平成２５年度食品健康影響評価技術研究成果発表会

Ⅰ化学物質関連分野（胎児期・発達期の暴露に関する研究）

登美 斉俊 （慶應義塾大学薬学部・准教授）

胎盤移行性における種差を反映したヒト胎児毒性リスク評価手法の開発

薬剤学講座組織関門を介した物質透過メカニズムの研究胎児期・発達期栄養環境が生活習慣病発症に及ぼす影響の研究

丸山 哲夫 （慶應義塾大学医学部・専任講師） 産婦人科学教室生殖内分泌研究室産科不育症、子宮由来疾患の病因解明

研究分担者：

研究開発課題名：

研究代表者：

平成25年8月29日（木）15:50-16:35

1

胎児・胎盤移行性の種差

標的細胞での感受性種差

ヒトでの発生毒性予測

？

MDR1 ENT2BCRPMRP2

OCT3OATP2B1

MRP1

ENT1

MRP5 OAT4

①胎盤拡散透過速度②胎盤トランスポータータンパク発現量 の定量的情報基盤を③胎盤トランスポーター輸送能力 各々構築することで、

ラット胎児・胎盤移行性からヒト移行性を高精度に外挿させた、動物種差を反映したヒト胎児毒性リスクの評価手法が開発できる。

胎児血

母体血 拡散透過 担体（トランスポーター）介在透過

胎盤

化学物質の胎児・胎盤移行性はヒト・ラット共に、胎盤関門を介した①脂溶性に従った拡散透過②トランスポーターを介した選択的透過によって規定

胎盤内分泌

但し、輸送速度、トランスポーター発現量には動物種差が存在

胎盤関門細胞膜透過機構に関わる定量的情報の欠如により、動物データからのヒト胎児・胎盤移行性予測が現状では不可能

毒

化学物質

ヒト胎児毒性リスク評価の現状・課題

毒

ラットでの発生毒性データ

化学物質

毒

2

Fig. Multiple captures of syncytin genes across evolution and diversity of placental structures in mammals. The phylogenetictree of mammalian evolution shows the time of insertion of the six syncytin genes identified to date (middle). Roman figuresindicate the four major eutherian clades: Afrotheria (I), Xenarthra (II), Euarchontoglires (III) and Laurasiatheria (IV). Atthis time, syncytins have been identified in the Euarchontoglires (primates, muroids and leporids) and Laurasiatheria(carnivores) classes. Capture of varied syncytins with differing properties and expression sites could explain the observeddiversity of placenta organization among mammalian species. The right panel shows a schematic representation of thematerno–fetal interface in the four main types of placental structures. Placental types are classified in order of increasinginvasive properties and extent of syncytialization.

Primates

Homo

Dupressoir et al., Placenta 33:663–671 (2012). 3

Fetal vessels

Decidua

Maternal vessels

Plac

enta

Syncytiotrophoblast(Placental barrier)

TransportersEnd of first trimester

Cytotrophoblast

Fetal capillaries

TermChorionic villus

Intervillus space

Fetus

Structure of the human placental barrierTomi et al., J Pharm Sci 100:3708–3718 (2011).

4

Syncytiotrophoblast(Placental barrier)

CytotrophoblastFetal SideMaternal side

Intervillous space(Filled with maternal blood)

Passive diffusion

Carrier-mediated

Gap junctions

Fetal drug transfer mechanisms across the rodent placental barrier 5

Fig. Uptake of 3-O-[14C]methyl-D-glucose into whole embryos atday 10 pc from maternal bloodacross the placentaDecreased accumulation of radioactivitywas measured in homozygous Cx26-defective embryos compared withheterozygous and wild-type embryos.

Cx26(-/-)embryos

Glucose transfer mechanisms across the rodent placenta

登美, 産婦人科の実際 62(8), 1041-1046 (2013).

Gabriel et al., J Cell Biol 140:1453-1461 (1998).

6

「胎盤移行性における種差を反映したヒト胎児毒性リスク評価手法の開発」 研究の全体構想

1. 「拡散透過」における種差の解明 2. 「胎盤トランスポーター発現量」における種差の解明

3. 「胎盤トランスポーター機能」における種差の解明

ヒト/ラット拡散移行比の算出

トランスポーター1分子あたりの輸送活性を算出

胎児側

母体側

刷子縁膜

側底膜

AB

CD

A B

C

細胞膜に発現するトランスポーター分子数の定量

D

胎盤

化学物質

脂溶性

胎児・胎盤移行性

ヒトy=ax

トランスポーター 膜ベシクル

分画分取

LC-MS/MSによるトランスポーターペプチド断片の絶対定量

消化

タンパク ペプチド MRM LC-MS/MS

標識ペプチド

対象ペプチド領域

標識ペプチド

対象ペプチド

分子数

A B C D

ヒト ラット

非発現細胞

トランスポーター強制発現細胞

A

トランスポーターを介した輸送速度(k2’-k2)の算出

トランスポーター分子数の絶対定量

k2’k1

k3 k4

k2k1

k3 k4

ラットy=bx

7

FUI ; fetal uptake index

injectate)dpm,tipyrine]([test]/[anfetus)dpm,tipyrine]([test]/[an

FUI

1. Inject the bolus containing the compound of interest and antipyrine (reference compound) into the abdominal aorta of the pregnant rat (GD19) under anesthesia

2. Isolate the fetus at cervical end 10 seconds after the injection

3. Measure the radioactivity4. Calculate the uptake ratio to antipyrine

(reference compounds)

Experimental method for evaluation of the maternofetal transfer across the rat placenta

Abdominal aorta

Cervical end

Ovarian end

OvaryU

teri

ne

1) 胎盤拡散透過における種差の解明

8

Syringe driver

Sampling

Qf : 500 µL/min

Placenta

FetusCLfm

1. Catheterize the umbilical artery and vein2. Perfuse test compounds and sample the perfusate3. Measure the radioactivity4. Calculate the clearance from fetus to motherCervical

end

Ovarian end

OvaryU

teri

ne

1) 胎盤拡散透過における種差の解明

ffm QCL x[a]

[v]-[a] )(

Concentration: [a]

Concentration: [v]

Experimental method for evaluation of the fetomaternal transfer across the rat placenta 9

1) 胎盤拡散透過における種差の解明

脂溶性・分子量と胎児から母体への胎盤透過性との相関性

脂溶性増加に伴う透過性上昇

Nishimura et al., J Pharm Sci, 102:3356-63 (2013). 10

2) 胎盤トランスポーター発現量における種差の解明

Placenta

Pellet

Centrifugation at 800 g

Centrifugation at 10,000 g

Re‐suspend

Mg2+‐precipitation, 2minCentrifugation at 2,500 g

SupernatantPellet

BLM

Homogenate

SupernatantRe‐suspend

Mince and Homogenization

Centrifugation at 110,000 g

BBM

Homogenate

Homogenization

Pellet Supernatant

Pellet

Centrifugation at 110,000 g

Supernatant

Homogenate 刷子縁膜（母体側）

側底膜（胎児側）

胎盤刷子縁膜・側底膜ベシクル単離プロトコル

Sucrose density gradient centrifugation

Purified BLM

11

2) 胎盤トランスポーター発現量における種差の解明

胎盤刷子縁膜ベシクルの評価

Brush-Border membrane (BBM; Maternal side)

胎盤

膜ベシクル分画分取

アルカリフォスファターゼ MDR1 BCRP

β受容体

Bcrp/Abcg2

Mdr1/Abcb1

Basolateral membrane (BLM; Fetal side)0

2468

1012

Rat

Human アルカリフォスファターゼ活性

MDR1/ABCB1Human

Rat

12

Brush-Border membrane (BBM; Maternal side)

Basolateral membrane (BLM; Fetal side)

2) 胎盤トランスポーター発現量における種差の解明

胎盤側底膜ベシクルの評価

胎盤

膜ベシクル分画分取

アルカリフォスファターゼ MDR1 BCRP

β受容体

Dihydroalprenolol(DHA; β blocker)

Human DHA結合活性

OAT4/SLC22A11

ASCT2/SLC1A5

Human

OAT4 ASCT2

13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1.10

1.12

1.14

1.16

1.18

1.20

1.22

1 2 6 8 10 1211

DHA binding activity (%)

Protein (%)

Fraction #3 4 5 7 9

Den

sity (g

/mL)

2) 胎盤トランスポーター発現量における種差の解明

Density (g/mL)

DHA bind

ing activ

ity (%

)Protein (%

)

密度勾配遠心によるラット胎盤側底膜ベシクル精製の検討14

3) 胎盤トランスポーター機能における種差の解明

hSNAT2

hSNAT1, hSNAT4, mock

rSNAT2

rSNAT1, rSNAT4, mock

RatHuman

胎盤

Betaine

SNAT2

SNAT2/SLC38A2Human

SNAT2を介したベタイン輸送機構 15

排出トランスポーター機能種差

16

母体-胎児方向と胎児-母体方向の胎盤透過性の比較登美, Drug Delivery System 28(4) (2013).

母体-胎児方向

InulinBetaineZidovudineAntipyrine GlyburideDigoxin

Tran

s-pl

acen

tal p

erm

eabi

lity

(% o

f an

tipy

rine

)200

150

100

50

0

胎児-母体方向

17

胎盤ヌクレオシド輸送の分子実体

18

ENT1の基質の方が透過性が高い

0

50

100

Control 1 mMAZT

100 MNBMPR

*

Upt

ake

( L/

mg

prot

ein/

5 m

in)

0.1 M 100 M0

1

2

3

4

*

Control+ NBMPR

ddI u

ptak

e(

L/m

g pr

otei

n/5

min

)

ENT2

AZT

ddI

ラット胎盤由来TR-TBT 18d-1細胞への取り込み

0.1 M 100 MControl+ NBMPR

**

**0

50

100

150

Upt

ake

( L/

mg

prot

ein/

5 m

in)

ENT1

ENT2

Uridine未同定のトランスポーターの関与

19

Yao et al., Molecular Membrane Biology 18:161-167 (2001)

Upt

ake

(pm

ol/o

ocyt

e 30

min

)-1

rENT1 rENT2 hENT1 hENT2 H2O rENT1 rENT2 hENT1 hENT2 H2O

20

ヌクレオシド系化合物のENTへの基質認識性

胎盤メチル水銀透過機構

21

胎児性水俣病の原因物質

胎児の神経形成を阻害

メチル水銀

メチル水銀 L-システインメチル水銀システイン複合体

非酵素的に結合

Cell

LAT

L-Type amino acid transporter (LAT)の基質

rLAT1 rLAT2

L‐ロイシン 18±3 μM 119±33 μM

メチル水銀複合体 98±8 μM 64±8 μM

L‐システイン ― 109 μM

LAT基質のrLAT1及びrLAT2に対するKm値

Simmons-Willis et al., Biochem J, 367, 239-246 (2002).

Kanai et al., J Biol Chem, 273, 23629-23632 (1998).Segawa et al., J Biol Chem, 274, 19745-19751(1999). 22

胎盤ベタイン透過機構

23

母体-胎児方向と胎児-母体方向の胎盤透過性の比較登美, Drug Delivery System 28(4) (2013).

母体-胎児方向

InulinBetaineZidovudineAntipyrine GlyburideDigoxin

Tran

s-pl

acen

tal p

erm

eabi

lity

(% o

f an

tipy

rine

)200

150

100

50

0

胎児-母体方向

24

Source of methyl groups

Osmotic regulation

Betaine

ApoptosisCell

Roles of betaine

B12, vitamin B-12 (cobalamin); BHMT, betaine homocysteine methyltransferase; DMG, dimethylglycine; MS, methionine synthase; MTHFR, methylenetetrahydrofolate reductase; SAH, S-adenosylhomocysteine; SAM, S-Adenosyl-methionine; THF, tetrahydrofolate; CH3-THF, 5-methyltetrahydrofolate.

BGT-1

Hypertonicity

25

Isotonic condition

Hypertonic condition

Time (min)

[14C]

Beta

ine

Upt

ake

(μL/

mg

prot

ein)

0

150

100

50

05 10 15

[14C]Betaine : 3 μM. Mean ± S.E.M. (n = 3-4). Uptake at 37ᵒC in the presence of an inwardly directed Na+gradient. A statistically significant difference is indicated by an asterisk * (p < 0.05).

Effect of osmotic stress on [14C]betaine uptake by the rat placental TR-TBT 18d-1 cell line

Nishimura et al., Placenta : 1003-1009 (2010).26

TR-TBT 18d-1 cells were cultured in isotonic (300mOsm/kg) or hypertonic (500mOsm/kg) medium . Uptake in the absence and presence of inhibitors. [14C]betaine : 3 μM. Mean ± S.E.M. (n = 3-4). *,p< 0.05 vs control.

Effect of inhibitors on osmosensitive [14C]betaine uptake by the rat placental TR-TBT 18d-1 cell line

System A substrate

Isotonic conditionHypertonic condition

Betaine MeAIB GABABetaine MeAIBGABA

BGT1 substrate

System A substrate

BGT1 substrate

Nishimura et al., Placenta : 1003-1009 (2010). 27

System A

Mackenzie and Erickson, Pflugers Arch, 447, 784-795 (2004).Hatanaka et al., Biochim Biophys Acta, 1510,10-17 (2001).

Protein name SNAT1 SNAT2 SNAT4

Human genename

SLC38A1 SLC38A2 SLC38A4

Formeraliases

ATA1 ATA2 ATA3

Predominant substrates

Glutamine,AlanineAsparagine,CysteineHistidine,Serine

Alanine,AsparagineCysteine,Glutamine,Glycine,Histidine,MethionineProline,Serine

Alanine,Asparagine,Cysteine,Glycine,SerineThreonine,Arginine,Lysine

Tissue distribution

Brain,Heart,Placenta

Widespread(including placenta)

Liver,Placenta

Km valuefor MeAIB

0.89mM 0.39mM 6.7mM

MeAIB : methylaminoisobutyric acid

28

hSNAT2

hSNAT1, hSNAT4, mock

rSNAT2

rSNAT1, rSNAT4, mock

RatHuman

胎盤

Betaine

SNAT2

SNAT2/SLC38A2Human

SNAT2を介したベタイン輸送機構 29

Western blot analysis : Protein was extracted from TR-TBT 18d-1 cells and expression of SNAT2 was analyzed by using an anti-SNAT2 antibodyImmunocytochemicalanalysis : Magnification x600. Bars=10 μm.

Induction of SNAT2 protein by hypertonicityin TR-TBT 18d-1 cells

Isotonic condition Hypertonic condition

30

基盤となる胎盤透過機構解析技術の確立胎盤透過性評価技術や、母体側および胎児側細胞膜の精製技術、トランスポーター絶対発現量の解析技術など、新規の胎盤透過機構解析系を確立できた。これら評価技術は透過機構解明を加速させる上で有用性が高い。

研究戦略の合理性を裏付ける知見基質選択性が低く、多くの化学物質の胎児移行に関与するABC排出トランスポーター活

性における種差を示すことができたなど、胎盤透過性種差を評価するための重要な知見を得た。

未達成の課題化学物質の胎盤関門透過機構における種差の解明は一部において達成できたが、化学物質の胎児移行性を予測可能な状態には達していない。

胎盤透過性における種差を機構論的に解明することは、ヒト胎児移行性の予測評価手法確立にむけた基盤データとして、食品健康影響評価に貢献できる。一方で、幅広い化学物質のヒト胎児移行性予測評価手法確立には、より長期的な研究が必要である。

総括

31

１ 発表論文

T. Nishimura, T. Takanohashi, M. Tomi, M. Horikoshi, K. Higuchi, Y. Sai, E. Nakashima: Evaluation of rat in vivo fetal‐to‐maternal transfer clearances of various xenobiotics by umbilical perfusion, J. Pharm. Sci., 102:3356‐63 (2013).

２ 発表学会

日本薬物動態学会第26年会 (2011年11月, 広島) 第33回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム (2011年11月, 岡山) Asian Federation for Pharmaceutical Sciences 2011 (Dec, 2011, Kuala Lumpur) International Symposium of Past, Present and Future of Molecular Pharmacokinetics

(Jan, 2012, Tokyo) 日本薬学会第132年会 (2012年3月, 札幌) 日本薬剤学会第２６年会（2012年5月, 神戸）

第7回トランスポーター研究会（2012年6月, 京都）

International Federation of Placenta Associations Meeting 2012 (Sep, 2012, Hiroshima) 日本薬物動態学会第27回年会 (Sep, 2012, Hiroshima) 第34回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム（2012年11月, 京都）

日本動物実験代替法学会第25回大会 (2012年12月, 東京)

３ 受賞

第20回日本胎盤学会相馬賞

「Characterization of sodium dependent betaine uptake in human placental brush‐border membranes」 32