fase aguda.

ELISA

• Alta sensibilidade Menor risco de falsos-negativos;

• Alta especificidade Menor risco de falso-positivo;

• Várias amostras simultaneamente;

• Rápido, simples, custo baixo a médio;

Vantagens:

ELISA

• Mão de obra especializada;

• Degradação de reagentes;

• Erros de pipetagem;

Desvantagens:

SDS - PAGESDS - PAGEEletroforese em gel de

poliacrilamida

SDS - PAGE

• SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE).

• É um método muito utilizado para a análise de massas moleculares de proteínas.

• As proteínas são misturadas ao detergente SDS, cuja função é desnaturar as proteínas e converte-las numa estrutura linear. O SDS, também, confere carga negativa às proteínas.

SDS - PAGE

SDS - PAGE

• As proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida.

• São submetidas a uma corrente elétrica, fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo.

SDS - PAGE

• As proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto que as maiores terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se moverão mais lentamente.

SDS - PAGE

WESTERN BLOTWESTERN BLOT

WESTERN BLOT

• Western Blot é um método usado para detectar uma certa proteína em uma amostra, usando anticorpo específico para aquela proteína. Além disso, esta técnica também dá informação acerca do tamanho da proteína.

• Eletroforese de proteínas.• Identifica antígenos ou anticorpos.

WESTERN BLOT

Serve como teste confirmatório dos resultados obtidos em testes imunoenzimaticos.

WESTERN BLOT

Método de execução de Western Blot:Método de execução de Western Blot:

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT

Técnica:

1) Preparo das amostras e eletroforese em gel (SDS-PAGE)

WESTERN BLOT

Técnica:

2) Transferência para a membrana (nitrocelulose ou PVDF)

WESTERN BLOT

Técnica:

3) Bloqueio da membrana e incubação com ac primário:

4) Incubação com ac secundário acoplado ao sistema de revelação:

WESTERN BLOT

Técnica:• A revelação pode ser feita com um substrato

colorimétrico (ex: TMB), que produzirá uma banda colorida.

• A revelação pode ser feita com um substrato quimioluminescente (ex. ECL), que produzirá uma banda colorida

WESTERN BLOT

Resumo:

Aplicação em diagnósticos médicos:

• A técnica western blot tem sua aplicação muito importante em diagnósticos médicos, o qual ajuda na detecção dos anticorpos, produzidos por nós, de varias doenças, como por exemplo a AIDS, a doença da Vaca Louca e outras.

WESTERN BLOT

Conclusão:

• O Western Blot é o exame mais especifico para a detecção de proteínas virais.

• Esse método utiliza eletroforese em gel para obter o resultado esperado.

• Ele é muito utilizado em testes imunoenzimáticos.• Utilizado em exames confirmatórios de doenças,

como a doença da vaca louca e doença de Lyme.• A técnica Western Blot foi e é para a medicina um

grande avanço, pois através deste podemos dizer com precisão resultados de doenças como a AIDS entre outras.

WESTERN BLOT

AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO

AGLUTINAÇÃO

• Consiste na formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinados antígenos em sua superfície.

Dois estágios:

1º - Ag + Ac

2º - Agregados

• Começam concomitantemente• Um demora mais que o outro

AGLUTINAÇÃO

1º 2º

AGLUTINAÇÃO

Pode ocorrer com partículas:

• Naturais; • Inertes;

De acordo com o tipo de partícula são classificadas:

• Aglutinação direta;• Aglutinação indireta.

AGLUTINAÇÃO

• Sensibilidade;

• Concentração de anticorpos.

Fatores que interferem na formação de agregados:

• Tipo de anticorpo;

• Temperatura;

• pH;

• Enzimas.

AGLUTINAÇÃO

Aplicação:• Diagnóstico laboratorial de doenças:

- Virais;- Bacterianas;- Auto-imunes;- Hormonais;

• Tipagem sanguínea.

• Utilizam-se partículas antigênicas insolúveis na sua forma íntegra ou fragmentada.

• Hemácias: tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh.

• Bactérias, espiroquetas, protozoários: teste de Widal (salmoneloses), teste de Wright (brucelose), teste de Weil-Felix (Rickettiose), teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase.

Teste de inibição de hemaglutinação direta• Capacidade que certos antígenos têm de,

espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias.

Anticorpos + partículas virais = inibição

• Útil para detectar Ac contra o vírus da rubéola, do sarampo, da influenza, dentre outros.

As hemácias ou partículas inertes podem se sensibilizar por:

• Adsorção passiva;• Adsorção via agentes químicos;• Conjugação do antígeno.

Devido à grande variedade de antígenos que podem ligar-se à células ou partículas, sua aplicação é bem variada.

Teste de hemaglutinação passiva

• Após a sensibilização das hemácias com a concentração adequada de antígenos, são suspensas em solução estabilizadora, para evitar reações inespecíficas sem diminuir a capacidade de aglutinação específica.

Teste em placas:

• Pequena quantidade de reagente;• + : formação de tapete em “V”• - : sedimentação em “botão”

Teste de inibição da hemaglutinação passiva

• Sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada.

Depende:

• Concentração do antígeno;• Afinidade pelos sítios de ligação de combinação.

• Especificidade;

• Pouca quantidade de antígeno;

Aplicação:• Detecção de antígenos na hepatite e hemofilia.

AGLUTINAÇÃO

Teste de aglutinação do látex:• O látex é utilizado como suporte na adsorção de

proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação Ag + Ac.

Aplicação:• Pesquisa de Ag ou Ac;• Fator reumatóide (Ac IgM).

Detecção do fator reumatóide:

• Ac IgG adsorvidos às partículas de látex;

• Reação com o fator reumatóide;

• Aglutinação;

AGLUTINAÇÃO

CITOMETRIA DE FLUXOCITOMETRIA DE FLUXO

CITOMETRIA DE FLUXO

• Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo.

CITOMETRIA DE FLUXO

Tecidos pesquisados:• Sangue• Urina• Exsudatos• Bile• Lavado brônquico • Fezes• Biopsias

CITOMETRIA DE FLUXO

A técnica:• As células e outras partículas passam por um feixe de

luz de único comprimento de onda, geralmente um laser, e dispersam essa luz em comprimentos diferentes a depender da morfologia da célula. Detectores localizados em frente ao feixe (Forward Scatter, FSC) e perpendiculares a ele (Side Scatter, SSC) identificam os diferentes comprimentos de onda e os transmitem para computadores para digitalização das informações.

CITOMETRIA DE FLUXO

• É possível identificar antígenos virais dentro e sobre a superfície de células infectadas e detectar ácidos nucléicos virais.

• Detecta-se também imunoglobulinas específicas, caracterizando o micróbio. Utiliza-se adição de microesferas que se ligam ao antígeno do micro-organismo e de fluorocromos aos anticorpos.

CITOMETRIA DE FLUXO

Diagnóstico:

• HIV• Vírus sincicial respiratório • Trypanosoma cruzi • Leishmania chagasi • Mycobacterium tuberculosis • Cryptosporidium hominis e C. parvum

CITOMETRIA DE FLUXO

Diagnóstico:

REFERÊNCIAS

FERREIRA, Antonio Walter; ÁVILA, Sandra do Lago Moraes de. Diagnóstico laboratorial: avaliação de métodos de diagnóstico das principais doenças infecciosas e parasitárias e auto-imunes. correlação clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 443 p. ISBN 8527706296

http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm, acesso em 14 de novembro de 2012

http://imunologiahematologia.wordpress.com/2010/06/14/sds-page, acesso em 14 de novembro de 2012

http://www.youtube.com/watch?v=J5qPKK0GGDo acesso em 19 de novembro de 2012.